HUT63339A

HUT63339A - Process for producing pharmaceutical compositions comprising bcrf1 antagonists

Info

Publication number: HUT63339A
Application number: HU923068A
Authority: HU
Inventors: Kevin W Moore
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1990-03-26
Filing date: 1991-03-22
Publication date: 1993-08-30
Also published as: FI924278A0; AU7588291A; CN1056245A; JP2509774B2; DE69112392D1; IE70910B1; FI924278A; DK0522010T3; JPH05501116A; IL97629A0; DE69112392T2; EP0522010B1; MX9203522A; CA2079230A1; NO923749L; IE910942A1; EP0522010A1; NO923749D0; PT97108B; KR960004856B1

Description

A találmány Epstein-Barr vírus (EBV) fertőzések kezelésére szolgáló eljárásra vonatkozik. A kezelés a BCRF1 EBV protein alkalmazását tartalmazza.

Az Epstein-Barr vírus egy ubikviter humán herpeszvírus, melyet először Burkitt-limfóma afrikai formájához (endémiás vagy e forma) társultan fedeztek fel. Ezt követően megtalálták a vírust nazofaringeális (orr-garat) k&rcinómához társultan is, és kimutatták, hogy szerepe van a mononucleosis infectiosa előidézésében. A fertőzés rendszerint a korai gyermekkor folyamán fordul elő, általában klinikai tünetek nélkül (szubklinikus manifesztáció), ritkán enyhe tüneteket okczva. A fertőzés a serdülőkor vagy felnőttkor folyamán azonban mononukleosis infectiosa-t idézhet elő, melyet torokgyulladás, láz és lymphadenopathia (nyirokcsomó-bántalom) jellemez. A mononukleosis infectiosa legtöbb esetben egy-három héten belül normalizálódik, bár rossz közérzet és fáradtság több hétig vagy hónapig fennmaradhat. Esetenként komplikációk fordulnak elő, így túlzott mandula duzzanat, trombocitopénia, léprepedés, sárgaság és encephalitis. Az immunológiailag veszélyeztetett betegeknél— ilyenek a transzplantáltak, AIDS betegek — az EBV fertőzések B-sejt lympho-proliferativ zavarokhoz vezetnek. Kollégiumi és katonai közösségekben tapasztalható a mononucleosis infectiosa eredetű megbetegedések legmagasabb száma, például a Wisconsini Egyetem összes kórházban ápolt diákjának 5 %-át teszi ki, és a hadsereg személyzeténél az e betegségnek tulajdonithetó kiesett • · *· napok száma sorrendben a negyedik helyen áll.

[jhorley-Lawson, Biochimica et Biophysica Acta, 948, 263-286 (1988);

Schooley et al., Mandell et al., (szerk.) Principles and

Practice of Infectious Diseases, 2. kiadás, 126. fejezetében (John Willey and Sons, New York, 1985)J.

Az EBV-vel fertőzött betegek kezelésére használható szerek hozzáférhetősége jelentős klinikai kihatással lenne az immunológiai szempontból veszélyeztetett személyekre nézve.

A találmány EBV fertőzések kezelésére alkalmas eljárásokra vonatkozik, a BCRF1 EBV protein egy antagonistája hatásos mennyiségének alkalmazása révén. Előnyös, hói a BCRF1 antagonisták monoklonális antitestek vagy az ezekből standard technikákkcl előállított, kötésre képes készítmények.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik.

Az 1. ábrán a BCRF1 termeléséhez használt emlős expreszsziós vektor sematikus rajza látható.

A 2. ábrán a BCRF1 termeléséhez használt bakteriális expressziós vektor sematikus rajza látható.

A találmány részben azon a felfedezésen alapul, hogy a BCRF1 elnyomja a '^-interferon (IFN-p termelését, amely citokin a vírusfertőzések elleni sejtközvetítette védekezéshez szükséges. Ismeretes, hogy a BCRFl-et az EBV azért termeli, hogy elősegítse fennmaradását gazdasejtjében. A találmány szerinti eljárásban egy BCRF1 antagonista hatékony mennyiségét vagy betegséget enyhítő mennyiségét adjuk be a betegnek.

• 4

- 4 Előnyös, ha a találmány szerinti antagonisták BCRFl-re specifikus antitestek származékai. Még előnyösebb, ha a találmány szerinti antagonisták a BCRF1-Ee specifikus ilyen antitestek fragmentumaiból vagy kötésére képes készítményekből állnak. Az antitesteket diszulfid hidakkal egymáshoz kapcsolt polipeptid láncok alkotják. Két fő polipeptid lánc — nevük: könynyű lánc és nehéz lánc — határozza meg, hogy az antitest mely fő szerkezeti osztályhoz (izotipushoz) tartozik. Mind a nehéz láncok, mind a könnyű láncok további alszakaszokra oszthatók, éspedig variábilis (változó) szakaszokra és konstans (állandó) szakaszokra. A nehéz láncok egyetlen variábilis szakaszt és három különböző konstans szakaszt foglalnak magukba, mig a könnyű láncok egyetlen (a nehéz lánc variábilis szakaszától különböző) variábilis szakaszt és egyetlen (a nehéz lánc konstans szakaszától különböző) konstans szakaszt tartalmaznak. A nehéz lánc és a könnyű lánc variábilis szakaszok felelősek az antigénkötő specificitásért.

