KR101661913B1 - 해파리 유래 녹색형광단백질을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오완해파리(Aequorea victoria) 유래 녹색형광단백질을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물 및 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 항산화 효과 및 세포 증식 효과를 나타내므로, 피부 노화 완화 또는 피부 주름 개선 등의 기능성 화장료 원료로 사용할 수 있을 것이다.

Description

해파리 유래 녹색형광단백질을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물{Cosmetic composition having antioxidant activity comprising green fluorescent protein from jellyfish as effective component}

본 발명은 해파리 유래 녹색형광단백질을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물 및 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.

산화 스트레스란 인체의 에너지 생성과정 중에 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생산과 항산화 방어 기구의 균형이 무너진 상태라고 정의하고 있다. 즉, ROS의 과잉 생산과 항산화 능력의 저하가 산화스트레스를 초래한다. ROS는 단백질을 산화 및 변성시켜 DNA의 변성을 일으킨다. 이런 이유로 산화 스트레스는 세포 및 조직을 상해하고, 생체 기능을 저해함으로써, 동맥 경화, 암 등 많은 질환에 관여하며, 노화를 촉진시킨다고 알려져 있다.

녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)은 1962년 일본의 해양생물학자인 시모무라 오사무가 오완해파리(Aequorea victoria)의 형광 물질을 연구하는 도중 처음 발견되었으며, 1969년 Hasting과 Morin에 의해 녹색형광 단백질로 명명되었다. GFP는 생체 내에서 칼슘에 의해 활성된 발광단백질(photoprotein)이나 루시페레이스-옥시루시페린 복합체의 에너지를 운반하는 에너지 전달 수용체로 작용하며, 에쿼린(aequorin)으로부터 에너지를 받아 508nm의 녹색 형광을 방출하는 2차 형광 단백질로서 작용한다. 세포에 이 GFP를 암호화하고 있는 DNA나 mRNA가 존재할 경우, GFP 단백질이 세포 내에서 합성되어 강한 형광을 발한다. 발현 정도를 조사하고 싶은 유전자에 GFP를 암호화하는 서열을 연결하면 원하는 유전자가 발현하는 장소에서 GFP가 형광을 발현하게 되므로, 유전자 발현을 조사하는데 많이 사용되고 있다. 특히 관찰이 용이하고 독성을 지니고 있지 않다는 장점으로 인해, 유전자 발현의 유무, 장소 및 시간 측정 등 다양한 분야에 사용되고 있다.

238개의 아미노산으로 구성된 녹색형광단백질은 약 27kDa의 단백질이다. 녹색형광단백질의 둘레에는 11개의 베타 병풍(beta sheet) 구조가 베타 베럴 (beta barrel)을 이루고 있으며, 녹색형광단백질의 위, 아래에는 각각 루프 구조가 존재한다. 베타 베럴 내부에는 세린65-타이로신66-글라이신67이 존재하며, 이 세 가지 아미노산이 형광체(fluorophore)를 이루며, 이로 인해 녹색 형광이 만들어진다.

식물체는 미생물과 달리 포유동물 단백질의 활성에 필수적 요소인 번역 후 변형(posttranslational modification) 과정이 수행되는 진핵생물 단백질 합성 경로를 갖고 있다. 따라서 식물체를 이용한 단백질 발현 시스템의 사용은 진핵세포인 동물에서 발현되는 단백질과 거의 유사하다고 할 수 있다.

일반적으로 동물에서 유래한 재조합 단백질의 합성은 동물 세포주를 이용해 왔지만 대량 발현 및 분리, 정제 등의 문제점에 따른 많은 비용이 소비되어 대장균을 포함한 원핵생물을 이용한 대량 발현 등이 시도되어 왔다. 하지만 대장균에서 동물 유래 재조합 단백질의 합성은 낮은 전사 및 해독 효율 등으로 유전자의 발현 수율이 낮거나 생성된 단백질의 3차 구조가 불안정하여 단백질의 분해 혹은 활성이 없는 봉입체(inclusion bodies)의 형태로 세포 내에 존재하는 문제점이 있다.

식물에서 외래 단백질을 생산할 경우 숙주 식물체의 선발, 사용할 프로모터 및 식물체에 도입할 대상 유전자의 디자인(해당 유전자의 식물 코돈화 및 인트론 제거) 등이 중요하며, 더불어 이와 같은 사항들을 고려하여 생산된 외래 단백질을 실질적으로 이용하기 위해서는 단백질의 분리 및 정제 방법이 매우 중요하다. 그러나, 현재까지 식물체에 발현된 단백질의 효율적인 분리 및 정제는 성공적으로 이루어지지 않고 있다. 진핵세포에서 발현되는 단백질과 거의 동일한 단백질을 획득할 수 있는 식물체에서 단백질의 효율적인 분리 및 정제 방법의 개발은 결국 원핵세포에서의 문제점 등을 해결할 수 있는 원동력이 될 것이다.

