SI9400206A - Uporaba interleukina-10 v adoptivniimunoterapiji raka - Google Patents

Abstract

Pridobljena in predstavljena je metoda primerna za uporabo interleukina-10 v adoptivni imunoterapiji raka. Populacija s tumorjem- infiltriranih limfocitov (TILs) je ekspandirana v kulturi v prisotnosti interleukina-2 (IL-2) in interleukina-10 (IL-10). Učinkovite količine obeh, IL-2 in IL-10 se doda po dodajanju TILs pacientu, da se poveča citotoksičnost tumorskih celic TILs in zmanjša stranske učinke povzročene z IL-2 inducirano produkcijo citokina v TILs in ostalih pacientovih celicah.

Description

UPORABA INTERLEUKINA-10 V ADOPTIVNI

IMUNOTERAPIJI RAKA

1. PODROČJE IZUMA

Izum se nanaša na splošne metode in sestavke primerne za zdravljenje neoplazem, ali rakastih obolenj pri ljudeh in bolj natančno na uporabo sestavkov interleukina-10 (IL-10) v adoptivni imunoterapiji humanega raka.

2. OZADJE IZUMA

Imunološki pristopi k zdravljenju raka so osnovani na predpostavki, da so se rakaste celice nekako izognile telesni obrambi proti nenormalnim ali tujim celicam ali molekulam, s tem, da se ti obrambni mehanizmi lahko terapevtsko stimulirajo in ponovno pridobijo izgubljeno osnovo: glej strani 623-648 v knjigi Klein, Immunology (Wiley-Interscience,New York, 1982). Novejša ugotovitve, da nekateri imunski efektorji lahko direktno inhibirajo rast tumorjev, vodijo do ponovnega zanimanja za ta pristop k zdravljenju raka: glej Herberman, Concepts Immunopathol. Vol.l, str. 96-132 (1985)(naravne celice ubijalke so rezistentne na rast tumorskih celic.); Rosenberg in sod., Ann.Rev. Immunol.jVol.T, str. 681-709 (1988) (klinična uporaba IL-2-aktiviranih celic ubijalk za zdravljenje raka); Ralph. in sod., J.Exp.Med., Vol.167, str. 712-717 (1988) (tumoricidna aktivnost z makrofagi stimuliranimi z limfokini), Tepper in sod. Celi, Vol.

57, str. 503-512 (1989) (IL-4 ima protitumorsko aktivnost), M.Cohen, Lymphokines and Tumor Immunity, str. 237-253 v

S.Cohen, ed. Lymphokines and the Immune Response (CRC Press, Boca Raton, 1990), in slični.

Tako imenovana adoptivna imunoterapija, ki uporablja celice ubijalke aktivirane z interleukinom-2 (IL-2) je pokazala klinično obetavnost za enga od imunoloških pristopov. : Rosenberg in sod.(citiran zgoraj) in Rosenberg. Sci. Amer. str. 62-69 (maj 1990). Resni stranski učinki povzročeni direktno ali indirektno z IL-2 so žal postali ovira pri razvoju rutinskega zdravljenja in protokolov osnovanih na tem pristopu: glej Gaynor in sod.,Ann. Int. Med. Vol. 109, str. 953-958 (1988); Lee in sod. J.Clin.Oncol., Vol. 7, str. 7-20 (1989); in Rosenberg in sod. Human. Path.,Vol.22, str.493-502 (1990). Z odkritjem metod, ki bi lahko zmanjšale resnost stranskih učinkov povzročenih z IL-2 ali direktno ali indirektno, bi bil dosežen velik napredek v tem pristopu k zdravljenju rakastih obolenj.

POVZETEK IZUMA

Ta izum se nanaša na uporabo interleukina-10 (IL10) pri adoptivni imunoterapiji rakastih obolenj. Izum vsebuje tudi farmacevtske sestavke, ki vsebujejo interleukin-10 za uporabo v adoptivni imunoterapiji. Osnova izuma sloni delno na odkritju, da IL-10 lahko prepreči ali zmanjša produkcijo citokinov, ki so odgovorni za mnoge psihično škodljive stranske učinke, ki jih srečujemo v adoptivni imunoterapiji. Izraz adoptivna imunoterapija, ki se uporablja tukaj, pomeni terapijo, kjer se pacientu vnese imuske celice, ki se bojujejo z rakom. Te z rakom se bojujoče imunske celice preferenčno vsebujejo v tumorinfiltrirane limfocite (TILs), pridobljene od pacienta ali pacientke.

Širše, metodologija izuma vsebuje sledeče stopnje (i) gojenje kulture TILs v prisotnosti IL-2 in IL-10, (ii) dodajanje tako kultivirane TILs pacientu, in (iii) dodajanje IL-2 in IL-10 pacientu po dodajanju (administriranju) TILs.

Interleukin-10 v tem izumu se preferenčno izbere iz skupine, ki je sestavljena iz dozorelih zolipeptidov, ki imajo ogrodje definirano z naslednjimi sekvencami aminokislin:

kjer je uporabljena standardna okrajšava s tremi črkami, da označi L-amino kisline in se začne pri N-končnici. Ti dve obliki IL-10 sta včasih imenovani tudi kot humani IL-10 (ali humani citokinski sintezni faktor inhibicije ) in virusni IL-10 (ali BCRF1), glej Moore in sod. Science,Vol. 248, str. 1230-1234 (1990); Vieira in sod.,Science,Vol. 88, str. 1172-1176 (1991); Fiorentino in sod. J. Exp. Med., Vol. 170, str. 2081-2095 (1989); in Hsu in sod.,Science, Voil. 250, str. 830-832 (1990). Še raje se v tem izumu izbere zreli IL-10 iz skupine, ki je sestavljena iz sledečih sekvenc.

in

KRATEK OPIS SKIC

Slika 1. predstavlja ekspresijski vektor pcD(SRa) pri sesalcih.

Slika 2. prestavlja bakterijski eksprecijski vektor TRP-C11.

Slika 3. ilustrira podatke o citokinski sintezi IL-2-aktivirane periferne krvne mononuklearne celice (PBMCs) vzgojene v prisotnosti IL-2 in ali IL-4; vIL-10, in hIL-10 (V pomeni virusno in črka ’h’ pomeni humano ).

Slika 4. (a) ilustrira podatke, ki kažejo učinek IL-4, vIL-10, in hIL-10 na z IL-2 inducirano citotoksičnost PBMCs-a.

Slika 4.(b) ilustrira podatke, ki kažejo, da CD56+ (Leu 19⁺) PBMCs izražajo LAK aktivnost v prisotnosti IL-10 in IL-2.

Slika 5(a) ilustrira podatke, ki kažejo učinek IL-4, vIL-10, in hIL-10 na IFNy produkcijo v očiščenih NK celicah.

Sliki 5(b) in (c) ilustrirata podatke, ki kažejo učinek monocitov na IFNy produkcijo z očiščenemi NK celicami v prisotnosti IL-2 in/ali hIL-10 in vIL-10.

NATANČEN OPIS IZUMA

Izum je usmerjen v metodologijo uporabe IL-10 za zmanjšanje citokin-induciranih stranskih učinkov pri adoptivni imunoterapiji raka. Izum tudi vsebuje farmacevtske sestavke, ki vsebujejo IL-10 za delovanje metodologije. IL-10 uporabljen v tem izumu je preferenčno izbran iz skupine dozorelih polipeptidov kodiranih z kodirajočim okvirom označenim z cDNA vključki pH15C, pH5C, in pBCRFl(SRa), ki so deponirani v American Type Culture Collection (ATCC)-zbirki v Rockvillu., Maryland, pod dostopnimi številkami 68191,68192 in 689193.

IL-10 se preferenčno uporablja v kombinaciji z IL-2 v adoptivni imunoterapiji, kakor je opisal Rosenberg s sod. v Ann. Rev. Immunol.,Vol. 4, str.681-709- (1988), Topalian s.sod. v J.Immunol.Meth.,Vol.l02, str.127-141 (1987), in Rosenberg s sod. v New.Eng.J.Med..Vol. 319, str. 167-1680 (1988). Te reference so vključene kot referenca.

