JP2014525899A - エフェクター機能を有する抗ｃｘｃｒ４抗体および癌治療のためのその使用 - Google Patents

エフェクター機能を有する抗ｃｘｃｒ４抗体および癌治療のためのその使用 Download PDF

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Abstract

本出願は、エフェクター機能を誘導することができる抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体を投与することにより癌を治療する方法に関する。

Description

本出願は、エフェクター機能を誘導することができる抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体を投与することにより癌を治療する方法に関する。
ケモカインは、特に免疫応答中のケモカイン勾配として知られるリガンドの化学的勾配に沿った白血球の遊走を制御する小さな分泌型ペプチドである（Zlotnick A. et al., 2000）。これらは、ＮＨ２末端システイン残基の位置に基づいて、２つの主要なサブファミリー、ＣＣおよびＣＸＣに分類され、Ｇタンパク質共役受容体に結合し、その２つの主要なサブファミリーはＣＣＲおよびＣＸＣＲと呼ばれている。これまでに５０種類を超えるヒトケモカインおよび１８種類のケモカイン受容体が発見されている。
多くの癌が、腫瘍の免疫細胞浸潤ならびに腫瘍細胞の成長、生存、遊走、および血管新生に影響を与える複雑なケモカインネットワークを有する。免疫細胞、内皮細胞および腫瘍細胞はそれら自体、ケモカイン受容体を発現し、ケモカイン勾配に応答することができる。ヒト癌生検サンプルおよびマウス癌モデルの研究により、癌細胞のケモカイン受容体発現が転移能の上昇に関連することが示されている。異なる種類の癌に由来する悪性細胞は異なるケモカイン受容体発現特性を示すが、ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）が最も多く見られる。上皮、間葉および造血起源の少なくとも２３の異なる種類のヒト癌に由来する細胞がＣＸＣＲ４受容体を発現する(Balkwill F. et al., 2004)。
ケモカイン受容体４（フーシン、ＣＤ１８４、ＬＥＳＴＲまたはＨＵＭＳＴＲとしても知られる）は、３５２または３６０のアミノ酸を含んでなる２種類のアイソフォームとして存在する。残基Ａｓｎ１１はグリコシル化され、残基Ｔｙｒ２１は硫酸基の付加により修飾され、Ｃｙｓ１０９および１８６は受容体の細胞外部分でジスルフィド架橋により結合している(Juarez J. et al., 2004)。
この受容体は、様々な種類の正常組織、ナイーブ、非記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、内皮細胞、一次単球、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞によって発現され、また低レベルで心臓、結腸、肝臓、腎臓および脳で発現される。ＣＸＣＲ４は、白血球輸送、Ｂ細胞リンパ球新生および骨髄造血において重要な役割を果たす。
ＣＸＣＲ４受容体は、限定されるものではないが、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、結腸癌(Ottaiano A. et al., 2004)、乳癌(Kato M. et al., 2003)、前立腺癌(Sun Y.X. et al., 2003)、肺癌［小細胞癌および非小細胞癌(Phillips R.J. et al., 2003)］、卵巣癌(Scotton C.J. et al., 2002)、膵臓癌(Koshiba T. et al., 2000)、腎臓癌、脳癌(Barbero S et al., 2002)、膠芽腫、およびリンパ腫を含む多数の癌で過剰発現される。
これまでに記載されているＣＸＣＲ４受容体のユニークなリガンドは、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）またはＣＸＣＬ１２である。ＳＤＦ−１は、リンパ節、骨髄、肝臓、肺において多量に、また、程度は低いが、腎臓、脳および皮膚で分泌される。ＣＸＣＲ４はまた、拮抗性のケモカインである、ＩＩＩ型ヒトヘルペスウイルスにコードされるウイルス性マクロファージ炎症性タンパク質ＩＩ（ｖＭＩＰ−ＩＩ）によっても認識される。
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸は、癌において重要な役割を果たしており、遊走、浸潤に直接関与して転移をもたらす。実際に、癌細胞はＣＸＣＲ４受容体を発現し、遊走して全身循環に入る。その後、癌細胞は、高レベルのＳＤＦ−１を産生する臓器の血管床に留まり、そこで増殖し、血管新生を誘導し、転移性腫瘍を形成する(Murphy PM., 2001)。この軸はまた、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）経路(Barbero S. et al., 2003)および血管新生(Romagnai P., 2004)の活性化を介して細胞増殖にも関与する。実際、ＣＸＣＲ４受容体およびそのリガンドＳＤＦ−１は、ＶＥＧＦ−Ａ発現を刺激することによって血管新生を明らかに促進し、それによりＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１の発現が増加する(Bachelder R.E. et al., 2002)。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が腫瘍の低酸素領域に蓄積され、刺激されて腫瘍細胞と共働して血管新生を促進することも知られている。低酸素症がＴＡＭを含む種々の細胞種においてＣＸＣＲ４の発現を選択的にアップレギュレートすることが認められている(Mantovani A. et al., 2004)。最近、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸がＣＸＣＲ４＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）の輸送／ホーミングを調節し、新血管形成において役割を果たしている可能性があることが示された。ＨＳＣに加え、機能的ＣＸＣＲ４は他の組織由来の幹細胞（組織コミット幹細胞＝ＴＣＳＣ）上でも発現するので、ＳＤＦ−１は臓器／組織再生に必要なＣＸＣＲ４＋ＴＣＳＣの化学誘引において中枢的役割を果たしている可能性があるが、これらのＴＣＳＣは癌発生の細胞的起源でもあり得ること（癌幹細胞理論）を示す証拠がある。幹細胞起源の癌は、ヒト白血病および最近では脳腫瘍や乳癌などのいくつかの固形腫瘍で示されている。白血病、脳腫瘍、小細胞肺癌、乳癌、肝芽腫、卵巣癌、子宮頸癌などの正常なＣＸＣＲ４＋組織／臓器特異的幹細胞に由来し得るＣＸＣＲ４＋腫瘍が数例ある(Kucia M. et al., 2005)。
ＣＸＣＲ４受容体との干渉による癌転移の標的化が、in vivoにおいてＣＸＣＲ４受容体に対するモノクローナル抗体を用いて示されている(Muller A. et al., 2001)。簡単に述べると、ＣＸＣＲ４受容体に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ１７３、R&D Systems）が、ＳＣＩＤマウスの同所性乳癌モデル（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）においてリンパ節転移の数を有意に減少させることが示された。別の研究(Phillips R.J et al., 2003)でも、ＳＤＦ−１に対するポリクローナル抗体を用いて、同所性肺癌モデル（Ａ５４９）の転移におけるＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸の重要な役割が示されたが、この研究では腫瘍の成長にも血管新生にも影響がなかった。他のいくつかの研究では、ＣＸＣＲ４の２本鎖ｓｉＲＮＡ(Liang Z. et al., 2005)、生体内で安定なＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニスト(Tamamura H. et al., 2003)を用いたin vivoでの転移阻害またはＡＭＤ３１００(Rubin J.B. et al., 2003; De Falco V. et al., 2007)もしくはＭａｂ（ＷＯ２００４／０５９２８５ Ａ２特許）のようなＣＸＣＲ４の小分子アンタゴニストを用いたin vivoでの腫瘍成長阻害も示されている。従って、ＣＸＣＲ４は癌に対する検証済みの治療標的である。
ＣＸＣＲ４と直接相互作用することができる、従って、ＣＸＣＲ４の活性化を阻害することができるマウスモノクローナル抗体も記載されている。このような阻害は、ｉ）細胞膜におけるリガンドＳＤＦ−１と受容体ＣＸＣＲ４との特異的結合、ｉｉ）細胞膜におけるＧＴＰγＳと受容体ＣＸＣＲ４との特異的結合、ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４により媒介されるｃＡＭＰ産生の調節、およびｉｖ）ＣＸＣＲ４受容体により媒介される、細胞内カルシウム貯蔵調節の動員（ＷＯ２０１０／０３７８３１参照）を妨げることによって起こり得る。
しかしながら、これらの抗体またはｓｉＲＮＡに、ＣＸＣＲ４発現癌細胞の死滅をもたらすものはない。それ故に、癌の再発のリスクがなお存在し、ＣＸＣＲ４標的治療を中止すべきである。よって、ＣＸＣＲ４発現細胞を直接標的とし、かつ、前記ＣＸＣＲ４発現細胞を死滅させることができる薬剤の必要がある。
本発明は、ＣＸＣＲ４を標的とする抗体に関して特定されたことのない新規な特性に関する。
実際に、本発明者らは、ＣＸＣＲ４に対するヒトまたはヒト化抗体がＣＸＣＲ４発現細胞に対してエフェクター機能を誘導することができ、従って、前記細胞に対して細胞傷害作用をもたらすことを見出した。
より詳しくは、本発明は、ＣＸＣＲ４発現癌細胞に対するエフェクター機能の誘導のための方法に関する。
従来技術で記載されているように、転移性ＣＸＣＲ４発現腫瘍の処置は、遊走、浸潤、増殖または血管新生の阻害は含んでいたが、ＣＸＣＲ４発現細胞の直接的な死滅は含んでいなかった。これとは著しく対照的に、本発明は、ＣＸＣＲ４発現標的細胞の死滅をもたらす細胞傷害作用の誘導に関する。特に、本発明は、ＣＸＣＲ４発現癌細胞に対して１以上のエフェクター機能を誘導し、従って、前記細胞の死滅を達成することができるヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を提供する。よって、本発明は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体により、ＣＸＣＲ４発現癌細胞に対して１以上のエフェクター機能を誘導することによる癌治療の方法を提供する。
第１の面において、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合するヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントを用いてＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させる方法に関し、該ヒトまたはヒト化抗体は、それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなり；前記方法は、エフェクター細胞または補体成分の存在下で前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能を誘導する工程を含んでなる。
別の面では、本発明は、エフェクター細胞または補体成分の存在下で少なくとも１つのエフェクター機能を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させるための組成物を製造するための、ＣＸＣＲ４と結合するヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントの使用に関し；該ヒトまたはヒト化抗体は、それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなる。
さらに別の面では、本発明はまた、エフェクター細胞または補体成分の存在下で少なくとも１つのエフェクター機能を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることに使用するための、ＣＸＣＲ４と結合するヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントに関し；該ヒトまたはヒト化抗体は、それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなる。
より具体的には、本発明は、ＣＸＣＲ４と結合するヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントを用いてＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることにより癌を治療する方法に関し；該ヒトまたはヒト化抗体は、それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなり；前記方法は、エフェクター細胞または補体成分の存在下で前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能を誘導する工程を含んでなる。
別の面では、本発明は、エフェクター細胞または補体成分の存在下で少なくとも１つのエフェクター機能を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることによって癌を治療するための組成物を製造するための、ＣＸＣＲ４と結合するヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントの使用に関し；該ヒトまたはヒト化抗体は、それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなる。
さらに別の面では、本発明はまた、エフェクター細胞または補体成分の存在下で少なくとも１つのエフェクター機能を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることによって癌を治療することに使用するための、ＣＸＣＲ４と結合するヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントに関し；該ヒトまたはヒト化抗体は、それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ならびにそれぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなる。
用語「抗体」は、本明細書において、最も広い意味で使用され、具体的には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥなどの任意のアイソタイプのモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ならびに抗体フラグメントを包含する。特定の抗原と反応性のある抗体は、ファージもしくは類似のベクターにおける組換え抗体ライブラリーの選択などの組換え法によるか、または動物を抗原もしくは抗原をコードする核酸で免疫することによって作製することができる。
「ポリクローナル抗体」は、同一でない他の１以上の抗体の中で、またはその存在下で生産された抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を産生する数種の他のＢリンパ球の存在下であるＢリンパ球から生産される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫動物から直接得ることができる。
「モノクローナル抗体」は、本明細書において、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体であり、すなわち、この集団を形成する抗体は、自然界に存在し得る突然変異が少数存在してよいこと以外は本質的に同一である。言い換えれば、モノクローナル抗体は、単細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均一な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核宿主細胞、均一な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核宿主細胞など）の増殖により生じる均一な抗体からなる。これらの抗体は、単一のエピトープに対するものであるので、特異性が高い。
「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の部位である。エピトープは、連続する残基によって形成されてもよく、または抗原タンパク質の折り畳みによって近接するようになる不連続の残基によって形成されてもよい。連続するアミノ酸によって形成されるエピトープは一般に変性溶媒に曝されても保持されるが、不連続アミノ酸により形成されるエピトープは一般に変性溶媒に曝されると失われる。
好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。
典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって連結された、２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖から構成される。各重鎖および軽鎖は、定常領域と可変領域を含む。各可変領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含み、これらが抗原のエピトープの結合を主として担っている。相補性決定領域は通常、Ｎ末端から順番に番号を付けてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる（Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)参照）。これらの可変領域の中で保存性の高い部分は「フレームワーク領域」と呼ばれる。
本明細書において「ＶＨ」または「ＶＨ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖を含め、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を意味する。「ＶＬ」または「ＶＬ」という場合には、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの軽鎖を含め、抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域を意味する。
抗体定常ドメインは、抗体と抗原の結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を発揮する。異なるクラスの免疫グロブリンに相当する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンは、異なるクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り付けることができ、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４；ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２にさらに細分することができる（W. E. Paul, ed., 1993, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, New York参照）。
抗体のパパイン消化により、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を含む２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りの「Ｆｃ」フラグメントが生じる。免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃドメインは通常、ヒンジ領域の、ＥＵインデックスによるＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基から、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むそのカルボキシル末端にわたると定義される(Edelman et al., The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulin molecule, PNAS 1969; 63:78-85)。明瞭にするために、ＥＵインデックスによるＣｙｓ２２６／Ｐｒｏ２３０残基は、ＫａｂａｔナンバリングシステムではＣｙｓ２３９／Ｐｒｏ２４３残基に相当し、また、ＩＭＧＴではヒンジ残基Ｃｙｓ１１／Ｐｒｏ１５に相当することを述べておくべきであろう。
用語「ヒンジ領域」は一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０にわたると定義される（Burton, Mol Immunol, 22: 161-206, 1985）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖内Ｓ−Ｓ結合を形成している最初と最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによってＩｇＧ１配列とアラインすることができる。ヒトＩｇＧ Ｆｃ部分の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は通常、アミノ酸２３１付近からアミノ酸３４０付近にわたる。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合しないという点でユニークである。むしろ、完全な天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間には２つのＮ−結合分岐糖鎖が挟まれている。この糖鎖がドメイン−ドメイン対合の代替となり、ＣＨ２ドメインの安定化を助けると推測されている(Burton, Mol Immunol, 22: 161-206, 1985)。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｃ末端残基からＦｃ部分のＣＨ２ドメインまでの広がり（すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基３４１付近からアミノ酸残基４４７付近）を含んでなる。
モノクローナル抗体を含め、ＩｇＧ免疫グロブリンは、各重鎖の定常領域がＮ−グリコシル化されていることが示されている。ＩｇＧ免疫グロブリンは、その２本の重鎖それぞれのＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に単一のＮ−結合グリカンを含む。本明細書において、用語「Ｎ−グリカン」は、Ｎ−結合オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により付加されたものを意味する。Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）の一般的な五糖類コアを有する。
Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ３コア構造に結合している側鎖糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース、およびシアル酸）を含んでなる分岐（アンテナ）の数および性質が異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分岐成分に応じて分類される（例えば、高マンノース型、複合型またはハイブリッド型）。「複合２アンテナ(complex bi-antennary)」型Ｎ−グリカンは一般に、三マンノースコアの１，３マンノース分岐に結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、１，６マンノース分岐に結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合２アンテナＮ−グリカンはまた、「バイセクト型(bisecting)」ＧｌｃＮＡｃとコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含んでなる鎖内置換を持っていてもよい。「バイセクト型ＧｌｃＮＡｃ」は、成熟コア糖鎖構造のβ−１，４−マンノースに結合したＧｌｃＮＡｃ残基である。
