JPH09206083A - Ｇｒｐ１７遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＧＲＰ１７蛋白の発現及び検出に利用でき、
該蛋白の関与する各種の疾患の診断、病態解明、治療及
び予防薬のスクリーニングや評価に利用できる遺伝子を
提供する。 【解決手段】 配列番号：１で示されるアミノ酸配列を
コードする塩基配列を含むことを特徴とするヒトＧＲＰ
１７遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞の成長阻止と
ＤＮＡ傷害誘導に関与し、癌の診断及び治療に有用なヒ
ト遺伝子、より詳しくはＧａｄｄ４５遺伝子及びＭｙＤ
１１８遺伝子と高い相同性を有する蛋白をコードする新
規なヒトＧＲＰ１７遺伝子(gadd45 and MyD118 related
protein, 17kda)に関する。

【０００２】

【従来の技術】成長阻止とアポトーシスは、細胞増殖の
調節のために重要である。成長阻止とＤＮＡ傷害誘導可
能な遺伝子群であるｇａｄｄ遺伝子（Fornace, A.J. et
al.,Mol. Cell Biol., 9, 4196-4203(1989)）とミエロ
イド分化初期応答遺伝子群であるＭｙＤ遺伝子（Lord,
K.A., et al., Oncogene, 5, 387-396 (1990)）との間
で注目すべき関連性が認められる。即ち、之等の遺伝子
群ｇａｄｄ３４／ＭｙＤ１１６、ｇａｄｄ４５、ＭｙＤ
１１８及びｇａｄｄ１５３は、成長調節における役割、
酸性アミノ酸クラスター、発現と調節パターンにおける
類似性のような複数の共通の特徴を持っている。これら
の遺伝子群は、細胞の成長を協同して抑制的に働く酸性
蛋白をコードしている新規な遺伝子ファミリーを定義す
るかもしれない（Zhan, Q., et al., Mol. Cell Biol.,
14, 2361-12371 (1994)）が、細胞成長のメカニズム
は、尚あまり解明されていない。

【０００３】Ｇａｄｄ４５(Carrier, F., et al., J. B
iol. Chem., 269, 32672-32677 (1994))とＭｙＤ１１８
(Abdollahi, A., et al., Oncogene, 6, 165-167 (199
1))は、互いに異なる遺伝子であるが、ＤＮＡ配列にお
いて非常に類似している。

【０００４】ｇａｄｄ４５の発現は、多様なストレスに
よって誘導され、ｐ５３によって調節される(Hollande
r, M.C., et al., J. Bio. Chem., 268, 24385-24393(1
993))。

【０００５】近年、スミスらがＰＣＮＡ(proliferating
cell nuclear antigen: 増殖細胞核抗原)とＧａｄｄ４
５の結合と、ＤＮＡ切取り修復を促進することを報告し
ている(Smith, M.L., et al., Science, 266, 1376-138
0 (1994))。更に、Ｇａｄｄ４５は、ｐ２１
^wafl/cip1（サイクリン依存性キナーゼ・インヒビタ
ー）と相互作用し、ＤＮＡ複製の抑制により細胞周期を
調節することもまた報告され、Ｇａｄｄ４５は、細胞周
期調節に重要な役割を演ずると提言されている(Chen,
I.T., et al., Oncogene, 11, 1931-1937(1995); Kears
ey, J. M., et al., Oncogene, 11, 1675-1683(199
5))。

【０００６】上記Ｇａｄｄ及びＭｙＤ１１８と高い相同
性を有する蛋白をコードするヒト遺伝子が提供できれ
ば、その各細胞での発現レベルや構造及び機能を解析で
き、またその発現物の解析等により、之等の関与する疾
患、例えば癌等の病態解明や診断、治療等が可能となる
と考えられるが、現在、かかる遺伝子について報告され
た例はない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、か
かる新たなヒト成長抑制及びＤＮＡ傷害誘導可能遺伝子
を提供することを目的としている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
より鋭意研究を重ねた結果、ヒトｃＤＮＡライブラリー
より新たに、上記目的に合致する遺伝子を単離するに成
功し、ここに本発明を完成するに至った。

【０００９】即ち、本発明によれば、配列番号：１で示
されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことを
特徴とする遺伝子（以下「ＧＲＰ１７遺伝子」とい
う）、より詳しくは、配列番号：２で示される塩基配列
を含む上記ＧＲＰ１７遺伝子及び配列番号：３で示され
る塩基配列からなる上記ＧＲＰ１７遺伝子が提供され
る。

【００１０】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡ
Ｃ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む
明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及
び当該分野における慣用記号に従うものとする。

