NO180637B - Fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale antistoffer eller fragmenter derav - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale antistoffer eller fragmenter derav for behandling av endotoksinbærende bakterieinfeksjoner.

Oppfinnelsens bakgrunn

Innføringen av angripende stimuli, slik som para-sitt-, bakterie- eller virusinfeksjoner, eller neoplastiske celler, induserer betydelige metabolske endringer hos den mot-takelige vert. Dersom de er alvorlige, kan endringene til sist avbryte normale homøostatiske mekanismer, både lokalt og systemisk, noe som fører til uttømming av vertsenergilagre og føre frem til utmagring (kakeksi), vevsskade, multippel organ-systemsvikt, sjokk og død.

Inntil nylig trodde legene at de systematiske mønstre primært skyldtes virkninger av selve de angripende agenser. Det er imidlertid nå kjent at de angripende stimuli forårsaket at verten genererte forskjellige cytokiner, hvis kombinerte virkninger forårsaker det meste av de uønskede biologiske responser. Disse vertsutvundne betennelsesmediatorer gir nye muligheter for utvikling av behandlingskurer mot en rekke forskjellige inflammatoriske sykdomstilstander.

Et av de sterkeste cytokiner er kakektin som først og fremst frigjøres av makrofager etter passende stimulering. Kakektin, også kjent som tumornekrosefaktor, er et protein med 157 aminosyrer som normalt finnes ln vivo som en dimer eller annen multimer. Den beregnede molekylvekt til human TNF-mono-mer er ca. 17.000 dalton.

Kakektin virker ved å undertrykke biosyntese av flere adipocyttspesifikke proteiner, slik som lipoproteinlipase. Det virker også til å indusere biosyntesen eller frigjørelsen av tallrike andre proteiner, inkludert klasse I hoved-histokompa-tibilitetsantigen, granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor og interleukin 1 (se generelt Beutler og Cerami, New Eng. J. of Med.. 316:379-385 [1987]).

Erkjennelsen av kakektins brede innflytelse på forskjellige sykdomstilstander har ført til forsøk på å kontrollere dets virkning. For eksempel har forsøk vist at antistoffer som reagerer spesifikt med kakektin, kan være terapeutisk anvendbare til å kontrollere de immunomodulerende responser som nå er kjent for å være forbundet med kakektin (se U.S. patentskrifter nr. 4.603.106 og 4.684.623). Særlig har nøytraliserende antistoffer med evne til å binde forskjellige epitoper på humankakektin med høy affinitet et betydelig potensial for mediering av de toksiske virkninger av for høye kakektinnivåer.

Det foreligger følgelig et behov for forbedrede antistoffer som kan nøytralisere de toksiske virkningene av kakektin in vivo. Foreliggende oppfinnelse oppfyller disse behov.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale antistoffer eller fragmenter derav for behandling av endotoksinbærende bakterieinfeksjoner, hvor de monoklonale antistoffene eller fragmentene derav har de følgende egenskaper: a) det monoklonale antistoff eller fragmentet derav binder humankakektin spesifikt, b) mindre enn 400 ng av det monoklonale antistoff eller fragmentet derav vil nøytralisere 20 ng humankakektin i

en L929-cellecytolytisk analyse,

c) det monoklonale antistoff eller fragmentet derav blokkerer bindingen av monoklonale antistoffer produsert av

ATCC HB9736 eller ATCC HB9737 til kakektin, og

d) de monoklonale antistoffene eller fragmentene derav er beskyttende mot endotoksemi in vivo.

Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at en cellelinje som er i stand til å produsere monoklonale antistoffer eller fragmenter derav, dyrkes, og de monoklonale antistoffene eller fragmentene derav utvinnes.

Beskrivelse av de bestemte utførelsesformene

Ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes det nye celler med evne til å produsere nøytraliserende monoklonale antistoffer med ønskede affiniteter. Antistoffene kan anvendes i preparater som er i stand til selektivt å gjenkjenne epitoper som er til stede på humankakektin. De foreliggende celler har identifiserbare kromosomer hvor bakterielinje-DNA fra dem eller en forløpercelle er blitt omordnet slik at den koder for et antistoff med et bindingssete for en ønsket epitop på humankakektin. Disse monoklonale antistoffene kan anvendes på en lang rekke forskjellige måter, inkludert diagnose og terapi.

