JPH1194833A - 抗ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ抗体免疫測定用抗原及び組換えヒト甲状腺ペルオキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗ｈＴＰＯ抗体を測定するための抗原として
用いた場合に、従来のＣＨＯ細胞を宿主として遺伝子工
学的手法により製造したｈＴＰＯを抗原として用いた場
合よりも高い測定感度を得ることができる、抗ｈＴＰＯ
抗体の免疫測定用抗原を提供すること。 【解決手段】 ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ遺伝子又は
該遺伝子の１若しくは複数の塩基が置換され若しくは欠
失され、若しくは該遺伝子に１若しくは複数の塩基が付
加若しくは挿入された核酸を昆虫細胞中で発現させて得
られた組換えヒト甲状腺ペルオキシダーゼ又はその誘導
体であって抗ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ抗体と抗原抗
体反応を行うものから成る、抗ヒト甲状腺ペルオキシダ
ーゼ抗体免疫測定用抗原を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗ヒト甲状腺ペル
オキシダーゼ抗体の免疫測定のための抗原及び新規な組
換えヒト甲状腺ペルオキシダーゼ誘導体に関する。

【０００２】甲状腺病の患者は、ヒト甲状腺ペルオキシ
ダーゼ（以下、「ｈＴＰＯ」ということがある）に対す
る自己抗体を有しており、甲状腺病の診断のために抗ｈ
ＴＰＯ抗体を測定することが行われている。抗ｈＴＰＯ
抗体はまた、自己免疫性甲状腺疾患のみならず、重症筋
無力症、ルポイト肝炎、インシュリン依存性小児糖尿病
等の疾患においても上昇することが報告されている。

【０００３】従来より、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞を宿主とした遺伝子工学的手法により製
造したｈＴＰＯが、抗ｈＴＰＯ抗体の免疫測定のための
抗原として用いられている（特開平３−９１４８７号公
報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＣＨＯ細胞を宿主とし
て遺伝子工学的手法により製造したｈＴＰＯを抗原とし
て用いて抗ｈＴＰＯ抗体を免疫測定すると、満足できる
測定感度が得られないという問題があった。

【０００５】従って、本発明の目的は、抗ｈＴＰＯ抗体
を測定するための抗原として用いた場合に、従来のＣＨ
Ｏ細胞を宿主として遺伝子工学的手法により製造したｈ
ＴＰＯを抗原として用いた場合よりも高い測定感度を得
ることができる、抗ｈＴＰＯ抗体の免疫測定用抗原を提
供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本願発明者は、鋭意研究
の結果、昆虫細胞を宿主細胞として遺伝子工学的手法に
より製造したｈＴＰＯを、抗ｈＴＰＯ抗体の免疫測定用
抗原として用いることにより、ＣＨＯ細胞を宿主として
遺伝子工学的手法により製造したｈＴＰＯを抗原として
用いた場合よりも測定感度が大幅に向上するという、驚
くべき知見を得て本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、ヒト甲状腺ペルオキ
シダーゼ遺伝子又は該遺伝子の１若しくは複数の塩基が
置換され若しくは欠失され、若しくは該遺伝子に１若し
くは複数の塩基が付加若しくは挿入された核酸を昆虫細
胞中で発現させて得られた組換えヒト甲状腺ペルオキシ
ダーゼ又はその誘導体であって抗ヒト甲状腺ペルオキシ
ダーゼ抗体と抗原抗体反応を行うものから成る、抗ヒト
甲状腺ペルオキシダーゼ抗体免疫測定用抗原を提供す
る。

【０００８】また、本願発明者は、マンノース型の糖鎖
を有し、ｈＴＰＯの膜貫通領域を除去したｈＴＰＯ誘導
体を初めて提供した。すなわち、本発明は、配列表の配
列番号１で表わされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列
において１若しくは複数のアミノ酸残基が置換され若し
くは欠失され、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複
数のアミノ酸残基が付加若しくは挿入されたアミノ酸配
列を有し、抗ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ抗体と抗原抗
体反応を行うものから成り、かつマンノース型糖鎖を有
する、組換えヒト甲状腺ペルオキシダーゼ誘導体を提供
する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の抗ｈＴＰＯ抗体免疫測定
用抗原は、昆虫細胞を宿主として遺伝子工学的に製造さ
れたものであり、従ってマンノース型の糖鎖を有してい
ることを特徴とする。天然のｈＴＰＯや、ＣＨＯ細胞を
宿主として遺伝子工学的に製造されたｈＴＰＯは、宿主
が哺乳動物細胞であるので、糖鎖は複合型であり、マン
ノース型ではない。このように、本発明の免疫測定用抗
原は、糖鎖において天然の抗原や従来の遺伝子工学的に
製造された抗原とは異なっている。

【００１０】本発明の免疫測定用抗原のアミノ酸配列
は、天然型のｈＴＰＯと同じであってよい。もっとも、
抗原の用途は抗ｈＴＰＯ抗体の免疫測定用であるから、
ｈＴＰＯと特異的に抗原抗体反応を行うことができれば
その目的を達成することができるのであり、ペルオキシ
ダーゼとしての酵素活性やｈＴＰＯのその他の理化学的
性質を必ずしも有している必要はない。すなわち、ｈＴ
ＰＯ遺伝子の１若しくは複数の塩基が置換され若しくは
欠失され、若しくは該遺伝子に１若しくは複数の塩基が
付加若しくは挿入された核酸を昆虫細胞中で発現させて
得られた組換えｈＴＰＯ誘導体であって抗ｈＴＰＯ抗体
と抗原抗体反応を行うものも本発明の免疫測定用抗原に
包含される。特に、抗原性は、タンパク質の一部分のみ
によっても得られるので、ｈＴＰＯの一部分のみから成
るｈＴＰＯ誘導体であって、抗ｈＴＰＯ抗体と抗原抗体
反応を行うものは、当然本発明の範囲内に含まれる。

