CN112166183A - 用于生长nk92细胞的基础培养基 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于培养
Figure DDA0002784965680000011
细胞的方法和定制的培养基组合物。

Description

用于生长NK92细胞的基础培养基
背景技术
天然杀伤细胞(NK)是细胞毒性淋巴细胞，其构成先天免疫系统的主要组成部分。通常代表约10-15％的循环淋巴细胞的NK细胞结合并杀死包括被病毒感染的细胞和许多恶性细胞在内的靶细胞，对抗原而言非特异性地且无需预先免疫致敏。Herberman等，Science214:24(1981)。通过诱导细胞裂解来杀死靶细胞。用于该目的NK细胞从受试者的血液的外周血淋巴细胞(“PBL”)级分中分离出，在细胞培养中扩增以获得足够数量的细胞，然后将其重新注入受试者中。NK细胞在体外疗法和体内疗法中都显示出了一定的疗效。然而，由于并非所有的NK细胞都具有细胞溶解作用，并且这样的疗法对所治疗的患者具有特异性，因此这样的疗法变得复杂。
Figure BDA0002784965660000015
细胞先前已被评价为治疗某些癌症的治疗剂。但是，
Figure BDA0002784965660000014
细胞在治疗应用中的用途要求批次之间的数量和质量必须一致，因此许多使用动物组分(例如血清)的培养基都不适合该目的。尽管可以使用化学成分明确的某些培养基，但这些培养基是专门为支持其他类型的细胞(如淋巴因子激活的杀伤细胞)的生长而设计的。这种类型的培养基可能包含增加生产成本的不必要的组分。这种类型的培养基也可能会留下影响
Figure BDA0002784965660000011
细胞功效和纯度的过程残留物。因此，对于通常设计用于生长
Figure BDA0002784965660000012
细胞的经济的生长培养基的需求仍然存在。
发明内容
本文提供了用于培养
Figure BDA0002784965660000013
细胞的方法和培养基组合物。所述培养基组合物包含补充有一种或多种选自以下的补充剂的基础培养基：乙醇胺(或其衍生物)、胰岛素、转铁蛋白和人白蛋白(HA)。任选地，所述基础培养基补充有亚硒酸钠和葡萄糖。所述基础培养基本身包含无机盐、维生素和氨基酸。任选地，所述基础培养基本身包含亚硒酸钠和葡萄糖。
本文提供了一种培养
Figure BDA0002784965660000021
细胞的方法，其包括在定制的
Figure BDA0002784965660000022
培养基中培养
Figure BDA0002784965660000023
细胞，所述定制的
Figure BDA0002784965660000024
培养基包含基础培养基和一种或多种补充剂，和所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、HA或其组合。所述基础培养基包含无机盐、维生素和氨基酸。
本文还提供了一种培养
Figure BDA0002784965660000025
细胞的方法，其包括在定制的
Figure BDA0002784965660000026
培养基中培养
Figure BDA0002784965660000027
细胞，所述定制的
Figure BDA0002784965660000028
培养基包含基础培养基和一种或多种补充剂，和所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物或其组合。所述基础培养基包含无机盐、维生素和氨基酸。
任选地，乙醇胺衍生物为乙醇酰胺。乙醇酰胺可为异油酸乙醇酰胺或油酸乙醇酰胺，软脂酸乙醇酰胺或硬脂酸乙醇酰胺。任选地，乙醇胺衍生物为磷脂酰乙醇胺。
任选地，一种或多种补充剂包含1-7％的人AB血清。任选地，一种或多种补充剂进一步包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。
任选地，一种或多种补充剂进一步包含300-600IU/mL白细胞介素-2。任选地，一种或多种补充剂进一步包含0.01％至0.1％的泊洛沙姆188。
任选地，在所述定制的
Figure BDA0002784965660000029
培养基中培养的
Figure BDA00027849656600000210
细胞相比于在参照生长培养基中生长的
Figure BDA00027849656600000211
细胞具有基本相同或更高的细胞毒性、生长速率和存活率。
任选地，在所述定制的
Figure BDA00027849656600000212
培养基中培养的
Figure BDA00027849656600000213
细胞具有85-100％的存活率。
任选地，在所述定制的
Figure BDA00027849656600000214
培养基中培养的
Figure BDA00027849656600000215
细胞在效应子与靶标比率为10：1时显示60-100％的直接细胞毒性和/或ADCC。
任选地，在所述定制的
Figure BDA00027849656600000216
培养基中培养的
Figure BDA00027849656600000217
细胞具有30-50小时的倍增时间。
任选地，所述
Figure BDA0002784965660000031
细胞表达细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
任选地，所述定制的
Figure BDA0002784965660000032
培养基包含0.05-40mg/L的乙醇胺、乙醇胺衍生物或其组合。