複合２アンテナＮ−グリカンはまた、場合によりシアル酸で修飾されているガラクトース（「Ｇａｌ」）残基を有してもよい。オリゴ糖鎖へのシアル酸の付加はシアリルトランスフェラーゼにより触媒されるが、事前に、ガラクトシルトランスフェラーゼにより末端Ｎ−アセチルグルコサミンに１以上のガラクトース残基が付加されている必要がある。本発明によれば「シアル酸」は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）と５−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＮＧｃ）の両方を包含する。
オリゴ糖は、０（Ｇ０）、１つ（Ｇ１）または２つ（Ｇ２）のガラクトース残基を含むとともに、最初のＧｌｃＮａｃと結合した１つのフコースを含むまたは含まない場合がある。これらの形態はそれぞれＧ０／Ｇ０Ｆ、Ｇ２／Ｇ２Ｆ、Ｇ１／Ｇ１Ｆとして示される（Theillaud, Expert Opin Biol Ther., Suppl 1: S15-S27, 2005の図１参照）。言い換えれば、オリゴ糖鎖の両腕がガラクトース残基を含んでなる場合、重鎖１モル当たりのガラクトースの最大モルは２であり、その構造は、コアがフコシル化されている場合にはＧ２Ｆ、フコシル化されていない場合にはＧ２と呼ばれる。一方の腕が末端ガラクトースを有する場合、その構造は、それがフコシル化されているかどうかによってＧ１ＦまたはＧ１と呼ばれ、末端ガラクトースが存在しない場合には、それぞれＧ０ＦまたはＧ０と呼ばれる。
従って、分泌されたＩｇＧ免疫グロブリンは、様々な糖残基フコース、ガラクトース、シアル酸、およびバイセクト型Ｎ−アセチルグルコサミン付加を示す糖型の不均一な混合物である。
Ｆｃドメインは、免疫グロブリンの生物学的機能を決定する上で中心となり、これらの生物学的機能は「エフェクター機能」と呼ばれる。これらのＦｃドメイン介在活性は、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、および活性化マクロファージなどの免疫エフェクター細胞、また様々な補体成分によって媒介される。これらのエフェクター機能は、前記受容体または補体成分への抗体のＦｃドメインの結合を介した、前記エフェクター細胞の表面での受容体の活性化を含む。
「抗体依存性細胞媒介型細胞傷害作用」、「抗体依存性細胞傷害作用」または「ＡＤＣＣ」という表現は、特定の細胞傷害性エフェクター細胞上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合したＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原担持標的細胞に特異的に結合させ、かつ、その後、細胞毒素によって標的細胞を死滅させることができるという細胞傷害作用の一形態を意味する。標的細胞の溶解は細胞外であり、細胞と細胞の直接的接触が必要であり、補体は関与しない。
細胞破壊は、例えば、溶解または食作用によって起こすことができる。「細胞傷害性エフェクター細胞」は、１以上のＦｃＲを発現してエフェクター機能を遂行する白血球である。好ましくは、これらの細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を遂行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞はそれらの天然源、例えば、血液またはＰＢＭＣから単離することができる。細胞溶解により細胞破壊を行うことができる細胞傷害性エフェクター細胞としては、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好酸球、マクロファージおよび好中球が挙げられる。
様々なヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧｌおよびＩｇＧ３は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも効果的にＡＤＣＣを媒介する。
有利には、本発明のヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有フラグメントは、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることができる。
よって、本発明の方法の第１の好ましい態様では、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）からなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）からなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）からなることを特徴とする。
非限定例として、in vitroにおいてＡＤＣＣを評価または定量するための以下の方法を挙げることができる：ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはカルセイン、５１Ｃｒもしくは蛍光色素、例えば、カルセイン−ＡＭ、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）、２’，７’−ビス−（２カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ）もしくはユウロピウムを用いたサイトメトリー、または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）もしくはＡＴＰなどのサイトゾル酵素の放出の測定による。これらの方法は当業者によく知られ［例えば、Jiang et al., “Advances in the assessment and control of the effector functions of therapeutic antibodies”, Nat Rev Drug Discov., 10: 101-110, 2011およびその中の参照文献を参照］、ここでさらに詳しく述べる必要はない。
「補体依存性細胞傷害作用」または「ＣＤＣ」は、本明細書において、細胞表面の抗原に抗体が特異的に結合することによって誘発された補体活性化が、血中の補体関連タンパク質群を含む一連のカスケード（補体活性化経路）を介して標的細胞の溶解を引き起こす機構を意味する。さらに、補体の活性化によって生成されたタンパク質フラグメントが免疫細胞の遊走および活性化を誘導することができる。補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の活性化の第一段階は、抗体の少なくとも２つのＦｃドメインにＣ１ｑタンパク質が結合することからなる。「Ｃ１ｑ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓとともに、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の第１の成分である複合体Ｃ１を形成する。
本発明のもう１つの有利な態様では、ヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有フラグメントは、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることができる。
よって、本発明はまた、エフェクター機能が補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）からなる、上記のような方法に関する。
言い換えれば、本発明による使用は、前記エフェクター機能が補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）からなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記エフェクター機能が補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）からなることを特徴とする。
ＣＤＣによる有核細胞の細胞傷害作用は、トリパンプルー排除、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いたフローサイトメトリー、５１Ｃｒ放出、テトラゾリウム塩ＭＴＴの還元、酸化還元色素アラマーブルー、細胞内ＡＴＰの損失、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、ＬＤＨ放出またはカルセイン−ＡＭ放出などのいくつかの方法によってin vitroで定量することができる。これらの方法は当業者によく知られ［例えば、Jiang et al., “Advances in the assessment and control of the effector functions od therapeutic antibodies”, Nat Rev Drug Discov., 10: 101-110, 2011およびその中の参照文献を参照］、ここでさらに詳しく述べる必要はない。
本発明のさらに有利な態様では、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）と補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の両方が誘導され、すなわち、ヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有フラグメントは、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）と補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の両方を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることができる。
好ましい態様では、本発明の方法のエフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）からなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）からなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）からなることを特徴とする。
抗体のこれらの２つのエフェクター機能は、ＡＤＣＣの場合には、免疫細胞表面の特異的受容体、本質的には、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球上で発現されるＦｃγＲＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩＡとも呼ばれる）およびＦｃγＲＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＡとも呼ばれる）、ならびにＣＤＣの場合には補体カスケードタンパク質Ｃ１ｑへの、抗体Ｆｃ部分の結合に直接的に関連している。
抗体のＦｃ部分とＦｃγＲおよびＣ１ｑとの間の厳密な相互作用は厳密にマッピングされており、この相互作用に関与する主要なＦｃドメインは、ＣＨ２ドメインに相当する。このＦｃ部分とＦｃ受容体の間の親和性は、誘発される免疫応答の程度と直接関連している。
上記のように、ＣＸＣＲ４に対するヒトまたはヒト化抗体は、ＣＸＣＲ４発現細胞に対してエフェクター機能を誘導することができ、従って、前記細胞に対して細胞傷害作用をもたらす。エフェクター機能の誘導が高いほど、ＣＸＣＲ４発現細胞に対する細胞傷害作用が大きいことは明らかである。抗体によっては自然に高いＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を示すものがあるが、そうでない場合には、抗体免疫応答、より詳しくは、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを増強するためにＣＸＣＲ４に対するヒトまたはヒト化抗体を操作する必要があるかもしれない。このような操作された抗体も本発明の範囲に包含される。
抗体の免疫応答、より詳しくは、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを操作および増強するためにはいくつかの方法があるが、それらのほとんどは、ＡＤＣＣに関しては、同族ＦｃγＲに対するＦｃ部分の結合を直接増加させることに基づく。主要な目標は、ヒトＦｃγＲａおよびヒトＦｃγＲＩＩａに対する結合を増加させ、かつ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ（免疫応答を低下させる阻害的受容体）に対する結合を低下させることである。これは、Ｆｃ部分内の個々のアミノ酸残基を変異させるか、または無フコシル化グリカン部分を増やすためにＣＨ２ドメインのアスパラギン２９７に結合しているグリカン部分を改変するかのいずれかによって達成することができる。糖鎖工学は、例えば、抗体を産生する宿主細胞においてＦＵＴ８遺伝子を遮断すること（ｓｉＲＮＡ、KO,など; Toyohide Shinkawa et al., The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. J. Biol. Chem 2003; 278: 3466-3473）、または抗体産生細胞においてＧｌｃＮＡｃ ＩＩＩトランスフェラーゼを過剰発現させること（例えば、Pablo Umana et al. Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxicity activity. Nat Biotechnol 1999;17:176-180参照）によって達成することができる。
このような抗体は、抗体の定常ドメインにおいて単一置換または多重置換を行ってＦｃ受容体とその相互作用を高めることによって得ることができる。このような突然変異体を設計するための方法は、Lazar et al. (2006, PNAS, 103(11): 4005-4010)およびOkazaki et al. (2004, J. MoI. Biol. 336(5): 1239-49)に見出すことができる。
改良型の抗体の生産のためには、特に操作を行った細胞株を使用することもできる。特に、これらの細胞株はグリコシル化経路の調節が変更されており、フコシル化の低い、またさらには完全に脱フコシル化された抗体が得られる。このような細胞株およびそれらを操作するための方法は例えばShinkawa et al. (2003, J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473), Ferrara et al. (Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-61)に開示されている。
ＡＤＣＣを高める他の方法は、Li et al. (2006, Nat Biotechnol. 24(2):210-5)、Stavenhagen et al. (2008, Advan. Enzyme Regul. 48:152-164)、Shields et al. (2001, J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604)およびＷＯ２００８／００６５５４にも記載されている。
ＣＤＣを高める方法は、Idusogie et al. (2001, J Immunol. 166(4):2571-5)、Dall'Acqua et al. (2006, J Immunol, 177(2):1129-38)、Michaelsen et al. (1990, Scand J Immunol, 32(5):517-28)、Brekke et al. (1993, Mol Immunol, 30(16):1419-25)、Tan et al. (1990, Proc; Natl. Acad. Sci. USA, 87:162-166)およびNorderhaug et al. (1991, Eur J Immunol, 21(10):2379-84)に記載されている。
十分に記載されている技術として、協和が開発した、ＣＤＣが増強されたキメラヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ３ Ｆｃ部分を作製することからなる補体技術がある（例えば、ＷＯ２００７／０１１０４１参照）。
ＡＤＣＣおよびＣＤＣを増強する方法を記載している参照文献としては、Natsume et al. (2008, Cancer Res. 68(10): 3863-3872)がある。これらの各参照文献の開示は、本発明の相互参照に含まれる。
ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの増強は、それがＣＸＣＲ４発現癌細胞の死滅をもたらし、それ自体、癌の再発の危険性を明らかに制限するので癌治療の分野で特に注目され、ＣＸＣＲ４標的治療が中止されるべきであることは当業者に自明である。
「ＣＨ２含有結合フラグメント」という表現は、親抗体の６つのＣＤＲと、エフェクター機能の誘導を担っていることが知られている少なくともＣＨ２ドメインとを含んでなる抗体の任意のフラグメントまたは部分と理解しなければならない。最も好ましい実施形態では、このＣＨ２は二量体でなければならず、すなわち、２コピーのＣＨ２を含んでなる。
別の態様では、ＣＨ２含有結合フラグメントは、親抗体の６つのＣＤＲと少なくともＣＨ２およびヒンジドメインとを含んでなる。
別の態様では、ＣＨ２含有結合フラグメントは、親抗体の６つのＣＤＲと少なくともＣＨ１、ヒンジおよびＣＨ２ドメインとを含んでなる。
別の態様では、ＣＨ２含有結合フラグメントは、親抗体の６つのＣＤＲと少なくともＣＨ１およびＣＨ２ドメインとを含んでなる。
別の態様では、ＣＨ２含有結合フラグメントは、親抗体の６つのＣＤＲと少なくともＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含んでなる。
さらに別の態様では、ＣＨ２含有結合フラグメントは、親抗体の６つのＣＤＲと少なくともＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含んでなり、すなわち、全長Ｆｃである。
より好ましくは、本発明は、遺伝子組換えまたは化学合成により得られたヒト化抗体、それらのＣＨ２含有結合フラグメントを含んでなる。
好ましい態様によれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。
言い換えれば、本発明の方法は、ＩＭＧＴに従い、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる、ヒトもしくはヒト化抗体またはＣＨ２含有結合フラグメントの使用を含んでなり、ここで、
・ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号１の配列、または配列番号１の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり；
・ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２の配列、または配列番号２の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり；および
・ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号３の配列、または配列番号３の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる。
いっそうより好ましくは、本発明の方法は、ＩＭＧＴに従い、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなる、ヒトもしくはヒト化抗体、またはＣＨ２含有結合フラグメントの使用を含んでなり、ここで、
・ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号４の配列、または配列番号４の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり；
・ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号５の配列、または配列番号５の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり；および
・ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号６の配列、または配列番号６の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる。
本明細書において、用語「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」は互換性がある。
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体、鎖型、または種に関わらず可変ドメインを比較するために定義されたものである[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)］。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は常に同じ位置になる：例えばシステイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）である。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６位、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５位、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４位およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８位）および相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７の標準化された境界を与える。ギャップは非占有位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（かぎ括弧中に示されドットで区切られる。例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ Ｃｏｌｌｉｅｒｓ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓと呼ばれる２次元グラフィック表示[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢの３次元構造[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)］に用いられる。
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２つの配列間の「同一性パーセンテージ」とは、最適なアラインメントの後に得られる、比較される２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは完全に統計的なものであり、２つの配列の間の差はその全長にわたってランダムに分布する。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、従来、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって行われ、該比較は、セグメントによってまたは「アラインメントウィンドウ」を用いることによって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業での比較の他に、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段、またはこれらのアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウェア(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウェアＢＬＡＳＴ ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ Ｐ）の手段によって行うことができる。
