NO180637B

NO180637B - Process for producing monoclonal antibodies or fragments thereof

Info

Publication number: NO180637B
Application number: NO952509A
Authority: NO
Inventors: George Kuo
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1988-07-18
Filing date: 1995-06-22
Publication date: 1997-02-10
Also published as: NO952509D0; NO180637C; NO952509L

Description

Oppfinnelsens område Field of the invention

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale antistoffer eller fragmenter derav for behandling av endotoksinbærende bakterieinfeksjoner. The present invention relates to a method for the production of monoclonal antibodies or fragments thereof for the treatment of endotoxin-carrying bacterial infections.

Oppfinnelsens bakgrunn The background of the invention

Innføringen av angripende stimuli, slik som para-sitt-, bakterie- eller virusinfeksjoner, eller neoplastiske celler, induserer betydelige metabolske endringer hos den mot-takelige vert. Dersom de er alvorlige, kan endringene til sist avbryte normale homøostatiske mekanismer, både lokalt og systemisk, noe som fører til uttømming av vertsenergilagre og føre frem til utmagring (kakeksi), vevsskade, multippel organ-systemsvikt, sjokk og død. The introduction of invading stimuli, such as parasitic, bacterial or viral infections, or neoplastic cells, induces significant metabolic changes in the susceptible host. If severe, the changes can ultimately disrupt normal homeostatic mechanisms, both locally and systemically, leading to depletion of host energy stores and leading to emaciation (cachexia), tissue damage, multiple organ-system failure, shock and death.

Inntil nylig trodde legene at de systematiske mønstre primært skyldtes virkninger av selve de angripende agenser. Det er imidlertid nå kjent at de angripende stimuli forårsaket at verten genererte forskjellige cytokiner, hvis kombinerte virkninger forårsaker det meste av de uønskede biologiske responser. Disse vertsutvundne betennelsesmediatorer gir nye muligheter for utvikling av behandlingskurer mot en rekke forskjellige inflammatoriske sykdomstilstander. Until recently, doctors believed that the systematic patterns were primarily due to the effects of the attacking agents themselves. However, it is now known that the offending stimuli caused the host to generate various cytokines, the combined effects of which cause most of the unwanted biological responses. These host-derived inflammatory mediators provide new opportunities for the development of treatment regimens against a number of different inflammatory disease states.

Et av de sterkeste cytokiner er kakektin som først og fremst frigjøres av makrofager etter passende stimulering. Kakektin, også kjent som tumornekrosefaktor, er et protein med 157 aminosyrer som normalt finnes ln vivo som en dimer eller annen multimer. Den beregnede molekylvekt til human TNF-mono-mer er ca. 17.000 dalton. One of the strongest cytokines is cachectin, which is primarily released by macrophages after appropriate stimulation. Cachectin, also known as tumor necrosis factor, is a protein with 157 amino acids that is normally found in vivo as a dimer or other multimer. The calculated molecular weight of human TNF-monomer is approx. 17,000 daltons.

Kakektin virker ved å undertrykke biosyntese av flere adipocyttspesifikke proteiner, slik som lipoproteinlipase. Det virker også til å indusere biosyntesen eller frigjørelsen av tallrike andre proteiner, inkludert klasse I hoved-histokompa-tibilitetsantigen, granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor og interleukin 1 (se generelt Beutler og Cerami, New Eng. J. of Med.. 316:379-385 [1987]). Cachectin works by suppressing the biosynthesis of several adipocyte-specific proteins, such as lipoprotein lipase. It also acts to induce the biosynthesis or release of numerous other proteins, including class I major histocompatibility antigen, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, and interleukin 1 (see generally Beutler and Cerami, New Eng. J. of Med.. 316:379- 385 [1987]).

Erkjennelsen av kakektins brede innflytelse på forskjellige sykdomstilstander har ført til forsøk på å kontrollere dets virkning. For eksempel har forsøk vist at antistoffer som reagerer spesifikt med kakektin, kan være terapeutisk anvendbare til å kontrollere de immunomodulerende responser som nå er kjent for å være forbundet med kakektin (se U.S. patentskrifter nr. 4.603.106 og 4.684.623). Særlig har nøytraliserende antistoffer med evne til å binde forskjellige epitoper på humankakektin med høy affinitet et betydelig potensial for mediering av de toksiske virkninger av for høye kakektinnivåer. The recognition of cachectin's broad influence on various disease states has led to attempts to control its action. For example, experiments have shown that antibodies that react specifically with cachectin may be therapeutically useful in controlling the immunomodulatory responses now known to be associated with cachectin (see U.S. Patent Nos. 4,603,106 and 4,684,623). In particular, neutralizing antibodies with the ability to bind different epitopes on human cachectin with high affinity have a significant potential for mediating the toxic effects of excessively high cachectin levels.

Det foreligger følgelig et behov for forbedrede antistoffer som kan nøytralisere de toksiske virkningene av kakektin in vivo. Foreliggende oppfinnelse oppfyller disse behov. Accordingly, there is a need for improved antibodies that can neutralize the toxic effects of cachectin in vivo. The present invention fulfills these needs.

Oppsummering av oppfinnelsen Summary of the invention

Det er tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale antistoffer eller fragmenter derav for behandling av endotoksinbærende bakterieinfeksjoner, hvor de monoklonale antistoffene eller fragmentene derav har de følgende egenskaper: a) det monoklonale antistoff eller fragmentet derav binder humankakektin spesifikt, b) mindre enn 400 ng av det monoklonale antistoff eller fragmentet derav vil nøytralisere 20 ng humankakektin i A method for the production of monoclonal antibodies or fragments thereof for the treatment of endotoxin-carrying bacterial infections is provided, where the monoclonal antibodies or fragments thereof have the following properties: a) the monoclonal antibody or fragment thereof binds human cachectin specifically, b) less than 400 ng of the monoclonal antibody or fragment thereof will neutralize 20 ng of human cacectin i

en L929-cellecytolytisk analyse, an L929 cell cytolytic assay,

c) det monoklonale antistoff eller fragmentet derav blokkerer bindingen av monoklonale antistoffer produsert av c) the monoclonal antibody or fragment thereof blocks the binding of monoclonal antibodies produced by

ATCC HB9736 eller ATCC HB9737 til kakektin, og ATCC HB9736 or ATCC HB9737 to cachectin, and

d) de monoklonale antistoffene eller fragmentene derav er beskyttende mot endotoksemi in vivo. d) the monoclonal antibodies or fragments thereof are protective against endotoxemia in vivo.

Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at en cellelinje som er i stand til å produsere monoklonale antistoffer eller fragmenter derav, dyrkes, og de monoklonale antistoffene eller fragmentene derav utvinnes. The method is characterized by the fact that a cell line capable of producing monoclonal antibodies or fragments thereof is cultivated, and the monoclonal antibodies or fragments thereof are recovered.

Beskrivelse av de bestemte utførelsesformene Description of the particular embodiments

Ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes det nye celler med evne til å produsere nøytraliserende monoklonale antistoffer med ønskede affiniteter. Antistoffene kan anvendes i preparater som er i stand til selektivt å gjenkjenne epitoper som er til stede på humankakektin. De foreliggende celler har identifiserbare kromosomer hvor bakterielinje-DNA fra dem eller en forløpercelle er blitt omordnet slik at den koder for et antistoff med et bindingssete for en ønsket epitop på humankakektin. Disse monoklonale antistoffene kan anvendes på en lang rekke forskjellige måter, inkludert diagnose og terapi. According to the present invention, new cells are used with the ability to produce neutralizing monoclonal antibodies with desired affinities. The antibodies can be used in preparations which are able to selectively recognize epitopes present on human cactin. The present cells have identifiable chromosomes where the germ line DNA from them or a precursor cell has been rearranged so that it codes for an antibody with a binding site for a desired epitope on human cacectin. These monoclonal antibodies can be used in a wide variety of ways, including diagnosis and therapy.