任选地，所述定制的
Figure BDA0002784965660000033
培养基为4.5-20g/L的葡萄糖。任选地，在所述基础培养基中进一步补充0.05％至1.0％的HA。
任选地，所述定制的
Figure BDA0002784965660000034
培养基的体积至少为5升。
本文还提供了一种细胞培养物，其包含在定制的
Figure BDA0002784965660000035
培养基中的
Figure BDA0002784965660000036
细胞，所述定制的
Figure BDA0002784965660000037
培养基包含基础培养基和一种或多种补充剂，和所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、HA或其组合，其中所述基础培养基包含无机盐、维生素和氨基酸。
本文还提供了一种细胞培养物，其包含在定制的
Figure BDA0002784965660000038
培养基中的
Figure BDA0002784965660000039
细胞，所述定制的
Figure BDA00027849656600000310
培养基包含基础培养基和一种或多种补充剂，其中所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物或其组合，以及其中所述基础培养基包含无机盐、维生素和氨基酸。任选地，所述细胞培养基的体积至少为5升。
任选地，所述乙醇胺衍生物为乙醇酰胺，其中所述乙醇酰胺为顺式异油酸乙醇酰胺或油酸乙醇酰胺。
任选地，所述一种或多种补充剂进一步包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。任选地，所述一种或多种补充剂进一步包含0.01％至0.1％的泊洛沙姆188。任选地，所述定制的
Figure BDA00027849656600000311
培养基包含4.5-20g/L的葡萄糖。任选地，所述一种或多种补充剂包含0.05％至1.0％的HA。
任选地，所述
Figure BDA00027849656600000312
细胞表达细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
任选地，所述基础培养基包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。
任选地，所述
Figure BDA00027849656600000313
细胞相比于对照
Figure BDA00027849656600000314
细胞具有基本相同或更高的细胞毒性、生长速率和/或存活率。任选地，已在所述定制的
Figure BDA0002784965660000041
培养基中培养的
Figure BDA0002784965660000042
细胞具有85-100％的存活率。
任选地，已在所述定制的
Figure BDA0002784965660000043
培养基中培养的
Figure BDA0002784965660000044
细胞的倍增时间为30-50小时。任选地，当使用10：1的效应子：靶标比率时，所述
Figure BDA0002784965660000045
细胞显示60-100％的直接细胞毒性和/或ADCC。
任选地，所述
Figure BDA0002784965660000046
细胞在被冷冻保存并融化后维持基本相同的存活率和/或细胞毒性。
上文的概述和下文的详述是示例性和说明性的，并且旨在提供对本发明公开内容的进一步说明。本发明的其他的目的、优点和新颖特征对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
通过结合附图并参考以下公开内容将更容易地理解本发明的目的、特征和优点。
图1是显示在生长周期5时
Figure BDA0002784965660000047
细胞对K562靶细胞的直接细胞毒性的图。
具体实施方式
本文提供了用于培养
Figure BDA0002784965660000048
细胞的方法和培养基组合物。所述培养基组合物包含补充有一种或多种补充剂的基础培养基，所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠，ha、或其组合。所述基础培养基本身可包含无机盐、维生素和氨基酸。
在阅读了该描述之后，对于本领域技术人员而言，如何实现多种替代实施方式和替代应用将变得显而易见。然而，本文未描述所有实施方式。将被理解的是，在此呈现的实施方式仅是示例性的，而非限制性的。因此，对多种替代实施方式的详细描述不应被理解为对本文公开内容的范围或广度的限制。将被理解的是，以下描述的方面不限于特定的组合物，制备这样的组合物的方法或其用途，因为这些当然是可变的。
术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的意思相同的含义。
在本说明书和随后的权利要求书中，将引用许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：
本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而无意于进行任何限制。除非上下文另外明确指出，本文所使用的单数形式“一个/一种(a/an)”，“所述”也意图包括复数形式。因此，例如，对“天然杀伤细胞”的引用包括多个天然杀伤细胞。
所有数字标识，例如pH值、温度、时间、浓度、含量和分子量，包括范围，均为近似值，在适当情况下以0.1或1.0为增量进行(+)或(-)的变化。将被理解的是，尽管并没有总是被明确指出，但是所有数字标识之前都可以有术语“约”。