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、２つの最適にアラインされた配列を比較することにより決定され、ここで、比較する核酸またはアミノ酸配列は、２つの配列間での最適なアラインメントのための参照配列と比較して付加または欠失を持ち得る。同一性パーセンテージは、２つの配列間で、好ましくは２つの完全配列間で、アミノ酸ヌクレオチドまたは残基が同一の箇所の数を決定し、この同一箇所の数をアラインメントウィンドウ中の箇所の総数で割り、その結果に１００を掛けて２つの配列間の同一性パーセンテージを得ることにより計算される。
例えば、サイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250)をデフォルトパラメーター（特にパラメーター「オープン・ギャップ・ペナルティ」：５、「エクステンション・ギャップ・ペナルティ」：２について；選択されるマトリックスは、例えばプログラムによって提案される「ＢＬＯＳＵＭ６２」マトリックス）とともに使用することができ、このプログラムにより、比較する２つの配列間の同一性パーセンテージが直接計算される。
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列の好ましい例として、参照配列、特定の修飾、特に少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または伸張を含むものが挙げられる。１以上の連続または不連続アミノ酸の置換の場合、置換は、被置換アミノ酸が「同等な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「同等なアミノ酸」という表現は、対応する抗体および以下に定義される具体例の生物活性を改変することなく、構造的アミノ酸の１つを置換し得る任意のアミノ酸を示すものとする。
同等なアミノ酸は、置換されるアミノ酸とのそれらの構造的相同性に基づくか、または生成される種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果に基づいて決定することができる。
非限定的例として、下表１に、対応する修飾抗体の生物活性に有意な改変を生じずに実施し得る置換をまとめる。なお、同じ条件下で逆の置換も当然可能である。
Figure 2014525899
当該技術分野の現状では、６つのＣＤＲ間で最大の可変性（長さおよび組成）は３つの重鎖ＣＤＲ、より具体的にはこの重鎖のＣＤＲ−Ｈ３に見られることが当業者に知られている。従って、本発明の抗体の、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的フラグメントの１つの、好ましい特徴的ＣＤＲが重鎖の３つのＣＤＲとなることは明らかであろう。
本発明の別の実施形態は、ヒトもしくはヒト化抗体、またはＣＨ２含有結合フラグメントの使用を開示し、それは、
以下の３つのＣＤＲ：
配列番号１の配列、または配列番号１の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号２の配列、または配列番号２の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２；
配列番号３の配列、または配列番号３の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３
を含んでなる重鎖と；
以下の３つのＣＤＲ：
配列番号４の配列、または配列番号４の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号５の配列、または配列番号５の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２；
配列番号６の配列、または配列番号６の配列と最適なアラインメントの後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３
を含んでなる軽鎖
とを含んでなる。
より明瞭にするために、下表２ａに本発明の抗体ｈｚ５１５Ｈ７のＣＤＲに相当する種々のアミノ酸配列をまとめ、表２ｂに本発明のヒト化抗体の種々の変異体の可変ドメインおよび全長配列に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる。
Figure 2014525899
Figure 2014525899
一例として、誤解を避けるため、「ＶＨ１」という表現は、「ＶＨ変異体１(VH Variant 1)」、「ＶＨ変異体１(VH variant 1)」、「ＶＨ Ｖａｒ １」または「ＶＨ ｖａｒ １」という表現と同等である。
本発明に使用される抗体は、２００８年６月２５日に番号Ｉ−４０１９としてFrench collection for microorganism cultures (CNCM, Institut Pasteur, Paris, France)に提出されたマウスハイブリドーマにより産生されたマウス抗体のヒト化から得られたものであることをここで述べることができる。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞と骨髄腫Ｓｐ ２／Ｏ−Ａｇ １４株の細胞の融合によって得られたものである。
本明細書で５１５Ｈ７と呼ばれるマウスモノクローナル抗体は、２００８年６月２５日に番号Ｉ−４０１９としてＣＮＣＭに提出されたハイブリドーマにより分泌される。
好ましい態様では、本発明の方法で使用される抗体はヒト化抗体である。
本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体を意味する。「キメラ抗体」は、本明細書において、定常領域またはその一部が変更、置換、または交換されて、その結果、可変領域が異種の、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する定常領域と結合される抗体である。「キメラ抗体」はまた、可変領域、またはその一部が変更、置換、または交換されて、その結果、定常領域が異種の、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する可変領域と結合される抗体も意味する。
特定の実施形態では、抗体、もしくは抗原結合フラグメント、変異体、またはその誘導体の、可変領域および定常領域の両方が完全にヒトである。完全ヒト抗体は、当技術分野で公知の技術を用いて作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原刺激に応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、その内在遺伝子座は無能にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。このような抗体を作製するために使用可能な技術の例は、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，４５８，５９２号、同第６，４２０，１４０号に記載されている。他の技術も当技術分野で公知である。完全ヒト抗体も同様に、種々のディスプレー技術、例えば、ファージディスプレーまたは他のウイルスディスプレー系によって生産することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号、および同第５，８１４，３１８号、ならびに国際特許出願公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１も参照（前記参照文献は引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる）。
「ヒト化抗体」は、本明細書において、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、その抗体分子の他の部分は１つ（または複数）のヒト抗体に由来する抗体を意味する。さらに、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）のいくつかは、結合親和性を保存するように改変することができる(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988)。
ヒト化の目的は、その抗体の完全な抗原結合親和性および特異性を保持しつつ、ヒトに導入するためにマウス抗体などの異種抗体の免疫原性を軽減することである。本発明のヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術によって調製することができる（例えば、Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992;およびBebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992に記載されているものなど）。このようなヒト化抗体は、in vitroにおける診断、またはin vivoにおける予防的および／もしくは治療的処置を含む方法におけるそれらの使用に好ましい。他のヒト化技術も当業者に公知であり、例えば、欧州特許第０４５１２６１号、欧州特許第０６８２０４０号、欧州特許第０９３９１２７号、欧州特許第０５６６６４７号、または米国特許第５，５３０，１０１号、米国特許第６，１８０，３７０号、米国特許第５，５８５，０８９号および米国特許第５，６９３，７６１号においてＰＤＬにより記載されている「ＣＤＲグラフト」技術がある。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も引用することができる。
拡大解釈すれば、本特許明細書の場合、キメラ抗体ｃ１５１Ｈ７は、「ヒト化抗体」という表現に含まれる。より詳しくは、ｃ５１５Ｈ７は、配列番号７０の配列（配列番号７２のヌクレオチドに相当）の重鎖、および配列番号７１の配列（配列番号７３のヌクレオチドに相当）の軽鎖を含んでなることを特徴とする。
本発明は、上記のマウス抗体５１５Ｈ７に由来するヒト化抗体に関し、前記抗体はそれらの重鎖および／または軽鎖可変ドメインの配列により定義される。実際に、本明細書記載のヒト化抗体は総て本発明の方法において使用可能であり、すなわち、それらはエフェクター細胞もしくは補体成分の存在下で少なくとも１つのエフェクター機能を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させるために使用可能であり、またはエフェクター細胞もしくは補体成分の存在下で少なくとも１つのエフェクター機能を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることによって癌を治療するために使用可能である。
本発明の方法の好ましい態様では、ヒトまたはヒト化抗体は、配列番号７〜１０の配列から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号１１〜１７の配列から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体からなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記ヒトまたはヒト化抗体が、配列番号７〜１０の配列から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号１１〜１７の配列から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体からなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、配列番号７〜１０の配列から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号１１〜１７の配列から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体からなることを特徴とする。
本発明による好ましいヒト化抗体は、配列番号８の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１１〜１７の配列から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体からなる。
さらに、本発明による好ましいヒト化抗体は、配列番号７〜１０の配列から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号１３の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体からなる。
本発明はまた、上記のマウス抗体５１５Ｈ７に由来するヒト化抗体に関し、前記抗体は、それらの全長重鎖および／または軽鎖の配列によって定義される。
本発明の方法の好ましい態様では、ヒトまたはヒト化抗体は、配列番号１８〜２１の配列から選択される重鎖および配列番号２２〜２８の配列から選択される軽鎖を含んでなるヒト化抗体からなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記ヒトまたはヒト化抗体が、配列番号１８〜２１の配列から選択される重鎖および配列番号２２〜２８の配列から選択される軽鎖を含んでなるヒト化抗体からなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、配列番号１８〜２１の配列から選択される重鎖および配列番号２２〜２８の配列から選択される軽鎖を含んでなるヒト化抗体からなることを特徴とする。
本発明による好ましいヒト化抗体は、配列番号１９の配列の重鎖および／または配列番号２２〜２８の配列から選択される軽鎖を含んでなるヒト化抗体からなる。
本発明による別の好ましいヒト化抗体は、配列番号１８〜２１の配列から選択される重鎖および／または配列番号２４の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体からなる。
好ましい態様では、本発明は、配列番号８の配列の重鎖可変領域、および配列番号１３の配列の軽鎖可変領域を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号１９の配列の重鎖、および配列番号２４の配列の軽鎖を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号８の配列の重鎖可変領域、および配列番号１４の配列の軽鎖可変領域を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号１９の配列の重鎖、および配列番号２５の配列の軽鎖を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号８の配列の重鎖可変領域、および配列番号１５の配列の軽鎖可変領域を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号１９の配列の重鎖、および配列番号２６の配列の軽鎖を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号８の配列の重鎖可変領域、および配列番号１６の配列の軽鎖可変領域を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号１９の配列の重鎖、および配列番号２７の配列の軽鎖を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号９の配列の重鎖可変領域、および配列番号１１の配列の軽鎖可変領域を含んでなる、ヒト化抗体 Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号２０の配列の重鎖、および配列番号２２の配列の軽鎖を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号９の配列の重鎖可変領域、および配列番号１２の配列の軽鎖可変領域を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ ＶＬ１ Ｔ５９Ａ Ｅ６１Ｄ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号２０の配列の重鎖、および配列番号２３の配列の軽鎖を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ ＶＬ１ Ｔ５９Ａ Ｅ６１Ｄ、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号７の配列の重鎖可変領域、および配列番号１１の配列の軽鎖可変領域を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
別の好ましい態様では、本発明は、配列番号１８の配列の重鎖、および配列番号２２の配列の軽鎖を含んでなる、ヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントに関する。
上記で例示されたＶＨ／ＶＬの組合せは限定的なものではないと理解すべきである。当然のことながら、当業者ならば、過度の負担なく、また、発明的な技術を用いずに、本明細書に開示されているＶＨおよびＶＬを総て再編成することができる。
本発明の方法のより好ましい態様では、前記ヒトまたはヒト化抗体は、配列番号８の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体からなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記ヒトまたはヒト化抗体が、配列番号８の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体からなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、配列番号８の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体からなることを特徴とする。
上記の種々の配列について、好ましい抗体（排他的なものではない）は、その全長重鎖および軽鎖配列の配列によっても記載される。
本発明の方法のより好ましい態様では、ヒトまたはヒト化抗体は、配列番号１９の配列の重鎖および配列番号２４の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体からなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記ヒトまたはヒト化抗体が、配列番号１９の配列の重鎖および配列番号２４の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体からなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、配列番号１９の配列の重鎖および配列番号２４の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体からなることを特徴とする。
当業者には、本発明の抗体はエフェクター機能を提示するために必要な構造エレメントを提供しなければならないことが自明であろう。より詳しくは、本抗体は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを可能とするために好適なアイソタイプのものでなければならない。例えば、種々のヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧｌおよびＩｇＧ３は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも効果的にＡＤＣＣを媒介することが知られている。他方、ＣＤＣに関する効力の順は、ＩｇＧ３≧ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２≒ＩｇＧ４である(Niwa et al., J Immunol Methods, 306: 151-160, 2005)。
本発明の方法の好ましい態様では、前記ヒトまたはヒト化抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。
言い換えれば、本発明による使用は、前記ヒトまたはヒト化抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものであることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのものであることを特徴とする。
特定の態様では、本発明は、ＩｇＧ１ Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２からなる本発明の好ましい抗体のＣＨ２含有結合フラグメントに関する。
より詳しくは、好ましいＣＨ２含有結合フラグメントは、ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン；ならびにｉｉｉ）少なくとも、配列番号６０の配列を含んでなるＣＨ２ドメインを含んでなるフラグメントからなる。
本発明の方法の好ましい態様では、ＣＨ２含有結合フラグメントは、それぞれ配列番号１、２および３を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；それぞれ配列番号４、５および６を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；ならびに少なくとも、配列番号６０を含んでなるＣＨ２ドメインを含んでなるフラグメントからなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記ＣＨ２含有結合フラグメントが、それぞれ配列番号１、２および３を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；それぞれ配列番号４、５および６を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；ならびに少なくとも、配列番号６０を含んでなるＣＨ２ドメインを含んでなるフラグメントを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記ＣＨ２含有結合フラグメントが、それぞれ配列番号１、２および３を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３；それぞれ配列番号４、５および６を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３；ならびに少なくとも、配列番号６０を含んでなるＣＨ２ドメインを含んでなるフラグメントからなることを特徴とする。
別の好ましいＣＨ２含有結合フラグメントは、ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン；ｉｉｉ）少なくとも配列番号６０の配列を含んでなるＣＨ２ドメイン；ならびにｉｖ）少なくとも配列番号６１の配列を含んでなるヒンジドメインを含んでなるフラグメントからなる。
さらに別の好ましいＣＨ２含有結合フラグメントは、ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン；ｉｉｉ）少なくとも配列番号６０の配列を含んでなるＣＨ２ドメイン；ｉｖ）少なくとも配列番号６１の配列を含んでなるヒンジドメイン；ならびにｖ）少なくとも配列番号６２の配列を含んでなるＣＨ１ドメインを含んでなるフラグメントからなる。
さらに別の好ましいＣＨ２含有結合フラグメントは、ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン；ｉｉｉ）少なくとも配列番号６０の配列を含んでなるＣＨ２ドメイン；ｉｖ）配列番号６１の配列を少なくとも含んでなるヒンジドメイン；ｖ）少なくとも配列番号６２の配列を含んでなるＣＨ１ドメイン；およびｖｉ）少なくとも配列番号６３の配列を含んでなるＣＨ３ドメインを含んでなるフラグメントからなる。