【００１１】

【発明の実施の態様】本発明に係わるＧＲＰ１７遺伝子
の一具体例としては、後述する実施例に示される「ＧＥ
Ｎ−５５４Ｈ０６」と名付けられたクローンの有するＤ
ＮＡ配列から演繹されるものを挙げることができる。上
記クローンは、配列番号：１に示される１５９アミノ酸
をコードする配列番号：２で表わされる４７７ヌクレオ
チド（核酸）をオープンリーディングフレームとして有
している。

【００１２】本発明遺伝子によりコードされる蛋白の推
定分子量は、１７，０３０ダルトンと計算され、また、
ノーザン・ブロット分析において試験したヒト成人組織
の心臓、膵臓、肝臓、骨格筋、前立腺、睾丸及び卵巣に
おいて、１．３５キロ塩基（Ｋｂ）の転写体が強く発現
していることが明らかとなり、更に肝臓において、１．
７Ｋｂの別の転写体が検出された。本発明遺伝子は、更
に染色体バンド９ｑ２２．１−ｑ２２．２にマップされ
た。

【００１３】これまでＧＲＰ１７の機能或は細胞内局在
については、何ら知られていなかったが、本発明によっ
て之等が明らかにされ、また上記ＧＲＰ１７遺伝子は組
織特異的であることが明らかにされた。

【００１４】本発明遺伝子は、細胞周期の抑制に係わっ
ていると考えられることから、この遺伝子産物は、細胞
増殖の抑制の調節や癌化に関係する因子と考えられる。
従って、この遺伝子は、その異常により、癌や奇形を惹
起する可能性があり、臨床的に、癌の診断や癌、奇形等
の治療に応用できると考えられる。

【００１５】また、本発明遺伝子は、アポトーシスに関
係し、細胞周期の抑制のみならず、医療分野での幅広い
応用が期待できる。更に、本発明遺伝子は、ＳＬＥ等の
自己免疫疾患における自己抗体の産生にも関係し、それ
らの診断、治療法の開発面でも有用であると考えられ
る。

【００１６】以下、本発明ＧＲＰ１７遺伝子につき詳述
する。

【００１７】上述したように従来より、Ｇａｄｄ４５と
ＭｙＤ１１８が細胞の成長調節に係わっていること及び
酸性蛋白をコードしている遺伝子ファミリーであって協
同的に細胞成長を抑制することが知られており、これら
の遺伝子は腫瘍抑制関連遺伝子として働くと考えられ
る。

【００１８】本発明ＧＲＰ１７遺伝子は、上記Ｇａｄｄ
４５及びＭｙＤ１１８と高い相同性を有している。即
ち、推定されたヒトＧＲＰ１７蛋白は、Ｇａｄｄ４５及
びＭｙＤ１１８と、アミノ酸レベルで、それぞれ５５％
及び５２％同一で、高い相同性を示す。

【００１９】本発明遺伝子は、例えば配列番号：２に示
されるように、一本鎖ＤＮＡ配列で表わされるが、本発
明はかかる一本鎖ＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列やこ
れらの両者を含むコンポーネントもまた包含する。尚、
配列番号：２に示す本発明遺伝子の配列は、これにより
コードされる各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合
わせ例であり、本発明遺伝子はこれに限らず、各アミノ
酸残基に対して任意のコドンを組合わせ選択したＤＮＡ
塩基配列を有することも勿論可能である。該コドンの選
択は常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコド
ン使用頻度を考慮することができる〔Ncl.Acids Res.,
9, 43-74 (1981) 〕。

【００２０】更に本発明遺伝子には、上記で示されるア
ミノ酸配列の一部のアミノ酸乃至アミノ酸配列を置換、
欠失、付加等により改変してなり、同様の機能を有する
同効物をコードするＤＮＡ配列もまた包含される。これ
らポリペプチドの製造、改変（変異）等は天然に生じる
こともあり、また翻訳後の修飾により、或は遺伝子工学
的手法により天然の遺伝子（本発明遺伝子）を、例えば
サイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in
Enzymology, 154, p350, 367-382 (1987)；同100, p46
8 (1983) ；Nucleic Acids Research, 12, p9441 (198
4)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化
学会編, p105 (1986) 〕等の方法により改変したり、リ
ン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の化学合成
手段〔J.Am. Chem. Soc., 89, p4801 (1967)；同91, p3
350 (1969)；Science, 150, p178 (1968) ；Tetrahedro
n Lett., 22, p1859 (1981)；同24, p245 (1983)〕によ
り変異させたＤＮＡを合成したり、それらの組合せによ
り収得することができる。

【００２１】本発明遺伝子は、これを利用して、即ち例
えばこれを微生物のベクターに組込み、形質転換された
微生物を培養することによって、上記ＧＲＰ１７蛋白を
容易にかつ安定して発現できる。

