JP2015202096A - エビルシフェラーゼの触媒蛋白質の変異遺伝子とその使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]以下の(a)または(b)に記載のルシフェラーゼ変異体:
(a)配列番号:2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
[2]前記(b)のルシフェラーゼ変異体が、以下の(c)に記載のものである、上記[1]に記載のルシフェラーゼ変異体:
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜16個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
[3]前記4番目のアミノ酸がグルタミン酸からアラニン、前記11番目のアミノ酸がアルギニンからグルタミン、前記18番目のアミノ酸がロイシンからグルタミン、および前記27番目のアミノ酸がバリンからロイシンに置換されている上記[1]または上記[2]に記載のルシフェラーゼ変異体。
[4]前記(a)または(b)のルシフェラーゼ変異体が、それぞれ以下の(d)または(e)のルシフェラーゼ変異体である上記[1]に記載のルシフェラーゼ変異体:
(d)配列番号:4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体;
(e)配列番号:4のアミノ酸配列において、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
[5]前記(e)のルシフェラーゼ変異体が、以下の(f)のルシフェラーゼ変異体である上記[4]に記載のルシフェラーゼ変異体:
(f)配列番号:4のアミノ酸配列において、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜16個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
[6]上記[1]〜[5]のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
[7]上記[6]記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
[8]上記[7]記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
[9]上記[8]記載の形質転換体を培養し、上記[1]〜[5]のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、上記[1]〜[5]のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体の製造方法。
[10]上記[1]〜[5]のいずれか1つに記載のルシフェラーゼ変異体、上記[6]記載のポリヌクレオチド、上記[7]記載の組換えベクターおよび上記[8]記載の形質転換体から選択される少なくとも1つを含む、キット。
[11]さらにルシフェリンを含む、上記[10]記載のキット。
[12]ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記[11]記載のキット。
[13]セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、上記[12]記載のキット。
[14]上記[1]〜[5]のいずれか1つに記載のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
[15]ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記[14]記載の方法。
[16]セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、上記[15]記載の方法。
[17]上記[6]記載のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させることを含む、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
[18]ルシフェリンがセレンテラジン類である、上記[17]記載の方法。
[19]セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、上記[18]記載の方法。
本発明のルシフェラーゼ変異体とは、オプロフォーラスルシフェラーゼの分子量19kDaの蛋白質の変異体である。具体的には、本発明のルシフェラーゼ変異体は、配列番号:2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体と実質的に同質の活性を有するルシフェラーゼ変異体を意味する。
(b)配列番号:2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。
前記配列番号:2のアミノ酸配列における11番目のアルギニンと置換する他のアミノ酸は、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、システイン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸であり、好ましくは、グルタミンである。
前記配列番号:2のアミノ酸配列における18番目のロイシンと置換する他のアミノ酸は、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸であり、好ましくは、グルタミンである。
前記配列番号:2のアミノ酸配列における27番目のバリンと置換する他のアミノ酸は、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンであり、好ましくは、ロイシンである。
A群:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、2−アミノブタン酸、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン;
B群:イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸;
C群:アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸;