De således tilveiebrakte monoklonale antistoffer er særlig anvendbare, sammenlignet med tidligere kjente antistoffer, ved behandlingen eller profylaksen av alvorlige sykdom-mer, slik som bakteriemi, sårbetennelse, kakeksi eller andre sykdomstilstander forbundet med forhøyede nivåer av kakektin. Antistoffene vil således vanligvis ha nøytraliserende aktivitet ved mindre enn 400 ng, fortrinnsvis mindre enn ca. 300 ng, helst ca. 50-200 ng, i den L929-cellecytolytiske analyse. Dette høyere aktivitetsnivå muliggjør benyttelse av betydelig lavere doseringsnivåer for behandlinger. The monoclonal antibodies thus provided are particularly useful, compared to previously known antibodies, in the treatment or prophylaxis of serious diseases, such as bacteremia, wound inflammation, cachexia or other disease states associated with elevated levels of cachectin. The antibodies will thus usually have neutralizing activity at less than 400 ng, preferably less than approx. 300 ng, preferably approx. 50-200 ng, in the L929 cell cytolytic assay. This higher level of activity enables the use of significantly lower dosage levels for treatments.

Fremstillingen av monoklonale antistoffer kan utføres ved å udødeliggjøre en cellelinje med evne til å uttrykke nukleinsyresekvenser som koder for antistoffer som er spesifikke for en passende epitop på humankakektin. Den udødelig-gjorte cellelinje kan være en pattedyrcellelinje som er blitt omdannet ved onkogenese, ved transfeksjon, mutasjon eller lignende. Slike celler omfatter myelomlinjer, lymfomlinjer eller andre cellelinjer som er i stand til å understøtte ekspresjonen og utskillelsen av immunoglobulinet eller bindende fragment derav in vitro. Immunoglobulinet eller fragmentet kan være et naturlig forekommende immunoglobulin fra et annet pattedyr enn de foretrukne muse- eller menneske-kilder, fremstilt ved transformasjon av en lymfocytt, særlig en splenocytt, ved hjelp av et virus, eller ved fusjon mellom lymfocytten og en neoplastisk celle, f.eks. et myelom, hvorved det fås en hybridcellelinje. Vanligvis vil splenocytten bli erholdt fra et dyr som er immunisert mot kakektinbeslektede antigener eller fragmenter derav, og som inneholder et epitop-sete. Immuniseringsfremgangsmåter er godt kjente og kan variere betydelig, men likevel være effektive (se Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. 2. utg., The production of monoclonal antibodies can be performed by immortalizing a cell line capable of expressing nucleic acid sequences encoding antibodies specific for an appropriate epitope on human cachectin. The immortalized cell line may be a mammalian cell line which has been transformed by oncogenesis, by transfection, mutation or the like. Such cells include myeloma lines, lymphoma lines or other cell lines capable of supporting the expression and secretion of the immunoglobulin or binding fragment thereof in vitro. The immunoglobulin or fragment may be a naturally occurring immunoglobulin from a mammal other than the preferred mouse or human sources, produced by transformation of a lymphocyte, in particular a splenocyte, by means of a virus, or by fusion between the lymphocyte and a neoplastic cell, e.g. a myeloma, whereby a hybrid cell line is obtained. Typically, the splenocyte will be obtained from an animal immunized against cachectin-related antigens or fragments thereof, and containing an epitope site. Immunization procedures are well known and can vary considerably but still be effective (see Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. 2nd ed.,

Academic Press, N.Y. [1986]). Academic Press, N.Y. [1986]).

Hybridcellelinjene kan klones og sorteres ifølge vanlige teknikker, og antistoffer som er i stand til å bindes The hybrid cell lines can be cloned and sorted according to standard techniques, and antibodies capable of binding

til de ønskede humane kakektindeterminanter med passende affiniteter kan påvises i cellesupernatantene. De passende hybridcellelinjene kan så dyrkes i storskalakultur eller injiseres i bukhulen til en passende vert for produksjon av antistoffer i until the desired human cachectin determinants with appropriate affinities can be detected in the cell supernatants. The appropriate hybrid cell lines can then be grown in large-scale culture or injected into the peritoneal cavity of a suitable host for the production of antibodies in

ascitesvæske. ascites fluid.

I og med at man har antistoffene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, som er spesifikke for humankakektin-proteinet, kan supernatantene i de etterfølgende forsøk i noen tilfeller undersøkes i en konkurranseanalyse med de foreliggende monoklonale antistoffer som et middel for å identi-fisere ytterligere eksempler på de ønskede antihumankakektin monoklonale antistoffer (såkalte "blokkerende antistoffer"). Hybridcellelinjer kan således lett produseres fra flere forskjellige kilder basert på tilgjengeligheten av foreliggende antistoffer som er spesifikke for de bestemte kakektindeter-minantene ved de passende affinitetsnivåer. As one has the antibodies produced according to the present invention, which are specific for the human cactin protein, the supernatants in the subsequent experiments can in some cases be examined in a competition analysis with the present monoclonal antibodies as a means of identifying further examples of the desired anti-human cectin monoclonal antibodies (so-called "blocking antibodies"). Thus, hybrid cell lines can be readily produced from several different sources based on the availability of available antibodies specific for the particular cachectin determinants at the appropriate affinity levels.

Alternativt kan, når det er tilgjengelig hybridcellelinjer som produserer antistoffer som er spesifikke for de foreliggende epitopseter, disse hybridcellelinjene fusjoneres med andre neoplastiske B-celler, hvor slike andre B-celler kan tjene som mottakere for genom-DNA som koder for antistoffene. Disse antistoffene kan være funksjonelle på celleoverflaten og, f.eks., ikke som reseptorer. Selv om neoplastiske B-celler fra gnagere, særlig murine celler, benyttes vanligvis, kan andre pattedyrarter anvendes, slik som hare-, storfe-, saue-, heste- eller grisearter, eller fjærfe eller lignende. Alternatively, when hybrid cell lines are available that produce antibodies specific for the present epitopes, these hybrid cell lines can be fused with other neoplastic B cells, where such other B cells can serve as recipients of genomic DNA encoding the antibodies. These antibodies may be functional on the cell surface and, for example, not as receptors. Although neoplastic B cells from rodents, especially murine cells, are usually used, other mammalian species can be used, such as hare, cattle, sheep, horse or pig species, or poultry or the like.

De monoklonale antistoffene kan være av hvilken som helst av klassene eller underklassene av immunoglobuliner, slik som IgM, IgD, IgA eller IgE, eller underklasser av IgG som er kjent for hver dyreart. Generelt kan de monoklonale antistoffene anvendes intakte, eller som bindende fragmenter, slik som Fv, Fab, F(ab')2, men vanligvis intakte. The monoclonal antibodies may be of any of the classes or subclasses of immunoglobulins, such as IgM, IgD, IgA or IgE, or subclasses of IgG known for each animal species. In general, the monoclonal antibodies can be used intact, or as binding fragments, such as Fv, Fab, F(ab')2, but usually intact.