【００２２】また本発明の遺伝子を利用して得られるＧ
ＲＰ１７蛋白は、これを用いて、特異抗体を作成するこ
ともできる。ここで抗原として用いられるコンポーネン
トは、上記遺伝子工学的手法に従って大量に産生される
蛋白を用いることができ、得られる抗体はポリクローナ
ル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、之等
抗体はＧＲＰ１７蛋白の精製、測定、識別等に有効に利
用できる。

【００２３】本発明遺伝子の製造は、本発明によって開
示された本発明遺伝子についての配列情報に基づいて、
一般的遺伝子工学的手法により容易に実施できる〔Mole
cular Cloning 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laborator
y Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、I
I、III」、日本生化学会編 (1986) 等参照〕。

【００２４】これは例えばヒトｃＤＮＡライブラリー
（ＧＲＰ１７遺伝子の発現される適当な起源細胞より常
法に従い調製されたもの）から、本発明遺伝子に特有の
適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択する
ことにより実施できる〔Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 7
8, 6613 (1981) ; Science, 222, 778 (1983)等〕。

【００２５】上記方法において、起源細胞としては、Ｇ
ＲＰ１７遺伝子を発現する各種の細胞、組織や之等に由
来する培養細胞等が例示され、これらからの全ＲＮＡの
分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡへの変換（合
成）とそのクローニング等はいずれも常法に従い実施で
きる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもお
り、本発明ではそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばク
ローンテック社（ClontechLab. Inc.）より市販の各種
ｃＤＮＡライブラリー等を用いることもできる。

【００２６】ｃＤＮＡライブラリーからの本発明遺伝子
のスクリーニングは、前記通常の方法に従い実施するこ
とができる。該スクリーニング方法としては、例えばｃ
ＤＮＡの産生する蛋白質に対して、ＧＲＰ１７特異抗体
を使用した免疫的スクリーニングにより、対応するｃＤ
ＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択
的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼ
ーション、コロニーハイブリダイゼーション等や之等の
組合せを例示できる。ここで用いられるプローブとして
は、本発明遺伝子のＤＮＡ配列に関する情報をもとにし
て化学合成されたＤＮＡ配列等を用いるのが一般的であ
り、勿論既に取得された本発明遺伝子やその断片もかか
るプローブとして利用できる。

【００２７】また、本発明遺伝子の取得に際しては、Ｐ
ＣＲ法〔Science, 230, 1350-1354(1985)〕によるＤＮ
Ａ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊にライブラリ
ーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合に、レー
ス法（ＲＡＣＥ：Rapid amplification of cDNA ends；
実験医学、12(6), 35-38 (1994))、殊に５′−レース
（ＲＡＣＥ）法（Frohman,M.A., et al., Proc.Natl.Ac
ad.Sci., USA., 8, 8998-9002(1988)）の採用が好適で
ある。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライ
マーは、既に本発明によって明らかにされた本発明遺伝
子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、これ
は常法に従い合成することができる。

【００２８】尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離
精製は前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電
気泳動法等によればよい。上記で得られる本発明遺伝子
或は各種ＤＮＡ断片等の塩基配列の決定も、常法に従う
ことができ、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)〕やマキサム−ギルバ
ート法〔Method in Enzymology, 65, 499(1980)〕等に
より行なうことができる。かかる塩基配列の決定は、市
販のシークエンスキット等を用いても容易に行ない得
る。

【００２９】本発明遺伝子の利用によれば、通常の遺伝
子組換え技術〔例えば、Science, 224, p1431 (1984) ;
Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, p692 (1985) ；
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, p5990 (1983)及び前
記引用文献等参照〕に従い、組換え体ＧＲＰ１７蛋白を
得ることができる。

【００３０】該ＧＲＰ１７蛋白の製造は、より詳細に
は、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮ
Ａを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該
形質転換体を培養することにより行なわれる。

【００３１】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細
胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細
胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cel
l, 23, 175-182 (1981)〕やチャイニーズ・ハムスター
卵巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 7, 4216-4220 (1980)〕等
がよく用いられているが、之等に限定される訳ではな
い。

【００３２】脊椎動物の発現ベクターとしては、通常発
現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、
ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写
終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要
により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの
例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保
有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1, 854 (198
1)〕等を例示できる。また、真核微生物としては、酵母
が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母を
有利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクタ
ーとしては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対する
プロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 80, 1-5 (1983)〕等を利用できる。

【００３３】また、本発明遺伝子の発現ベクターとして
は、原核生物遺伝子融合ベクターを好ましく利用するこ
とができ、該ベクターの具体例としては、例えば分子量
２６０００のＧＳＴドメイン（S.japonicum 由来）を有
するｐＧＥＸ−２ＴＫやｐＧＥＸ−４Ｔ−２等を例示す
ることができる。

【００３４】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられる。之等を宿主とする場合、本発
明では、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベク
ターを用い、このベクター中に本発明遺伝子が発現でき
るように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤ
イン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開
始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現
プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としての
大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Escherichia co
li）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般
にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられる
が、之等に限定されず公知の各種の菌株及びベクターを
も利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプト
ファン(trp) プロモーター、lpp プロモーター、lac プ
ロモーター、PL/PR プロモーター等を使用できる。

