CN112858671A - 制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法,涉及类风湿因子检测技术领域。本发明公开的制备方法将含有变性IgG与抑制剂的第一混合溶液与胶乳溶液混合,得到第二混合溶液;其中,抑制剂用于抑制变性IgG与胶乳的非特异性凝集。采用本发明制备方法制备类风湿因子检测试剂可以降低IgG的使用量,成本低,所制得的类风湿因子检测试剂批间重复性好,稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及类风湿因子检测技术领域,具体而言,涉及一种制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法。
背景技术
类风湿因子(rheumatoid factor,RF)是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体,主要成分为IgM类型抗体,也有IgG类、IgA类、IgD类和IgE 类。研究表明类风湿因子的阳性率在正常人中只有2%,老年人中有5%,而在类风湿关节炎(RA)患者中有80%的阳性率。因此RF作为RA诊断的指标有重要价值。
目前对RF检测的方法有乳胶凝集法,ELISA夹心法和胶乳增强免疫比浊法等。其中胶乳增强比浊法的增强原理,是将变性IgG偶联到胶乳微球表面,在与RF反应时浊度得到大幅提高,从而起到信号放大的作用。
但目前,基于胶乳增强比浊法检测的RF检测试剂在其制备过程中经常容易出现IgG使用量高,批间重复性差、RF检测试剂成品后期的稳定性也低等一些问题。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法。采用本发明制备方法制备类风湿因子检测试剂可以降低IgG的使用量,成本低,所制得的类风湿因子检测试剂批间重复性好,稳定性高。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明实施例提供一种制备类风湿因子检测试剂的方法,其包括:将含有变性IgG与抑制剂的第一混合溶液与胶乳溶液混合,得到第二混合溶液;
其中,所述抑制剂用于抑制变性IgG与胶乳的非特异性凝集。
本发明的发明人首次发现,现有的将变性IgG偶联到胶乳微球表面过程中,IgG变性过程中暴露出很多疏水基团,这些疏水基团在跟胶乳混合时,容易产生剧烈凝集,由于产生非特异性凝集,导致抗原表位被屏蔽,很多抗原没有得到充分利用,使得试剂成本增加,交联过程凝集的产生也会影响试剂批间差及后期的稳定性。
基于此,本发明实施例提出的制备类风湿因子检测试剂的方法,先使变性IgG与抑制剂混合,再与胶乳溶液混合,其中的抑制剂能够抑制变性 IgG与胶乳的非特异性凝集,通过该抑制剂的使用,大大地减少变性IgG与胶乳的非特异性凝集,使其抗原表位被充分暴露,进而得到充分利用,减少IgG的使用量,降低成本,批间重复性好。此外,由该制备方法所制得的类风湿因子检测试剂,稳定性也好,由于其中的变性IgG的抗原表位被充分暴露,其在检测的过程中也具有较好的灵敏度和特异性。
需要说明的是,抑制剂的类型可以是多种多样的,例如在可选的实施方式中,所述抑制剂选自尿素和BSA中的至少一种。只要其具有抑制变性 IgG与胶乳的非特异性凝集的作用,均可以用作本发明的抑制剂,因此,只要是将具有抑制变性IgG与胶乳的非特异性凝集作用的物质用于本发明,无论其类别如何,均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中,所述第一混合液由变性IgG溶液与尿素溶液和 BSA溶液混合得到。
在可选的实施方式中,每70μl变性IgG溶液对应使用60-1000μl尿素溶液。其中,变性IgG溶液中的变性IgG浓度为10-50mg/ml;尿素溶液中的尿素浓度为7-9mol/L。
在可选的实施方式中,变性IgG溶液中的变性IgG浓度为8-12mg/ml。
本发明实施例研究发现,合适浓度的尿素有利于提高制得的类风湿因子检测试剂的检测效果。例如每70μl变性IgG溶液(8-12mg/ml)对应使用 60-1000μl尿素溶液(7-9mol/L)。
在可选的实施方式中,每70μl变性IgG溶液对应使用250-500μl尿素溶液。
本发明实施例进一步研究发现,将每70μl变性IgG溶液(8-12mg/ml) 对应使用250-500μl尿素溶液(7-9mol/L)进行混合后,这样,所制得的类风湿因子检测试剂的检测效果有明显提高。
在可选的实施方式中,每70μl变性IgG溶液对应使用25-125μl BSA 溶液;其中,BSA溶液中的BSA含量为8%-12%。
本发明实施例研究发现,合适浓度的BSA有利于提高制得的类风湿因子检测试剂的检测效果,例如,每70μl变性IgG溶液(8-12mg/ml)对应使用25-125μl BSA溶液(8%-12%)。
在可选的实施方式中,每70μl变性IgG溶液对应使用25-50μl BSA溶液。
