KR20140041698A

KR20140041698A - 효과기 기능들을 가진 항-cxcr4 항체 및 암의 치료를 위한 그의 용도

Info

Publication number: KR20140041698A
Application number: KR1020147000453A
Authority: KR
Inventors: 크리스땅 끌렝귀에르-앙무르
Original assignee: 피에르 파브르 메디카먼트
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2014-04-04
Also published as: NZ618655A; WO2012175576A1; US20140120555A1; EP2721069A1; MA35173B1; MX2013015061A; RU2013158624A; CA2838484A1; AU2012274104A1; CN103649120A; JP6223966B2; BR112013032456A2; AR086984A1; AU2012274104B2; JP2014525899A

Abstract

본 출원은 효과기 기능(들)을 유도할 수 있는 항-CXCR4 단일클론 항체를 투여하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

효과기 기능들을 가진 항-CXCR4 항체 및 암의 치료를 위한 그의 용도 {Anti-CXCR4 antibody with effector functions and its use for treatment of cancer}

케모카인 (chemokines)은 케모카인 구배 (chemokine gradient)라고 알려져 있는 리간드의 화학적 구배를 따라 특히 면역 반응들 동안 백혈구의 이동을 조절하는 작은 분비 단백질이다 (Zlotnick A. et al., 2000). 그들은 NH₂-말단 시스테인 잔기들의 위치를 기초하여 두 가지의 주요 서브패밀리, CC 및 CXC로 나누어지고, G 단백질 연결된 수용체들과 결합하며, 이들 두 가지 주요 서브패밀리들은 CCR 및 CXCR이라고 명명된다. 지금까지 50가지 이상의 인간 케모카인들 및 18가지의 케모카인 수용체들이 발견되어 왔다.

많은 암들은 종양의 면역세포 침윤뿐만 아니라 종양세포 성장, 생존, 이동 (migration) 및 혈관형성 (angiogenesis)에 영향을 주는 복잡한 케모카인 연결망 (network)을 가진다. 면역 세포들, 내피 세포들 및 종양 세포들은 스스로 케모카인 수용체들을 발현하고 케모카인 구배들에 반응할 수 있다. 인간 암 생검 시료들과 마우스 암 모델들의 연구들은 암 세포의 케모카인-수용체 발현이 전이 능력 (metastatic capacity)의 증가와 연관되는 점을 보여준다. 서로 다른 암 유형들로부터 나온 악성 (malignant) 세포들은 케모카인-수용체 (chemokine-receptor) 발현의 서로 다른 프로파일들을 가지지만, 케모카인 수용체 4 (CXCR4)는 가장 보편적으로 관찰되고 있다. 표피 (epithelial), 중간엽 (mesenchymal) 및 조혈 (haematopoietic) 기원의 인간 암들의 적어도 23가지의 서로 다른 유형들로부터 나온 세포들이 CXCR4 수용체를 발현한다 (Balkwill F. et al ., 2004).

케모카인 수용체 4 [퓨신 (fusin), CD184, 레스터 (LESTR) 또는 험스터 (HUMSTR)라고도 알려져 있음]는 352개 또는 360개 아미노산들을 포함하는 두 가지 이소형들로서 존재한다. Asn 11번 잔기는 당화되고 Tyr 21번 잔기는 설페이트 그룹의 부가에 의해 변형되고 Cys 109번 및 186번은 수용체의 세포외 (extracellular) 부분 상에 디설파이드 연결 (disulfide bridge)로 결합된다 (Juarez J. et al., 2004).

본 수용체는 서로 다른 종류의 정상 조직들, 고유의 (naive) 비-메모리 T-세포들, 조절 T-세포들, B-세포들, 호중성구들, 내피 세포들, 일차 단핵구들, 가지세포들 (dendritic cell), 자연 킬러 (NK) 세포들, CD34+ 조혈 줄기 세포들에 의해 낮은 수준으로는 심장, 결장, 간, 신장 및 뇌에서 발현된다. CXCR4는 백혈구 운반 (trafficking), B 세포 백혈구형성 (lymphopoiesis) 및 골수형성 (myelopoiesis)에서 핵심 역할을 담당한다.

CXCR4 수용체는, 이에 제한되는 것은 아니지만 림프종, 백혈병, 다발성 골수종, 결장 (Ottaiano A et al., 2004), 유방 (Kato M. et al., 2003), 전립선 (Sun Y. X. et al., 2003), 폐 [소세포- 및 비-소세포 암종 (Phillips R. J. et al ., 2003)], 난소 (Scotton C. J. et al., 2002), 췌장들 (Koshiba T. et al., 2000), 신장들, 뇌 (Barbero S. et al., 2002), 교모세포종 (glioblastoma) 및 림프종들 (lymphomas)을 포함하는 매우 많은 암들에서 과다-발현 (over-express)된다.

지금까지 기술된 CXCR4 수용체의 독특한 리간드는 간질세포-유래 인자-1 (Stromal-cell-derived factor-1, SDF-1) 또는 CXCL12 이다. SDF-1은 림프절들, 골수, 간, 폐들에서 다량 분비되고, 보다 소량으로는 신장들, 뇌 및 피부에 의해 분비된다. CXCR4는 또한 인간 헤르페스 바이러스 제 Ⅲ형에 의해 인코딩되는 길항적 케모카인 (antagonistic chemokine)인 바이러스성 대식구 염증 단백질 Ⅱ (vMIP-Ⅱ)에 의해 인식된다.

CXCR4/SDF-1 주축 (axis)은 암에서 핵심 역할을 담당하고, 전이들을 유도하는 이동, 침습에 직접적으로 연루되어 있다. 따라서, 암 세포들은 CXCR4 수용체를 발현하고, 그들은 이동하여 전신적 순환에 진입한다. 다음으로 암세포들은 높은 수준들의 SDF-1를 생산하는 기관들의 혈관 기질들에 정지하게 되고 여기에서 그들은 증식하고 혈관형성을 유도하며 전이성 종양들을 형성한다 (Murphy P. M., 2001). 본 주축은 세포외-신호-조절된 키나제 (ERK) 경로의 활성화를 통한 세포 증식 (Barbero S. et al ., 2001) 및 혈관형성 (Romagnani P., 2004)에도 역시 관여한다. 이에 따라, CXCR4 수용체 및 그의 리간드 SDF-1은 다음 순서로 CXCR4/SDF-1의 발현을 증가시키는 VEGF-A 발현을 자극하여 혈관형성을 분명하게 촉진한다 (Bachelder R. E. et al ., 2002). 또한 종양 연관된 대식구들 (TAM)가 종양의 저산소 (hypoxic) 영역들에 축적되었고, 자극되어 종양세포들과 협력하고, 혈관형성을 촉진시키는 것도 알려져 있다. 저산소증 (hypoxia)이 TAM을 포함한 다양한 세포 유형들에서 CXCR4의 발현을 선택적으로 상승-조절하는 것이 관찰되었다 (Mantovani A. et al., 2004). 최근에는 CXCR4/SDF-1 주축이 CXCR4+ 조혈 줄기/전구체 세포들 (HSC)의 운반/회귀를 조절하고 신생혈관증식에서 역할을 담당할 수 있는 것으로 밝혀져 왔다. HSC 이외에 기능적 CXCR4도 역시 다른 조직들로부터 나온 줄기 세포들 (조직-고정 줄기세포 = TCSCs) 상에서 발현되어 SDF-1이 기관/조직 재생에 필요한 CXCR4+ TCSCs를 화학유도 하는 데 결정적인 역할을 담당할 수 있지만, 이들 TCSC도 역시 암 발생의 세포성 기원이 될 수 있는 점을 (암 줄기세포 이론) 증거는 가리키고 있다. 암의 줄기세포 기원은 인간 백혈병에 대해 최근에는 뇌 및 유방과 같은 여러 고형 종양증에 대해 밝혀졌다. 백혈병들, 뇌 종양들, 소세포 폐암, 유방암, 간모세포종 (hepatoblastoma), 난소 및 자궁경부 암들과 같은 정상적 CXCR4+ 조직/기관-특이 줄기 세포들로부터 유래할 수 있는 CXCR4+ 종양들의 여러 예들이 있다 (Kucia M. et al ., 2005).

CXCR4 수용체로의 간섭에 의한 암 전이들을 표적하는 것 (targeting cancer metastasis)이 CXCR4 수용체에게로 유도되는 (directed against) 단일클론 항체를 사용하여 생체내 (in vivo)에서 밝혀졌다 (Muller A. et al ., 2001). 간략하게, CXCR4 수용체에게로 유도되는 단일클론 항체 (Mab 173 R&D 시스템사)는 SCID 마우스의 동소적 (orthotopic) 유방암 모델 (MDA-MB231)에서 림프절 전이들의 수를 유의하게 감소시켰던 것으로 확인되었다. 또 다른 연구도 역시 SDF-1에 대한 다중클론 항체들을 사용하여 동소적 폐 암종 모델 (A549)의 전이들에서 SDF-1/CXCR4 주축의 결정적 역할을 확인하였지만, 본 연구에서 종양 성장 또는 혈관형성에 미치는 효과는 전혀 없었다. 여러 다른 연구들도 역시 CXCR4의 siRNA 이중복합체들 (duplex)를 사용한 생체내 전이 (Liang Z. et al ., 2005), 생물안정한 (biostable) CXCR4 펩타이드 길항제들 (Tamamura H. et al ., 2003), 또는 AMD 3100 (Rubin J. B. et al ., 2003; De Falco V. et al ., 2007) 또는 Mab (국제특허출원 제 WO2004/059285 A2호)와 같은 CXCR4의 소분자 길항체를 사용한 생체내 종양 성장 둘 중 하나의 저해를 기술하였다. 따라서, CXCR4는 암을 위한 입증된 치료적 표적이 된다.

CXCR4와 상호작용을 유도하여, CXCR4 활성화를 저해할 수 있는 마우스 단일클론 항체들도 역시 기술되어 왔다. 이러한 저해는: i) 리간드 SDF-1의 세포막들에서 수용체 CXCR4와의 특이적 결합, ii) 리간드 GTPγS의 세포막들에서 수용체 CXCR4와의 특이적 결합, iii) cAMP 생산의 CXCR4-매개성 조정, 및 iv) 세포내 칼슘 저장들 조정의 CXCR4 수용체-매개성 가동화 (국제특허출원 제 WO 2010/037831호 참조)로 간섭하여 일어날 수 있다.

그러나, 이들 항체들 또는 siRNA는 CXCR4-발현 암성 세포들의 살상을 전혀 유도하지 않는다. 따라서 암의 재발의 위험성이 여전히 존재하고, CXCR4-표적화 치료는 종결되어야 한다. 이에 따라 CXCR4-발현 세포들을 직접적으로 표적하고, 상기 CXCR4-발현 세포들을 살상할 수 있는 제제들에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 CXCR4를 표적하는 항체와 관련하여 확인된 적이 전혀 없었던 새로운 성질에 관한 것이다.

이에 따라, 본 발명자들은 CXCR4에게로 유도된 인간 또는 인간화 항체들이 CXCR4-발현 세포에 대한 효과기 기능을 유도할 수 있어, 상기 세포들에 대한 세포독성 효과들을 가져오는 점을 확인하였다.

보다 상세하게, 본 발명은 CXCR4-발현 암세포에 대한 효과기 기능(들)의 유도 방법에 관한 것이다.

선행기술에서 기술된 바와 같이, 전이성 CXCR4-발현 종양들의 치료는 이동, 칩습, 증식 또는 혈관형성의 저해가 관여하였지만, CXCR4-발현 세포들의 직접적 살상은 전혀 없었다. 매우 대조적으로, 본 발명은 CXCR4-발현 표적 세포의 사망을 가져오는 세포독성 효과들의 유도에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 CXCR4-발현 암세포에 대한 하나 이상의 효과기 기능(들)을 유도할 수 있어, 상기 세포의 살상을 달성하는 인간 또는 인간화 단일클론 항체를 제공한다. 따라서 본 발명은 CXCR4-발현 암세포에 대한 하나 이상의 효과기 기능(들)을 유도를 통하여 인간 또는 인간화 단일클론 항체에 의한 암의 치료 방법을 제공한다.

첫 번째 관점에서, 본 발명은 CXCR4와 결합하는 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편로 CXCR4-발현 암세포를 살상하는 방법으로서; 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 1, 2 및 3의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 상기 방법은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시, 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능을 유도하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 CXCR4와 결합하는 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편의 용도로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 1, 2 및 3의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시, 적어도 하나의 효과기 기능의 유도에 의해 CXCR4 발현 암세포를 살상하는 조성물을 제조하기 위한, 용도에 관한 것이다.

보다 또 다른 관점에서, 본 발명은 또한 CXCR4와 결합하는 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편으로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 1, 2 및 3의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시, 적어도 하나의 효과기 기능의 유도에 의해 CXCR4 발현 암세포를 살상하는 데 사용하기 위한, 용도에 관한 것이다.

보다 상세하게, 본 발명은 CXCR4와 결합하는 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편으로 CXCR4-발현 암세포를 살상하여 암을 치료하는 방법으로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 1, 2 및 3의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 상기 방법은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시, 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능을 유도하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 CXCR4와 결합하는 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편의 용도로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 1, 2 및 3의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시, 적어도 하나의 효과기 기능의 유도에 의해 CXCR4 발현 암세포를 살상하여 암을 치료하는 조성물을 제조하기 위한, 용도에 관한 것이다.

보다 또 다른 관점에서, 본 발명은 또한 CXCR4와 결합하는 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편으로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 1, 2 및 3의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시, 적어도 하나의 효과기 기능의 유도에 의해 CXCR4 발현 암세포를 살상하여 암을 치료하는 데 사용하기 위한, 용도에 관한 것이다.

용어 "항체"는 본 명세서에서 가장 광범위한 의미로 사용되고 상세하게는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE와 같은 임의의 유형의 단일클론 항체들 (전장의 단일클론 항체들을 포함함), 다중클론 항체들, 다중특이적 항체들, 키메라 항체들, 및 항체 단편들을 포괄한다. 특이적 항원과 반응하는 항체는 파지 또는 유사한 벡터들에서 재조합 항체들의 라이브러리들의 선택과 같은 재조합 방법들에 의해, 또는 항원 또는 항원-인코딩 핵산으로 동물을 면역화하여 생성될 수 있다.

"다중클론 항체 (polyclonal antibody)"는 하나 이상의 다른, 비-일치하는 항체들 중에서 또는 그들의 존재 시 생산되었던 항체이다. 일반적으로, 다중클론 항체들은 비-일치하는 항체들을 생산하는 여러 다른 B-림프구들의 존재 시 B-림프구로부터 생산된다. 보통, 다중클론 항체들은 면역화된 동물로부터 직접 획득된다.

"단일클론 항체 (monoclonal antibody)"는 본 명세서에서 사용되는 바 실질적으로 균질한 (homogeneous) 항체들의 집단으로부터 획득된 항체이고, 예로 본 집단을 형성하는 항체들은 최소의 양들로 존재할 수 있는 자연적으로 생기는 가능한 돌연변이들을 제외하고는 필수적으로 일치한다. 다른 말로 하면, 단일클론 항체는 단일한 세포 클론 (예를 들면, 하이브리도마, 균질한 항체를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 진핵 숙주세포, 균질한 항체를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 원핵 숙주세포 등)의 성장으로부터 나오는 균질한 항체로 구성된다. 이들 항체들은 단일한 에피토프에게로 유도되고 따라서 매우 특이적이다.

"에피토프 (epitope)"는 항체가 결합하는 항원 위의 부위이다. 이것은 연속적 잔기들에 의해 또는 항원성 단백질의 접힘에 의해 매우 근접하게 되는 비-연속적 잔기들에 의해 형성될 수 있다. 연속적 아미노산들에 의해 형성되는 에피토프들은 전형적으로 변성화 용매들에 대한 노출 시 보유되는 한편, 비-연속적 아미노산들에 의해 형성되는 에피토프들은 전형적으로 상기 노출 하에서 소실된다.

바람직하게, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다.

전형적인 항체는 디설파이드 결합들에 의해 연결된 두 개의 일치하는 중쇄들 및 두 개의 일치하는 경쇄들을 포함한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 부위 및 가변 부위를 포함한다. 각각의 가변 부위는 주로 항원의 에피토프와의 결합을 부여하는 "상보성-결정 부위들" ("CDR들") 또는 "과다가변 부위들"이라고 불리는 세 가지의 분절들을 포함한다. 그들은 보통 N-말단으로부터 연속적으로 번호가 매겨진 CDR1, CDR2, 및 CDR3라고 말한다 (Lefranc M. P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M. P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommie C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). 가변 부위들의 더욱 높게 보존된 부분들은 "구조틀 부위들 (Framework region)"라고 불린다.

본 명세서에서 사용되는 바, "VH" 또는 "VH"은 Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편의 중쇄를 포함하는, 항체의 면역글로불린 중쇄의 가변 부위를 말한다. "VL" 또는 "VL"의 참조는 Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편의 경쇄를 포함하는, 항체의 면역글로불린 경쇄의 가변 부위를 말한다.

항체 불변 도메인들은 항원과 항체를 결합하는 데 직접 관여하지 않지만, 다양한 효과기 기능들을 나타낸다. 서로 다른 클래스들의 면역글로불린들에 해당하는 중쇄 불변 부위들은 α, δ, ε, ν, 및 μ라고 각각 불린다. 그들의 중쇄들의 불변 부위의 아미노산 서열에 의존하여, 항체들 또는 면역글로불린들은 서로 다른 클래스들, 예로 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM로 할당될 수 있고, 이들 중 여럿은 서브클래스들 (이소형들), 예로 gGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4; IgAl 및 IgA2로 더 세분될 수 있다 (W. E. Paul, ed., 1993, Fundamental Immunology, Raven Press, New York, New York 참조).

항체들의 파파인 소화는 각각 단일한 항원 결합 부위, 및 남은 "Fc" 단편을 가진 Fab 단편들이라고 불리는 두 개의 일치하는 항원 결합 단편들을 생산한다. 면역글루불린 중쇄의 Fc 도메인의 경계들이 변화할 수 있더라도, 인간 IgG 중쇄 Fc 도메인은 보통 EU 인덱스에 따라, 힌지 부위의 Cys 226번 또는 Pro 230번 위치에 있는 아미노산 잔기로부터 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 그의 카복시-말단까지 연장하도록 정의된다 (Edelman et al., The covalent structure of an entire gammaG immunoglobulin molecule, PNAS 1969; 63: 78-85). 명확하게 설명하자면, EU 인덱스에 따라 Cys 226번/Pro 230번 잔기들은 카밧 번호매김 시스템에서 Cys 239번/Pro 243번 잔기들에 해당하고 IMGT에 따라 힌지 잔기들 Cys 11번/Pro 15번에 해당하는 점이 본 명세서에서 진술되어야 한다.

용어 "힌지 부위 (hinge region)"는 일반적으로 인간 IgG1의 Glu 216번으로부터 Pro 230번까지 연장하는 것으로 정의된다 (Burton, Mol Immunol, 22: 161-206, 1985). 다른 IgG 이소형들의 힌지 부위들은 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기들을 동일한 위치들에서 중쇄-간 S-S 결합들을 형성하도록 배치하여 IgG1 서열과 함께 정렬될 수 있다. 인간 IgG Fc 부분 ("Cγ2" 도메인이라고 역시 명명됨)의 "CH2 도메인"은 보통 약 아미노산 231번으로부터 약 아미노산 340번까지 연장된다. CH2 도메인은 이것이 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 형성하지 않는 점에서 독특하다. 오히려, 두 개의 N-연결 분지된 탄수화물 사슬들이 고유의 IgG 분자의 두 개 CH2 도메인들 사이에 끼여있다. 탄수화물은 도메인-도메인 쌍 형성을 위한 치환기를 제공할 수 있고 CH2 도메인을 안정화하도록 돕는다 (Burton, MoI Immunol, 22: 161-206, 1985). "CH3 도메인"은 Fc 부분에서 C-말단 내지 CH2 도메인 잔기들의 연장을 포함한다 (예로, IgG의 약 아미노산 잔기 341번으로부터 약 아미노산 잔기 447번까지).