【００３５】かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿
主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法として
は、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質
転換体は、常法に従い培養でき、該培養により本発明遺
伝子によりコードされる目的のＧＲＰ１７蛋白が生産、
発現される。該培養に用いられる培地としては、採用し
た宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利
用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実
施できる。

【００３６】上記により、形質転換体の細胞内、細胞外
乃至は細胞膜上に目的とする組換えＧＲＰ１７蛋白が発
現、生産、蓄積乃至分泌される。

【００３７】組換えＧＲＰ１７蛋白は、所望により、そ
の物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作
〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版
第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Bi
ochemistry, 25(25), 8274-8277 (1986); Eur. J. Bioc
hem., 163, 313-321 (1987) 等参照〕により分離、精製
できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構
成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、
浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロ
マトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、之等の
組合せ等を例示でき、特に好ましい上記方法としてはＧ
ＲＰ１７蛋白を結合させたカラムを利用したアフィニテ
ィクロマトグラフィーを例示できる。

【００３８】また、本発明によって明らかにされた本発
明遺伝子の配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一
部又は全部の塩基配列を利用することにより、各種ヒト
組織における本発明遺伝子の発現の検出を行なうことが
できる。これは常法に従って行なうことができ、例えば
ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse transcribed-Polymerase chain
reaction ）（Kawasaki, E.S., et al., Amplificatio
n of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and
applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-2
7(1991) ）によるＲＮＡ増幅により、またノーザンブロ
ッティング解析（Molecular Cloning, Cold Spring Har
bor Laboratory(1989)）等により、いずれも良好に実施
し得る。

【００３９】尚、前記ＰＣＲ法を採用する場合におい
て、用いられるプライマーは、本発明遺伝子のみを特異
的に増幅できる本発明遺伝子に特有のものである限り何
等限定はなく、本発明遺伝情報に基いてその配列を適宜
設定することができる。通常これは常法に従って２０〜
３０ヌクレオチド程度の部分配列を有するものとするこ
とができる。その好適な１例は、後記実施例に示す通り
である。

【００４０】しかして、本発明はかかるＧＲＰ１７遺伝
子に特有の検出に有用なプライマー及び／又はプローブ
をも提供するものである。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、新規なヒトＧＲＰ１７
遺伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、該遺伝子の各
種組織での発現の検出や、ヒトＧＲＰ１７蛋白の遺伝子
工学的製造が可能となり、これらにより、細胞の成長調
節に深く関与しているヒトＧＲＰ１７のシステム乃至機
能の解析や、これが関与する悪性腫瘍、奇形、自己免疫
疾患等の各種疾患の診断等を行なうことができ、またそ
れら各種疾患の治療及び予防薬のスクリーニングや評価
等をも行なうことができる。

【００４２】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げる。

【００４３】

【実施例１】 （１）クローニング及びＤＮＡシークエンシング ヒト胎児脳、成人血管及び胎盤の各組織より抽出したｍ
ＲＮＡをクローンテック社より購入し、出発材料とし
た。

【００４４】該ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、ベクタ
ーλＺＡＰII（ストラタジーン社製）に挿入し、ｃＤＮ
Ａライブラリーを構築した（大塚ＧＥＮリサーチ・イン
スティチュート、大塚製薬株式会社）。

【００４５】インビボ・エキシジョン法(in vivo excis
ion:Short, J. M., et al., Nucleic Acids Res., 16,
7583-7600 (1988))によって寒天培地上にヒト遺伝子を
含む大腸菌コロニーを形成させ、ランダムにそのコロニ
ーをピックアップし、９６ウエルマイクロプレートにヒ
ト遺伝子を含む大腸菌クローンを登録した。登録された
クローンは、−８０℃にて保存した。

【００４６】次に登録した各クローンを１．５ｍｌのＬ
Ｂ培地で一昼夜培養し、プラズミド自動抽出装置ＰＩ−
１００（クラボウ社製）を用いてＤＮＡを抽出精製し
た。尚、コンタミした大腸菌のＲＮＡは、ＲＮase処理
により分解除去した。

【００４７】最終的に３０μｌに溶解し、２μｌは、ミ
ニゲルによりおおまかにＤＮＡのサイズ、量をチェック
し、７μｌをシークエンス反応用に用い、残りの２１μ
ｌは、プラスミドＤＮＡとして４℃に保存した。また、
この方法は若干のプログラム変更によって後記に示され
るＦＩＳＨ(fluoresence in situ hybridization)のプ
ローブ用としても使用可能なコスミド抽出法である。

