CN112858671A - 制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法，涉及类风湿因子检测技术领域。本发明公开的制备方法将含有变性IgG与抑制剂的第一混合溶液与胶乳溶液混合，得到第二混合溶液；其中，抑制剂用于抑制变性IgG与胶乳的非特异性凝集。采用本发明制备方法制备类风湿因子检测试剂可以降低IgG的使用量，成本低，所制得的类风湿因子检测试剂批间重复性好，稳定性高。

Description

制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂 盒和检测方法

技术领域

本发明涉及类风湿因子检测技术领域，具体而言，涉及一种制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法。

背景技术

类风湿因子(rheumatoid factor，RF)是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，主要成分为IgM类型抗体，也有IgG类、IgA类、IgD类和IgE 类。研究表明类风湿因子的阳性率在正常人中只有2％，老年人中有5％，而在类风湿关节炎(RA)患者中有80％的阳性率。因此RF作为RA诊断的指标有重要价值。

目前对RF检测的方法有乳胶凝集法，ELISA夹心法和胶乳增强免疫比浊法等。其中胶乳增强比浊法的增强原理，是将变性IgG偶联到胶乳微球表面，在与RF反应时浊度得到大幅提高，从而起到信号放大的作用。

但目前，基于胶乳增强比浊法检测的RF检测试剂在其制备过程中经常容易出现IgG使用量高，批间重复性差、RF检测试剂成品后期的稳定性也低等一些问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备类风湿因子检测试剂的方法、类风湿因子检测试剂、试剂盒和检测方法。采用本发明制备方法制备类风湿因子检测试剂可以降低IgG的使用量，成本低，所制得的类风湿因子检测试剂批间重复性好，稳定性高。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种制备类风湿因子检测试剂的方法，其包括：将含有变性IgG与抑制剂的第一混合溶液与胶乳溶液混合，得到第二混合溶液；

其中，所述抑制剂用于抑制变性IgG与胶乳的非特异性凝集。

本发明的发明人首次发现，现有的将变性IgG偶联到胶乳微球表面过程中，IgG变性过程中暴露出很多疏水基团，这些疏水基团在跟胶乳混合时，容易产生剧烈凝集，由于产生非特异性凝集，导致抗原表位被屏蔽，很多抗原没有得到充分利用，使得试剂成本增加，交联过程凝集的产生也会影响试剂批间差及后期的稳定性。

基于此，本发明实施例提出的制备类风湿因子检测试剂的方法，先使变性IgG与抑制剂混合，再与胶乳溶液混合，其中的抑制剂能够抑制变性 IgG与胶乳的非特异性凝集，通过该抑制剂的使用，大大地减少变性IgG与胶乳的非特异性凝集，使其抗原表位被充分暴露，进而得到充分利用，减少IgG的使用量，降低成本，批间重复性好。此外，由该制备方法所制得的类风湿因子检测试剂，稳定性也好，由于其中的变性IgG的抗原表位被充分暴露，其在检测的过程中也具有较好的灵敏度和特异性。

需要说明的是，抑制剂的类型可以是多种多样的，例如在可选的实施方式中，所述抑制剂选自尿素和BSA中的至少一种。只要其具有抑制变性 IgG与胶乳的非特异性凝集的作用，均可以用作本发明的抑制剂，因此，只要是将具有抑制变性IgG与胶乳的非特异性凝集作用的物质用于本发明，无论其类别如何，均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述第一混合液由变性IgG溶液与尿素溶液和 BSA溶液混合得到。

在可选的实施方式中，每70μl变性IgG溶液对应使用60-1000μl尿素溶液。其中，变性IgG溶液中的变性IgG浓度为10-50mg/ml；尿素溶液中的尿素浓度为7-9mol/L。

在可选的实施方式中，变性IgG溶液中的变性IgG浓度为8-12mg/ml。

本发明实施例研究发现，合适浓度的尿素有利于提高制得的类风湿因子检测试剂的检测效果。例如每70μl变性IgG溶液(8-12mg/ml)对应使用 60-1000μl尿素溶液(7-9mol/L)。

在可选的实施方式中，每70μl变性IgG溶液对应使用250-500μl尿素溶液。

本发明实施例进一步研究发现，将每70μl变性IgG溶液(8-12mg/ml) 对应使用250-500μl尿素溶液(7-9mol/L)进行混合后，这样，所制得的类风湿因子检测试剂的检测效果有明显提高。

在可选的实施方式中，每70μl变性IgG溶液对应使用25-125μl BSA 溶液；其中，BSA溶液中的BSA含量为8％-12％。

本发明实施例研究发现，合适浓度的BSA有利于提高制得的类风湿因子检测试剂的检测效果，例如，每70μl变性IgG溶液(8-12mg/ml)对应使用25-125μl BSA溶液(8％-12％)。