Ebben a leírásban a nehéz lánc variábilis szakasz kifejezés egy olyan polipeptidet jelent, amely (1) 110-125 aminosav hosszúságú, és (2). amelynek az aminosavszekvenciája egy a találmány szerinti monoklonális antitest nehéz lánca aminosavszekvenciájának felel meg. Hasonlóképpen a könnyű lánc variábilis szakasz egy olyan polipeptidet jelent, amely (1) 95-115 aminosav hosszúságú, és (2) amelynek aminosavszekvenciája a találmány szerinti monoklonális antitest könynyű lánca aminosavszekvenciájának felel meg.

« ·

- 5 A monoklonális antitest kifejezés itt az immunglobulinok olyan homogén populációját jelenti, amely specifikusan képes kötődni a BCRFl-hez.

A kötésre képes készítmény kifejezés itt egy olyan készítményt jelent, amely két polipeptid láncból áll, melyeket ha (1) mesterségesen összekapcsolunk, olyan konformációt öltenek, amely erős kötőaffinitást biztosít BCRFl-gyel szemben, és (2) amelyek BCRFl-re specifikus monoklonális antitesteket termelő hibridómákból származnak. A mesterségesen öszszekapcsolt kifejezéssel azt óhajtjuk jelezni, hogy a két polipeptid lánc egymáshoz viszonyítva úgy helyezkedhet el, hogy azok különböző módon kötődhessenek egymáshoz, akár mint natív antitest fragmentumok — mint a Fab vagy Fv — társulása révén, vagy géntechnológiai úton előállított cisztein-tartalmú peptid linkerek útján a karboxiterminális végeken. E két polipeptid lánc rendszerint egy a BCRFl-re specifikus monoklonális antitest könnyű lánc variábilis szakaszának és nehéz lánc variábilis szakaszának felel meg. Előnyös, ha a találmány szerinti antagonisták BCRFl-re specifikus monoklonális antitestekből származnak. A BCRFl-et blokkolni vagy neutralizálni képes monoklonális antitesteket azon az alapon választjuk ki, hogy képesek-e a ^-interferon termelés BCRF1-indukálta szuppresszióját gátolni. Ilyen vizsgálatokhoz szükség van egy olyan sejtvonalra vagy sejtpopulációra, mely IFN-(f-t szintetizál. A mitogénnel — ilyen a fitohemagglutinin (PHA = phytohemagglutinin) — stimulált perifériás vérlimfociták (PBL = peripheral blood lymphocyte) alkalmas sejt ♦ ··<· populációként jöhetnek számításba. A vizsgálatot nagy vonalakban a következőképpen végezzük. A PHA-val stimulált perifériás vér limfocitákat három egyenlő részre osztjuk. Az első részhez BCRFl-et adunk. A második részhez hozzáadjuk a BCRF1et és a vélt antagonistát. A harmedik rész kontroll gyanánt szolgál. Több nap múlva a tenyészetek felülúszóit IFN-^f-ra vizsgáljuk. Ezt a vizsgálatot alkalmas módon standard ELISA módszerrel végezzük, kereskedelemben kapható (például: Genzyme, Inc., Boston, MA., USA) IFN-^ elleni monoklonális és poliklonális antitesteket használva. A vizsgálat eredményét az átírt IFN-^ mRNS mennyisége is kifejezheti, mely például RNS-blotting segítségével, PCR-rel (PCR = polymerase chain reaction) vagy hasonló módszerrel mérhető. Perifériás vér limfocitákat standard technikákkal nyerhetünk {például: Mishell et al., (szerk.) Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, New York, 1980)J .

A találmány szerinti hibridómákat jól ismert technikákkal állítjuk elő. Az eljárás rendszerint abból áll, hogy egy végtelenségig szaporodó sejtvonalat egy a. kívánt antitest-termelő .B-limfocitával fuzionálunk. Egy másik megoldás szerint fúzió nélküli technikákat is használhatunk a végtelen ideig szaporítható antitest termelő sejtvonalak előállítására — ezek szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak — például ilyen a vírus-indukálta transzformáció. [^Casalli et al., Humán Monoklonals írom Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes and Transformation by EBV, Science, 234, 476-479 (1986)J .