한편, 한국등록특허 제1536215호에는 '해파리 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염, 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 해파리 유래 녹색형광단백질을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 오완해파리(Aequorea victoria)에서 유래한 녹색형광단백질의 아미노산 서열을 식물체의 코돈에 최적화하여 염기서열을 제작하였고, 이를 담배 식물체에 형질전환하여 재조합 녹색형광단백질을 생산하였고, 생산된 녹색형광단백질이 우수한 자유라디칼 소거능을 보임과 동시에 피부섬유아세포의 세포증식 효과를 보임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 해파리 유래 녹색형광단백질을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 해파리 유래 녹색형광단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 해파리 유래 녹색형광단백질(GFP)은 세포 내 항산화 효과 및 피부 세포 증식 효과를 나타내므로, 피부 노화 완화 또는 피부 주름 개선 등의 기능성 화장료 원료로 사용할 수 있을 것이며, GFP의 특성을 이용, 시료에 자외선을 조사하여 육안으로 손쉽게 시료 중의 목적 단백질의 추적이 가능하므로, 추후 GFP를 융합파트너로써 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

도 1은 녹색형광단백질(GFP) 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pRD400의 모식도이다.
도 2는 GFP 형질전환 식물체에서 GFP의 발현 양상을 확인한 사진으로, A는 야생형 담배, B는 형질전환 담배 식물체의 잎 그리고 C는 형질전환 식물체의 조직 추출물의 상층액 형광을 확인한 결과이다.
도 3은 일시적 형질감염(transient transfection) 식물체에서 발현된 GFP의 발현 여부와 분리 및 정제를 확인하기 위하여 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동한 결과이다. A는 형질전환 식물체와 비형질전환 식물체의 조직 파쇄물 상층액을 확인한 결과이며, B는 형질전환 식물체의 상층액을 정제한 후의 결과를 나타낸다. M, 크기 마커; 1, 형질전환체의 조직 파쇄물 상층액; 2, 대조군(비형질전환체의 조직 파쇄물 상층액); 화살표, GFP.
도 4는 GFP의 항산화 효능을 알아보기 위해 DPPH 실험을 수행한 결과이다.
도 5는 GFP를 처리한 피부섬유아세포의 세포 증식을 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 확인한 사진이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해파리 유래 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 해파리는 오완해파리(Aequorea victoria)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 녹색형광단백질은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 식물체 코돈 최적화된 녹색형광단백질 코딩 유전자를 식물체에 형질전환하여 발현시켜 생산할 수 있으며, 예를 들면, 상기 해파리 유래 녹색형광단백질은 담배 식물체에서 생산한 녹색형광단백질로, 높은 자유라디칼 소거능을 가지고 있어, 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 항산화 활성을 가지게 되는 것이다.

본 발명에 따른 해파리 유래 녹색형광단백질의 범위는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 항산화 활성을 의미한다.

본 발명은 또한, 상기 해파리 유래 녹색형광단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 식물체 코돈 최적화된 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 해파리 유래 녹색형광단백질 코딩 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로는, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

"코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 본 발명의 상기 서열번호 2의 염기서열은 해파리 유래 녹색형광단백질 코딩 유전자가 담배 식물체 내에서 발현될 수 있도록 식물체의 코돈에 최적화된 서열이다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 해파리 유래 녹색형광단백질을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 해파리는 오완해파리(Aequorea victoria)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 해파리 유래 녹색형광단백질은 담배 식물체에서 생산한 녹색형광단백질로, 우수한 피부 세포 증식 효과와 높은 자유라디칼 소거능을 보이므로, 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 피부 재생을 통한 주름 개선 및 항노화 화장료로 사용될 수 있는 것이다.

본 발명에 따른 상기 해파리 유래 녹색형광단백질의 범위는 전술한 바와 같다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 이는 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 녹색형광단백질(GFP)를 포함하는 식물 발현용 벡터 제작