在可选的实施方式中，每70μl变性IgG溶液对应使用25-50μl BSA溶液。

本发明实施例进一步研究发现，将每70μl变性IgG溶液(10-50mg/ml) 对应使用25-50μl BSA溶液(8％-12％)进行混合，这样，所制得的类风湿因子检测试剂的检测效果有明显提高。

在可选的实施方式中，所述方法还包括：在室温下搅拌所述第二混合溶液反应2-4h。

在可选的实施方式中，所述方法还包括：在反应结束后，离心所述第二混合溶液，用于封闭液重悬沉淀，得到所述类风湿因子检测试剂；

在可选的实施方式中，所述封闭液为8-12mM的PBS溶液，其含有： 0.1％-0.5％吐温20，0.1％-1％BSA和5％-10％保护剂。

在可选的实施方式中，所述保护剂选自蔗糖或海藻糖。

需要说明的是，除蔗糖和海藻糖之外，使用其他保护剂也属于本发明的保护范围。

本发明对胶乳粒子的类别不作特别限定，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，例如，在可选的实施方式中，所述胶乳溶液中的胶乳粒子选自聚苯乙烯羧基胶乳。无论使用何种胶乳粒子，无论其粒径大小，只要其在偶联变性IgG的过程中，使用了上述抑制剂即属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，所述胶乳溶液中的胶乳粒子的粒径150-200nm。

第二方面，本发明实施例提供一种类风湿因子检测试剂，其由前述实施方式任一项所述的方法制得。

该类风湿因子检测试剂具有较好的检测效果、以及具有较好的灵敏度、特异性和稳定性，可用于类风湿因子的检测以及类风湿关节炎的诊断。

第三方面，本发明实施例提供一种类风湿因子检测试剂盒，其含有前述实施方式所述的类风湿因子检测试剂。

在可选的实施方式中，所述类风湿因子检测试剂盒还含有保存缓冲液。

在可选的实施方式中，所述保存缓冲液选择Tris-HCl、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液和磷酸盐缓冲液中的任意一种。

保存缓冲液用于控制反应体系的PH、离子强度等反应环境，提高检测效果。

在可选的实施方式中，所述保存缓冲液的浓度为10-100mM、离子强度为200-800mM、pH为7.0-8.5。

在可选的实施方式中，所述类风湿因子检测试剂盒还含有甘氨酸缓冲液。

第四方面，本发明实施例提供一种检测类风湿因子的方法，其包括：使用前述实施方式所述的类风湿因子检测试剂或试剂盒进行检测。

在可选的实施方式中，上述检测方法以非疾病的诊断为目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实验例1中采用实施例1-6的类风湿因子检测试剂检测不同浓度校准品的反应度曲线图，图中横坐标为校准品浓度。

图2为实验例2中采用实施例7-10的类风湿因子检测试剂检测不同浓度校准品的反应度曲线图，图中横坐标为校准品浓度。

图3为实验例4中对比例1-4的类风湿因子检测试剂检测不同浓度校准品的反应度曲线图，图中横坐标为校准品浓度。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

本发明实施例中所用材料信息如下：

胶乳：JSR公司制造；

变性IgG：浓度10mg/ml；

EDC：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；

NHS：N-羟基琥珀酰亚胺(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；

BSA：默克公司；

尿素：上海西宝生物。

实施例1

本实施例提供的制备类风湿因子检测试剂的方法，其包括如下步骤：

1胶乳活化

(a)取160μl粒径为188nm的10％(质量百分比)聚苯乙烯羧基胶乳，用10mM的HEPES(PH7.5)缓冲溶液定容至2ml；

(b)向步骤(a)缓慢加入50μl(10mg/ml)EDC溶液、50μl(10mg/ml) NHS溶液，室温搅拌反应20min后，用10mM的HEPES(PH7.5)缓冲溶液定容至10ml，得到胶乳溶液，胶乳终浓度约为0.16％(质量百分比)。

2偶联

(c)取70μl变性IgG溶液，加入50μl浓度为10％BSA以及62.5μl浓度为8mol/L的尿素进行稀释，得到第一混合液；

(d)将第一混合液缓慢加入到胶乳溶液中，得到第二混合液，室温搅拌反应3h。

3重悬

(e)第二混合液于15000rpm离心40min，使用10mM PBS(含0.2％吐温20(质量百分比)、0.1％BSA(质量百分比)和10％蔗糖(质量百分比))超声重悬，即得到本实施例的类风湿因子检测试剂。

实施例2-6

实施例2-6的制备方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(c) 中的尿素用量不同，具体如下：