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸;
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン;
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン;
G群:フェニルアラニン、チロシン。
本発明は、前述した本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAとしては、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞・組織由来のcDNA、細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotal RNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
(i)配列番号:2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;または
(ii)配列番号:2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
配列番号:4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号:3の塩基配列を含有するポリヌクレオチドを挙げることができる。本発明の他の態様のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号:3からなる塩基配列を含有するポリヌクレオチドである。
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド(DNA)を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド(DNA)を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110, pTP5等)、および酵母由来のプラスミド(例えばYEp13, YEp24, YCp50等)があげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、および昆虫ウイルス(例えば、バキュロウイルス)があげられる。また、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター(以上、タカラバイオ社製)、pcDNA3ベクター、PICZ aベクター(インビトロジェン社製)なども好適に使用することができる。
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド(DNA)を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)などがあげられる。バチルス属菌としては、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、COS細胞、CHO細胞、HeLa細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、Sf9、Sf21などがあげられる。
発現ベクターとしては、なかでも低温で発現誘導可能なプロモーター配列を含有する発現ベクターが好ましい。
(1)低温で発現誘導可能なプロモーター配列;および
(2)本発明のポリヌクレオチドを含有するコード配列。
低温で発現誘導可能なプロモーター配列とは、宿主細胞を増殖させる培養条件から、温度を下げることによって蛋白質の発現を誘導可能なプロモーター配列を意味する。低温で発現誘導可能なプロモーターとしては、例えば、コールドショック蛋白質をコードする遺伝子(コールドショック遺伝子)のプロモーターが挙げられる。コールドショック遺伝子のプロモーターとしては、前記したものが挙げられる。
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、本発明のルシフェラーゼ変異体の製造方法を提供する。本発明のルシフェラーゼ変異体は、例えば、前記形質転換体を本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド(DNA)が発現可能な条件下で培養し、本発明のルシフェラーゼ変異体を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明のルシフェラーゼ変異体が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明のルシフェラーゼ変異体が蓄積される。
上記培養物から、本発明のルシフェラーゼ変異体を分離・精製することによって、本発明のルシフェラーゼ変異体を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のルシフェラーゼ変異体の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
発光による検出マーカーとしての利用
本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリン存在下、発光による検出マーカー(以下、「本発明の検出マーカー」)として利用することができる。本発明の検出マーカーは、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイなどにおける目的物質の検出に利用することができる。
本発明のルシフェラーゼ変異体は、レポーター蛋白質としてプロモーターなどの転写活性の測定に利用することもできる。この場合、本発明のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させる。ここで、「接触」とは、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明のルシフェラーゼ変異体を発現する細胞の培養容器にルシフェリンを添加すること、前記細胞とルシフェリンとを混合すること、前記細胞をルシフェリンの存在下で培養することが含まれる。本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド(すなわち、本発明のポリヌクレオチド)を、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列(例えば、エンハンサー)に融合したベクターを構築する。前記ベクターを宿主細胞に導入し、ルシフェリン(発光基質)存在下、本発明のルシフェラーゼ変異体に由来する発光を検出することにより、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列の活性を測定することができる。さらに、発現したルシフェラーゼ変異体をセレンテラジン類と反応させ、生成する発光を高感度検出装置により可視化、画像化することもできる。