단일클론 항체들을 포함하는 IgG 면역글로불린들은 각각의 중쇄의 불변 부위에서 N-당화된 것으로 확인되어 왔다. 그들은 그의 두 개 중쇄들의 각각 위의 CH2 도메인에 있는 Asn 297번에서 단일한 N-연결 글리칸을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "N-글리칸"은 N-연결된 올리고당류 (oligosaccharide), 예로 아스파라진-N-아세틸글루코사민 결합에 의해 폴리펩타이드의 아스파라진 잔기와 부착된 것을 말한다. N-글리칸들은 공통적인 오탄당류 (pentasaccharide) 코아를 가진다 ("만 (Man)"은 만노스를 말하고; "Glc"는 포도당을 말하고; "NAc"는 N-아세틸을 말하고; GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 말한다).

N-글리칸들은 Man3 코아 구조와 부착된 말단 당들을 (예로, GluNAc, 갈락토스, 퓨코스, 및 시알린산) 포함하는 분지들 (안테나들)의 수 및 특성에 관하여 서로 다르다. N-글리칸들은 그들의 분지된 구성성분들에 따라 분류된다 (예로, 높은 만노스, 복합체 또는 혼성체). "복합, 이중-안테나성" 유형의 N-글리칸은 전형적으로 1,3 만노스 분지와 부착된 적어도 하나의 GluNAc 및 트리만노스 코아의 1,6 만노스 분지와 부착된 적어도 하나의 GluNAc를 가진다. 복합 이중-안테나성 N-글리칸들은 GluNAc 및 코아 퓨코스 ("Fuc")을 "이분 (bisecting)"하는 것을 포함하는 사슬간 치환들도 역시 가질 수 있다. "이분 GluNAc"는 성숙한 코아 탄수화물 구조의 β-1,4-만노스와 부착된 GluNAc 잔기이다.

복합 이중-안테나성 N-글리칸들은 선택적으로 시알린산으로 변형되는 갈락토스 ("Gal") 잔기들도 역시 가질 수 있다. 올리고당류 사슬에 시알린산 부가는 시아릴전이효소에 의해 촉매화되지만, 갈락토실전이효소에 의한 말단 N-아세틸글루코사민들과 하나 이상의 갈락토스 잔기들의 사전의 부착을 요구한다. 본 발명에 따른 "시알린산들"은 5-N-아세틸뉴라미닌산 (NeuNAc) 및 5-글리코릴뉴라미닌산 (NeuNGc)을 포괄한다.

올리고당류는 제로 (G0), 하나 (G1) 또는 둘 (G2) 갈락토스 잔기들, 뿐만 아니라 첫 번째 GlcNac과 부착되는지와 상관없이 하나의 퓨코스를 포함할 수 있다. 이들 형태들은 각각 G0/G0F, G2/G2F, G1/G1F로서 나타낸다 (Theillaud, Expert Opin Biol Ther ., Suppl 1: S15-S27, 2005의 도 1 참조). 다른 말로 하면, 올리고당류 사슬의 양쪽 팔들이 갈락토스 잔기들을 포함할 때, 중쇄 몰 당 최대의 갈락토스 몰들은 2이고 코아가 퓨코실화될 때 구조는 G2F, 퓨코실화되지 않을 때 G2라고 명명된다. 하나의 팔이 말단 갈락토스를 가질 때, 이것이 퓨코실화 여부에 의존하여 구조는 G1F 또는 G1라고 명명되는 한편, 말단 갈락토스가 전혀 존재하지 않을 때, 구조는 각각 G0F 또는 G0라고 명명된다.

분비된 IgG 면역글로불린은 따라서 당 잔기들 퓨코스, 갈락토스, 시알린산, 및 이분 N-아세틸글루코사민의 다양한 부가를 나타내는 당 형태들의 불균질한 혼합물이다.

Fc 도메인들은 면역글로불린의 생물학적 기능들을 결정하는 데 중심적이고 이들 생물학적 기능들은 "효과기 기능들 (effector function)"이라고 말한다, 이들 Fc 도메인-매개된 활성들은 킬러 세포들, 자연 킬러 세포들, 및 활성화된 대식구들, 또는 다양한 보체 성분들과 같은 면역학적 효과기 세포들을 통해 매개된다. 이들 효과기 기능들은 상기 수용체와 또는 보체 성분(들)과 항체의 Fc 도메인의 결합을 통하여, 상기 효과기 세포들의 표면 상의 수용체들의 활성화가 관여한다.

용어 표현 "항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)", "항체-의존성 세포 세포독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity)" 또는 "ADCC"는 소정의 세포독성 효과기 세포들 상에 존재하는 Fc 수용체들 (FcR들) 위로 결합된 Ig가 이들 세포독성 효과기 세포들을 항원-보유 표적 세포와 특이적으로 결합하게 하고 연속적으로 표적 세포를 세포독소들로 살상하는 세포독성의 형태를 말한다. 표적 세포의 용해는 세포외에서 일어나고 직접적인 세포-대-세포 접촉을 요구하며, 보체가 관여하지 않는다.

세포 파괴는, 예를 들면 용해 또는 포식작용 (phagocytosis)에 의해 일어날 수 있다. "세포독성 효과기 세포들"은 하나 이상의 FcR들을 발현하고 효과기 기능들을 수행하는 백혈구들이다. 바람직하게, 세포들은 적어도 FcγRⅢ를 발현하고 ADCC 효과기 기능들을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구들의 예들로는 말초혈액 단핵 세포들 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포들, 단핵구들, 세포독성 T 세포들, 호중성구들을 포함하고; PBMC들 및 NK 세포들이 바람직하다. 효과기 세포들은 그의 고유의 출처로부터, 예로 혈액 또는 PBMC들로부터 분리될 수 있다. 용해 수단에 의해 세포 파괴를 할 수 있는 세포독성 효과기 세포들로는, 예를 들면 자연 킬러 (NK) 세포들, 호산구들, 대식구들 및 호중성구들을 포함한다.

다양한 인간 면역글로불린 클래스들 중에서 인간 IgGl 및 IgG3가 IgG2 및 IgG4보다 더욱 효과적으로 ADCC를 매개한다.

유리하게, 본 발명의 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 단편은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 유도하여 CXCR4-발현 암 세포들을 살상할 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법의 첫 번째 바람직한 구현예에서, 상기 효과기 기능은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)으로 구성된다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 효과기 기능이 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 효과기 기능이 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

비제한적인 예들로서, 시험관내 ADCC를 평가하거나 정량하는 다음의 방법들이 언급될 수 있다: 프로피디움 요오드 (PI) 또는 칼세인 (calcein), ⁵¹Cr 또는 칼세인-AM과 같은 형광성 염료들, 카복시플루오레신 숙시니미딜 에스테르 (CFSE), 2',7'-비스-(2 카복시에틸)-5-(앤드-6)-카복시플로오레신 (BCECF) 또는 유로피움 (Europium)을 사용하거나, 락테이트 탈수소화효소 (LDH) 또는 ATP와 같은 세포질 효소들의 방출을 측정하는 것에 의한 세포측정법. 이들 방법들은 당업자에게 잘-알려져 있고 [예로, Jiang et al., "Advances in the assessment and control of the effector functions of therapeutic antibodies", Nat Rev Drug Discov., 10: 101-110, 2011 및 본 명세서에서의 참고문헌들 참조], 본 명세서에서 더 상술될 필요가 없다.

"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"에 의하여, 이것은 본 명세서에서 세포 표면 상의 항원과 결합하는 특이적 항체에 의해 촉발되는 보체 활성화가 혈액에서 보체-관련된 단백질 그룹들을 포함하는 일련의 연쇄과정들 (보체 활성화 경로들)을 통하여 표적 세포의 용해를 유발하는 기작이라고 말한다. 또한, 보체의 활성화에 의해 생성된 단백질 단편들은 면역 세포들의 이동 및 활성화를 유도할 수 있다. 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성화의 첫 번째 단계는 항체의 적어도 두 개의 Fc 도메인들과 C1q 단백질의 결합을 포함한다. C1q는 두 가지의 세린 프로테아제들 C1r 및 C1s와 함께 복합체 C1, 보체-의존성 세포독성(CDC) 경로의 첫 번째 성분을 형성한다.

본 발명의 또 다른 유리한 구현예에서, 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 단편은 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 유도하여 CXCR4-발현 암 세포들을 살상할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기에 기술된 바와 같이, 효과기 기능이 보체-의존성 세포독성 (CDC)으로 구성되는 방법에 관한 것이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 효과기 기능이 보체-의존성 세포독성 (CDC)으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 효과기 기능이 보체-의존성 세포독성 (CDC)으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

CDC에 의해 핵형성된 세포들의 세포독성은 다음과 같은 여러 방법들에 의해 시험관내에서 정량될 수 있다: 트립판 블루 배제, 프로피디움 요오드 (PI)를 사용한 유동 세포측정법, ⁵¹Cr 방출, 테트라졸리움 염 MTT의 감소, 레독스 염료 알라마 블루 (Alamar blue), 세포내 ATP의 소실, 셀타이터-Glo (CellTiter-Glo), LDH 방출 또는 칼세인-AM 방출. 이들 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다 [예로, Jiang et al., "Advances in the assessment and control of the effector functions of therapeutic antibodies", Nat Rev Drug Discov., 10: 101-110, 2011 및 본 명세서에서의 참고문헌들 참조], 본 명세서에서 더 상술될 필요가 없다.

본 발명의 더 유리한 구현예에서, 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC) 둘 다가 유도되고, 예로 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 단편은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC) 둘 다를 유도하여 CXCR4-발현 암 세포들을 살상할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법의 효과기 기능들은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)로 구성된다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 효과기 기능들은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 효과기 기능들이 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

항체의 이들 두 가지 효과기 기능들은 면역 세포들 상의 특이적 수용체들과 항체 Fc 부분의 결합과 직접적으로 연관된다 - 필수적으로 CDCC의 경우 NK 세포들, 대식구들, 단핵구들 상에 발현된 FcγRⅢa (FcγRⅢA라고도 역시 명명됨) 및 FcγRⅡa (FcγRⅡA라도도 역시 명명됨) 그리고 CDC의 경우 보체 연쇄과정 단백질 C1q.

항체의 Fc 부분 및 FcγR들 및 C1q 간의 정확한 상호작용들은 정확하게 지도 작성되어 왔고 본 상호작용에서 관여하는 주요한 Fc 도메인은 CH2 도메인에 해당한다. Fc 부분 및 Fc 수용체들 간의 친화도는 촉발되는 면역 반응들의 정도와 직접적으로 연관된다.

상기에 기술된 바와 같이, CXCR4에게로 유도되는 인간 또는 인간화 항체들은 CXCR4-발현 세포들에 대해 효과기 기능들을 유도할 수 있어, 상기 세포들에 대한 세포독성 효과들을 가져온다. 효과기 기능 유도가 더 높을수록 CXCR4-발현 세포들에 대한 세포독성 효과들이 더 큰 점은 명백하다. 일정 항체들이 자연적으로 증가된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 보여줄 수 있더라도, 다른 경우들에서 항체 면역 반응들, 보다 상세하게 ADCC 및/또는 CDC를 증진하기 위하여 CXCR4에게로 유도된 인간 또는 인간화 항체를 조작하는 것이 필요할 수 있다. 이러한 조작된 항체들도 역시 본 발명의 범위에 의해 포괄된다.

항체 면역 반응들, 보다 상세하게 ADCC 및/또는 CDC를 조작하고 증진하는 여러 방식들이 존재하고, 이들 대부분은 ADCC의 경우 인지체 (cognate) FcγR와 결합의 직접적 증가를 기초로 한다. 주요한 목표는 인간 FcγRa 및 인간 FcγRⅡa와 결합을 증가시키소 인간 FcγRⅡb와 결합을 감소시키는 것이다 (저해성 수용체는 면역 반응들을 감소시킨다. 이것은 Fc 부분 내의 개별적 아미노산 잔기들을 변이화하거나, CH2 도메인의 아스파라진 297번과 연결된 글리칸 분체를 변형하여 퓨코실화된 글리칸 부분을 증가시켜서 달성될 수 있다. 당조작 (glycoengineering)은, 예를 들면 항체를 생산하는 숙주 세포에서 FUT8 유전자를 멈추게 (shutting-down)하거나 (siRNA, KO, etc; Toyohide Shinkawa et al., The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. J. Biol. Chem 2003; 278: 3466-3473) 항체-생산 세포에서 GlcNAcⅢ 전이효소를 과다발현하여 (예로, Pablo Umana et al. Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxicity activity. Nat Biotechnol 1999; 17: 176-180) 달성될 수 있다.

이러한 항체들은 항체의 불변 도메인에서 단일한 또는 복수의 치환들을 만들어 획득될 수 있어, Fc 수용체들과의 그의 상호작용을 증가시킨다. 이러한 돌연변이체들을 설계하는 방법들은 예를 들면 라자르 등 (Lazar et al., 2006, PNAS, 103(11): 4005-4010) 및 오카자키 등 (Okazaki et al., 2004, J. MoI. Biol. 336(5): 1239-49)에서 찾을 수 있다.

개선된 항체들의 생산을 위해 특이적으로 조작된 세포주들을 사용하는 것도 역시 가능하다. 상세하게, 이들 세포주들은 당화 경로의 조절을 변경하여 왔고, 빈약하게 퓨코실화된 또는 심지어 전부 탈퓨코실화된 항체들을 가져왔다. 이러한 세포주들 및 이들을 조작하는 방법들이, 예로 신카와 등 (Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473), 페라라 등 (Ferrara et al., Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-61)에 개시된다.

ADCC를 증가시키는 다른 방법들도 역시 리 등 (Li et al., 2006, Nat Biotechnol. 24(2): 210-5), 스타벤하겐 등 (Stavenhagen et al., 2008, Advan. Enzyme Regul. 48: 152-164), 쉴드 등 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(9): 6591-6604); 및 국제특허출원 제 WO 2008/006554호에 기술되어 왔다.

CDC를 증가시키는 방법들은 이듀소지 등 (Idusogie et al., 2001, J Immunol. 166(4): 2571-5), 달라쿠아 등 (Dall'Acqua et al., 2006, J Immunol　, 177(2): 1129-38), 마이켈센 등 (Michaelsen et al., 1990, Scand J Immunol, 32(5): 517-28), 브레케 등 (Brekke et al., 1993, Mol Immunol, 30(16): 1419-25), 탄 등 (Tan et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 162-166) 및 노르데하우그 등 (Norderhaug et al., 1991, Eur J Immunol, 21(10): 2379-84)에 기술되어 왔다.

잘 설명된 기술학은 증진된 CDC를 가진 키메라 인간 IgG1/IgG3 Fc 부분을 제조하는 것으로 구성되는 교와사 (Kyowa)에 의해 개발된 보체 기술학이다 (예로, 국제특허출원 제 WO 2007/011041호 참조).

ADCC 및 CDC를 증가시키는 방법들을 기술하는 참고문헌들로는 나트수메 등 (Natsume et al., 2008, Cancer Res. 68(10): 3863-3872)을 포함한다. 각각의 이들 참고문헌들의 개시는 본 명세서에서 교차 참조문헌으로 포함된다.

ADCC 및/또는 CDC를 증진하는 것은 이것이 CXCR4-발현 암성 세포들의 살상을 유도할 것이고, 이와 같이 CXCR4-표적화 치료가 정지되더라도 암의 재발의 위험성을 분명하게 제한할 것이기 때문에 암들의 치료의 분야에서 특히 흥미로운 점이 당업자에게 명백할 것이다.

용어 표현 "CH2-포함 결합 단편 (CH2-containing binding fragment)"에 의하여, 이것은 부모 항체의 6개 CDR들을 포함하는 항체의 임의의 단편 또는 일부 및 및 효과기 기능의 유도를 부여하는 것으로 알려진 적어도 CH2 도메인으로 이해되어야 한다. 가장 바람직한 구현예에서, CH2는 이량체이어야 하고, 다시 말하면 이것은 CH2의 두 개 사본들을 포함한다.

또 다른 구현예에서, CH2-포함 결합 단편은 부모 항체의 6개 CDR들 그리고 적어도 CH2 및 힌지 도메인들을 포함한다.

또 다른 구현예에서, CH2-포함 결합 단편은 부모 항체의 6개 CDR들 그리고 적어도 CH1, 힌지 및 CH2 도메인들을 포함한다.

또 다른 구현예에서, CH2-포함 결합 단편은 부모 항체의 6개 CDR들 그리고 적어도 CH1, 및 CH2 도메인들을 포함한다.

또 다른 구현예에서, CH2-포함 결합 단편은 부모 항체의 6개 CDR들 그리고 적어도 CH1, CH2 및 CH3 도메인들을 포함한다.

보다 또 다른 구현예에서, CH2-포함 결합 단편은 부모 항체의 6개 CDR들 그리고 적어도 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인들, 예로 전장의 Fc를 포함한다.

더욱 바람직하게, 본 발명은 유전적 재조합 또는 화학적 합성에 의해 획득된 인간화 항체들, 그들의 CH2-포함 결합 단편들을 포함한다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 이것이 단일클론 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

다른 말로 하면, 본 발명의 방법은 중쇄가 IMGT에 따라 다음의 3가지 CDR들, 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하고:

- CDR-H1는 서열번호 1, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 1의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열을 포함하고;

- CDR-H2는 서열번호 2, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 2의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열을 포함하고;

- CDR-H3은 서열번호 3, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 3의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열을 포함하는;

인간 또는 인간화 항체들, 또는 CH2-포함 결합 단편의 용도를 포함한다.

보다 더 바람직하게, 본 발명의 방법은 경쇄가 IMGT에 따라 다음의 3가지 CDR들, 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하고:

- CDR-L1는 서열번호 4, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 4의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열을 포함하고;

- CDR-L2는 서열번호 5, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 5의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열을 포함하고;

- CDR-L3은 서열번호 6, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 6의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열을 포함하는;

본 발명의 상세한 설명에서, 용어들 "폴리펩타이드들 (polypeptide)", "폴리펩타이드 서열들 (polypeptide sequence)", "펩타이드들 (peptadie)"은 상호교환이 가능하다.

독특한 IMGT 번호매김 시스템 (IMGT unique numbering system)은 어떠한 항원 수용체, 사슬 유형 또는 종이라도 가변 도메인들을 비교하도록 정의되어 왔다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommie C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. IMGT 번호매김 시스템에서, 보존되는 아미노산들은 항상 23번 시스테인 (1번째-CYS), 41번 트립토판 (보존되는 TRP), 89번 소수성 아미노산, 104번 시스테인 (2번째-CYS), 118번 페닐알라닌 또는 트립토판 (J-PHE 또는 TRP)과 같이 동일한 위치를 가진다. 독특한 IMGT 번호매김 시스템은 구조틀 부위들 (FR1-IMGT: 1 내지 26번 위치, FR2-IMGT: 39 내지 55번 위치, FR3-IMGT: 66 내지 104번 위치 및 FR4-IMGT: 118 내지 128번 위치) 및 상보성 결정 부위들 (CDR1-IMGT: 27 내지 38번 위치, CDR2-IMGT: 56 내지 65번 위치 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117번 위치)의 표준화된 구획 (standardized delimitation)을 제공한다. "공간들 (gaps)"은 채워지지 않은 위치들을 나타내기 때문에, CDR-IMGT 길이 (괄호들 사이에 나타나고 점들로 분리됨, 예로 [8.8.13])는 결정적인 정보가 된다. 독특한 IMGT 번호매김은 IMGT 진주목걸이 (IMGT pearl necklace)라고도 명명되는 2차원 그래픽 전시들 [Ruiz, M. and Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] 및 IMGT/3D 구조-DB의 3차원 구조 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data . Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]에서 사용된다.

