KR100394387B1 - 세포 성장 억제 및 세포 분화 특이적인 지에이디디45감마유전자의 게놈 디엔에이 염기 서열 및 그것의 프로모터 - Google Patents

세포 성장 억제 및 세포 분화 특이적인 지에이디디45감마유전자의 게놈 디엔에이 염기 서열 및 그것의 프로모터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포가 분화될 때 특이적으로 발현되는 유전자인 Gadd45γ 유전자의 게놈 DNA 염기서열 및 그 유전자의 전사를 조절하는 프로모터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Gadd45γ 게놈 DNA는 네 개의 엑손과 세 개의 인트론으로 이루어져 있으며 프로모터는 유전자의 전사가 시작되는 전사 시작 부위에서 5'쪽으로 3 kb 길이에 달하며, Gadd45γ 게놈 DNA와 프로모터는 세포의 사멸과 분화를 촉진하거나 억제하는 약물의 디자인 및 스크리닝에 사용될 수 있으며, 특히 세포의 성장과 분화가 비정상적으로 이루어지는 질병인 암 치료제의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 또한 유전자 치료용 벡터의 프로모터로도 사용할 수 있을 것이다.

Description

세포 성장 억제 및 세포 분화 특이적인 지에이디디45감마 유전자의 게놈 디엔에이 염기 서열 및 그것의 프로모터{Genomic DNA encoding Gadd45γgene and promoter thereof}
본 발명은 세포의 분화와 사멸에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려진 Gadd45γ 유전자의 게놈 DNA, 그것의 프로모터 및 이들의 응용에 관한 것이다.
Gadd45γ 유전자는 세포의 분화와 사멸에 관련된 유전자로, Gadd45γ는 MTK1/MEKK4에 결합하는 단백질로 발견되었다. 종래의 연구 결과에 따르면 Gadd45γ는 세포의 스트레스 신호전달 기작에 관련하고 있으며, 특히 세포의 성장 억제와 사멸에 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 Gadd45γ 유전자의 발현을 세포내에서 증가시켰을 때는 현저한 세포 성장 억제 현상이 관찰되는 것으로 보고되었으며, 세포에 따라서 사멸을 유도하기도 한다는 사실이 보고되었다 (Takekawa M 등, 1998. Cell 13:521-5301; Nakayama K, T 등, 1999. J. Biol. Chem. 274:24766-24772). 뿐만 아니라, 일련의 연구결과는 Gadd45γ 유전자의 발현이 단순한 세포 성장억제 뿐만 아니라, 세포의 분화와도 밀접한 관련이 있다는 것을 암시해주고 있다(Zhang W, I 등, 1999. Oncogene 18:4899-4907).
세포의 분화는 여러 가지 유전자들의 조화된 발현을 통해 일어나는 현상으로 특정 세포가 특정한 기능을 갖게 되는 과정으로, 미분화된 세포가 특정한 기능을 지닌 세포로 분화되기 위해서는 우선 세포 성장의 억제 및, 특정 세포 타입에 특이적인 유전자들의 발현을 동반하게 된다. 본 발명자들은 한국특허출원 1998-54933호에서, Gadd45γ 유전자는 세포 분화를 유도하는 자극의 종류나 세포의 타입에 상관없이 분화의 신호가 개시되었을 때 공통적으로 발현이 증가하는 특징을 지니고 있음을 밝혔다. 이것은 이 유전자가 실재 생체 내에서도 분화와 관련된 중요한 역할을 수행하고 있음을 확인해 준다. 또한 본 발명자들은 위의 한국특허출원을 통해, Gadd45γ 유전자는 정상 유방조직과 비교할 때 암세포로 바뀐 유방 조직에서 낮은 유전자 발현을 보여줌을 밝혔다. 즉 정상 세포가 비정상적으로 왕성히 분열하는 암세포의 상태가 되었을 때 유전자 발현이 현저히 낮아진다는 사실은 당 유전자가 암세포 내에서 기능을 잃어버렸다는 것을 의미하며, 이는 이 유전자의 활성을 조절하는 약물이 암세포의 성장 억제, 사멸에 이용될 수 있다는 것을 시사한다.