【００１１】このようなｈＴＰＯ誘導体の好ましい例と
して、ｈＴＰＯの膜貫通領域を欠失したものを挙げるこ
とができる。ｈＴＰＯの膜貫通領域を欠失させることに
より、昆虫細胞内で発現されたｈＴＰＯ誘導体を分泌型
にすることができるので、膜貫通領域を有する完全なｈ
ＴＰＯよりも大量のｈＴＰＯ誘導体を容易に得ることが
でき、また、精製が容易である。

【００１２】下記実施例で作製した、膜貫通領域を欠失
させたｈＴＰＯ誘導体のアミノ酸配列を配列表の配列番
号１に示す。また、該アミノ酸配列をコードする、下記
実施例で作製されたＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示
す。なお、該アミノ酸配列において１若しくは複数のア
ミノ酸残基が置換され若しくは欠失され、若しくは該ア
ミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸残基が付加若し
くは挿入されたアミノ酸配列を有し、抗ｈＴＰＯ抗体と
抗原抗体反応を行うものも本発明の範囲に当然含まれ
る。もっとも、測定対象は抗ｈＴＰＯポリクローナル抗
体、すなわち、ｈＴＰＯの種々の領域をエピトープとす
る抗体の混合物であるから、膜貫通領域以外の部分はで
きるだけ削除しない方が測定感度が高くなる。また、ア
ミノ酸の置換、欠失、挿入等もできるだけ少ない方が測
定感度が高くなる。このような観点から、本発明の免疫
測定用抗原は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と６
０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好まし
くは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性
を有していることが好ましい。

【００１３】ｈＴＰＯのｃＤＮＡの塩基配列は公知であ
り、また、ｈＴＰＯのｃＤＮＡは市販されている。ま
た、昆虫細胞を宿主として外来遺伝子を発現させるため
の宿主−ベクター系も周知であり、市販もされている。
従って、本発明の免疫測定用抗原は、これらの市販のｃ
ＤＮＡ及び昆虫細胞の宿主−ベクター系を用いた遺伝子
工学的手法により容易に調製することができる。また、
ｈＴＰＯｃＤＮＡ中のどの部分が膜貫通領域であるかと
いうこともわかっているので、下記実施例に記載される
ように、膜貫通領域以外の部分をＰＣＲで増幅したＤＮ
Ａを用いることにより、膜貫通領域を欠失させたｈＴＰ
Ｏ誘導体を調製することができる。

【００１４】本発明の抗ｈＴＰＯ抗体免疫測定用抗原
は、従来の抗ｈＴＰＯ抗体免疫測定用抗原と全く同様に
して用いることができる。すなわち、免疫測定の方法自
体は何ら限定されるものではなく、反応様式で分類すれ
ばサンドイッチ法、競合法、凝集法等のいずれにも用い
ることができ、また、標識で分類すれば酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定
法（ＲＩＡ）等のいずれにも用いることができる。これ
らの免疫測定方法自体は周知であり、下記実施例にも一
例が具体的に記載されている。

【００１５】本発明の免疫測定用抗原を用いた免疫測定
は、甲状腺疾患、重症筋無力症、ルポイト肝炎、インシ
ュリン依存性小児糖尿病等の疾患の診断に有用である。
また、検体は、何ら限定されないが、血清、血液等の体
液を挙げることができる。

【００１６】上記のように、マンノース型の糖鎖を有
し、ｈＴＰＯの膜貫通領域を除去したｈＴＰＯ誘導体
は、初めて提供されたものであり、従って、本発明は、
配列番号１で表わされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配
列において１若しくは複数のアミノ酸残基が置換され若
しくは欠失され、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは
複数のアミノ酸残基が付加若しくは挿入されたアミノ酸
配列を有し、抗ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ抗体と抗原
抗体反応を行うものから成り、かつマンノース型糖鎖を
有する、組換えヒト甲状腺ペルオキシダーゼ誘導体自体
をも提供する。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００１８】実施例１ ｈＴＰＯの調製 Ｉ 材料及び方法 TPO 遺伝子は、市販cDNA（商品名Thyroid Gland 、CLON
TECH社より市販）を使用した。また、発現ベクターは、
pBacPK9 (CLONTECH 社）を使用した。

【００１９】(1) TPO 遺伝子のクローニング 膜貫通ドメイン領域を削除するため、次のプライマーに
よりPCR を実施した。 プライマー１ GTGGAATTCATGAGAGCGCTGGCTGTGCTGTCTGTC プライマー２ GCGCATTTTAAGCGGCCGCCTAAGTCGCCCGAGGGA
GCCTCC PCR 反応液組成は、100 μｌ中、10×LA PCR Buffer I
I、25mM MgCl₂, 10mM dNTP mix,5U TaKaRa LA Taq, 50
μＭプライマー、1.0 μｌcDNAである(TaKaRaLA PCR k
it（宝酒造社より市販）を使用）。ＰＣＲの反応は、94
℃ 1 分、60℃ 5 分 72℃ 10分の30サイクルであった。