实施例2：尿素(8mol/L)用量为125μl；

实施例3：尿素(8mol/L)用量为250μl；

实施例4：尿素(8mol/L)用量为500μl；

实施例5：尿素(8mol/L)用量为750μl；

实施例6：尿素(8mol/L)用量为1000μl。

实施例7-10

实施例7-10的制备方法与实施例3基本相同，不同的是，在步骤(c) 中的BSA用量不同，具体如下：

实施例7：BSA(10％)用量为25μl；

实施例8：BSA(10％)用量为75μl；

实施例9：BSA(10％)用量为100μl；

实施例10：BSA(10％)用量为125μl。

实验例1

使用实施例1-6提供的类风湿因子检测试剂对类风湿因子进行检测。

测试仪器：迈瑞BS-480；

实验试剂：使用50mM甘氨酸缓冲液作为RF检测试剂1，用于控制反应体系的环境，提高检测效果，实施例1-6提供的类风湿因子检测试剂作为 RF检测试剂2，组成本实验检测试剂；

校准品：使用RF病人血清标本进行稀释，得到不同浓度的校准品：0、 11.5、18.5、40、85以及150IU/ml；

检测参数：见下表1；

表1

样本量(μl)	2.5
		RF检测试剂1(μl)	200
RF检测试剂2(μl)	50
		检测波长(nm)	660
读点1	51-51
		读点2	65-65

基于胶乳增强免疫比浊法原理，采用上述检测试剂进行检测，操作如下：

1.在反应杯中加入200ul RF检测试剂1，37度孵育117秒；

2.在步骤1中加入2.5ul待测样本，混匀后37度孵育333秒；

3.加入50ul RF检测试剂2，混合后等待9秒，测试660nm的吸光度 A1；

4.反应120秒，测试660nm的吸光度A2；

5.计算吸光度差值△A＝A2-A1。

实施例1-6的检测结果见下表2和图1。

说明：表2-表7中的数值代表的是反应度，是由△A值乘以10000得到。

表2采用实施例1-6的类风湿因子检测试剂检测RF病人血清标本的反应度结果

校准品浓度(IU/ml)	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
							0	2032.3	222	47.2	3.5	591.6	1451.3
11.5	3522	1502	556	544	2749	3692
							18.5	4145	2410	765	1023	3440	4349
40	5250	4425	2142	2051	4562	5422
							85	6855	7444	4810	4011	6085	6919
150	7936	8582	8197	7296	7723	8104
							试剂空白	7399	5230	5098	4877	5463	8418

试剂空白是指测试水时的A2，然后乘以10000转换为反应度；0点的反应度相当于测试水或者稀释液的反应度，具体是A2-A1，然后乘以10000 转换为反应度。

由表2可以看出，相较于其他实施例，检测试剂空白时，实施例3和实施例4的反应度较低，且实施例3和实施例4在检测0IU/ml校准品的反应度最低，由图1可知，实施例3和实施例4的曲线趋势较其他实施例更佳，可见，将尿素用量控制在250～500μl之间具有更好的检测效果。

实验例2

使用实施例7-10提供的类风湿因子检测试剂对类风湿因子进行检测，检测方法同实验例1，结果见下表3和图2

表3

由表3和图2可以看出，BSA控制在25～50μl之间，检测0IU/ml校准品和反应曲线趋势最佳，BSA优选范围在25～50μl之间。

实验例3

按照实施例3的方法制备多批次的类风湿因子检测试剂，分别是 20190515批、20190516批、20190615批和20190616批。按实验例1的方法将上述不同批次的试剂用于检测类风湿因子，结果见下表4。

表4

从表4可以看出，不同时间制备出的不同批次试剂，测试相同浓度的标本，反应度变异系数都小于10％，说明实施例3的制备方法具有较好的批间差控制能力。

实验例4

设置对比例1-4，对比例1-4的制备方法与实施例3基本相同，不同的是，在步骤(c)中的变性IgG、尿素和BSA用量不同，具体如下：

对比例1：变性IgG(10mg/ml)用量为70μl，尿素和BSA均不添加；

对比例2：变性IgG(10mg/ml)用量为90μl，尿素和BSA均不添加；

对比例3：变性IgG(10mg/ml)用量为110μl，尿素和BSA均不添加；

对比例4：变性IgG(10mg/ml)用量为140μl，尿素和BSA均不添加；

使用对比例1-4提供的类风湿因子检测试剂对类风湿因子进行检测，方法同实验例1，结果见下表5和图3。

表5

根据表5和图3，实施例3的类风湿因子检测试剂的检测效果最佳，而不添加尿素和BSA的其他条件，反应效果都很差，空白也很高，说明在不添加尿素和BSA的情况下已经发生不可逆的凝集，随着变性IgG的加入量增加，凝集程度和反应曲线有一定改善，但要达到添加尿素和BSA的效果，变性IgG的加入量可能需要增加2倍以上；由此说明，本发明实施例提供的类风湿因子检测试剂可以减少变性IgG的使用量。