본 발명의 목적은 유전자 Gadd45γ의 게놈 DNA 염기서열을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 유전자 Gadd45γ의 전사를 조절하는 프로모터의 염기 서열을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 유전자 Gadd45γ의 프로모터를 이용한, 세포 사멸과 분화를 촉진하거나 억제하는 약물 고안 및 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 유전자 Gadd45γ의 프로모터를 이용한 유전자 치료용 벡터를 제공하는 것이다.
도 1a는 PC12 세포가 신경 세포로 분화됨에 따른 Gadd45γ mRNA의 증가 정도를 보여주는 노던 블롯 분석 결과이다.
도 1b는 C2C12 세포가 근육 세포로 분화됨에 따른 Gadd45γ mRNA의 증가 정도를 보여주는 노던 블롯 분석 결과이다.
도 1c는 L6 세포가 근육 세포로 분화됨에 따른 Gadd45γmRNA의 증가 정도를 보여주는 노던 블롯 분석 결과이다.
도 2는 Gadd45γ유전자의 게놈 유전자 염기서열이다.
도 3는 세포내에서 Gadd45γ 프로모터의 활성을 측정한 그림이다.
도 4a는 M1 백혈병 세포주에 IL-6를 처리하였을 때 Gadd45γ mRNA가 증가함을 보여주는 노던 블롯 분석 결과이다.
도 4b은 M1 백혈병 세포주에 IL-6를 처리하였을 때 Gadd45γ 프로모터의 활성이 증가함을 보여주는 결과이다.
도 5은 다양한 길이의 Gadd45γ 프로모터의 활성 및 그 프로모터의 활성이 전사조절인자인 C/EBPβ와 C/EBPδ에 의해 조절되는 것을 보여주는 결과이다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.
"염기 서열의 변이체"는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 Gadd45γ의 하나 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 염기 서열을 의미한다.
"단백질의 변이체"는 생물학적 또는 면역학적 활성은 유지하면서 Gadd45γ에서 유래된 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 변경된 아미노산 서열을 의미한다.
"Gadd45γ 프로모터"는 서열번호 1의 2864~2973 위치의 염기 서열을 포함하며, 작동가능하게 연결된 유전자에 적절한 조건 하에서 구조적(constitutive) 또는 조절된 전사 활성을 부여하는 염기 서열을 의미한다.
"Gadd45γ 프로모터의 활성 단편"은 서열번호 1의 2864~2973번 위치의 염기 서열 중 일부를 포함하며, 작동가능하게 연결된 유전자에 Gadd45γ 프로모터 활성을 부여하는 염기 서열을 의미한다.
본 발명은 세포의 분화 및 암세포의 생성에 중요한 역할을 담당하는 Gadd45γ 유전자의 게놈 DNA에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 세포의 분화 및 암세포의 생성에 중요한 역할을 담당하는 Gadd45γ 유전자의 게놈 DNA를 밝여 그 구조를 알아내고, 그 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 찾아 그 활성을 분석하였다.
본 발명에서 Gadd45γ또는 이것의 전구체를 코딩하는 DNA 및 Gadd45γ의 프로모터는 다음과 같은 방법에 의해 얻을 수 있다:
1) 사람 세포 DNA를 추출하여 제한효소로 처리하여 얻은 사람 게놈 라이브러리를 파아지 DNA 또는 플라즈미드 DNA에 도입하고,
2) 얻어진 재조합 파아지 DNA 또는 플라즈미드 DNA를 적절한 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 얻고,
3) 얻어진 형질전환체를 배양한 후, 예를 들어 Gadd45γ유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 DNA 프로브를 사용한 하이브리다이제이션에 의해, 형질전환체로부터 목적 DNA가 도입된 파아지 또는 플라즈미드를 분리하고,
4) 재조합 DNA로부터 목적 DNA를 분리하는 것에 의해 얻을 수 있다.
이와 같은 방법으로 도 2에 표시된 Gadd45γ게놈 DNA를 얻을 수 있다.