본 발명의 의미에서, 핵산들 또는 아미노산들의 두 개 서열들 간 "일치도 백분율 (percentage identity)"는 최적의 정렬에 따라 획득되어 비교되는 두 개의 서열들 간에 일치하는 뉴클레오타이들드 또는 아미노산 잔기들의 백분율을 의미하고, 본 백분율은 순수하게 통계적이고 두 서열들 간의 차이는 그들의 길이를 따라 무작위적으로 분포한다. 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 서열 비교는 통상적으로 그들을 최적으로 정렬시킨 이후 서열들을 비교하여 수행되고, 상기 비교는 분절에 의해 또는 "비교창 (comparison window)"에 의해 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 수작업으로 수행되는 것과 함께 스미스 및 워터맨 (Smith and Waterman, (1981) Ad. App. Math. 2:482)의 로칼 상동성 알고리즘에 의해, 네들만 및 운쉬 (Neddleman and Wunsch, (1970), J. Mol. Biol. 48: 443)의 로칼 상동성 알고리즘에 의해, 피어슨 및 립만 (Pearson and Lipman, (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444)의 유사도 탐색 방법에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI 에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 또는 비교 소프트웨어 BLAST N 또는 BLAST P 에 의해)에 의해 수행될 수 있다.

두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 일치도 백분율은 비교되는 핵산 또는 아미노산 서열이 이들 두 서열들 간 최적의 정렬을 위한 기준 서열 (reference sequence)에 비해 부가 (addition) 또는 결실 (deletion)을 포함할 수 있는 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정된다. 일치도 백분율은 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 두 개 서열들 간에, 바람직하게 두 개 완전한 서열들 간에 일치하는 동일한 위치의 숫자를 결정하고, 동일한 위치의 숫자를 정렬창에서의 전체 위치 숫자로 나눈 다음 획득된 결과를 두 개 서열들 간 일치도 백분율을 얻기 위하여 100으로 곱하여 계산된다.

예를 들면, 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 상에서 입수가능한 BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열들" (Tatusova et al ., "Blast 2 서열- 단백질 및 뉴클레오타이드 서열들을 비교하기 위한 새로운 도구", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250)이 디폴트 매개변수들 (명확하게, 매개변수들 "오픈 갭 페널티 (open gap penalty)"의 경우: 5, 및 "연장 갭 페널티 (extension gap penalty)": 2; 선택된 매트릭스는 예를 들면 프로그램에 의해 제시되는 "BLOSUM 62" 매트릭스일 수 있음)와 함께 사용될 수 있고; 비교를 위한 두 개 서열들 간 일치도 백분율은 프로그램에 의해 직접 계산될 수도 있다.

기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 나타내는 아미노산 서열을 위해, 바람직한 예들로는 기준 서열, 소정의 변형들 (modification), 명확하게 적어도 하나의 아미노산의 결실 (deletion), 부가 (addition) 또는 치환 (substituiton), 절단 (truncation) 또는 연장 (extension)을 포함하는 것들을 들 수 있다. 하나 이상의 연속적 (consecutive) 또는 비-연속적 (non-consecutive) 아미노산(들)의 치환의 경우에서, 치환된 아미노산은 "동등한" 아미노산에 의해 대체되는 치환이 바람직하다. 본 명세서에서 용어 표현 "동등한 아미노산들 (equivalent amino acids)"은 해당하는 항체 및 하기 정의된 이들 특정한 예들의 생물학적 활성을 변형시키지 않지만, 구조적 아미노산들의 하나가 치환될 수 있는 임의의 아미노산들을 가리키도록 의미한다.

동등한 아미노산들은 치환되어진 아미노산들과 그들의 구조적 상동성 (structural homology)을 기초로 하거나 생성될 수 있는 다양한 항체들 간의 생물학적 활성의 비교 테스트들의 결과들을 기초로 하여 결정될 수 있다.

비-제한적인 예로서, 하기 표 1 은 해당되는 변형된 항체의 생물학적 활성의 유의한 변형을 유발하지 않고도 수행될 수 있는 가능한 치환들을 요약하고; 역 치환들 (inverse substituiton)은 동일한 조건들 하에서 자연적으로 가능하다.

당해 기술분야의 현재 상황에서 당업자라면 여섯 가지 CDR들 간의 가장 큰 다양성 (길이 및 조성)은 세 가지의 중쇄 CDR들, 보다 상세하게는 본 중쇄의 CDR-H3에서 발견되는 점을 숙지하고 있다. 결론적으로, 본 발명의 항체들, 또는 그들의 유래한 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나의 바람직한 특징적 CDR들은 중쇄의 세 가지 CDR들이 될 것이라는 점은 명백할 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예는

세 가지 CDR들을 포함하는 중쇄:

서열번호 1의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 1의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열의 CDR-H1;

서열번호 2의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 2의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열의 CDR-H2;

서열번호 3의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 3의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열의 CDR-H3; 및

세 가지 CDR들을 포함하는 경쇄:

서열번호 4의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 4의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열의 CDR-L1;

서열번호 5의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 5의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열의 CDR-L2;

서열번호 6의 서열, 또는 최적의 정렬 이후에 서열번호 6의 서열과 적어도 80%, 바람직하게 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가진 서열의 CDR-L3;

를 포함하는, 인간 또는 인간화 항체, 또는 CH2-포함 결합 단편의 용도를 개시한다.

더욱 명확하게는, 하기 도 2a는 본 발명의 항체 hz515H7의 CDR들에 해당하는 다양한 아미노산 서열들을 요약하는 한편; 도 2b는 본 발명의 인간화 항체의 다양한 변이체들의 가변 도메인들 및 전장의 서열들에 해당하는 다양한 아미노산 서열들을 요약하고 있다.

예로서, 의심을 피하기 위해, 용어 표현 "VH1"은 용어 표현들 "VH 변이체 1 (VH Variant 1)", "VH 변이체 1 (VH variant 1)", "VH Var 1", 또는 "VH var 1"과 유사하다.

본 명세서에서는 본 발명에 사용된 항체가 2008년 6월 25일자로 기탁번호 제 I-4019호 하에서 프랑스 미생물 배양의 수집기관 (CNCM, 프랑스 파리 파스퇴르 연구소)으로 제출된 마우스 하이브리도마에 의해 생산된 마우스 항체의 인간화 (humanization)로부터 획득되었던 점이 언급될 수 있다. 상기 하이브리도마는 Balb/C 면역화된 마우스 비장세포들 및 골수종 Sp 2/O-Ag 14 계열들의 세포들의 융합에 의해 획득되었다.

본 명세서에서 515H7이라고 명명되는 마우스 단일클론 항체는 2008년 6월 25일자로 기탁번호 제 I-4019호 하에서 CNCM으로 제출된 하이브리도마에 의해 분비된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 항체는 인간화 항체이다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "인간화 항체 (humanized antibody)"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래한 최소의 서열을 포함하는 키메라 항체를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "키메라 항체 (chimeric antibody)"는 불변 부위, 또는 그의 부분이 변경되거나, 치환되거나, 교환되어, 가변 부위가 서로 다른 종들의 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 불변 부위와 연결되는 항체이다. "키메라 항체"는 또한 가변 부위, 또는 그의 부분이 변경되거나, 치환되거나, 교환되어, 불변 부위가 서로 다른 종들의 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 가변 부위와 연결되는 항체를 말한다.

소정의 구현예들에서, 항체들의 가변 및 불변 부위들, 또는 그의 항원-결합 단편들, 변이체들, 또는 유도체들은 전적으로 인간이다. 전적인 인간 항체들은 당해 기술분야에서 알려진 기법들을 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 특이적 항원에 대한 전적인 인간 항체들은 항원을 항원성 접종에 반응하여 이러한 항체들을 생산하도록 변형되었지만, 그의 내인성 좌위들은 불구되었던 형질전환 (transgenic) 동물에게 투여하여 제조될 수 있다. 이러한 항체들을 만드는 데 사용될 수 있는 대표적인 기법들은 미국 특허들: 제 6,150,584호; 제 6,458,592호; 제 6,420,140호에 기술되어 있다. 다른 기법들이 당해 기술분야에서 알려져 있다. 전적인 인간 항체들은 마찬가지로 다양한 디스플레이 기술학들, 예로 파지 디스플레이 또는 다른 바이러스성 디스플레이 시스템들에 의해 생산될 수 있다. 또한 미국 특허들 제 4,444,887호, 제 4,716,111호, 제 5,545,806호, 및 제 5,814,318호; 그리고 국제 특허출원 공고번호들 제 WO 98/46645호, 제 WO 98/50433호, 제 WO 98/24893호, 제 WO 98/16654호, 제 WO 96/34096호, 제 WO 96/33735호, 및 제 WO 91/10741호 참조 (상기 참고문헌들은 그들의 전부가 참조문헌으로 통합됨).

"인간화 항체"는 본 명세서에서 사용되는 바, 비인간 기원의 항체로부터 유래한 CDR 부위들, 하나 (또는 여러) 인간 항체들로부터 유래한 항체 분자의 다른 부분들을 포함하는 항체를 말한다. 또한, 일정 골격의 분절 잔기들 (FR이라고 명명됨)는 결합 친화도를 보존하도록 변형될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al ., Nature, 332: 323-327, 1988).

인간화의 목표는 인간 내로 도입을 위해 항체의 전체 항원 결합 친화도 및 특이성을 유지하면서 마우스 항체와 같은 이종유래 항체의 면역원성에서 감소이다. 본 발명의 인간화 항체 또는 그의 단편들은 당업자가 숙지하고 있는 기법들에 의해 제조될 수 있다 (예를 들면, Singer et al., J. Immun. 150: 2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; 또는 Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992에 기술된 것들과 같음). 이러한 인간화 항체들은 시험관내 진단들이 관여하는 방법들 또는 생체내 예방적 및/또는 요법적 치료에서 그들의 사용을 위해 바람직하다. 다른 인간화 기법들도 역시, 예를 들면 유럽특허 제 EP 0 451 261호, 제 EP　0　682 040호, 제 EP 0 939 127호, 제 EP 0 566 647호 또는 미국특허 제 US 5,530,101호, 제 US 6,180,370호, 제 US　5,585,089호 및 제 US 5,693,761호 특허들에서 PDL에 의해 기술된 "CDR 이식 (CDR Grafting)"과 같은 선행기술을 통해 당업자가 잘 숙지하고 있다. 미국 특허 제 US　5,639,641호, 제 US 6,054,297호, 제 US 5,886,152호 및 제 US 5,877,293호도 역시 인용될 수 있다.

본 명세서의 경우에 계속하여, 키메라 항체 c515H7은 용어 표현 "인간화 항체"에 포함될 것이다. 보다 상세하게, c515H7은 이것이 서열번호 70 서열의 (서열번호 72의 뉴클레오타이드에 해당함) 중쇄 및 서열번호 71 서열의 (서열번호 73의 뉴클레오타이드에 해당함) 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기에 기술된 마우스 항체 c515H7로부터 나온 인간화 항체로서, 상기 항체들은 그들의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인들의 서열들에 의해 정의되는, 항체에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서에 기술된 인간화 항체들 모두가 본 발명의 방법들에서 사용될 수 있고, 예로 그들은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 적어도 하나의 효과기 기능의 유도에 의해 CXCR4-발현 암 세포들을 살상하는 데 사용될 수 있거나, 그들은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 적어도 하나의 효과기 기능의 유도에 의해 CXCR4-발현 암 세포들을 살상하는 단계에 의해 암을 치료하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 방법들의 바람직한 구현예에서, 인간 또는 인간화 항체는 서열번호 7 내지 10의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 11 내지 17의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체로 구성된다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 인간 또는 인간화 항체가 서열번호 7 내지 10의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 11 내지 17의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 이것이 서열번호 7 내지 10의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 11 내지 17의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 바람직한 인간화 항체는 서열번호 8의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 11 내지 17의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체로 구성된다.

본 발명에 따른 보다 바람직한 인간화 항체는 서열번호 7 내지 10의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 13의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체로 구성된다.

본 발명은 또한 상기에 기술된 마우스 항체 515H7로부터 나온 인간화 항체들로서, 상기 항체들은 그들의 전장의 중쇄 및/또는 경쇄의 서열들에 의해 정의되는, 항체들에 관한 것이다.

본 발명의 방법들의 바람직한 구현예에서, 인간 또는 인간화 항체는 서열번호 18 내지 21의 서열들로부터 선택되는 중쇄 및 서열번호 22 내지 28의 서열들로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 인간화 항체로 구성된다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 인간 또는 인간화 항체가 서열번호 18 내지 21의 서열들로부터 선택되는 중쇄 및 서열번호 22 내지 28의 서열들로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 인간화 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 이것이 서열번호 18 내지 21의 서열들로부터 선택되는 중쇄 및 서열번호 22 내지 28의 서열들로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 인간화 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 바람직한 인간화 항체는 서열번호 19의 서열의 중쇄 및/또는 서열번호 22 내지 28의 서열들로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 인간화 항체로 구성된다.

본 발명에 따른 또 다른 바람직한 인간화 항체는 서열번호 18 내지 21의 서열로부터 선택되는 중쇄 및 서열번호 24의 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체로 구성된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 8의 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 13의 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　D76N　VL2, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 19의 서열의 중쇄 및 서열번호 24의 서열의 경쇄를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　D76N　VL2, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 8의 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 14의 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　D76N　VL2.1, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 19의 서열의 중쇄 및 서열번호 25의 서열의 경쇄를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　D76N　VL2.1, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 8의 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 15의 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　D76N　VL2.2, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 19의 서열의 중쇄 및 서열번호 26의 서열의 경쇄를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　D76N　VL2.2, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 8의 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 16의 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　D76N　VL2.3, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 19의 서열의 중쇄 및 서열번호 27의 서열의 경쇄를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　D76N　VL2.3, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 9의 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 11의 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　V48L D76N　VL1, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 20의 서열의 중쇄 및 서열번호 22의 서열의 경쇄를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　V48L D76N　VL1, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 9의 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 12의 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　V48L　D76N　VL1　T59A　E61D, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 20의 서열의 중쇄 및 서열번호 23의 서열의 경쇄를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　V48L　D76N　VL1　T59A　E61D, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 7의 서열의 중쇄 가변 부위 및 서열번호 11의 서열의 경쇄 가변 부위를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　VL1, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 서열번호 18의 서열의 중쇄 및 서열번호 22의 서열의 경쇄를 포함하는, 인간화 항체 Hz515H7　VH1　VL1, 또는 그의 유래한 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

상기 예시된 VH / VL 조합들은 제한적이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 당업자라면 물론 부당한 부담이 없이도 또한 발명적 기술을 적용하지 않고도 본 명세서에서 개시된 모든 VH 및 VL를 재배열할 수 있을 것이다.

본 발명의 방법의 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호 8의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 13의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체로 구성된다.

다른 말로 하면, 본 발명의 용도는 상기 인간 또는 인간화 항체가 서열번호 8의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 13의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 이것이 서열번호 8의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 13의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

상기 기술된 서로 다른 서열들에 관하여, 바람직한 항체는 (그러나 배타적인 것은 아님) 그의 전장의 중쇄 및 경쇄 서열들의 서열들에 의해 역시 기술될 것이다.

본 발명의 방법의 더욱 바람직한 구현예에서, 인간 또는 인간화 항체는 서열번호 19의 서열의 중쇄 및 서열번호 24의 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체로 구성된다.

다른 말로 하면, 본 발명의 용도는 상기 인간 또는 인간화 항체가 서열번호 19의 서열의 중쇄 및 서열번호 24의 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 이것이 서열번호 19의 서열의 중쇄 및 서열번호 24의 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

당업자에게라면 본 발명의 항체가 효과기 기능들을 나타내는 데 필요한 구조적 요소들을 나타내야 하는 점이 자명할 것이다. 보다 상세하게, 항체는 ADCC 및/또는 CDC를 허용하도록 적합한 이소형이어야 한다. 예를 들면, 다양한 인간 면역글로불린 클래스들 중에서 인간 IgGl 및 IgG3는 IgG2 및 IgG4보다 더욱 효과적으로 ADCC를 매개하는 것으로 알려져 있다. 한편으로, CDC를 위한 효능의 순서는 IgG3 = IgG1 >> IgG2 ≒ IgG4이다 (Niwa et al., J Immunol Methods, 306: 151-160, 2005).

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 IgG1 이소형이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 인간 또는 인간화 항체가 IgG1 이소형인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 이것이 IgG1 이소형인 것을 특징으로 한다.

특정한 구현예에서, 본 발명은 IgG1 Hz515H7　VH1　D76N　VL2로 구성되는 본 발명의 바람직한 항체의 CH2-포함 결합 단편에 관한 것이다.

보다 상세하게, 바람직한 CH2-포함 결합 단편은 i) 서열번호들 1, 2 및 3을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인; ii) 서열번호들 4, 5 및 6을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및 iii) 적어도 서열번호 60의 서열을 포함하는 CH2 도메인;을 포함하는 단편으로 구성된다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, CH2-포함 결합 단편은 서열번호들 1, 2 및 3을 각각 포함하는 3개의 중쇄 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 서열번호들 4, 5 및 6을 각각 포함하는 3개의 경쇄 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3; 및 적어도 서열번호 60을 포함하는 CH2 도메인;으로 구성된다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 CH2-포함 결합 단편이 서열번호들 1, 2 및 3을 각각 포함하는 3개의 중쇄 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 서열번호들 4, 5 및 6을 각각 포함하는 3개의 경쇄 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3; 및 적어도 서열번호 60을 포함하는 CH2 도메인;을 포함하는 단편으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 CH2-포함 결합 단편이 서열번호들 1, 2 및 3을 각각 포함하는 3개의 중쇄 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 서열번호들 4, 5 및 6을 각각 포함하는 3개의 경쇄 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3; 및 적어도 서열번호 60을 포함하는 CH2 도메인;을 포함하는 단편으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

또 다른 바람직한 CH2-포함 결합 단편은 i) 서열번호들 1, 2 및 3을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인; ii) 서열번호들 4, 5 및 6을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인; iii) 적어도 서열번호 60의 서열을 포함하는 CH2 도메인; 및 iv) 적어도 서열번호 61의 서열을 포함하는 힌지 도메인을 포함하는 단편으로 구성된다.

보다 또 다른 바람직한 CH2-포함 결합 단편은 i) 서열번호들 1, 2 및 3을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인; ii) 서열번호들 4, 5 및 6을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인; iii) 적어도 서열번호 60의 서열을 포함하는 CH2 도메인; iv) 적어도 서열번호 61의 서열을 포함하는 힌지 도메인; 및 v) 적어도 62의 서열을 포함하는 CH1 도메인;을 포함하는 단편으로 구성된다.

보다 또 다른 바람직한 CH2-포함 결합 단편은 i) 서열번호들 1, 2 및 3을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인; ii) 서열번호들 4, 5 및 6을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인; iii) 적어도 서열번호 60의 서열을 포함하는 CH2 도메인; iv) 적어도 서열번호 61의 서열을 포함하는 힌지 도메인; v) 적어도 62의 서열을 포함하는 CH1 도메인; 및 vi) 적어도 63의 서열을 포함하는 CH3 도메인;을 포함하는 단편으로 구성된다.

본 발명의 보다 또 다른 바람직한 구현예에서, 바람직한 CH2-포함 결합 단편은 i) 서열번호들 1, 2 및 3을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인; ii) 서열번호들 4, 5 및 6을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및 iii) 적어도 서열번호 64의 서열을 포함하는 전장의 Fc 도메인;을 포함하는 단편으로 구성된다.

더욱 명확하게, 다음의 표 3은 항체 Hz515H7　VH1　D76N　VL2의 각각의 도메인에 대한 서열들을 도시한다.