【００２０】発現ベクターpBacPk9 および、PCR 増幅産
物を制限酵素EcoRI とNotIで37℃ 1 時間消化した。制限酵素処理したDNA 断片と発現ベク
ターをライゲーション反応した。反応は、15℃、一昼夜
反応させた。ligation kit(TAKARA 、（宝酒造社製））
を使用した。このDNA 溶液を、コンピテントセル（大腸
菌XL1-Blue）100μｌに加える。氷中で30分置、42℃ 4
5秒インキュベートし、再度氷中に２分間置いた。SOC
培地500 μｌ加え、37℃1 時間インキュベートした。ア
ガロースカンテンプレートに100 μｌまき、37℃一昼夜
インキュベーション後、シングルコロニーを採取した。
次に、塩化セシウム密度勾配による超遠心により、プラ
スミドを精製した。

【００２１】(2) 組み換えウイルスの作成およびクロ
ーニング 昆虫培養用細胞（SF9 ）を35mmプレートに1 ×10⁶ 撒い
た。無血清培地SF II900 (GBCO BRL 社）で2 回細胞を
洗浄後、1ml のSF900IISFMを加えた。

【００２２】コートランスフォーメーション用溶液を次
の組成で作成した。プラスミドDNA5μｇ、バキュロウイ
ルスＤＮＡ（制限酵素、Bsu36I処理AcMNPV viral DNA、
CLONTECH社）0.1 μｇ、滅菌水2 μｌ、にあらかじめ滅
菌水で2 倍に希釈したリポフェクチン（GIBCO BRL ）８
μｌを加えた。室温で30分保存し、培養細胞に滴下し
た。27℃で24時間培養後、10％血清含グレース培地を1m
l 加え、更に27℃で3日間培養した。培養上清を採取
し、これをP1ウイルス溶液とする。次に、プラックアッ
セイによりウイルスをクローニングをした。昆虫細胞を
35mmプレートに1×10⁶ まき、ウイルス希釈液（10倍、1
00 倍、1000倍）を100 μｌ加え、室温で30分感染させ
た。1 ％アガロース1ml をゆっくり重層し、10％血清含
グレース培地を1ml 加え27℃4 日培養した。ニュートラ
ルレッドを加え27℃、１日培養し、プラックを採取し
た。

【００２３】(3) 組み換えウイルスの増殖とタンパク
発現 クローン化したウイルスを、SF9 細胞3 ×10⁶ に感染さ
せ、27℃4 日間培養しウイルスを増幅させた。次に、SF
9 細胞3 ×10⁷ に一細胞当たり10PFU になるようにウイ
ルスを感染させ、27℃4 日間培養後、培養上清を採取し
た。

【００２４】II 発現タンパクの精製法 培養上清をPBS で透析後、Q-セファロースカラム（ファ
ルマシア）で分離した。平衡バッファーは、50mM Tris-
HCl pH8.0, 100mM KCl, 0.1M NaCl 、溶出バッファー
は、50mM Tris-HCl pH8.0, 100mM KCl, 2M NaCl の塩濃
度勾配により溶出させた。

【００２５】アフィニティクロマトグラフにより、精製
した。リガンド固定用アフィニティ担体は、ホルミル−
セロファイン（生化学工業社製）を使用した。平衡バッ
ファーは、Tris-HCl pH8.0, 溶出バッファーは、2M KSC
N, 50mM Tris-HCl pH8.0, 2MNaCl でおこなった。カラ
ムは、常法通りにTPO モノクローナル抗体（アドバンス
・イムノケミカル社製）を結合させた。

【００２６】III 発現タンパクの確認 (1) 蛍光抗体による確認 組換えウイルスをプラックアッセイ後、ウイルスの増幅
をおこなった細胞を遠心により集めた。PBS で洗浄後、
スライドにスポットした。室温で乾燥させ、冷アセトン
に１０分間置き、一昼夜乾燥させた。次に、ＴＰＯモノ
クローナル抗体（5 μｇ/ml ）100 μｌを加え、37℃１
時間反応した。PBS で3 回洗浄後、FITC標識抗マウスIg
G （120 倍）を100 μｌ加え、37℃20分反応させ、蛍光
顕微鏡で確認した。

【００２７】結果 発現させた細胞は、アップルグリーンに発色したが、発
現させていない細胞は発色していなかった。

【００２８】(2) EIA による確認 EIA プレートにTPO 抗マウスIgG モノクローナル抗体を
（10μｇ/ml ）PBS で希釈し、100 μｌずつスポットし
た。4 ℃一昼夜置き、PBS で３回洗浄後、1 ％BSA/PBS2
00μｌを加え、室温で1 時間反応した。PBS+Tween20
（商品名）で3 回洗浄後した。このプレートを使用し
て、発現細胞培地上清を100 μｌ使用し、室温で1 時間
反応させた。二次抗体は、甲状腺疾患患者(TPO陽性患
者）の血清1000倍希釈を使用し、100 μｌを加え、室温
で1 時間反応させた。標識抗体は、ペルオキシダーゼ標
識抗ヒトIgG 25000 倍希釈を使用した。基質はバイオラ
ッド社のTMB を用いた。アッセイは、常法に従った。ま
た、標準物質は、ヒト甲状腺組織より精製したものを使
用した。

【００２９】結果 hTPOは、10μｇ/ml の発現が確認された。コントロール
として、発現させていない培養上清では、吸光は示さな
かった。

【００３０】(3) SDS-PAGEによる確認 発現タンパクを10％ポリアクリルアミドゲルでSDS 電気
泳動した。コントロールとしてヒト甲状腺組織から精製
したTPO を用いた。得られた電気泳動パターンの模式図
を図３に示す。

【００３１】結果 天然型TPO は、107kDaであるのに対しバキュロウイルス
発現系によるhTPOは、膜貫通ドメインを除去したTPO の
ため分子量約100KDaであった。