Cellelinjene som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan finne andre anvendelser for den direkte produksjon av de monoklonale antistoffene. Cellelinjene kan fusjoneres med andre celler (slik som passende legemiddelmerkede humanmyelom-, musemyelom- eller humanlymfo-blastoidceller), hvorved det fås hybridomer eller triomer, og således sørge for overføringen av genene som koder for de monoklonale antistoffene. Alternativt kan cellelinjene brukes som en kilde for kromosomene som koder for immunoglobulinene, som kan isoleres og overføres til celler ved hjelp av andre teknikker enn fusjon. I tillegg kan genene som koder for de monoklonale antistoffene, isoleres og brukes i henhold til teknikker med rekombinant DNA til fremstillingen av det bestemte immunoglobulin i flere forskjellige verter. Særlig kan, ved å fremstille cDNA-biblioteker fra budbringer-RNA, en enkelt cDNA-klon som koder for immunoglobulinet og er fri for introner, isoleres og plasseres i egnede prokaryote eller eukaryote ekspresjonsvektorer og deretter transformeres i en vert for endelig masseproduksjon (se generelt U.S. patentskrifter nr. 4.172.124, 4.350.683, 4.363.799, 4.381.292 og 4.423.147. Se også Rennett et al., Monoclonal Antibodies. Plenum, New York [1980] og henvisninger som er gitt der). The cell lines used in the method according to the present invention can find other uses for the direct production of the monoclonal antibodies. The cell lines can be fused with other cells (such as suitably drug-labelled human myeloma, mouse myeloma or human lymphoblastoid cells), whereby hybridomas or triomas are obtained, thus ensuring the transfer of the genes encoding the monoclonal antibodies. Alternatively, the cell lines can be used as a source for the chromosomes encoding the immunoglobulins, which can be isolated and transferred into cells using techniques other than fusion. In addition, the genes encoding the monoclonal antibodies can be isolated and used according to recombinant DNA techniques for the production of the particular immunoglobulin in several different hosts. In particular, by preparing cDNA libraries from messenger RNA, a single cDNA clone encoding the immunoglobulin and free of introns can be isolated and placed into suitable prokaryotic or eukaryotic expression vectors and then transformed into a host for final mass production (see generally U.S. Patent Nos. 4,172,124, 4,350,683, 4,363,799, 4,381,292, and 4,423,147. See also Rennett et al., Monoclonal Antibodies. Plenum, New York [1980] and references therein).

Nærmere bestemt kan immunoglobulinene eller fragmentene fremstilles i bakterier eller gjær i henhold til hybrid-DNA-teknikk (se Boss et al., Nucl. Acid. Res.. 12:3791 og Wood et al., Nature, 314:446). For eksempel kan budbringer-RNA tra-nsskribert fra genene som koder for de lette og tunge kjedene i de monoklonale antistoffene, fremstilt ved hjelp av en cellelinje som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, isoleres ved hjelp av differensiell cDNA-hybridi-sering under anvendelse av annen cDNA fra BALB/c-lymfocytter enn den foreliggende klon. mRNA som ikke hybridiserer, vil være rik på budskapet som koder for de ønskede immunoglobulin-kjeder. Om nødvendig kan denne fremgangsmåten gjentas for ytterligere å øke nivåene av den ønskede mRNA. Det fratrukne mRNA-preparat kan så revers-transskriberes, hvorved man får en cDNA-blanding som er anriket på de ønskede sekvenser. RNA kan hydrolyseres ved en passende RNAse, og ssDNA kan gjøres dobbelttrådet med DNA-polymerase I og vilkårlige primere, f.eks. vilkårlig fragmentert kalvethymus-DNA. Den resulterende dsDNA kan så klones ved innføring i en passende vektor, f.eks. virusvektorer, slik som lambdavektorer eller plasmidvektorer More specifically, the immunoglobulins or fragments can be prepared in bacteria or yeast according to the hybrid DNA technique (see Boss et al., Nucl. Acid. Res.. 12:3791 and Wood et al., Nature, 314:446). For example, messenger RNA transcribed from the genes encoding the light and heavy chains of the monoclonal antibodies, produced by means of a cell line used in the method according to the present invention, can be isolated by means of differential cDNA hybridization using of cDNA from BALB/c lymphocytes other than the present clone. mRNA that does not hybridize will be rich in the message encoding the desired immunoglobulin chains. If necessary, this procedure can be repeated to further increase the levels of the desired mRNA. The subtracted mRNA preparation can then be reverse-transcribed, whereby a cDNA mixture is obtained which is enriched in the desired sequences. RNA can be hydrolyzed by an appropriate RNAse, and ssDNA can be made double-stranded with DNA polymerase I and arbitrary primers, e.g. arbitrarily fragmented calf thymus DNA. The resulting dsDNA can then be cloned by introduction into a suitable vector, e.g. viral vectors, such as lambda vectors or plasmid vectors

(slik som pBR322, pACYC184 etc). Ved å utvikle prober basert på kjente sekvenser for de konstante områdene i de lette og tunge kjedene, kan de cDNA-klonene som har gener som koder for de ønskede lette og tunge kjedene, identifiseres ved hybridi-sering. Deretter kan genene skjæres ut fra plasmidene, mani-puleres for å fjerne overflødig DNA oppstrøms fra initierings-kodonet eller konstantområde-DNA, og så innføres i en passende vektor for transformasjon av en vert og endelig ekspresjon av genet. (such as pBR322, pACYC184 etc). By developing probes based on known sequences for the constant regions in the light and heavy chains, the cDNA clones that have genes encoding the desired light and heavy chains can be identified by hybridization. The genes can then be excised from the plasmids, manipulated to remove excess DNA upstream of the initiation codon or constant region DNA, and then introduced into an appropriate vector for transformation of a host and final expression of the gene.

Passende kan pattedyrverter (f.eks. museceller) anvendes til å fremstille kjeden (f.eks. knytte de tunge og lette kjedene sammen), hvorved man får et intakt immunoglobulin, og dessuten utskille immunoglobulinet fritt for leder-sekvensen om ønsket. Alternativt kan man bruke encellede mikroorganismer for å fremstille de to kjedene, hvor ytterligere manipulasjon kan være påkrevet for å fjerne DNA-sekvensene som koder for de sekretoriske leder- og prosesserings-signaler, mens man sørger for et initieringskodon i 5'-enden til sekvensen som koder for den tunge kjeden. På denne måten kan immunoglobulinene fremstilles og bearbeides slik at de settes sammen og glykolyseres i andre celler enn pattedyr-celler. Om ønsket kan hver av kjedene avkortes slik at i det minste det variable område beholdes, områder som så kan mani-puleres slik at det sørges for å få andre immunoglobuliner, eller fragment som er spesifikt for kakektinepitopene (se f.eks. europeiske patentsøknader med publikasjonsnummer 0239400 og 0125023). Appropriately, mammalian hosts (e.g. mouse cells) can be used to produce the chain (e.g. link the heavy and light chains together), thereby obtaining an intact immunoglobulin, and also secrete the immunoglobulin free of the leader sequence if desired. Alternatively, single-celled microorganisms can be used to produce the two chains, where further manipulation may be required to remove the DNA sequences encoding the secretory leader and processing signals, while providing an initiation codon at the 5' end of the sequence which codes for the heavy chain. In this way, the immunoglobulins can be produced and processed so that they are assembled and glycolysed in cells other than mammalian cells. If desired, each of the chains can be shortened so that at least the variable region is retained, regions that can then be manipulated so that it is ensured that other immunoglobulins are obtained, or fragments that are specific for the cachectin epitopes (see e.g. European patent applications with publication numbers 0239400 and 0125023).

De monoklonale antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er særlig anvendbare på grunn av sin høye affinitet for epitoper til humankakektin. Noen av de monoklonale antistoffene er også beskyttende in vivo, noe som muliggjør inkorporering i farmasøytiske produk-ter, slik som antistoffkombinasjoner for bakterieinfeksjoner. The monoclonal antibodies produced by the method according to the present invention are particularly useful because of their high affinity for epitopes of human cachectin. Some of the monoclonal antibodies are also protective in vivo, which enables incorporation into pharmaceutical products, such as antibody combinations for bacterial infections.

Monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også finne et stort antall forskjellige anvendelser in vitro. For eksempel kan de monoklonale antistoffene benyttes til å rense naturlig forekommende eller rekombinant humankakektin for selektivt å fjerne humankakektin i en heterogen blanding av proteiner eller lignende. Monoclonal antibodies produced by the method according to the present invention can also find a large number of different applications in vitro. For example, the monoclonal antibodies can be used to purify naturally occurring or recombinant human cacectin to selectively remove human cacectin in a heterogeneous mixture of proteins or the like.