이들 요소들을 기초로 하여, 당업자라면 본 명세서에서 기술된 임의의 서열로부터 유래한 임의의 CH2-포함 결합 단편을 임의의 부당한 실험이 없이도 생성하는 것이 자명할 것이다. 결론적으로, 기타 다른 CH2-포함 결합 단편이 본 출원의 범위의 일부로서 고려되어야 한다.

하기 표 4a는 본 발명의 항체 hz515H7의 CDR들에 해당하는 다양한 뉴클레오타이드 서열들을 요약하는 한편; 도 4b는 본 발명의 인간화 항체의 다양한 변이체들의 가변 도메인들 및 전장의 서열들에 해당하는 다양한 최적화된 뉴클레오타이드 서열들을 요약하고 있다.

용어 표현 "최적화된 서열"은 관심 있는 단백질 (본 명세서에서는 항체 가변 도메인들)을 구성하는 아미노산들을 인코딩하는 코돈들이 헌신된 세포 유형, 본 발명에서는 포유동물 세포들에서 해독 기작 (translation machinery)에 의한 더 나은 인지를 위해 변형되었던 것을 의미한다. 이에 따라, 당업자에게는 발현에 사용된 유전자 및 세포의 출처에 의존하여, 코돈 최적화 (codon optimization)가 본 발명의 인코딩된 폴리펩타이드들의 발현을 증가시키도록 도울 수 있는 점이 숙지되어 있다. "코돈 최적화"에 의하여, 숙주 세포에서 코돈 사용도 (codon usage)를 위해 서열들을 개선하는 본 발명의 폴리펩타이드들의 코딩 서열들에 대한 변경들을 말한다. 코돈 사용도 도표들이 당해 기술분야에서, 예로 CHO 세포들과 같은 포유동물 세포들을 위해, 뿐만 아니라 다양한 다른 유기체들을 위해 알려져 있다. 또한, 최적화는 G/C 함량 적응 및 안정한 RNA 이차 구조의 예방을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열들의 변경들에 의해서도 달성될 수 있다 (예를 들면, Kim et al., 1997 Gene 199(1-2): 293-301 참조).

본 발명의 상세한 설명에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 " 핵산 (nucleic acid)", "핵산 서열 (nucleic sequence)", "핵산 서열 (nucleic acid sequence)", "폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)", "폴리뉴클레오타이드 서열 (polynucleotide sequence)",및 " 뉴클레오타이드 서열 (nucleotide sequence)"은 변형 여부와 상관없이 핵산의 단편 또는 부위를 정의하고, 비-천연의 뉴클레오타이드를 포함하는 여부와 상관없이, 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 또는 상기 DNA들의 전사 산물들의 어느 하나가 되는 뉴클레오타이드들의 정확한 서열을 의미한다.

본 발명의 핵산 서열들은 모두 이미 분리되었고/되었거나 정제되었으며, 예로 그들은 예를 들면 복제에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 시료수집되었고, 그들의 환경은 적어도 부분적으로는 변형되었다. "최적의 정렬 이후에 바람직한 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도 백분율을 나타내는 핵산 서열들"은 기준 핵산 서열에 관하여, 상세하게 결실, 절단, 연장, 키메라 융합 및/또는 치환, 명확하게 점 치환 (punctual)과 같은 소정의 변형들을 나타내는 핵산 서열들을 의미한다. 바람직하게, 이들은 기준 서열과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열들로서, 이것은 유전적 암호의 중복성 (degeneracy)과 관련되는 서열들, 또는 기준 서열들과 바람직하게는 높은 엄격도, 명확하게 하기에 정의된 조건들 하에서 특이적으로 혼성화할 수 있는 상보적인 서열들이다.

높은 엄격도의 조건들 하에서 혼성화 (hybridization)는 온도 및 이온 강도와 관련된 조건들이 그들이 두 개 상보적인 DNA 단편들 간에 혼성화가 유지되도록 허용하는 방식으로 선별되는 것을 의미한다. 간단하게 설명하면, 상기에서 기술된 폴리뉴클레오타이드 단편들을 정의하려는 목적으로 혼성화 단계의 높은 엄격도 조건들은 유리하게는 하기와 같다.

DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화는 두 단계들로 수행된다: (1) 5 x SSC (1 x SSC 는 0.15 M NaCl + 0.015 M 소듐 사이트레이트 용액에 해당한다), 50% 포름아마이드, 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 10 x 덴하르트 용액 (Denhardt's), 5% 덱스트란 설페이트, 1% 연어정자 DNA를 포함하는 포스페이트 완충액에서 42℃에서 3시간 동안 전혼성화 (prehybridization); (2) 탐침의 길이에 의존하는 온도에서 (예로, > 100개 뉴클레오타이드 길이의 탐침의 경우 42℃) 20시간 동안 일차적으로 혼성화, 이어서 2 x SSC + 2% SDS에서 20분 동안 20℃에서 두 번 세척, 0.1 x SSC + 0.1% SDS에서 20분 동안 20℃에서 한 번 세척. 마지막 세척은 > 100개 뉴클레오타이드 길이의 탐침의 경우 0.1 x SSC + 0.1% SDS에서 30분 동안 60℃에서 수행된다. 정의된 크기의 폴리뉴클레오타이드를 위한 상기에서 기술된 높은 엄격도 혼성화는, 샘브룩 등에 기술된 절차들에 따라, 더 길거나 더 짧은 길이의 올리고뉴클레오타이드의 경우 당업자에 의해 적응될 수 있다 (Sambrook et al., 1989, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼 제 3판, 2001).

본 발명의 인간 또는 인간화 항체 또는, 그의 CH2-포함 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하기 위하여, 상기 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 발현 벡터들 내로 삽입되어 유전자들은 전사 및 해독 조절 서열들과 작동적으로 연결된다.

"작동적으로 연결된 (operably linked)" 서열들은 관심 있는 유전자와 연속적인 발현 조절 서열들 및 관심 있는 유전자를 조절하도록 트랜스로 (in trans) 또는 원거리에서 작용하는 발현 조절 서열들 둘 다를 포함한다. 용어 "발현 조절 서열들"은 본 명세서에서 사용되는 바 그들이 라이게이션된 코딩 서열들의 발현 및 가공에 효과를 미치는 데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열들을 말한다. 발현 조절 서열들은 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열들; 스프라이싱 및 폴리아데닐화 신호들과 같은 효율적인 RNA 프로세싱 신호들; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열들; 해독 효율을 증진하는 서열들 (예로, 코작 공통 서열 (Kozak consensus sequence)); 단백질 안정성을 증진하는 서열들; 및 원하는 경우 단백질 분비를 증진하는 서열들;을 포함한다. 이러한 조절 서열들의 특성은 숙주 유기체에 의존하여 서로 달라진다; 원핵생물들에서 이러한 조절 서열들은 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 해독 종결 서열을 포함하고; 진핵생물들에서는 일반적으로 이러한 조절 서열들은 프로모터 및 전사 조절 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열들 (control sequence)"은 최소로, 발현 및 프로세싱을 위해 그의 존재가 필수적인 모든 구성성분들을 포함하려고 의도되고, 또한 그의 존재가 유리한 추가적인 구성성분들 예를 들면 리더 서열들 및 융합 파트너 서열들을 포함할 수 있다.

용어 "벡터"는 본 명세서에서 사용되는 바, 이것이 연결되었던 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 말하려고 의도된다. 한 가지 유형의 벡터가 "플라스미드"이고, 이는 추가적인 DNA 분절들이 내부로 라이게이션될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 루프를 말한다. 또 다른 유형의 벡터는 추가적인 DNA 분절들이 바이러스성 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스성 벡터이다. 소정의 벡터들은 그들이 도입되는 숙주세포에서 자발적인 복제를 할 수 있다 (예로, 박테리아성 복제 원점을 가지는 박테리아 벡터들 및 에피좀 포유동물 벡터들). 다른 벡터들은 (예로, 비-에피좀 포유동물 벡터들) 숙주세포 내로 도입 시 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈와 함께 복제된다.

소정의 벡터들은 그들이 작동적으로 연결된 유전자들의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터들은 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터들" (또는 단순하게, "발현 벡터들")이라고 말한다. 일반적으로 재조합 DNA 기법들에서 유용한 발현 벡터들은 플라스미드들의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 보편적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 박테리아성 플라스미드들, YAC들, 코스미드들, 레트로바이러스, EBV-유래성 에피좀들, 및 당업자라면 본 발명의 항체들의 중쇄 및/또는 경쇄의 발현을 입증하기 위해 편리한 것으로 알려질 다른 벡터들 모두와 같은 이러한 형태들의 발현 벡터들을 포함하려고 의도된다. 당업자라면 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들이 서로 다른 벡터들 내로 또는 동일한 벡터에서 클론될 수 있는 것을 실현할 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드들은 동일한 벡터에 클론된다.

항체 사슬 유전자들 및 조절 서열들에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터들은 숙주 세포들에서 벡터의 복제를 조절하는 서열들 (예로, 복제 원점들) 및 선별가능한 마커 유전자들과 같은 추가적인 서열들을 보유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 내부로 도입되었던 숙주 세포들의 선별을 용이하게 한다 (예로, 미국 특허들 제 4,399,216호, 제 4,634.665호 및 제 5,179,017호 참조). 예를 들면, 전형적으로 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 내부로 도입되었던 숙주세포 상에서 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물들에 대한 저항성을 부여한다. 바람직한 선별가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭으로 dhfr- 숙주 세포들에서 사용을 위해) 및 네오 유전자 (G418 선별을 위해)를 포함한다. 이에 제한되는 것은 아니지만 tk, hgprt 또는 aprt 세포들에서 각각 메티오닌 설폭시마이드 (Adv Drug Del Rev, 58: 671, 2006, 및 론자사 (Lonza Group Ltd.)의 웹사이트 또는 문헌) 및 아데닌 포스포리보실전이효소 (Lowy et al., Cell 22: 817, 1980) 유전자들의 존재 시 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (Wigler et al., Cell 11: 223, 1977), 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 (Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48: 202, 1992), 글루타메이트 합성효소 선별을 포함하는, 많은 선별 시스템들이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한, 항대사물 저항성이 다음의 유전자들에 대한 선별의 기초로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr (Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 357, 1980); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072, 1981); 아미노글리코사이드, G-418에 대한 저항성을 부여하는 neo (Wu et al., Biotherapy 3: 87, 1991); 및 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro (Santerre et al., Gene 30: 147, 1984). 재조합 DNA 기술학의 기술분야에서 알려진 방법들이 원하는 재조합 클론을 선별하는 데 일상적으로 적용될 수 있고, 이러한 방법들은 예를 들면 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993)에 기술되어 있다. 항체의 발현 수준들은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다. 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭가능할 때, 배양액에 존재하는 저해제의 수준에서 증가는 마커 유전자의 사본들의 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 부위가 본 발명의 IgG 항체를 인코딩하는 유전자와 연관되기 때문에, 상기 항체의 생산도 역시 증가할 것이다 (Crouse et al., Mol Cell Biol 3: 257, 1983).

본 발명의 폴리뉴클레오타이드들 및 이들 분자들을 포함하는 벡터들은 적합한 포유동물 숙주세포, 또는 당업자에게 알려진 기타 다른 유형의 숙주세포에 사용될 수 있다. 용어 "재조합 숙주세포" (또는 단순하게 "숙주세포")는 본 명세서에서 사용되는 바, 재조합 발현 벡터가 내부로 도입되었던 세포를 말하려고 의도된다. 이러한 용어들은 특정한 개체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 말하려고 의도되는 것으로 이해되어야 한다. 소정의 변형들이 돌연변이 또는 환경적 영향들 둘 중 하나로 인해 다음 세대들에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에서 사용되는 바 용어 "숙주세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.

형질전환 (transformation)은 숙주세포 내로 폴리뉴클레오타이드들을 도입하는 임의의 기지의 방법에 의할 수 있다. 이러한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있고, 덱스트란-매개성 형질전환법, 칼슘 포스페이트 침전법, 폴리브렌-매개성 형질전환법 (polybrene-mediated transfection), 원형질 융합법 (protoplast fusion), 전기천공법 (electroporation), 리포좀들 내로 폴리뉴클레오타이드의 피막화, 바이오리스틱 주입법 (biolistic injection) 및 핵 내로 DNA의 직접적 미세주입법을 포함한다. 본 발명의 재조합 항체들을 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포들은 중국 햄스터 난소 (CHO 세포들), NS0 골수종 세포들, COS 세포들 및 SP2 세포들을 포함한다. 항체 유전자들을 인코딩하는 재조합 발현 벡터들이 포유동물 숙주 세포들 내로 도입될 때, 항체들은 숙주 세포들에서 항체의 발현 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포들이 성장하는 배양 배지 내로 항체의 분비를 허용하기에 충분한 시간의 기간 동안 숙주 세포들을 배양하여 생산된다.

항체들은 표준 단백질 정제 방법들을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 본 발명의 항체의 용해성 형태들은 배양 상청액으로부터 회수될 수 있다. 다음으로 이것은 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당해 기술분야에서 알려진 임의의 방법에 의해, 예를 들면 크로마토그래피 (예로, 이온 교환, 친화, 상세하게는 Fc에 대한 프로테인 A 친화에 의함 등), 원심분리, 차별적 용해도에 의해, 또는 단백질들의 정제를 위한 기타 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 적합한 정제의 방법들은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명자들은 CXCR4에게로 유도되는 인간 또는 인간화 항체가 상기 항체의 적어도 하나의 효과기 기능의 유도를 통하여 CXCR4-발현 암세포를 살상할 수 있는 점을 확인하였다.

"CXCR4-발현 암세포 (CXCR4-expressing cancer cell)"에 의하여, 이것은 본 명세서에서 정상적인 어른 세포 상의 CXCR4 발현 수준과 대비하여 높은 CXCR4 발현 수준을 보여주는 암의 세포를 말한다. 이러한 암들로는 (이에 제한되는 것은 아니지만) 다음을 포함한다: 방광, 유방, 결장, 두경부, 전립선, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상샘 및 피부의 암을 포함하고, 편평세포 암종을 포함하는 암종들 및 샘암종들; 다발성 골수종, 백혈병, 급성 및 만성 림프구성 (또는 림프성) 백혈병, 급성 및 만성 림프모세포성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 비-호지킨 림프종 (예로, 버킷 림프종)을 포함하는 림프 계열의 조혈성 종양들; 급성 및 만성 골수생성 (골수성 또는 골수세포성) 백혈병들, 및 전구골수세포성 백혈병을 포함하는 골수 계열의 조혈성 종양들; 섬유육종, 골육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양들; 별교아세포종, 신경모세포종, 교아종, 및 신경집종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양들; 그리고 흑색종, 기형암종, 색소성 건피증, 각질극세포종, 및 고환종을 포함하는, 기타 종양들, 또한 CXCR4가 발현되는 것으로 아직 결정되어야 할 다른 암들.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 CXCR4를 발현하는 암세포는 악성 혈액학적 세포로 구성된다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 CXCR4를 발현하는 암세포가 악성 혈액학적 세포로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 CXCR4를 발현하는 암세포가 악성 혈액학적 세포로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게, 상기 CXCR4 악성 혈액학적 세포는 림프종 세포, 백혈병 세포 또는 다발성 골수종 세포를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 CXCR4 악성 혈액학적 세포가 림프종 세포, 백혈병 세포 또는 다발성 골수종 세포를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 CXCR4 악성 혈액학적 세포가 림프종 세포, 백혈병 세포 또는 다발성 골수종 세포를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CXCR4 악성 혈액학적 세포는 림프종 세포로 구성된다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 CXCR4 악성 혈액학적 세포가 림프종 세포로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 CXCR4 악성 혈액학적 세포가 림프종 세포로 구성되는 것을 특징으로 한다.

상기에 언급된 바와 같이, 효과기 세포들 및/또는 보체 성분들은 본 발명을 위해 특히 흥미롭다.

본 발명의 방법의 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 효과기 세포들은 NK 세포들, 대식구들, 단핵구들, 호중성구들 또는 호산구들을 포함한다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 효과기 세포들이 NK 세포들, 대식구들, 단핵구들, 호중성구들 또는 호산구들을 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 효과기 세포들이 NK 세포들, 대식구들, 단핵구들, 호중성구들 또는 호산구들을 포함하는 것을 특징으로 한다.

다음의 예들을 기초로 하여, 본 발명들에서 사용되는 항체들의 특히 흥미로운 성질들이 기술된다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, RAMOS 림프종 세포들 상의 유도된 ADCC 수준은 4시간의 배양 기간 이후에 적어도 40%이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 RAMOS 림프종 세포들 상의 유도된 ADCC 수준이 4시간의 배양 기간 이후에 적어도 40%인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 RAMOS 림프종 세포들 상의 유도된 ADCC 수준이 4시간의 배양 기간 이후에 적어도 40%인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, DAUDI 림프종 세포들 상의 유도된 ADCC 수준은 4시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 DAUDI 림프종 세포들 상의 유도된 ADCC 수준은 4시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 DAUDI 림프종 세포들 상의 유도된 ADCC 수준은 4시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, HeLa 자궁경부암 세포들 상의 유도된 ADCC 수준은 4시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 HeLa 자궁경부암 세포들 상의 유도된 ADCC 수준은 4시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 HeLa 자궁경부암 세포들 상의 유도된 ADCC 수준은 4시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 특히 중요한 관점은 유도된 ADCC 및 CDC의 특이성에 의존한다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 유의한 ADCC는 NK 세포들 상에서 전혀 유도되지 않는다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 유의한 ADCC가 NK 세포들 상에서 전혀 유도되지 않는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 유의한 ADCC가 NK 세포들 상에서 전혀 유도되지 않는 것을 특징으로 한다.

보체 성분들은 적어도 C1q를 포함한다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 보체 성분들이 적어도 C1q를 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 보체 성분들이 적어도 C1q를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, RAMOS 림프종 세포들 상의 유도된 CDC 수준은 1시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게 적어도 50%, 가장 바람직하게 적어도 70%이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 RAMOS 림프종 세포들 상의 유도된 CDC 수준이 1시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게 적어도 50%, 가장 바람직하게 적어도 70%인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 RAMOS 림프종 세포들 상의 유도된 CDC 수준이 1시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게 적어도 50%, 가장 바람직하게 적어도 70%인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 보다 또 다른 바람직한 구현예에서, NIH3T3 CXCR4 세포들 상의 유도된 CDC 수준은 1시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게 적어도 50%, 가장 바람직하게 적어도 70%이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 NIH3T3 CXCR4 세포들 상의 유도된 CDC 수준이 1시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게 적어도 50%, 가장 바람직하게 적어도 70%인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 NIH3T3 CXCR4 세포들 상의 유도된 CDC 수준이 1시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게 적어도 50%, 가장 바람직하게 적어도 70%인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 보다 또 다른 바람직한 구현예에서, DAUDI 림프종 세포들 상의 유도된 CDC 수준은 1시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게 적어도 40%이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 DAUDI 림프종 세포들 상의 유도된 CDC 수준은 1시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게 적어도 40%인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 항체 또는 인간화 항체는 DAUDI 림프종 세포들 상의 유도된 CDC 수준은 1시간의 배양 기간 이후에 적어도 30%, 바람직하게 적어도 40%인 것을 특징으로 한다.

본 발명들의 항체의 ADCC 성질들의 의미에서, 결과들은 FcγR과 상기 항체의 결합을 고려하여 생성되었다.