实验例5

设置对比例5-8，对比例5-8制备方法与实施例3基本相同，不同的是，在步骤(c)中的变性IgG、尿素和BSA用量不同，具体如下：

对比例5：尿素(8mmol/L)用量为62.5μl，BSA(10％)用量为0μl；

对比例6：尿素(8mmol/L)用量为125μl，BSA(10％)用量为0μl；

对比例7：尿素(8mmol/L)用量为250μl，BSA(10％)用量为0μl；

对比例8：尿素(8mmol/L)用量为500μl，BSA(10％)用量为0μl。

使用对比例5-8的类风湿因子检测试剂对类风湿因子进行检测，方法同实验例1，结果见下表6。

表6

由表6可知，相较于实施例3，对比例5-8单独添加尿素，但检测试剂空白和0浓度校准品的反应度都很高，且曲线趋势很差，说明单独添加尿素不能获得较好的类风湿因子检测试剂。

实验例6

实施例21-25

设置对比例9-12，对比例9-12的制备方法与实施例3基本相同，不同的是，在步骤(c)中的尿素和BSA用量不同，具体如下：

对比例9：尿素(8mmol/L)用量为0μl，BSA(10％)用量为25μl；

对比例10：尿素(8mmol/L)用量为0μl，BSA(10％)用量为50μl；

对比例11：尿素(8mmol/L)用量为0μl，BSA(10％)用量为75μl；

对比例12：尿素(8mmol/L)用量为0μl，BSA(10％)用量为100μl。

使用对比例9-12提供的类风湿因子检测试剂对类风湿因子进行检测，方法同实验例1，结果见下表7。

表7

由表7可知，相较于实施例3，对比例9-12单独添加BSA，但检测试剂空白和0浓度校准品的反应度都很高，且曲线趋势很差，说明单独添加 BSA不能获得较好的检测试剂。上述实验充分说明，BSA和尿素组合在一起时可以发挥更好的抑制变性IgG与胶乳的非特异性凝集效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备类风湿因子检测试剂的方法，其特征在于，其包括：将含有变性IgG与抑制剂的第一混合液与胶乳溶液混合，得到第二混合溶液；

其中，所述抑制剂用于抑制变性IgG与胶乳的非特异性凝集。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制剂选自尿素和BSA中的至少一种；

优选的，所述抑制剂包括尿素和BSA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一混合液由变性IgG溶液与尿素溶液和BSA溶液混合得到；

优选地，每70μl变性IgG溶液对应使用60-1000μl尿素溶液；

其中，变性IgG溶液中的变性IgG浓度为10-50mg/ml，优选为8-12mg/ml；尿素溶液中的尿素浓度为7-9mol/L；

优选地，每70μl变性IgG溶液对应使用250-500μl尿素溶液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，每70μl变性IgG溶液对应使用25-125μlBSA溶液；其中，BSA溶液中的BSA含量为8％-12％；

优选地，每70μl变性IgG溶液对应使用25-50μl BSA溶液。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在室温下搅拌所述第二混合溶液反应2-4h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在反应结束后，离心所述第二混合溶液，用封闭液重悬沉淀，得到所述类风湿因子检测试剂；

优选地，所述封闭液为8-12mM的PBS溶液，其含有：0.1％-0.5％吐温20，0.1％-1％BSA和5％-10％保护剂；

优选地，所述保护剂为蔗糖或海藻糖。

7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述胶乳溶液中的胶乳粒子选自聚苯乙烯羧基胶乳、氨基胶乳、磁珠和胶体金中的任意一种；

优选地，所述胶乳溶液中的胶乳粒子的粒径为100-200nm，进一步优选为180nm。

8.一种类风湿因子检测试剂，其特征在于，其由权利要求1-7任一项所述的方法制得。

9.一种类风湿因子检测试剂盒，其特征在于，其含有权利要求8所述的类风湿因子检测试剂；

优选地，所述类风湿因子检测试剂盒还含有保存缓冲液；

优选地，所述保存缓冲液选择Tris-HCl、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液和磷酸盐缓冲液中的任意一种；

优选地，所述保存缓冲液的浓度为10-100mM、离子强度为200-800mM、pH为7.0-8.5。

10.一种检测类风湿因子的方法，其特征在于，其包括：使用权利要求8所述的类风湿因子检测试剂或权利要求9所述的类风湿因子检测试剂盒进行检测。

Images