【００３２】IV 抗体測定用EIA プレートの作製 精製したhTPOを96ウエルマイクロプレートに各ウエルあ
たり0.5 μｇ固相した。コーティングバッファーは、カ
ーボネートバッファー（pH9.0 ）を使用した。以下ブロ
ッキングおよび標識抗体と基質は、上記III(2)のものと
同じものを使用し、上記と同様に実施した。標準血清
は、WHO 血清（66/387) を使用し、検量線を作成した。
また、ＣＨＯ細胞を宿主として、完全長ｃＤＮＡの全領
域を発現させて得られた組換えｈＴＰＯを抗原として用
いた市販のキットとの比較検討を行った。反応液は市販
のキットのものを用い、また、抗原固相量は、市販のキ
ットに合わせて0.5 μｇ／wellとした。キット比較で
は、100 検体数を対象に実施した。

【００３３】結果 得られた検量線を図１に示す。検量線に示されるよう
に、検出感度は、1.9U〜1250U まで測定可能であった。
また、図２に示されるように、本発明の抗原を用いた場
合には、低値での検出感度が約１０倍近く市販品よりも
高かった。

【００３４】(4) サイログロブリン吸収試験 ＥＩＡをおこなう前に、サイログロブリンによる影響を
検定するために、検体にサイログロブリン抗原を添加し
37℃30分反応させた後、抗TPO 抗体を測定した。 結果、サイログロブリンを添加前後で、抗TPO 抗体値の
変動は認められなかった。

【００３５】Ｖ 糖鎖解析 ヒト甲状腺組織から精製したTPO とバキュロウイルスで
発現させたｈＴＰＯを用いて解析した。解析試薬は、GL
YKO 社のFACEを使用した。以下、常法に従った。それぞ
れ糖タンパク質として（50μｇ〜200 μｇ）を使用し
た。これに、5 ％SDS 及び緩衝液、2ME を加え100 ℃、
5 分間加熱した。次に、7.5 ％NP40 ,緩衝液を加え、37
℃2 時間反応させた。反応後、エタノールを加え氷中で
10分間置き、遠心後上清を分取し乾燥させた。ここに、
還元剤を加え、45℃一昼夜反応させ、N 結合糖鎖分離用
ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。画像解析装置
（FACE）で解析した。ヒト甲状腺組織から精製したTPO
は、複合型糖タンパクが結合し、バキュロウイルス発現
TPO は、マンノース型糖タンパクが結合している。解析
の結果、ネイティブTPO とレコンビナントTPO の糖分解
産物パターンに違いが認められた（図４参照）。また、
レコンビナントTPO の糖鎖パターンは、ネイティブTPO
とは違い、G3,G5 にバンドが認められた。これは、GlcN
acにマンノースが数個結合したN-オリゴ糖であり、ネイ
ティブには、存在しないパターンであることが示唆され
た。