For diagnoseformål kan de monoklonale antistoffene enten være merket eller umerket. Vanligvis medfører diagnose-analysene å påvise dannelsen av et kompleks gjennom bindingen av det monoklonale antistoff til proteinet. Når de er umerkede, finner antistoffene anvendelse i agglutinerings-analyser. I tillegg kan umerkede antistoffer anvendes sammen med andre merkede antistoffer (andre-antistoffer) som reagerer med det monoklonale antistoff, slik som antistoffer som er spesifikke for immunoglobulin. Alternativt kan de monoklonale antistoffene være direkte merket. Et stort antall forskjellige markører kan anvendes, slik som radionuklider, fluorescerende midler, enzymer, enzymsubstrater, enzymkofaktorer, enzym-inhibitorer, ligander (særlig haptener) etc. Et stort antall typer av immunologiske analyser er tilgjengelig, og f.eks. omfatter noen de som er beskrevet i U.S. patentskrifter nr. 3.817.827, 3.850.752, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074 og 4.098.876. For diagnostic purposes, the monoclonal antibodies can be either labeled or unlabeled. Usually, the diagnostic analyzes involve detecting the formation of a complex through the binding of the monoclonal antibody to the protein. When unlabelled, the antibodies find use in agglutination assays. In addition, unlabeled antibodies can be used together with other labeled antibodies (second antibodies) that react with the monoclonal antibody, such as antibodies specific for immunoglobulin. Alternatively, the monoclonal antibodies may be directly labeled. A large number of different markers can be used, such as radionuclides, fluorescent agents, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, ligands (especially haptens), etc. A large number of types of immunological assays are available, and e.g. includes some those described in the U.S. Patents Nos. 3,817,827, 3,850,752, 3,901,654, 3,935,074, 3,984,533, 3,996,345, 4,034,074 and 4,098,876.

Vanligvis benyttes de monoklonale antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse i enzym-immunoanalyser, hvor de foreliggende antistoffer, eller andre-antistof f er fra en annen art, er konjugert til et enzym. Når en prøve som inneholder humankakektin, slik som humant blod eller lysat derav, blandes med de foreliggende antistoffer, oppstår binding mellom antistoffene og de molekylene som oppviser den ønskede epitop. Slike komplekser kan så sepa-reres fra de ikke-bundne reagenser, og et andre-antistoff (merket med et enzym) tilsettes. Deretter bestemmes tilstedeværelsen av antistoff-enzymkonjugatet som er spesifikt bundet til cellene. Andre vanlige teknikker som er godt kjent for fagfolk innen teknikken, kan også benyttes. Generally, the monoclonal antibodies produced by the method according to the present invention are used in enzyme immunoassays, where the present antibodies, or other antibodies from another species, are conjugated to an enzyme. When a sample containing human cachectin, such as human blood or lysate thereof, is mixed with the antibodies present, binding occurs between the antibodies and the molecules that exhibit the desired epitope. Such complexes can then be separated from the unbound reagents, and a second antibody (labelled with an enzyme) added. The presence of the antibody-enzyme conjugate specifically bound to the cells is then determined. Other common techniques well known to those skilled in the art may also be used.

Prøvesett kan også leveres for bruk sammen med de foreliggende antistoffer til påvisning av humankakektin i opp-løsninger, eller tilstedeværelsen av humankakektinepitoper i rekombinante fraksjoner. Et slikt preparat med monoklonalt antistoff fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan således tilveiebringes, vanligvis i en lyo-filisert form, enten alene eller sammen med antistoffer som er spesifikke for endotoksiner, eksotoksiner eller gramnegative bakterier. Antistoffene som kan være konjugert til en markør eller ikke-konjugert, er inkludert i prøvesettene sammen med buffere, slik som tris, fosfat, karbonat etc, stabiliserings-midler, biocider, inerte proteiner, f.eks. bovint serumalbumin eller lignende. Generelt vil disse stoffene være til stede i mindre enn ca. 5 vekt%, basert på mengden av aktivt antistoff, og vanligvis til stede i en samlet mengde på minst ca. Test kits can also be supplied for use with the present antibodies for the detection of human cachectin in solutions, or the presence of human cachectin epitopes in recombinant fractions. Such a preparation with monoclonal antibody produced by the method according to the present invention can thus be provided, usually in a lyophilized form, either alone or together with antibodies specific for endotoxins, exotoxins or gram-negative bacteria. The antibodies, which may be conjugated to a marker or unconjugated, are included in the sample sets together with buffers, such as tris, phosphate, carbonate etc., stabilizers, biocides, inert proteins, e.g. bovine serum albumin or similar. In general, these substances will be present for less than approx. 5% by weight, based on the amount of active antibody, and usually present in a total amount of at least approx.

0,001 vekt%, igjen basert på antistoffkonsentrasjonen. Ofte vil det være ønskelig å ta med et inert fyllstoff eller en eksipiens for å fortynne de aktive bestanddelene, idet eksi-piensen kan være til stede ved fra ca. 1 til 99 vekt% av den totale blanding. Når et andre-antistoff med evne til å binde til det monoklonale antistoff anvendes, vil dette vanligvis være til stede i en separat ampulle. Det andre antistoff er vanligvis konjugert til en markør og formulert på en analog måte med antistoffpreparatene beskrevet ovenfor. 0.001% by weight, again based on the antibody concentration. It will often be desirable to include an inert filler or an excipient to dilute the active ingredients, as the excipient can be present at from approx. 1 to 99% by weight of the total mixture. When a second antibody capable of binding to the monoclonal antibody is used, this will usually be present in a separate ampoule. The second antibody is usually conjugated to a marker and formulated in an analogous manner to the antibody preparations described above.

De monoklonale antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også være inkorporert som be-standdeler i farmasøytiske preparater som inneholder en terapeutisk eller profylaktisk mengde av minst ett, men vanligvis en blanding som omfatter to eller flere, av de monoklonale antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen sammen med en farmasøytisk effektiv bærer. En farmasøytisk bærer bør være et hvilket som helst kompatibelt, ikke-toksisk stoff egnet til å avgi de monoklonale antistoffene til pasienten. Sterilt vann, alkohol, fettstoffer, voksstoffer og inerte, faste stoffer kan anvendes som bærer. Farmasøytisk godtatte adjuvanser (buffermidler, dispergeringsmidler) kan også være inkorporert i det farmasøytiske preparat. Slike preparater kan inneholde monoklonale antistoffer som bare er spesifikke for humankakektin. Alternativt kan et farmasøytisk preparat som inneholder monoklonale antistoffer som reagerer direkte med bakterier, benyttes til å danne en "cocktail". For eksempel ville en "cocktail" som inneholder monoklonale antistoffer mot humankakektinepitoper og motgrupper av de forskjellige bakteriestammer (f.eks. forskjellige serotyper) som forårsaker sårbetennelse, være et universalprodukt med aktivitet mot den store majoritet av de kliniske isolater som er The monoclonal antibodies produced by the method according to the invention can also be incorporated as ingredients in pharmaceutical preparations containing a therapeutic or prophylactic amount of at least one, but usually a mixture comprising two or more, of the monoclonal antibodies produced by the method according to the invention together with a pharmaceutically effective carrier. A pharmaceutical carrier should be any compatible, non-toxic substance suitable for delivering the monoclonal antibodies to the patient. Sterile water, alcohol, fatty substances, waxes and inert, solid substances can be used as carriers. Pharmaceutically accepted adjuvants (buffering agents, dispersing agents) may also be incorporated into the pharmaceutical preparation. Such preparations may contain monoclonal antibodies specific only for human cachectin. Alternatively, a pharmaceutical preparation containing monoclonal antibodies that react directly with bacteria can be used to form a "cocktail". For example, a "cocktail" containing monoclonal antibodies against human cacectin epitopes and countergroups of the various bacterial strains (eg, different serotypes) causing wound inflammation would be a universal product with activity against the vast majority of clinical isolates that are

ansvarlige for sykdommen. responsible for the disease.