A halhatatlan sejtvonalak rendszerint emlős sejtek, főképpen rágcsáló, marha és emberi eredetű myeloma sejtek (lásd a 4,693,975 és 4,720,459 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). A leggyakrabban patkány vagy egér myeloma sejtvonalakat használnak, alkalmasságuk és hozzáférhetőségük miatt. A cél-antigénnel oltott emlősökből a megfelelő limfociták kinyerésére szolgáló technikák jól ismertek. Általában, ha humán eredetű sejtekre van szükség, akkor perifériás vér limfocitákat (PBL) használunk, vagy ha nem-humán emlős források a kívánatosak, akkor ez esetben lépsejteket vagy nyirokmirigy sejteket használunk. A gazda emlős szervezeteket ismételten beoltjuk a tisztított antigénnel, és hagyjuk, hogy az emlősben kifejlődjenek a kívánt antitest-termelő sejtek, majd ezeket learatjuk, és a halhatatlanságot biztosító sejtvonallal fuzionáljuk. Előnyös, ha az antitest termelő B sejtek egér, patkány, nyúl vagy humán sejtek. A fúziós technikák szintén jól ismertek, és általában úgy járunk el, hogy a sejteket egy fúziót elősegítő szerrel, például polietilénglikollal keverjük el. A hibridómákat standard eljárásokkal szelektáljuk, például HAT módszerrel. A hibridómák közül azokat, amelyek a kívánt antitesteket, például az anti-BCRFl antitestet szekretálják, úgy választjuk ki, hogy a táptalajt standard immunassay-k segítségével vizsgáljuk.

Ilyenek a következők: Western-blotting, ELISA, RIA, BCRF1-neutralizáló képesség vizsgálata vagy hasonlók. Az antitesteket a táptalajból standard protein tisztítási technikákkal különítjük el [^például: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays )Elsevierj Amsterdam, 1985/]. Számos közlemény nyújt segítséget a fent említett technikák használatához. ^Például: Köhler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell Monoclonal Hybridoma Antibodies·. Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL., 1982) és így továbbj. A BCRFl-re specifikus monoklonális antitesteket termelő hibridómákat ezután egy második szűrésnek vetjük alá a fent leírt IFN-Qf -szuppressziós vizsgálat használatával, hogy kiválasszuk azokat, amelyek a BCRF1 biológiai aktivitását képesek blokkolni vagy neutralizálni.

Az antitest fragmentumok használata és előállítása ugyancsak jól ismert. {Például: Fab fragmentumok: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays ( Elsevier^ Amsterdam, 1985); és Fv fragmentumok: Hochman et al., Biochemistry, 12, 1130-1135 (1973); Sharon et al., Biochemistry, 15, 1591-1594 (1976); és Ehrlich et al., 4,355,023 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; és fél antitest molekulák: Auditore-Hargreavés, 4,470,925 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásj .

A találmány szerinti hibridómákat és monoklonális antitesteket rekombináns technológiával előállított, érett BCRF1 glükozilált vagy nem-glükozilált változatával — mint immuno génekkel — termeljük. Általában a BCRF1 nem-glükozilált változatait E.coli-ban és glükozilált változatait emlős gazdasejtekben .— például CV1 vagy COS majomsejtekben, egér L sejtekben, vagy hasonlókban — termeljük. A rekombináns technológiával előálított érett BCRFl-et úgy kapjuk, hogy egy expressziós vektort gazdasejtbe vezétünk be standard technológiák segítségével. £ Lásd például: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982); Okayama és Berg, Mól. Cell.Bioi., 2, 161-170 (1982) és 3, 280-289 (1983); Takebe et al., Mól.Cell.Bioi. , 8, 466-472 (1988); 4,599,308 és 4,675,285 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások; Kaufman et al., Mól. Cell. Bioi: , J2, 1304-1319 (1982); vagy hasonlók^. A bakteriális vagy emlős expressziós vektorok szerkesztését a szakemberek el tudják végezni, ha a kívánt proteint kódoló nukleotid szekvencia ismert vagy más módon hozzáférhető. Például: DeBoer a 4,551,433 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban a bakteriális expressziós vektorokhoz használt promoterekkel foglalkozik; Goeddel és munkatársai a 4,601,980 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és Riggs a 4,431,739 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban emlős proteinek termelését írják le E.coli expressziós rendszerekben, továbbá Riggs (lásd fentebb), Ferretti és munkatársai, Proc.Natl.Acad.Sci., 83, 599-603 (1986); Sproat és munkatár sai, Nucleic Acids Research, 13, 2959-2977 (1985) és Mullenbach és munkatársai, J.Bioi.Chem., 261, 719-722 (1986) a szintetikus gének szerkesztését ismertetik baktériumokban való kifejezés céljára. Ennek megfelelően ezeket a hivatkozásokat ebben a leírásban referenciaként használjuk fel. A BCRFl-et úgy is előállíthatjuk, hegy a C0S7 sejteket tranziens módon transzformáljuk pBCRFl(SRoO-val. Ezt a plazmidot az American Type Culture Collection (Rockvil)e, MD., USA) intézményben 68193 letéti számon helyeztük letétbe. A plazmid a találmány részét képezi. Az 1. ábrán a pBCRFl(SR«z) plazmid restrikciós térképe látható.