【００３６】

【発明の効果】本発明により、従来のものよりも免疫測
定の感度を向上させることができる抗ヒト甲状腺ペルオ
キシダーゼ抗体免疫測定用抗原が提供された。

【００３７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：８４８ 配列の型：アミノ酸 配列 Met Arg Ala Leu Ala Val Leu Ser Val Thr Leu Val Met Ala Cys Thr 1 5 10 15 Glu Ala Phe Phe Pro Phe Ile Ser Arg Gly Lys Glu Leu Leu Trp Gly 20 25 30 Lys Pro Glu Glu Ser Arg Val Ser Ser Val Leu Glu Glu Ser Lys Arg 35 40 45 Leu Val Asp Thr Ala Met Tyr Ala Thr Met Gln Arg Asn Leu Lys Lys 50 55 60 Arg Gly Ile Leu Ser Pro Ala Gln Leu Leu Ser Phe Ser Lys Leu Pro 65 70 75 80 Glu Pro Thr Ser Gly Val Ile Ala Arg Ala Ala Glu Ile Met Glu Thr 85 90 95 Ser Ile Gln Ala Met Lys Arg Lys Val Asn Leu Lys Thr Gln Gln Ser 100 105 110 Gln His Pro Thr Asp Ala Leu Ser Glu Asp Leu Leu Ser Ile Ile Ala 115 120 125 Asn Met Ser Gly Cys Leu Pro Tyr Met Leu Pro Pro Lys Cys Pro Asn 130 135 140 Thr Cys Leu Ala Asn Lys Tyr Arg Pro Ile Thr Gly Ala Cys Asn Asn 145 150 155 160 Arg Asp His Pro Arg Trp Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Ala Arg Trp 165 170 175 Leu Pro Pro Val Tyr Glu Asp Gly Phe Ser Gln Pro Arg Gly Trp Asn 180 185 190 Pro Gly Phe Leu Tyr Asn Gly Phe Pro Leu Pro Pro Val Arg Glu Val 195 200 205 Thr Arg His Val Ile Gln Val Ser Asn Glu Val Val Thr Asp Asp Asp 210 215 220 Arg Tyr Ser Asp Leu Leu Met Ala Trp Gly Gln Tyr Ile Asp His Asp 225 230 235 240 Ile Ala Phe Thr Pro Gln Ser Thr Ser Lys Ala Ala Phe Gly Gly Gly 245 250 255 Ala Asp Cys Gln Met Thr Cys Glu Asn Gln Asn Pro Cys Phe Pro Ile 260 265 270 Gln Leu Pro Glu Glu Ala Arg Pro Ala Ala Gly Thr Ala Cys Leu Pro 275 280 285 Phe Tyr Arg Ser Ser Ala Ala Cys Gly Thr Gly Tyr Gln Gly Ala Leu 290 295 300 Phe Gly Asn Leu Ser Thr Ala Asn Pro Arg Gln Gln Met Asn Gly Leu 305 310 315 320 Thr Ser Phe Leu Asp Ala Ser Thr Val Tyr Gly Ser Ser Pro Ala Leu 325 330 335 Glu Arg Gln Leu Arg Asn Trp Thr Ser Ala Glu Gly Leu Leu Arg Val 340 345 350 His Ala Arg Leu Arg Asp Ser Gly Arg Ala Tyr Leu Pro Phe Val Pro 355 360 365 Pro Arg Ala Pro Ser Ala Cys Ala Pro Glu Pro Gly Ile Pro Gly Glu 370 375 380 Thr Arg Gly Pro Cys Phe Leu Ala Gly Asp Gly Arg Ala Thr Glu Val 385 390 395 400 Pro Ser Leu Thr Ala Leu His Thr Leu Trp Leu Arg Glu His Asn Arg 405 410 415 Leu Ala Ala Ala Leu Lys Ala Leu Asn Ala His Trp Ser Ala Asp Ala 420 425 430 Val Tyr Gln Asp Ala Arg Lys Val Val Gly Ala Leu His Gln Ile Ile 435 440 445 Thr Leu Arg Asp Tyr Ile Pro Arg Ile Leu Gly Ser Gln Ala Phe Gln 450 455 460 Gln Tyr Val Gly Pro Tyr Glu Gly Tyr Asp Ser Thr Ala Asn Pro Thr 465 470 475 480 Val Ser Asn Val Phe Ser Thr Ala Ala Phe Arg Phe Gly His Ala Thr 485 490 495 Ile His Pro Leu Val Lys Arg Leu Asp Ala Ser Phe Gln Glu His Pro 500 505 510 Asp Leu Pro Gly Leu Trp Leu His Gln Ala Phe Phe Ser Pro Trp Thr 515 520 525 Leu Leu Arg Gly Gly Gly Leu Asp Pro Leu Ile Arg Gly Leu Leu Ala 530 535 540 Arg Pro Ala Lys Leu Gln Val Gln Asp Gln Leu Met Asn Glu Glu Leu 545 550 555 560 Thr Glu Arg Leu Phe Val Leu Ser Asn Ser Ser Thr Leu Asp Leu Ala 565 570 575 Ser Ile Asn Leu Gln Arg Gly Arg Asp His Gly Leu Pro Gly Tyr Asn 580 585 590 Glu Trp Arg Glu Phe Cys Gly Leu Pro Arg Leu Glu Thr Pro Ala Asp 595 600 605 Leu Ser Thr Ala Ile Ala Ser Arg Ser Val Ala Asp Lys Ile Leu Asp 610 615 620 Leu Tyr Lys His Pro Asp Asn Ile Asp Phe Trp Leu Gly Gly Leu Ala 625 630 635 640 Glu Asn Phe Leu Pro Arg Ala Arg Thr Gly Pro Leu Phe Ala Cys Leu 645 650 655 Ile Gly Lys Gln Met Lys Ala Leu Arg Asp Gly His Trp Phe Trp Trp 660 665 670 Glu Asn Ser His Val Phe Thr Asp Ala Gln Arg Arg Glu Leu Glu Lys 675 680 685 His Ser Leu Ser Arg Val Ile Cys Asp Asn Thr Gly Leu Thr Arg Val 690 695 700 Pro Met Asp Ala Phe Gln Val Gly Lys Phe Pro Glu Asp Phe Glu Ser 705 710 715 720 Cys Asp Ser Ile Thr Gly Met Asn Leu Glu Ala Trp Arg Glu Thr Phe 725 730 735 Pro Gln Asp Asp Lys Cys Gly Phe Pro Glu Ser Val Glu Asn Gly Asp 740 745 750 Phe Val His Cys Glu Glu Ser Gly Arg Arg Val Leu Val Tyr Ser Cys 755 760 765 Arg His Gly Tyr Glu Leu Gln Gly Arg Glu Gln Leu Thr Cys Thr Gln 770 775 780 Glu Gly Trp Asp Phe Gln Pro Pro Leu Cys Lys Asp Val Asn Glu Cys 785 790 795 800 Ala Asp Gly Ala His Pro Pro Cys His Ala Ser Ala Arg Cys Arg Asn 805 810 815 Thr Lys Gly Gly Phe Gln Cys Leu Cys Ala Asp Pro Tyr Glu Leu Gly 820 825 830 Asp Asp Gly Arg Thr Cys Val Asp Ser Gly Arg Leu Pro Arg Ala Thr 835 840 845