本発明のさらに別の好ましい態様では、好ましいＣＨ２含有結合フラグメントは、ｉ）それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメイン；ｉｉ）それぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメイン；ならびにｉｉｉ）少なくとも配列番号６４の配列を含んでなる全長Ｆｃドメインを含んでなるフラグメントからなる。
より明確にするために、下表３に、抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２の各ドメインの配列を示す。
Figure 2014525899
これらのエレメントに基づき、本出願に記載のいずれの配列に由来するＣＨ２含有結合フラグメントも、過度な実験を行うことなく生成することが当業者には自明である。結果として、他のいずれのＣＨ２含有結合フラグメントも、本出願の範囲の一部とみなされるべきである。
下表４ａに、本発明の抗体ｈｚ５１５Ｈ７のＣＤＲに相当する最適化ヌクレオチド配列をまとめ、表４ｂに、本発明のヒト化抗体の種々の変異体の可変ドメインおよび全長配列に相当する種々の最適化ヌクレオチド配列をまとめる。
Figure 2014525899
Figure 2014525899
「最適化配列」という表現は、対象タンパク質（本明細書では抗体の可変ドメイン）の構成的アミノ酸をコードするコドンが、専用の細胞型（本明細書では哺乳動物細胞）における翻訳機構によってよりよく認識されるように改変されていることを意味する。実際に、発現に用いる遺伝子および細胞の供給源に応じ、コドンを最適化すれば、コードされる本発明のポリペプチドの発現を高める助けとなり得ることが当業者に知られている。「コドンの最適化」とは、宿主細胞におけるコドンの使用に合わせて配列を改良する、本発明のポリペプチドのコード配列に対する改変を意味する。コドン使用表は、例えばＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、ならびに多様な他の生物に関して当技術分野で公知である。さらに、最適化はまた、Ｇ／Ｃ含量適応および安定なＲＮＡ二次構造の阻害を含むポリヌクレオチド配列の改変によっても達成することができる（例えば、Kim et al., 1997 Gene199(1-2):293-301参照）。
本明細書において互換的に使用される「核酸」、「核酸配列(nucleic sequence)」、「核酸配列(nucleic acid sequence)」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は、改変型または非改変型である、核酸のフラグメントまたは領域を定義し、非天然ヌクレオチドを含んでも含まなくてもよく、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、または前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである、ヌクレオチドの正確な配列を意味する。
本発明の核酸配列は総て単離および／または精製されており、すなわち、それらは例えばコピーにより直接または間接的にサンプリングされたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。「好ましい配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性パーセンテージを示す核酸配列」とは、参照核酸配列に関して、特定の改変、例えば特に欠失、末端切断、伸張、キメラ融合および／または置換（特に、点での）を示す核酸配列を意味する。好ましくは、これらは、参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列であり、これは、遺伝コードの変性、または、好ましくは高ストリンジェントな条件（特に、以下に定義される）下で、参照配列と特異的にハイブリダイズし得る相補的配列に関連する。
高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションとは、２つの相補的ＤＮＡフラグメント間でハイブリダイゼーションが維持されるように温度およびイオン強度に関連する条件が選択されることを意味する。単に例として、上記のポリヌクレオチドフラグメントを定義するためのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェント条件は有利には以下の通りである。
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは２工程で行われる：（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液に相当）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハー液、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブの長さに応じた温度（すなわち、長さが１００ヌクレオチドを超えるプローブでは４２℃）で２０時間の一次ハイブリダイゼーション、続いて、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、２０℃で２０分間の洗浄２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、２０℃で２０分間の洗浄１回。最後の洗浄を、長さが１００ヌクレオチドを超えるプローブでは６０℃で３０分間、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で行う。当業者ならば、所定サイズのポリヌクレオチドについての上記高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001)に記載されている手順に従って、より長いまたはより短いオリゴヌクレオチドに適合させることができる。
本発明のヒトもしくはヒト化抗体の重鎖および／または軽鎖、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントを発現させるためには、前記重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、前記遺伝子が転写および翻訳制御配列と動作可能なように連結されるように発現ベクターに挿入する。
「動作可能なように連結される」配列には、対象遺伝子に隣接している発現制御配列とトランスでまたは遠隔で対象遺伝子を制御する働きをする発現制御配列の両方が含まれる。本明細書において、用語「発現制御配列」は、それらが連結されたコード配列の発現およびプロセシングを果たすために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列には、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどの有効なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；および所望により、タンパク質分泌を高める配列が含まれる。このような制御配列の性質は宿主生物によって異なり；原核生物では、このような制御配列は一般にプロモーター、リボゾーム結合部位、および転写終結配列を含み；真核生物では、一般に、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最低限、その存在が発現およびプロセシングに不可欠な総ての成分を含むものとし、また、存在すると有利である付加的成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことを意図する。
本明細書において、用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味するものとする。ベクターの一種が「プラスミド」であり、これは、付加的ＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。もう一種のベクターがウイルスベクターであり、この場合には、付加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞で自律的に複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主のゲノムとともに複製され得る。
ある特定のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクターは、本明細書には「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）として言及されている。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターはプラスミドの形態である。プラスミドは最もよく用いられるベクターの形態であるので、本明細書では「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用できる。しかしながら、本発明は、細菌プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来エピソーム、および本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖の発現を確保するのに好都合であることが当業者に知られている他の総てのベクターなどの形態の発現ベクターを含むものとする。当業者は、重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを異なるベクターにクローニングすることも同じベクターにクローニングすることもできることを十分理解するであろう。好ましい態様では、前記ポリヌクレオチドは、同じベクターにクローニングされる。
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内でベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子などの付加的配列を有してもよい。選択マーカー遺伝子は、そのベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号参照）。例えば、一般に、選択マーカー遺伝子は、そのベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞において使用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択）が含まれる。いくつかの選択系が本発明に従って使用可能であり、限定されるものではないが、ｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞のそれぞれにおいて、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., Cell 11:223, 1977)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48: 202, 1992)、メチオニンスルホキシミドの存在下でのグルタミン酸シンターゼ選択(Adv Drug Del Rev, 58: 671, 2006、およびLonza Group Ltd社のウェブサイトまたは文献)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., Cell 22: 817, 1980)が挙げられる。また、以下の遺伝子の選択の基礎として代謝拮抗物質耐性が使用可能である：メトトレキサート耐性を付与するｄｈｆｒ(Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 357, 1980)；ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ(Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072, 1981)；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ(Wu et al., Biotherapy 3: 87, 1991)；およびハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ(Santerre et al., Ge
ne 30: 147, 1984)。組換えＤＮＡ技術に関して当技術分野で公知の方法は所望の組換えクローンを選択するために慣例的に適用することができ、このような方法は、例えば、Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993)に記載されている。抗体の発現レベルはベクターの増幅によって高めることができる。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能であれば、培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加により、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。この増幅領域は本発明のＩｇＧ抗をコードする遺伝子に関連しているので、前記抗体の生産も増加する(Crouse et al., Mol Cell Biol 3: 257, 1983)。
本発明のポリヌクレオチドおよびこれらの分子を含んでなるベクターは、好適な哺乳動物宿主細胞、または当業者に知られている他の任意のタイプの宿主細胞の形質転換に使用することができる。本明細書において、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味するものとする。このような用語は特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代も意味するものと理解すべきである。次世代には突然変異または環境的影響のために改変が起こることがあるので、このような後代は実際には親細胞と同一であるとは限らないが、本明細書で用いる「宿主細胞」という用語の範囲内になお含まれる。
形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するためのいずれの既知法によるものでもよい。このような方法は当業者によく知られ、デキストラン媒介形質転換、リン酸カルシウム沈殿法、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、微粒子銃およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが挙げられる。本発明の組換え抗体を発現させるのに好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入し、その宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくはその宿主細胞が成長している培養培地への抗体の分泌を可能とするのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより、前記抗体を生産する。
抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。可溶型の本発明の抗体は、培養上清から回収することができる。これを次に、免疫グロブリン分子の精製、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に、Ｆｃの場合にはＡタンパク質アフィニティーなど）、遠心分離、示差溶解度または他の任意の標準的なタンパク質精製技術など、当技術分野で公知の任意の方法により精製することができる。好適な精製方法は当業者に自明である。
本発明者らは、ＣＸＣＲ４に対するヒトまたはヒト化抗体が、前記抗体の少なくとも１つのエフェクター機能を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることができることを示した。
「ＣＸＣＲ４発現癌細胞」とは、本明細書では、正常成体細胞でのＣＸＣＲ４発現レベルに比べて高いＣＸＣＲ４発現を示す癌の細胞を意味する。このような癌としては（限定されるものではないが）以下のものが挙げられる：膀胱、乳房、結腸、頭頸部、前立腺、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸、甲状腺および皮膚を含む癌腫および腺癌（扁平上皮癌を含む）；多発性骨髄腫、白血病、急性および慢性リンパ性（またはリンパ様）白血病、急性および慢性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）を含むリンパ系列の造血系腫瘍；急性および慢性骨髄性（骨髄様または骨髄球性）白血病、および前骨髄球性白血病を含む骨髄系列の造血系腫瘍；線維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；ならびに黒色腫、奇形癌、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、および精上皮腫を含むその他の腫瘍、および、ＣＸＣＲ４が発現されるまだ同定されていないその他の癌。
本発明で特許請求する方法の好ましい態様では、前記ＣＸＣＲ４発現癌細胞は悪性血液細胞からなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記ＣＸＣＲ４発現癌細胞が悪性血液細胞からなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記ＣＸＣＲ４発現癌細胞が悪性血液細胞からなることを特徴とする。
より詳しくは、前記ＣＸＣＲ４悪性血液細胞は、リンパ腫細胞、白血病細胞または多発性骨髄腫細胞を含んでなる群から選択される。
言い換えれば、本発明による使用は、前記ＣＸＣＲ４悪性血液細胞がリンパ腫細胞、白血病細胞または多発性骨髄腫細胞を含んでなる群から選択されることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記ＣＸＣＲ４悪性血液細胞がリンパ腫細胞、白血病細胞または多発性骨髄腫細胞を含んでなる群から選択されることを特徴とする。
別の好ましい態様では、前記悪性血液細胞はリンパ腫細胞からなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記悪性血液細胞がリンパ腫細胞からなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記悪性血液細胞がリンパ腫細胞からなることを特徴とする。
上述のように、エフェクター細胞および／または補体成分が、本発明にとって特に注目されるものである。
本発明の方法のより好ましい態様では、前記エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、好中球または好酸球を含んでなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記エフェクター細胞がＮＫ細胞、マクロファージ、単球、好中球または好酸球を含んでなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記エフェクター細胞がＮＫ細胞、マクロファージ、単球、好中球または好酸球を含んでなることを特徴とする。
以下の例に基づき、本発明で用いられる抗体の特に注目される特性を記載する。
本発明の方法の好ましい態様では、ＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して４時間のインキュベーション期間後に誘導されるＡＤＣＣレベルは少なくとも４０％である。
言い換えれば、本発明による使用は、ＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して４時間のインキュベーション期間後に誘導されるＡＤＣＣレベルが少なくとも４０％であることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、ＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して４時間のインキュベーション期間後に誘導されるＡＤＣＣレベルが少なくとも４０％であることを特徴とする。
本発明の方法の好ましい態様では、ＤＡＵＤＩリンパ腫細胞に対して４時間のインキュベーション期間後に誘導されるＡＤＣＣレベルは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％である。
言い換えれば、本発明による使用は、ＤＡＵＤＩリンパ腫細胞に対して４時間のインキュベーション期間後に誘導されるＡＤＣＣレベルが少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％であることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、ＤＡＵＤＩリンパ腫細胞に対して４時間のインキュベーション期間後に誘導されるＡＤＣＣレベルが少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％であることを特徴とする。
本発明の方法の好ましい態様では、ＨｅＬａ子宮頸癌細胞に対して４時間のインキュベーション期間後に誘導されるＡＤＣＣレベルは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％である。
言い換えれば、本発明による使用は、ＨｅＬａ子宮頸癌細胞に対して４時間のインキュベーション期間後に誘導されるＡＤＣＣレベルが少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％であることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、ＨｅＬａ子宮頸癌細胞に対して４時間のインキュベーション期間後に誘導されるＡＤＣＣレベルが少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％であることを特徴とする。
本発明のもう１つの特に重要な面は、誘導されるＡＤＣＣおよびＣＤＣの特異性にある。
本発明の方法の別の好ましい態様では、ＮＫ細胞に対して有意なＡＤＣＣが誘導されない。
言い換えれば、本発明による使用は、ＮＫ細胞に対して有意なＡＤＣＣが誘導されないことを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、ＮＫ細胞に対して有意なＡＤＣＣが誘導されないことを特徴とする。
本補体成分は少なくともＣ１ｑを含んでなる。
言い換えれば、本発明による使用は、前記補体成分が少なくともＣ１ｑを含んでなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記補体成分が少なくともＣ１ｑを含んでなることを特徴とする。
本発明の方法の別の好ましい態様では、ＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して１時間のインキュベーション期間後に誘導されるＣＤＣレベルは少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％である。
言い換えれば、本発明による使用は、ＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して１時間のインキュベーション期間後に誘導されるＣＤＣレベルが少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％であることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、ＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して１時間のインキュベーション期間後に誘導されるＣＤＣレベルが少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％であることを特徴とする。
本発明の方法のさらに別の好ましい態様では、ＮＩＨ３Ｔ３ ＣＸＣＲ４細胞に対して１時間のインキュベーション期間後に誘導されるＣＤＣレベルは少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％である。