얻어진 Gadd45γDNA 클론을 Gadd45γcDNA와 비교하여 인트론과 액손을 결정하고, Gadd45γ유전자 발현에 필요한 프로모터 또는 Gadd45γ프로모터 중 Gadd45γ유전자 발현에 필수적인 부분을 결정한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, Gadd45γ 게놈 DNA는 네 개의 엑손과 세 개의 인트론으로 이루어져 있다. 도 2에서 엑손에 해당하는 부분은 밑줄로 표시되어 있고, 염기 서열의 우측에 표시된 숫자는 유전자 전사가 시작되는 엑손의 첫번째 염기를 1로 환산한 숫자이다.
본 발명은 Gadd45γ를 코딩하는 엑손을 포함하는 Gadd45γ게놈 DNA 서열 또는 그것의 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 Gadd45γ게놈 DNA 서열은 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열 또는 그것의 일부로 이루어지며, Gadd45γ단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 DNA 서열이다. 본 발명에 따른 Gadd45γ게놈 DNA 서열은 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열 또는 그것의 일부의 변이체로 이루어지며, Gadd45γ단백질 또는 Gadd45γ단백질의 변이체를 코딩하는 DNA를 포함하는 DNA 서열 역시 포함한다. 한 예로, 본 발명에 따른 Gadd45γ게놈 DNA 서열은 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열 중 1~163, 421~522, 656~928, 957~1471번의 DNA를 포함하는 DNA 서열 또는 이것의 변이체이다.
또한 본 발명은 Gadd45γ 유전자의 발현에 필요한 프로모터(이하 "Gadd45γ 프로모터"라 한다)에 관한 것이다. 본 명세서에서 특별히 한정하는 경우를 제외하고는 Gadd45γ 프로모터는 Gadd45γ 프로모터의 활성 단편을 포함한다.
유전자의 전사를 조절하는 부위(프로모터)는 대개 유전자의 전사가 시작되는 부위(transcription start site)의 5'쪽에 위치해 있으며, 여기에 어떠한 전사조절인자(transcription factor)들이 결합하는가에 따라 유전자의 발현이 조절된다. 즉 특정 유전자의 조직 특이성 및 분화에 따른 발현의 변화 등을 조절하는 부위는 바로 그 유전자의 프로모터가 결정한다고 할 수 있다.
프로모터로 필수적인 부분은 Gadd45γ의 프로모터에 의해 커버되는 일부분으로부터 결정된다. 도 5에서 제시한 바와 같이, 본 발명의 프로모터는 도 2에 표시된 DNA 서열의 -2914~-1의 DNA 서열에서 -110 bp까지는 그 활성이 유지되다가 -110 bp에서 -50 bp가 없어졌을 때는 프로모터 활성이 거의 사라졌다.
본 발명에 따른 Gadd45γ 프로모터는 서열번호 2에 기재된 DNA 또는 이것의 일부를 포함하는 DNA 서열로 이루어진다.
본 발명에 따른 Gadd45γ 프로모터는 서열번호 2에 기재된 DNA 서열 2864~2973번 DNA 또는 이것의 일부를 포함하는 DNA 서열로 이루어진다.
Gadd45γ는 세포가 분화될 때 특이적으로 발현되므로, Gadd45γ 프로모터는특히 세포의 분화 및 사멸이 비 정상적으로 일어남으로 인해 발생되는 질병, 예를 들면 암, 알자이머 병이나 파킨슨 병과 같은 퇴행성 신경계 질환 등에 대한 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 유전자 Gadd45γ의 프로모터를 이용한, 세포 사멸과 분화를 촉진하거나 억제하는 약물 고안 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약물 고안 및 스크리닝 방법은 한 예로, Gadd45γ 프로모터에 연결된 리포터 유전자와 리포터 유전자의 활성을 측정하는 세포-기초 스크리닝 분석법(cell-based screening assay)을 이용하여 수행될 수 있다. 한 예로, 본 발명에 따른 Gadd45γ 프로모터의 활성을 조절하는 약물 스크리닝 방법은 세포에 Gadd45γ 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자를 도입하고, 상기 세포에서 상기 리포토 유전자의 발현 정도를 측정하고, 상기 리포터 유전자가 도입된 세포에 시료 약물을 처리하고, 상기 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하여 시료 약물이 처리되지 않은 상태에서의 발현 정도와 비교하는 것으로 이루어진다. 이러한 방법을 통해 세포내에서 Gadd45γ 유전자의 발현을 억제하거나 증가시키는 표적 약물을 선별할 수 있다. 예를 들면 Gadd45γ 유전자의 발현을 암세포 내에서 증가시킴으로써 표적 암세포의 성장을 억제하고 사멸을 유도하는 기능이 있는 표적 약물을 선별할 수 있다.