A BCRF1 cDNS leghosszabb nyílt leolvasási keretét az

1. számú szekvenciaváltozatban megadott aminosavszekvencia határozza meg. Az EBV genomot Baer és munkatársai (_Nature, 310. 207-211 (1964)J írták le. A BCRF1 cDNS nukleotid szekvencia a GenBank-tól 26-os szám alatt beszerezhető.

Ha a BCRF1 oldható formában fejeződik ki, például transzformált élesztő vagy emlős sejtek szekretált termékeként, tisztítását a szakma standard eljárásaival végezhetjük el. Ezek az eljárások a következő .lépéseket tartalmazzák: ammónium-szulfátos kicsapás, ioncserélő kromatográfia, és/vagy ezekhez hasonló eljárások. Lásd például: Enzyme Purification and Related Techniques, Methods in Enzymology, 22, 233-577 (1977) és Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982). A hivatkozott irodalom útmutatást ad az ilyen tisztítási eljárások kivitelezéséhez. Ha a BCRF1 oldhatatlan formában — például aggregátumok, ♦ ·

- 11 zárványtestek vagy hasonló formában — fejeződik ki, ezek a szakma standard eljárásaival ugyancsak tisztíthatok: a zárványtesteket centrifugálással választjuk el az elroncsolt gazdasejtektől, a zárvány testeket kaotróp szerekkel vagy redukáló szerekkel szolubilizáljuk, majd a kaotróp és redukáló szerek koncentrációját úgy csökkentjük, hogy a polipeptid biológiailag aktív konformációt Öltsön. Ez utóbbi eljárásokat a következő közlemények és szabadalmi leírások tartalmazzák: Winkler és munkatársai, Biotechnology, 2» 992-998 (1985); Koths és munkatársai, 4,569,790 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; és a 86306917.5 és

86306353.3 számú európai szabadalmi bejelentések. Az említett hivatkozásokat referenciaként használjuk.

A találmány szerinti hibridómákra jellemző antitesteket és antitest fragmentumokat rekombináns technológiával is előállíthatjuk. Ekkor úgy járunk el, hegy kivonjuk az mRNS-t, cDNS gyűjteményt hozunk létre, majd kiválasztjuk azokat a kiónokat, amelyek az antitest molekula szegmentumait

kódolják.	\| Például	: Wall	et	al . ,	Nucleic Acids Research, 5_,
3113-3128	(1978) ;	Zakut	et	al. ,	Nucleic Acids Research, 8,
3591-3601	(1980) ;	Cabilly	et al	Prcc. Natl. Acad. Sc:i. , 81,
3273-3277	(1984) j	Boss	et ;	al. ,	Nucleic Acids Research, 12,
3791-3806	(1984)';	Amster et al.	, Nucleic Acids Research, 2
2055-2065	(1980) ;	Moore	et	al. ,	4,642,334 számú amerikai

egyesült államokbeli szabadalmi leirás; Skerra et al . , Scienc:e, 240, 1038-1041 (1988); Huse et al., Science, 246, • ·

- 12 - ..........

1275-1281 (1989); Better et al., Science, 240, 1041-1043 (1988); Riechmann et al., Natúré, 332, 323-327 (1988)J . Ezeket a technikákat fel lehet használni olyan interspecifikus mcnoklonális antitestek előállítására, amelyekben az egyik faj kötő szakaszait a másik fajból származó, antitestet nem kötő szakasszal kombináljuk az immunogenitás csökkentése érdekében. [^Például: Liu és munkatársai, Proc.Natl.Acad. Sci., 8_4_, 3439-3443 (1987)J.