TILs so bili pripravljeni kot sledi. Trdni tumorji (preferenčno 10-30 g) so bili z uporabo sterilne tehnike izločeni iz pacienta in razrezani na 5mm^ koščke, katere so namočili v RPMI 1640 mediju, ki je vseboval hiluronidazo tipa V 0.01%, DNAso tipa I 0,002%, kolagenazo tipa IV 0,1% (Sigma,ST.Louis,MO), penicilin 50 IU/ml, streptomicin 50 μ g/ml(Flow Laboratoires,McLean,VA), in gentamicin 50 pg/ml (Gibco Laboratoires,Chagrin Falls, OH).

To zmes so mešali 6-24 ur pri sobni temperaturi, jo nato filtrirali skozi grobo žičnato sito, da so odstranili nerazdeljene celične sestavine. Tako dobljeno suspenzijo tumorskih celic so centrifugirali pri 400 x g obratih 10 minut. Peletko so sprali dvakrat s Hanksovo uravnoteženo raztopino soli (HBSS) brez Ca/Mg/fenol rdečega (Whittaker MA Bioproducts,

Walkersville,MD), nato resuspendirali v HBSS in spustili skozi Ficoll-Hypaque gradiente (LSM, Bionetics, Kensigton,MD). Deli gradienta, ki vsebujejo žive tumorske celice, limfocite in monocite, so pobrali skupaj in jih še dvakrat sprali s HBSS. Število limfocitov se lahko ugotovi vizualno, s citološkim preskusom, ali s tekočo citometrijo. Zbrane pridelane celice se lahko zamrzne in shrani kot tipsko primerljive humane serume, ki vsebujejo 10% (v/v) DMSO.

Pri koncentraciji okoli 2,5-5,0 x 10^ živih celic/ml, suspenzij enotnih tumorskih celic, ki smo jih dobili ali direktno iz procesa encimatske prebave opisane zgoraj, ali iz hitrega odmrznenja zamrznjenih vzorcev, so bile slednje razredčene v mediju kultur, ki so vsebovale 20% (po volumnu) LAK celične tekočine (opisane spodaj) in 80% (po volumnu) RPMI 1640 medija, ki vsebuje 10% toplotno inaktiviranega humanega seruma, penicilina, streptomicina, gentamicina in amfotericina 250 enot/ml (Fungizone, Squibb, Flow Laboratoires, McLean, VA), 10 mM Hepes pufer in 2mM L-glutamin. IL-2 je dodan pri končni koncentraciji 1000 U/ml (enote IL-2 aktivnosti so določene po Rosenbergu in sod. Science (citirano zgoraj ) in je IL-10 dodan pri končni koncentraciji med okoli 10 in 100 U/ml (enote so določene kot spodaj). Kulture TIL so upeljane s porazdelitvijo celic v 175 cm^ bučke (Falcon, Becton Dickinson,Oxnard,CA), ali podobne, katere se drži pri 37°C v vlažni 5% atmosferi CO2Kulture TIL se pobere, peletira, resuspendira v svežem mediju in svežem IL-2 enkrat tedensko, ali kakor je narekovano s hitrostjo rasti kulture. TIL kulture so ponovno precepljene pri koncentracijah okoli 2,5 x 10^ živih celic/ml pri vsakem cepljenju. Po 9-28 dnevnem kultiviranju, preferenčno celo po 30-40 dnevih, tumorske celice izginejo iz kultur. TILsi so pobrani s cetrifugiranjem, resuspendirani v izotonični slani raztopini ali sorodnem farmacevtskem nosilcu, in so z infuzijo dodani pacientu (maksimalno 2 x 10^ celic v 200-250 ml nosilne raztopine v obdobju 30-60 minut.). Po infuziji TILsa, sta pacientu administrirana tudi IL-2 in IL-10, kot bo opisano spodaj.

Supernatant LAK celic so dobili kot sledi. Humane periferne krvne limfocite, ki so jih dobili ali iz leukofereznih vzorcev, ali iz periferne venozne krvi s standardno FicollHypaqueovo separacijsko tehniko, so suspendirali v RPMI 1640 mediju z 2% toplotno -inaktiviranem humanem AB serumom, penicilinom, streptomicinom in gentamicinom pri celični koncentraciji okoli 1,0 x 10^ celic/ml., IL-2 so dodali pri koncentraciji okoli 1000 U/ml, in celice inkubirali 3-5 dni. Supernatant kulture so pobrali po centrifugiranju in jo skladiščili pri 4°C za nadalnjo uporabo v TIL kulturah.

I. EKSPRESIJA REKOMBINANTNEGA IL-10

Uporablja se lahko širok spekter enoceličnih in policeličnih ekspresijskih sistemov (gostitelj/kombinacije ekspresijskega vektorja) za produkcijo polipeptidov v tem izumu. Možni tipi gostiteljevih celic vsebujejo, vendar niso omejeni na, bakterijske, kvasovske, insektne, sesalske in podobne. Mnogo je primernih preglednih člankov, ki omogočijo usmerjanje pri izbiri in /ali modifikacijah posebnih ekspresijskih sistemov; da jih nekaj imenujemo : de Boer and Shepard, Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli, str. 205-247, v Kroon, ed. Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), in opisuje ekspresijske sisteme E. Coli; Kucherlapati in sod., Critical Rewiews in Biochemistry, Vol. 16, Issue 4, str. 349-379 (1984), in Banerji s sod.,Genetic

Engineering, Vol._5, str. 19-31 (1983) opisuje metotologijo transfekcije in pretvorbe celic sesalcev; Reznikoff in Gold. ed.„ Maximizing Gene Expression (Buttenvorths, Boston, 1986)opisujeta izbrane teme o genski ekspresiji pri E. Coli, kvasovkah in celic sesalcev; in Thilly, Mammalian Celi Technology (Buttenvorths, Boston, 1986) ekspresijske sisteme sesalcev. Podobno so primerni mnogi pregledi, ki opisujejo tehnike in pogoje za vezavo in/ali manipulacijo specifičnih cDNAjev in ekspresijsko kontrolo sekvenc, ki kreirajo in/ali modificirajo ekspresijske vektorje primerne za uporabo v tem izumu, na.primer Sambrook in sod. (citiran zgoraj).

E.Coli ekspresijski sistem je odkril Riggs v U.S. Patentu 4.431.739, ki je vključen kot referenca. Posebno uporaben prokariotski promotor za doseganje visoke ekspresije pri E.Coli je tac promotor, ki ga je odkril- de Boer v U.S. Patentu 4.551.433, ki je prav tako vključen kot referenca.. Izločevalni ekpresijski vektorji za E.Coli gostitelje so tudi na voljo. Posebno uporabni so pIN-III-ompA vektorji, ki jih je opisal Ghrayeb s sod. v EMBO J., Vol. X str. 2437-2442 (1984), v katerih je cDNA, ki bo transkribirana spojena z delom E.Coli OmpA gena, ki kodira signalni peptid ompA proteina, ki izmenoma povzroča, da se dozoreli protein izloča v periplazmični prostor bakterije. U.S. Patenta 4.336.336 in 4.338.397 tudi poročata o izločevalnih ekspresijskih vektorjih prokariotov. Te reference so skladno vključene.

Številni bakterijski rodovi so primerni gostitelji prokariotskih ekspresijskih vektorjev vključno z E.Coli, kot je W3110 (ATCC No. 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB101, Χ1776 (ATCC No. 31244), Χ2282, RR1 (ATCC No. 31343) MRCI; rod Bacillus subtilis; in druge enterobakterije kot Salmonella typhimurium ali Serratia marcescens, in različne specije Pseudomonas. splošne metode uporabljene kot izvor bakterijskih sevov, kot je E.Coli Κ12Χ17765, ki so uporabne za ekspresijo eukariotskih proteinov je opisal Curtis III v U.S. Patentu 4.190.495. Usklajeno je patent vključen kot referenca.

Dodatno k prokariotskim in eukariotskim mikroorganizmom, so lahko ekspresijski sistemi, ki vsebujejo celice, ki izvirajo iz policeličnih organizmov, prav tako uporabljani za produkcijo proteinov v tem izumu. Posebno zanimivi so ekspresijski sistemi sesalcev, ker njihov posttranslacijski ustroj verjetneje tvori biološko aktivne proteine. Več DNA tumomih virusov je bilo uporabljenih kot vektorjev pri sesalskih gostiteljih.