De således tilveiebrakte monoklonale antistoffer er særlig anvendbare, sammenlignet med tidligere kjente antistoffer, ved behandlingen eller profylaksen av alvorlige sykdom-mer, slik som bakteriemi, sårbetennelse, kakeksi eller andre sykdomstilstander forbundet med forhøyede nivåer av kakektin. Antistoffene vil således vanligvis ha nøytraliserende aktivitet ved mindre enn 400 ng, fortrinnsvis mindre enn ca. 300 ng, helst ca. 50-200 ng, i den L929-cellecytolytiske analyse. Dette høyere aktivitetsnivå muliggjør benyttelse av betydelig lavere doseringsnivåer for behandlinger.

Fremstillingen av monoklonale antistoffer kan utføres ved å udødeliggjøre en cellelinje med evne til å uttrykke nukleinsyresekvenser som koder for antistoffer som er spesifikke for en passende epitop på humankakektin. Den udødelig-gjorte cellelinje kan være en pattedyrcellelinje som er blitt omdannet ved onkogenese, ved transfeksjon, mutasjon eller lignende. Slike celler omfatter myelomlinjer, lymfomlinjer eller andre cellelinjer som er i stand til å understøtte ekspresjonen og utskillelsen av immunoglobulinet eller bindende fragment derav in vitro. Immunoglobulinet eller fragmentet kan være et naturlig forekommende immunoglobulin fra et annet pattedyr enn de foretrukne muse- eller menneske-kilder, fremstilt ved transformasjon av en lymfocytt, særlig en splenocytt, ved hjelp av et virus, eller ved fusjon mellom lymfocytten og en neoplastisk celle, f.eks. et myelom, hvorved det fås en hybridcellelinje. Vanligvis vil splenocytten bli erholdt fra et dyr som er immunisert mot kakektinbeslektede antigener eller fragmenter derav, og som inneholder et epitop-sete. Immuniseringsfremgangsmåter er godt kjente og kan variere betydelig, men likevel være effektive (se Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. 2. utg.,

Academic Press, N.Y. [1986]).

Hybridcellelinjene kan klones og sorteres ifølge vanlige teknikker, og antistoffer som er i stand til å bindes

til de ønskede humane kakektindeterminanter med passende affiniteter kan påvises i cellesupernatantene. De passende hybridcellelinjene kan så dyrkes i storskalakultur eller injiseres i bukhulen til en passende vert for produksjon av antistoffer i

ascitesvæske.

I og med at man har antistoffene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, som er spesifikke for humankakektin-proteinet, kan supernatantene i de etterfølgende forsøk i noen tilfeller undersøkes i en konkurranseanalyse med de foreliggende monoklonale antistoffer som et middel for å identi-fisere ytterligere eksempler på de ønskede antihumankakektin monoklonale antistoffer (såkalte "blokkerende antistoffer"). Hybridcellelinjer kan således lett produseres fra flere forskjellige kilder basert på tilgjengeligheten av foreliggende antistoffer som er spesifikke for de bestemte kakektindeter-minantene ved de passende affinitetsnivåer.

Alternativt kan, når det er tilgjengelig hybridcellelinjer som produserer antistoffer som er spesifikke for de foreliggende epitopseter, disse hybridcellelinjene fusjoneres med andre neoplastiske B-celler, hvor slike andre B-celler kan tjene som mottakere for genom-DNA som koder for antistoffene. Disse antistoffene kan være funksjonelle på celleoverflaten og, f.eks., ikke som reseptorer. Selv om neoplastiske B-celler fra gnagere, særlig murine celler, benyttes vanligvis, kan andre pattedyrarter anvendes, slik som hare-, storfe-, saue-, heste- eller grisearter, eller fjærfe eller lignende.

De monoklonale antistoffene kan være av hvilken som helst av klassene eller underklassene av immunoglobuliner, slik som IgM, IgD, IgA eller IgE, eller underklasser av IgG som er kjent for hver dyreart. Generelt kan de monoklonale antistoffene anvendes intakte, eller som bindende fragmenter, slik som Fv, Fab, F(ab')2, men vanligvis intakte.