【００４８】続いて、Ｔ３、Ｔ７或は合成オリゴヌクレ
オチド・プライマーを用いるサンガーらのジデオキシタ
ーミネーター法(Sanger, F., et al., Proc. Natl. Ac
ad.Sci. U.S.A., 74, 5463-5467 (1977))或はジデオキ
シターミネーター法にＰＣＲ法を加味するした方法であ
るサイクルシークエンス法(Carothers, A.M., et al.,
Bio. Techniques, 7, 494-499 (1989))で抽出した少量
のプラスミドＤＮＡ(およそ０．１−０．５μｇ)をテン
プレート(鋳型)として４種の塩基特異的に停止する伸長
反応させた。

【００４９】シークエンスプライマーとしては、ＦＩＴ
Ｃ(fluorescein isothiocyanate)の蛍光標識したものを
使用し、Ｔａｑポリメラーゼにより通常約２５サイクル
反応させた。そのＰＣＲ産物はポリアクリルアミド・尿
素ゲルで分離し、蛍光標識したＤＮＡ断片を自動ＤＮＡ
シークエンサー、ＡＬＦ^TMＤＮＡシークエンサー(ファ
ルマシア社製)によりｃＤＮＡの５’末端側から約４０
０塩基の配列を決定した。

【００５０】また、３’非翻訳領域は各遺伝子のヘテロ
ジェナイティ(heterogeneity)が高く、個々の遺伝子を
区別するのに適しているので、場合によっては、３’側
のシークエンスも行なった。

【００５１】ＤＮＡシークエンサーで得られた膨大な塩
基配列情報は、６４ビットのコンピューターＤＥＣ３４
００に転送し、コンピュターによるホモロジー解析に用
いた。ホモロジー解析には、ＵＷＧＣＧのＦＡＳＴＡプ
ログラム（Pearson, W.R. and Lipman, D. J., Proc.Na
tl.Acad.Sci., USA., 85, 2444-2448 (1988)）によるデ
ーターベース（GenBank, EMBL ）検索により行なった。

【００５２】上記方法によって任意に選択し、ＧＥＮ−
５５４Ｈ０６と名前付けた１．１キロベースのｃＤＮＡ
クローンが、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから得ら
れ、該ｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸
配列が、ヒトＧａｄｄ４５とマウスＭｙＤ１１８と高い
相同性を示した。

【００５３】本発明者らは、推定オープン・リーディン
グ・フレームを確認するために、１０３６ヌクレオチド
の全体のコード配列と５’と３’フランキング配列を決
定した。

【００５４】配列番号：３に、ＧＥＮ−５５４Ｈ０６と
命名されたｃＤＮＡクローンの核酸配列、配列番号：２
にそのクローンのコーディング領域の核酸配列並びに配
列番号：１に該核酸配列でコードされる推定アミノ酸配
列を示す。

【００５５】このｃＤＮＡは、１０３６塩基からなり、
１５９アミノ酸をコードする４７７塩基のオープン・リ
ーディング・フレームを含んでいた。該ｃＤＮＡクロー
ンの最初のＡＴＧであると推定された転写開始コドンは
８４−８６番目に位置していた。ＡＣＴＡＴＧＡ(配列
番号：３の塩基配列番号８１−８７番目)の配列は、翻
訳開始付近のコンセンサス配列（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＴＧＧ
と異なっていた(Kozak,M., Nucl. Acids Res., 15, 812
5-8148 (1987))。しかしながら、核酸レベルでのヒトＧ
ａｄｄ４５とのその高い配列相同性は、塩基配列番号８
４−８６番目のＡＴＧが開始コドンであることを強く示
唆した。塩基配列番号１０２０−１０２５番目に示され
るようにポリ・アデニレーション・シグナルがポリ
（Ａ）スタート部位の前１７塩基に見られた。更に、イ
ン−フレーム停止コドンは、塩基配列番号５６１−５６
３番目に位置していた。また、その計算された等電点
(ｐＩ値)は、約４．０６で、酸性蛋白質と考えられた。

【００５６】しかして、本発明者らはこの遺伝子により
コードされるアミノ酸配列がＧａｄｄ４５及びＭｙＤ１
１８と高い相同性を有することから、この遺伝子をＧＲ
Ｐ１７遺伝子(gadd45 and MyD118 related protein, 17
KD)と名付けた。

【００５７】（２）ヒトＧａｄｄ４５及びマウスＭｙＤ
１１８とＧＲＰ１７との類似性 ＧＲＰ１７とヒトＧａｄｄ４５及びマウスＭｙＤ１１８
の複数整列比較を図１に示す。図中、同一アミノ酸残基
は反転表示した。またマウスＭｙＤ１１８は「ｍＭｙ
Ｄ」と略した。