言い換えれば、本発明による使用は、ＮＩＨ３Ｔ３ ＣＸＣＲ４細胞に対して１時間のインキュベーション期間後に誘導されるＣＤＣレベルが少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％であることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、ＮＩＨ３Ｔ３ ＣＸＣＲ４細胞に対して１時間のインキュベーション期間後に誘導されるＣＤＣレベルが少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％であることを特徴とする。
本発明の方法のさらに別の好ましい態様では、ＤＡＵＤＩリンパ腫細胞に対して１時間のインキュベーション期間後に誘導されるＣＤＣレベルは少なくとも３０％、優先的には少なくとも４０％である。
言い換えれば、本発明による使用は、ＤＡＵＤＩリンパ腫細胞に対して１時間のインキュベーション期間後に誘導されるＣＤＣレベルが少なくとも３０％、優先的には少なくとも４０％であることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、ＤＡＵＤＩリンパ腫細胞に対して１時間のインキュベーション期間後に誘導されるＣＤＣレベルが少なくとも３０％、優先的には少なくとも４０％であることを特徴とする。
本発明の抗体のＡＤＣＣ特性という意味では、前記抗体とＦｃγＲとの結合に関して結果が得られた。
本発明のもう１つの特定の面は、本発明の抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントの１つが、少なくとも１つのＦｃγＲと結合し得るということに関連する。
本発明の方法の好ましい態様では、前記少なくとも１つのＦｃγＲはＦｃγＲＩである。
言い換えれば、本発明による使用は、前記少なくとも１つのＦｃγＲがＦｃγＲＩであることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記少なくとも１つのＦｃγＲがＦｃγＲＩであることを特徴とする。
本発明の方法の別の好ましい態様では、ラングミュアモデルに従った、本発明の抗体とヒトＦｃ［γ］ＲＩとの結合を特徴付ける解離定数（ＫＤ）は１〜１０ｎＭの間である。
言い換えれば、本発明による使用は、ラングミュアモデルに従った、本発明の抗体とヒトＦｃγＲＩとの結合を特徴付ける解離定数（ＫＤ）が１〜１０ｎＭの間であることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、ラングミュアモデルに従った、本発明の抗体とヒトＦｃγＲＩとの結合を特徴付ける解離定数（ＫＤ）が１〜１０ｎＭの間であることを特徴とする。
本発明の方法の別の好ましい態様では、前記少なくとも１つのＦｃγＲはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。
言い換えれば、本発明による使用は、前記少なくとも１つのＦｃγＲがヒトＦｃγＲＩＩＩａであることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、前記少なくとも１つのＦｃγＲがヒトＦｃγＲＩＩＩａであることを特徴とする。
本発明の方法のより好ましい態様では、不均一リガンドモデルに従った、本発明の抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの結合を特徴付ける解離定数（ＫＤ）は２００〜１０００ｎＭの間である。
言い換えれば、本発明による使用は、不均一リガンドモデルに従った、本発明の抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの結合を特徴付ける解離定数（ＫＤ）が２００〜１０００ｎＭの間であることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、不均一リガンドモデルに従った、本発明の抗体とヒトＦｃγＲＩＩＩａとの結合を特徴付ける解離定数（ＫＤ）が２００〜１０００ｎＭの間であることを特徴とする。
本明細書において、用語「ＫＤ」は、特定の抗体／抗原相互作用の解離定数を意味する。「結合親和性」は一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原）の間の非共有結合的相互作用の総和の強度を意味する。そうではないことが示されない限り、本明細書において「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間での１：１の相互作用を表す固有の結合親和性を表す。分子Ｘの、その相手Ｙに対する親和性は一般にＫＤで表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものをはじめ、当技術分野で公知の常法により測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原とゆっくり結合し、容易に解離する傾向にあるが、高親和性抗体は一般に抗原とより速く結合し、長く結合を維持する傾向にある。結合親和性を測定する多様な方法は当技術分野で公知であり、そのいずれもが本発明の目的で使用可能である。
好ましくは、解離定数は、ラングミュアモデルに従って算出される。
ラングミュアモデルは慣行に従って次のように表される。
Figure 2014525899
式中、Ａは分析物であり、Ｂはリガンドであり、ＡＢは分析物とリガンドとの非共有結合的複合体であり、ｋａおよびｋｄはこの相互作用のそれぞれ結合速度および解離速度である。
同様に、リガンドが２成分の混合物とみなされる不均一リガンドモデルは次の２式系で表される。
Figure 2014525899
式中、Ａは分析物であり、Ｂ１はリガンドの第１の成分であり、ＡＢ１は分析物とリガンドの第１の成分の間の非共有結合的複合体であり、ｋａ１およびｋｄ１はこの相互作用のそれぞれ結合速度および解離速度であり、Ｂ２はリガンドの第２の成分であり、ＡＢ２は分析物とリガンドの第２の成分の間の非共有結合的複合体であり、ｋａ２およびｋｄ２はこの相互作用のそれぞれ結合速度および解離速度である。
ＢＩＡＣＯＲＥデータの処理には、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）が使用されている。
最後に、本発明はまた、有効量のヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントを投与する工程を含んでなる、ＣＸＣＲ４発現癌細胞の存在に関連する病態を治療または予防する方法にも関し；前記ヒトまたはヒト化抗体は、配列番号１、２および３の配列の３つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメインと、配列番号４、５および６の配列の３つのＣＤＲを有する軽鎖可変ドメインとを含んでなり；前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能が、エフェクター細胞または補体成分の存在下で誘導される。
言い換えれば、本発明は、ＣＸＣＲ４発現癌細胞の存在に関連する病態の治療用の組成物を製造するためのヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントの使用に関し；前記ヒトまたはヒト化抗体は、それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインと、それぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインとを含んでなり；前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能が、エフェクター細胞または補体成分の存在下で誘導される。
さらに言い換えれば、本発明は、ＣＸＣＲ４発現癌細胞の存在に関連する病態を治療することに使用するための、ＣＸＣＲ４を特異的に認識するヒトまたはヒト化抗体、ＣＨ２含有結合フラグメントに関し；前記ヒトまたはヒト化抗体は、それぞれ配列番号１、２および３の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖可変ドメインと、それぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなるＣＤＲ領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖可変ドメインとを含んでなり；前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能が、エフェクター細胞または補体成分の存在下で誘導される。
好ましくは、本発明はまた、有効量のヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントを投与する工程を含んでなる、ＣＸＣＲ４発現癌細胞の存在に関連する病態を治療または予防する方法にも関し；前記ヒトまたはヒト化抗体は、配列番号７〜１０の配列から選択される重鎖可変ドメインと、配列番号１１〜１７の配列から選択される軽鎖可変ドメインとを含んでなり；前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能が、エフェクター細胞または補体成分の存在下で誘導される。
言い換えれば、本発明は、ＣＸＣＲ４発現癌細胞の存在に関連する病態の治療用の組成物を製造するためのヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントの使用に関し；前記ヒトまたはヒト化抗体は、配列番号７〜１０の配列から選択される重鎖可変ドメインと、配列番号１１〜１７の配列から選択される軽鎖可変ドメインとを含んでなり；前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能が、エフェクター細胞または補体成分の存在下で誘導される。
さらに言い換えれば、本発明は、ＣＸＣＲ４発現癌細胞の存在に関連する病態を治療することに使用するための、ＣＸＣＲ４を特異的に認識するヒトまたはヒト化抗体、ＣＨ２含有結合フラグメントに関し；前記ヒトまたはヒト化抗体は、配列番号７〜１０の配列から選択される重鎖可変ドメインと、配列番号１１〜１７の配列から選択される軽鎖可変ドメインとを含んでなり；前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能が、エフェクター細胞または補体成分の存在下で誘導される。
モノクローナル抗体は、各重鎖の定常領域においてＮ−グリコシル化されていることが知られている。特定のグリコシル化変異体がＡＤＣＣに影響を及ぼすことが示されている。例えば、ＩｇＧ１の低フコシル化がＡＤＣＣの増強と相関している(Shields et al., J Biol Chem., 277(30): 26733-2640, 2002; Shinkawa et al., J Biol Chem., 278(5): 3466-3473, 2003)。
ガラクトースレベルとＣＤＣ活性の間には有意な相関が見られた。例えば、リツキシマブのＣＤＣ活性は、ガラクトース含量の低下とともに低下する(Hodoniczky et al, Biotechnol Prog. , 21(6): 1644-1652, 2005)。
ＡＤＣＣおよびＣＤＣ試験に使用されるｈｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂの代表的なグリコシル化特性を下表５に示す。
Figure 2014525899
驚くことに、本発明によるＨｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂは、その糖鎖の９２％前後がフコース残基を含んでなっていても、ＣＸＣＲ４を発現する細胞に対して高いパーセンテージのＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘導する。
よって、本発明はまた、有効量のヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントを投与する工程を含んでなる、ＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることにより癌を治療する方法にも関し、前記ヒトまたはヒト化抗体は、以下のようなグリカン特性を含んでなり、
Figure 2014525899
 この場合、前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能がエフェクター細胞または補体成分の存在下で誘導される。
本発明はまた、ＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることによる癌治療の方法に使用するためのＣＸＣＲ４と結合するヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントにも関し、前記ヒトまたはヒト化抗体は、以下のようなグリカン特性を含んでなり、
Figure 2014525899
この場合、前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能がエフェクター細胞または補体成分の存在下で誘導される。
本発明はまた、ＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることより癌を治療するための薬剤を製造するための、ＣＸＣＲ４と結合するヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントの使用にも関し、前記ヒトまたはヒト化抗体は、以下のようなグリカン特性を含んでなり、
Figure 2014525899
この場合、前記ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能がエフェクター細胞または補体成分の存在下で誘導される。
本明細書の実施例に示されるように、本発明のヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントは、少なくともＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ応答の誘導を介した抗腫瘍活性を有し、従って、転移性腫瘍および癌などの疾患の治療に有用である。
用語「治療する(traeting)」または「治療(treatment)」とは、本明細書に記載の組成物を、統計的に有意な程度または当業者に検出可能な程度まで、障害に関連する病態、症状もしくはパラメーターを改善するため、または障害の進行もしくは悪化（その障害により引き起こされる二次的傷害を含む）を防ぐために有効な量、方法および／または様式での投与または投与することを意味する。
本発明のもう１つの面は、ヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントの医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は、担体およびヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントに加えて、種々の希釈剤、増量剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、および当技術分野で周知の他の物質を含有し得る。
本明細書において、「薬学上許容される担体」には、生理学的に適合する溶媒、バッファー、塩溶液、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれか、また総てが含まれる。担体のタイプは意図する投与経路に基づいて選択することができる。種々の態様において、担体は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経皮または経口投与に好適なものである。薬学上許容される担体には、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液の即時調合剤形用の無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質に対する媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。以下に詳細に示すように、本組成物に、抗癌薬および／または抗血管新生薬などの付加的な有効化合物を配合することもでき、特に、この付加的有効化合物は、抗血管新生薬、化学療法薬、または低分子量薬であり得る。典型的な静注用医薬組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル液と１００ｍｇの前記組合せを含有するように構成することができる。非経口的に投与可能な化合物を調製するための実際の方法は当業者にとっては既知または自明であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)ならびにその第18版および第19版に詳細に記載されており、これらは引用することにより本明細書の一部とされる。
本組成物中のヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントは好ましくは、有効量で処方される。「有効量」とは、腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導などの所望の結果を達成するために必要な用量および期間において有効な量を意味する。「治療上有効な量」とは、特定の病状の治療経過に影響を与えるに十分な量を意味する。治療上有効な量はまた、治療上有益な作用がその薬剤の有毒または有害な作用にまさる量でもある。
治療適用としては、本発明のヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントは、哺乳動物、好ましくはヒトに、ボーラスとして、もしくは一定時間にわたる持続的注入によりヒト静脈内に投与され得るもの、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によるものを含む、上述のものなどの薬学上許容される投与形で投与される。前記ヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントはまた、局所的ならびに全身的治療効果を発揮するために、腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内、または病巣周辺経路によっても好適に投与される。腹腔内経路は、例えば卵巣腫瘍の治療で特に有用であると思われる。
投与計画は最適な応答をもたらすように調整することができる。例えば、単回のボーラス投与を行ってもよく、数回の分割用量を経時的に投与してもよく、または用量を比例的に増減してもよい。本発明の組成物は、対象において細胞増殖活性を果たすために対象に投与することができる。本明細書において用語「対象」は、アポトーシスが誘導され得る生物を含むものとし、具体的には、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、サル、そのトランスジェニック種などの哺乳動物、好ましくはヒトが含まれる。
本発明のヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメント、および本発明の医薬組成物は、（限定されるものではないが）以下を含む数種の癌の治療または予防において特に有用である：膀胱、乳房、結腸、頭頸部、前立腺、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸、甲状腺および皮膚を含む癌腫および腺癌（扁平上皮癌を含む）；多発性骨髄腫、白血病、急性および慢性リンパ性（またはリンパ様）白血病、急性および慢性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）を含むリンパ系列の造血系腫瘍；急性および慢性骨髄性（骨髄様または骨髄球性）白血病、および前骨髄球性白血病を含む骨髄系列の造血系腫瘍；線維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；ならびに黒色腫、奇形癌、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、および精上皮腫を含むその他の腫瘍、および、ＣＸＣＲ４が発現されるまだ同定されていないその他の癌。ＣＸＣＲ４発現を有する癌とは、本明細書では、正常成体細胞でのＣＸＣＲ４発現レベルに比べて高いＣＸＣＲ４発現を示す癌の細胞を意味する。
本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体は独特な作用機序を有するので、本発明のヒトもしくはヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメント、および本発明の組成物は、主として、慣用の抗癌薬に耐性のある白血病、リンパ腫および癌を治療するのに有用である。
本発明の方法の好ましい態様では、ＣＸＣＲ４発現癌細胞の存在に関連する前記病態は、リンパ腫、白血病または多発性骨髄腫、優先的にはリンパ腫からなる。
言い換えれば、本発明による使用は、ＣＸＣＲ４発現癌細胞の存在に関連する前記病態がリンパ腫、白血病または多発性骨髄腫、優先的にはリンパ腫からなることを特徴とする。
さらに言い換えれば、本発明によるヒトまたはヒト化抗体は、ＣＸＣＲ４発現癌細胞の存在に関連する前記病態がリンパ腫、白血病または多発性骨髄腫、優先的にはリンパ腫からなることを特徴とする。
非限定例として、対象におけるＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在および／または場所をin vitroで検出する方法は、
（ａ）前記対象からのサンプルと、ヒト化抗体重鎖および／またはヒト化抗体軽鎖および／またはヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントとを、ＣＸＣＲ４との特異的結合能に従って接触させる工程；および
（ｂ）前記抗体と前記サンプルとの結合を検出する工程
を含んでなる。
特に、対象からのＣＸＣＲ４発現腫瘍におけるＣＸＣＲ４の発現レベルをin vitroまたはex vivoで決定する方法は、
（ａ’）前記対象からのサンプルと、ＣＸＣＲ４に特異的に結合することができるヒト化抗体重鎖および／またはヒト化抗体軽鎖および／またはヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的フラグメントとを接触させる工程；および
（ｂ’）前記サンプルにおける抗体とＣＸＣＲ４との結合レベルを定量する工程
を含んでなる。
好ましい態様では、ＣＸＣＲ４発現レベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）またはＦＡＣＳ分析により測定することができる。
本明細書において、用語「ＣＸＣＲ４の発現に関連する腫瘍形成性障害」または「ＣＸＣＲ４発現癌細胞」は、障害を患っている対象における高レベルまたは異常に低いレベルのＣＸＣＲ４（異常）の存在が、その障害の病態生理の原因であるか、またはその障害の悪化に寄与する要因であることが示されている、または疑われる疾患およびその他の障害を含むものとする。あるいは、例えば、障害を患っている対象の罹患細胞または組織の細胞表面におけるＣＸＣＲ４レベルの増大により、このような障害を証明することもできる。ＣＸＣＲ４レベルの増大は、例えば、本発明の抗体５１５Ｈ７またはｈｚ５１５Ｈ７を用いて検出することができる。さらに、それは、相対的に自律的な成長を示し、従って、細胞増殖の制御の著しい低下を特徴とする異常成長表現型を示す細胞を意味する。あるいは、前記細胞は正常レベルのＣＸＣＲ４を発現するが、異常な増殖を特徴とする場合もある。
本発明はまた、エフェクター細胞または補体成分の存在下で少なくとも１つのエフェクター機能を誘導することによりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることに使用するための、ＣＸＣＲ４と結合するヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントをスクリーニングするための方法も記載し、前記方法は、
・４時間のインキュベーション期間後にＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して少なくとも４０％のＡＤＣＣレベルを誘導する抗体を選択すること；
・１時間のインキュベーション期間後にＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％のＣＤＣレベルを誘導する抗体を選択すること；
・１時間のインキュベーション期間後にＮＩＨ３Ｔ３ ＣＸＣＲ４細胞に対して少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％のＣＤＣレベルを誘導する抗体を選択すること；