Cellelinjene som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan finne andre anvendelser for den direkte produksjon av de monoklonale antistoffene. Cellelinjene kan fusjoneres med andre celler (slik som passende legemiddelmerkede humanmyelom-, musemyelom- eller humanlymfo-blastoidceller), hvorved det fås hybridomer eller triomer, og således sørge for overføringen av genene som koder for de monoklonale antistoffene. Alternativt kan cellelinjene brukes som en kilde for kromosomene som koder for immunoglobulinene, som kan isoleres og overføres til celler ved hjelp av andre teknikker enn fusjon. I tillegg kan genene som koder for de monoklonale antistoffene, isoleres og brukes i henhold til teknikker med rekombinant DNA til fremstillingen av det bestemte immunoglobulin i flere forskjellige verter. Særlig kan, ved å fremstille cDNA-biblioteker fra budbringer-RNA, en enkelt cDNA-klon som koder for immunoglobulinet og er fri for introner, isoleres og plasseres i egnede prokaryote eller eukaryote ekspresjonsvektorer og deretter transformeres i en vert for endelig masseproduksjon (se generelt U.S. patentskrifter nr. 4.172.124, 4.350.683, 4.363.799, 4.381.292 og 4.423.147. Se også Rennett et al., Monoclonal Antibodies. Plenum, New York [1980] og henvisninger som er gitt der).

Nærmere bestemt kan immunoglobulinene eller fragmentene fremstilles i bakterier eller gjær i henhold til hybrid-DNA-teknikk (se Boss et al., Nucl. Acid. Res.. 12:3791 og Wood et al., Nature, 314:446). For eksempel kan budbringer-RNA tra-nsskribert fra genene som koder for de lette og tunge kjedene i de monoklonale antistoffene, fremstilt ved hjelp av en cellelinje som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, isoleres ved hjelp av differensiell cDNA-hybridi-sering under anvendelse av annen cDNA fra BALB/c-lymfocytter enn den foreliggende klon. mRNA som ikke hybridiserer, vil være rik på budskapet som koder for de ønskede immunoglobulin-kjeder. Om nødvendig kan denne fremgangsmåten gjentas for ytterligere å øke nivåene av den ønskede mRNA. Det fratrukne mRNA-preparat kan så revers-transskriberes, hvorved man får en cDNA-blanding som er anriket på de ønskede sekvenser. RNA kan hydrolyseres ved en passende RNAse, og ssDNA kan gjøres dobbelttrådet med DNA-polymerase I og vilkårlige primere, f.eks. vilkårlig fragmentert kalvethymus-DNA. Den resulterende dsDNA kan så klones ved innføring i en passende vektor, f.eks. virusvektorer, slik som lambdavektorer eller plasmidvektorer

(slik som pBR322, pACYC184 etc). Ved å utvikle prober basert på kjente sekvenser for de konstante områdene i de lette og tunge kjedene, kan de cDNA-klonene som har gener som koder for de ønskede lette og tunge kjedene, identifiseres ved hybridi-sering. Deretter kan genene skjæres ut fra plasmidene, mani-puleres for å fjerne overflødig DNA oppstrøms fra initierings-kodonet eller konstantområde-DNA, og så innføres i en passende vektor for transformasjon av en vert og endelig ekspresjon av genet.

Passende kan pattedyrverter (f.eks. museceller) anvendes til å fremstille kjeden (f.eks. knytte de tunge og lette kjedene sammen), hvorved man får et intakt immunoglobulin, og dessuten utskille immunoglobulinet fritt for leder-sekvensen om ønsket. Alternativt kan man bruke encellede mikroorganismer for å fremstille de to kjedene, hvor ytterligere manipulasjon kan være påkrevet for å fjerne DNA-sekvensene som koder for de sekretoriske leder- og prosesserings-signaler, mens man sørger for et initieringskodon i 5'-enden til sekvensen som koder for den tunge kjeden. På denne måten kan immunoglobulinene fremstilles og bearbeides slik at de settes sammen og glykolyseres i andre celler enn pattedyr-celler. Om ønsket kan hver av kjedene avkortes slik at i det minste det variable område beholdes, områder som så kan mani-puleres slik at det sørges for å få andre immunoglobuliner, eller fragment som er spesifikt for kakektinepitopene (se f.eks. europeiske patentsøknader med publikasjonsnummer 0239400 og 0125023).

De monoklonale antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er særlig anvendbare på grunn av sin høye affinitet for epitoper til humankakektin. Noen av de monoklonale antistoffene er også beskyttende in vivo, noe som muliggjør inkorporering i farmasøytiske produk-ter, slik som antistoffkombinasjoner for bakterieinfeksjoner.

Monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også finne et stort antall forskjellige anvendelser in vitro. For eksempel kan de monoklonale antistoffene benyttes til å rense naturlig forekommende eller rekombinant humankakektin for selektivt å fjerne humankakektin i en heterogen blanding av proteiner eller lignende.