【００５８】図１に示されるように、ＧＲＰ１７とヒト
Ｇａｄｄ４５及びマウスＭｙＤ１１８は、アミノ酸レベ
ルで著しい相同性を示した。即ち、ＧＲＰ１７とヒトＧ
ａｄｄ４５及びマウスＭｙＤ１１８とは、それぞれ約５
５％及び５２％のアミノ酸が同一であり、之等は進化的
に近い関係にあるファミリー遺伝子であると考えられ
る。既知のモチーフは同一ではなかったが、推定された
ＧＲＰ１７蛋白のアミノ酸配列番号４０−６９番目の領
域は、これら３つの蛋白の間では、大変よく保存されて
いた。

【００５９】Ｇａｄｄ４５とＭｙＤ１１８は、同様に酸
性アミノ酸を多く含む特徴を有し酸性蛋白をコードして
いる。更に、これら２つの遺伝子は成長抑制機能を有
し、協同的に細胞成長を抑制する。しかしながら、成長
抑制のメカニズムはまだよく分かっていない(Zhan, Q.,
et al., Mol. Cell Biol., 14, 2361-2371(1994))。

【００６０】ＧＲＰ１７の配列は、Ｇａｄｄ４５とＭｙ
Ｄ１１８とに有意な類似性を有し、酸性の蛋白をコード
している。これらのデータより、ＧＲＰ１７は細胞成長
のコントロールに関与している酸性蛋白をコードしてい
る遺伝子ファミリーの新規な遺伝子であることが提言さ
れる。

【００６１】本発明者らは、ＭｙＤ１１８の別のヒトホ
モローグを単離することによって、ＧＲＰ１７がマウス
ＭｙＤ１１８の対応物でなかったことを確認した。従っ
て、ＧＲＰ１７は新規なファミリー遺伝子の一つである
と考えられる。

【００６２】（３）ノーザンブロット分析 正常ヒト組織におけるＧＲＰ１７ｍＲＮＡの発現を、ラ
ンダム・オリゴヌクレオチド・プライミング法によって
標識したヒトｃＤＮＡクローンをプローブとするノーザ
ンブロットにより評価した。

【００６３】ノーザンブロット分析は、製品使用法に従
い、ヒトＭＴＮブロット（Human Multiple Tissue Noth
ern blot ; クローンテック社製、パロ・アルト、カリ
フォルニア、米国）を用いて実施した。

【００６４】即ち、上記ＧＥＮ−５５４Ｈ０６ｃＤＮＡ
クローンのＰＣＲ増幅産物を［³²Ｐ］−ｄＣＴＰ（ラン
ダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガー
・マンハイム社）により標識してプローブとした。

【００６５】ブロッティングは、６時間プレハイブリダ
イズ後、４２℃で１７時間、５０％ホルムアミド／５×
ＳＳＣ／１０×デンハルツ溶液／２％ＳＤＳ溶液（１０
０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ含有）の溶液中でハイ
ブリダイズした。２×ＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳにて室
温下にて１０分間洗浄後、０．１×ＳＳＣ／０．０１％
ＳＤＳにて６５℃下に３０分間洗浄した。フィルターは
−８０℃下に７時間、Ｘ線フィルム(コダック社製)に対
して露光した。

【００６６】ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、
腎臓、膵臓、脾臓、甲状腺、前立腺、睾丸、卵巣、小
腸、大腸及び末梢血白血球の１６種のヒト組織におい
て、ＧＲＰ１７の発現の有無について検討した結果、心
臓、胎盤、肝臓、骨格筋、前立腺、睾丸及び卵巣におい
て、１．３５Ｋｂの転写体を検出した。更に過剰露光
(１７時間)することにより、１．３５Ｋｂの転写体もま
た肺、膵臓、小腸及び大腸において検出された。

【００６７】ノーザン・ブロット分析は、ＧＲＰ１７の
発現が正常成人組織の組織特異的であることを明らかに
した。加えて、１．７Ｋｂの転写体が肝臓においてのみ
発現していた。これらの異なるサイズを有する転写体の
発現は、オルタナティブスプライシングに負うか、或は
別の相同遺伝子に対するクロス−ハイブリダイゼーショ
ンに負うのかもしれない。筋肉組織、睾丸、卵巣におい
て強くＧＲＰ１７の発現があることは、興味深く、これ
らのデータはＧＲＰ１７がこれらの組織の増殖、分化に
対して重要な役割を演じていることを提言するかもしれ
ない。

【００６８】（４）ダイレクト・Ｒ−バィンディングＦ
ＩＳＨによる染色体の局在 ＧＲＰ１７ｃＤＮＡに相等するコスミド・クローンを単
離するために、１５３，６００コスミド・クローンをス
クリーニングした。第１段階のＰＣＲスクリーニング
は、表１に示されるＣＯＳ１とＣＯＳ２プライマーを用
いて９４℃で１分間、最初の変性を行ない、続いて９４
℃で３０秒間、５５℃で４５秒間、そして７２℃で４５
秒間の３５サイクルを続け、１４４０クローンにしぼり
こんだ。