・ラングミュアモデルに従い、１〜１０ｎＭの間の解離定数（ＫＤ）でＦｃγＲＩと結合する抗体を選択すること；
・不均一リガンドモデルに従い、２００〜１０００ｎＭの間の解離定数（ＫＤ）でＦｃγＲＩＩＩＡと結合する抗体を選択すること
から選択される、少なくとも１つの選択工程を含んでなる。
本発明の実施には、そうではないこと示されない限り、従来技術、すなわち、タンパク質化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、および薬理学を使用し、これらは当分野の技術の範囲内である。このような技術は文献で十分に説明されている（Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Eds., John Wiley & Sons, Inc. New York, 1995; Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985;およびSambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989; Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Press; Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)参照）。本明細書に記載の分子・細胞生物学、タンパク質化学、酵素学、および医薬品・薬化学の実験室手順および技術に関しての名称は、当技術分野で周知かつ慣用のものである。
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用する総ての技術用語および科学用語は、本発明の属する当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。
本発明の他の特徴および利点を実施例および図面を用いた説明でさらに明らかにする。図面の凡例を以下に示す。
５１５Ｈ７重鎖可変ドメインとヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ３−４９＊０４およびＩＧＨＪ４＊０１のアミノ酸配列アラインメントを示す。５１５Ｈ７ ＶＨアミノ酸配列が選択されたヒトアクセプターフレームワーク配列とアラインされている。ＶＨ１およびＶＨ２（ＶＨ３は示されていない）配列は、実施される５１５Ｈ７ ＶＨドメインのヒト化変異体に相当し、太字の復帰突然変異残基を有する。変異体１ ＶＨ１は復帰突然変異残基を含まず、完全ヒト変異体を表す。変異体ＶＨ２は８つの復帰突然変異を有し、ほとんどマウス変異体である。変異体ＶＨ３は５つの復帰突然変異を有する（示されていない）。 ５１５Ｈ７軽鎖とヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ４−１＊０１およびＩＧＫＪ１＊０１とのアミノ酸配列アラインメントを示す。５１５Ｈ７ ＶＬアミノ酸配列が選択されたヒトアクセプターフレームワーク配列とアラインされている。ＶＬ１〜ＶＬ３配列は、実施された５１５Ｈ７ ＶＬドメインのヒト化変異体に相当し、太字の復帰突然変異残基を有する。変異体ＶＬ１は復帰突然変異残基を含まず、ほとんどヒト変異体を表す。変異体ＶＬ２は１３の復帰突然変異を有し、ほとんどマウス変異体を表す。変異体ＶＬ３は５つの復帰突然変異を有する。 キメラ５１５Ｈ７および種々のヒト化５１５Ｈ７変異体によるビオチン化マウス抗体５１５Ｈ７の交差遮断を示す。親マウス抗体５１５Ｈ７の交差遮断に対する５１５Ｈ７のヒト化変異体（ｈｚ５１５Ｈ７）の活性を、ＣＸＣＲ４トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いたフローサイトメトリーにより評価した。これらのヒト化変異体の活性をキメラ５１５Ｈ７と比較した。ＶＨの３つの異なる変異体（ＶＨ１〜ＶＨ３）をキメラＶＬ（ｃＶＬ）と組み合わせた場合の交差遮断活性は極めてよく類似していた（図３Ａ〜図３Ｃ）。ＶＬの変異体１および２と組み合わせた場合、ＶＨ変異体１（ＶＨ１、復帰突然変異を含まない変異体）の活性に低下はないと判定された。構築物ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ ＶＬ３では、活性の有意な低下が検出された（図３Ｄ〜３Ｆ）。 ヒト化抗体５１５Ｈ７変異体ＶＨ１ ＶＬ１の活性を試験するためのＢＲＥＴアッセイを示す。ヒト化変異体５１５Ｈ７ ＶＨ変異体１ ＶＬ変異体１（ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ ＶＬ１）の活性を、ＳＤＦ−１媒介シグナル伝達を阻害するその能力により評価した。この変異体は、ＢＲＥＴにより決定した場合、ＳＤＦ−１媒介シグナル伝達に軽微な阻害を示したに過ぎなかった。ＳＤＦ−１は１００ｎＭの濃度で使用した。 単一または二重復帰突然変異を有するＶＨ１の種々の突然変異と、種々のＶＬ変異体とｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎの組合せとの比較を示す。単一および二重復帰突然変異をＶＨ１に生じさせ、ＶＬ１と組み合わせた。これらの構築物をＢＲＥＴアッセイで評価した（図５Ａ〜５Ｃ）。これらの単一復帰突然変異体のうち、復帰突然変異Ｄ７６Ｎを有する構築物だけがＳＤＦ−１媒介シグナル伝達の阻害の増大を示した。ＶＨにおける二重復帰突然変異体に強い阻害活性を有するものは無かった（図５Ｃ）。ＶＨ１の単一復帰突然変異体Ｄ７６ＮをＶＬの種々の変異体と組み合わせた。ＳＤＦ−１濃度は１００ｎＭであった。 単一または二重復帰突然変異を有するＶＨ１およびＶＬ１の種々の突然変異体のランク付けを構築物ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２と比較して示す。単一および二重復帰突然変異をＶＨ１に生じさせ、ＶＬ１と組み合わせた。総ての構築物をＢＲＥＴアッセイで評価し、それらの阻害パーセントを計算した。ＳＤＦ−１濃度は１００ｎＭであった。 ヒト化５１５Ｈ７の種々の構築物によるＳＤＦ−１結合の阻害、ならびにＦＡＣＳおよびＢＲＥＴにより得られた結果の間の相関を示す。β−アレスチンの動員遮断に強い活性を有するヒト化抗体５１５Ｈ７の種々の変異体の、ビオチン化ＳＤＦ−１の結合を阻害する能力を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で試験した（Ａ）。これらをＶＨ１およびＶＬ１と比較した。ＦＡＣＳに基づくアッセイから得られた結果は、ＢＲＥＴから得られた結果と相関している（Ｂ）。 ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２とさらなるヒト化型５１５Ｈ７ ＶＬ２．１、５１５Ｈ７ ＶＬ２．２および５１５Ｈ７ ＶＬ２．３とのアミノ酸配列アラインメントを示す。５１５Ｈ７ ＶＬアミノ酸配列を、選択されたヒトアクセプターフレームワーク配列とアラインした。ＶＬ２．１、ＶＬ２．２およびＶＬ２．３配列は、実施されたヒト化５１５Ｈ７ ＶＬ２のヒト化変異体に相当し、太字の突然変異残基を有する。ＶＬ２．１およびＶＬ２．２はさらに４つのヒト化残基を有し、ＶＬ２．３はさらに５つのヒト残基を含む。 ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４細胞（図９Ａ）、Ｕ９３７細胞（図９Ｂ）およびＲａｍｏｓ細胞（図９Ｃ）上のＣＸＣＲ４に対する５１５Ｈ７ヒト化Ｍａｂ（ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２およびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３）の特異的結合を示す。 ＣＸＣＲ４発現細胞であるＲａｍｏｓ細胞（図１０Ａ）およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）（図１０Ｂ）に対するｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂの抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の効果を示す。 ＣＸＣＲ４発現細胞であるＲａｍｏｓ細胞（図１１Ａ）およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）（図１１Ｂ）に対するｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂの抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の効果を示す。 ＣＸＣＲ４を発現するＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４細胞株およびＲａｍｏｓ細胞に対するｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂの補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の効果を示す。 ＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓ細胞に対するｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂの補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の効果を示す。 ＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓ細胞に対するｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（図１４Ａ）およびｃ５１５Ｈ７（図１４Ｂ）Ｍａｂの補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の用量効果を示す。 組換えヒトＦｃγＲＩと、ＣＭ４センサーチップ上に固定化されているｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂとの結合。６つの異なる濃度のｈ−ＦｃγＲＩを試験した（２００、１００、５０、２５、１２．５および６．２５ｎＭ）。 組換えヒトＦｃγＲＩＩＩＡと、ＣＭ４センサーチップ上に固定化されているｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂとの結合。５つの異なる濃度のｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡを試験した（１０００、５００、２５０、１２５および６２．５ｎＭ）。 ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ濃度（１０００、５００、２５０、１２５および６２．５ｎＭ）プロットに対する、結合相終了時の応答を用いた定常状態解析によるｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡ／ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２複合体の解離定数の決定。 組換えマウスＦｃγＲＩと、ＣＭ４センサーチップ上に固定化されているｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂとの結合。５つの異なる濃度のｍ−ＦｃγＲＩを試験した（４００、２００、１００、５０および２５ｎＭ）。 マウスＦｃγＲＩ濃度（４００、２００、１００、５０および２５ｎＭ）プロットに対する、結合相終了時の応答を用いた定常状態解析によるｍ−ＦｃγＲＩ／ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２複合体の解離定数の決定。 組換えマウスＦｃγＲＩＩＩと、ＣＭ４センサーチップ上に固定化されているｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂとの結合。５つの異なる濃度のｍ−ＦｃγＲＩＩＩを試験した（４００、２００、１００、５０および２５ｎＭ）。 ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂ／Ｆｃγ受容体複合体の半減期（分）の関数としての解離定数（ｎＭ）プロットに対する、４つのＦｃγ受容体とｈｚ−５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂ（ｈ−ＦｃγＲＩとｍ−ＦｃγＲＩＩＩを有する１成分およびｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡとｍ−ＦｃγＲＩを有する２成分）との結合のランク付け。 組換えヒトＦｃγＲＩと、ＣＭ４センサーチップ上に固定化されているｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂとの結合。６つの異なる濃度のｈ−ＦｃγＲＩを試験した（２００、１００、５０、２５、１２．５および６．２５ｎＭ）。 組換えヒトＦｃγＲＩＩＩＡと、ＣＭ４センサーチップ上に固定化されているｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂとの結合。５つの異なる濃度のｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡを試験した（１０００、５００、２５０、１２５および６２．５ｎＭ）。 ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ濃度（１０００、５００、２５０、１２５および６２．５ｎＭ）プロットに対する、結合相終了時の応答を用いた定常状態解析によるｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡ／ｃ５１５Ｈ７複合体の解離定数の決定。 組換えマウスＦｃγＲＩと、ＣＭ４センサーチップ上に固定化されているｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂとの結合。５つの異なる濃度のｍ−ＦｃγＲＩを試験した（４００、２００、１００、５０および２５ｎＭ）。 マウスＦｃγＲＩ濃度（４００、２００、１００、５０および２５ｎＭ）プロットに対する、結合相終了時の応答を用いた定常状態解析によるｍ−ＦｃγＲＩ／ｃ５１５Ｈ７複合体の解離定数の決定。 組換えマウスＦｃγＲＩＩＩと、ＣＭ４センサーチップ上に固定化されているｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂとの結合。５つの異なる濃度のｍ−ＦｃγＲＩＩＩを試験した（４００、２００、１００、５０および２５ｎＭ）。 ｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂ／Ｆｃγ受容体複合体の半減期（分）の関数としての解離定数（ｎＭ）プロットに対する、４つのＦｃγ受容体とｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂ（ｈ−ＦｃγＲＩとｍ−ＦｃγＲＩＩＩを有する１成分およびｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡとｍ−ＦｃγＲＩを有する２成分）との結合のランク付け。 ＣＸＣＲ４発現細胞：ＲＡＭＯＳ、ＤＡＵＤＩおよびＨｅＬａ細胞に対する、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７）Ｍａｂの抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）の効果を示す。 ＣＸＣＲ４発現細胞：ＤＡＵＤＩおよびＲＡＭＯＳ細胞に対する、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７）Ｍａｂの補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の効果を示す。
実施例１：ヒトＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の作製
ＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体を作製するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、組換えＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４細胞ならびに／またはＣＸＣＲ４の細胞外Ｎ末端およびループに相当するペプチドで免疫した。初回の免疫誘導時に６〜１６週齢のマウスを完全フロイントアジュバント中の抗原で１回皮下（ｓ．ｃ．）免疫した後、フロイントの不完全アジュバント中の抗原で２〜６回、皮下免疫した。免疫応答は眼窩後方採血(retroorbital bleeds)によりモニタリングした。血清をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし（下記の通り）、高い力価の抗ＣＸＣＲ４抗体を有するマウスを融合に用いた。マウス静脈に抗原を追加投与し、２日後にマウスを屠殺し、脾臓を摘出した。
ＥＬＩＳＡ
抗ＣＸＣＲ４抗体を産生するマウスを選択するために、免疫されたマウスの血清をＥＬＩＳＡにより調べた。簡単に述べると、マイクロタイタープレートをＢＳＡとコンジュゲートした精製［１−４１］Ｎ末端ペプチドにて５μｇ当量ペプチド／ｍＬでコーティングし、１００μＬ／ウェルを４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ中２５０μＬ／ウェルの０．５％ゼラチンでブロッキングした。ＣＸＣＲ４免疫マウスの血漿の希釈液を各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。これらのプレートをＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体(Jackson Laboratories)とともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、５分後に、１００μＬ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することにより反応を停止させた。最高力価の抗ＣＸＣＲ４抗体を生成したマウスを抗体作製に用いた。
ＣＸＣＲ４に対するＭａｂを産生するハイブリドーマの作製
最高力価の抗ＣＸＣＲ４抗体を生成したＢａｌｂ／ｃマウスから単離したマウス脾細胞を、ＰＥＧを用いてマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０と融合させた。細胞を約１×１０５／ウェルでマイクロタイタープレートに播種した後、ｕｌｔｒａ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１×ＨＡＴを含有する選択培地中で２週間インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡにより抗ＣＸＣＲ４モノクローナルＩｇＧ抗体についてウェルをスクリーニングした。その後、抗体を分泌するハイブリドーマを、限界希釈により少なくとも２回サブクローニングし、さらなる分析のためにin vitroで培養して抗体を作製した。
実施例２：抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７の結合特異性および癌細胞株認識のＦＡＣＳ分析による特性決定
本実験では、抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７のヒトＣＸＣＲ４への特異的結合をＦＡＣＳ分析により調べた。
ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅｌａおよびＵ９３７癌細胞株を、１０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体５１５Ｈ７とともにインキュベートした。その後、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で洗浄した。次に、Ａｌｅｘａ標識二次抗体を細胞に添加し、４℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を再び２回洗浄した。２回目の洗浄後、ＦＡＣＳ分析を行った。これらの結合実験の結果を以下の表６に示す。この表は、抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７がヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクト細胞株に特異的に結合したが、親ＮＩＨ３Ｔ３細胞での認識は見られないことを示している［ＦＡＣＳで得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）］。このＭａｂは、ヒト癌細胞株、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、Ｕ９３７前骨髄球性癌細胞およびＨｅｌａ子宮頸癌細胞も認識することができた。
抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７は、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクタントを認識したが、親ＮＩＨ３Ｔ３野生型細胞は認識しなかった。Ｍａｂ ５１５Ｈ７は癌細胞株も認識することができた。
Figure 2014525899
実施例３：５１５Ｈ７抗ＣＸＣＲ４マウス抗体のヒト化
一般手順
５１５Ｈ７抗ＣＸＣＲ４抗体のヒト化は、ＣＤＲグラフト法のグローバルルールを適用することにより行った。免疫原性分析ならびにＣＤＲおよびフレームワーク（ＦＲ）領域の定義は、ＩＭＧＴ独自ナンバリング法ならびにＩＭＧＴライブラリーおよびツール(Lefranc, 1997-www.imgt.org)を適用することにより行った。
ヒト化プロセスの効率は、操作された抗体の機能活性を、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイにより、ＳＤＦ−１により媒介されるβ−アレスチン動員を阻害するそれらの能力に関して調べることによって評価した。このアッセイでは、ＣＸＣＲ４をルシフェラーゼで、β−アレスチンをＹＦＰで標識した。ＳＤＦ−１により媒介されるＣＸＣＲ４へのβ−アレスチンの動員は、ＣＸＣＲ４のシグナル伝達において重要なステップである。また、ヒトＣＸＣＲ４で安定してトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞株に対する５１５Ｈ７ヒト化変異体の結合も測定した。結合活性は、ビオチン化マウス抗体との競合アッセイにより評価した。第二の試みにおいて、ヒト化抗体を、ＲＡＭＯＳ細胞に対するビオチン化ＳＤＦ−１の結合を阻害するそれらの能力について評価した。ＣＸＣＲ４の発現が高く、ＣＸＣＲ７およびＳＤＦ−１の発現が低いことから、ＲＡＭＯＳ細胞を選択した。
これらのアッセイを用いて抗ＣＸＣＲ４抗体の組換えヒト化型の特性決定を行った。ヒトＩｇＧ１／ｋ定常ドメインを用いて可変ドメインをフォーマットし、哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰにクローニングした。組換えＩｇＧ１／κ由来抗体をＨＥＫ２９３細胞で一時的に発現させた。発現培養上清を濾過し、プロテインＡタンパク質セファロースを用いて抗体を精製した。精製した抗体をＰＢＳ中で再び緩衝させ、ＥＬＩＳＡにより抗体濃度を決定した。
５１５Ｈ７可変ドメインのヒト化
ＣＤＲグラフトに適当なヒト生殖細胞系を選択するために、５１５Ｈ７ ＶＨマウス配列に対して最大の相同性を有するヒト生殖細胞系遺伝子を特定した。ＩＭＧＴデータベースおよびツールを用いて、ヒトＩＧＨＶ３−４９＊０４生殖細胞系遺伝子およびヒトＩＧＨＪ４＊０１ Ｊ生殖細胞系遺伝子をマウス５１５Ｈ７ ＶＨ ＣＤＲのヒトアクセプター配列として選択した。ヒトＶ−遺伝子ＩＧＨＶ３−４９＊０４は、マウス５１５Ｈ７重鎖の可変ドメインのＶ−遺伝子と８０．２７％の相同性を有する。ヒトＪ−遺伝子ＩＧＨＪ４＊０１ Ｊに対する相同性は８７．５０％である。選択されたヒト生殖細胞系遺伝子とマウス抗体５１５Ｈ７のＶＨドメインの間では、１９残基が異なる。親抗体のＶＨドメインと生殖細胞系配列とのアラインメントを図１に示す。