【００３８】配列番号：２ 配列の長さ：２５４６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：２本鎖 配列 ATG AGA GCG CTG GCT GTG CTG TCT GTC ACG CTG GTT ATG GCC TGC ACA 48 Met Arg Ala Leu Ala Val Leu Ser Val Thr Leu Val Met Ala Cys Thr 1 5 10 15 GAA GCC TTC TTC CCC TTC ATC TCG AGA GGG AAA GAA CTC CTT TGG GGA 96 Glu Ala Phe Phe Pro Phe Ile Ser Arg Gly Lys Glu Leu Leu Trp Gly 20 25 30 AAG CCT GAG GAG TCT CGT GTC TCT AGC GTC TTG GAG GAA AGC AAG CGC 144 Lys Pro Glu Glu Ser Arg Val Ser Ser Val Leu Glu Glu Ser Lys Arg 35 40 45 CTG GTG GAC ACC GCC ATG TAC GCC ACG ATG CAG AGA AAC CTC AAG AAA 192 Leu Val Asp Thr Ala Met Tyr Ala Thr Met Gln Arg Asn Leu Lys Lys 50 55 60 AGA GGA ATC CTT TCT CCA GCT CAG CTT CTG TCT TTT TCC AAA CTT CCT 240 Arg Gly Ile Leu Ser Pro Ala Gln Leu Leu Ser Phe Ser Lys Leu Pro 65 70 75 80 GAG CCA ACA AGC GGA GTG ATT GCC CGA GCA GCA GAG ATA ATG GAA ACA 288 Glu Pro Thr Ser Gly Val Ile Ala Arg Ala Ala Glu Ile Met Glu Thr 85 90 95 TCA ATA CAA GCG ATG AAA AGA AAA GTC AAC CTG AAA ACT CAA CAA TCA 336 Ser Ile Gln Ala Met Lys Arg Lys Val Asn Leu Lys Thr Gln Gln Ser 100 105 110 CAG CAT CCA ACG GAT GCT TTA TCA GAA GAT CTG CTG AGC ATC ATT GCA 384 Gln His Pro Thr Asp Ala Leu Ser Glu Asp Leu Leu Ser Ile Ile Ala 115 120 125 AAC ATG TCT GGA TGT CTC CCT TAC ATG CTG CCC CCA AAA TGC CCA AAC 432 Asn Met Ser Gly Cys Leu Pro Tyr Met Leu Pro Pro Lys Cys Pro Asn 130 135 140 ACT TGC CTG GCG AAC AAA TAC AGG CCC ATC ACA GGA GCT TGC AAC AAC 480 Thr Cys Leu Ala Asn Lys Tyr Arg Pro Ile Thr Gly Ala Cys Asn Asn 145 150 155 160 AGA GAC CAC CCC AGA TGG GGC GCC TCC AAC ACG GCC CTG GCA CGA TGG 528 Arg Asp His Pro Arg Trp Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Ala Arg Trp 165 170 175 CTC CCT CCA GTC TAT GAG GAC GGC TTC AGT CAG CCC CGA GGC TGG AAC 576 Leu Pro Pro Val Tyr Glu Asp Gly Phe Ser Gln Pro Arg Gly Trp Asn 180 185 190 CCC GGC TTC TTG TAC AAC GGG TTC CCA CTG CCC CCG GTC CGG GAG GTG 624 Pro Gly Phe Leu Tyr Asn Gly Phe Pro Leu Pro Pro Val Arg Glu Val 195 200 205 ACA AGA CAT GTC ATT CAA GTT TCA AAT GAG GTT GTC ACA GAT GAT GAC 672 Thr Arg His Val Ile Gln Val Ser Asn Glu Val Val Thr Asp Asp Asp 210 215 220 CGC TAT TCT GAC CTC CTG ATG GCA TGG GGA CAA TAC ATC GAC CAC GAC 720 Arg Tyr Ser Asp Leu Leu Met Ala Trp Gly Gln Tyr Ile Asp His Asp 225 230 235 240 ATC GCG TTC ACA CCA CAG AGC ACC AGC AAA GCT GCC TTC GGG GGA GGG 768 Ile Ala Phe Thr Pro Gln Ser Thr Ser Lys Ala Ala Phe Gly Gly Gly 245 250 255 GCT GAC TGC CAG ATG ACT TGT GAG AAC CAA AAC CCA TGT TTT CCC ATA 816 Ala Asp Cys Gln Met Thr Cys Glu Asn Gln Asn Pro Cys Phe Pro Ile 260 265 270 CAA CTC CCG GAG GAG GCC CGG CCG GCC GCG GGC ACC GCC TGT CTG CCC 864 Gln Leu Pro Glu Glu Ala Arg Pro Ala Ala Gly Thr Ala Cys Leu Pro 275 280 285 TTC TAC CGC TCT TCG GCC GCC TGC GGC ACC GGG TAC CAA GGC GCG CTC 912 Phe Tyr Arg Ser Ser Ala Ala Cys Gly Thr Gly Tyr Gln Gly Ala Leu 290 295 300 TTT GGG AAC CTG TCC ACG GCC AAC CCG CGG CAG CAG ATG AAC GGG TTG 960 Phe Gly Asn Leu Ser Thr Ala Asn Pro Arg Gln Gln Met Asn Gly Leu 305 310 315 320 ACC TCG TTC CTG GAC GCG TCC ACC GTG TAT GGC AGC TCC CCG GCC CTA 1008 Thr Ser Phe Leu Asp Ala Ser Thr Val Tyr Gly Ser Ser Pro Ala Leu 325 330 335 GAG AGG CAG CTG CGG AAC TGG ACC AGT GCC GAA GGG CTG CTC CGC GTC 1056 Glu Arg Gln Leu Arg Asn Trp Thr Ser Ala Glu Gly Leu Leu Arg Val 340 345 350 CAC GCG CGC CTC CGG GAC TCC GGC CGC GCC TAC CTG CCC TTC GTG CCG 1104 His Ala Arg Leu Arg Asp Ser Gly Arg Ala Tyr Leu Pro Phe Val Pro 355 360 365 CCA CGC GCG CCT TCG GCC TGT GCG CCC GAG CCC GGC ATC CCC GGA GAG 1152 Pro Arg Ala Pro Ser Ala Cys Ala Pro Glu Pro Gly Ile Pro Gly Glu 370 375 380 ACC CGC GGG CCC TGC TTC CTG GCC GGA GAC GGC CGC GCC ACC GAG GTC 1200 Thr Arg Gly Pro Cys Phe Leu Ala Gly Asp Gly Arg Ala Thr Glu Val 385 390 395 400 CCC TCC CTG ACG GCA CTG CAC ACG CTG TGG CTG CGC GAG CAC AAC CGC 1248 Pro Ser Leu Thr Ala Leu His Thr Leu Trp Leu Arg Glu His Asn Arg 405 410 415 CTG GCC GCG GCG CTC AAG GCC CTC AAT GCG CAC