本发明实施例进一步研究发现,将每70μl变性IgG溶液(10-50mg/ml) 对应使用25-50μl BSA溶液(8%-12%)进行混合,这样,所制得的类风湿因子检测试剂的检测效果有明显提高。
在可选的实施方式中,所述方法还包括:在室温下搅拌所述第二混合溶液反应2-4h。
在可选的实施方式中,所述方法还包括:在反应结束后,离心所述第二混合溶液,用于封闭液重悬沉淀,得到所述类风湿因子检测试剂;
在可选的实施方式中,所述封闭液为8-12mM的PBS溶液,其含有: 0.1%-0.5%吐温20,0.1%-1%BSA和5%-10%保护剂。
在可选的实施方式中,所述保护剂选自蔗糖或海藻糖。
需要说明的是,除蔗糖和海藻糖之外,使用其他保护剂也属于本发明的保护范围。
本发明对胶乳粒子的类别不作特别限定,本领域技术人员可以根据实际需要进行选择,例如,在可选的实施方式中,所述胶乳溶液中的胶乳粒子选自聚苯乙烯羧基胶乳。无论使用何种胶乳粒子,无论其粒径大小,只要其在偶联变性IgG的过程中,使用了上述抑制剂即属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中,所述胶乳溶液中的胶乳粒子的粒径150-200nm。
第二方面,本发明实施例提供一种类风湿因子检测试剂,其由前述实施方式任一项所述的方法制得。
该类风湿因子检测试剂具有较好的检测效果、以及具有较好的灵敏度、特异性和稳定性,可用于类风湿因子的检测以及类风湿关节炎的诊断。
第三方面,本发明实施例提供一种类风湿因子检测试剂盒,其含有前述实施方式所述的类风湿因子检测试剂。
在可选的实施方式中,所述类风湿因子检测试剂盒还含有保存缓冲液。
在可选的实施方式中,所述保存缓冲液选择Tris-HCl、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液和磷酸盐缓冲液中的任意一种。
保存缓冲液用于控制反应体系的PH、离子强度等反应环境,提高检测效果。
在可选的实施方式中,所述保存缓冲液的浓度为10-100mM、离子强度为200-800mM、pH为7.0-8.5。
在可选的实施方式中,所述类风湿因子检测试剂盒还含有甘氨酸缓冲液。
第四方面,本发明实施例提供一种检测类风湿因子的方法,其包括:使用前述实施方式所述的类风湿因子检测试剂或试剂盒进行检测。
在可选的实施方式中,上述检测方法以非疾病的诊断为目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例1中采用实施例1-6的类风湿因子检测试剂检测不同浓度校准品的反应度曲线图,图中横坐标为校准品浓度。
图2为实验例2中采用实施例7-10的类风湿因子检测试剂检测不同浓度校准品的反应度曲线图,图中横坐标为校准品浓度。
图3为实验例4中对比例1-4的类风湿因子检测试剂检测不同浓度校准品的反应度曲线图,图中横坐标为校准品浓度。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本发明实施例中所用材料信息如下:
胶乳:JSR公司制造;
变性IgG:浓度10mg/ml;
EDC:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司);
NHS:N-羟基琥珀酰亚胺(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司);
BSA:默克公司;
尿素:上海西宝生物。
实施例1
本实施例提供的制备类风湿因子检测试剂的方法,其包括如下步骤:
1胶乳活化
(a)取160μl粒径为188nm的10%(质量百分比)聚苯乙烯羧基胶乳,用10mM的HEPES(PH7.5)缓冲溶液定容至2ml;
(b)向步骤(a)缓慢加入50μl(10mg/ml)EDC溶液、50μl(10mg/ml) NHS溶液,室温搅拌反应20min后,用10mM的HEPES(PH7.5)缓冲溶液定容至10ml,得到胶乳溶液,胶乳终浓度约为0.16%(质量百分比)。
2偶联
(c)取70μl变性IgG溶液,加入50μl浓度为10%BSA以及62.5μl浓度为8mol/L的尿素进行稀释,得到第一混合液;
(d)将第一混合液缓慢加入到胶乳溶液中,得到第二混合液,室温搅拌反应3h。
3重悬
(e)第二混合液于15000rpm离心40min,使用10mM PBS(含0.2%吐温20(质量百分比)、0.1%BSA(质量百分比)和10%蔗糖(质量百分比))超声重悬,即得到本实施例的类风湿因子检测试剂。
实施例2-6
实施例2-6的制备方法与实施例1基本相同,不同的是,在步骤(c) 中的尿素用量不同,具体如下:
实施例2:尿素(8mol/L)用量为125μl;
实施例3:尿素(8mol/L)用量为250μl;
实施例4:尿素(8mol/L)用量为500μl;
实施例5:尿素(8mol/L)用量为750μl;
实施例6:尿素(8mol/L)用量为1000μl。
实施例7-10