Molforholdet mellom de forskjellige bestanddelene som består av monoklonalt antistoff, vil vanligvis ikke atskille seg med mer enn en faktor på 10, mer vanlig med ikke mer enn en faktor på 5, og vil vanligvis være i et molforhold på ca. 1:1-2 i forhold til hver av de andre antistoffbestanddelene. Når de anvendes i blanding, vil de monoklonale antistoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse vanligvis bli brukt i like molforhold. The molar ratio of the various components comprising the monoclonal antibody will usually not differ by more than a factor of 10, more usually by no more than a factor of 5, and will usually be in a molar ratio of about 1:1-2 in relation to each of the other antibody components. When used in mixture, the monoclonal antibodies produced by the method according to the present invention will usually be used in equal molar ratios.

De monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i kombinasjon med eksisterende blodplasmaprodukter, slik som kommersielt tilgjengelig gammaglobulin- og immunoglobulin-produkter som brukes i profylaktisk eller terapeutisk behandling av bakteriell sårbetennelse hos mennesker. For immunoglobuliner vil plasmaet fortrinnsvis bli erholdt fra menneske-donorer som oppviser forhøyede nivåer av immunoglobuliner som reagerer med endotoksinbærende bakterier (se generelt kompen-diet "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer. J. Med.. 76 (3a), 30. mars, 1984, s. 1-231. The monoclonal antibodies produced by the method according to the present invention can also be used in combination with existing blood plasma products, such as commercially available gamma globulin and immunoglobulin products which are used in prophylactic or therapeutic treatment of bacterial wound inflammation in humans. For immunoglobulins, the plasma will preferably be obtained from human donors who exhibit elevated levels of immunoglobulins that react with endotoxin-bearing bacteria (see generally the compendium "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer. J. Med.. 76 (3a), March 30, 1984, pp. 1-231.

De monoklonale antistoffer kan også anvendes som separat administrerte preparater gitt sammen med antibiotika eller antimikrobielle midler. Vanligvis kan de antimikrobielle midler omfatte et penicillin sammen med et aminoglykosid (f.eks. gentamicin, tobramycin etc), men et stort antall til-leggsmidler (f.eks. cefalosporiner) som er godt kjent for fagfolk innen teknikken, kan også benyttes. The monoclonal antibodies can also be used as separately administered preparations given together with antibiotics or antimicrobial agents. Typically, the antimicrobial agents may comprise a penicillin together with an aminoglycoside (eg gentamicin, tobramycin etc), but a large number of additional agents (eg cephalosporins) well known to those skilled in the art may also be used.

De monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og farmasøytiske preparater derav er særlig anvendbare for oral eller parenteral administrering. Fortrinnsvis kan de farmasøytiske preparater administreres parenteralt, dvs. subkutant, intramuskulært, intraarterielt eller intravenøst. Det kan således tilveiebringes preparater for parenteral administrering som omfatter en oppløsning av det monoklonale antistoff eller en "cocktail" derav oppløst i akseptabel bærer, fortrinnsvis en vandig bærer. Det kan anvendes flere forskjellige vandige bærere, f.eks. vann, bufret vann, 0,4 % saltoppløsning, 0,3 % glysin og lignende. Disse oppløsningene er sterile og generelt frie for partikkelformig stoff. Disse preparatene kan steriliseres ved hjelp av vanlige, godt kjente steriliseringsteknikker. Preparatene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpestof-fer etter behov for å nærme seg fysiologiske betingelser, slik som pH-reguleringsmidler og buffermidler, toksisitetsregu-lerende midler og lignende, f.eks. natriumacetat, natrium-klorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, natriumlaktat etc. Antistoff konsentrasjonen i disse preparatene kan variere bredt, dvs. fra mindre enn ca. 0,5 vekt%, vanligvis ved eller i det minste omkring 1 vekt% til så mye som 15 eller 20 vekt%, og vil velges hovedsakelig basert på væskevolumer, viskositeter etc., fortrinnsvis for den bestemte administreringsmåte som velges. The monoclonal antibodies produced by the method according to the present invention and pharmaceutical preparations thereof are particularly suitable for oral or parenteral administration. Preferably, the pharmaceutical preparations can be administered parenterally, i.e. subcutaneously, intramuscularly, intraarterially or intravenously. Preparations for parenteral administration can thus be provided which comprise a solution of the monoclonal antibody or a "cocktail" thereof dissolved in an acceptable carrier, preferably an aqueous carrier. Several different aqueous carriers can be used, e.g. water, buffered water, 0.4% saline, 0.3% glycine and the like. These solutions are sterile and generally free of particulate matter. These preparations can be sterilized using standard, well-known sterilization techniques. The preparations can contain pharmaceutically acceptable excipients as needed to approach physiological conditions, such as pH-regulating agents and buffering agents, toxicity-regulating agents and the like, e.g. sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium lactate etc. The antibody concentration in these preparations can vary widely, i.e. from less than approx. 0.5% by weight, usually at or at least about 1% by weight to as much as 15 or 20% by weight, and will be selected based primarily on liquid volumes, viscosities, etc., preferably for the particular mode of administration selected.

Et typisk farmasøytisk preparat for intramuskulær injeksjon ville således kunne lages slik at det inneholder 1 ml sterilt, bufret vann og 500 mg monoklonalt antistoff. Et typisk preparat for intravenøs innsprøyting kunne lages slik at det inneholder 250 ml steril Ringers oppløsning og 150 mg monoklonalt antistoff. Aktuelle fremgangsmåter for fremstilling av parenteralt administrerbare preparater vil være kjente eller åpenbare for fagfolk innen teknikken og er beskrevet nærmere i f.eks. Remington' s Pharmaceutical Science. 15. utg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980). A typical pharmaceutical preparation for intramuscular injection could thus be made so that it contains 1 ml of sterile, buffered water and 500 mg of monoclonal antibody. A typical preparation for intravenous injection could be made to contain 250 ml of sterile Ringer's solution and 150 mg of monoclonal antibody. Current methods for the production of parenterally administrable preparations will be known or obvious to those skilled in the art and are described in more detail in e.g. Remington's Pharmaceutical Science. 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).

De monoklonale antistoffer fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan lyofiliseres for lagring og re-kondisjoneres i en egnet bærer før bruk. Denne teknikken er blitt påvist å være effektiv med vanlige immunoglobuliner, og vanlig kjente lyofiliserings- og rekondisjoneringsteknikker kan anvendes. Det vil forstås av fagfolk innen teknikken at lyofilisering og rekondisjonering kan føre til varierende grader av antistoffaktivitetstap (med f.eks. vanlige immunoglobuliner er IgM-antistoffer tilbøyelige til å ha større aktivitetstap enn IgG-antistoffer), og at bruksnivåer vil kunne måtte bli regulert for å kompensere. The monoclonal antibodies produced by the method according to the invention can be lyophilized for storage and reconditioned in a suitable carrier before use. This technique has been shown to be effective with common immunoglobulins, and commonly known lyophilization and reconditioning techniques can be used. It will be appreciated by those skilled in the art that lyophilization and reconditioning can lead to varying degrees of loss of antibody activity (eg, with common immunoglobulins, IgM antibodies tend to have greater loss of activity than IgG antibodies), and that usage levels may need to be regulated to compensate.