TGG AGC GCG GAC GCC 1296 Leu Ala Ala Ala Leu Lys Ala Leu Asn Ala His Trp Ser Ala Asp Ala 420 425 430 GTG TAC CAA GAT GCG CGC AAG GTC GTG GGC GCT CTG CAC CAG ATC ATC 1344 Val Tyr Gln Asp Ala Arg Lys Val Val Gly Ala Leu His Gln Ile Ile 435 440 445 ACC CTT AGG GAT TAC ATC CCC AGG ATC CTG GGA TCC CAG GCC TTC CAG 1392 Thr Leu Arg Asp Tyr Ile Pro Arg Ile Leu Gly Ser Gln Ala Phe Gln 450 455 460 CAG TAC GTG GGT CCC TAT GAA GGC TAT GAC TCC ACC GCC AAC CCC ACT 1440 Gln Tyr Val Gly Pro Tyr Glu Gly Tyr Asp Ser Thr Ala Asn Pro Thr 465 470 475 480 GTG TCC AAC GTG TTC TCC ACA GCC GCC TTC CGC TTC GGC CAT GCC ACG 1488 Val Ser Asn Val Phe Ser Thr Ala Ala Phe Arg Phe Gly His Ala Thr 485 490 495 ATC CAC CCG CTG GTG AAG AGG CTG GAC GCC AGC TTC CAA GAA CAC CCC 1536 Ile His Pro Leu Val Lys Arg Leu Asp Ala Ser Phe Gln Glu His Pro 500 505 510 GAC CTG CCC GGG CTG TGG CTG CAC CAG GCT TTC TTC AGC CCA TGG ACA 1584 Asp Leu Pro Gly Leu Trp Leu His Gln Ala Phe Phe Ser Pro Trp Thr 515 520 525 TTA CTC CGT GGA GGT GGT TTG GAC CCA CTA ATA CGA GGC CTT CTT GCA 1632 Leu Leu Arg Gly Gly Gly Leu Asp Pro Leu Ile Arg Gly Leu Leu Ala 530 535 540 AGA CCA GCC AAA CTG CAG GTG CAG GAT CAG CTG ATG AAC GAG GAG CTG 1680 Arg Pro Ala Lys Leu Gln Val Gln Asp Gln Leu Met Asn Glu Glu Leu 545 550 555 560 ACG GAA AGG CTC TTT GTG CTG TCC AAT TCC AGC ACC TTG GAT CTG GCG 1728 Thr Glu Arg Leu Phe Val Leu Ser Asn Ser Ser Thr Leu Asp Leu Ala 565 570 575 TCC ATC AAC CTG CAG AGG GGC CGG GAC CAC GGG CTG CCA GGT TAC AAT 1776 Ser Ile Asn Leu Gln Arg Gly Arg Asp His Gly Leu Pro Gly Tyr Asn 580 585 590 GAG TGG AGG GAG TTC TGC GGC CTG CCT CGC CTG GAG ACC CCC GCT GAC 1824 Glu Trp Arg Glu Phe Cys Gly Leu Pro Arg Leu Glu Thr Pro Ala Asp 595 600 605 CTG AGC ACA GCC ATC GCC AGC AGG AGC GTG GCC GAC AAG ATC CTG GAC 1872 Leu Ser Thr Ala Ile Ala Ser Arg Ser Val Ala Asp Lys Ile Leu Asp 610 615 620 TTG TAC AAG CAT CCT GAC AAC ATC GAT TTC TGG CTG GGA GGC TTA GCT 1920 Leu Tyr Lys His Pro Asp Asn Ile Asp Phe Trp Leu Gly Gly Leu Ala 625 630 635 640 GAA AAC TTC CTC CCC AGG GCT CGG ACA GGG CCC CTG TTT GCC TGT CTC 1968 Glu Asn Phe Leu Pro Arg Ala Arg Thr Gly Pro Leu Phe Ala Cys Leu 645 650 655 ATT GGG AAG CAG ATG AAG GCT CTG CGG GAC GGT CAC TGG TTT TGG TGG 2016 Ile Gly Lys Gln Met Lys Ala Leu Arg Asp Gly His Trp Phe Trp Trp 660 665 670 GAG AAC AGC CAC GTC TTC ACG GAT GCA CAG AGG CGT GAG CTG GAG AAG 2064 Glu Asn Ser His Val Phe Thr Asp Ala Gln Arg Arg Glu Leu Glu Lys 675 680 685 CAC TCC CTG TCT CGG GTC ATC TGT GAC AAC ACT GGC CTC ACC AGG GTG 2112 His Ser Leu Ser Arg Val Ile Cys Asp Asn Thr Gly Leu Thr Arg Val 690 695 700 CCC ATG GAT GCC TTC CAA GTC GGC AAA TTC CCC GAA GAC TTT GAG TCT 2160 Pro Met Asp Ala Phe Gln Val Gly Lys Phe Pro Glu Asp Phe Glu Ser 705 710 715 720 TGT GAC AGC ATC ACT GGC ATG AAC CTG GAG GCC TGG AGG GAA ACC TTT 2208 Cys Asp Ser Ile Thr Gly Met Asn Leu Glu Ala Trp Arg Glu Thr Phe 725 730 735 CCT CAA GAC GAC AAG TGT GGC TTC CCA GAG AGC GTG GAG AAT GGG GAC 2256 Pro Gln Asp Asp Lys Cys Gly Phe Pro Glu Ser Val Glu Asn Gly Asp 740 745 750 TTT GTG CAC TGT GAG GAG TCT GGG AGG CGC GTG CTG GTG TAT TCC TGC 2304 Phe Val His Cys Glu Glu Ser Gly Arg Arg Val Leu Val Tyr Ser Cys 755 760 765 CGG CAC GGG TAT GAG CTC CAA GGC CGG GAG CAG CTC ACT TGC ACC CAG 2352 Arg His Gly Tyr Glu Leu Gln Gly Arg Glu Gln Leu Thr Cys Thr Gln 770 775 780 GAA GGA TGG GAT TTC CAG CCT CCC CTC TGC AAA GAT GTG AAC GAG TGT 2400 Glu Gly Trp Asp Phe Gln Pro Pro Leu Cys Lys Asp Val Asn Glu Cys 785 790 795 800 GCA GAC GGT GCC CAC CCC CCC TGC CAC GCC TCT GCG AGG TGC AGA AAC 2448 Ala Asp Gly Ala His Pro Pro Cys His Ala Ser Ala Arg Cys Arg Asn 805 810 815 ACC AAA GGC GGC TTC CAG TGT CTC TGC GCG GAC CCC TAC GAG TTA GGA 2496 Thr Lys Gly Gly Phe Gln Cys Leu Cys Ala Asp Pro Tyr Glu Leu Gly 820 825 830 GAC GAT GGG AGA ACC TGC GTA GAC TCC GGG AGG CTC CCT CGG GCG ACT 2544 Asp Asp Gly Arg Thr Cys Val Asp Ser Gly Arg Leu Pro Arg Ala Thr 835 840 845 TA 2546