A találmány szerinti antagonistákat gyógyszerkészítmény formájában alkalmazzuk. Ezek a készítmények legalább egy találmány szerinti monoklonális antitestet vagy ennek fragmentumait tartalmazzák egy, a gyógyszergyártásban használt hordozóban. A gyógyszerhordozó bármilyen kompatibilis, nem toxikus anyag lehet, amely alkalmas arra, hogy a találmány szerinti készítményeket betegnek adhassuk be. Hordozók lehetnek a steril víz, alkohol, zsírok, gyanták és inért szilárd anyagok. Gyógyszergyártásban elfogadott adjuvánsokat (például: pufferhatású szerek és diszpergáló szerek) szintén hozzá lehet adni a gyógyszerkészítményhez. A gyógyszerek parenterális alkalmazásához megfelelő készítmények általában jól ismertek. [^Például: Remington's Pharmaceutical Science, 15. kiadás (Mack Publishing Company, Easton, PA., USA 1980/j . A találmány szerinti készítmények implantált vagy injektált gyógyszerkibocsátó rendszerek formájában is beadhatók a betegnek. (Például: Urguhart et al., Ann.Rev.Phcrmacol.Toxicol., 24, 199-236 (1984); Lewis (szerk.), Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New Ycrk, 1981);

• ·

Johrson et al., (szerk.), Drug Delivery Systems: Fundamentals and Techniques (Ellis Horwood, Ltd., London, 1987); 3,773,919 és 3,270,960 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi 1 e í r á s o k J.

Ha a találmány szerinti antagonisták antitest eredetűek, ezeket rendszerint parenterálisan, előnyösen intravénásan_i alka1mszzuk. Minthogy ezen protein vagy peptid antagohisták immunogének lehetnek,, ezeket előnyösen lassan adagoljuk vagy hagyományos, intravénás beadásra alkalmas szerelékkel vagy szubkután depúbói, ahogyan Tomasi és munkatársai a 4,732,863 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertették. Parenterális alkalmazás esetén az antitesteket vagy fragmentumokat egyadagos injekcióként formulázzuk (oldat, szuszpenzió, emulzió) egy, a gyógyszergyártásban elfogadott parenterális vivőanyaggal. A vivőanyagok önmagukban nem toxikusak és nem gyógyhatásúak. Ilyen vivőanyag például a normál (izotoniás) konyhasó oldat, a Ringer oldat, a glükóz oldat és a Hank oldat. Nem vizes vivőanyagokat is használhatunk, ilyenek az állandó olajok és az etil-oleát. Előnyös vivőanyag az 5 %-os glükóz/konyhasó oldat. A vivőanyag kis mennyiségben adalékanyagokat is tartalmazhat·, ilyenek az izotonicitást és a kémiai stabilitást biztosító anyagok, például a pufferek és konzerválószerek. Az antitestet előnyösen tisztított formában, lényegében aggregátumoktól, más proteinektől, endotoxinoktól és hasonló anyagoktól mentesen formázzuk, körülbelül 5-30 mg/ml, előnyösen 10-20 mg/ml

- 14 koncentrációban. Előnyös, ha az endotoxin szint 2,5 EU/mlnél alacsonyabb.

Egy antagonista alkalmazási formájának megválasztása számos faktortól függ: például az antagonistának a szérumban való átalakulási sebességétől, a BCRF1 szérum-szintjétől, az antagonista immunogén voltától, a cél-BCRFl hozzáférhetőségétől és így tovább. Előnyös, ha az alkalmazási forma maximalizálja a betegnek beadott antagonista mennyiségét, a mellékhatások elfogadható szintjével összhangban. Ennek megfelelően a beadott antagonista mennyisége egyrészt az adott antagonistától, másrészt a kezelendő állapot súlyosságától függ. A megfelelő adagolás megválasztásához útmutatást találunk az antitestek terápiás felhasználásával foglalkozó irodalomban. [_Például: Bach et al., Ferrone et al., (szerk.) Handbook of MonoclonalAntibodies (Noges Publications, Park Ridge, NO., USA, 1985) kiadványban; Russell, 303-357 old. és Smith et ál., 365-389 oldal és a Haber et al., (szerk.) Antibodies in Humán Diagnosis and Therapy (Raven Press, New York, 1977) kiadványban]. Amennyiben az antagonista mőnoklonális antitestekből vagy ezek Fab méretű fragmentumaiból áll (beleértve a kötésre képes készítményeket), az előnyös dózis

1-20 mg/kg/nap. Még előnyösebb, ha a dózis 1-10 mg/kg/nap tartományba esik.

Az alábbi példák a találmány jellemzőinek szemléltetéséül szolgálnak. A kiválasztott vektorokat, gazdasejteket, fúziós partnereket, a reagensek koncentrációját és hőmérsékle♦ 0*0» ·« ··** • · r «· le · · · ··

- £ 5 - ·«· ·00 000» tét, valamint az egyéb változók értékeit a találmányban csupán példákként szerepeltetjük, és ezekkel nem óhajtjuk korlátozni a találmány oltalmi körét.

1. példa

A BCRF1_ jif_e jezé je_C0Sj7 majom. sejtekbej

A BCRF1 nyílt leolvasási keretét meghatározó gént polimeráz láncreakcióval (PCR) sokszorozzuk, olyan primereket használva, amelyek lehetővé teszik, hogy a sokszorozott fragmentumot később EcoRI-gyel emésztett pcD(SRK) vektorba (1. ábra) építsük be. A beépített fragmentum kódoló szálát a 2. számú szekvencia vázlat ábrázolja. Itt a nyílt leolvasási keretet 3 betűvel jelzett csoportokkal adjuk meg az ATG START szignál kodonjától a TGA STOP kodonig.