본 발명의 또 다른 상세한 관점은 본 발명의 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편의 하나가 적어도 하나의 FcγR들을 결합할 수 있는 점에 관한 것이다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 FcγR들은 FcγRI이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 적어도 하나의 FcγR들이 FcγRI인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 적어도 하나의 FcγR들이 FcγRI인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 랑뮈르 (Langmuir) 모델에 따라 인간 Fc[감마]RI와 본 발명의 항체의 결합을 특징으로 하는 해리 상수 (K_D)는 1 및 10 nM 사이의 범위이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 랑뮈르 모델에 따라 인간 Fc[감마]RI와 본 발명의 항체의 결합을 특징으로 하는 해리 상수 (K_D)는 1 및 10 nM 사이의 범위인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 랑뮈르 모델에 따라 인간 Fc[감마]RI와 본 발명의 항체의 결합을 특징으로 하는 해리 상수 (K_D)는 1 및 10 nM 사이의 범위인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 FcγR들은 인간 FcγRⅢa이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 적어도 하나의 FcγR들이 인간 FcγRⅢa인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 적어도 하나의 FcγR들이 인간 FcγRⅢa인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법의 더욱 바람직한 구현예에서, 불균질 리간드 모델 (heterogeneous ligand model)에 따라 인간 FcγRⅢa와 본 발명의 항체의 결합을 특징으로 하는 해리 상수 (K_D)는 200 및 1,000 nM 사이의 범위이다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 불균질 리간드 모델에 따라 인간 FcγRⅢa와 본 발명의 항체의 결합을 특징으로 하는 해리 상수 (K_D)는 200 및 1,000 nM 사이의 범위인 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 불균질 리간드 모델에 따라 인간 FcγRⅢa와 본 발명의 항체의 결합을 특징으로 하는 해리 상수 (K_D)는 200 및 1,000 nM 사이의 범위인 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "K_D"는 특정한 항체/항원 상호작용의 해리 상수를 말한다. "결합 친화도"는 일반적으로 분자의 단일한 결합 부위 (예로, 항체) 및 그의 결합 파트너 (예로, 항원) 간의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 표시되지 않은 경우라면, 본 명세서에서 사용되는 바, "결합 친화도"는 결합쌍의 구성원들 (예로, 항체 및 항원) 간의 1 : 1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 말한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 K_P에 의해 나타낼 수 있다. 친화도는 본 명세서에서 기술된 것들을 포함하여 당해 기술분야에서 알려진 보편적인 방법들에 의해 측정될 수 있다. 낮은 친화도 항체들은 일반적으로 항원과 느리게 결합하고 바로 해리되는 경향이 있는 한편, 높은 친화도 항체들은 일반적으로 항원과 더 빨리 더 오래 결합되어 남는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법들이 당해 기술분야에서 알려져 있으며, 이들 모두는 본 발명의 목적들을 위해 사용될 수 있다.

바람직하게, 해리 상수는 랑뮈르 모델에 따라 계산된다.

랑뮈르 모델은 고전적으로 다음으로서 기술된다:

여기에서 A는 분석물이고, B는 리간드이고, AB는 분석물 및 리간드 간의 비공유 복합체이고, k_a 및 k_d는 각각 본 발명의 결합 및 해리 속도들이다.

동일한 방식으로 리간드가 두 개 성분들의 혼합물로서 고려되는 불균질 리간드 모델은 다음의 두 가지 공식 시스템들에 의해 기술된다:

여기에서 A는 분석물이고, B1은 리간드의 첫 번째 성분이고, AB1은 분석물 및 리간드의 첫 번째 성분 간의 비공유 복합체이고, k_a1 및 k_d1는 각각 본 발명의 결합 및 해리 속도들이고, B1은 리간드의 두 번째 성분이고, AB2는 분석물 및 리간드의 두 번째 성분 간의 비공유 복합체이고, k_a2 및 k_d2는 각각 본 발명의 결합 및 해리 속도들이다.

BIA 평가 (BIAevaluation) 버전 3.1 (Biacore AB)은 BIACORE 데이타의 처리에 사용되어 왔다.

마지막으로, 본 발명은 또한 CXCR4를 발현하는 암 세포들의 존재와 연관된 병리학적 병태를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 1, 2 및 3의 서열들의 3가지 CDR들을 가진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 4, 5 및 6의 서열들의 3가지 CDR들을 가지는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 유도되는, 방법에 관한 것이다.

다른 말로 하면, 본 발명은 CXCR4를 발현하는 암 세포들의 존재와 연관된 병리학적 병태의 치료를 위한 조성물을 제조하기 위한 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편의 용도로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 1, 2 및 3의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 유도되는, 용도에 관한 것이다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명은 CXCR4를 발현하는 암 세포들의 존재와 연관된 병리학적 병태를 치료하는 데 사용하기 위한, CXCR4를 특이적으로 인식하는 인간 또는 인간화 항체, 또는 CH2-포함 결합 단편으로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 1, 2 및 3의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 4, 5 및 6의 서열들을 각각 포함하는 CDR 부위들 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 유도되는, 항체에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명은 또한 CXCR4를 발현하는 암 세포들의 존재와 연관된 병리학적 병태를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 7 내지 10의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 11 내지 17의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 유도되는, 방법에 관한 것이다.

다른 말로 하면, 본 발명은 CXCR4를 발현하는 암 세포들의 존재와 연관된 병리학적 병태의 치료를 위한 조성물을 제조하기 위한, CXCR4를 특이적으로 인식하는 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편의 용도로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 7 내지 10의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 11 내지 17의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 유도되는, 용도에 관한 것이다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명은 CXCR4를 발현하는 암 세포들의 존재와 연관된 병리학적 병태를 치료하는 데 사용하기 위한, CXCR4를 특이적으로 인식하는 인간 또는 인간화 항체, 또는 CH2-포함 결합 단편으로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호들 7 내지 10의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호들 11 내지 17의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 유도되는, 항체에 관한 것이다.

단일클론 항체들은 각각의 중쇄의 불변 부위에서 N-당화되는 것으로 알려져 있다. 특이적 당화 변이체들은 ADCC에 영향을 주는 것으로 확인되어 왔다. 예를 들면, IgG1들의 더 낮은 퓨코실화가 증가된 ADCC와 상관된다 (Shields et al., J Biol Chem., 277(30): 26733-2640, 2002; Shinkawa et al., J Biol Chem., 278(5): 3466-3473, 2003).

갈락토스의 수준 및 CDC 활성 간의 유의한 상관성이 관찰되었다. 예를 들면, 리투시마브 (rituximab)의 CDC 활성은 감소하는 갈락토스 함량과 함께 감소된다 (Hodoniczky et al, Biotechnol Prog . , 21(6): 1644-1652, 2005)

ADCC 및 CDC 실험들에 사용된 hz515H7 Mab의 대표적인 당화 프로파일은 다음의 표 5에 나타나 있다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 Hz515H7 Mab는 그의 탄수화물 사슬들의 대략 92%가 퓨코스 잔기를 포함하더라도, CXCR4를 발현하는 세포들 상에서 높은 백분율의 ADCC 및 CDC를 유도한다.

따라서, 본 발명은 CXCR4를 발현하는 암 세포들을 살상하여 암을 치료하는 방법으로서, 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체는 다음과 같은 글리칸 프로파일을 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 유도되는, 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 CXCR4를 발현하는 암 세포들을 살상하는 것에 의한 암의 치료 방법에 사용하기 위한, CXCR4 결합하는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편으로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 다음과 같은 글리칸 프로파일을 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 유도되는, 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 CXCR4 결합하는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편의 용도로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 CXCR4를 발현하는 암 세포들을 살상하여 암을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해 다음과 같은 글리칸 프로파일을 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체의 적어도 하나의 효과기 기능은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 유도되는, 용도에 관한 것이다.

본 명세서의 실시예들에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편은 적어도 ADCC 및/또는 CDC 반응들의 유도를 통하여 항-종양 활성을 가지고, 이에 따라 전이성 종양들 및 암과 같은 질환들의 치료에 유용하다.

용어들 "치료하는 (treating)" 또는 "치료 (treatment)"는 통계학적으로 유의한 정도로 또는 당업자라면 검출가능한 정도로 장애와 연관된 병태, 증상 또는 매개변수를 개선하거나 장애의 진행 또는 악화를 (장애에 의해 유발된 이차적인 손상을 포함함) 예방하는 데 효과적인 양, 방식 및/또는 양식으로 본 명세서에서 기술된 조성물을 투여하는 것 또는 그의 투여를 말한다.

본 발명의 또 다른 관점은 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편의 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 담체 및 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편에 추가하여, 다양한 희석제들, 충전제들, 염들, 완충용액들, 안정화제들, 용해제들, 및 당해 기술분야에서 잘 알려진 기타 물질들을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매들, 완충용액들, 염 용액들, 분산 배지들, 코팅제들, 항박테리아성 및 항곰팡이성 제제들, 등장성 및 흡수 지연 제제들 등을 포함한다. 담체의 유형은 의도된 투여의 경로를 기초로 하여 선택될 수 있다. 다양한 구현예들에서, 담체는 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소적, 피부내 또는 경구적 투여에 적합하다. 약제학적으로 허용가능한 담체들은 무균의 수용성 용액들 또는 분산제들 및 무균의 주사가능한 용액들 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 무균의 분말들을 포함한다. 약제학적으로 활성을 가진 물질들을 위한 배지들 및 제제들의 용도는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 하기 본 명세서에서 상술된 바와 같이, 추가적인 활성을 가진 화합물들은 또한 항-암 및/또는 항-조혈 제제들과 같은 조성물들 내로 통합될 수 있다; 상세하게, 추가적인 활성을 가진 화합물은 항-조혈제, 화학치료제 또는 저-분자량 제제일 수 있다. 정맥내 주입을 위한 전형적인 약제학적 조성물은 250 mL의 무균의 링거 용액 및 100 mg의 조합을 포함하도록 만들어질 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 화합물들을 제조하는 실제적인 방법들은 당업자들에게 자명한 것으로 알려져 있을 것이고, 예를 들면 레밍턴의 약제학적 과학 (Remington's Pharmaceutical Science), 제 17판., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), 그리고 그의 제 18판 및 제 19판에서 더욱 자세하게 기술되고, 이들은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

조성물에서 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편은 바람직하게 유효량으로 제형화된다. "유효량"은 종양 세포들에서 세포사멸의 유도와 같은 원하는 결과를 달성하도록 필요한 기간 동안 용량들에서 효과적인 양을 말한다. "치료적 유효량"은 특정한 질환 상태의 치료적 경과에 영향을 주기에 충분한 양을 의미한다. 치료적 유효량은 또한 제제의 임의 독성 또는 해로운 효과들이 치료적으로 유익한 효과들에 의해 상쇄되는 양이다.

치료적 적용들을 위해, 본 발명의 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편은, 정맥내 볼루스로서 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 동맥내, 활액내, 경막내, 경구적, 국소적 또는 흡입 경로들에 의한 일정 기간 동안 계속적 주입에 의해 인간에게 투여될 수 있는 것들을 포함하는 상기에 논의된 것들과 같은 약제학적으로 허용가능한 용량으로 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 상기 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편은 또한 국부적 뿐만 아니라 전신적 치료 효과들을 나타내도록 종양내, 종양주변, 병변내 또는 병변주변 경로들에 의해 적합하게 투여된다. 복강내 경로는 예를 들면 난소 종양들의 치료에서 특히 유용할 것으로 기대된다.

용량 섭생들은 최적의 반응을 제공하도록 적응될 수 있다. 예를 들면, 단일한 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 번 분할된 용량들이 시간을 두고 투여될 수 있거나, 용량이 비율적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 본 발명의 조성물들은 개체에서 세포 성장 활성에 효과를 미치도록 개체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "개체"는 세포사멸이 유도될 수 있는 살아있는 유기체들을 포함하려고 의도되고, 상세하게는 토끼들, 개들, 고양이들, 마우스들, 래트들, 원숭이, 그들의 형질전환 종들, 바람직하게는 인간들과 같은 포유동물들을 포함한다.

본 발명의 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편, 및 본 발명의 약제학적 조성물들은, (이에 제한되는 것은 아니지만) 방광, 유방, 결장, 두경부, 전립선, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상샘 및 피부의 암을 포함하고, 편평세포 암종을 포함하는 암종들 및 샘암종들; 다발성 골수종, 백혈병, 급성 및 만성 림프구성 (또는 림프성) 백혈병, 급성 및 만성 림프모세포성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 비-호지킨 림프종 (예로, 버킷 림프종)을 포함하는 림프 계열의 조혈성 종양들; 급성 및 만성 골수생성 (골수성 또는 골수세포성) 백혈병들, 및 전구골수세포성 백혈병을 포함하는 골수 계열의 조혈성 종양들; 섬유육종, 골육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양들; 별교아세포종, 신경모세포종, 교아종, 및 신경집종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양들; 그리고 흑색종, 기형암종, 색소성 건피증, 각질극세포종, 및 고환종을 포함하는, 기타 종양들, 또한 CXCR4가 발현되는 것으로 아직 결정되어야 할 다른 암들을 포함하는 여러 유형들의 암들의 치료 또는 예방에 특히 유용하다. CXCR4 발현을 가지는 암들에 의하여, 이것은 본 명세서에서 정상적인 어른 세포 상의 CXCR4 발현 수준과 대비하여 높은 CXCR4 발현을 보여주는 암들을 말한다.

본 발명의 인간 또는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편, 및 본 발명의 약제학적 조성물들은 본 발명의 항-CXCR4 항체들이 독특한 작용 기작을 가지기 때문에 백혈병, 림프종 및 보편적으로 사용되는 항암 제제들에 대한 저항성을 가진 암들을 위해 주로 유용하다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 CXCR4를 발현하는 암 세포들의 존재와 연관된 병리학적 병태는 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종, 바람직하게 림프종으로 구성된다.

다른 말로 하면, 본 발명에 따른 용도는 상기 CXCR4를 발현하는 암 세포들의 존재와 연관된 병리학적 병태가 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종, 바람직하게 림프종으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

보다 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 인간 또는 인간화 항체는 상기 CXCR4를 발현하는 암 세포들의 존재와 연관된 병리학적 병태가 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종, 바람직하게 림프종으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

비제한적인 예로서, 개체에서 CXCR4를 발현하는 종양의 존재 및/또는 위치를 시험관내 검출하는 방법은

(a) 개체로부터 얻은 시료를 CXCR4와 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 항체 중쇄 및/또는 인간화 항체 경쇄 및/또는 인간화 항체, 또는 그들의 유래한 화합물 또는 기능적 단편과 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 시료와 상기 항체의 결합을 검출하는 단계:

를 포함한다.

상세하게는, 개체로부터 얻은 CXCR4를 발현하는 종양에서 CXCR4의 발현 수준을 시험관내 또는 생체외에서 결정하는 방법은

(b) 상기 시료에서 CXCR4와 결합하는 항체의 수준을 정량하는 단계:

를 포함한다.

바람직한 구현예에서, CXCR4 발현 수준은 면역조직화학법 (IHC) 또는 FACS 분석에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 " CXCR4의 발현과 연관된 종양원성 장애" 또는 "CXCR4-발현 암 세포들"은 장애로 고생하는 개체에서 CXCR4의 높은 수준들 또는 비정상적으로 낮은 수준들의 존재 (이상적)가 장애의 병리생리학을 부여하거나 장애의 악화에 기여하는 요인이거나 요인인 것으로 의심되도록 확인되었던 질환들 및 다른 장애들을 포함하려고 의도된다. 대안적으로, 이러한 장애들은 예를 들면 장애로 고생하는 개체의 침범된 세포들 또는 조직들의 세포 표면 상에서 CXCR4의 순준들의 증가에 의해 입증될 수 있다. CXCR4 수준들의 증가는 예를 들면 본 발명의 항체 515H7 또는 hz515H7을 사용하여 검출될 수 있다. 보다 상세하게, 이것은 상대적으로 자발적인 성장을 나타내어, 그들이 세포 성장의 조절의 유의한 상실을 특징으로 하는 이상적 성장 표현형을 나타내는 세포들을 말한다. 대안적으로, 세포들은 정상적인 수준들의 CXCR4를 발현할 수 있지만, 비정상적 증식에 의해 표시된다.

본 발명은 또한 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시, 적어도 하나의 효과기 기능의 유도에 의해 CXCR4를 발현하는 암 세포들을 살상하는 데 사용하기 위한, CXCR4와 결합하는 인간화 항체들, 또는 그들의 CH2-포함 결합 단편들을 검색하는 방법으로서, 상기 방법은

- 4시간의 배양 기간 이후에, 적어도 40%의 RAMOS 림프종 세포들 상에서 ADCC 수준을 유도하는 항체들을 선별하는 단계;

- 1시간의 배양 기간 이후에, 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 70%의 RAMOS 림프종 세포들의 상에서 ADCC 수준을 유도하는 항체들을 선별하는 단계;

- 1시간의 배양 기간 이후에, 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 70%의 NIH3T3 CXCR4 세포들의 상에서 CDC 수준을 유도하는 항체들을 선별하는 단계;

- 랑뮈르 모델에 따라, 1 및 10 nM 사이 범위의 해리 상수 (KD)로 FcγR과 결합하는 항체들을 선별하는 단계;

- 불균질 리간드 모델에 따라, 200 및 1000 nM 사이 범위의 해리 상수 (KD)로 상기 FcγRⅢA와 결합하는 항체들을 선별하는 단계:

로부터 선택되는 적어도 하나의 선별 단계를 포함하는, 방법을 기술하고 있다.

본 발명의 관행은 달리 다른 것을 표시하지 않은 경우라면, 당해 기술분야 내에 속하는 통상적인 기법들 또는 단백질 화학, 분자 바이러스학, 미생물학, 재조합 DNA 기술학, 및 약학을 채용하고 있다. 이러한 기법들은 문헌에서 전적으로 설명된다. (Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology, Eds., John Wiley & Sons, Inc. New York, 1995; Remingtong's Pharmaceutical Sciences, 제 17판., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985; 및 Sambrook et al ., Molecular cloning: A laboratory manual 제 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989; Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol Ⅱ 1976 CRC Press; Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999) 참조). 본 명세서에서 기술된 분자 및 세포생물학, 단백질 생화학, 효소학 그리고 의학 및 약제학적 화학과 연결되어 사용되는 명명법들 그리고 이들의 연구실 절차들 및 기법들은 잘 알려진 것들이고 당해 기술분야에서 보편적으로 사용된다.