实施例7-10的制备方法与实施例3基本相同,不同的是,在步骤(c) 中的BSA用量不同,具体如下:
实施例7:BSA(10%)用量为25μl;
实施例8:BSA(10%)用量为75μl;
实施例9:BSA(10%)用量为100μl;
实施例10:BSA(10%)用量为125μl。
实验例1
使用实施例1-6提供的类风湿因子检测试剂对类风湿因子进行检测。
测试仪器:迈瑞BS-480;
实验试剂:使用50mM甘氨酸缓冲液作为RF检测试剂1,用于控制反应体系的环境,提高检测效果,实施例1-6提供的类风湿因子检测试剂作为 RF检测试剂2,组成本实验检测试剂;
校准品:使用RF病人血清标本进行稀释,得到不同浓度的校准品:0、 11.5、18.5、40、85以及150IU/ml;
检测参数:见下表1;
表1
样本量(μl) | 2.5 |
RF检测试剂1(μl) | 200 |
RF检测试剂2(μl) | 50 |
检测波长(nm) | 660 |
读点1 | 51-51 |
读点2 | 65-65 |
基于胶乳增强免疫比浊法原理,采用上述检测试剂进行检测,操作如下:
1.在反应杯中加入200ul RF检测试剂1,37度孵育117秒;
2.在步骤1中加入2.5ul待测样本,混匀后37度孵育333秒;
3.加入50ul RF检测试剂2,混合后等待9秒,测试660nm的吸光度 A1;
4.反应120秒,测试660nm的吸光度A2;
5.计算吸光度差值△A=A2-A1。
实施例1-6的检测结果见下表2和图1。
说明:表2-表7中的数值代表的是反应度,是由△A值乘以10000得到。
表2采用实施例1-6的类风湿因子检测试剂检测RF病人血清标本的反应度结果
校准品浓度(IU/ml) | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 |
0 | 2032.3 | 222 | 47.2 | 3.5 | 591.6 | 1451.3 |
11.5 | 3522 | 1502 | 556 | 544 | 2749 | 3692 |
18.5 | 4145 | 2410 | 765 | 1023 | 3440 | 4349 |
40 | 5250 | 4425 | 2142 | 2051 | 4562 | 5422 |
85 | 6855 | 7444 | 4810 | 4011 | 6085 | 6919 |
150 | 7936 | 8582 | 8197 | 7296 | 7723 | 8104 |
试剂空白 | 7399 | 5230 | 5098 | 4877 | 5463 | 8418 |
试剂空白是指测试水时的A2,然后乘以10000转换为反应度;0点的反应度相当于测试水或者稀释液的反应度,具体是A2-A1,然后乘以10000 转换为反应度。
由表2可以看出,相较于其他实施例,检测试剂空白时,实施例3和实施例4的反应度较低,且实施例3和实施例4在检测0IU/ml校准品的反应度最低,由图1可知,实施例3和实施例4的曲线趋势较其他实施例更佳,可见,将尿素用量控制在250~500μl之间具有更好的检测效果。
实验例2
使用实施例7-10提供的类风湿因子检测试剂对类风湿因子进行检测,检测方法同实验例1,结果见下表3和图2
表3
由表3和图2可以看出,BSA控制在25~50μl之间,检测0IU/ml校准品和反应曲线趋势最佳,BSA优选范围在25~50μl之间。
实验例3
按照实施例3的方法制备多批次的类风湿因子检测试剂,分别是 20190515批、20190516批、20190615批和20190616批。按实验例1的方法将上述不同批次的试剂用于检测类风湿因子,结果见下表4。
表4
从表4可以看出,不同时间制备出的不同批次试剂,测试相同浓度的标本,反应度变异系数都小于10%,说明实施例3的制备方法具有较好的批间差控制能力。
实验例4
设置对比例1-4,对比例1-4的制备方法与实施例3基本相同,不同的是,在步骤(c)中的变性IgG、尿素和BSA用量不同,具体如下:
对比例1:变性IgG(10mg/ml)用量为70μl,尿素和BSA均不添加;
对比例2:变性IgG(10mg/ml)用量为90μl,尿素和BSA均不添加;
对比例3:变性IgG(10mg/ml)用量为110μl,尿素和BSA均不添加;
对比例4:变性IgG(10mg/ml)用量为140μl,尿素和BSA均不添加;
使用对比例1-4提供的类风湿因子检测试剂对类风湿因子进行检测,方法同实验例1,结果见下表5和图3。
表5
根据表5和图3,实施例3的类风湿因子检测试剂的检测效果最佳,而不添加尿素和BSA的其他条件,反应效果都很差,空白也很高,说明在不添加尿素和BSA的情况下已经发生不可逆的凝集,随着变性IgG的加入量增加,凝集程度和反应曲线有一定改善,但要达到添加尿素和BSA的效果,变性IgG的加入量可能需要增加2倍以上;由此说明,本发明实施例提供的类风湿因子检测试剂可以减少变性IgG的使用量。
实验例5