Posebno pomembni so številni vektorji, ki zajemajo replikacijo,transkripcijo, in /ali traslacijsko kontrolo SV40, sekvenc vezanih na bakterijske kontrolne sekvence replikacije: na pr. pcD vektorji, ki sta jih razvila Okdyama in Berg, opisani v Mol. Celi. Biol.,Vol. 2, str.161-170 (1982) in v Mol.Cell. Biol., Vol. 3, str. 280-289 (1983), in izboljšani pri Takebi in sod. v Mol. Celi. Biol. Vol.,8, str. 466-472 (1988). Te reference so usklajeno vključene kot referenca. Ostali SV40-bazirani ekspresijski vektorji sesalcev vsebujejo tudi ostale opisane pri Kaufmanu in Sharpu, v Mol. Celi. Biol., Vol. 2, str. 1304-1319 (1982), in Clarku in sod. v U.S. Patentu 4.675.285. Oba sta tu vključena kot referenci.

Opičje celice so običajno najprimernejši gostitelji za gornje vektorje. Ti vektorji, ki vsebujejo SV40 ori sekvence in intaktni A gen se lahko replicirajo avtonomno v opičjih celicah (da dajo večje število kopij in bolj stabilno število kopij kot neavtonomno se množeči plazmidi). Nadalje se vektorji, ki vsebujejo SV40 ori sekvence brez intaktnega A gena lahko avtonomno replicirajo v velikem številu kopij (toda ne trajno) v COS7 opičjih celicah opisanih pri Guluzmanu v Celi, Vol. 23, str. 175-182 (1981) in so na voljo iz ATCC (dostopna št. CRL

1651). Gornji SV40-bazirani vektorji so tudi zmožni trasformiranja ostalih celic sesalcev, kot so mišje L celice, z integracijo v celično DNA gostitelja.

Policelični organizmi se tudi lahko uporabljajo kot gostitelji primerni za produkcijo polipeptidov iz tega izuma, na pr. ličinke insektov (Maeda in sod.,Nature, Vol., 315, str. 592594 (1985) in Ann. Rev. Entomol., str. 351-372 (1989),), in transgene živali (Jaenisch, Science, Vol. 240, str. 1468-1474 (1988)).

II. ANALIZA INTERLEUKINA-10 IN DEFINICIJA

ENOT,

IL-10 kažejo več bioloških aktivnosti, ki lahko tvorijo osnovo za analizo (preskuse) in enote. Prav posebej, poseduje IL-10 lastnost zmožnosti inhibiranja sinteze najmanj enega citokina v skupini, ki sestoji iz IFN-γ, limfotoksina, IL-2, IL-3, in GM-CSF v populaciji T vmesnih celic, induciranih z namenom sintetiziranja enega ali več od teh citokinov, s tem da jih izpostavimo singeničnim antigen-navzočim celicah (APCs) in antigenu. Pri teh aktivnostih, so APCs obdelane tako, da postanejo nezmožne replikacije, medtem ko ostane njihov ustroj antigenskega procesiranja še vedno funkcionalen. To se običajno doseže z iradiacijo APC-jev, na pr. z okoli 1500-3000 R (γ ali x-sevanje ) preden se zmešajo s T celicami.

Alternativno se lahko citokinska inhibicija analizira v primarnih ali raje v sekundarnih mešanih-limfocitnih reakcijah (MLR), kjer ni potrebno uporabljati singenične APCs. MLR-je so dobro znane, na pr. Bradley, str. 162-166, v Mishell in sod. ed. Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, San

Frančiško, 1980); in Battisto s sod., Meth. in Enzymol, Vol. 150, str. 83-91 (1987). Na kratko, zmeša se dve populaciji alogenskih limfoidnih celic, ena je bila najprej obdelana pred mešanjem, da bi se preprečila proliferacija, na pr. z obsevanjem. Preferenčno so celične populacije pripravljene v koncentracijah okoli 2 x 10^ celic/ml v dodatnem mediju, na pr. RPMI 1640 z 10% serumom telečjega zarodka. Za obe kontroli in testne kulture, zmešaj 0,5 ml obeh populacij za preskus. Za sekundarno MLR, so celice, ki ostanejo po 7 dneh v primarni MLR, stimulirane s sveže pripravljenimi, z obsevanjem stimuliranimi celicami. Vzorec, ki naj bi vseboval IL-10 lahko dodamo testnim kulturam ob času mešanja, in obe kontroli in testne kulture lahko preskusimo na produkcijo citokinov od 1 do 3 dneva po mešanju.

Za izračunanje populacij T celic, oziroma APC populacij za IL-10 preskuse se uporablja dobro znana tehika, ki je v celoti opisana v DiSabato in sod., ed. Meth. in Enzymol, Vol. 1087 (1984). APCs potrebni za preferenčni preskus na IL-10 so periferni krvni monociti. Te se pridobi z uporabo standardnih tehnik: na pr. tako kot so jih opisali Boyum, v Meth. in Enzymol., Vol. 108, str. 88-102 (1984), ali Mage v Meth. in Enzymol., Vol. 108, str. 118-132 (1984), ali Litvin s sod. v Meth. in Enzymol., Vol. 108, str. 298-302 (1984), ali Stevenson v Meth. in Enzymol., Vol. 108, str. 242-249 (1989), in tudi Romain s sod. v Meth. in EnzymoL, Vol. Io8, str. 148-153 (1984), katerih reference so vkljopljene kot reference. Najraje uporabljajo Tvmesne celice za IL-10 poskuse, katere pridobijo s prvo separacijo limfocitov iz periferne krvi, nadalnjo selekcijo na primer z izpiranjem ali pretočno citometrijo, vmesnih celic z uporabo komercialno dostopnih anti-CD4 protiteles, na pr. OKT4, ki so opisana v U.S. Patentu 4.381.295 in dostopna pri Ortho Pharmaceutical Corp. Potrebne tehnike je v detaljih opisal Boyum v Scand. J. Ciin. Lab. Invest.,Vol. 21 (Suppl. 97), str. 77 (1968) in v Meth. in Enzymol., Vol., 108 (cit. zgoraj ), in tudi Bra. s sod., v Meth. in Enzymol., Vol. 121, str.737-748 (1986). Navadno se PBLs pridobi s Ficoll-Hypaque gradientnim gostotnim centrifugiranjem sveže krvi.

V poskusu se lahko uporablja vrsta antigenov, na pr. Keyhole limpetni hemocianin (KHL), perutninski γ-globulin in podobne. Namesto antigena, se T- vmesne celice raje stimulira z anti-CD3 monoklonskimi antitelesi v preizkusu, na pr. OKT3 opisanem v U.S. Patentu 4.361.549.

Koncentracije citokina v kontroli in testnih vzorcih so merili s standardnimi biološkimi in imunokemijski preizkusi. Izdelava imunokemijskega preizkusa za specifične citokine je dobro znana, kadar imamo na razpolago očiščen citokin. : na pr. Campbell v Monoclonal Antibody Technology (Elsevir, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practice 'and Theory of Enzyme Immunoessays (Elsevir, Amsterdam, 1985 ); in v U.S. Patentu 4.486.530, so primeri iz obširne literature o tej tematiki. ELISA oprema za humane IL-2, IL-3, in humane GM-CSF je na trgu . Prodaja jo Genzyme Corp. (Boston, MA ; prav tako se ELISA oprema za humani IFN-γ dobi pri Endogen, Inc. (Boston, MA). Poliklonska antitelesa specifična za humani limfotoksin se dobi pri Genzyme Corp., katere se lahko uporablja v radioimunskem preizkusu na humani limfotoksin, na pr.kot opisano pri v Chard, Aa Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982).

Biološki testi (preskusi) citokinov omenjeni zgoraj se lahko tudi uporabljajo za določitev aktivnosti IL-10. Biološki test za humani limfotoksin je opisal Aggarwall, v Met. in Enzymol., Vol. 116, str. 441-447 (1985), in tudi Matthews s. sod.,str. 221225, v izdaji Clemensa s sod., Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1987). Humani IL-2 in GM-CSF lahko testiramo s časovno-odvisnimi celičnimi kulturami CTLL-2 in KG-1, ki so dostopne iz ATCC pod dostopnimi številkami TIB 214 in CCL 246. Humani IL-3 je lahko preskusen po njegovi zmožnosti stimuliranja tvorbe širokega območja kolonij krvotvornih celic v kulturah mehkega agarja, na pr. kot jo je opisal Metcalf, v The Hematopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevir, Am,sterdam, 1984 ). INF-γ se lahko kvantificira s protivirusnim testom, na pr. Meager, str. 129-147, v Izdaji Clemens in sod. (citirano zgoraj ).