GFP를 포함하는 식물 발현용 벡터를 제작하기 위해 GFP를 포함하는 DNA 도메인 및 종결부위(stop codon)로 구성된 뉴클레오타이드 서열을 디자인하였고(서열번호 2: Nco Ⅰ-GFP-Bgl Ⅱ; 도 1), PBI, National Research Centre(캐나다)에서 화학적으로 합성하였다. 상기와 같은 뉴클레오타이드 서열의 디자인은 GFP의 5'-측면 부위에 식물 발현용 35S 프로모터를 부착시키고 3'-측면 부위에 nos 터미네이터를 추가시켜 해당 유전자가 식물에서 발현이 가능하도록 하기 위한 것이다. 즉, 35S 프로모터 및 nos 터미네이터 사이에 유전자 또는 유전자 카세트를 도입시킬 수 있는 클로닝 사이트를 가지고 있는 pBI121의 클로닝 사이트인 Nco I과 Bam HI에 유전자를 클로닝하기 위한 것으로 Nco I은 Nco I과 상보적이며, Bgl Ⅱ는 Bam HI과 상보적인 제한효소로, 클로닝 시 각각의 제한효소가 서로 결합이 된 후에는 제한효소 인식부위가 제거되어 컨스트럭트에 포함되어 있는 클로닝 사이트를 효과적으로 이용할 수 있게 되는 것이다.

상기와 같이 제작된 35S 프로모터, GFP 합성 유전자와 nos 터미네이터가 연결되어 있는 유전자 발현 카세트를 Hind Ⅲ 및 EcoR I 효소로 처리하여 절단한 후 분리, 정제하였다. 이 유전자 발현카세트를 식물 발현용 바이너리 벡터인 pRD400에 도입하기 위하여 pRD400을 제한효소 Hind Ⅲ 및 EcoR I 효소로 처리하여 절단한 후 분리, 정제 하였다. 상기 분리, 정제한 해당 DNA들을 회수한 후 동일한 제한효소 처리에 의해 절단된 pRD400 벡터에 혼합한 후, 이 혼합물에 라이게이션 완충액(KOSCO, 한국) 및 T4 리가아제(KOSCO, 한국)를 첨가한 후 1시간 이상 16℃에서 반응시켰다. 그런 다음, 반응물을 염화칼슘(CaCl₂)으로 처리된 컴피턴트 세포(E. coli strain DH5α, Promega, 미국)에 형질전환시킨 후 항생제 카나마이신(100㎎/㎖)이 포함된 LB 배지에서 배양하며 항생제 저항성 균주를 선별하였다. 도 1은 녹색형광단백질(GFP) 유전자를 포함하는 pRD400-GFP의 유전자 지도를 나타내는 모식도이다.

실시예 2. 식물체로 GFP를 포함하는 식물발현용 벡터의 도입

2-1. 아그로박테리움 GV3101 배양액의 제조

실시예 1에서 제작한 재조합 pRD400-GFP 벡터를 접합(conjugation)에 의하여 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium Tumefaciens) GV3101(Mp90)에 도입하였다(Plant cell rep., 1996, 15(11):799-803). 재조합 pRD400-GFP 벡터를 가진 대장균 및 아그로박테리움 튜머파시엔스 GV3101(Mp90)를 각각 LB 액체배지에서 대수기까지 배양한 후, 이들 각각의 세포들을 에펜도르프 튜브에 1:1로 혼합한 다음 30초간 원심 분리하여 세포들을 농축시키고 28℃에서 1-2일 동안 정치배양을 하였다. 그 후, 세포들이 든 에펜도르프 튜브를 살살 흔들어 농축된 세포를 부유화시킨 다음, 50 ㎎/ℓ 카나마이신 및 30㎎/ℓ 겐타마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말하고, 28℃에서 2일 동안 배양한 후 콜로니를 선별하였다.

pRD400-GFP를 갖는 아그로박테리움 튜머파시엔스를 LB 액체배지에 접종한 후 28℃에서 2일간 배양하여 종균(seed culture)으로 사용하였다. 충분히 배양된 종균을 LB 액체배지에 최종 배양 볼륨의 1/50과 항생제(50 ㎎/ℓ 카나마이신)를 넣고 600㎚에서 흡광도 1.5에 도달할 때까지 약 18시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 상온에서 3,500rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, 균체를 10mM 염화마그네슘(MgCl₂) 용액(BA 0.2ppm, 아세토시린곤 150μM 함유)에 현탁한 후 3시간 이상 상온에서 적응시킨 후 식물체의 감염에 사용하였다.

2-2. 식물세포의 준비 및 아그로인필트레이션(agroinfiltration)

먼저 소독한 담배(Nicotiana benthamiana)의 종자를 파종하여 3주 이상 배양한 후 온실에서 순화시켰다. 순화된 식물체의 잎사귀에 GFP 유전자를 가진 pRD400-GFP 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스 GV3101(Mp90) 액을 바늘을 제거한 1㎖ 주사기(녹십자, 한국)에 삽입 후 이를 담배 잎의 뒷면에 고르게 퍼질 때까지 주입하였다. 아그로박테리움이 주입된 식물체는 10분에서 1시간이 경과하면 원래의 상태를 회복하게 된다. 아그로박테리움이 주입된 식물체는 배양 3일이 경과한 후 5일 이내에 수확하여 하기 실시예 3의 방법을 이용하여 분석하였다.