【００６９】

【表１】

【００７０】上記１４４０クローンをドットしたナイロ
ン膜は、ノーザン・ブロッティングと同じ条件下でｃＤ
ＮＡをプローブとしてハイブリタイズされ、単一のコス
ミドクローンを単離した。

【００７１】上記方法によって得られた３つの独立した
クローンを、プロメタフェーズＲ−バンド染色体標本と
ＦＩＳＨ法に基づく技術であるダイレクトＲ−バィンデ
ィング・フルオレッセン・インサイチュー・ハイブリダ
イゼーション(ＦＩＳＨ)によるマッピングのためのプロ
ーブとして使用した(Takahashi E., et al, Hum. Gene
t., 86, 14-16(1990): Takahashi E., et al, Hum. Gen
et., 88, 119-121(1991))。

【００７２】尚、これらのクローンに供されている反復
配列の抑制のために、リヒター(Lichter P. et al., Pr
oc. Natl. Sci. U.S.A., 87, 6634-6638(1990))によっ
て記載された方法を少し修飾して１０倍過剰のヒトＣｏ
ｔ−１ＤＮＡ(ＢＲＬ社製)を用いた。標識、ハイブリダ
イゼーション、ゆすぎ、検出は、通常の方法において実
施した。プロビア１００フィルム(フジＩＳＯ１００；
フジ・フィルム社製)を顕微鏡写真のために用いた(フィ
ルター・コンビネーション、ニコンＢ−２Ａ)。

【００７３】その結果、１００の典型的なＲ−バンド染
色体プレートを観察した所、３つの独立したクローンの
シグナルが染色体９のｑ２２．１−ｑ２２．１に局在し
ていた。

【００７４】ホルムキストに従えば(Holmquist, G. P.,
Am. J. Hum. Genet., 51, 17-37 (1992))、Ｒ−ポジテ
ィブ・バンドは、ＧＣリッチであり、組織特異的遺伝子
と細胞にとって必須の遺伝子を含んでいる。ＧＲＰ１７
が、Ｒ−ポジティブ・バンドに局在されていて、ノーザ
ン分析によって組織特異的遺伝子であるという事実は、
この考えを支持する。

【００７５】

【配列表】

【００７６】配列番号：１ 配列の長さ：１５９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： Met Thr Leu Glu Glu Val Arg Gly Gln Asp Thr Val Pro Glu Ser Thr 1 5 10 15 Ala Arg Met Gln Gly Ala Gly Lys Ala Leu His Glu Leu Leu Leu Ser 20 25 30 Ala His Gly Gln Gly Cys Leu Thr Ala Gly Val Tyr Glu Ser Ala Lys 35 40 45 Val Leu Asn Val Asp Pro Asp Asn Val Thr Phe Cys Val Leu Ala Ala 50 55 60 Gly Glu Glu Asp Glu Gly Asp Ile Ala Leu Gln Ile His Phe Thr Leu 65 70 75 80 Ile Gln Ala Phe Cys Cys Glu Asn Asp Ile Asp Ile Val Arg Val Gly 85 90 95 Asp Val Gln Arg Leu Ala Ala Ile Val Gly Ala Gly Glu Glu Ala Gly 100 105 110 Ala Pro Gly Asp Leu His Cys Ile Leu Ile Ser Asn Pro Asn Glu Asp 115 120 125 Ala Trp Lys Asp Pro Ala Leu Glu Lys Leu Ser Leu Phe Cys Glu Glu 130 135 140 Ser Arg Ser Val Asn Asp Trp Val Pro Ser Ile Thr Leu Pro Glu 145 150 155

【００７７】配列番号：２ 配列の長さ：４７７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA (cDNA) 配列： ATGACTCTGG AAGAAGTCCG CGGCCAGGAC ACAGTTCCGG AAAGCACAGC CAGGATGCAG 60 GGTGCCGGGA AAGCGCTGCA TGAGTTGCTG CTGTCGGCGC ACGGTCAGGG CTGCCTCACT 120 GCCGGCGTCT ACGAGTCAGC CAAAGTCTTG AACGTGGACC CCGACAATGT GACCTTCTGT 180 GTGCTGGCTG CGGGTGAGGA GGACGAGGGC GACATCGCGC TGCAGATCCA TTTTACGCTG 240 ATCCAGGCTT TCTGCTGCGA GAACGACATC GACATAGTGC GCGTGGGCGA TGTGCAGCGG 300 CTGGCGGCTA TCGTGGGCGC CGGCGAGGAG GCGGGTGCGC CGGGCGACCT GCACTGCATC 360 CTCATTTCGA ACCCCAACGA GGACGCCTGG AAGGATCCCG CCTTGGAGAA GCTCAGCCTG 420 TTTTGCGAGG AGAGCCGCAG CGTTAACGAC TGGGTGCCCA GCATCACCCT CCCCGAG 477