Produkcija citokina je prav tako lahko določena z analizo mRNA. Citokinski m.RNA-ji so lahko izmerjeni s citoplazmično hibridizajo opisano v White in sod. J.Biol.Chem., Vol.l 257, str. 8569-8572 (1982) in v Gillespie in sod. U.S. Patent 4.483.920. Te reference skladno vključujejo ostale reference. Ostali pristopi vsebujejo dot blotting z očiščeno RNA, na pr. poglavje 6, v Hames s sod., Nucleic Acid Hybridization A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985)

Nekaj vzorcev pripravljenih za testiranje se mora predhodno obdelati, da se odstrani vnaprejšne citokine, ki bi lahko vplivali na preskus. Na primer, IL-2 zveča produkcijo IFNγ v nekaterih celicah. Tako se mora glede na uporabljene Tvmesne celice v testu, IL-2 odstraniti predhodno iz testnega vzorca. To se ustrezno doseže s pretakanjem vzorca čez standardno anti-citokinsko afinitetno kolono.

Enote IL-10 aktivnosti so zaradi primernosti določene v oznakah aktivnosti zmožnosti IL-10, da poviša proliferacijo MC/9 celic, inducirano z IL-4. Te so opisane v U.S.Patentu 4.559.310 in so dostopne iz ATCC pod doistopno številko CRL 8306. 1 enota/ml je definirana kot koncentracija IL-10, ki daje 50% maksimalno stimulacijo MC/9 proliferacije nad nivojem IL-4 v testih, ki sledijo. Pripravi dvojne ali trojne razrečitve IL-4 in IL-10 v 50 pl medija na izvor na standardni mikrotitrski plošči. Medij sestoji iz RPMI 1640, 10% zarodnega telečjega seruma, 50 pm 2-merkaptoetanola, 2 mM glutamina, penicilina (100 U/l) in streptomicina (100 pg/l). Dodaj IL-4, 25 μΐ/izvor 1600 U/ml, razredčen v mediju (4oo U/ml IL-4 koncu ) in inkubiraj preko noči, na pr. 20-24 ur. Dodaj 3H-timidin (na pr. 50 pCi/ml v mediju ) pri 0,5-1,0 pCi/izvor in ponovno inkubiraj celice preko noči; nato celice poberi in zmeri inkorporirano radioaktivnost.

III. ČIŠČENJE. FARMACEVTSKI PRIPRAVKI IN

DODAJANJE PRIPRAVKOV.

Če so polipeptidi iz tega izuma ekspresirani v topni obliki, na primer kot izločeni produkt .transformiranega kvasa ali celic sesalcev, se jih lahko očisti po standardnih postopkih, vključno z obarjanjem z amonijevim sulfatom, ionsko izmenjalno kromatografijo, gelsko filtracijo, elektroforezo, afinitetno kromatografijo itd.; na pr. v Enzyme Purification and Related Techniques, Methods in Enzymology, 22:233-577 (1977), in Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice (SpringerVerlag, NewYork, 1982) predstavijo smernice za uporabo teh čiščenj. Podobno se, kadar so polipeptidi tega izuma ekspresirani v netopni obliki, na pr. kot agregati, inkluzijski vključki, ali podobno, lahko čistijo s standardnimi postopki, ki vključujejo separacijo inkluzijskih vključkov od razbitih celic 3gostitelja s centrifugiranjem, z raztapljanjem inkluzijskih teles s kaotropičnimi in reducirajočimi reagenti, z razredčenjem te raztopljane zmesi, in z znižanjem koncentracije kaotropičnega reagenta in reducirajočega reagenta, tako da polipeptid zavzame biološko aktivno konformacijo. Slednji postopki so opisani v naslednjih referencah: Winkler in sod., Biochemistrv, 25: 4041-4045 (1986);

Winkler in sod., Biotechnology, 3: 992-998 (1985); Koths in sod,U.S. Patent 4.569.790; in evropska patenti prijavi 86306917.5 in 863063353.3. IL-10 se raje uporablja v kombinaciji s humanim interleukinom-2 (hIL-2). IL-2 se lahko pridobiva po Taniguchiju in sod. v U.S.Patentu 4.738.927; ali Rosenbergu in sod.,Science, Vol. 223, str. 1412-1415 (1984); Dorin in sod., U.S. Patent 4.748.234; Koth. in sod., U.S. Patent 4.569.790; in sorodnih. Skladno so v teh referencah povzete reference.

Običajno se IL-10 dodaja kot farmacevtski pripravek, ki vsebuje farmacevtski nosilec, učinkovito količino IL-10, in IL-2. Farmacevtski nosilec je lahko vsaka kompatibilna netoksična substanca primerna za prenos pripravka tega izuma do pacienta.

Običajno so pripravki uporabni za parenteralno dodajanje takih zdravil dobro znani, na pr. v Remington’s Pharmaceutical Science, 15th Ed. (Mačk Publishing Company, Easton, PA 1980). Alternativno so lahko pripravki iz izuma vneseni v pacientovo telo z implantilnimi ali injektivnimi sistemi dostavljanja zdravil: Urquhart in sod., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, str. 199-236 (1984); Lewis, Ed. Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum press, New York, 1981); U.S. patent 3.773.919: U.S. patent 3.270.960; in sorodni.

Kadar je IL-10 doziran parenteralno je formuliran v enotni dozirni brizgalni obliki (raztopina, suspenzija, emulzija) in priključen farmacevtskemu nosilcu. Primeri teh nosilcev so normalna sol, Ringerjeva raztopina, raztopina dekstroze in Hanckova raztopina. Uporabljajo se lahko tudi nevodni nosilci, kot pritrdilna olja in etilni oleat. Preferenčni nosilec je 5% raztopina dekstroze v slanici. Nosilec lahko vsebuje manjše količine aditivov, kot so substance, ki pospešijo izotoničnost in kemično stabilnost, na pr. pufri in preservativi. IL-10 je preferenčno formuliran v očščeni obliki, bistveno prost od agregatov in ostalih proteinov v koncentracijskem območju okoli 5 do 20 pg/ml.

Tu uporabljen izraz učinkovita količina IL-10 pomeni dovolj veliko količino primerno za zmanjšanje ali preprečenje stranskih učinkov pri adoptivni imunoterapiji. Učinkovita količina za posameznega pacienta lahko varira odvisno od faktorjev kot so stanje in tip neoplastične bolezni, ki jo zdravimo, splošnega zdravja in počutja pacienta, pacientove teže, metode dodajanja, resnosti stranskih učinkov, količine in vrste ostalih zdravil, ki se tekoče uporabljajo in sorodnih.

Preferenčno se IL-10 dodaja v maksimalnih dozah, ki jih pacient še prenese. Prav tako se dodaja IL-2 v maksimalno tolerantnih dozah (na pr. 105 U/kg, ki se jih dodaja vsakih 8 ur intravenozno v 50 ml 0,9 % slanice v 5% albuminu ali podobnbem nosilcu). Preferenčno se IL-2 in IL-10 dodajata hkrati.

PRIMERI

Naslednji primeri bodo ponazorili ta izum. Izbrani vektorji in gostitelji, koncentracija reagentov, temperature, in vrednosti ostalih spremenljivk so navedeni da ponazorijo aplikacijo tega izuma in ga s tem ne omejujejo.

Primer 1. Ekspresija humanega CSIF v bakterijskem gostitelju.

Sintetični humani CSIF gen je sestavljen iz množice kemično sintetiziranih dvojnovijačnih DNA fragmentov, da tvori ekspresijski vektor označen kot TAC-RBS-hCSIF. Kloniranje in ekspresija sta izvršeni na standardnem bakterijskem sistemu, na pr. E.Coli K-12 sev JM101, JM103, ali sorodnih, ki sta jih opisala Vierra in Messing v Gene, Vol. 19, str. 259-268 (1982). Presnavljanje z restrikcijskimi endonukleazami in reakcije z ligazami so izvršene po standardnih protokolih, na pr. po Maniatis in sod. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Alkalijska metoda (Maniatis s sod.,citirano zgoraj ) se uporablja za pripravo plazmidov na majnši skali. Večje preparacije zahtevajo modifikacijo alkalijske metode pri kateri se uporablja enak volumen izopropanola za obarjanje nukleinskih kislin iz zbistrenega lizata. Obarjanje z mrzlim 2,5 M amonijevim acetatom se uporablja za odstranitev RNA pred ravnotežnim gostotnim centrifugiranjem s cezijevim kloridom in detekcijo z etidijevim bromidom.