设置对比例5-8,对比例5-8制备方法与实施例3基本相同,不同的是,在步骤(c)中的变性IgG、尿素和BSA用量不同,具体如下:
对比例5:尿素(8mmol/L)用量为62.5μl,BSA(10%)用量为0μl;
对比例6:尿素(8mmol/L)用量为125μl,BSA(10%)用量为0μl;
对比例7:尿素(8mmol/L)用量为250μl,BSA(10%)用量为0μl;
对比例8:尿素(8mmol/L)用量为500μl,BSA(10%)用量为0μl。
使用对比例5-8的类风湿因子检测试剂对类风湿因子进行检测,方法同实验例1,结果见下表6。
表6
由表6可知,相较于实施例3,对比例5-8单独添加尿素,但检测试剂空白和0浓度校准品的反应度都很高,且曲线趋势很差,说明单独添加尿素不能获得较好的类风湿因子检测试剂。
实验例6
实施例21-25
设置对比例9-12,对比例9-12的制备方法与实施例3基本相同,不同的是,在步骤(c)中的尿素和BSA用量不同,具体如下:
对比例9:尿素(8mmol/L)用量为0μl,BSA(10%)用量为25μl;
对比例10:尿素(8mmol/L)用量为0μl,BSA(10%)用量为50μl;
对比例11:尿素(8mmol/L)用量为0μl,BSA(10%)用量为75μl;
对比例12:尿素(8mmol/L)用量为0μl,BSA(10%)用量为100μl。
使用对比例9-12提供的类风湿因子检测试剂对类风湿因子进行检测,方法同实验例1,结果见下表7。
表7
由表7可知,相较于实施例3,对比例9-12单独添加BSA,但检测试剂空白和0浓度校准品的反应度都很高,且曲线趋势很差,说明单独添加 BSA不能获得较好的检测试剂。上述实验充分说明,BSA和尿素组合在一起时可以发挥更好的抑制变性IgG与胶乳的非特异性凝集效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种制备类风湿因子检测试剂的方法,其特征在于,其包括:将含有变性IgG与抑制剂的第一混合液与胶乳溶液混合,得到第二混合溶液;
其中,所述抑制剂用于抑制变性IgG与胶乳的非特异性凝集。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述抑制剂选自尿素和BSA中的至少一种;
优选的,所述抑制剂包括尿素和BSA。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述第一混合液由变性IgG溶液与尿素溶液和BSA溶液混合得到;
优选地,每70μl变性IgG溶液对应使用60-1000μl尿素溶液;
其中,变性IgG溶液中的变性IgG浓度为10-50mg/ml,优选为8-12mg/ml;尿素溶液中的尿素浓度为7-9mol/L;
优选地,每70μl变性IgG溶液对应使用250-500μl尿素溶液。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,每70μl变性IgG溶液对应使用25-125μlBSA溶液;其中,BSA溶液中的BSA含量为8%-12%;
优选地,每70μl变性IgG溶液对应使用25-50μl BSA溶液。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:在室温下搅拌所述第二混合溶液反应2-4h。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:在反应结束后,离心所述第二混合溶液,用封闭液重悬沉淀,得到所述类风湿因子检测试剂;
优选地,所述封闭液为8-12mM的PBS溶液,其含有:0.1%-0.5%吐温20,0.1%-1%BSA和5%-10%保护剂;
优选地,所述保护剂为蔗糖或海藻糖。
7.根据权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述胶乳溶液中的胶乳粒子选自聚苯乙烯羧基胶乳、氨基胶乳、磁珠和胶体金中的任意一种;
优选地,所述胶乳溶液中的胶乳粒子的粒径为100-200nm,进一步优选为180nm。
8.一种类风湿因子检测试剂,其特征在于,其由权利要求1-7任一项所述的方法制得。
9.一种类风湿因子检测试剂盒,其特征在于,其含有权利要求8所述的类风湿因子检测试剂;
优选地,所述类风湿因子检测试剂盒还含有保存缓冲液;
优选地,所述保存缓冲液选择Tris-HCl、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液和磷酸盐缓冲液中的任意一种;
优选地,所述保存缓冲液的浓度为10-100mM、离子强度为200-800mM、pH为7.0-8.5。
10.一种检测类风湿因子的方法,其特征在于,其包括:使用权利要求8所述的类风湿因子检测试剂或权利要求9所述的类风湿因子检测试剂盒进行检测。
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