【００７８】配列番号：３ 配列の長さ：１０３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ （ｃＤＮＡ） 配列の特徴： 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：８４．．５６０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： CTGAGCTCTG GCTGTCAGTG TGTTCGCCCG CGTCCCCTCC GCGCTCTCCG CTTGTGGATA 60 ACTAGCTGCT GGTTGATCGC ACT ATG ACT CTG GAA GAA GTC CGC GGC CAG 110 Met Thr Leu Glu Glu Val Arg Gly Gln 1 5 GAC ACA GTT CCG GAA AGC ACA GCC AGG ATG CAG GGT GCC GGG AAA GCG 158 Asp Thr Val Pro Glu Ser Thr Ala Arg Met Gln Gly Ala Gly Lys Ala 10 15 20 25 CTG CAT GAG TTG CTG CTG TCG GCG CAC GGT CAG GGC TGC CTC ACT GCC 206 Leu His Glu Leu Leu Leu Ser Ala His Gly Gln Gly Cys Leu Thr Ala 30 35 40 GGC GTC TAC GAG TCA GCC AAA GTC TTG AAC GTG GAC CCC GAC AAT GTG 254 Gly Val Tyr Glu Ser Ala Lys Val Leu Asn Val Asp Pro Asp Asn Val 45 50 55 ACC TTC TGT GTG CTG GCT GCG GGT GAG GAG GAC GAG GGC GAC ATC GCG 302 Thr Phe Cys Val Leu Ala Ala Gly Glu Glu Asp Glu Gly Asp Ile Ala 60 65 70 CTG CAG ATC CAT TTT ACG CTG ATC CAG GCT TTC TGC TGC GAG AAC GAC 350 Leu Gln Ile His Phe Thr Leu Ile Gln Ala Phe Cys Cys Glu Asn Asp 75 80 85 ATC GAC ATA GTG CGC GTG GGC GAT GTG CAG CGG CTG GCG GCT ATC GTG 398 Ile Asp Ile Val Arg Val Gly Asp Val Gln Arg Leu Ala Ala Ile Val 90 95 100 105 GGC GCC GGC GAG GAG GCG GGT GCG CCG GGC GAC CTG CAC TGC ATC CTC 446 Gly Ala Gly Glu Glu Ala Gly Ala Pro Gly Asp Leu His Cys Ile Leu 110 115 120 ATT TCG AAC CCC AAC GAG GAC GCC TGG AAG GAT CCC GCC TTG GAG AAG 494 Ile Ser Asn Pro Asn Glu Asp Ala Trp Lys Asp Pro Ala Leu Glu Lys 125 130 135 CTC AGC CTG TTT TGC GAG GAG AGC CGC AGC GTT AAC GAC TGG GTG CCC 542 Leu Ser Leu Phe Cys Glu Glu Ser Arg Ser Val Asn Asp Trp Val Pro 140 145 150 AGC ATC ACC CTC CCC GAG TGACAGCCCG GCGGGGACCT TGGTCTGATC 590 Ser Ile Thr Leu Pro Glu 155 GACGTGGTGA CGCCCCGGGG CGCCTAGAGC GCGGCTGGCT CTGTGGAGGG GCCCTCCGAG 650 GGTGCCCGAG TGCGGCGTGG AGACTGGCAG GCGGGGGGGG CGCCTGGAGA GCGAGGAGGC 710 GCGGCCTCCC GAGGAGGGGC CCGGTGGCGG CAGGGCCAGG CTGGTCCGAG CTGAGGACTC 770 TGCAAGTGTC TGGAGCGGCT GCTCGCCCAG GAAGGCCTAG GCTAGGACGT TGGCCTCAGG 830 GCCAGGAAGG ACAGACTGGC CGGGCAGGCG TGACTCAGCA GCCTGCGCTC GGCAGGAAGG 890 AGCGGCGCCC TGGACTTGGT ACAGTTGCAG GAGCGTGAAG GACTTAGCCG ACTGCGCTGC 950 TTTTTCAAAA CGGATCCGGG CAATGCTTCG TTTTCTAAAG GATGCTGCTG TTGAAGCTTT 1010 GAATTTTACA ATAAACTTTT TGAAAC 1036

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明ＧＲＰ１７の推定アミノ酸配列と、ヒ
トＧａｄｄ４５及びマウスＭｙＤ１１８の各アミノ酸配
列との比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコ
   ードする塩基配列を含むことを特徴とするＧＲＰ１７遺
   伝子。
2. 【請求項２】配列番号：２で示される塩基配列を含むこ
   とを特徴とするＧＲＰ１７遺伝子。
3. 【請求項３】配列番号：３で示される塩基配列である請
   求項２に記載のＧＲＰ１７遺伝子。