Whatmanovi 540 filtrirni krogci se uporabljajo za filtrirne hibridizacije, da se odstrani kolonije, ki so potem lizirane in fiksirane z obdelovanjem (vsako za 2 minuti) z 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl in potem z IM Tris.HCl pH8,0, 1,5 M NaCl, in nato s segrevanjem pri 80°C (30 min). Hibridizacije se vršijo v 6xSSPE, 20% formamidu, 0,1% natrijevem dodecil sulfatu (SDS), 100 mg/ml E.Coli tRNA, 00 mg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) pri 42oC po 6 ur z uporabo 32Poznačenih (s kinazo) sintetičnih DNA-jev, (20xSSPE je pripravljen z raztopljenjem 174 g NaCL, 27,6 g NaH2PO4.9H2O, in 7,4 g EDTA v 800 ml H2O; pH naravnan na 7,4 z NaOH, volumen prirejen na 1 1, in vzorec steriliziran v avtoklavu ). Filtri se dvakrat sperejo (15 min, sobna temperatura ) z lxSSPE, 0,1% SDS. Po autoradiografiji (Fuji RX film), se pozitivne kolonije namesti z razvrstitvijo ponovno zraslih kolonij z modro obarvanimi kolonijami na filtrih. DNA so sekvencionirane po dideoksi metodi, ki jo je razvil Sanger s sod. Proc.Natl. Acad.

Sci., Vol 74, str. 5463 (1977). Templati za dideoksi reakcije so ali enoverižne DNA ali ustrezni deli (regije ) reklonirani v M13mp vektorje (na pr. Messing in sod. Nucleic Acid Res., Vol. 9, str. 309 (1981)), ali dvojnoverižna DNA pripravljene po mini verižni metodi in denaturirane z 0,2M NaOH (5 min, sobna temperatura) in obarjane iz 0,2M NaoH, 1,43M amonijevega aceta z dodatkom dveh volumnov etanola. DNA je sintetizirana s fosforamiditno kemijo z uporabo Applied Biosystems, 380A sintezerjev. ; sinteza, odstranitev zaščitnih skupin, ceplenje in čiščenje (7M sečnina PAGE, spiranje, DEAE-celulozna kromatografija ) je izvršena kot opisano v priročniku sintezerja 380A.

Komplementarna veriga sintetične DNA, ki bo klonirana (400 ng vsakega) se zmeša in fosforilira s polinukleotidno kinazo v 50 ml reakcijskem volumnu. Ta DNA se ligira v 50 ml volumnu pri sobni temperaturi 24 do 12 ur z 1 mg vektorja DNA presnovljenega s primernim restrikcijskim encimom. Pogoji potrebni za fosforiliranje, presnovo z restrikcijskimi encimi, polimerazne reakcije in ligiranje so opisani (Maniatis s sod., citirano zgoraj). Kolonije so računane na lacZ+ (kadar se želi) z nasajenjem na L agar z dodanim ampicilinom, l-tio-beta-D-galaktozidom (IPTG) (0,4 mM) in 5-bromo-4-kloro-3indolil-beta-D-galaktopiranozidom (x-gal) (40 mg/ml).

TAC-RBS vektor je skonstruiran z napolnjenjem z DNA polimerazo posamezno Bam HI mestom plazmida tacPpDR540 (Pharmacia). Ta je nato ligiran v nefosforilirane sintetične oligonukleotide. (Pharmacia), ki tvorijo dvojnoverižne fragmente, ki kodirajo konsenzualno ribosomsko vezivno mesto GTAAGGAGGTTTAAC, označeno RBS. Po ligaciji, se zmes fosforilira in ponovno ligira s Sst I linkerjem ATGAGCTCAT. Ta kompleks se potem cepi s Sst I in Eco RI, izolira 173 bazni par (bp) fragment s poliaakrilamidno gel elektroforezo (PAGE) in klonira v Eco Rl-Sst I-restrikcijski pUC19 (Pharmacia), kakor opisano spodaj. Sekvenca RBS-ATG-polilinkerjevih predelov končne konstrukcije (imenovane TAC-RBS) je prikazana na sliki

3.

Sintetični IL-10 je vgrajen v pUC19 plazmid v osmih stopnjah. V vsaki stopnji se detektira vključke po kloniranju z vzdrževanjem lacZ(a) gena pUC19 v okviru ATG začetnega kodona, vključenega v 1.stopnji. Klone, ki vsebujejo izbrisane in /ali vključene spremembe se lahko odfiltrira s tem, da se jih šteje na modre kolonije na L-ampicilinskih ploščah, ki vsebujejo x-gal in IPTG. Alternativno, se pri vsaki stopnji, sekvence vključkov hitro določi z uporabo univerzalnih sekvenčnih primerjev pri preparacijah plazmidnih-DNA na manjši skali, na pr. nabavljenih pri Boehrigeiju iz Mannheima.

V prvi stopnji se TAC-RBS vektor presnovi s Sst I, obdela s T4 DNA polimerazo (katere 3’-eksonukleazna aktivnost presnovi 3-’-štrleča vlakna Sst I odrezkov da tvori fragmente s topim koncem ), in po deaktivaciji T4 DNA polimeraze, obdela Eco RI, da se tvori fragment 173 bp, ki vsbuje TAC-RBS predel in ima top konec na ATG začetnem kodonu in Eco RI odsek na nasprotnem koncu. Na koncu se izolira še fragment 173 bp TAC-RBS.

V drugem koraku se izolirani fragment TAC-RBS iz prvega koraka zmeša s Eco RI/Kpn I- presnovljenim plazmidom pUC19 in sintetičnim fragmentom 1A/B, ki kakor vidimo spodaj,ima top zključek na gornjem terminalu in nesovpadajočem koncu, in ki sovpada z Κρη I odsekom pri spodnjem kraju. Ta konec Κρη I je soseden in na spodnjem toku Bst Eli mesta. Framente se nato ligira, da tvorijo pUC19 iz 2.koraka.

V tretjem koraku se zmeša sintetičen fragment 2A/B in 3A/B z Bst E II/S ma-I- presnovljenim pUC19 iz 2.koraka (po amplifikaciji in čiščenju) in ligara, da formira pUC19 iz 3.

koraka. Zabeleži, da spodnjetočni zaključek fragmenta 3A/B vsebuje posebne baze, ki tvorijo Sma I topi zaključek. Te ekstra baze so cepljene v četrtem koraku. Tudi fragmenti 2A/B in 3A/B imajo komplementarne 9-delne preostanke enoverižnih zaključkov, ki se upognejo po dodatku, in pustijo gomjetočni BstEII odrezek 2A/B-a in spodnjetočni topi-zaključek 3A/B-a, da se ligirajo na pUC19.

V četrtem koraku, se pUC19 iz koraka 3 presnovi z AflII/XbaI, ojača, očisti, ponovno očisti, zmeša s sintetičnim fragmentom 4A/B (glej spodaj ), in ligira v pUC19 iz koraka 4.

V koraku 5, se pUC19 iz koraka 4 presnovi z Xbal/Sa/I, ojači in očisti in zmeša s sintetičnim fragmentom 5A/B (glej spodaj) in ligira da tvori pUC19 iz koraka 5. Upoštevaj, da je Sa/I-skrhani konec fragmenta 5A./B, eliminiran s presnovo Hpa I v koraku 6.

V koraku 6 je pUC19 iz koraka 5 presnovljen s Hpa I/Pst I, ojačen in očiščen in zmešan s sintetičnim fragmentom 6A/B (glej spodaj ) in ligiran da tvori pUC19 iz koraka 6.

V sedmem koraku je pUC19 iz koraka 6 presnovljen z Cia I/Sph I, ojačen in očiščen in zmešan s sintetičnim fragmentom 7A/B (glej spodaj) in ligiran v pUC19 iz koraka 7.