달리 정의되지 않은 경우라면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술학적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 보편적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 다른 특징들 및 장점들은 실시예들 및 간단한 설명들이 하기에 나타난 도면들과 함께 상세한 설명에서 더 명확해진다.
도 1은 인간 배아계열 IGHV3-49*04 및 IGHJ4*01과 515H7 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열들 정렬을 나타낸 것이다. 515H7 VH 아미노산 서열은 선택된 인간 수여자 구조틀 서열들과 정렬된다. VH1 및 VH2 (VH3는 나타내지 않음) 서열들은 역 돌연변이된 잔기들을 굵게 표시한 515H7 VH 도메인의 제작된 인간화 변이체들에 해당한다. 변이체 1 VH1은 역 돌연변이된 잔기를 전혀 보유하지 않고 전적인 인간 변이체를 재연한다. 변이체 VH2는 8개 역 돌연변이들을 가지고 가장 마우스 변이체이다. 변이체 VH3는 5개 역 돌연변이들을 보유한다 (재연되지 않음).
도 2는 인간 배아계열 IGKV4-1*01 및 IGKJ1*01과 515H7 경쇄의 아미노산 서열들 정렬을 나타낸 것이다. 515H7 VL 아미노산 서열은 선택된 인간 수여자 구조틀 서열들과 정렬된다. VL1 내지 VL3 서열들은 역 돌연변이된 잔기들을 굵게 표시한 515H7 VL 도메인의 제작된 인간화 변이체들에 해당한다. 변이체 1 VL1은 역 돌연변이된 잔기를 전혀 보유하지 않고 가장 인간 변이체를 재연한다. 변이체 VL2는 13개 역 돌연변이들을 가지고 가장 마우스 변이체이다. 변이체 VL3는 5개 역 돌연변이들을 보유한다.
도 3A 내지 도 3F는 키메라 515H7 및 인간화 515H7의 서로 다른 변이체들에 의한 바이오틴화된 마우스 항체 515H7의 교차 차단을 나타낸 것이다. 부모 마우스 항체 515H7를 교차 차단하는 515H7의 인간화 변이체들 (hz515H7)의 활성은 CXCR4 형질전환된 NIH3T3 세포들을 사용한 유동 세포측정법에 의해 평가되었다. 인간화 변이체들의 활성은 키메라 515H7와 비교되었다. 키메라 VL (cVL)과 조합된 VH (VH1 내지 VH3)의 3개 서로 다른 변이체들의 교차 차단 활성은 매우 유사하였다 (도 3A 내지 도 3C). VH 변이체 1 (VH1, 역 돌연변이가 없는 변이체)의 활성에서 감소는 VL의 변이체 1 및 2와 조합될 때 전혀 결정되지 않았다. 활성의 유의한 감소가 제작물 hz515H7 VH1 VL3의 경우 검출되었다 (도 3D 내지 도 3F).
도 4는 인간화 항체 515H7 VH1 VL1의 활성을 테스트하는 BRET 검정법을 나타낸 것이다. 인간화 변이체 515H7 VH 변이체 1 VL 변이체 1 (hz515H7 VH1 VL1)의 활성은 SDF-1 매개성 신호 전달을 저해하는 그의 능력에 의해 평가되었다. 본 변이체는 BRET에 의해 결정된 바와 같이 SDF-1 매개성 신호 전달의 단지 소수의 저해를 나타내었다. SDF-1은 100 nM의 농도에서 사용되었다.
도 5A 내지 도 5D는 hz151H7 VH1 D76N과 VH1의 서로 다른 돌연변이들을 가진 VH1의 서로 다른 돌연변이체들 및 서로 다른 VL 변이체들의 조합들의 비교를 나타낸 것이다. 단일 및 이중 역 돌연변이체들은 VH1에서 만들어졌고 VL1과 조합되었다. 이들 제작물들은 BRET 검정법들로 평가되었다 (도 5A 내지 도 5C). 이들 단일한 역 돌연변이체들 중에서 역 돌연변이 D76N을 가진 제작물만이 SDF-1 매개성 신호 전달의 증가된 저해를 나타내었다. VH에서 이중 역 돌연변이체는 전혀 강한 저해 활성을 가지지 않았다 (도 5C). VH1의 단일한 역 돌연변이체 D76N은 VL의 서로 다른 변이체들과 조합되었다. SDF-1 농도는 100 nM이었다.
도 6은 제작물 VH1 D76N VL2와 비교하여 단일 또는 이중 역 돌연변이체들을 가진 VH1 및 VL1의 서로 다른 돌연변이체들의 순위 매김을 나타낸 것이다. 단일 및 이중 역 돌연변이체들은 VH1에서 만들어졌고 VL1과 조합되었다. 모든 제작물들은 BRET 검정법들로 평가되었고 그들의 저해 백분율이 계산되었다. SDF-1 농도는 100 nM이었다.
도 7A 내지 도 7B는 인간화 515H7의 서로 다른 제작물들에 의한 SDF-1 결합의 저해 그리고 FACS 및 BRET에 의해 획득된 결과 간의 상관성을 나타낸 것이다. β-아레스틴의 채용을 차단하는 강한 활성을 가진 인간화 항체 515H7의 서로 다른 변이체들은 유동 세포측정법 (FACS)으로 바이오틴화된 SDF-1의 결합하는 저해하는 그들의 능력이 테스트되었다 (FACS) (A). 이들은 VH1 및 VL1로 비교되었다. FACS-기초 검정법으로부터 얻은 결과들은 BRET에 의해 획득된 결과들과 상관된다 (B).
도 8은 hz515H7 VL2 및 더 인간화된 버전들 515H7 VL2.1, 515H7 VL2.2 및 515H7 VL2.3의 아미노산 서열 정렬을 나타낸 것이다. 515H7 VL 아미노산 서열은 선택된 인간 수여자 구조틀 서열과 정렬된다. VL2.1, VL2.2 및 VL2.3 서열들은 역 돌연변이된 잔기들을 굵게 표시한 인간화 515H7 VL2의 제작된 인간화 변이체들에 해당한다. VL2.1 및 VL2.2는 4개 이상의 인간화 잔기들을 보유하는 한편, VL2.3는 5개 이상의 인간 잔기들을 포함한다.
도 9A 내지 도 9C는 NIH3T3-CXCR4 (도 9A), U937 (도 9B) 및 Ramos 세포들 (도 9C) 상에서 CXCR4와 특이적으로 결합하는 515H7 인간화 Mab들 (hz515H7 VH1 D76N VL2, hz515H7 VH1 D76N VL2.1, hz515H7 VH1 D76N VL2.2 및 hz515H7 VH1 D76N VL2.3)를 나타낸 것이다.
도 10은 CXCR4를 발현하는 세포들, Ramos 세포들 (도 10A) 및 자연 킬러 세포들 (NK) (도 10B) 상에 미치는 hz515H7VH1D76NVL2 Mab의 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)의 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 CXCR4를 발현하는 세포들, Ramos 세포들 (도 11A) 및 자연 킬러 세포들 (NK) (도 11B) 상에 미치는 c515H7 Mab의 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)의 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 NIH3T3-CXCR4 세포주 및 CXCR4를 발현하는 Ramos 세포들 상에 미치는 hz515H7VH1D76NVL2 Mab의 보체 의존성 세포독성 (CDC)의 효과를 나타낸 것이다.
도 13은 CXCR4를 발현하는 Ramos 세포들 상에 미치는 c515H7 Mab의 보체 의존성 세포독성 (CDC)의 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 CXCR4를 발현하는 Ramos 세포들 상에 미치는 hz515H7VH1D76NVL2 (도 14A) 및 c151H7 (도 14B) Mab들의 보체 의존성 세포독성 (CDC)의 용량 효과를 나타낸 것이다.
도 15는 CM4 센서칩 상에 고정화된 hz515H7VH1D76NVL2 Mab와 재조합 인간 FcγRI의 결합을 나타낸 것이다. 6가지 서로 다른 농도들의 h-FcγRI가 테스트되었다 (200, 100, 50, 25, 12.5 및 6.25 nM).
도 16은 CM4 센서칩 상에 고정화된 hz515H7VH1D76NVL2 Mab와 재조합 인간 FcγRⅢA의 결합을 나타낸 것이다. 5가지 서로 다른 농도들의 h-FcγRⅢA가 테스트되었다 (1000, 500, 250, 125 및 62.5 nM).
도 17은 결합 단계의 말단에서 반응 대비 인간 h-FcγRⅢA 농도들 (1000, 500, 250, 125 및 62.5 nM) 좌표를 사용하는 안정된-상태 분석에 의한 h-FcγRⅢA/hz515H7VH1D76NVL2 복합체의 해리 상수의 결정을 나타낸 것이다.
도 18은 CM4 센서칩 상에 고정화된 hz515H7VH1D76NVL2 Mab와 재조합 마우스 FcγRI의 결합을 나타낸 것이다. 5가지 서로 다른 농도들의 m-FcγRI가 테스트되었다 (400, 200, 100, 50, 및 25 nM).
도 19는 결합 단계의 말단에서 반응 대비 마우스 FcγRI 농도들 (400, 200, 100, 50, 및 25 nM) 좌표를 사용하는 안정된-상태 분석에 의한 m-FcγRI/hz515H7VH1D76NVL2 복합체의 해리 상수의 결정을 나타낸 것이다.
도 20은 CM4 센서칩 상에 고정화된 hz515H7VH1D76NVL2 Mab와 재조합 마우스 FcγRⅢ의 결합을 나타낸 것이다. 5가지 서로 다른 농도들의 m-FcγRⅢ가 테스트되었다 (400, 200, 100, 50, 및 25 nM).
도 21은 hz515H7VH1D76NVL2 Mab/Fc 감마 수용체 복합체들의 반감기 (분)의 함수로 해리 상수 (나모몰라) 좌표 상에서 hz-515H7VH1D76NVL2 Mab (h-FcγRI 및 m-FcγRⅢ를 가진 하나의 성분 및 h-FcγRⅢA 및 m-FcγRI를 가진 2개 성분들)과 결합하는 4개의 Fc 감마 수용체들의 순위 매김을 나타낸 것이다.
도 22는 CM4 센서칩 상에 고정화된 c515H7 Mab와 재조합 인간 FcγRI의 결합을 나타낸 것이다. 6가지 서로 다른 농도들의 h-FcγRI가 테스트되었다 (200, 100, 50, 25, 12.5 및 6.25 nM).
도 23은 CM4 센서칩 상에 고정화된 c515H7 Mab와 재조합 인간 FcγRⅢA의 결합을 나타낸 것이다. 5가지 서로 다른 농도들의 h-FcγRⅢA가 테스트되었다 (1000, 500, 250, 125 및 62.5 nM).
도 24는 결합 단계의 말단에서 반응 대비 인간 h-FcγRⅢA 농도들 (1000, 500, 250, 125 및 62.5 nM) 좌표를 사용하는 안정된-상태 분석에 의한 h-FcγRⅢA /c515H7 복합체의 해리 상수의 결정을 나타낸 것이다.
도 25는 CM4 센서칩 상에 고정화된 c515H7 Mab와 재조합 마우스 FcγRI의 결합을 나타낸 것이다. 5가지 서로 다른 농도들의 m-FcγRI가 테스트되었다 (400, 200, 100, 50, 및 25 nM).
도 26은 결합 단계의 말단에서 반응 대비 마우스 h-FcγRI 농도들 (400, 200, 100, 50 및 25 nM) 좌표를 사용하는 안정된-상태 분석에 의한 m-FcγRI/c515H7 복합체의 해리 상수의 결정을 나타낸 것이다.
도 27은 CM4 센서칩 상에 고정화된 c515H7 Mab와 재조합 마우스 FcγRⅢ의 결합을 나타낸 것이다. 5가지 서로 다른 농도들의 m-FcγRⅢ가 테스트되었다 (400, 200, 100, 50, 및 25 nM).
도 28은 c515H7 Mab/Fc 감마 수용체 복합체들의 반감기 (분)의 함수로 해리 상수 (나모몰라) 좌표 상에서 c515H7 Mab (h-FcγRI 및 m-FcγRⅢ를 가진 하나의 성분 및 h-FcγRⅢA 및 m-FcγRI를 가진 2개 성분들)과 결합하는 4개의 Fc 감마 수용체들의 순위 매김을 나타낸 것이다.
도 29는 CXCR4를 발현하는 세포들: RAMOS, DAUDI 및 HeLa 세포들 상에 미치는 hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7) Mab의 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 효과를 나타낸 것이다.
도 30은 CXCR4를 발현하는 세포들: DAUDI 및 RAMOS 세포들 상에 미치는 hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7) Mab의 보체 의존성 세포독성 (CDC) 효과를 나타낸 것이다.

실시예 1: 인간 CXCR4 에 대한 단일클론 항체 ( Mab 들)의 생성

CXCR4에 대한 단일클론 항체를 생성하기 위하여, Balb/c 마우스가 재조합 NIH3T3-CXCR4 세포 및/또는 CXCR4 세포외 N-말단 및 루프들에 해당하는 펩타이드들로 면역화되었다. 첫 번째 면역화 시 6 내지 16주령이 된 마우스가 완전 프런드 아쥬반트에 녹인 항원으로 한 번 피하로 (s.c.) 면역접종되었고, 이어서 불완전 프런드 아쥬반트에 녹인 항원으로 피하로 2 내지 6번 면역접종었다. 면역 반응은 안와후방 채혈에 의해 감시되었다. 혈청은 엘라이자 (ELISA)에 의해 검색되었고 (하기 기술된 바와 같음) 더 높은 역가들의 항-CXCR4 항체를 가진 마우스가 융합들에 사용되었다. 마우스는 희생시켜서 비장 제거하기 이틀 전에 항원으로 정맥내 추가접종 (boost)되었다.

- 엘라이자 ( ELISA )

항-CXCR4 항체들을 생산하는 마우스를 선별하기 위하여, 면역화된 마우스로부터 얻은 혈청이 엘라이자에 의해 테스트되었다. 간략하게, 마이크로타이터 플레이트들은 BSA와 결합된 정제된 [1-41] N-말단 펩타이드를 사용하여 5 μg의 동등한 펩타이드/mL 농도로 코팅되었고, 100 μL/웰로 4℃에서 밤샘 배양된 다음, 250 μL/웰 농도의 PBS에 녹인 0.5% 젤라틴으로 블록킹 되었다. CXCR4-면역화된 마우스로부터 나온 혈장의 희석액들이 각각의 웰에 첨가되었고 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 플레이트들은 PBS로 세척된 다음 HRP와 결합된 염소 항-마우스 IgG 항체 (잭슨 연구소)와 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 세척 이후에, 플레이트들은 TMB 기질로 현상되었고, 반응은 5분 경과시 100 μL/웰의 1 M H₂SO₄의 첨가에 의해 정지되었다. 가장 높은 역가들의 항-CXCR4 항체를 가진 마우스가 항체 생성을 위해 사용되었다.

- CXCR4 에 대한 Mab 들을 생산하는 하이브리도마들의 생성

가장 높은 역가들의 항-CXCR4 항체를 발생시켰던 Balb/c 마우스로부터 분리된 마우스 비장세포들이 PEG로 마우스 골수종 세포주 Sp2/O와 융합되었다. 세포들은 마이크로타이터 플레이트들에서 대략 1 x 10⁵개/웰 농도로 도말되었고, 이어서 2주 동안 울트라 배양 배지 + 2 mM L-글루타민 + 1 mM 소듐 피루베이트 + 1 x HAT을 포함하는 선별 배지에서 배양되었다. 다음으로, 웰은 항-CXCR4 단일클론 IgG 항체들에 대해 엘라이자에 의해 검색되었다. 다음으로 하이브리도마들을 분비하는 항체는 희석을 제한하여 적어도 두 번 서브클론 되었고 심화 분석법을 위해 항체를 생성하도록 시험관내에서 배양되었다.

실시예 2: FACS 분석법에 의한 항- CXCR4 Mab 515 H7 결합 특이성 및 암 세포주들 인식의 특징 분석

본 실험에서는, 항-CXCR4 Mab 515H7의 인간 CXCR4와의 특이적 결합이 FACS 분석법에 의해 조사되었다.

NIH-3T3, NIH3T3-hCXCR4 형질전환된 세포, MDA-MB-231, HeLa 및 U937 암 세포주가 10 μg/mL의 단일클론 항체 515H7와 함께 배양되었다. 다음으로 세포들은 1% BSA/PBS/0.01% NaN₃로 세척되었다. 이후, 알렉사-표지된 이차 항체들이 세포들에 첨가되었고 4℃에서 20분 동안 배양되도록 허용되었다. 다음으로 세포들은 다시 두 번 세척되었다. 두 번째 세척에 이어서, FACS 분석법이 수행되었다. 이들 결합 연구들의 결과들은 다음의 표 6에 제공되고, 이는 항-CXCR4 Mab 515H7가 인간 CXCR4-NIH3T3 형질전환된 세포주과 특이적으로 결합된 반면 부모 NIH3T3 세포들 상에서는 전혀 인식이 없는 점을 [FACS에 의해 획득된 평균 형광 강도 (MFI)]로 보여준다. 또한 본 Mab는 인간 암 세포주들, 예를 들면 MDA-MB-231 유방암 세포, U937 전구골수암 세포들 및 HeLa 자궁경부암 세포들을 인식할 수 있었다.

항-CXCR4 Mab 515H7는 NIH3T3-hCXCR4 형질전환체를 인식하였던 반면 부모 NIH3T3 야생형 세포들의 인식은 전혀 없었다. Mab 515H7는 또한 암 세포주들도 인식할 수 있었다.

실시예 3: 515 H7 항- CXCR4 마우스 항체의 인간화

- 일반적인 절차

515H7 항-CXCR4 마우스 항체의 인간화는 CDR-이식 (CDR-grafting)의 보편적 규칙들을 적용하여 수행되었다. CDR 및 구조틀 (FR) 부위들의 면역유전적적 분석 및 정의는 독특한 IMGT 번호매김 설계뿐만 아니라 IMGT 라이브러리들 및 도구들을 적용하여 수행되었다 (Lefranc, 1997- www.imgt.org).

인간화 공정의 효율은 β-아레스틴의 SDF-1-매개성 채용을 저해하는 그들의 능력을 위해 조작된 항체들의 기능적 활성을 생물발광 공명 에너지 전이 (BRET) 검정법에 의해 테스트하여 평가되었다. 본 검정법에서 CXCR4는 루시페라제로 또한 β-아레스틴은 YFP로 태그 표지되었다. CXCR4와 β-아레스틴의 SDF1-매개성 채용은 CXCR4의 신호 전달에서 중요한 단계이다. 515H7의 인간화 변이체들의 결합도 역시 인간 CXCR4로 안정하게 형질전환된 NIH3T3 세포주 상에서 결정되었다. 결합 활성은 바이오틴화된 마우스 항체로의 경쟁 분석법에 의해 평가되었다. 두 번째 시도에서, 인간화 항체들은 RAMOS 세포들과 바이오틴화된 SDF-1의 결합을 저해하는 그들의 능력에 대해 평가되었다. RAMOS 세포들은 CXCR4의 높은 발현 및 CXCR7과 SDF-1의 낮은 발현 때문에 선택되었다.

이들 검정법들은 항-CXCR4 항체들의 재조합 인간화 버전들을 특징 분석하는 데 사용되었다. 가변 도메인들은 IgG1/k 불변 도메인들으로 포맷되었고 포유동물 발현 벡터 pCEP 내로 클론되었다. 재조합 IgG1/κ-유래 항체들은 HEK293 세포들에서 일시적으로 발현되었다. 발현 배양 상청액은 여과되었으며 항체들은 프로테인 A 세파로스를 사용하여 정제되었다. 정제된 항체들은 PBS로 재완충되었으며 항체 농도들은 엘라이자에 의해 결정되었다.

- 515 H7 가변 도메인들의 인간화

CDR 이식을 위한 적당한 인간 배아계열을 선별하기 위하여, 515H7 VH 마우스 서열과 가장 높은 상동성을 가지는 인간 배아계열 유전자가 확인되었다. IMGT 데이타베이스들 및 도구들의 도움을 받아, 인간 IGHV3-49*04 배아계열 유전자 및 인간 IGHJ4*01 J 배아계열 유전자가 마우스 515H7 VH CDR들을 위한 인간 수여자 서열들로서 선택되었다. 인간 V-유전자 IGHV3-49*04는 마우스 515H7 중쇄의 가변 도메인의 V-유전자와 80.27%의 상동성을 가진다. 인간 J-유전자 IGHJ4*01 J에 대한 상동성은 87.50%이다. 19개의 잔기들이 선택된 인간 배아계열 유전자들 및 마우스 항체 515H7의 VH 도메인 간에 서로 다르다. 부모 항체의 VH 도메인 및 배아계열 서열들 간의 정렬은 도 1에 나타나 있다.

경쇄의 가변 도메인에 관하여, 인간 배아계열 유전자들 IGKV4-1*01 및 IGKJ1*01이 선택되었다 (도 2). 인간 V-유전자 IGKV4-1*01와의 상동성은 79.12%이다. 경쇄의 515H7 J-유전자는 인간 J-유전자 IGKJ1*01와 84.85%의 상동성을 가진다.

해독된 인간 배아계열 유전자들 IGHV3-49*04 및 IGKV4-1*01의 아미노산 서열은 결정화되었던 동종유래 항체들을 확인하는 데 사용되었다. 중쇄의 경우 RCSB 단백질 데이타은행 (RCSB Protein Data Bank)에서 기탁번호 1MAM를 가진 항체가 모델로서 선택된 한편, 경쇄의 경우는 1SBS가 선택되었다. 2개의 도메인들이 컴퓨터 프로그램 DS 비주얼 (DS visual)을 사용하여 조립되었고 인간화 항체 515H7를 위한 모델로서 사용되었다.