本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリンが酸素分子で酸化されてオキシルシフェリンが励起状態で生成される反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは可視光を発して基底状態となる。よって、本発明のルシフェラーゼ変異体は、アミューズメント用品の材料の発光基材として好適に使用することができる。アミューズメント用品としては、たとえば、発光シャボン玉、発光アイス、発光飴、発光絵の具等があげられる。本発明のアミューズメント用品は、通常の方法によって製造することができる。
本発明のルシフェラーゼ変異体は、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法による分子間相互作用の原理を利用した生理機能の解析や酵素活性の測定等の分析方法に利用することができる。
本発明は、本発明ルシフェラーゼ変異体、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクター、本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにルシフェリンを含んでいてもよい。
本発明のキットは、上述したレポーター蛋白質もしくはレポーター遺伝子を用いた測定、発光による検出マーカー、BRET法による生理機能の解析または酵素活性の測定などに利用することができる。また、後述の発光反応方法に用いることもできる。
発光活性
本発明のルシフェラーゼン変異体は、ルシフェリンを酸素分子で酸化して励起状態のオキシルシフェリンを生成させる反応を触媒する活性を有する。励起状態のオキシルシフェリンは、基底状態となる際に可視光を発する。すなわち、本発明のルシフェラーゼ変異体は、ルシフェリンを基質とする発光反応を触媒し、発光を生じさせる活性を有する。この活性を、本明細書において、「発光活性」と称することがある。
本発明のルシフェラーゼ変異体を用いた、ルシフェリンを基質とする発光反応は、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることにより行うことができる。ここで、「接触」とは、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを同一の反応系に存在させることを意味し、例えば、ルシフェリンを収容した容器に本発明のルシフェラーゼ変異体を添加すること、本発明のルシフェラーゼ変異体を収容した容器にルシフェリンを添加すること、本発明のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを混合することが含まれる。反応条件としては、オプロフォーラスルシフェラーゼを用いた発光反応に通常用いられる条件またはそれに準じた条件で行うことができる。
本発明のルシフェラーゼ変異体の、ルシフェラーゼ活性は、ハロゲン化物イオン、非イオン性界面活性剤などにより活性化され得る。
N末端領域に変異を導入したnanoKAZ遺伝子の調製は、Ho et al., Gene (1989) 77: 51-59記載の方法に従い、PCR法により行った。具体的には、pcDNA3-GLsp-dnKAZを鋳型として、4種のPCRプライマーを用いて、PCRキット(タカラバイオ社製)にて2カ所のPCR(サイクル条件25サイクル;1分/94℃、1分/50℃、1分/72℃)を実施し、増幅した2種のDNA断片を鋳型として2回目のPCRを実施することにより、目的の変異遺伝子を調製した。
まず、Inouye et al (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 437: 23−28に記載のpCold−ZZ−P−nanoKAZを鋳型として以下のプライマーを用いて、PCR法により遺伝子増幅した。
nanoKAZ-3C/XbaI(5’ gccTCTAGATTAGGCCAGGATTCTCTCGCACAGTCT 3’:アンダーラインXbaI 配列)(配列番号:10)
T7(5' TAATACG ACTCACTATAGGG 3')(配列番号:12)
T7(5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3')(配列番号:12)
nKAZ-2R/AQQL(5' CAG GCT GCT CAA GCC GCC CTG CTC CAG GAC CTG GTC TTG GTT GTA GCC GGC GGT CTG TTG CCA GTC GCC GAC GAA GTC TGC CAG GGT GAA GAC 3')(配列番号:13)
nKAZ-1F/AQQL(5' TTC ACC CTG GCA GAC TTC GTC GGC GAC TGG CAA CAG ACC GCC GGC TAC AAC CAA GAC CAG GTC CTG GAG CAG GGC GGC TTG AGC AGC CTG TTC 3')(配列番号:14)
BGH-R(5’ TAG AAG GCA CAG TCG AGG 3’)(配列番号:15)
大腸菌内での変異体発現は、ZZ融合蛋白質として発現を行なった。具体的には、大腸菌内で、可溶性蛋白質としてnanoKAZ変異体蛋白質を発現するために、発現ベクターpCold-ZZ-P-X(Inouye & Sahara, Protein Express. Purif. (2009) 66:52-57に記載)を使用した。
ZZ融合nanoKAZ変異体を大腸菌において発現させるため、実施例2で作製した組換えプラスミドおよびコントロールベクターとしてpCold-ZZ-P-nanoKAZを用いた。