V osmem koraku se pUC19 iz koraka 7 presnovi z

Mlu I/HindIII, ojači, očisti in zmeša s sintetičnim fragmenti 8A/B in 9A/B in ligira v končno zgradbo, ki je nato vključena v E.Coli K-12 rod JM101, na pr. dostopen iz ATCC pod dostopno številko 33876, s standardnimi tehnikami. Po kultiviranju, se proteine ekstrahira iz JM101 celic in razredčene količine ekstrakta testira na biološko aktivnost.

Fragment 1A/B

Fragment 2A/B

Fragment 3A/B

Fragment 4A/B

Fragment 5A/B

Fragment 6A/B

Fragment 7A/B

Fragment 8A/B

Fragment 9A/B (Spodnje črke v teh primerih označujejo, da se baze razlikujejo od naravnih sekvenc na istem mestu).

Primer 2. Ekspresija vIL-10 v COS 7 opičjih celicah

Gen, ki kodira kodirajoči okvir za vIL-10 je bil ojačen s polimerazno verižno reakcijo z uporabo primerjev, ki dovoljujejo kasnejšo vgradnjo ojačenega fragmenta v Eco RIpresnovljen pcD(SRa) vektor (Slika 1). Kodirano vlakno vgrajenega fragmenta se vidi spodaj (Kodirajoči okvir je podan v velikih črkah).

Kloni, ki nosijo vključek v pravilni orientaciji so identificirani z ekspresijo vIL-10 in/ali z elektroforetskim vzorcem restrikcijskih presnov. Eden od vektorjev, ki nosi vIL-10 gen, je označen pBCRFl (SRa) in deponiran z ATCC pod dostopno številko 68193. pBCRFl(SRa) je bil ojačen v E. Coli MC1061, izoliran s standardnimi tehnikami in uporabljen za transinficiranje opičjih celic COS 7 kot sledi: dan pred transinfekcijo, so zasejali približno 1,5 x 10^ COS 7 opičjih celic na posamezne 100 mm Petrijeve plošče v Dulbeccov modificirani Eagle medij (DME), ki vsebuje 5% fetalni telečji serum (FCS) in 2 mM glutamin. Da se transfekcijo lahko izvrši, se COS 7 celice odstrani s krožnikov z inkubacijo s tripsinom, dvakrat spere v serumu brez DME-a in suspendira v 10^ celic/ml v serumu brez DME-a. Alikvotni del (0,75 ml) se zmeša z 20 pg DNA in prenese v sterilno 0,4 cm elektroporacijsko kiveto. Po 10 minutah, se celice pulzno obdela pri 200 voltih, 960 pF na BioRad genski pulzni napravi. Po nadalnjih 10 minutah se celice odstrani iz kivete in se jih doda k 20 ml DME, ki vsebuje 5% FCS, 2mM glutamina, penicilina, streptomicina in gentamicina. Zmes se porazdeli na štiri 100 mm petrijevke pripravljene za celične kulture. Po 12-24 urah pri 37°C, 5% CO2, se medij zamenja s podobnim medijem, ki vsebuje samo 1% FCS in se inkubacija nadaljuje za dodatnih ur pri 37°C, 55 C02_? nakar se medij zbere in ga preskusi na njegovo zmožnost inhibiranja IFN-γ sinteze.

ml alikvote sveže izoliranih PBLs (okoli 2x10^ celic/ml) so inkubirali pri 37°C z PHA (100 ng/ml) v mediju, ki sestoji iz (i) 90% DME z dodanim 5% FCS in 2 mM glutaminom, in (ii) 10% supernatanta iz COS 7 celic predhodno transfektirane s pBCRFl (SRa). Po 24 urah se celice in supernatant pobere, da se ugotovi prisotnost, ali IFN-γ mRNA ali IFN-γ proteina. Kontrole so obdelane identično, razen, da se 10% supernatant iz COS 7 kultur predhodno transfektira s plazmidom, ki nosi neodvisen cDNA vključek. Obdelani vzorci vIL-10 kažejo približno 50% inhibicijo sinteze IFN-γ v primerjavi s kontrolo.

Primer 3. Ekspresija vIL-10 v Escherichia coli

Gen, ki kodira naslednji zreli vIL-10 je lahko ekspresiran v E.Coli.

cDNA vključek pBCRFl(SRa) je ponovno kloniran v M13 plazmid, kjer je dvakrat spremenjen s položajno dirigirano mutagenezo: prvič, da tvori Cia I lego na 5’-koncu kodiranega predela za dozoreli vIL-10 polipeptid in drugič, da tvori Bam HI lego na 3’-koncu kodiranega predela za dozoreli vIL-10 polipeptid. Mutirana sekvenca je nato enostavno vkljužena v

TRPC11 ekspresijski vektor opisan spodaj.

TRPC11 vektor je bil zgrajen z ligiranjem (zvezanjem) sintetično skladnih RBS fragmentov na Cia I linkerje (ATGCAT) in s kloniranjem dobljenih fragmentov v Cia Irestriktivni pMTllhc (predhodno modificiran tako da vsebuje Cia I lego ). pMTllhc je majhna (2,3 kilobazna), visoka kopija AMpR, TET$ derivata pBR322, ki nosi kVX plazmid Eco RIHzn dlll predela polilinkerja. ( 7tVX je opisal Maniatis s sod. v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.) Ta je bil modificiran tako, da vsebuje tudi Cia I lego z restriktiranjem pMTllhc z Eco RI in Ram HI, z izpolnjenjem lepljivih koncev, ki nastanejo in z ligiranjem z Cia I linkerjem (CATCGATG), zaradi tega povrnjenjem Eco RI in Ram HI leg in zamenjanjem Srna I lege z Cia I lego. Eden od transformantov TRPC11 zgradbe ima tandemsko RBS sekvenco izbočeno z Cia legami. Ena od Cia leg in del druge kopije RBS sekvence sta bili odstranjeni s presnovo plazmida s Pst I, obdelanega z Bal 31 nukleazo, restriktirano z Eco RI in obdelano z T4 DNA polimerazo v prisotnosti vseh štirih deoksinukleotidnih trifosfatov. Dobljeni 30-40 bp fragmenti so bili pridobljeni nazaj preko PAGE in klonirani v Srna I-restriktne pUC12. 248 bp E. Coli RI fragment dobljen iz pKCIOl ( razložen v Methods in Enzymology, Vol.101. str. 155, Nichols in sod. (Academic press, Ν.Υ. 1983) je bil nato kloniran v Eco RI lego z namenom, da zaključi konstrukcijo TRPC11, kar je ponazorjeno na sliki 2. TRPC11 se uporablja kot vektor za vIL10 tako, da se ga najprej presnovi z Cia I in Bam HI, ga očisti in zameša v standardno ligacijsko raztopino s Cia 1-Bam Hil fragmentom M13, ki vsebuje nukleotidne sekvence kodirane za dozoreli BCRF1. Vključek, ki vsebuje TRPC11, označen kot TRPC11-BCRF1, se lahko razmnoži v E. Coli K12 rodu JM101, na pr. dostopnem v ATCC pod dostopno številko 33876.

Primer 4. Razlikovalni učinki IL-4 in IL-10 na z IL-2 inducirano interferon-^ sintezo in citotoksičnost v humanih NK celicah

Ta primer pokaže, da IL-4, hIL-10, in vIL-10 inhibirajo sintezo interferona-γ (INFy) in tumor nekrosis faktor-a (TNFa) z IL-2 stimuliranimi mononukleiskimi celicami periferne krvi (PBMCs), toda, da samo IL-4 inhibira INFy sintezo z očiščenemi NK celicami. Dodatek monocitov, vendar ne T celic, kot dodatnih celic, povrne inhibicijski učinek hIL-10 na INFysintezo z NK celicami. Drugače kot IL-4, hIL-10 in vIL-10 ne inhibirata indukcijo limfokinsko-aktivirane ubijalske (killer) (LAK) aktivnosti v PBMCs z IL-2. Zato delujeta IL-4 in IL-10 na NK celice po različnih mehanizmih.