【００３９】配列番号：３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 GTGGAATTCA TGAGAGCGCT GGCTGTGCTG TCTGTC 36

【００４０】配列番号：４ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 GCGCATTTTA AGCGGCCGCC TAAGTCGCCC GAGGGAGCCT CC 42

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の抗ｈＴＰＯ抗体免疫測定用抗原を用い
た免疫測定系により作成した検量線を示す。

【図２】本発明の抗ｈＴＰＯ抗体免疫測定用抗原を用い
た免疫測定系による測定値と、市販のキットを用いた場
合の測定値の相関関係を示す図である。

【図３】実施例で作製された組換えｈＴＰＯのＳＤＳ−
ＰＡＧＥによる泳動パターンの模式図である。

【図４】ネイティブＴＰＯと、実施例で作製された組換
えｈＴＰＯの糖分解産物のポリアクリルアミド電気泳動
パターンの模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ遺伝子又は
   該遺伝子の１若しくは複数の塩基が置換され若しくは欠
   失され、若しくは該遺伝子に１若しくは複数の塩基が付
   加若しくは挿入された核酸を昆虫細胞中で発現させて得
   られた組換えヒト甲状腺ペルオキシダーゼ又はその誘導
   体であって抗ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ抗体と抗原抗
   体反応を行うものから成る、抗ヒト甲状腺ペルオキシダ
   ーゼ抗体免疫測定用抗原。
2. 【請求項２】 前記核酸は、ヒト甲状腺ペルオキシダー
   ゼ遺伝子のうち、膜貫通領域を欠失したものである請求
   項１記載の免疫測定用抗原。
3. 【請求項３】 前記核酸は、配列表の配列番号１で表わ
   されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若し
   くは複数のアミノ酸残基が置換され若しくは欠失され、
   若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸残
   基が付加若しくは挿入されたアミノ酸配列をコードする
   ものである請求項２記載の免疫測定用抗原。
4. 【請求項４】 前記核酸は、配列表の配列番号１で表わ
   されるアミノ酸配列をコードするものである請求項３記
   載の免疫測定用抗原。
5. 【請求項５】 前記核酸は、配列表の配列番号２で表わ
   される塩基配列又は該塩基配列の１若しくは複数の塩基
   が置換され若しくは欠失され、若しくは該遺伝子に１若
   しくは複数の塩基が付加若しくは挿入された塩基配列を
   有する、請求項３記載の免疫測定用抗原。
6. 【請求項６】 前記核酸は、配列表の配列番号２で表わ
   される塩基配列を有する請求項５記載の免疫測定用抗
   原。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号１で表わされるアミノ
   酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数のア
   ミノ酸残基が置換され若しくは欠失され、若しくは該ア
   ミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸残基が付加若し
   くは挿入されたアミノ酸配列を有し、抗ヒト甲状腺ペル
   オキシダーゼ抗体と抗原抗体反応を行うものから成り、
   かつマンノース型糖鎖を有する、組換えヒト甲状腺ペル
   オキシダーゼ誘導体。
8. 【請求項８】 膜貫通領域を欠失したものである請求項
   ７記載の組換えヒト甲状腺ペルオキシダーゼ誘導体。
9. 【請求項９】 分子量が約１００ｋｄである請求項８記
   載の組換えヒト甲状腺ペルオキシダーゼ誘導体。
10. 【請求項１０】 配列表の配列番号１で示されるアミノ
    酸配列を有する請求項９記載の組換えヒト甲状腺ペルオ
    キシダーゼ誘導体。