軽鎖の可変ドメインに関しては、ヒト生殖細胞系遺伝子ＩＧＫＶ４−１＊０１およびＩＧＫＪ１＊０１を選択した（図２）。ヒトＶ−遺伝子ＩＧＫＶ４−１＊０１との相同性は７９．１２％である。軽鎖の５１５Ｈ７ Ｊ−遺伝子は、ヒトＪ−遺伝子ＩＧＫＪ１＊０１と８４．８５％の相同性を有する。
翻訳されたヒト生殖細胞系遺伝子ＩＧＨＶ３−４９＊０４およびＩＧＫＶ４−１＊０１のアミノ酸配列を用いて相同な抗体を同定し、それらを結晶化させた。重鎖については、ＲＣＳＢタンパク質データバンクにおいて受託番号１ＭＡＭの抗体をモデルとして選択し、軽鎖については、抗体１ＳＢＳを選択した。これらの２つのドメインを、コンピュータープログラムＤＳ ｖｉｓｕａｌを用いてアセンブルし、ヒト化抗体５１５Ｈ７のモデルとして用いた。
親抗体と対応するヒト生殖細胞系配列の間で異なる各残基の位置に基づき、ヒト配列とマウス配列の間で異なる各残基について優先ランクの順位を付けた（図１および２）。これらの優先順位を用いて、それぞれＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ３と呼ばれる各ヒト化可変ドメインの３つの異なる変異体を作出した。
第１の実験系で、本発明者らは３つの第１ヒト化改変体を構築し、その抗ＣＸＣＲ４結合活性を分析した。ＶＨ変異体１（ＶＨ１）をマウスＶＬと組み合わせ、これらの構築物の、ビオチン化マウス５１５Ｈ７親抗体の結合を阻害する能力を評価した。総ての構築物がマウス抗体に対して同等の競合能を示した（図３Ａ〜Ｃ）。このことは、ほとんどのヒトＶＨ変異体が少数のヒト変異体と同等の結合能を有することを示している。従って、ＶＨ１をＶＬの３つの異なる変異体と組み合わせた（図３Ｄ〜Ｆ）。ＶＨ１とＶＬ３の組合せだけはビオチン化マウス抗体との低い競合能を示したが、フレームワーク内に復帰突然変異を持たないほとんどのヒト変異体ＶＨ１ ＶＬ１は、キメラ抗体と同等の交差遮断活性を示した。
さらに、ＢＲＥＴアッセイにおいて、この変異体ＶＨ１ ＶＬ１の、ＳＤＦ−１により媒介されるβ−アレスチンの動員を阻害する能力を調べた（図４）。親抗体の交差遮断によって判断した場合に受容体に対して望ましい結合活性であったにもかかわらず、構築物ＶＨ１ ＶＬ１は、β−アレスチンの動員については弱い阻害を示したに過ぎなかった。このように強い阻害活性がないために、ヒトフレームワーク残基をマウス残基で置換することが必要となる。ＶＨ １に関して単一の復帰突然変異を構築した。以下の残基：Ｖ４８Ｌ、Ｅ６１Ｄ、Ｄ７６ＮおよびＡ８１Ｌ（一次アミノ酸配列に従って符番）を置換した。変異体ＶＨ１のこれらの単一復帰突然変異体を変異体ＶＬ１と組み合わせた。これらのうち、復帰突然変異Ｄ７６Ｎだけが、ＢＲＥＴアッセイによって評価した場合に、シグナル伝達の阻害の増強をもたらした（図５Ｂ）。
この構築物の活性を高め、さらに他の残基の重要性を評価するために、ＶＨ １に関して種々の二重復帰突然変異体を構築した。これらの構築物の阻害活性は若干改善された（平均阻害率約４５〜５０％）が、満足のいくものではなかった（図５Ｃ）。次に、単一復帰突然変異体Ｄ７６Ｎを３つの異なるＶＬ変異体と組み合わせた（図５Ｄ）。構築物ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２は平均で８８．２％の活性を示し、これはキメラ抗体と同じ範囲である。
変異体ＶＬ１ドメインに単一および二重復帰突然変異を構築し、構築物ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２と比較した（図６）。調べた組合せの中に、この構築物と同等またはより良い活性を有するものは無かった。
ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２について、フレームワーク中のヒト残基のパーセンテージを計算したところ、１８０残基のうち１４の非ヒト残基を含み、これは９２．２％の「ジャーミナリティ・インデックス(germinality index)」に等しい。比較として、市販のヒト化抗体ベバシズマブおよびトラスツズマブは、それらの可変ドメインにそれぞれ３０および１４の非ヒト残基を含む。
ＳＤＦ−１により媒介されるβ−アレスチン動員の阻害に最強の有効性を示す、４つの最良のヒト化型も、ビオチン化ＳＤＦ−１の結合を阻害するそれらの能力に関して調べた（図７Ａ）。ＳＤＦ−１結合とβ−アレスチン動員の阻害の密接な相関が認められた。この相関は、ＳＤＦ−１結合の阻害がシグナル伝達阻害の主要な機構である可能性が最も高いことを示す。
ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２変異体をさらにヒト化するために、図６で評価した二重および三重突然変異体で得た情報を用いることで、さらに３つの変異体を設計した。変異体ＶＬ２．１、ＶＬ２．２およびＶＬ２．３（ＶＬ２−１、ＶＬ２−２およびＶＬ２−３とも呼ばれる）のそれぞれにおいて４つおよび５つの付加的残基をヒト化した。それらは残基Ｄ９、Ｐ４９、Ｄ６６、Ｓ６９、Ｓ８３、Ｌ８４；Ｖ８９に相当する。これら３つの変異体のアラインメントをＶＬ２と比較して図８に示す。
これらのＶＬ２変異体の、ＳＤＦ−１により媒介されるβ−アレスチンの動員を阻害する能力を評価した。ヒト化ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、ＶＬ２．１、ＶＬ２．２およびＶＬ２．３変異体は、キメラ抗体ｃ５１５Ｈ７と同等の活性を示した（図６）。
実施例４：ＦＡＣＳ分析による抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７の結合特異性および癌細胞株認識の特性決定
この試験では、抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７のヒトＣＸＣＲ４に対する特異的結合をＦＡＣＳ分析により調べた。
ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞およびＲａｍｏｓ、Ｕ９３７癌細胞株を０〜１０μｇ／ｍＬのヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７（ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２およびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３）とともに、１００μｌのＦａｃｓバッファー中、暗所にて４℃で２０分間インキュベートした。Ｆａｃｓバッファー中で３回洗浄した後、細胞を二次抗体としてのヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ ４８８（１／５００希釈）とともに、暗所にて４℃で２０分間インキュベートした。Ｆａｃｓバッファーで３回洗浄した後、各ウェルにヨウ化プロピジウムを加え、生存細胞だけをＦａｃｓにより分析した。少なくとも５０００の生存細胞を評価し、各条件について蛍光強度の平均値を求めた。
これらの結合試験の結果を図９Ａ〜９Ｃに示す。これらの図［ＦＡＣＳにより得られる平均蛍光強度（ＭＦＩ）］は、抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ｈｚ５１５Ｈ７がヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクト細胞株と特異的に結合し（図９Ａ）（ＮＩＨ３Ｔ３親細胞の場合ＭＦＩ＝２．２）、かつまたヒト癌細胞株、例えば、Ｕ９３７（図９Ｂ）およびＲａｍｏｓ（図９Ｃ）を認識することを示す。
実施例５：ＣＸＣＲ４発現細胞に対するｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂの抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）効果
ＡＤＣＣは、Cytotoxicity Detection KitPLUS (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を製造者の説明書に従って用いる乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイにより測定した。乳酸デヒドロゲナーゼは、アポトーシスまたは壊死のいずれかに起因する膜の健全性の欠如の後に培養培地中に放出される可溶性サイトゾル酵素である。従って、ＬＤＨ活性は、細胞膜の健全性の指標として使用することができ、ＡＤＣＣを含む細胞傷害作用を評価するための一般的手段として役立つ。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール密度勾配(Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare, Amersham, UK)を用い、健康なドナーから得たヒトバフィーコートから単離した。このＰＢＭＣ画分から、RoboSep（登録商標）Human NK Cell Enrichment Kit製造者プロトコール(StemCell Technologies)に従ってナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を分離した。ＮＫ細胞を９６ウェル平底プレートに、５０μＬ／ウェルでエフェクター／標的比を５０：１として播種した。抗体とともに室温で１０分間プレインキュベートした１００００個の標的細胞（Ｒａｍｏｓ）をエフェクター細胞上に５０μＬ／ウェルで添加した。３７℃で４時間のインキュベーション後、ＬＤＨの放出量を測定することにより細胞傷害作用を求めた。細胞傷害パーセントは、次のように算出した：溶解率％＝［実験的放出−エフェクターおよび標的の自然放出］／［標的の最大放出−標的の自然放出］×１００。
図１０は、高レベルのＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓ細胞およびＮＫ細胞単独に対するＡＤＣＣを示す［ＣＸＣＲ４レベル（ＭＦＩ）：Ｒａｍｏｓ＞ＮＫ細胞］。黒い柱：Ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７ＶＬ２）（１０μｇ／ｍＬ）、白い柱：アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１（１０μｇ／ｍＬ）。細胞をｈＩｇＧ１アイソタイプ対照とともにインキュベートした際には効果は見られなかった（図１０Ａおよび１０Ｂ）。これに対して、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ ＭａｂはＲａｍｏｓ細胞に対して有意なＡＤＣＣ（４７．９％＋／−８．９）を誘導することができた（図１０Ａ）が、ＣＸＣＲ４の発現レベルが低いＮＫ細胞では有意なＡＤＣＣ（３％＋／−３）は見られなかった（図１０Ｂ）。
実施例６：ＣＸＣＲ４発現細胞に対するｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂの抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）効果
ＡＤＣＣは、Cytotoxicity Detection KitPLUS (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)を製造者の説明書に従って用いる乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイにより測定した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール密度勾配(Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare, Amersham, UK)を用い、健康なドナーから得たヒトバフィーコートから単離した。このＰＢＭＣ画分から、RoboSep（登録商標）Human NK Cell Enrichment Kit製造者プロトコール(StemCell Technologies)に従ってナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を分離した。ＮＫ細胞を９６ウェル平底プレートに、５０μＬ／ウェルでエフェクター／標的比を５０：１として播種した。抗体とともに室温で１０分間プレインキュベートした１００００個の標的細胞（Ｒａｍｏｓ）をエフェクター細胞上に５０μＬ／ウェルで添加した。３７℃で４時間のインキュベーション後、ＬＤＨの放出量を測定することにより細胞傷害作用を求めた。細胞傷害パーセントは、次のように算出した：溶解率％＝［実験的放出−エフェクターおよび標的の自然放出］／［標的の最大放出−標的の自然放出］×１００。
図１１は、高レベルのＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓ細胞およびＮＫ細胞単独に対するＡＤＣＣを示す［ＣＸＣＲ４レベル（ＭＦＩ）：Ｒａｍｏｓ＞ＮＫ細胞］。黒い柱：ｃ５１５Ｈ７（１０μｇ／ｍＬ）、白い柱：アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１（１０μｇ／ｍＬ）。細胞をｈＩｇＧ１アイソタイプ対照とともにインキュベートした際には効果は見られなかった（図１１Ａおよび１１Ｂ）。これに対して、ｃ５１５Ｈ７ ＭａｂはＲａｍｏｓ細胞に対して有意なＡＤＣＣ（６１．４％＋／−８．１）を誘導することができた（図１１Ａ）が、ＣＸＣＲ４の発現レベルが低いＮＫ細胞では有意なＡＤＣＣ（５．４％＋／−４．６）は見られなかった（図１１Ｂ）。
実施例７：ＣＸＣＲ４発現細胞に対するｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂの補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）効果
ＣＤＣアッセイは、CellTiter Glo試薬(Promega, Madison, WI, USA)を用いるＡＴＰ測定に基づいた。
簡単に述べると、１００００個の標的細胞を、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２の存在下、９６ウェル平底プレートに播種した。室温で１０分間のインキュベーションの後、健康なドナーからのヒト血清をプールしたものを終濃度１０％で添加した。３７℃で１時間の後、ＡＴＰの量を測定することにより生存率を決定した。細胞傷害パーセントは次のように算出した：細胞傷害率％＝１００−［［実験細胞／標的細胞（抗体不含）］×１００］。
図１２は、高レベルのＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓおよびＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４細胞株に対するＣＤＣを示す。黒い柱：Ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７ＶＬ２）（１０μｇ／ｍＬ）、白い柱：アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１（１０μｇ／ｍＬ）。細胞をｈＩｇＧ１アイソタイプ対照とともにインキュベートした際には効果は見られなかった（図１２）。これに対して、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂは、 ＮＩＨ／３Ｔ３ＣＸＣＲ４およびＲＡＭＯＳ細胞株の両方に対して有意なＣＤＣ（８０％前後）を誘導することができた（図１２）。
実施例８：高レベルのＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓ細胞に対するｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂの補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）効果
ＣＤＣアッセイは、CellTiter Glo試薬(Promega, Madison, WI, USA)を用いるＡＴＰ測定に基づいた。
簡単に述べると、１００００個の標的細胞を、Ｍａｂの存在下、９６ウェル平底プレートに播種した。室温で１０分間のインキュベーションの後、健康なドナーからのヒト血清をプールしたものを終濃度１０％で添加した。３７℃で１時間の後、ＡＴＰの量を測定することにより生存率を決定した。細胞傷害パーセントは次のように算出した：細胞傷害率％＝１００−［［実験細胞／標的細胞（抗体不含）］×１００］。
図１３は、高レベルのＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓ細胞株に対するＣＤＣを示す。黒い柱：ｃ５１５Ｈ７（１０μｇ／ｍＬ）、白い柱：アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１（１０μｇ／ｍＬ）。細胞をｈＩｇＧ１アイソタイプ対照とともにインキュベートした際には効果は見られなかった（図１３）。これに対して、ｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂは、ＲＡＭＯＳ細胞に対して有意なＣＤＣ（３４％）を誘導することができた（図１３）。
実施例９：高レベルのＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓ細胞に対するｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２およびｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂの補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）容量効果
ＣＤＣアッセイは、CellTiter Glo試薬(Promega, Madison, WI, USA)を用いるＡＴＰ測定に基づいた。
簡単に述べると、１００００個の標的細胞を、Ｍａｂの存在下、９６ウェル平底プレートに播種した。室温で１０分間のインキュベーションの後、健康なドナーからのヒト血清をプールしたものを終濃度１０％で添加した。３７℃で１時間の後、ＡＴＰの量を測定することにより生存率を決定した。細胞傷害パーセントは次のように算出した：細胞傷害率％＝１００−［［実験細胞／標的細胞（抗体不含）］×１００］。
図１４は、高レベルのＣＸＣＲ４を発現するＲａｍｏｓ細胞株に対するＣＤＣを示す。黒い柱：ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７ＶＬ２）（図１４Ａ）またはｃ５１５Ｈ７（図１４Ｂ）のいずれか（１０μｇ／ｍＬ）、白い柱：アイソタイプ対照ｈＩｇＧ１（１０μｇ／ｍＬ）。細胞をｈＩｇＧ１アイソタイプ対照とともにインキュベートした際には効果は見られなかった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。これに対して、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（図１４Ａ）およびｃ５１５Ｈ７（図１４Ｂ）Ｍａｂは、Ｒａｍｏｓ細胞に対して有意なＣＤＣを誘導することができ、ＣＤＣ最大値はそれぞれ７４％および３４％であり、ＥＣ５０はそれぞれ０．０３３μｇ／ｍＬおよび０．０４μｇ／ｍＬであった。
実施例１０：リアルタイム表面プラズモン共鳴によるｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂとｈ−ＦｃγＲＩ、ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡ、ｍ−ＦｃγＲＩおよびｍ−ＦｃγＲＩＩＩの間の相互作用試験
これらの試験はＢｉａｃｏｒｅ Ｘ装置を用いて行った。本試験に用いた可溶型の４つのＦｃγ受容体はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
１−組換えヒトＦｃγＲＩ［ＣＤ６４］は、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有するＧｌｎ１６−Ｐｒｏ２８８フラグメントに相当する［カタログ番号：１２５７−ＦＣ］。本試験に用いた５０ｋＤａの分子量（供給者により明記）は、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定義される分子量の平均値に相当する。
２−組換えヒトＦｃγＲＩＩＩＡ変異体Ｖ［ＣＤ１６ａ］は、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有するＧｌｎ１７−Ｇｌｎ２０８フラグメントに相当する［カタログ番号：４３２５−ＦＣ］。本試験に用いた４５ｋＤａの分子量（供給者により明記）は、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定義される分子量の平均値に相当する。
３−組換えマウスＦｃγＲＩ［ＣＤ６４］は、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有するＧｌｎ２５−Ｐｒｏ２９７フラグメントに相当する［カタログ番号：２０７４−ＦＣ］。本試験に用いた５５ｋＤａの分子量（供給者により明記）は、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定義される分子量の平均値に相当する。
４−組換えマウスＦｃγＲＩＩＩ［ＣＤ１６］は、Ｃ末端１０−Ｈｉｓタグを有するＡｌａ３１−Ｔｈｒ２１５フラグメント［カタログ番号：１９６０−ＦＣ］に相当する。本試験に用いた３７．５ｋＤａの分子量（供給者により明記）は、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定義される分子量の平均値に相当する。
他の試薬は、Ｂｉａｃｏｒｅ(GE Healthcare)により供給された。
アミンカップリングキット化学を用い、ＣＭ４センサーチップの第２フローセル（ＦＣ２）に１９６４ＲＵのｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂを固定した。ＮＨＳとＥＤＣの混合物により活性化され、エタノールアミンにより不活性される第１フローセル（ＦＣ１）を、分析物（Ｆｃγ受容体）とセンサーチップマトリックスの間の非特異的相互作用を確認して差し引くための参照表面として用いた。
動態試験は、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。ランニングバッファーまたは分析物溶液の調製目的のいずれかとしてＨＢＳ−ＥＰバッファーを用いた。これらの分析物溶液を９０秒注入し（結合相）、９０秒待機した（解離相）。分析物としてのランニングバッファーの注入を二重参照として用いた。センサーグラムは総て、二重参照センサーグラムと相関性があった。
分析物の各注入の後に、ｈ−ＦｃγＲＩおよびｍ−ＦｃγＲＩＩＩの後には２０ｍＭ ＮａＯＨ溶液を、またはｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡおよびｍ−ＦｃγＲＩの後には１０ｍＭ ＮａＯＨを注入することによりセンサーチップを再生した。
「ラングミュア」および「不均一リガンド」モデルの２つの数学モデルを用いてこれらのセンサーグラムを解析した。
ｈ−ＦｃγＲＩで得られたセンサーグラム［図１５］はラングミュアモデルに完全には適合せず（５％＜Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＜２０％）、「不均一リガンド」モデルもこの適合性の質を改善しなかった。ラングミュアモデルを用いた場合、解離定数はナノモル範囲であった（０．９±０．１ｎＭ）。
ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡで得られたセンサーグラム［図１６］はラングミュアモデルには明確には適合しなかった（Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＞２０％）。「不均一リガンド」モデルはこの適合性の質を有意に改善した（Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＜５％）。このモデルによれば、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂ Ｆｃドメインは２成分の混合物とみなすことができる。総量の７９％に当たる主成分は３００〜３５０ｎＭの間の解離定数を示し、副成分（２１％）は２７〜３２ｎＭの間の解離定数を示した。文献によれば、ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡで見られる不均一性は、おそらくＭａｂ Ｆｃドメイン上のグリコシル化の不均一性に関連している。
ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡ濃度（Ｃ）に対する結合相終了時の応答の平均値（ＲＵ、Ｒｅｑに近似）を表すプロットは下記の数学モデル：
Ｒｅｑ＝（ＫＡ．Ｃ．Ｒｍａｘ）／ＫＡ．Ｃ．ｎ＋１）（ただしｎ＝１）に適合することができる［図１７］。１／ＫＡに相当する解離定数ＫＤは１７６ｎＭに等しい。
ｍ−ＦｃγＲＩで得られたセンサーグラム［図１８］はラングミュアモデルに適合することができ（５％＜Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＜１０％）、「不均一リガンド」モデルはこの適合性の質を有意に改善した（Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＜１％）。このモデルによれば、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂ Ｆｃドメインは２成分の混合物とみなすことができる。総量の８２％に当たる主成分は７５〜８０ｎＭの間の解離定数を示し、副成分（１８％）は９０ｎＭ前後の解離定数を示した。解離定数が接近していたとしても、反応速度は有意に異なった（結合速度は主成分では５．７倍高く、その解離速度は４．８倍速かった）。
ｍ−ＦｃγＲＩ濃度（Ｃ）に対する結合相終了時の応答の平均値（ＲＵ、Ｒｅｑに近似）を表すプロットは下記の数学モデル：
Ｒｅｑ＝（ＫＡ．Ｃ．Ｒｍａｘ）／（ＫＡ．Ｃ．ｎ＋１）（ただし、ｎ＝１）に適合することができる［図１９］。１／ＫＡに相当する解離定数ＫＤは９５ｎＭに等しい。
ｍ−ＦｃγＲＩＩＩで得られたセンサーグラム［図２０］はラングミュアモデルに完全には適合せず（５％＜Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＜２０％）、「不均一リガンド」モデルも適合性の質を改善することはなかった。ラングミュアモデルを用いれば、解離定数は１７および１８ｎＭ前後であった。
４つのＦｃγ受容体のランク付けを図２１に示す。この図は、Ｋｄプロットを複合体の半減期の関数として表している。文献によれば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体のＦｃ部分に対し、ｈ−ＦｃγＲＩは高い親和性で結合し、ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡは低い親和性で結合する。ｍ−ＦｃγＲＩＩＩは、ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡに対するｈｚ−５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂの主成分の親和性とｈ−ＦｃγＲＩの場合の親和性の間の中間的な親和性で結合する。ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂの両成分はｍ−ＦｃγＲＩと、ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡに対するｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２の両成分の親和性間の中間的な親和性で相互作用する。
これらの試験は、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２ Ｍａｂ Ｆｃドメインが４つの供試ＦｃγＲと有意に相互作用することを明らかに示した。
実施例１１：リアルタイム表面プラズモン共鳴によるｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂとｈ−ＦｃγＲＩ、ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡ、ｍ−ＦｃγＲＩおよびｍ−ＦｃγＲＩＩＩの間の相互作用試験
これらの試験はＢｉａｃｏｒｅ Ｘ装置を用いて行った。本試験に用いた可溶型の４つのＦｃγ受容体はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
１−組換えヒトＦｃγＲＩ［ＣＤ６４］は、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有するＧｌｎ１６−Ｐｒｏ２８８フラグメントに相当する［カタログ番号：１２５７−ＦＣ］。本試験に用いた５０ｋＤａの分子量（供給者により明記）は、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定義される分子量の平均値に相当する。
２−組換えヒトＦｃγＲＩＩＩＡ変異体Ｖ［ＣＤ１６ａ］は、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有するＧｌｎ１７−Ｇｌｎ２０８フラグメントに相当する［カタログ番号：４３２５−ＦＣ］。本試験に用いた４５ｋＤａの分子量（供給者により明記）は、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定義される分子量の平均値に相当する。
３−組換えマウスＦｃγＲＩ［ＣＤ６４］は、Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有するＧｌｎ２５−Ｐｒｏ２９７フラグメントに相当する［カタログ番号：２０７４−ＦＣ］。本試験に用いた５５ｋＤａの分子量（供給者により明記）は、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定義される分子量の平均値に相当する。
４−組換えマウスＦｃγＲＩＩＩ［ＣＤ１６］は、Ｃ末端１０−Ｈｉｓタグを有するＡｌａ３１−Ｔｈｒ２１５フラグメント［カタログ番号：１９６０−ＦＣ］に相当する。本試験に用いた３７．５ｋＤａの分子量（供給者により明記）は、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定義される分子量の平均値に相当する。
他の試薬は、Ｂｉａｃｏｒｅ(GE Healthcare)により供給された。
アミンカップリングキット化学を用い、ＣＭ４センサーチップの第２フローセル（ＦＣ２）に２０１７ＲＵのｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂを固定した。ＮＨＳとＥＤＣの混合物により活性化され、エタノールアミンにより不活性される第１フローセル（ＦＣ１）を、分析物（Ｆｃγ受容体）とセンサーチップマトリックスの間の非特異的相互作用を確認して差し引くための参照表面として用いた。
動態試験は、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。ランニングバッファーとしてまたは分析物溶液の調製目的のいずれかにはＨＢＳ−ＥＰバッファーを用いた。これらの分析物溶液を９０秒注入し（結合相）、９０秒待機した（解離相）。分析物としてのランニングバッファーの注入を二重参照として用いた。センサーグラムは総て、二重参照センサーグラムにより修正された。
分析物の各注入の後に、２０ｍＭ ＮａＯＨ、７５ｍＭ ＮａＣｌ溶液を注入することによりセンサーチップを再生した。
「ラングミュア」および「不均一リガンド」モデルの２つの数学モデルを用いてこれらのセンサーグラムを解析した。
ｈ−ＦｃγＲＩで得られたセンサーグラム［図２２］はラングミュアモデルに完全には適合せず（Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＞１０％）、「不均一リガンド」モデルもこの適合性の質を改善しなかった。ラングミュアモデルを用いた場合、解離定数はナノモル範囲に近かった（１．２±０．１ｎＭ）。
ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡで得られたセンサーグラム［図２３］はラングミュアモデルには明確には適合しなかった（Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＞２０％）。「不均一リガンド」モデルはこの適合性の質を有意に改善した（Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＜５％）。このモデルによれば、ｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂ Ｆｃドメインは２成分の混合物とみなすことができる。総量の８１％に当たる主成分は３８０〜４５０ｎＭの間の解離定数を示し、副成分（１９％）は３２〜３７ｎＭの間の解離定数を示した。文献によれば、ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡで見られる不均一性は、おそらくＭａｂ Ｆｃドメイン上のグリコシル化の不均一性に関連している。結合相の終了時は、定常状態への到達に近い。ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡ濃度（Ｃ）に対する結合相終了時の応答の平均値（ＲＵ、Ｒｅｑに近似）を表すプロットは下記の数学モデル：
Ｒｅｑ＝（ＫＡ．Ｃ．Ｒｍａｘ）／ＫＡ．Ｃ．ｎ＋１）（ただしｎ＝１）に適合することができる［図２４］。１／ＫＡに相当する解離定数ＫＤは１６０ｎＭに等しい。
ｍ−ＦｃγＲＩで得られたセンサーグラム［図２５］はラングミュアモデルに適合することができ（５％＜Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＜１０％）、「不均一リガンド」モデルはこの適合性の質を有意に改善した（Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＜２％）。このモデルによれば、ｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂ Ｆｃドメインは２成分の混合物とみなすことができる。総量の８１％に当たる主成分は３８０および４５０ｎＭ前後の解離定数を示し、副成分（１９％）は３２〜３７ｎＭの間の解離定数を示した。
結合相の終了時は、定常状態への到達に近い。ｍ−ＦｃγＲＩ濃度（Ｃ）に対する結合相終了時の応答の平均値（ＲＵ、Ｒｅｑに近似）を表すプロットは下記の数学モデル：
Ｒｅｑ＝（ＫＡ．Ｃ．Ｒｍａｘ）／ＫＡ．Ｃ．ｎ＋１）（ただしｎ＝１）に適合することができる［図２６］。１／ＫＡに相当する解離定数ＫＤは１０７ｎＭに等しい。
ｍ−ＦｃγＲＩＩＩで得られたセンサーグラム［図２７］はラングミュアモデルには完全には適合せず（１０％＜Ｃｈｉ２／Ｒｍａｘ＜２０％）、「不均一リガンド」モデルもこの適合性の質を改善しなかった。ラングミュアモデルを用いた場合、解離定数は２０ｎＭ前後であった。
４つのＦｃγ受容体のランク付けを図２８に示す。この図は、Ｋｄプロットを複合体の半減期の関数として表している。文献によれば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体のＦｃ部分に対し、ｈ−ＦｃγＲＩは高い親和性で結合し、ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡは低い親和性で結合する。ｍ−ＦｃγＲＩＩＩは、ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡに対するｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂの主成分の親和性とｈ−ＦｃγＲＩの場合の親和性の間の中間的な親和性で結合する。ｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂの両成分は、ｈ−ＦｃγＲＩＩＩＡの場合と同等にｍ−ＦｃγＲＩと相互作用する。
実施例１２：ＣＸＣＲ４発現細胞に対するｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７）Ｍａｂの抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）効果
ＡＤＣＣは、上記（実施例５参照）の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイを用いて測定した。
簡単に述べると、フィコール密度勾配を用い、健康なボランティアドナーの血液からヒトＰＢＭＣを単離した。このＰＢＭＣ画分から、Human NK Cell Enrichment Kit製造者プロトコールに従ってＮＫ細胞を精製した。エフェクター細胞（Ｅ）として用いるＮＫ細胞をＲＡＭＯＳ（リンパ腫）、ＤＡＵＤＩ（リンパ腫）またはＨｅＬａ（子宮頸癌）腫瘍標的細胞（Ｔ）とＥ：Ｔ比５０：１で混合し、前記標的細胞は、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７）抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに室温で１０分間事前にプレインキュベートした。３７℃で４時間のインキュベーションの後、製造者の説明書に従ってCytotoxicity Detection KitPLUSを用いてＬＤＨの放出量を測定することにより特異的細胞溶解を求めた。細胞傷害パーセントは次のように算出した：溶解率％＝［実験的放出−エフェクターおよび標的の自然放出］／［標的の最大放出−標的の自然放出］×１００。
図２９は、ＣＸＣＲ４発現細胞：ＲＡＭＯＳ、ＤＡＵＤＩおよびＨｅＬａ細胞に対するＡＤＣＣを示す。細胞をｈＩｇＧ１アイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした際には効果は見られなかった。これに対して、ｈｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂ（１０μｇ／ｍｌ）は、ＲＡＭＯＳ、ＤＡＵＤＩおよびＨｅＬａ細胞に対して有意なＡＤＣＣ（４０％前後）を誘導することができた。
実施例１３：ＣＸＣＲ４発現細胞に対するｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７）Ｍａｂの補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）効果
ＣＤＣアッセイは、実施例７に記載のようにCellTiter Glo試薬(Promega, Madison, WI, USA)を用いるＡＴＰ測定に基づいた。
簡単に述べると、１００００個の標的細胞を、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７）Ｍａｂの存在下、９６ウェル平底プレートに播種した。室温で１０分間のインキュベーションの後、健康なドナーからのヒト血清をプールしたものを終濃度１０％で添加した。３７℃で１時間の後、ＡＴＰの量を測定することにより生存率を決定した。細胞傷害パーセントは次のように算出した：細胞傷害率％＝１００−［［実験細胞／標的細胞（抗体不含）］×１００］。
図３０は、ＣＸＣＲ４発現細胞株：ＲＡＭＯＳおよびＤＡＵＤＩ細胞に対するＣＤＣを示す。細胞をｈＩｇＧ１アイソタイプ対照（１０μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした際には効果は見られなかった。これに対して、ｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１Ｄ７６ＮＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７−１）Ｍａｂ（１０μｇ／ｍＬ）は有意なＣＤＣ、すわなち、ＲＡＭＯＳ細胞では５８％前後、ＤＡＵＤＩ細胞では３６％前後を誘導することができた。

Claims (22)

  1. エフェクター細胞または補体成分の存在下で少なくとも１つのエフェクター機能の誘導によりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることによる癌治療の方法で使用するための、ＣＸＣＲ４と結合するヒト化抗体またはそのＣＨ２含有結合フラグメントであって、配列番号７〜１０の配列から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号１１〜１７の配列から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなる、ヒト化抗体またはそのＣＨ２含有結合フラグメント。
  2. 前記エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）からなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
  3. 前記エフェクター機能が補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）からなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
  4. 前記エフェクター機能が抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）と補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）からなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
  5. 前記ヒト化抗体が、
    配列番号８の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１１〜１７の配列から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体；
    配列番号７〜１０の配列から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号１３の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体；
    配列番号８の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号１３の配列の軽鎖可変ドメインを含んでなるヒト化抗体；
    配列番号１８〜２１の配列から選択される重鎖および／または配列番号２２〜２８の配列から選択される軽鎖を含んでなるヒト化抗体；
    配列番号１９の配列の重鎖および／または配列番号２２〜２８の配列から選択される軽鎖を含んでなるヒト化抗体；
    配列番号１８〜２１の配列から選択される重鎖および／または配列番号２４の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体；ならびに
    配列番号１９の配列の重鎖および／または配列番号２４の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体
    からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  6. 前記抗体がＩｇＧ１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  7. 前記ＣＸＣＲ４発現癌細胞が悪性血液細胞からなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  8. 前記ＣＸＣＲ４悪性血液細胞が、リンパ腫細胞、白血病細胞または多発性骨髄腫細胞を含んでなる群から選択される、請求項７に記載のヒト化抗体。
  9. 前記エフェクター細胞が、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、好中球または好酸球を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  10. ４時間のインキュベーション期間後にＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して少なくとも４０％のＡＤＣＣレベルを誘導する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  11. ＮＫ細胞に対して有意なＡＤＣＣが誘導されない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  12. 前記補体成分が少なくともＣ１ｑを含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  13. １時間のインキュベーション期間後にＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％のＣＤＣレベルを誘導する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  14. １時間のインキュベーション期間後に、ＮＩＨ３Ｔ３ ＣＸＣＲ４細胞に対して少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％のＣＤＣレベルを誘導する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  15. ヒト化抗体、またはそのＣＨ２含有結合フラグメントが少なくとも１つのヒトＦｃγＲと結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
  16. 前記少なくとも１つのＦｃγＲがヒトＦｃγＲＩである、請求項１５に記載のヒト化抗体。
  17. ラングミュアモデルに従い、１〜１０ｎＭの間の解離定数（ＫＤ）で前記ＦｃγＲＩと結合する、請求項１６に記載のヒト化抗体。
  18. 前記少なくとも１つのＦｃγＲがヒトＦｃγＲＩＩＩＡである、請求項１７に記載のヒト化抗体。
  19. 不均一リガンドモデルに従い、２００〜１０００ｎＭの間の解離定数（ＫＤ）で前記ＦｃγＲＩＩＩＡと結合する、請求項１８に記載のヒト化抗体。
  20. ＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることによる癌治療の方法で使用するための、ＣＸＣＲ４と結合するヒト化抗体またはそのＣＨ２含有結合フラグメントであって、該ヒトまたはヒト化抗体が配列番号７〜１０の配列から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号１１〜１７の配列から選択される軽鎖可変ドメインを含んでなり、エフェクター細胞または補体成分の存在下で、該ヒトまたはヒト化抗体の少なくとも１つのエフェクター機能が誘導される、ヒト化抗体またはそのＣＨ２含有結合フラグメント。
  21. 前記癌がリンパ腫からなる、請求項２０に記載のヒト化抗体。
  22. エフェクター細胞または補体成分の存在下で少なくとも１つのエフェクター機能の誘導によりＣＸＣＲ４発現癌細胞を死滅させることに使用するためのＣＸＣＲ４と結合するヒト化抗体またはそのＣＨ２含有結合フラグメントをスクリーニングする方法であって、
    -４時間のインキュベーション期間後にＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して少なくとも４０％のＡＤＣＣレベルを誘導する抗体を選択すること；
    -１時間のインキュベーション期間後にＲＡＭＯＳリンパ腫細胞に対して少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％のＣＤＣレベルを誘導する抗体を選択すること；
    -１時間のインキュベーション期間後にＮＩＨ３Ｔ３ ＣＸＣＲ４細胞に対して少なくとも３０％、優先的には少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７０％のＣＤＣレベルを誘導する抗体を選択すること；
    -ラングミュアモデルに従い、１〜１０ｎＭの間の解離定数（ＫＤ）でＦｃγＲＩと結合する抗体を選択すること；
    -不均一リガンドモデルに従い、２００〜１０００ｎＭの間の解離定数（ＫＤ）でＦｃγＲＩＩＩＡと結合する抗体を選択すること
    から選択される、少なくとも１つの選択工程を含んでなる、方法。
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