Rekombinantni hIL-10, vIL-10, in hIL-4 so bili testirani na njihov upliv na sintezo INFy in TNFa in na LAK aktivnost inducirano z IL-2 in PBMCs. Celice so bile gojene v 200 enot/ml rIL-2 z ali IL-4 (200 enot/ml) ali COS 7 supernatanti, ki vsebujejo hIL-10, vIL-10 ali nikakršnih citokinov (modelno ) 5 dni, nakar se meri sinteza citokinov. LAK aktivnost je bila tudi ocenjena proti Burkittovi limfomski celični vrsti Daudi, ki je učinkovito pobita z LAK celicami, toda ne s svežimi NK celicami. Sinteza INFy in TNFa, inducirana z IL-2 v kulturah, ki vsebujejo hIL-10, vIL-10 ali IL-4, je bila znatno inhibirana (Slika 3). Nasprotno, je bila z 11-2 inducirana LAK aktivnost proti Daudi celicam, inhibirana samo v kulturah z 11-4, in je ostala nespremenjena, ali celo rahlo zvišana v hIL-10 in vIL-10 kulturah (Slika 4a). LAK aktivnost inducirana z IL-2 je lahko primarno umirjena z CD56⁺ (Leu 19⁺) NK celicami; glej Philips in sod. J. Exp. Med., Vol. 164, str. 814-825 (1986), in Ortaldo in sod. v J. Exp. Med., Vol. 164, str. 1193-1205 (1986). Za določitev fenotipa LAK celic induciranih v PBMCs, gojenih z IL-2 in hIL-10 ali vIL-10, so bile razvrščene populacije CD56⁺ in CD56‘ s FACS in testirane na citotoksičnost proti Daudi celicam. Slika 4b kaže, da je kot s samim IL-2, pomembna LAK aktivnost opažena samo pri CD56⁺ populacijah, Zato ker 11-4 in IL-10 obe inhibirata IL-2 inducirano sintezo IFNy in TNFa, samo IL-4 inhibira z 11-2 inducirano citotoksičnost v PBMCs.

Večina z IL-2 induciranih IFNy sintez v PBMCs izhaja iz NK celic in ne iz T celic, na pr. v Trinchieri in sod., J. Exp. Med., Vol. 160, str.1147-1169 (1984). Zato so testirali učinek hIL-10, vIL-10 in IL-4 na IL-2 inducirano sintezo IFNy s FACS-očiščenemi NK celicami (čistoča > 99,5%). IL-4 inhibira IL-2 -inducirano izličanje IFNy s temi celicami; nasprotno, pa niti hIL-10 niti vIL-10 ne zadušijo sinteze IFNy z očiščenimi svežimi NK celicami (Slika 5a).

To, da je sinteza IFNy bila inhibirana z IL-10 v PBMC kulturah in ne v čistih NK celicah, je dalo slutiti, da je ta učinek IL-10 povzročen z dodatno celično populacijo. NK celice so bile očiščene z razvrstitvijo CD56⁺ celic iz nizko gostotne celične frakcije, ki je bila dobljena s Percolljevim gradientnim centrifugiranjem, in so bile zmešane s pritrjenimi celicami ali z visoko gostotnimi celičnimi populacijami (98% T celic). Dodatek pritrjenih celic k NK celicam močno pospeši z IL-2 inducirano produkcijo IFNy z NK celicami. Stimulatorni učinek pritrjenih celic se zaustavi z IL_10 (Slika 5b). Frakcija, ki vsebuje T celice ni imela učinka na produkcijo IFNy inducirano z IL-2, z NK celicami in ni vplivala na inhibicijo produkcije INF γ z IUL-10. (Slika 5b). Čeprav so večina pritrjenih celic monociti, je bilo potrjeno, da monociti obakrat pospečujejo produkcijo IFNy, inducirano z IL-2 in tudi posredujejo( mirijo ) njeno inhibicijo z IL-10 : NK celice in CD14+ monociti so bili čiščeni z razvrščanjem in gojeni v prisotnosti IL-2 in IL-10. Na sliki 3c se vidi, da dodatek očiščenih monocitov k NK celicam pospeši produkcijo INFy induciranega z IL-2. Razen tega, je produkcija INFy, induciranega z IL-2,inhibirana z z IL-10 samo v prisotnosti monocitov.

Ti rezultati kažejo, da IL-4 in IL-10 (humani ali virusni) zadušita sintezo IFNy in TFNa z PBMCs stimuliranimi s IL-2, tada samo IL-4 inhibira z IL-2 inducirano LAK aktivnost. Ta opazovanja naznačijo, da sta citokinska produkcija, ki je inducirana z IL-2 in citotoksičnost povzročena z NK celicami, regulirani po različnih poteh. Nadalje je inhibitomi učinek IL-10 na sintezo IFNy z NK celicami spoznan kot indirekten in posredovan z monociti, medtem ko IL-4 deluje na NK celice v odsotnosti dodatnih celic.

IL-4, hIL-10 in vIL-10 inhibirajo sintezo INFy z od IL-2 aktiviranih PBMCs (Slika 3). Humani PBMCs so izolirani iz kožnih ovojnic zdravih donorjev s pomočjo centrifugiranja nad Ficoll-Hypaqueom in gojeni pri lO^/ml v rIL-2 (200 enot/ml), z ali rIL-4 (200 enot/ml), 10% COS-hIL-10, 10% COS-vIL-10 ali 10% COS(lažni) v Ysselovem mediju z 1% humanim AB+serumom (glej Yssel s sod.Jmmunol. Meth., Vol. 72, str. 219-227 (1984). Kulture so bile vzgojene v 24 -izvornih ploščicah in supernatanti pobrani za merjenje INFy z ELISA testom, na pr. kakor je razložil Hsu s sod. v Science, Vol. 25o, str. 830-832 (1990). TNFa je bil prav tako izmerjen z ELISA testom (Endogen, Boston, MA).

Produkcija Citokina v odsotnosti IL-2 je bila pod mejo občutljivosti za INFy in TNFa ELISA testov, ki so bili 0,3 ng/ml in 10 pg/ml. Območje napak pri dupliciranih vzorcih je prikazano v shemi. PBMCs iz različnih donorjev varirajo v moči produkcije IFNy in TFNa, kadar so stimulirani z IL-2; razen tega, so bili ti poskusi večkrat ponovljeni (> kot 12 x-za IFNy) in trikrat za TNFa s kvalitativno sličnimi rezultati.

IL-4, toda ne hIL-10 ah vIL-10, inhibira citotoksičnost inducirano zIL-2 v PBMCjs (Slika 4a). PBMCs pridobljeni iz sorodnega poskusa kot je opisaga na Sliki 1 so bili požeti skupaj s supernatanti in testirani na citotoksičnost proti z 51Cr -označenim Daudi celicam.

LAK aktivnost je ekspresirana z CD56+ celicami v PBMCs gojenih z IL-2 in IL-10 (Slika 4b). PBMCsso bili obarvani z anti-CD56 protitelesi konjugiranimi na FITC, in razvrščeni na FacStar Plus (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Citotoksična aktivnost v CD56⁺ in CD56_( čisstota 99,7%) frakcijah je bila testirana kot je opisal Spits s sod., v J. Immunol., Vol. 14L str. 29-36 (1988).