For diagnoseformål kan de monoklonale antistoffene enten være merket eller umerket. Vanligvis medfører diagnose-analysene å påvise dannelsen av et kompleks gjennom bindingen av det monoklonale antistoff til proteinet. Når de er umerkede, finner antistoffene anvendelse i agglutinerings-analyser. I tillegg kan umerkede antistoffer anvendes sammen med andre merkede antistoffer (andre-antistoffer) som reagerer med det monoklonale antistoff, slik som antistoffer som er spesifikke for immunoglobulin. Alternativt kan de monoklonale antistoffene være direkte merket. Et stort antall forskjellige markører kan anvendes, slik som radionuklider, fluorescerende midler, enzymer, enzymsubstrater, enzymkofaktorer, enzym-inhibitorer, ligander (særlig haptener) etc. Et stort antall typer av immunologiske analyser er tilgjengelig, og f.eks. omfatter noen de som er beskrevet i U.S. patentskrifter nr. 3.817.827, 3.850.752, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074 og 4.098.876.

Vanligvis benyttes de monoklonale antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse i enzym-immunoanalyser, hvor de foreliggende antistoffer, eller andre-antistof f er fra en annen art, er konjugert til et enzym. Når en prøve som inneholder humankakektin, slik som humant blod eller lysat derav, blandes med de foreliggende antistoffer, oppstår binding mellom antistoffene og de molekylene som oppviser den ønskede epitop. Slike komplekser kan så sepa-reres fra de ikke-bundne reagenser, og et andre-antistoff (merket med et enzym) tilsettes. Deretter bestemmes tilstedeværelsen av antistoff-enzymkonjugatet som er spesifikt bundet til cellene. Andre vanlige teknikker som er godt kjent for fagfolk innen teknikken, kan også benyttes.

Prøvesett kan også leveres for bruk sammen med de foreliggende antistoffer til påvisning av humankakektin i opp-løsninger, eller tilstedeværelsen av humankakektinepitoper i rekombinante fraksjoner. Et slikt preparat med monoklonalt antistoff fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan således tilveiebringes, vanligvis i en lyo-filisert form, enten alene eller sammen med antistoffer som er spesifikke for endotoksiner, eksotoksiner eller gramnegative bakterier. Antistoffene som kan være konjugert til en markør eller ikke-konjugert, er inkludert i prøvesettene sammen med buffere, slik som tris, fosfat, karbonat etc, stabiliserings-midler, biocider, inerte proteiner, f.eks. bovint serumalbumin eller lignende. Generelt vil disse stoffene være til stede i mindre enn ca. 5 vekt%, basert på mengden av aktivt antistoff, og vanligvis til stede i en samlet mengde på minst ca.

0,001 vekt%, igjen basert på antistoffkonsentrasjonen. Ofte vil det være ønskelig å ta med et inert fyllstoff eller en eksipiens for å fortynne de aktive bestanddelene, idet eksi-piensen kan være til stede ved fra ca. 1 til 99 vekt% av den totale blanding. Når et andre-antistoff med evne til å binde til det monoklonale antistoff anvendes, vil dette vanligvis være til stede i en separat ampulle. Det andre antistoff er vanligvis konjugert til en markør og formulert på en analog måte med antistoffpreparatene beskrevet ovenfor.

De monoklonale antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også være inkorporert som be-standdeler i farmasøytiske preparater som inneholder en terapeutisk eller profylaktisk mengde av minst ett, men vanligvis en blanding som omfatter to eller flere, av de monoklonale antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen sammen med en farmasøytisk effektiv bærer. En farmasøytisk bærer bør være et hvilket som helst kompatibelt, ikke-toksisk stoff egnet til å avgi de monoklonale antistoffene til pasienten. Sterilt vann, alkohol, fettstoffer, voksstoffer og inerte, faste stoffer kan anvendes som bærer. Farmasøytisk godtatte adjuvanser (buffermidler, dispergeringsmidler) kan også være inkorporert i det farmasøytiske preparat. Slike preparater kan inneholde monoklonale antistoffer som bare er spesifikke for humankakektin. Alternativt kan et farmasøytisk preparat som inneholder monoklonale antistoffer som reagerer direkte med bakterier, benyttes til å danne en "cocktail". For eksempel ville en "cocktail" som inneholder monoklonale antistoffer mot humankakektinepitoper og motgrupper av de forskjellige bakteriestammer (f.eks. forskjellige serotyper) som forårsaker sårbetennelse, være et universalprodukt med aktivitet mot den store majoritet av de kliniske isolater som er

ansvarlige for sykdommen.