뿐만 아니라 본 발명에 따른 프로모터는 외부에서 처리한 사이토카인 IL-6에 의해, 또는 IL-6 신호전달기작을 활성화함에 의해서, 유전자의 발현을 선택적으로 유도할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 프로모터가 최근 유전자 치료에서 사용되기시작한 유도성 프로모터로 사용될 수 있음을 의미한다. 유전자 치료 분야에서 유도성 프로모터의 개발이 중요한 이유는 전통적으로 사용되던 바이러스 프로모터의 비 효율성, 즉 인위적으로 프로모터의 활성을 외부에서 조절할 수 없다는 데서 기인한다. 현재 사용되고 있는 유도성 프로모터에는 스테로이드 호르몬에 의해 발현을 유도할 수 있는 프로모터, 열에 의해 발현을 유도할 수 있는 Hsp70프로모터, X 선 조사에 의해 발현을 유도할 수 있는 Egr-1 프로모터 등이 포함되는데 본 발명에서 개발한 Gadd45γ 유전자의 프로모터는 외부에서 투입한 사이토카인에 의해 발현을 유도할 수 있다는 점에서 현재까지 개발된 유도성 프로모터와는 다른 새로운 유용성을 가진다.
따라서 본 발명은 유전자 치료용 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전자 치료용 벡터는 Gadd45γ의 프로모터에 연결된 표적 유전자로 이루어진다. 여기서 표적유전자라 함은 Gadd45γ 프로모터에 의해 발현이 조절되는 유전자를 의미하며, 표적 유전자의 대표적인 예로는 현재 항암 유전자 치료에 사용중인 사이토신 디아미네이즈(cytonsine deaminase) 유전자나, 타이미딘 카이네이즈(thymidine kinase) 유전자 또는 p53 유전자를 들 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 벡타는 바이러스성 또는 비바이러스성 매체에 의해 세포에 전달될 수 있다. 바이러스성 매체에는 유전자 치료에 사용될 수 있는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스 등을 포함되며, 비바이러스성 매체에는 리포좀, 폴리머 등이 포함된다.
본 발명에 따른 Gadd45γ 프로모터를 포함하는 유전자 치료용 벡터는 예를들어 다음과 같이 사용될 수 있다. Gadd45γ 프로모터에 연결된 표적 유전자로 이루어지는 벡터를 세포내로의 효과적 전달을 목적으로 하는 바이러스성 혹은 비바이러스성 전달매체에 실어 표적 세포, 예를 들면 암세포에 전달하게 되는데 이때 세포 내에서는 Gadd45γ 프로모터의 활성이 유도되지 않으므로 표적 유전자의 발현이 일어나지 않는다. 표적 유전자의 발현을 유도하기 위해 IL-6 혹은 IL-6 신호전달기작을 활성화시킬 수 있는 물질을 처리하게 되며 이는 본 발명의 실시예에서 제시한 바와 같이 Gadd45γ 프로모터의 활성을 유도하게 된다. 즉 원하는 시기에 외부에서 주입한 약물에 의해 Gadd45γ 프로모터의 활성을 선택적으로 유도함으로서 표적 유전자의 발현을 유도하는 것이다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 여러 가지 분화 모델에서 Gadd45γ유전자 발현 양상 조사
세포의 분화 시 Gadd45γ mRNA의 양적 변화를 조사하기 위해 세 가지의 다른 세포 분화 모델을 사용하였다. PC12세포는 호크롬성세포종(pheochromocytoma)로 신경성장인자(NGF)에 의해 신경세포로 분화하는 특징이 있으며, C2C12와 L6는 각각 생쥐 근원세포(myoblast), 흰쥐 근원세포로 분화를 유도하는 자극이 있을 때 근육세포로 분화하는 특징을 지니고 있다. PC12 세포는 DMEM (GibcoBRL)에 10 %의 말 혈청(GibcoBRL)과 5%의 소 태아 혈청, 100unit/ml 페니실린 G 소디움, 100mg/ml 스트렙토마이신 설페이트를 첨가한 배지에서 배양하였다. 분화된 PC12세포로부터 RNA를 얻기 위해서 50ng/ml의 NGF(GibcoBRL)를 위의 배지에 첨가한 뒤 일정시간이 지난 다음 분화된 세포의 모양을 현미경 하에서 육안으로 확인하고, 이때 세포를 시간 별로 수거하였다.