A megfelelő irányitottságú inszertumot tartalmazó kiónokat a BCRF1 expressziója segítségével és/vagy a restrikciós emésztések elektroforetikus képe alapján azonosítjuk. Egy ilyen vektor, mely a BCRF1 gént hordozza, pBCRFl(SR χ) elnevezést kapott, és letétbe helyeztük az American Type Culture Collection intézményben 68193 letéti szám alatt. A pBCRFl(SRrz)át E.coli MC1O61 sejtekben sokszorozzuk, standard technikákkal izoláljuk és COS7 majomsejtek transzfekciójára használjuk a következőképpen: a transzfekció előtt egy nappal, körülbelül 1,5 x 10^ C0S7 majomsejtet oltunk le egyedi 100 mm-es lemezekre, Dulbecco által módosított, 5 % fetális borjú szérumot (FCS) és 2 mM glutamint tartalmazó Eagle táptalajra (DME).

·« «··· • · · · * «·* ··« · · ·»

- 16 A transzfekció keresztülviteléhez a COS sejteket tripszinnel való inkubálással távolítjuk el a lemezekről, kétszer mossuk szérum-mentes DME-ben és szérum-mentes DME-ben szuszpendáljuk 10⁷ sejt/ml sűrűségben. A szuszpenzió 0,75 ml alikvot részéhez 20 ^ug DNS-t keverünk, és átvisszük egy steril, 0,4 cm-es elektroporációs küvettába. A sejteket 10 perc múlva 200 V, 960 jjF mellett pulzáljuk BioRad féle GenePulser készülékben. Újabb 10 perc múlva a sejteket eltávolítjuk a küvettából, és bevisszük 20 ml 5 % FCS, 2 mM glutamin, penicillin, sztreptomicin és gentamicin tartalmú DME-be. Az elegyet négy egyenlő részben 100 mm-es szövettenyésztő csészére visszük. A csészéket 12-24 órán át 37 °C-on 5 % szén-dioxid mellett tartjuk, majd a táptalajt hasonló, csak 1 % FCS-t tartalmazó táptalajra cseréljük, és az inkubálást tovább folytatjuk 72 órán át 37 °C-on, 5 % szén-dioxid mellett.

Ezt követően a táptalajt összegyűjtjük, és arra vizsgáljuk, hogy képes-e gátolni az IFN-j szintézisét.

Frissen izolált perifériás vér limfocitákat tartalmazó szuszpenzió (körülbelül 2x10^ /jg/ml) 10 ml-eit 37 °C-on PHA-val (100 yug/ml) inkubáljuk olyan táptalajban, melynek 90 %-a 5 % FCS-sel és 2 mM glutaminnal kiegészített DME-ből és 10 Va az előzőleg pBCRFl(SROC )-val transzf iciált C0S7 sejtek felülúszójából áll. A sejteket és a felülúszókat 24 óra múlva aratjuk le, és akár IFN-y mRNS, akár IFN-^ protein jelenlétére vizsgáljuk. A kontrollokat azonos módon kezeljük, kivéve, hogy a 10 % felülúszó olyan C0S7 tenyészetekből szár·ν·«

- 17 ·· · · · • *44 • 4 4 44

4*4 44* 4«·· mazik, amelyet előzőleg egy nem rokon cDNS inszertumot hordozó plazmiddal transzformáltunk. A BCRFl-gyel kezelt minták az IFN-^ szintézisre körülbelül 50 %-os gátlást fejtettek ki a kontrolihoz képest.

2. példa

BCRF1_ ki£eje^é_se_Esch_e.rich_ia_C£M sejtekben.

Az érett BCRFl-et kódoló gén — a 3. számú szekvenciavázlat írja le — kifejezhető E.coliban.

A pBCRFl(SRoC) cDNS inszertumát M13 plazmidba klónozzuk be, amikoris kétszer módosítjuk helyre irányuló mutagenezissel: először egy Clal helyet képezünk az érett BCRF1 polipeptidet kódoló szakasz 5’ végén, másodszor egy BamHI helyet képezünk az érett BCRF1 polipeptidet kódoló szakasz 3’ végén. A mutagenizált szekvenciát ezután könnyen beépíthetjük az alább leírt TRPC11 expressziós vektorba.