Molforholdet mellom de forskjellige bestanddelene som består av monoklonalt antistoff, vil vanligvis ikke atskille seg med mer enn en faktor på 10, mer vanlig med ikke mer enn en faktor på 5, og vil vanligvis være i et molforhold på ca. 1:1-2 i forhold til hver av de andre antistoffbestanddelene. Når de anvendes i blanding, vil de monoklonale antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse vanligvis bli brukt i like molforhold.

De monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i kombinasjon med eksisterende blodplasmaprodukter, slik som kommersielt tilgjengelig gammaglobulin- og immunoglobulin-produkter som brukes i profylaktisk eller terapeutisk behandling av bakteriell sårbetennelse hos mennesker. For immunoglobuliner vil plasmaet fortrinnsvis bli erholdt fra menneske-donorer som oppviser forhøyede nivåer av immunoglobuliner som reagerer med endotoksinbærende bakterier (se generelt kompen-diet "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer. J. Med.. 76 (3a), 30. mars, 1984, s. 1-231.

De monoklonale antistoffer kan også anvendes som separat administrerte preparater gitt sammen med antibiotika eller antimikrobielle midler. Vanligvis kan de antimikrobielle midler omfatte et penicillin sammen med et aminoglykosid (f.eks. gentamicin, tobramycin etc), men et stort antall til-leggsmidler (f.eks. cefalosporiner) som er godt kjent for fagfolk innen teknikken, kan også benyttes.

De monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og farmasøytiske preparater derav er særlig anvendbare for oral eller parenteral administrering. Fortrinnsvis kan de farmasøytiske preparater administreres parenteralt, dvs. subkutant, intramuskulært, intraarterielt eller intravenøst. Det kan således tilveiebringes preparater for parenteral administrering som omfatter en oppløsning av det monoklonale antistoff eller en "cocktail" derav oppløst i akseptabel bærer, fortrinnsvis en vandig bærer. Det kan anvendes flere forskjellige vandige bærere, f.eks. vann, bufret vann, 0,4 % saltoppløsning, 0,3 % glysin og lignende. Disse oppløsningene er sterile og generelt frie for partikkelformig stoff. Disse preparatene kan steriliseres ved hjelp av vanlige, godt kjente steriliseringsteknikker. Preparatene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpestof-fer etter behov for å nærme seg fysiologiske betingelser, slik som pH-reguleringsmidler og buffermidler, toksisitetsregu-lerende midler og lignende, f.eks. natriumacetat, natrium-klorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, natriumlaktat etc. Antistoff konsentrasjonen i disse preparatene kan variere bredt, dvs. fra mindre enn ca. 0,5 vekt%, vanligvis ved eller i det minste omkring 1 vekt% til så mye som 15 eller 20 vekt%, og vil velges hovedsakelig basert på væskevolumer, viskositeter etc., fortrinnsvis for den bestemte administreringsmåte som velges.

Et typisk farmasøytisk preparat for intramuskulær injeksjon ville således kunne lages slik at det inneholder 1 ml sterilt, bufret vann og 500 mg monoklonalt antistoff. Et typisk preparat for intravenøs innsprøyting kunne lages slik at det inneholder 250 ml steril Ringers oppløsning og 150 mg monoklonalt antistoff. Aktuelle fremgangsmåter for fremstilling av parenteralt administrerbare preparater vil være kjente eller åpenbare for fagfolk innen teknikken og er beskrevet nærmere i f.eks. Remington' s Pharmaceutical Science. 15. utg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).

De monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan lyofiliseres for lagring og re-kondisjoneres i en egnet bærer før bruk. Denne teknikken er blitt påvist å være effektiv med vanlige immunoglobuliner, og vanlig kjente lyofiliserings- og rekondisjoneringsteknikker kan anvendes. Det vil forstås av fagfolk innen teknikken at lyofilisering og rekondisjonering kan føre til varierende grader av antistoffaktivitetstap (med f.eks. vanlige immunoglobuliner er IgM-antistoffer tilbøyelige til å ha større aktivitetstap enn IgG-antistoffer), og at bruksnivåer vil kunne måtte bli regulert for å kompensere.

Preparatene som inneholder de foreliggende monoklonale antistoffer eller en "cocktail" derav, kan administreres for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling av hvilken som helst av flere forskjellige bakterieinfeksjoner. Ved terapeutisk anvendelse administreres preparater til en pasient som allerede er smittet med én eller flere bakteriestammer, i en tilstrekkelig mengde til å helbrede eller i det minste delvis stanse infeksjonen og dens komplikasjoner. En passende mengde for oppnåelse av dette er definert som en "terapeutisk effektiv dose". Mengder som er effektive for dette, vil avhenge av alvorligheten av infeksjonen og den generelle tilstand i pasientens eget immunsystem, men varierer generelt fra ca. 1 til ca. 200 mg antistoff pr. kg kroppsvekt, idet doseringer fra 5 til 25 mg pr. kg vanligvis brukes. Det må huskes at stoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse generelt kan anvendes ved alvorlige sykdomstilstander, dvs. livstruende eller potensielt livstruende situasjoner, spesielt bakteriemi og endotoksemi.