C2C12세포와 L6세포는 모두 DMEM에 10%의 소 태아 혈청, 100unit/ml 페니실린 G 소디움, 100mg/ml 스트렙토마이신 설페이트를 첨가한 배지에서 배양하였다. 이들 세포를 분화시키기 위해서는 각각 2% 말 혈청이 첨가된 DMEM과 5%의 말 혈청이 첨가된 배지로 바꾸어 준 뒤 마찬가지로 현미경 하에서 육안으로 세포의 분화정도를 확인하였다.
각각의 샘플로부터, 산 구안디늄 티오시아네이트 페놀-클로로포름 방법(acid guandinium thiocyanate phenol-chloroform method)에 따라 총 RNA를 분리하였다 (Chomczynski, P., Sacchi, N. (1987). Anal. Biochem. 162, 156-159). 30 mg의 총 RNA를 동량의 RNA 로딩 완충액(50 % 포름아마이드, 6.2 % 포름알데하이드, 20 mM MOPS (3-[N-morpholino]propansulfonic acid), 5 mM 소디움 아세테이트, 1mM EDTA)와 혼합한 뒤, 65 ℃에서 10 분간 변성시켰다. 모든 샘플을 1.2 % 포름알데하이드 젤에서 1시간 동안 100볼드의 전압으로 전기영동하였고, 전개된 RNA는 나일론 멤브래인에 48시간 동안 모세관 방법에 의해 옮겼다. UV 크로스링커(UVP500; Hoefer)를 이용하여 최종적으로 멤브래인을 크로스링킹시켰다(120,000 mJ/cm2). Gadd45γ cDNA 탐침은 Gadd45γ 유전자의 전체 cDNA를 랜덤 프라이머레이블링(random primer labeling) 방법에 의해 [α-32P]dCTP로 표지함으로 얻었다.
위에서 준비한 나이론 멤브레인을 45 ℃에서 1 시간 동안 하이브리다이제이션 완충액 (50 % 포름아미드, 5X SSPE, 5X Denhardt 용액, 0.01 % SDS, 1mg/ml denatured salmon sperm DNA)에서 배양한 뒤 여기에 분리된 탐침을 첨가하여 24 시간 동안 하이브리다이제이션하였다. 멤브래인을 1차 세척액 (2X SSC, 0.1 % SDS)으로 상온에서 10 분간, 2차 세척액 (0.1X SSC, 0.1 % SDS)으로 50 ℃에서 30 분간 세척한 뒤, -70 ℃에서 X-ray 필름에 1 주일간 노출시킨 뒤 현상하였다. 도 1a, 1b, 1c에 나타난 바와 같이, Gadd45γ RNA는 세포가 분화함에 따라 유의하게 증가하였다. PC12 세포가 신경세포로 분화할 때는 분화 유도 후 7일이 지난 다음에 높은 RNA 증가를 보였으며, C2C12와 L6 세포가 근육세포로 분화할 때는 분화 유도 후 1일이 지난 다음부터 많은 양의 RNA가 검출되기 시작했다.