부모 항체 및 해당하는 인간 배아계열 서열 간에 서로 다른 각각의 잔기의 위치를 기초로 하여, 우선도의 순위매김 순서가 인간 및 마우스 서열들 간에 서로 다른 각각의 잔기에 주어졌다 (도 1 및 도 2). 이들 우선도들은 각각 VHl, VH2 및 VH3라고 명명되는 각각의 인간화 가변 도메인들의 3가지 서로 다른 변이체들을 만드는 데 사용되었다.

첫 번째 일련의 실험들에서, 우리는 3가지의 첫 번째 인간화 변이체들을 제작하였고 그들의 항-CXCR4 결합 활성들을 분석하였다. VH 변형체 1 (VH1)은 마우스 VL과 조합되었고 이들 제작물들은 바이오틴화된 마우스 515H7 부모 항체의 결합을 저해하는 그들의 능력으로 평가되었다. 모든 제작물들은 마우스 항체과 경쟁하는 유사한 능력을 보여주었다 (도 3A 내지 도 3C). 이것은 가장 인간 VH 변이체가 인간과 덜 가까운 변이체들과 동일한 결합 능력을 가지는 점을 가리킨다. 따라서, VH1은 VL의 3가지 서로 다른 변이체들과 조합되었다 (도 3D 내지 도 3F). 단지 VHl 및 VL3의 조합만이 바이오틴화된 마우스 항체와 경쟁하는 감소된 능력을 보여주었던 한편, 구조틀 상에서 역 돌연변이들을 전혀 보유하지 않는 가장 인간과 가까운 변이체 VHl VLl은 키메라 항체와 동일한 교차 차단 활성을 보여주었다.

이러한 변이체 VHl VLl은 또한 BRET 검정법들에서 β-아레스틴의 SDF-1 매개성 채용을 저해하는 그의 능력에 대해 테스트되었다 (도 4). 부모 항체의 교차 차단에 의해 결정된 바와 같이 수용체와의 기대가능한 결합 활성에도 불구하고, 제작물 VHl VLl는 β-아레스틴의 채용의 약한 저해만을 보여주었다. 이러한 강한 저해적 활성의 결여는 필요한 마우스 잔기들로 인간 구조틀 잔기들의 치환을 만들어낸다. 단일한 역 돌연변이들이 VH1을 위해 제작되었다. 다음의 잔기들이 치환되었다: V48L, E61D, D76N 및 A81L (일차 아미노산 서열에 따른 번호매김). 변이체 VH1의 이들 단일 역 돌연변이체들은 변이체 VL1과 조합되었다. 이들 중에서 역 돌연변이 D76N만이 BRET 검정법에 의해 평가되는 바와 같은 신호 전달의 증가된 저해를 유도하였다 (도 5B).

본 제작물의 활성을 증가시키고 또한 다른 잔기들의 중요성을 평가하기 위하여, 서로 다른 이중 역 돌연변이체들이 VH1을 위해 제작되었다. 이들 제작물들의 저해적 활성은 약간 개선되었지만 (약 40 내지 50%의 평균 저해), 만족할만 하지 못하였다 (도 5C). 다음으로 단일한 역 돌연변이체 D76N는 3가지 서로 다른 VL 변이체들과 조합되었다 (도 5D). 제작물 hz515H7 VH D76N VL2는 키메라 항체와 동일한 범위에 있는 평균 상의 88.2%의 활성을 보여주었다.

단일 및 이중 역 돌연변이들이 변이체 VL1 도메인에서 제작되었고 제작물 hz515H7 VH1 D76N VL2의 활성과 비교되었다 (도 6). 테스트된 조합들은 본 제작물과 유사하거나 더 나은 활성을 전혀 가지지 않았다.

hz515H7 VH1 D76N VL2의 경우 구조틀에서 인간 잔기들의 백분율이 계산되었고: 이것은 180개 잔기들에서 나온 14개의 비-인간 잔기들을 포함하고, 이는 92.2%의 《배아도 지표 (germinality index)》와 동일하다. 비교로서, 인간화되고 시판되는 항체들 베박시주마브 (bevacizumab) 및 트라스투주마브 (trastuzumab)는 그들의 가변 도메인들에서 각각 30개 및 14개의 비-인간 잔기들을 포함한다.

SDF1-매개성 β-아레스틴의 채용을 저해하는 가장 강한 효능을 보여주는 4가지 최상의 인간화 형태들도 역시 바이오틴화된 SDF-1의 결합을 저해하는 그들의 능력에 대하여 테스트되었다 (도 7A). SDF-1 결합의 저해 및 β-아레스틴 채용의 밀접한 상관성이 결정되었다. 본 상관성은 SDF-1 결합의 저해가 신호 전달의 저해의 주요한 기작과 가장 유사한 점을 가리킨다.

hz515H7 VL2 변이체를 더 인간화하기 위하여, 3가지의 추가적인 변이체들이 도 6에서 평가된 이중 및 삼중 돌연변이체들로 획득된 정보를 사용하여 설계되었다. 4개 및 5개의 추가적인 잔기들이 변이체 VL2.1, VL2.2 및 VL2.3 (VL2-1, VL2-2 및 VL2-3라고도 역시 명명됨) 각각이 인간화되었다, 그들은 잔기들 D9, P49, D66, S69, S83, L84, V89에 해당한다. VL2와 비교하여 이들 3가지의 변이체들의 정렬은 도 8에 나타나있다.

이들 VL2 변이체들이 SDF1-매개성 β-아레스틴의 채용을 저해하는 능력이 평가되었다. 인간화 hz515H7 VH1 D76N VL2, VL2.1, VL2.2 및 VL2.3 변이체들은 키메라 항체 c515H7과 유사한 활성을 보여주었다 (도 6).

실시예 4: FACS 분석법에 의한 항- CXCR4 인간화 Mab 515 H7 결합 특이성 및 암 세포주들 인식의 특징 분석

본 실험에서는, 항-CXCR4 인간화 Mab들 515H7의 인간 CXCR4와 특이적 결합이 FACS 분석법에 의해 조사되었다.

NIH-3T3, NIH3T3-hCXCR4 형질전환된 세포, Ramos, U937 암 세포주들은 100 μL Facs 완충용액에서 0 내지 10 μg/mL의 인간화 항체들 515H7 (hz515H7 VH1 D76N VL2, hz515H7 VH1 D76N VL2.1, hz515H7 VH1 D76N VL2.2 및 hz515H7 VH1 D76N VL2.3)와 함께 암소에서 4℃로 20분 동안 배양되었다. Facs 완충용액으로 3번 세척한 이후에, 세포들은 이차 항체와, 염소 항-인간 알렉사 488 (1/500 희석)으로 암소에서 4℃로 20분 동안 배양되었다. Facs 완충용액으로 3번 세척한 이후에, 프로피디움 요오드가 각각의 웰에 첨가되었고 생존 세포들만 Facs에 의해 분석되었다. 적어도 5,000개 생존 세포들이 각각의 조건을 위해 형광 강도의 평균 수치를 평가하도록 측정되었다.

이들 결합 연구들의 결과들은 도 9A 내지 도 9C에서 제공되고, 이는 항-CXCR4 인간화 Mab들 hz515H7이 인간 CXCR4-NIH3T3 형질전환된 세포주와 특이적으로 결합되고 (도 9A) [MFI = NIH3T3 부모 세포들로 2.2] 또한 인간 암 세포주들 예를 들면 U937 (도 9B) 및 Ramos (도 9C)를 인식하는 점의 [FACS에 의해 획득된 평균 형광 강도 (MFI)]를 보여준다.

실시예 5: CXCR4 를 발현하는 세포들 상에 미치는 hz515H7VH1D76NVL2 Mab 의 항체 의존성 세포 세포독성 ( ADCC ) 효과

ADCC는 제조사의 지침들에 따라 세포독성 검출 키트^플러스 (Cytotoxicity Detection Kit^PLUS) (로슈 어플라이드 사이언스사 (Roche Applied Science), 인디애나폴리스, IN, USA)를 사용하는 락테이트 탈수소화효소 (LDH) 방출 검정법에 의해 측정되었다. 락테이트 탈수소화효소는 세포사멸 (apoptosis) 또는 괴사 (necrosis)둘 중 하나로부터 유발되는 막 본질의 상실에 이어서 배양 배지로 방출되는 용해성 세포질 효소이다. 따라서, LDH 활성은 세포막 본질의 지시인자로서 사용될 수 있고 ADCC를 포함하는 세포독성을 평가하도록 일반적인 수단으로서 작용한다.

말초혈액 단핵구 세포들 (PBMC)은 피콜 밀도 구배 (Ficoll-Paque PLUS, GE 헬스케어사, 에머샴, UK)를 사용하여 건강한 공여자로부터 획득된 인간 연막들 (buffy coat)로부터 분리되었다. 자연 킬러 (NK) 세포들은 RoboSep® 인간 NK 세포 농축 키트의 제조사의 프로토콜 (스템셀 테크놀로지사)에 따라 PBMC 분획으로부터 분리되었다. NK 세포들은 웰 당 50 μL로 50 : 1의 효과기-대-표적 비율로 96-웰 편평바닥 플레이트들에 도말되었다. 10,000개 표적 세포들 (Ramos)은 상온에서 10분 동안 항체들과 전-배양되었고, 50 μL/웰로 효과기 세포들 상에 첨가되었다. 4시간 동안 37℃에서 배양 이후에, 세포독성이 방출된 LDH의 양을 측정하여 결정되었다. 세포독성의 백분율은 다음과 같이 계산되었다: % 용출 = [실험적 방출 - 효과기 및 표적 자발적 방출]/[표적 최대 방출 - 표적 자발적 방출] × 100.

도 10은 높은 수준의 CXCR4를 발현하는 Ramos 세포들 상의 및 NK 세포들 단독 상의 ADCC를 나타낸다 [CXCR4 수준들 (MFI): Ramos > NK 세포들]. 검은색 컬럼들: Hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7VL2) (10μg/mL), 흰색 컬럼들: 이소형 대조군 hIgG1 (10 μg/mL). 세포들이 hIgG1 이소형 대조군과 배양되었을 때 효과는 전혀 관찰되지 않았다 (도 10A 및 도 10B). 대조적으로, hz515H7VH1D76NVL2 Mab는 Ramos 세포들 상에 미치는 유의한 ADCC (47.9% +/- 8.9)를 유도할 수 있었던 반면 (도 10A), 낮은 수준의 CXCR4를 발현하는 NK 세포들에 미치는 유의한 ADCC (3% +/- 3)는 전혀 없었다 (도 10B).

실시예 6: CXCR4 를 발현하는 세포들 상에 미치는 c515H7 Mab 의 항체 의존성 세포 세포독성 ( ADCC ) 효과

ADCC는 제조사의 지침들에 따라 세포독성 검출 키트^플러스 (Cytotoxicity Detection Kit^PLUS) (로슈 어플라이드 사이언스사, 인디애나폴리스, IN, USA)를 사용하는 락테이트 탈수소화효소 (LDH) 방출 검정법에 의해 측정되었다.

말초혈액 단핵구 세포들 (PBMC)은 피콜 밀도 구배 (Ficoll-Paque PLUS, GE 헬스케어사, 에머샴, UK)를 사용하여 건강한 공여자로부터 획득된 인간 연막들로부터 분리되었다. 자연 킬러 (NK) 세포들은 RoboSep® 인간 NK 세포 농축 키트의 제조사의 프로토콜 (스템셀 테크놀로지사)에 따라 PBMC 분획으로부터 분리되었다. NK 세포들은 웰 당 50 μL로 50 : 1의 효과기-대-표적 비율로 96-웰 편평바닥 플레이트들에 도말되었다. 10,000개 표적 세포들 (Ramos)은 상온에서 10분 동안 항체들과 전-배양되었고, 50 μL/웰로 효과기 세포들 상에 첨가되었다. 4시간 동안 37℃에서 배양 이후에, 세포독성이 방출된 LDH의 양을 측정하여 결정되었다. 세포독성의 백분율은 다음과 같이 계산되었다: % 용출 = [실험적 방출 - 효과기 및 표적 자발적 방출]/[표적 최대 방출 - 표적 자발적 방출] × 100.

도 11은 높은 수준의 CXCR4를 발현하는 Ramos 세포들 상의 및 NK 세포들 단독 상의 ADCC를 나타낸다 [CXCR4 수준들 (MFI): Ramos > NK 세포들]. 검은색 컬럼들: c515H7 (10μg/mL), 흰색 컬럼들: 이소형 대조군 hIgG1 (10 μg/mL). 세포들이 hIgG1 이소형 대조군과 배양되었을 때 효과는 전혀 관찰되지 않았다 (도 11A 및 도 11B). 대조적으로, c515H7 Mab는 Ramos 세포들 상에 미치는 유의한 ADCC (61.4% +/- 8.1)를 유도할 수 있었던 반면 (도 11A), 낮은 수준의 CXCR4를 발현하는 NK 세포들에 미치는 유의한 ADCC (5.4% +/- 4.6)는 전혀 없었다 (도 11B).

실시예 7: CXCR4 를 발현하는 세포들 상에 미치는 hz515H7VH1D76NVL2 Mab 의 보체 의존성 세포독성 ( CDC ) 효과

CDC 검정법은 셀타이터 글로 (CellTiter Glo) 시약 (프로메가사, 매디슨, WI, USA)을 사용하는 ATP 측정을 기초로 하였다.

간략하게, 10,000개의 표적 세포들이 hz515H7VH1D76NVL2의 존재 시 96-웰 편평바닥 플레이트들에 도말되었다. 상온에서 10분 동안 배양에 이어서, 건강한 공여자들로부터 얻은 인간 혈청 풀이 10%의 최종 농도로 첨가되었다. 37℃에서 1시간 이후에, 생존도 (viability)가 ATP의 양을 측정하여 결정되었다. 세포독성의 백분율은 다음과 같이 계산되었다: % 세포독성 = 100 - [[실험적/항체 없는 표적세포] × 100].

도 12는 높은 수준의 CXCR4를 발현하는 Ramos 및 NIH3T3-CXCR4 세포주들 상의 CDC를 나타낸다. 검은색 컬럼들: Hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7VL2) (10μg/mL), 흰색 컬럼들: 이소형 대조군 hIgG1 (10 μg/mL). 세포들은 hIgG1 이소형 대조군과 배양되었을 때 효과가 전혀 관찰되지 않았다 (도 12). 대조적으로, hz515H7VH1D76NVL2 Mab는 NIH/3T3CXCR4 및 Ramos 세포주들 상에 미치는 유의한 CDC (대략 80%)를 유도할 수 있었다 (도 12).

실시예 8: 높은 수준의 CXCR4 를 발현하는 Ramos 세포들 상에 미치는 c515H7 Mab의 보체 의존성 세포독성 ( CDC ) 효과

CDC 검정법은 셀타이터 글로 시약 (프로메가사, 매디슨, WI, USA)을 사용하는 ATP 측정을 기초로 하였다.

간략하게, 10,000개의 Ramos 세포들이 Mab들의 존재 시 96-웰 편평바닥 플레이트들에 도말되었다. 상온에서 10분 동안 배양에 이어서, 건강한 공여자들로부터 얻은 인간 혈청 풀이 10%의 최종 농도로 첨가되었다. 37℃에서 1시간 이후에, 생존도가 ATP의 양을 측정하여 결정되었다. 세포독성의 백분율은 다음과 같이 계산되었다: % 세포독성 = 100 - [[실험적 / 항체 없는 표적세포] × 100].

도 13은 높은 수준의 CXCR4를 발현하는 Ramos 세포주 상의 CDC를 나타낸다. 검은색 컬럼들: c515H7 (10μg/mL), 흰색 컬럼들: 이소형 대조군 hIgG1 (10 μg/mL). 세포들은 hIgG1 이소형 대조군과 배양되었을 때 효과가 전혀 관찰되지 않았다 (도 13). 대조적으로, c515H7 Mab는 Ramos 세포들 상에 미치는 유의한 CDC (대략 34%)를 유도할 수 있었다 (도 13).

실시예 9: 높은 수준의 CXCR4를 발현하는 Ramos 세포들 상에 미치는 hz515H7VH1D76NVL2 및 c515H7 Mab 들의 보체 의존성 세포독성 ( CDC ) 용량 효과

도 14는 높은 수준의 CXCR4를 발현하는 Ramos 세포주 상의 CDC를 나타낸다. 검은색 컬럼들: hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7VL2) (도 14A) 또는 c515H7 (도 14B) (10μg/mL) 둘 중 하나, 흰색 컬럼들: 이소형 대조군 hIgG1 (10 μg/mL). 세포들은 hIgG1 이소형 대조군과 배양되었을 때 효과가 전혀 관찰되지 않았다 (도 14A 및 도 14B). 대조적으로, hz515H7VH1D76NVL2 (도 14A) 및 c515H7 (도 14B) Mab들은Ramos 세포들 상에 미치는 유의한 CDC를, CDC_최대의 각각 74% 및 34%로, EC₅₀의 각각0.033 μg/mL 및 0.04 μg/mL로 유도할 수 있었다.

실시예 10: 실시간 표면 플라스몬 공명에 의한 hz515H7VH1D76NVL2 Mab 그리고 h- Fc γ RI , h- Fc γRⅢA, m- Fc γ RI 및 m- Fc γRⅢ 간의 상호작용의 연구

실험들은 Biacore X 장치를 사용하여 수행되었다. 본 연구에서 사용된 4가지의 Fc 감마 수용체들의 용해성 형태들은 R&D 시스템사로부터 구입되었다.

1. 재조합 인간 FcγRI[CD64]은 C-말단 6개-His 태그를 가진 Gln 16번 내지 Pro 288번 단편에 해당한다 [카탈로그 번호: 1257-FC]. 본 연구에서 사용된 50 kDa의 분자량 (공급자에 의해 특정됨)은 환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 정의되는 분자량의 평균에 해당한다.

2. 재조합 인간 FcγRⅢA[CD16a]은 C-말단 6개-His 태그를 가진 Gln 17번 내지 Gln 208번 단편에 해당한다 [카탈로그 번호: 4325-FC]. 본 연구에서 사용된 45 kDa의 분자량 (공급자에 의해 특정됨)은 환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 정의되는 분자량의 평균에 해당한다.

3. 재조합 인간 FcγRI[CD64]은 C-말단 6개-His 태그를 가진 Gln 25번 내지 Pro 297번 단편에 해당한다 [카탈로그 번호: 2074-FC]. 본 연구에서 사용된 55 kDa의 분자량 (공급자에 의해 특정됨)은 환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 정의되는 분자량의 평균에 해당한다.

4. 재조합 인간 FcγRⅢ[CD16]은 C-말단 6개-His 태그를 가진 Ala 31번 내지 Thr 215번 단편에 해당한다 [카탈로그 번호: 1960-FC]. 본 연구에서 사용된 37.5 kDa의 분자량 (공급자에 의해 특정됨)은 환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 정의되는 분자량의 평균에 해당한다.

다른 시약들은 비아코아 (Biacore) (GE 헬스케어사)에 의해 공급되었다.

1964 RU의 hz515H7VH1D76NVL2 Mab가 CM4 센서칩의 두 번째 유동세포 (FC2) 상에 아민 커플링 키트 화학을 사용하여 고정되었다. NHS 및 EDC 혼합물에 의해 활성화되고 에탄올아민에 의해 탈활성화된 첫 번째 유동세포 (FC1)는 분석물 (Fc 감마 수용체들) 및 센서칩 매트릭스 간의 비특이적 상호작용을 검토하고 차감하도록 기준 표면으로서 작용한다.

역학적 실험들이 30 μL/분의 유동 속도로 25℃에서 수행되었다. HBS-EP 완충용액이 전개 완충용액으로서 또는 분석물 용액들의 제조를 위해 사용되었다. 분석물 용액들은 90초의 지연 (해리 단계)을 가지고 90초 동안 (결합 단계) 주입되었다. 분석물로서 전개 완충용액의 주입은 이중 기준으로서 사용되었다. 모든 센서그램들은 본 이중 기준 센서그램에 의해 교정되었다.