Ved profylaktiske anvendelser administreres preparater som inneholder det foreliggende antistoff eller en "cocktail" derav til en pasient som ikke allerede er smittet, for å øke pasientens motstandsevne mot potensielle infeksjoner. En slik mengde er definert som en "profylaktisk effektiv dose". Ved denne bruk avhenger igjen de nøyaktige mengder av pasientens helsetilstand og generelle immunitetsnivå, men varierer generelt fra 0,1-25 mg pr. kg, spesielt 0,5-2,5 mg pr. kg.

Enkle eller multiple administreringer av preparatene kan utføres med dosenivåer og -mønstre valgt av den behand-lende lege. I alle tilfeller bør de farmasøytiske preparater gi en mengde antistoff(er) fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som er tilstrekkelig til effektivt å behandle eller forebygge sykdom hos pasienten.

FORSØK

Fremstilling og rensing av kakektin

Rekombinant humankakektin (Pennica et al., Nature, 312:724-729 [1984] og Shirai et al., Nature. 313:803-806

[1985] ) ble uttrykt som et intracellulært protein i gjær fra et syntetisk gen som koder for et startmetionin og sekvensen til fullstendig kakektin, idet kodoner ble valgt til å gjen-speile kodonene til høyuttrykte gjærgener i henhold til standardteknikker. De syntetiske sekvensene ble plassert ned-strøms fra en hybrid alkoholdehydrogenase/glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (ADH2/GAPDH) promoter. Kakektinsyntese ble indusert i transformerte kulturer av Saccharomvces cere-visiae ved berøving av glukose. Cirka 5-10 % av samlet gjær-protein var kakektin.

Kakektinet ble renset fra urene gjærekstrakter ved (a) ammoniumsulfatfraksjonering, (b) Q-Sepharose-kolonnekromatografi med hurtig gjennomstrømning, (c) S-Sepharose-kolonnekromatografi med hurtig gjennomstrømning og (d) Sephacryl S-200 (HR) kolonnekromatografi.

Denne fremgangsmåten gav ca. 80 % gjenvinning av kakektinaktivitet analysert med aktinomycin D-behandlede L929-celler (Ruff og Gifford (1981), Tumor Necrosis Factor, Lvmphokines, 2:235-272). Den spesifikke aktivitet til renset kakektin var 2-4 x IO<8> enheter/mg, og renheten var høyere enn 98 % bedømt ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese.

Fremstilling av monoklonale antistoffer til kakektin

BALB/c-mus ble immunisert intraperitonealt med 5-

25 ug Freunds komplette adjuvans og forsterket to ganger med

den samme dose i Freunds ukomplette adjuvans med tre ukentlige mellomrom. En siste intraperitoneal forsterkning med den samme dose i vandig oppløsning ble gitt og fusjonen utført 3-4 dager senere.

Miltceller (ca. 10° celler) fra immuniserte mus ble fusjonert med ca. 2 x IO<7> myelomceller (P3-X63-Ag8.653)

(Kearney et al., J. Immunol. [1979], 123:1548-1550) under anvendelse av polyetylenglykol ifølge Kohler og Milstein (Nature 256:495 [1979]). Cellene ble platet ut på mikrotiterplater, og hybridene ble valgt ut ved hjelp av hypoksantinaminopterin-thymidin-mediet (HAT-mediet).

Fem fusjoner ble utført med miltceller fra fem mus immunisert med kakektin. Ved å bruke fastfase enzymbundet immunosorbentanalyse ble det erholdt 60 positive kloner som produserte monoklonale antistoffer til kakektin.

Hybridene fra positive brønner ble klonet tre ganger med grensefortynninger for å sikre at hver var en virkelig klon. Fjorten hybridomer som var positive for kakektin, ble klonet og karakterisert.

Kakektin/ TNF- bioanalvse: L929- celle- cytotoksisitet

TNF-aktivitet ble målt under anvendelse av en cyto-lytisk analyse med aktinomycin D-behandlede 929-celler som beskrevet av Ruff og Gifford i Lvmphokines. 2:235 (1981).