실시예 2. Gadd45γ 유전자의 게놈 DNA 분리
람다 EMBL3 SP6/T7 사람 게놈 라이브러리(Clontech)에서 Gadd45γ 유전자의 게놈 DNA를 분리하기 위해 5 X 106pfu의 파아지를 K802 숙주 박테리아에 접종한 뒤 10장의 150mm petri-dish에 뿌렸다. 8 시간 뒤 파아지에 의한 박테리아의 용혈을 확인하고 이를 나일론 멤브레인에 옮긴 뒤 제조회사에서 제공하는 설명서에 따라 변성 및 크로스링킹시켰다. [α-32P]dCTP로 표지시킨 Gadd45γ cDNA 탐침을 사용하여 서든 블롯 하이브리디제이션 방법에 의해 하이브리디제이션하고 세척하였고 X-ray 필름에 1주일간 노출시킴으로써 Gadd45γ 유전자의 게놈 DNA가 존재하는지를검사하였다. 첫 번째 스크리닝에서 13개의 양성 클론을 얻었다. 이를 다시 동일한 방법으로 2차 및 3차 스크리닝을 거쳐 최종적으로 약 11kb 길이의 인설트(insert)를 포함하는 하나의 클론을 얻었다. 얻어진 클론을 BamH I 제한효소로 절단하여 0.8 % 아가로즈 젤에서 전기영동한 뒤, 방사성 동위원소로 표지한 cDNA 탐침을 이용해서 이를 다시 서든 블롯 하이브리디제이션을 수행하여 약 4.kb의 DNA 단편을 얻었다. 얻어진 단편은 pUC19 플라스미드 벡터에 클로닝하여 DNA 시퀀싱한 결과 최종적으로 Gadd45γ 유전자의 게놈 DNA임을 확인하였다.
게놈 DNA 서열중 RNA를 암호화하고 있는 부위 및 유전자의 전사가 시작되고 있는 부위를 찾기 위하여 RACE(Rapid Amplification of cDNA End)방법을 사용하였다. Gadd45γ 게놈 DNA는 네 개의 엑손과 세 개의 인트론으로 이루어져 있으며, 엑손을 연결시킨 염기서열은 Gadd45γ의 cDNA 염기 서열과 정확히 일치하였다.
실시예 3. Gadd45γ 프로모터의 활성 측정
Gadd45γ 프로모터의 활성을 조사하기 위해 프로모터 부분을 pGL-basic(Promega) 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 프로모터 부위는 단백질 합성 신호 (ATG 코돈)가 있는 부분의 약 80 bp 윗쪽에서 출발하여 5'쪽으로 1.2 kb 크기를 가진다. 이 벡터를 원숭이 신장 세포주인 COS-7 세포주에 LipofectAmine Plus (GibcoBRL)를 이용하여, pRL-TK (Promega)벡터와 함께 도입하였다. DNA를 도입한 지 24시간이 지난 후에 세포를 파쇄하여 단백질 추출물을 얻었으며, 이 추출물 20ml로 Firefly 루시퍼레이즈와 Renila 루시퍼레이즈의 활성을 루미노미터(Luminometer)를 이용하여 측정하였다. Gadd45γ 프로모터의 활성 여부를 조사함에 있어 대조군으로는 프로모터가 포함되지 않은 pGL-basic 벡터와 SV40 프로모터와 인핸서가 포함된 pGL-control 벡터를 각각 사용하였으며, DNA 도입 및 단백질 양에 의해 발생될 수 있는 오차는 Renila 루시퍼레이즈의 활성도로 보정하였다. 실험 결과를 도 3에 나타낸다. Gadd45γ 프로모터는 원숭이 신장 세포내에서 프로모터로서의 활성을 지니고 있음을 알 수 있다.
실시예 4. Gadd45γ 프로모터의 IL-6 의존적 활성 측정
실시예 2에서 제시된 Gadd45γ 프로모터를 M1 백혈병 세포주에 도입한 뒤 이 세포주를 100 ng/ml 농도의 IL-6로 자극하였다. 자극 후 24시간이 지난 다음 실시예 2와 마찬가지로 프로모터의 활성을 조사한 결과 Gadd45γ 프로모터의 활성은 도 4b에 나타난 바와 같이 IL-6를 처리하지 않은 그룹에 비해 약 3배 정도 증가하였다. 이 M1 백혈병 세포주에서 RNA를 추출하여 Gadd45γ mRNA에 대해 노던 블롯을 수행한 결과 세포내 Gadd45γ mRNA 역시 IL-6에 의존적으로 발현하고 있음을 확인하였다(도 4a). 즉 Gadd45γ 유전자의 전사는 IL-6와 같은 사이토카인에 의해 조절되며, 외부에서 처리한 사이토카인으로 프로모터의 활성을 조절할 수 있다.