Preparatene som inneholder de foreliggende monoklonale antistoffer eller en "cocktail" derav, kan administreres for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling av hvilken som helst av flere forskjellige bakterieinfeksjoner. Ved terapeutisk anvendelse administreres preparater til en pasient som allerede er smittet med én eller flere bakteriestammer, i en tilstrekkelig mengde til å helbrede eller i det minste delvis stanse infeksjonen og dens komplikasjoner. En passende mengde for oppnåelse av dette er definert som en "terapeutisk effektiv dose". Mengder som er effektive for dette, vil avhenge av alvorligheten av infeksjonen og den generelle tilstand i pasientens eget immunsystem, men varierer generelt fra ca. 1 til ca. 200 mg antistoff pr. kg kroppsvekt, idet doseringer fra 5 til 25 mg pr. kg vanligvis brukes. Det må huskes at stoffene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse generelt kan anvendes ved alvorlige sykdomstilstander, dvs. livstruende eller potensielt livstruende situasjoner, spesielt bakteriemi og endotoksemi. The compositions containing the present monoclonal antibodies or a "cocktail" thereof can be administered for the prophylactic and/or therapeutic treatment of any of several different bacterial infections. In therapeutic use, preparations are administered to a patient already infected with one or more bacterial strains, in an amount sufficient to cure or at least partially stop the infection and its complications. An appropriate amount to achieve this is defined as a "therapeutically effective dose". Amounts that are effective for this will depend on the severity of the infection and the general state of the patient's own immune system, but generally vary from approx. 1 to approx. 200 mg of antibody per kg body weight, with dosages from 5 to 25 mg per kg is usually used. It must be remembered that the substances produced by the method according to this invention can generally be used in serious disease states, i.e. life-threatening or potentially life-threatening situations, especially bacteremia and endotoxemia.

Ved profylaktiske anvendelser administreres preparater som inneholder det foreliggende antistoff eller en "cocktail" derav til en pasient som ikke allerede er smittet, for å øke pasientens motstandsevne mot potensielle infeksjoner. En slik mengde er definert som en "profylaktisk effektiv dose". Ved denne bruk avhenger igjen de nøyaktige mengder av pasientens helsetilstand og generelle immunitetsnivå, men varierer generelt fra 0,1-25 mg pr. kg, spesielt 0,5-2,5 mg pr. kg. In prophylactic applications, preparations containing the present antibody or a "cocktail" thereof are administered to a patient who is not already infected, to increase the patient's resistance to potential infections. Such an amount is defined as a "prophylactically effective dose". In this case, the exact amounts again depend on the patient's state of health and general level of immunity, but generally vary from 0.1-25 mg per kg, especially 0.5-2.5 mg per kg.

Enkle eller multiple administreringer av preparatene kan utføres med dosenivåer og -mønstre valgt av den behand-lende lege. I alle tilfeller bør de farmasøytiske preparater gi en mengde antistoff(er) fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som er tilstrekkelig til effektivt å behandle eller forebygge sykdom hos pasienten. Single or multiple administrations of the preparations can be carried out with dose levels and patterns chosen by the attending physician. In all cases, the pharmaceutical preparations should provide an amount of antibody(ies) produced by the method according to the invention which is sufficient to effectively treat or prevent disease in the patient.

FORSØK ATTEMPT

Fremstilling og rensing av kakektin Preparation and purification of cachectin

Rekombinant humankakektin (Pennica et al., Nature, 312:724-729 [1984] og Shirai et al., Nature. 313:803-806 Recombinant human cachectin (Pennica et al., Nature, 312:724-729 [1984] and Shirai et al., Nature. 313:803-806

[1985] ) ble uttrykt som et intracellulært protein i gjær fra et syntetisk gen som koder for et startmetionin og sekvensen til fullstendig kakektin, idet kodoner ble valgt til å gjen-speile kodonene til høyuttrykte gjærgener i henhold til standardteknikker. De syntetiske sekvensene ble plassert ned-strøms fra en hybrid alkoholdehydrogenase/glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase (ADH2/GAPDH) promoter. Kakektinsyntese ble indusert i transformerte kulturer av Saccharomvces cere-visiae ved berøving av glukose. Cirka 5-10 % av samlet gjær-protein var kakektin. [1985] ) was expressed as an intracellular protein in yeast from a synthetic gene encoding an initial methionine and the sequence of complete cachectin, codons being chosen to reflect the codons of highly expressed yeast genes according to standard techniques. The synthetic sequences were placed downstream of a hybrid alcohol dehydrogenase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (ADH2/GAPDH) promoter. Cachectin synthesis was induced in transformed cultures of Saccharomyces cerevisiae by glucose deprivation. Approximately 5-10% of total yeast protein was cachectin.

Kakektinet ble renset fra urene gjærekstrakter ved (a) ammoniumsulfatfraksjonering, (b) Q-Sepharose-kolonnekromatografi med hurtig gjennomstrømning, (c) S-Sepharose-kolonnekromatografi med hurtig gjennomstrømning og (d) Sephacryl S-200 (HR) kolonnekromatografi. The cakectin was purified from crude yeast extracts by (a) ammonium sulfate fractionation, (b) fast flow Q-Sepharose column chromatography, (c) fast flow S-Sepharose column chromatography, and (d) Sephacryl S-200 (HR) column chromatography.

Denne fremgangsmåten gav ca. 80 % gjenvinning av kakektinaktivitet analysert med aktinomycin D-behandlede L929-celler (Ruff og Gifford (1981), Tumor Necrosis Factor, Lvmphokines, 2:235-272). Den spesifikke aktivitet til renset kakektin var 2-4 x IO<8> enheter/mg, og renheten var høyere enn 98 % bedømt ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese. This procedure gave approx. 80% recovery of cachectin activity assayed with actinomycin D-treated L929 cells (Ruff and Gifford (1981), Tumor Necrosis Factor, Lvmphokines, 2:235-272). The specific activity of purified cachectin was 2-4 x 10<8> units/mg, and the purity was higher than 98% as judged by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.

Fremstilling av monoklonale antistoffer til kakektin Preparation of monoclonal antibodies to cachectin

BALB/c-mus ble immunisert intraperitonealt med 5- BALB/c mice were immunized intraperitoneally with 5-

25 ug Freunds komplette adjuvans og forsterket to ganger med 25 µg Freund's complete adjuvant and boosted twice with

den samme dose i Freunds ukomplette adjuvans med tre ukentlige mellomrom. En siste intraperitoneal forsterkning med den samme dose i vandig oppløsning ble gitt og fusjonen utført 3-4 dager senere. the same dose in Freund's incomplete adjuvant at three weekly intervals. A final intraperitoneal boost with the same dose in aqueous solution was given and the fusion performed 3-4 days later.

Miltceller (ca. 10° celler) fra immuniserte mus ble fusjonert med ca. 2 x IO<7> myelomceller (P3-X63-Ag8.653) Spleen cells (approx. 10° cells) from immunized mice were fused with approx. 2 x IO<7> myeloma cells (P3-X63-Ag8.653)

(Kearney et al., J. Immunol. [1979], 123:1548-1550) under anvendelse av polyetylenglykol ifølge Kohler og Milstein (Nature 256:495 [1979]). Cellene ble platet ut på mikrotiterplater, og hybridene ble valgt ut ved hjelp av hypoksantinaminopterin-thymidin-mediet (HAT-mediet). (Kearney et al., J. Immunol. [1979], 123:1548-1550) using polyethylene glycol according to Kohler and Milstein (Nature 256:495 [1979]). The cells were plated on microtiter plates and the hybrids were selected using the hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium (HAT medium).

Fem fusjoner ble utført med miltceller fra fem mus immunisert med kakektin. Ved å bruke fastfase enzymbundet immunosorbentanalyse ble det erholdt 60 positive kloner som produserte monoklonale antistoffer til kakektin. Five fusions were performed with spleen cells from five mice immunized with cachectin. Using solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay, 60 positive clones were obtained that produced monoclonal antibodies to cachectin.

Hybridene fra positive brønner ble klonet tre ganger med grensefortynninger for å sikre at hver var en virkelig klon. Fjorten hybridomer som var positive for kakektin, ble klonet og karakterisert. The hybrids from positive wells were cloned three times with limiting dilutions to ensure that each was a true clone. Fourteen cachectin-positive hybridomas were cloned and characterized.