A TRPC11 vektort úgy szerkesztjük, hogy egy szintetikus, általánosan elfogadott RBS fragmentumot Clal link'erekhez (ATGCAT) ligálunk, majd a kapott fragmentumokat a Clal-gyel hasított pMTllhc plazmidba (melyet előzőleg úgy módosítottunk, hogy Clal helyet tartalmazzon) klónozzuk be. A pMTllhc a pBR322 plazmid egy kisméretű (2,3 kilobázis méretű), magas másolatszámú, AMP TÉT származéka, amely a JfVX plazmid EcoRI-HindlII polilinker szakaszait hordozza (a 5ÍVX leírását lásd: Maniatis »* ·«·« ·· J* • ·«« ·· « • « « «9 ·♦· « « * *··β

- 18 et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982). Ezt a plazmidot módosítottuk úgy, hogy Clal helyet tartalmazzon. Úgy jártunk el, hogy a pMTllhc-t EcoRI-gyel és BamHI-gyel hasítottuk, a kapott 5’_tragadós végeket betöltöttük^ és Clal linkerrel (CATCGATG) ligáltuk, miáltal visszaállítottuk az EcoRI és BamHI helyeket, ée a Smal helyet, Clal hellyel cseréltük ki. A TRPC11 szerkezet egy transzformált egyede tandem RBS (RBS = ribosome binding site) szekvenciát tartalmazott, melyet Clal helyek határoltak. Az egyik Clal helyet és az RBS szekvencia második másolatának egy részét olyan módon távolítjuk el, hogy e plazmidot Pstlgyel emésztjük, Bal31 nukleázzal kezeljük, EcoRI-gyel hasítjuk és T4 DNS polimerázzal kezeljük a négy dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében. A kapott 30 - 40 bp méretű fragmentumokat PAGE segítségével izoláljuk, és beklónozzuk Smal-gyel hasított pUC12-be. A pKCIOl-ből [Nichols et al., Methods in Enzymology, 101, 155 old. Academic Press, N.Y. (1983)J származó 248 bp méretű E.coli trpP-t hordozó EcoRI fragmentumot ezután beklónozzuk az EcoRI helyre, hogy teljessé tegyük a TRPC11 szerkezetét, amelyet a 2. ábrán mutatunk be. A TRPC11et használjuk vektor gyanánt a BCRF1 számára úgy, hogy először Clal-gyel és BamHI-gyel emésztjük, tisztítjuk, majd összehozzuk az érett BCRFl-et kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó M13 Clal-BamHI fragmentumával, standard ligáló oldatban. Az inszertumot tartalmazó TRPCll-et — elnevezése: TRPC11-BCRF1 —

E.coli K12 0M101 törzsben hozzáférhető például az ATCC « * · «··« ·· 4 <4« • »«4 ·&« · · «♦ ··· ··· »·<·· intézménynél 33876 letéti szám alatt — szaporítjuk el.

3. példa

B.CR_Fl_-£eu_t£aMz^ál_Ló_m£n£kl_oriál^i£ a_n_tit_^e£t_termelé£e_

Hím Lewis patkányt immunizáltunk COS7 sejtek által kifejezett, tisztított BCRF1 készítményekkel. A patkányt először 1 ml komplett Freund adjuvánssal emulgeált 1 ml BCRF1 oldattal (50—100 /jg/ml BCRF1 10 ml 0,5 M nátrum-klorid tartalmú 10 mmólos trisz.HCl-ben) oltottuk, majd kétszer kapott az állat emlékeztető oltást azonos mennyiségű anyaggal inkomplett Freund adjuvánsban. Vérmintákat vettünk. Az állat egy utolsó emlékeztető oltóanyaga foszfáttal pufferolt konyhasó oldatban feloldott 25 /jg BCRFl-et tartalmazott. Négy nappal később a lépet kivettük fúzió céljára.

Körülbelül 3 x 10 patkány lépsejtet fuzionáltunk azonos mennyiségű P3X63-AG8.653 egér myeloma sejtekkel (beszerezhető az ATCC-től CRL 1580 letéti számon), polietilén-glikol használatával. A sejtszuszpenziót (körülbelül 3,5 x 10⁵ sejt/ml HAT táptalajban, negyven 96 tartályos mikrotitráló lemezre osztottuk szét a Chrétien és munkatársai . Immunoi. Meth . , 117 , 67-81 (1989)J által leírt technológia szerint. Tíz nap múlva a hibridóma felülúszókat arra vizsgáltuk, hogy képesek-e kötődni a mikrotitráló lemezeken közvetlenül immobilizált BCRFl-hez (indirekt ELISA) vagy az immobilizált nyúl poliklonális anti-BCRFl IgG frakcióhoz kötött BCRFl-hez. A megkötött antitestet peroxidázzal konjugált kecske anti-patkány immunglobulinnal mutattuk ki, standard eljárást alkalmazva.