실시예 5. Gadd45γ 프로모터의 활성을 유도하는 신호전달 기작 및 최소 부위 결정
Gadd45γ 프로모터의 활성이 IL-6 사이토카인의 신호 전달 기작을 매개하는 전사조절인자인 C/EBPβ와 C/EBPδ에 의해 조절되는지 여부를 조사하기 위해 NIH3T3 세포주에 Gadd45γ 프로모터와 C/EBPβ 및 C/EBPδ 발현 벡터를 코-트랜스펙션시켰다. 도 5에서 알 수 있듯이 Gadd45γ 프로모터의 활성은 C/EBPβ 및 C/EBPδ 코-트랜스펙션에 의해 강하게 증가함을 알 수 있었다.
또한 Gadd45γ 프로모터 중에서 어떤 서열이 위와 같은 활성을 매개하는지를 조사하기 위해 순차적 돌연변이(serial deletion construct) 프로모터를 Firefly 루시퍼레이즈 유전자 앞에 클로닝하였다. 도 5에 알 수 있듯이, IL-6 신호 전달 자극이 없는 상태의 Gadd45γ 프로모터의 활성은 -110 단편까지는 약간씩 감소하다가 -110 bp 에서 -51 bp 부위가 잘려나갔을 때 완전히 없어졌다.
마찬가지로 IL-6 신호전달을 매개하는 프로모터의 최소 부위를 결정하기 위해 C/EBPβ 및 C/EBPδ 코-트랜스펙션 실험을 수행하였다. 도 5에서 제시한 바와 같이 -110 bp까지는 그 활성이 유지되다가 -110 bp에서 -50 bp가 없어졌을 때는 C/EBPβ 및 C/EBPδ에 의한 유도효과가 완전히 사라졌다.결론적으로, 프로모터의 활성을 조절하는 최소부위는 전사시작 부위로부터 -110bp까지(서열번호 2의 2864~2973번)임을 알 수 있었다.
본 발명에서 제시한 Gadd45γ 유전자의 프로모터는 항암제 및 퇴행성 신경 질환에 관련된 약물을 고안하고 탐색하는 데 사용할 수 있을 것이다. 또한 본 발명에서 제시한 Gadd45γ 유전자의 프로모터는 유전자 치료용 벡터의 프로모터로 사용될 수 있으며 특히 사이토카인에 의해 조절되는 유도성 프로모터로 사용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, Gadd45γ단백질을 코딩하는 DNA 서열.
  2. 삭제
  3. 서열번호 2에 기재된 DNA서열로 이루어지며 Gadd45γ프로모터 기능을 발휘하는 DNA서열.
  4. 서열번호 2의 2864~2973번 염기서열을 포함하는 Gadd45γ프로모터의 기능을 발휘하는 DNA서열.
  5. 서열번호 2에 기재된 DNA 서열을 가지거나 서열번호 2의 2864~2973번 염기서열을 포함하는 Gadd45γ프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자를 세포에 도입하고, 상기 세포에서 상기 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하고, 상기 리포터 유전자가 도입된 세포에 시료 약물을 처리하고, 상기 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하여 시료 약물이 처리되지 않은 상태에서의 발현 정도와 비교하는 것으로 이루어지는, Gadd45γ 프로모터의 활성을 조절하는 약물 스크리닝 방법.
  6. 서열번호 2에 기재된 DNA 서열을 가지거나 서열번호 2의 2864~2973번의 염기서열을 포함하는 Gadd45γ프로모터에 연결된 표적 유전자로 이루어지는 벡타.
  7. 제6항에 있어서, 상기 벡타가 사이토카인 IL-6 또는 IL-6 신호전달기작을 활성화함에 의해서 상기 표적 유전자의 발현이 유도되는 벡타.
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