L929-celler (CCL1, American Type Culture Collection, Rockville, MD) holdes i RPMI 1640 supplert med 10 mM Hepes og 10 % kalvefosterserum (eller DME + 10 % FBS). Sammenflytende kulturer (3-4 x 10<7> celler/75 cm kolbe) frigjøres ved kortvarig trypsinbehandling (skylling med 0,05 % trypsin) i fysiologisk saltoppløsning inneholdende 5 mM EDTA og 10 mM Hepes, pH 7,4, og på nytt oppslemmet i friskt medium inneholdende aktinomycin D (1 ug/ml). Cellene plates så ut i 96-brønners mikrotiter-skåler (5-7 x 10<4> celler/brønn).

Etter 2 timer i kultur tilsettes seriefortynnede prøver til brønnene (mindre enn 10-20 % serum), og platene inkuberes over natten (5 % C02 , 37 °C). Prøver analyseres in kvadruplo. Den neste dag dekanteres mediet etter mikroskopisk evaluering, og brønnene fylles med en oppløsning av 0,2 % krystallfiolett, 10 % formalin og 0,01 % fosfat, pH 7-7,5, i 5 minutter, vaskes grundig med vann og tørkes. Graden av lyse kvantifiseres spektrofotometrisk (550-570 nM) på en mikro-titerplateleser. Analyseresultatene uttrykkes som U/ml, idet én enhet (U) defineres som mengden av kakektin som resulterer i lyse av 50 % av cellene.

In vitro nøvtraliseringsanalyse

Rekombinant humankakektin (20 ng/ml i 0,02 M tris-HC1, pH 8,0, 0,15 M NaCl, 1 mg/ml BSA) blandes med like store volumer fortynnet antistoff og inkuberes ved 37 °C i 60 minutter. Blandingen fortynnes 1:10 med friskt medium inneholdende aktinomycin D (ug/ml), og 0,1 ml seriefortynnet (to ganger) prøver in kvadrupliko tilsettes mikrotiterplatebrønner. Den gjenværende cytolytiske aktivitet bestemmes ved å bruke L929-celle-cytotoksisitetsanalysen.

Karakterisering av monoklonale antistoffer

Fjorten hybridomer som er positive for kakektin ble identifisert og subklonet. Antistoffene fremstilt ved hjelp av disse hybridomene ble karakterisert med hensyn på sin evne til å konkurrere med monoklonalt antistoff 18-1-1 (Tracey et al., Nature, 330:662-664 [1987]) for kakektinbinding i en ELISA. Som vist i tabell 1 faller de monoklonale antistoffene innen-for tre klasser; de som ikke konkurrerer med 18-1-1, de som gjør det og de som oppviser intermediær konkurranse. For å bekrefte at de monoklonale antistoffene som ikke konkurrerte med 18-1-1 var spesifikke for kakektin, ble det utført en kakektinoppfangingsanalyse. De monoklonale antistoffene ble bundet på en fast fase for å fange opp kakektin, og monoklonalt antistoff 18-1-1 ble brukt som det merkede antistoff. Alle de monoklonale antistoffene var spesifikke for kakektin ved denne analysen.

Forsøk med kondisjonerte medier fra hybridomceller ble også utført for å bestemme i hvilken utstrekning de monoklonale antistoffene nøytraliserte den celledrepende aktivitet av kakektin. Alle de 14 monoklonale antistoffene ble produsert i museascitesvæske for videre karakterisering. Virkningsfullheten av de rensede monoklonale antistoffene når det gjelder å beskytte L929-celler mot dreping med kakektin, ble bestemt. Den nøytraliserende aktivitet av MAb 1-2-4B1 var blitt bekreftet med det rensede materiale. Inkubasjon av MAb 2-2-3E3 (50 ng/ml) med et like stort volum rekombinant kakektin (20 ng/ml) ved 37 °C i 60 minutter viste at 50 % av den cytolytiske aktivitet av kakektin ble nøytralisert, bestemt ved hjelp av L929-celledrepingsanalysen. Som vist i tabell 1 er MAb 2-2-3E3, som gjenkjenner den samme epitop som MAb 18-1-1, påkrevet i 1/8 av mengden av 18-1-1 for cellebeskyttelse. Også vist i tabell 1 er at de fleste av antistoffene med den samme spesifisitet som 18-1-1 nøytraliserte kakektin (ved 100 %) i L929-celledrepingsanalysen. Andre antistoffer, slik som 1-2-4B1, som har andre epitopspesifisiteter enn 18-1-1, hadde også betydelig nøytraliserende aktivitet. Virkningsfullhet av etterbehandling med anti- TNF monoklonalt antistoffragment til forhindring av de skadelige virkningene av sårbetennelse hos bavian