각각의 분석물의 주입 이후에, 센서칩은 h-FcγRI 및 m-FcγRⅢ 이후 20 mM NaOH 또는 h-FcγRⅢA 및 m-FcγRI 이후 10 mM NaOH 둘 중 하나의 주입에 의해 재생되었다.

두 가지의 수학적 모델들이 센서그램들을 분석하는 데 사용되었다: "랑뮈르" 및 "불균질 리간드" 모델들.

h-FcγRI로 획득된 센서그램들 [도 15]은 랑뮈르 모델에 의해 완벽하게 맞추어지지 않았지만 (5% < Chi2/Rmax < 20%) "불균질 리간드" 모델은 맞춤의 질을 개선하지 못하였다. 랑뮈르 모델을 사용하여, 해리 상수는 나노몰라 범위 (0.9 ± 0.1 nM)에 있었다.

h-FcγRⅢA로 획득된 센서그램들 [도 16]은 랑뮈르 모델에 의해 분명하게 맞추어지지 않았다 (Chi2/Rmax > 20%). "불균질 리간드 모델"은 맞춤의 질을 유의하게 개선하였다 (Chi2/Rmax < 5%). 본 모델에 따르면, hz515H7VH1D76NVL2 Mab Fc 도메인은 2개 성분들의 혼합물로서 고려될 수 있다. 전체 양의 79%를 차지하는 주요 성분은 300 및 350 nM 사이 범위의 해리 상수를 보여주었고, 소수의 성분 (21%)은 27 및 32 nM 사이 범위의 해리 상수를 보여주었다. 문헌에 따르면, h-FcγRⅢA로 관찰되는 불균질도는 Mab Fc 도메인 상의 당화 불균질도와 연결되는 것 같았다.

결합 단계의 말단의 RU에서 (Req 밀접) 반응의 평균 대비 h-FcγRⅢA 농도 (C)를 나타내는 좌표는 수학적 모델로 맞추어질 수 있다:

Req = (K_A.C.R_max)/K_A.C.n+1), n = 1 [도 17]. 1/K_A에 해당하는 해리 상수 K_D는 176 nM과 동등하다.

m-FcγRI로 획득된 센서그램들 [도 18]은 랑뮈르 모델에 의해 맞추어질 수 있지만 (5% < Chi2/Rmax < 10%) "불균질 리간드" 모델은 맞춤의 질을 유의하게 개선하였다. 본 모델에 따르면, hz515H7VH1D76NVL2 Mab Fc 도메인은 2개 성분들의 혼합물로서 고려될 수 있다. 전체 양의 82%를 차지하는 주요 성분은 75 및 80 nM 사이 범위의 해리 상수를 보여주었고, 소수의 성분 (18%)은 90 nM 주변의 해리 상수를 보여주었다. 해리 상수가 가깝더라도, 역학적 속도들은 유의하게 서로 달랐다 (결합 속도는 주요 성분의 경우 5.7배 더 좋았지만 그의 해리 속도는 4.8배 더 신속하였다).

결합 단계의 말단의 RU에서 (Req 밀접) 반응의 평균 대비 m-FcγRI 농도 (C)를 나타내는 좌표는 수학적 모델로 맞추어질 수 있다:

Req = (K_A.C.R_max)/K_A.C.n+1), n = 1 [도 19]. 1/K_A에 해당하는 해리 상수 K_D는 95 nM과 동등하다.

m-FcγRⅢ로 획득된 센서그램들 [도 20]은 랑뮈르 모델에 의해 완벽하게 맞추어지지 않지만 (5% < Chi2/Rmax < 20%) "불균질 리간드" 모델은 맞춤의 질을 유의하게 개선하지 못하였다. 랑뮈르 모델을 사용하여 해리 상수는 17 및 18 nM 주변이었다.

4가지 Fc 감마 수용체들의 순위매김은 복합체의 반감기의 함수로 Kd 좌표를 재연하는 도 21에 나타나 있다. 문헌에 따르면, h-FcγRI는 인간 IgG1 이소형 항체의 Fc 부분과 높은 친화도로 결합하고 h-FcγRⅢA는 낮은 친화도로 결합한다. m-FcγRⅢ는 h-FcγRⅢ에 대한 hz-515H7VH1D76NVL2 Mab의 주요 성분의 친화도 및 h-FcγRI의 친화도 사이의 중간 친화도로 결합한다. hz515H7VH1D76NVL2 Mab의 성분들 둘 다는 m-FcγRI와 h-FcγRⅢA에 대한 hz515H7VH1D76NVL2의 성분들 둘 다의 친화도들 사이의 중간 친화도로 상호작용한다.

이들 실험들은 분명하게 hz515H7VH1D76NVL2 Mab Fc 도메인이 유의하게 테스트된 4가지 FcγR과 상호작용하는 것으로 확인하였다.

실시예 11: 실시간 표면 플라스몬 공명에 의한 c515H7 Mab 그리고 h- Fc γ RI , h-FcγRⅢA, m- Fc γ RI 및 m- Fc γRⅢ 간의 상호작용의 연구

2017 RU의 c515H7 Mab가 CM4 센서칩의 두 번째 유동세포 (FC2) 상에 아민 커플링 키트 화학을 사용하여 고정되었다. NHS 및 EDC 혼합물에 의해 활성화되고 에탄올아민에 의해 탈활성화된 첫 번째 유동세포 (FC1)는 분석물 (Fc 감마 수용체들) 및 센서칩 매트릭스 간의 비특이적 상호작용을 검토하고 차감하도록 기준 표면으로서 작용한다.

각각의 분석물의 주입 이후에, 센서칩은 20 mM NaOH, 75 mM NaCl 용액의 주입에 의해 재생되었다.

h-FcγRI로 획득된 센서그램들 [도 22]은 랑뮈르 모델에 의해 완벽하게 맞추어지지 않았지만 (Chi2/Rmax > 10%) "불균질 리간드" 모델은 맞춤의 질을 개선하지 못하였다. 랑뮈르 모델을 사용하여, 해리 상수는 나노몰라 범위 (1.2 ± 0.1 nM)에 접근하였다. 본 모델에 따르면, c515H7 Mab Fc 도메인은 2개 성분들의 혼합물로서 고려될 수 있다. 전체 양의 81%를 차지하는 주요 성분은 380 및 450 nM 사이 범위의 해리 상수를 보여주었고, 소수의 성분 (19%)은 32 및 37 nM 사이 범위의 해리 상수를 보여주었다. 문헌에 따르면, h-FcγRⅢA로 관찰되는 불균질도는 Mab Fc 도메인 상의 당화 불균질도와 연결되는 것 같았다. 결합 단계의 말단은 안정된-상태에 도달하도록 접근되었다. 결합 단계의 말단의 RU에서 (Req 밀접) 반응의 평균 대비 h-FcγRⅢA 농도 (C)를 나타내는 좌표는 수학적 모델로 맞추어질 수 있다:

Req = (K_A.C.R_max)/K_A.C.n+1), n = 1 [도 24]. 1/K_A에 해당하는 해리 상수 K_D는 160 nM과 동등하다.

m-FcγRI로 획득된 센서그램들 [도 25]은 랑뮈르 모델에 의해 맞추어질 수 있지만 (5% < Chi2/Rmax < 10%) "불균질 리간드" 모델은 맞춤의 질을 유의하게 개선하였다. 본 모델에 따르면, c515H7 Mab Fc 도메인은 2개 성분들의 혼합물로서 고려될 수 있다. 전체 양의 81%를 차지하는 주요 성분은 380 및 450 nM 사이 범위의 해리 상수를 보여주었고, 소수의 성분 (19%)은 32 및 37 nM 사이 범위의 해리 상수를 보여주었다.

결합 단계의 말단은 안정된-상태에 도달하도록 접근되었다. 결합 단계의 말단의 RU에서 (Req 밀접) 반응의 평균 대비 m-FcγRI 농도 (C)를 나타내는 좌표는 수학적 모델로 맞추어질 수 있다:

Req = (K_A.C.R_max)/K_A.C.n+1), n = 1 [도 26]. 1/K_A에 해당하는 해리 상수 K_D는 107 nM과 동등하다.

m-FcγRⅢ로 획득된 센서그램들 [도 27]은 랑뮈르 모델에 의해 완벽하게 맞추어지지 않지만 (5% < Chi2/Rmax < 20%) "불균질 리간드" 모델은 맞춤의 질을 유의하게 개선하지 못하였다. 랑뮈르 모델을 사용하여 해리 상수는 17 및 18 nM 주변이었다.

4가지 Fc 감마 수용체들의 순위매김은 복합체의 반감기의 함수로 Kd 좌표를 재연하는 도 28에 나타나 있다. 문헌에 따르면, h-FcγRI는 인간 IgG1 이소형 항체의 Fc 부분과 높은 친화도로 결합하고 h-FcγRⅢA는 낮은 친화도로 결합한다. m-FcγRⅢ는 h-FcγRⅢ에 대한 c515H7 Mab의 주요 성분의 친화도 및 h-FcγRI의 친화도 사이의 중간 친화도로 결합한다. c515H7 Mab의 성분들 둘 다는 m-FcγRI의 것과 유사한 방식으로 h-FcγRⅢA와 상호작용한다.

실시예 12: CXCR4 를 발현하는 세포들 상에 미치는 hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7) Mab 의 항체 의존성 세포 세포독성 ( ADCC ) 효과

ADCC는 상기에 기술된 (실시예 5 참조) 락테이트 탈수소화효소 (LDH) 방출 검정법을 사용하여 측정되었다.

간략하게, 인간 PBMC들은 피콜 밀도 구배를 사용하여 지원 건강한 공여자들의 혈액으로부터 분리되었다. NK 세포들은 인간 NK 세포 농축 키트의 제조사의 프로토콜에 따라 PBMC들 분획으로부터 정제되었다. 효과기 세포들 (E)로서 사용되는 NK 세포들은 50 : 1의 E : T 비율로 RAMOS (림프종), DAUDI (림프종) 또는 HeLa (자궁경부암) 종양 표적 세포들 (T)과 혼합되었고, 상기 표적 세포들은 미리 hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7) 항체 (10 μg/mL)와 상온에서 10분 동안 전-배양되었다. 4시간 동안 37℃에서 배양 이후에, 특이적 세포 용해가 방출된 LDH의 양을 세포독성 검출 키트^플러스로 제조사의 지침들에 따라 측정하여 결정되었다. 세포독성의 백분율은 다음과 같이 계산되었다: % 용출 = [실험적 방출 - 효과기 및 표적 자발적 방출]/[표적 최대 방출 - 표적 자발적 방출] × 100.

도 29는 CXCR4를 발현하는 세포들: RAMOS, DAUDI 및 HeLa 세포들 상의 ADCC를 나타낸다. 세포들이 hIgG1 이소형 대조군 (10 μg/mL)과 배양되었을 때 효과는 전혀 관찰되지 않았다. 대조적으로, hz515H7 Mab (10 μg/mL)는 RAMOS, DAUDI 및 HeLa 세포들 상에 미치는 유의한 ADCC (대략 40%)를 유도할 수 있었다.

실시예 13: CXCR4 를 발현하는 세포들 상에 미치는 hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7) Mab 의 보체 의존성 세포독성 ( CDC ) 효과

CDC 검정법은 실시예 7에서 기술된 바와 같이 셀타이터 글로 시약 (프로메가사, 매디슨, WI, USA)을 사용하는 ATP 측정을 기초로 하였다.

간략하게, 10,000개의 표적 세포들이 hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7)의 존재 시 96-웰 편평바닥 플레이트들에 도말되었다. 상온에서 10분 동안 배양에 이어서, 건강한 공여자들로부터 얻은 인간 혈청 풀이 10%의 최종 농도로 첨가되었다. 37℃에서 1시간 이후에, 생존도가 ATP의 양을 측정하여 결정되었다. 세포독성의 백분율은 다음과 같이 계산되었다: % 세포독성 = 100 - [[실험적/항체 없는 표적세포] × 100].

도 30은 CXCR4를 발현하는 세포주들: RAMOS 및 DAUDI 세포들 상의 CDC를 나타낸다. 세포들은 hIgG1 이소형 대조군 (10μg/mL)과 배양되었을 때 효과가 전혀 관찰되지 않았다. 대조적으로, hz515H7VH1D76NVL2 (hz515H7-1) Mab (10μg/mL)는 유의한 CDC를 유도할 수 있었다: RAMOS 세포들의 경우 대략 58%, DAUDI 세포들의 경우 36%.

SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT KLINGUER-HAMOUR, Christine <120> Anti-CXCR4 antibody with effector functions and its use for the treatment of cancer <130> 361039D29882 <150> EP 11305773.1 <151> 2011-06-20 <150> US 61/499,004 <151> 2011-06-20 <160> 73 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 1 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Asn Tyr 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Ala Arg Asp Val Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> mus musculus <400> 5 Trp Ala Ser 1 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 6 Met Gln Ser Phe Asn Leu Arg Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> humanized antibody <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 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Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 72 <211> 1404 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chimeric antibody <400> 72 atgaagatgt ggctgaactg ggtgttcctg gtgaccctgc tgaacggcat ccagtgcgaa 60 gtgaacctgg tggagtctgg cggcggactg gtgcagcctg ggggcagcct gagactgagc 120 tgcgccacct ccggcttcac cttcaccgac aactacatga gctgggtgcg ccagccccct 180 ggcaaggccc tggaatggct gggcttcatc cggaacaagg ccaacggcta caccaccgac 240 tacagcgcca gcgtgcgggg cagattcacc atcagccggg acaacagcca gagcatcctg 300 tacctgcaga tgaacgccct gcgggccgag gacagcgcca cctactactg tgcccgggac 360 gtgggcagca actacttcga ctactggggc cagggcacca cactgaccgt gtccagcgcc 420 agcaccaagg gcccctccgt gttcccgcta gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 480 acagccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 540 aacagcggag ccctgacctc cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 600 ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 660 atctgtaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt ggagcccaag 720 agctgtgaca agacccacac ctgccccccc tgcccagccc ccgagctgct gggcggaccc 780 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 840 gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccac gaggacccag aggtgaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagccca gagaggagca gtacaacagc 960 acctacaggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020 tacaagtgta aggtgtccaa caaggccctg ccagccccaa tcgaaaagac catcagcaag 1080 gccaagggcc agccaagaga gccccaggtg tacaccctgc cacccagcag ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaagggct tctacccaag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc cccagtgctg 1260 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag cagatggcag 1320 cagggcaacg tgttcagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1380 aagagcctga gcctgtcccc aggc 1404 <210> 73 <211> 717 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chimeric antibody <400> 73 atggagtcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtcgaa cccgaaagaa ctacttggct 180 tggtaccagc agaagccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccgctagg 240 gattctgggg tccctgctcg cttcacaggc agtggatctg agacatattt cactctcacc 300 atcagccgtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcatgcaatc ttttaatctt 360 cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgta cggtggccgc tcccagcgtg 420 ttcatcttcc ccccaagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgtctg 480 ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 540 agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 600 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgag 660 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 717

Claims

CXCR4, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편과 결합하는 인간화 항체로서, 상기 인간화 항체는 서열번호 7 내지 10의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 11 내지 17의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시, 적어도 하나의 효과기 기능의 유도에 의해 CXCR4를 발현하는 암 세포들을 살상하는 단계에 의해 암의 치료 방법에서 사용하기 위한, 인간화 항체.
제 1항에 있어서,
상기 효과기 기능은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 1항에 있어서,
상기 효과기 기능은 보체 의존성 세포독성 (CDC)으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 1항에 있어서,
상기 효과기 기능은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간화 항체는
서열번호 8의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 11 내지 17의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체;
서열번호 7 내지 10의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 13의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체;
서열번호 8의 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 13의 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체;
서열번호 18 내지 21의 서열들로부터 선택되는 중쇄 및/또는 서열번호 22 및 28의 서열들로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 인간화 항체;
서열번호 19의 서열의 중쇄 및/또는 서열번호 22 및 28의 서열들로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 인간화 항체;
서열번호 18 내지 21의 서열들로부터 선택되는 중쇄 및/또는 서열번호 24의 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체;
서열번호 19의 서열의 중쇄 및/또는 서열번호 24의 서열의 경쇄를 포함하는 인간화 항체:
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 인간화 항체.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 IgG1인 것을 특징으로 하는, 인간화 항체
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 CXCR4를 발현하는 암 세포는 악성 혈액학적 세포로 구성되는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 7항에 있어서,
상기 CXCR4 악성 혈액학적 세포는 림프종 세포, 백혈병 세포 또는 다발성 골수종 세포를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 인간화 항체.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 효과기 세포들은 NK 세포들, 대식구들, 단핵구들, 호중성구들 또는 호산구들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 4시간의 배양 기간 이후에 적어도 40%의 RAMOS 림프종 세포들 상에서 ADCC 수준을 유도하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
유의한 ADCC가 NK 세포들 상에서 전혀 유도되지 않는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 보체 성분들은 적어도 C1q를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 1시간의 배양 기간 이후에, 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 70%의 RAMOS 림프종 세포들의 상에서 ADCC 수준을 유도하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 1시간의 배양 기간 이후에, 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 70%의 NIH3T3 CXCR4 세포들의 상에서 CDC 수준을 유도하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편은 적어도 하나의 인간 FcγR들과 결합하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 15항에 있어서,
상기 적어도 하나의 FcγR들은 인간 FcγRI인 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 16항에 있어서,
상기 항체는 랑뮈르 (Langmuir) 모델에 따라, 1 및 10 nM 사이 범위의 해리 상수 (KD)로 상기 FcγRI와 결합하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 17항에 있어서,
상기 적어도 하나의 FcγR들은 인간 FcγRⅢA인 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
제 18항에 있어서,
상기 항체는 불균질 리간드 모델에 따라 200 및 1,000 nM 사이 범위의 해리 상수 (KD)로 상기 FcγRⅢA와 결합하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
CXCR4를 발현하는 암 세포들을 살상하는 단계에 의한 암의 치료 방법에서 사용하기 위한, CXCR4와 결합하는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편으로서, 상기 인간 또는 인간화 항체는 서열번호 7 내지 10의 서열들로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 11 내지 17의 서열들로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인을 포함하고; 상기 인간 또는 인간화 항체의 효과기 기능은 효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시 유도되는, 인간화 항체.
제 20항에 있어서,
상기 암은 림프종으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체.
효과기 세포들 또는 보체 성분들의 존재 시, 적어도 하나의 효과기 기능의 유도에 의해 CXCR4를 발현하는 암 세포들을 살상하는 데 사용하기 위한, CXCR4와 결합하는 인간화 항체, 또는 그의 CH2-포함 결합 단편들을 검색하는 방법으로서, 상기 방법은
- 4시간의 배양 기간 이후에, 적어도 40%의 RAMOS 림프종 세포들 상에서 ADCC 수준을 유도하는 항체들을 선별하는 단계;
- 1시간의 배양 기간 이후에, 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 70%의 RAMOS 림프종 세포들 상에서 CDC 수준을 유도하는 항체들을 선별하는 단계;
- 1시간의 배양 기간 이후에, 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 70%의 NIH3T3 CXCR4 세포들 상에서 CDC 수준을 유도하는 항체들을 선별하는 단계;
- 랑뮈르 모델에 따라, 1 및 10 nM 사이 범위의 해리 상수 (KD)로 FcγRI와 결합하는 항체들을 선별하는 단계;
- 불균질 리간드 모델에 따라, 200 및 1,000 nM 사이 범위의 해리 상수 (KD)로 FcγRⅢA와 결합하는 항체들을 선별하는 단계:
로부터 선택되는 적어도 하나의 선별 단계를 포함하는, 방법.