실시예 3. 형질전환 식물체에서 도입 유전자의 발현 분석

상기 실시예 2에서 확보한 형질전환 식물체의 유전자 발현 확인은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, GFP 유전자의 발현을 확인하기 위해 담배 식물체의 잎을 채취한 다음, 암실에서 휴대용 자외선 램프(파장 길이 366nm)를 이용하여 형광이 발색되는지 관찰하였다. 유전자가 도입된 잎의 세포들은 GFP가 발현되면 암상태에서 자외선을 조사하면 형광을 발하게 된다. 본 발명에서 GFP 유전자가 도입된 식물체의 잎은 자외선 조사에 의해 형광이 확인되므로, GFP 유전자가 도입되어 발현되었음을 확인할 수 있었다(도 2).

실시예 4. 식물체로부터 GFP의 정제 및 분리

식물체로부터 GFP 단백질을 분리하기 위해 적당량의 액체질소가 들어있는 막자사발에 GFP 유전자가 도입된 담배의 잎 1g을 넣고 조직을 분쇄하였다. 그 후, 분쇄한 식물 조직 생중량 0.5g 당 단백질 분해효소 억제제를 함유한 추출완충액(250mM 수크로스, 1M Hepes, 1mM MgCl₂ 및 1mM DTT)을 2㎖ 첨가하여 단백질을 추출하고, 상기 추출액을 12,000rpm, 4℃에서 30분 이상 원심분리한 후 상등액을 취한 후 상기 용액을 Sepabeads Resin Brominated Styrenic Adsorbent(Sorbent Technologies, Inc., 미국)를 사용하여 최종적으로 GFP를 분리, 정제하였다.

분리 정제한 GFP의 확인을 위해, 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법으로 확인한 결과, 25~35kDa 부근에서 분리, 정제한 GFP를 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 5. GFP의 항산화 효능

GFP의 항산화 효능을 측정하기 위해 자유라디칼 소거 효과 측정 방법 중 하나인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 분석을 수행하였다.

DPPH 분석 시 GFP의 대조군으로 L-아스코르브산(Ascorbic acid)을 사용하였다. 실험 방법은 GFP와 L-아스코르브산을 각각 10μM 농도로 준비하였으며, DPPH는 0.2mM 농도로 준비하였다. 각각을 1:1로 혼합한 후 37℃에서 30분 방치하였다. 이 후 ELISA 리더로 520nm 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거능(%)은 하기 식 1로 계산하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.

자유라디칼 소거능(%) = 100-((B/A)*100) (식 1)

[A: 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도

B: 시료를 처리한 대조군 또는 실험군의 흡광도]

그 결과, GFP는 대조군보다 약 4배 높은 자유라디칼 소거능을 보였다(도 4). 따라서, GFP는 높은 항산화 효능을 가지고 있으며, 이는 GFP 단백질의 항산화 효능에 의해 피부 노화 방지 효과를 가질 수 있다는 것을 의미하였다.

실시예 6. GFP의 활성 측정 - 피부섬유아세포 세포 증식 효과

실시예 4에서 최종 분리, 정제된 GFP의 존재가 확인된 분획을 시료로 택하여 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts adult, HDFa cell)의 세포 증식 효과를 확인하였다.

GFP의 세포 증식 활성 측정을 위해 배양한 피부섬유아세포에 0, 0.02 ppm, 0.2 ppm, 2 ppm 농도의 GFP를 처리한 후 3일 동안 37℃에서 배양하고, 이 후 크리스탈 바이올렛 염색법으로 세포 증식 여부를 확인하였다. 그 결과, GFP 처리 농도 증가에 따른 피부섬유아세포의 세포 수 증식 효과를 확인할 수 있었다(도 5).

상기의 결과들을 통해, GFP는 우수한 항산화 효능과 피부 재생 효능을 가지고 있다는 것을 확인하였다.

<110> Nexgen Biotechnologies, Inc. <120> Cosmetic composition having antioxidant activity comprising green fluorescent protein from jellyfish as effective component <130> PN15459 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 238 <212> PRT <213> Aequorea victoria <400> 1 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ala Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 2 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP <400> 2 atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60 gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120 aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180 gtcactactt tcacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacgg 240 catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300 aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360 aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420 ttggaataca actataaccc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480 atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540 cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600 ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660 cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaatag 717

Claims (6)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 해파리 유래 녹색형광단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 녹색형광단백질은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 식물체 코돈 최적화된 녹색형광단백질 코딩 유전자를 식물체에 형질전환하여 발현시켜 생산한 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
6. 삭제

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