A BCRFl-gyel reagáló antitesteket szekretáló hibridómákat határhigításos módszerrel klőnojtuk. A kiválasztott hibridómákat -70 °C-on, 10 % DMSO (dimetil-szulfoxid) tartalmú táptalajban tároljuk, és standard emlős-sejt tenyésztésére alkalmas technikákkal tenyésztjük (például: 1 mM glutaminnal és 50 mM 2-merkapto-etanollal kiegészített, 10 % fetális marhaszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban). A BCRF1-blokkoló antitesteket termelő hibridómákat azon az alapon választjuk ki a BCRF1 specifikus antitesteket termelő hibridómák csoportjából, hogy mennyire képesek az IFN-^r termelés BCRFl-indukálta szuppresszióját kivédeni a fent leírt vizsgálatban .

A találmány előbbiekben leírt megvalósítási módozatait a szemléltetés és jellemzés céljából ismertettük. A leírás nem kívánt részletekbe bocsátkozni, és nem kívánta korlátozni a találmány oltalmi körét a leírt speciális megoldásokra, ugyanis kétségkívül számtalan módosítás és változtatás eszközölhető a fentiekben előadottak alapján. A kiviteli formákat úgy választottuk meg és úgy írtuk le, hogy azok a találmány elveinek legjobb magyarázatát adják. A gyakorlott szakemberek tehát jól tudják hasznosítani a találmányt különböző kiviteli formákban és különböző módosításokkal is, minthogy az ismertetett kiviteli formák egy elképzelt speciális felhasználáshoz is alkalmasak. A találmány elveit a csatolt szabadalmi igény pontokban határoztuk meg.

A bejelentők a pBCRFl(SRoc) hordozó E.coli MC 1061 törzset az American Type Culture Collection intézményben (RockΛ vilié, MD., USA, ATCC) helyezték letétbe 68193 letéti szám alatt. A letétbehelyezést az ATCC szabadalmi Célokat Szolgáló Letétek-re vonatkozó megállapodásban kikötött feltételek mellett hajtották végre. E megállapodás biztosítja, hogy a letét — a 35 USC 122 és 37 CFR 1.14 értelmében i — rendelkezésre álljon az Egyesült Államok szabadalmak és védjegyek ügyében eljáró kormánybiztosa számára, és egy egyesült államokbeli szabadalmi vita esetében a nyilvánosság számára. Fentiek megkívánják a letét fenntartását. A letétbehelyezett törzs hozzáférhetősége nem úgy értelmezendő, hogy a szabadalmat fel lehet használni azon jogok megsértésével, amelyeket az egyes kormányok hatalmi szervei szabadalmi törvényeikben elfogadtak.

A letétbehelyezés a Budapesti Egyezmény a Mikroorganizmusok Letétbehelyezéséről előírásai szeint került módosítás

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. BCRF1 antagonista felhasználása Epstein-Barr vírusbetegség kezelésére alkalmas gyógyszer előállításához.
2. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, azzal jellemezve, hogy az említett BCRF1 antagonistát a ^-interferon BCRFl-indukálta szuszpresszióját blokkolni képes monoklonális antitestek közül vagy a ^-interferon BCRFl-indukálta szuppresszióját blokkolni képes monoklonális antitest fragmentumai közül választjuk ki, és hogy a kötésre képes készítmény egy olyan monoklonális antitest nehéz lánc variábilis szakaszát és könnyű lánc variábilis szakaszát tartalmazza, amely a ^-interferon BCRFl-indukálta szuppresszióját. blokkolni képes.
3. A 2. igénypont szerinti felhasználás, azzal jellemezve, hogy az említett monoklonális antitest említett fragmentuma Fab fragmentum.
4. Eljárás Epstein-Barr vírussal fertőzött beteg kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy BCRF1 antagonista hatásos mennyiségének alkalmazásából áll.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett BCRF1 antagonistát a ^-interferon BCRFl-indukálta szuppresszióját blokkolni képes monoklonális antitestek közül vagy egy a ^-interferon BCRFl-indukálta szuppreszszióját blokkolni képes monoklonális antitest fragmentumai közül választjuk ki, és hogy a kötésre képes készítmény egy olyan monoklonális antitest nehéz lánc variábilis szakaszát és könnyű lánc variábilis szakaszát tartalmazza, amely a ^-interferon BCRFl-indukálta szuppresszióját blokkolni képes.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett monoklonális antitest említett fragmentuma Fab fragmentum.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett monoklonális antitestet humán-humán hibridóma termeli.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett monoklonális antitest említett fragmentuma Fab fragmentum.
9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett monoklonális antitest humán monoklonális antitest.
10. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett alkalmazás esetén az említett antagonista körülbelül 1-20 mg/kg-testtömeg mennyiségét adjuk intravénásán a betegnek naponta.
11. BCRF1 antagonista alkalmazása Epstein-Barr vírusbetegség kezelésére.