Bavianer fikk intravenøst administrert en 2-timers LD100-innsprøyting av Escherichia coli (E. coli). Dyrene ble overvåket i 10 timer og ble observert inntil de døde, eller maksimalt i 7 dager. Aminoglykosidantibiotikumet gentamicin ble administrert til bestemte tidspunkter etter en 2-timers innsprøyting av E. coli. En bolusinjeksjon av anti-TNF monoklonalt antistoff 2-2-3E3 F(ab' )2-fragment (10 mg/kg) ble administrert til fire bavianer ved T + 30 minutter (1/4 av for-løpet gjennom bakterieinnsprøytingen, dvs. "etterbehandling"). En ytterligere bavian ble gitt den samme dose E. coli pluss gentamicin og behandlet med en isotypekontroll av et ir-relevant F (ab' )2-fragment.

(2) Observasjoner etter død

Oppsummering av undersøkelser etter død utført på bavianene nr. 1, 2 og 5 (undersøkelse etter død ikke tatt med for overlevende bavianer nr. 3 og 4 fordi tidligere arbeider med overlevende dyr viste ingen skadelige histologiske effekter). Hoveddelen av funnene etter død på dyrene nr. 1, 2 og 5 var like med hverandre og er som følger:

Lun<g>er: blødninger (3<++>)

Nyrer: for sterk blodtilstrømning, nekrotisk (3<*>) Binyrer: blødninger, nekrotisk (4<*>)

Lever: for stor blodtilstrømning (2<+>)

Milt: oppsvulmet og overfylt med blod

Tarmer: normale av utseende, men innkrengninger i tynntarmen ble observert hos dyrene nr. 1 og 2.

Hjerte, bukspyttkjertel. mage, tykktarm: normale av utseende.

(3) Fysiologiske og andre parametere overvåket i 10 timer (a) Parametere forbundet med overlevelsesfordeler hos bavianene 3 og 4, og som var forskjellige ikke-overlevende bavianer (nr. 1, 2 og 5), var: tgjennomsnittlig systemisk arterietrykk (MSAP), TpH, ilaktat, iBUN, ikreatinin, iSGPT, Ikortisol, Tglukose, iFDP og Tfibrinogen. (b) Parametere uten forskjeller mellom overlevende (nr. 3 og 4) og ikke-overlevende (nr. 1, 2 og 5) bavianer var: hjerte- og åndedrettsvirksomhet, VBS, blodplater, pC02, p02, CPK, hematokrit, koloni ( E. coli)-blodkonsentrasjoner, kropps-temperatur .

Når undersøkelsene ble gjentatt med helt antistoff, ble det ikke lagt merke til noen betydelige forskjeller. Både bindende fragmenter og intakte antistoffer kan således benyttes.

Av det ovenfor nevnte vil det forstås at cellelinjene som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, gir midler for å fremstille monoklonale antistoffer og fragmenter derav som reagerer med humankakektin ved lave nøytraliserende mengder. Dette muliggjør at profylaktiske og terapeutiske preparater kan utvikles mer økonomisk og administreres sikrere for å være effektive mot infeksjoner som skyldes de fleste endotoksinbærende bakteriestammer. I tillegg vil antistoffene finne anvendelse ved de forskjellige diagnos-tiske og andre terapeutiske fremgangsmåter.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale antistoffer eller fragmenter derav for behandling av endotoksinbærende bakterieinfeksjoner, hvor de monoklonale antistoffene eller fragmentene derav har de følgende egenskaper: a) det monoklonale antistoff eller fragmentet derav binder humankakektin spesifikt, b) mindre enn 400 ng av det monoklonale antistoff eller fra<g>mentet derav vil nøytralisere 20 ng humankakektin i en L929-cellecytolytisk analyse, c) det monoklonale antistoff eller fragmentet derav blokkerer bindingen av monoklonale antistoffer produsert av ATCC HB9736 eller ATCC HB9737 til kakektin, og d) de monoklonale antistoffene eller fragmentene derav er beskyttende mot endotoksemi in vivo, karakterisert ved at en cellelinje som er i stand til å produsere monoklonale antistoffer eller fragmenter derav, dyrkes, og de monoklonale antistoffene eller fragmentene derav utvinnes.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at cellelinjen er ATCC HB9736 eller ATCC HB9737.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at cellelinjen er ATCC HB9737.