実験例3で得られた可溶性画分溶液5 μLを、1μg のセレンテラジン(CTZ)(JNC社製)またはその類縁体を含む100μLの50 mM Tris-HCl (pH 7.6)-10 mM EDTAに加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、60秒間で測定し、表2に相対最大発光強度(Imax)と括弧内に60秒間の積算値を相対発光強度で表記した。
基質特異性実験に使用したセレンテラジン類縁体は、それぞれ論文記載の方法で合成した。具体的には、bis-セレンテラジンはNakamura et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38:6405-6406に記載の方法で、フリマジン(Furimazine)はHall et al. (2012) ACS Chem. Biol. 16; 848-1857に記載の方法で、h-セレンテラジンはInouye et al (2010) Anal. Biochem. 407:247-252に記載の方法で、6h-セレンテラジン及び6h-f-セレンテラジンはInouye et al (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun. 437: 23-28 に記載の方法で合成した。f-セレンテラジンはProlume社より入手した。ZZ融合nanoKAZ変異体の発光活性は、実施例4記載の方法で測定した。
ガウシアルシフェラーゼの分泌シグナル配列を使用してnanoKAZ変異体を動物培養細胞で分泌発現するベクターの構築は以下の通りである。
実施例1で得られた変異遺伝子断片をPCR精製キット(キアゲン社製)で精製し、常法により制限酵素EcoRI/XbaIにて消化した後、pcDNA3-GLspベクターのEcoRI-XbaI 部位に連結することによって、pcDNA3-GLsp-nanoKAZ-AQQL、pcDNA3-GLsp-nanoKAZ-KVAおよびpcDNA3-GLsp-nanoKAZ-FLMを構築した。DNA シークエンサー(ABI社製)により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。
実施例6で得られたpcDNA3-GLsp-nanoKAZ-AQQL、pcDNA3-GLsp-nanoKAZ-KVAおよびpcDNA3-GLsp-nanoKAZ-FLMより、常法により制限酵素Asp718/XbaIにて消化し得られたDNA断片を、pcDNA3ベクター(インビトロジェン社製)のAsp718/XbaI 部位に連結することによって、pcDNA3-nanoKAZ-AQQL、pcDNA3-nanoKAZ-KVAおよびpcDNA3-nanoKAZ-FLMを構築した。DNA シークエンサー(ABI社製)により塩基配列を決定することにより、インサート遺伝子配列の確認を行った。
(1)発現プラスミドの精製
実施例6および実施例7にて得られたプラスミドを精製するため、発現プラスミドを有する宿主大腸菌株JM83を培養し、プラスミド精製キット(QIAGEN社製)にて精製後、1μg/μLの濃度になるよう滅菌水に溶解した。同様に、内部標準のためのホタルルシフェラーゼベクター(pGL4.13 [Luc2/sv40]:プロメガ社製)を精製した。
チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞株CHO-K1株を、10%(v/v)牛胎児血清(バイオウエスト社製)を含むHam’s F-12培地(和光純薬社製)にて培養した。CHO-K1細胞を2 x 105 細胞/ウエル/2 mL培地にて6 ウエルプレートに播種し(n = 2)、インキュベーター中37 ℃、5 %(v/v) CO2にて培養した。24時間後、精製した組換えプラスミドをFuGene HD(プロメガ社製)トランスフェクション試薬を用いて、CHO-K1細胞にトランスフェクションし、次の実験に用いた。具体的には、100μL の培地に、組換えプラスミド1μgとpGL4.13 [Luc2/sv40]内部標準ベクター0.1μgと、FuGene HD 3.3μLを加え、室温で15分間静置した。100μLのDNA-FuGene 複合体溶液を、6ウエルの細胞に添加し、46時間培養後、培養液を回収した。
実施例8で得られた培養液5μLを、1μg のセレンテラジン(JNC社製)を含む100μLの30mM Tris-HCl (pH 7.6)-10 mM EDTA(和光純薬)に加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)にて60秒間測定し、表3に最大発光強度(Imax)と括弧内に60秒間の積算値を相対発光強度で表記した。
実施例9に記載の方法で、動物培養細胞発現分泌シグナル配列を用いて分泌発現したnanoKAZ変異体の培養液の発光活性を測定した。その結果を表3に示す。表3の結果から、nanoKAZ変異体のうちnanoKAZ-AQQLは細胞からの分泌が認められ、セレンテラジンを発光基質とした時の発光活性がnanoKAZの約20倍となる事が明らかとなった。すなわちnanoKAZ-AQQLは分泌可能な変異体であり、かつセレンテラジンを最も良い基質として利用可能である変異体である。
実施例9に記載の方法で、動物培養細胞で分泌シグナル配列を使用しないで発現したnanoKAZ変異体の培養養液中の発光活性を測定した。その結果を表4に示す。表4の結果から、分泌シグナル配列のないnanoKAZ変異体のうち、nanoKAZ-AQQLは細胞からの分泌が認められ、セレンテラジンを発光基質とした時の発光活性がnanoKAZの約18倍となる事が明らかとなった。この発現量は、表3記載の分泌シグナル配列を有するnanoKAZ-AQQLの発現の場合の約20倍とほぼ同じである。すなわちnanoKAZ-AQQLは発現分泌シグナル配列を使用なしでも分泌可能な変異体である。また、分泌シグナル配列の有無によらず培養液に分泌したnanoKAZ は、どちらの蛋白質も基本構造は同一と考えられことから、その基質特性も同一と推定できる。以上のことから、nanoKAZ変異体nanoKAZ-AQQLは、真核細胞生物の分泌シグナル配列の有無にかかわらず、動物培養細胞で分泌発現できる変異体であり、かつセレンテラジンを最も良い基質として利用可能である変異体である。
[配列番号:2] nanoKAZのアミノ酸配列である。
[配列番号:3] nanoKAZ-AQQLの塩基配列である。
[配列番号:4] nanoKAZ-AQQLのアミノ酸配列である。