IL-2 inducirana sinteza INFy z očiščenemi NK celicami je direktno inhibirana z IL-4, vendar ne z hIL-10 ali z vIL-10 (Slika 5a). S FACS-očišččene NK celice ( čistota 99,5%) so bile gojene pri 10^ celic/ml z 200 enotami/ml rIL-2 ali s 500 enotami/ml rIL-4, ah COS-hIL-10, COS-vIL-10, ah COS-lažnimi matičnimi raztopinami(supernatanti) (10%) v Ysseljevem mediju za 4-5 dni, in nato zbrali supernatante iz paralelnih kultur in jih zmešali za merjenje IFNy z ELISA testom. Dodatek pritrjenih celic, vendar nikakor ne T celic, povrne z 11-10 posredovano moč inhibicije sinteze INFy inducirane z IL-2, z očiščenemi NK celicami (Slika 5b). Dodatek očiščenih monocitov povrne z IL-10 posredovano inhibicijo IFNy inducirane sinteze z IL-2 z očiščenimi NK celicami. Sami monociti ne producirajo IFNy (Slika 5c). PBMCjs so bili sprani in inkubirani v posodice za celične kulture za 40 minut pri 37°C. Pritrjene celice so bile zbrane z postrganjem z gumijastim strgalnikom. Nepritrjene celice so bile odstranjene, peletirane in nanešene na kolono iz najlonske volne in inkubirane 40 minut pri 37°C. Po izpranju s kolone, so bile celice ponovno peletirane in resuspendirane v 30% Percoll z 10% FCS/PBS in porazdeljene v plasti na 40% Percoll. Po 30 minutnem centrifugiranju pri sobni temperaturi, so bili povrnjeni veliki granulatni limfociti na vmesni površini in dvakrat sprani. Te celice so bile inkubirane z anti-CD56 protitelesom (Becton-Dickinson, San Jose, CA) za obdobje 30 minut pri 4°C, sprane in potem obarvane s kozjim-anti-mišjimFITC (Jackson Immunoresearch, Avondale, PA) pred sortiranjem FACS. CD56⁺ celice vsebujejo okoli 35-50% celic, ki so izpostavljene sortiranju. Sortirane celice so več kot 99,5% CD56⁺ po ponovni analizi. 9 x 10$ očiščenih NK celic je bilo zmešano z 3 x 10^ pritrjenih ali T celic v končnem 100 ml volumnu in kultivirano z IL-10 + hIL-10, vIL-ΙΌ, ali z lažno matično rqaztopino opisano zgoraj . Supernatante so pobrali in testirali na produkcijo IFNy. Označbe napak kažejo območje paralelk. NK celice in monocite istega donorja so dobili kot sledi : PBMCjs so inkubirali z ovčjimi rdečimi krvničkami preko noči; celice z vrtnici podobnimi oblikami (CD2+) in octale so separirali s centrifugiranjem nad Ficoll-hypquevim gradientom. E+ celice so podvrgli enakim postopkom čiščenja kot opisanimi pri PBMCs (glej zgoraj), da bi dobili očiščene NK celice. E- celice so inkubirali dodatno z anti-CD14 mAB(LeuM3) in FITCoznačenimi kozjimi anti-mišjimi IgG protitelesi in sortirali CD14+celice s FACStar plus. Čistota omenjenih celic je bila večja od 98%. 10^ očiščenih NK celic so zmešali z 10^ čistih monocitov v 100 ml in jih kultivirali same ali z IL-2+hIL-10, vIL-10, ali lažnim supernatantom kot je bilo opisano zgoraj. Supernatante so poželi in testirali na produkcijo IFNy. Produkcija IFNy v odsotnosti IL-2 je bila pod detekcijsko limito. Označbe napak kažejo območja paralelnih vzorcev. NK celice različnih donorjev varirajo v moči produkcije IFNy.

Opisi predstoječih uresničenj izuma so bili predstavljeni v smislu predstavitve in opisa. Njihov namen ni izključujoč, ali da bi omejeval na natančne predstavljene oblike. Seveda so možne mnoge modifikacije in variacije v razumevanju smisla dosedanjih predstavitev. Uresničene zamisli so bile izbrane in opisane za boljše razumevanje principov predočenih v izumu in s tem omogoči ostalim usposobljenim kadrom, da najbolje uporabijo izum v različnih izročilih in z različnimi modifikacijami kot služi nameravani uporabi. Hočemo tudi, da je cilj izuma definiran s patentnimi zahtevki.

Decembra (20-tega) 1989, so aplikanti deponirali posamezne kulture E.Coli MC1061, ki so nosile pH5C, pH15C in pBCRFl (SRa) v American TYpe Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), pod dostopnimi številkami 68192, 68193 in 68191. Ti depoziti so bili narejeni v skladu s pogoji predvidenimi v sporazumu ATCC za depozite kultur podrejene patentnim namenom, ki zagotavlja, da bo depozit dostopen US Commissioner-ju of Patents and Trademarks glede na 35 USC 122 in 37 CFR 1,14 in bo dostopen javnosti po izidu U.S. patenta, kar zahteva vzdrževanje depozita. Dostopnost deponiranega seva ne sme biti tolmačena kot licenca za prakticiranje tega izuma v nasprotju s podeljenimi pravicami pod nadzorstvom vsake vlade in v soglasju z njenimi patentnimi zakoni.

Depoziti so bili modificirani tako, da zadostijo zahtevkom Budimpeštanskega dogovora.

Claims (10)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Farmacevtski sestavki, označeni s tem, da vsebujejo v tumor-infiltrirane limfocite (TILS) ali limfokinsko aktivirane ubijalske (LAK) celice gojene v kulturi, ki omogoča proliferacijo v prisotnosti interleukina-2 in interleukina-10.
2. 2. Farmacevtski sestavki iz zahtevka 1, označeni s tem, da so omenjene TIL ali LAK celice bile izolirane iz tumorja odstranjenega od pacienta, ki ima raka.
3. 3. Farmacevtski sestavki iz zahtevka 2, označeni s tem, da so prilagojeni za intravenozno infuzijo in vsebujejo TIL ali LAK celice gojene v kulturi, ki omogoča proliferacijo v prisotnosti interleukina-2 in interleukina-10;

   označeni s tem, da so prilagojeni dajanju pacientu v količini približno 1 χ IO¹⁰ do približno 2 χ IO¹⁰ TIL ali LAK celic.
4. 4. Farmacevtski sestavki, označeni s tem, da vsebujejo učinkovito količino interleukina-2 in/ali učinkovito količino interleukina-10 za zdravljenje raka z dajanjem pacientu, po predhodnem dajanju omenjenemu pacientu TIL in/ali LAK celic, ki so bile gojene v kulturi v prisotnosti interleukina-2 in interleukina-10, tako da so lahko proliferirale.
5. 5. Farmacevtski sestavki iz zahtevka 4, za zdravljenje raka z dajanjem pacientu po predhodnem dajanju omenjenemu pacientu TIL ali LAK celic, označeni s tem, da so omenjene TIL ali LAK celice bile izolirane iz tumorja odstranjenega od omenjenega pacienta.
6. 6. Farmacevtski sestavki iz zahtevka 4, za uporabo pri zdravljenju raka z dajanjem pacientu po predhodnem dajanju omenjenemu pacientu TIL ali LAK celic, označeni s tem, da so omenjene TIL ali LAK celice bile izolirane iz tumorja odstranjenega od omenjenega pacienta in se omenjenemu pacientu daje približno 1 x 10^{9 10} do približno 2 χ IO¹⁰ TIL ali LAK celic z intravenozno infuzijo.
7. 7. Uporaba interleukina-2 in interleukina-10 za pripravo zdravila uporabnega pri zdravljenju raka pri pacientu, vključno s koraki:

   dodajanjem učinkovite količine interleukina-10 pacientu po dodatku gojenih tumor-infiltriranih limfocitov (TILs) in/ali limfokinaktiviranih celic ubijalk (LAK celic);

   kjer so omenjene TILs in/ali LAK celice gojene v prisotnosti interleukina-2 in prisotnosti interleukina-10 tako, da se TILs in/ali LAK celice množijo.
8. 8. Uporaba interleukina-2 in interleukina-10 za gojenje tumorinfiltriranih limfocitov (TILs) in/ali limfokin-aktiviranih celic ubijalk (LAK celic).
9. 9. Metoda gojenja tumor-infiltriranih limfocitov (TILs) in/ali limfokin-aktiviranih celic ubijalk (LAK celic) za uporabo pri zdravljenju raka, označena s tem, da vsebuje naslednji korak:

   gojenje TILs in/ali LAK celic v prisotnosti interleukina-2 in interleukina-10 tako, da se TILs in/ali LAK celice množijo.

   Z

   JO. Metoda iz zahtevka 7, označena s tem, da vključuje sledeče korake:

   dodajanje kultiviranih TILs in/ali LAK celic pacientu, ki boleha od raka.

   ZL Metoda iz zahtevka 7, označena s tem, da vsebuje sledeče korake:

   dodajanje učinkovite količine interleukina-2 in učinkovite količine interleukina-10 pacientu po dodatku gojenih TILs in LAK celic.
10. 12. Metoda priprave farmacevtske zmesi, označena s tem, da vsebuje interleukin-2 in interleukin-10, kjer pomeni da se omenjena zmes uporablja za zdravljenje raka pri pacientu, ki je bil zdravljen s tumor-infiltriranimi limfociti (TILs) in/ali limfokinaktiviranimi celicami ubijalkami (LAK celice), ki so bile gojene v prisotnosti interleukina-2 in interleukina-10; kar obsega primešanje interleukina-2 in interleukina-10 farmacevtskemu nosilcu ali ukscipientu.