Kakektin/ TNF- bioanalvse: L929- celle- cytotoksisitet Cachectin/TNF bioassay: L929 cell cytotoxicity

TNF-aktivitet ble målt under anvendelse av en cyto-lytisk analyse med aktinomycin D-behandlede 929-celler som beskrevet av Ruff og Gifford i Lvmphokines. 2:235 (1981). TNF activity was measured using a cytolytic assay with actinomycin D-treated 929 cells as described by Ruff and Gifford in Immunokines. 2:235 (1981).

L929-celler (CCL1, American Type Culture Collection, Rockville, MD) holdes i RPMI 1640 supplert med 10 mM Hepes og 10 % kalvefosterserum (eller DME + 10 % FBS). Sammenflytende kulturer (3-4 x 10<7> celler/75 cm kolbe) frigjøres ved kortvarig trypsinbehandling (skylling med 0,05 % trypsin) i fysiologisk saltoppløsning inneholdende 5 mM EDTA og 10 mM Hepes, pH 7,4, og på nytt oppslemmet i friskt medium inneholdende aktinomycin D (1 ug/ml). Cellene plates så ut i 96-brønners mikrotiter-skåler (5-7 x 10<4> celler/brønn). L929 cells (CCL1, American Type Culture Collection, Rockville, MD) are maintained in RPMI 1640 supplemented with 10 mM Hepes and 10% fetal calf serum (or DME + 10% FBS). Confluent cultures (3-4 x 10<7> cells/75 cm flask) are released by brief trypsinization (rinsing with 0.05% trypsin) in physiological saline containing 5 mM EDTA and 10 mM Hepes, pH 7.4, and again resuspended in fresh medium containing actinomycin D (1 µg/ml). The cells were then plated in 96-well microtiter dishes (5-7 x 10<4> cells/well).

Etter 2 timer i kultur tilsettes seriefortynnede prøver til brønnene (mindre enn 10-20 % serum), og platene inkuberes over natten (5 % C02 , 37 °C). Prøver analyseres in kvadruplo. Den neste dag dekanteres mediet etter mikroskopisk evaluering, og brønnene fylles med en oppløsning av 0,2 % krystallfiolett, 10 % formalin og 0,01 % fosfat, pH 7-7,5, i 5 minutter, vaskes grundig med vann og tørkes. Graden av lyse kvantifiseres spektrofotometrisk (550-570 nM) på en mikro-titerplateleser. Analyseresultatene uttrykkes som U/ml, idet én enhet (U) defineres som mengden av kakektin som resulterer i lyse av 50 % av cellene. After 2 hours in culture, serially diluted samples are added to the wells (less than 10-20% serum), and the plates are incubated overnight (5% CO 2 , 37 °C). Samples are analyzed in quadruplicate. The next day, after microscopic evaluation, the medium is decanted, and the wells are filled with a solution of 0.2% crystal violet, 10% formalin and 0.01% phosphate, pH 7-7.5, for 5 minutes, washed thoroughly with water and dried. The degree of lysis is quantified spectrophotometrically (550-570 nM) on a microtiter plate reader. The analysis results are expressed as U/ml, one unit (U) being defined as the amount of cachectin that results in the lysis of 50% of the cells.

In vitro nøvtraliseringsanalyse In vitro neutralization assay

Rekombinant humankakektin (20 ng/ml i 0,02 M tris-HC1, pH 8,0, 0,15 M NaCl, 1 mg/ml BSA) blandes med like store volumer fortynnet antistoff og inkuberes ved 37 °C i 60 minutter. Blandingen fortynnes 1:10 med friskt medium inneholdende aktinomycin D (ug/ml), og 0,1 ml seriefortynnet (to ganger) prøver in kvadrupliko tilsettes mikrotiterplatebrønner. Den gjenværende cytolytiske aktivitet bestemmes ved å bruke L929-celle-cytotoksisitetsanalysen. Recombinant human cachectin (20 ng/ml in 0.02 M tris-HCl, pH 8.0, 0.15 M NaCl, 1 mg/ml BSA) is mixed with equal volumes of diluted antibody and incubated at 37 °C for 60 minutes. The mixture is diluted 1:10 with fresh medium containing actinomycin D (ug/ml), and 0.1 ml serially diluted (twice) samples in quadruplicate are added to microtiter plate wells. The residual cytolytic activity is determined using the L929 cell cytotoxicity assay.

Karakterisering av monoklonale antistoffer Characterization of monoclonal antibodies

Fjorten hybridomer som er positive for kakektin ble identifisert og subklonet. Antistoffene fremstilt ved hjelp av disse hybridomene ble karakterisert med hensyn på sin evne til å konkurrere med monoklonalt antistoff 18-1-1 (Tracey et al., Nature, 330:662-664 [1987]) for kakektinbinding i en ELISA. Som vist i tabell 1 faller de monoklonale antistoffene innen-for tre klasser; de som ikke konkurrerer med 18-1-1, de som gjør det og de som oppviser intermediær konkurranse. For å bekrefte at de monoklonale antistoffene som ikke konkurrerte med 18-1-1 var spesifikke for kakektin, ble det utført en kakektinoppfangingsanalyse. De monoklonale antistoffene ble bundet på en fast fase for å fange opp kakektin, og monoklonalt antistoff 18-1-1 ble brukt som det merkede antistoff. Alle de monoklonale antistoffene var spesifikke for kakektin ved denne analysen. Fourteen cachectin-positive hybridomas were identified and subcloned. The antibodies produced using these hybridomas were characterized for their ability to compete with monoclonal antibody 18-1-1 (Tracey et al., Nature, 330:662-664 [1987]) for cachectin binding in an ELISA. As shown in Table 1, the monoclonal antibodies fall into three classes; those that do not compete with 18-1-1, those that do and those that exhibit intermediate competition. To confirm that the monoclonal antibodies that did not compete with 18-1-1 were specific for cachectin, a cachectin capture assay was performed. The monoclonal antibodies were bound on a solid phase to capture cachectin, and monoclonal antibody 18-1-1 was used as the labeled antibody. All of the monoclonal antibodies were specific for cachectin in this assay.

Forsøk med kondisjonerte medier fra hybridomceller ble også utført for å bestemme i hvilken utstrekning de monoklonale antistoffene nøytraliserte den celledrepende aktivitet av kakektin. Alle de 14 monoklonale antistoffene ble produsert i museascitesvæske for videre karakterisering. Virkningsfullheten av de rensede monoklonale antistoffene når det gjelder å beskytte L929-celler mot dreping med kakektin, ble bestemt. Den nøytraliserende aktivitet av MAb 1-2-4B1 var blitt bekreftet med det rensede materiale. Inkubasjon av MAb 2-2-3E3 (50 ng/ml) med et like stort volum rekombinant kakektin (20 ng/ml) ved 37 °C i 60 minutter viste at 50 % av den cytolytiske aktivitet av kakektin ble nøytralisert, bestemt ved hjelp av L929-celledrepingsanalysen. Som vist i tabell 1 er MAb 2-2-3E3, som gjenkjenner den samme epitop som MAb 18-1-1, påkrevet i 1/8 av mengden av 18-1-1 for cellebeskyttelse. Også vist i tabell 1 er at de fleste av antistoffene med den samme spesifisitet som 18-1-1 nøytraliserte kakektin (ved 100 %) i L929-celledrepingsanalysen. Andre antistoffer, slik som 1-2-4B1, som har andre epitopspesifisiteter enn 18-1-1, hadde også betydelig nøytraliserende aktivitet. Virkningsfullhet av etterbehandling med anti- TNF monoklonalt antistoffragment til forhindring av de skadelige virkningene av sårbetennelse hos bavian Experiments with conditioned media from hybridoma cells were also performed to determine the extent to which the monoclonal antibodies neutralized the cytotoxic activity of cachectin. All 14 monoclonal antibodies were produced in mouse ascites fluid for further characterization. The efficacy of the purified monoclonal antibodies in protecting L929 cells from killing by cachectin was determined. The neutralizing activity of MAb 1-2-4B1 had been confirmed with the purified material. Incubation of MAb 2-2-3E3 (50 ng/ml) with an equal volume of recombinant cachectin (20 ng/ml) at 37 °C for 60 minutes showed that 50% of the cytolytic activity of cachectin was neutralized, as determined by of the L929 cell killing assay. As shown in Table 1, MAb 2-2-3E3, which recognizes the same epitope as MAb 18-1-1, is required at 1/8 the amount of 18-1-1 for cell protection. Also shown in Table 1 is that most of the antibodies with the same specificity as 18-1-1 neutralized cachectin (at 100%) in the L929 cell killing assay. Other antibodies, such as 1-2-4B1, which have epitope specificities other than 18-1-1, also had significant neutralizing activity. Efficacy of post-treatment with anti-TNF monoclonal antibody fragment in preventing the deleterious effects of wound inflammation in baboons