[配列番号:5] nanoKAZ-KVAの塩基配列である。
[配列番号:6] nanoKAZ-KVAのアミノ酸配列である。
[配列番号:7] nanoKAZ-FLMの塩基配列である。
[配列番号:8] nanoKAZ-FLMのアミノ酸配列である。
[配列番号9] 実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nanoKAZ-1N/EcoRI)。
[配列番号10]実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nanoKAZ-3C/XbaI)。
[配列番号11]実施例で用いたプライマーの塩基配列である(GLsp-1R/EcoRI)
[配列番号12]実施例で用いたプライマーの塩基配列である(T7)。
[配列番号13]実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nKAZ-2R/AQQL)。
[配列番号14]実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nKAZ-1F/AQQL)。
[配列番号15]実施例で用いたプライマーの塩基配列である(BGH-R)。
[配列番号16]実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nKAZ-4R/KVA)。
[配列番号17]実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nKAZ-3F/KVA)。
[配列番号18]実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nKAZ-6R/FLM)。
[配列番号19]実施例で用いたプライマーの塩基配列である(nKAZ-5F/FLM)。
Claims (19)
- 以下の(a)または(b)に記載のルシフェラーゼ変異体:
(a)配列番号:2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。 - 前記(b)のルシフェラーゼ変異体が、以下の(c)に記載のものである、請求項1に記載のルシフェラーゼ変異体:
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、4番目のグルタミン酸、11番目のアルギニン、18番目のロイシン、および27番目のバリンが他のアミノ酸に置換され、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜16個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。 - 前記4番目のアミノ酸がグルタミン酸からアラニン、前記11番目のアミノ酸がアルギニンからグルタミン、前記18番目のアミノ酸がロイシンからグルタミン、および前記27番目のアミノ酸がバリンからロイシンに置換されている請求項1または2に記載のルシフェラーゼ変異体。
- 前記(a)または(b)のルシフェラーゼ変異体が、それぞれ以下の(d)または(e)のルシフェラーゼ変異体である請求項1に記載のルシフェラーゼ変異体:
(d)配列番号:4のアミノ酸配列を含有するルシフェラーゼ変異体;
(e)配列番号:4のアミノ酸配列において、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。 - 前記(e)のルシフェラーゼ変異体が、以下の(f)のルシフェラーゼ変異体である請求項4に記載のルシフェラーゼ変異体:
(f)配列番号:4のアミノ酸配列において、4番目、11番目、18番目、27番目、33番目、43番目、44番目、54番目、68番目、72番目、75番目、90番目、115番目、124番目、138番目および166番目の位置以外で1〜16個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含有し、かつルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼ変異体。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
- 請求項6記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項7記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
- 請求項8記載の形質転換体を培養し、請求項1〜5のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を生成させる工程を含む、請求項1〜5のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体、請求項6記載のポリヌクレオチド、請求項7記載の組換えベクターおよび請求項8記載の形質転換体から選択される少なくとも1つを含む、キット。
- さらにルシフェリンを含む、請求項10記載のキット。
- ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項11記載のキット。
- セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、請求項12記載のキット。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のルシフェラーゼ変異体とルシフェリンとを接触させることを含む、発光反応を行う方法。
- ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項14記載の方法。
- セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、請求項15記載の方法。
- 請求項6記載のポリヌクレオチドをレポーター遺伝子として用い、当該レポーター遺伝子がコードするルシフェラーゼ変異体をルシフェリンに接触させることを含む、プロモーター制御に関与する配列の活性を測定する方法。
- ルシフェリンがセレンテラジン類である、請求項17記載の方法。
- セレンテラジン類がセレンテラジン、h-セレンテラジンまたはf-セレンテラジンである、請求項18記載の方法。
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