Bavianer fikk intravenøst administrert en 2-timers LD100-innsprøyting av Escherichia coli (E. coli). Dyrene ble overvåket i 10 timer og ble observert inntil de døde, eller maksimalt i 7 dager. Aminoglykosidantibiotikumet gentamicin ble administrert til bestemte tidspunkter etter en 2-timers innsprøyting av E. coli. En bolusinjeksjon av anti-TNF monoklonalt antistoff 2-2-3E3 F(ab' )2-fragment (10 mg/kg) ble administrert til fire bavianer ved T + 30 minutter (1/4 av for-løpet gjennom bakterieinnsprøytingen, dvs. "etterbehandling"). En ytterligere bavian ble gitt den samme dose E. coli pluss gentamicin og behandlet med en isotypekontroll av et ir-relevant F (ab' )2-fragment. Baboons were intravenously administered a 2-hour LD100 injection of Escherichia coli (E. coli). The animals were monitored for 10 hours and were observed until they died, or for a maximum of 7 days. The aminoglycoside antibiotic gentamicin was administered at specific time points after a 2-hour injection of E. coli. A bolus injection of anti-TNF monoclonal antibody 2-2-3E3 F(ab' )2 fragment (10 mg/kg) was administered to four baboons at T + 30 minutes (1/4 of the precourse through the bacterial injection, i.e. "finishing"). An additional baboon was given the same dose of E. coli plus gentamicin and treated with an isotype control of an irrelevant F (ab' ) 2 fragment.

(2) Observasjoner etter død (2) Observations after death

Oppsummering av undersøkelser etter død utført på bavianene nr. 1, 2 og 5 (undersøkelse etter død ikke tatt med for overlevende bavianer nr. 3 og 4 fordi tidligere arbeider med overlevende dyr viste ingen skadelige histologiske effekter). Hoveddelen av funnene etter død på dyrene nr. 1, 2 og 5 var like med hverandre og er som følger: Summary of postmortem examinations performed on baboons #1, 2, and 5 (postmortem examination not included for surviving baboons #3 and 4 because previous work on surviving animals showed no deleterious histological effects). The main part of the findings after death on animals No. 1, 2 and 5 were similar to each other and are as follows:

Lun<g>er: blødninger (3<++>) Lun<g>er: bleeding (3<++>)

Nyrer: for sterk blodtilstrømning, nekrotisk (3<*>) Binyrer: blødninger, nekrotisk (4<*>) Kidneys: excessive blood flow, necrotic (3<*>) Adrenal glands: bleeding, necrotic (4<*>)

Lever: for stor blodtilstrømning (2<+>) Liver: excessive blood flow (2<+>)

Milt: oppsvulmet og overfylt med blod Spleen: swollen and congested with blood

Tarmer: normale av utseende, men innkrengninger i tynntarmen ble observert hos dyrene nr. 1 og 2. Intestines: normal in appearance, but invasion of the small intestine was observed in animals #1 and #2.

Hjerte, bukspyttkjertel. mage, tykktarm: normale av utseende. Heart, pancreas. Stomach, colon: normal in appearance.

(3) Fysiologiske og andre parametere overvåket i 10 timer (a) Parametere forbundet med overlevelsesfordeler hos bavianene 3 og 4, og som var forskjellige ikke-overlevende bavianer (nr. 1, 2 og 5), var: tgjennomsnittlig systemisk arterietrykk (MSAP), TpH, ilaktat, iBUN, ikreatinin, iSGPT, Ikortisol, Tglukose, iFDP og Tfibrinogen. (b) Parametere uten forskjeller mellom overlevende (nr. 3 og 4) og ikke-overlevende (nr. 1, 2 og 5) bavianer var: hjerte- og åndedrettsvirksomhet, VBS, blodplater, pC02, p02, CPK, hematokrit, koloni ( E. coli)-blodkonsentrasjoner, kropps-temperatur . (3) Physiological and other parameters monitored for 10 hours (a) Parameters associated with survival benefits in baboons 3 and 4, which were different non-surviving baboons (Nos. 1, 2 and 5), were: tmean systemic arterial pressure (MSAP) , TpH, ilactate, iBUN, icreatinine, iSGPT, Icortisol, Tglucose, iFDP and Tfibrinogen. (b) Parameters with no differences between surviving (nos. 3 and 4) and non-surviving (nos. 1, 2 and 5) baboons were: cardiorespiratory activity, VBS, platelets, pC02, p02, CPK, hematocrit, colony ( E. coli) blood concentrations, body temperature.

Når undersøkelsene ble gjentatt med helt antistoff, ble det ikke lagt merke til noen betydelige forskjeller. Både bindende fragmenter og intakte antistoffer kan således benyttes. When the studies were repeated with whole antibody, no significant differences were noted. Both binding fragments and intact antibodies can thus be used.

Av det ovenfor nevnte vil det forstås at cellelinjene som anvendes ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, gir midler for å fremstille monoklonale antistoffer og fragmenter derav som reagerer med humankakektin ved lave nøytraliserende mengder. Dette muliggjør at profylaktiske og terapeutiske preparater kan utvikles mer økonomisk og administreres sikrere for å være effektive mot infeksjoner som skyldes de fleste endotoksinbærende bakteriestammer. I tillegg vil antistoffene finne anvendelse ved de forskjellige diagnos-tiske og andre terapeutiske fremgangsmåter. From the above, it will be understood that the cell lines used in the method according to the present invention provide means for producing monoclonal antibodies and fragments thereof which react with human cachectin at low neutralizing amounts. This enables prophylactic and therapeutic preparations to be developed more economically and administered more safely to be effective against infections caused by most endotoxin-carrying bacterial strains. In addition, the antibodies will find use in the various diagnostic and other therapeutic procedures.

Claims

1. Process for the production of monoclonal antibodies or fragments thereof for the treatment of endotoxin-carrying bacterial infections, where the monoclonal antibodies or fragments thereof have the following properties: a) the monoclonal antibody or fragment thereof binds human cachectin specifically, b) less than 400 ng of the monoclonal antibody or fragment thereof will neutralize 20 ng of human cachectin in an L929 cell cytolytic assay, c) the monoclonal antibody or fragment thereof blocks the binding of monoclonal antibodies produced by ATCC HB9736 or ATCC HB9737 to cachectin, and d) the monoclonal antibodies or the fragments thereof are protective against endotoxemia in vivo, characterized in that a cell line capable of producing monoclonal antibodies or fragments thereof is cultured, and the monoclonal antibodies or fragments thereof are recovered.

2. Method according to claim 1, characterized in that the cell line is ATCC HB9736 or ATCC HB9737.

3. Method according to claim 2, characterized in that the cell line is ATCC HB9737.