除非另有说明，否则百分比在表示浓度时是指w/v百分比。例如，1.0％HA是指1.0％w/v HA。
除非另有说明，否则本公开中的浓度是指所述定制的
Figure BDA0002784965660000051
培养基中的最终工作浓度。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围也涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地识别为充分描述，并且可以将相同范围分解为至少相等的一半，三分之一，四分之一，五分之一，十分之一等。作为非限制性示例，本文讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，例如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等，均包括所列举的数字，并且指代可随后被细分为上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，所述范围包括每个单独的成分。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，依此类推。
还将被理解的是，尽管并没有总是被明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。
“任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情况能或不能发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例以及所述事件或情况没有发生的实例。
术语“包含/包括”旨在表示所述组合物和方法包含所列举的要素，但不排除其他要素。当被用于定义组合物和方法时，“基本由……组成”应表示排除对该组合具有任何实质意义的其他要素。例如，基本由本文所定义的元素组成的组合物将不排除不会实质上影响权利要求的基本和新颖特征的其他元素。“由……组成”是指排除超过痕量的其他成分和实质性的方法步骤。由这些过渡(transition)术词中的每一个所定义的实施方式在本公开内容的范围内。
本文所用的“自然杀伤(NK)细胞”是免疫系统的细胞，其在没有特异性抗原刺激且不受任何主要组织相容性复合物(MHC)类别限制的情况下杀死靶细胞。靶细胞可为癌细胞或肿瘤细胞。NK细胞的特征在于CD56的存在和CD3表面标志物的缺失。
为了本发明的目的，除非另有说明，术语
Figure BDA0002784965660000061
或“NK92”旨在表示原始的
Figure BDA0002784965660000062
细胞系和
Figure BDA0002784965660000063
细胞系，
Figure BDA0002784965660000064
细胞的克隆和经过修饰的
Figure BDA0002784965660000065
细胞(例如，通过对外源基因的引入)。美国专利号7,618,817；8,034,332；8,313,943；9,181,322；9,150,636和公开的美国申请号10/008955描述了
Figure BDA0002784965660000066
细胞及其示例性和非限制性的修饰，其全部内容通过引用并入本文，包括野生型
Figure BDA0002784965660000067
Figure BDA0002784965660000068
(F176V)、
Figure BDA0002784965660000069
和
Figure BDA00027849656600000610
Figure BDA00027849656600000613
细胞是本领域普通技术人员已知的，可从NantKwest公司容易地获得此类细胞。
如本文所用，术语“aNKTM细胞”是指亲代
Figure BDA00027849656600000611
细胞。aNKTM细胞的生长依赖于IL-2。
如本文所用，术语“
Figure BDA00027849656600000612
细胞”是指经工程化以表达Fc受体的
Figure BDA0002784965660000071
细胞。
如本文所用，术语“
Figure BDA0002784965660000072
细胞”是指已经工程化以表达对癌特异性抗原、癌相关抗原或肿瘤特异性抗原具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)的
Figure BDA0002784965660000073
细胞。在一些实施方式中，肿瘤特异性抗原是HER-2，例如人HER-2，并且这些
Figure BDA0002784965660000074
细胞被称为HER-2
Figure BDA0002784965660000075
细胞。
如本文所用，术语“
Figure BDA0002784965660000076
细胞”是指经工程化以表达对癌特异性抗原、癌相关抗原或肿瘤特异性抗原具有亲和力的Fc受体和嵌合抗原受体(CAR)的
Figure BDA0002784965660000077
细胞。例如，肿瘤特异性抗原为CD19，以及这些
Figure BDA0002784965660000078
细胞被称为CD19
Figure BDA0002784965660000079
细胞。
术语“Fc受体”是指在某些细胞(例如自然杀伤细胞)的表面上发现的蛋白质，其通过结合至被称为Fc区的抗体的一部分而有助于免疫细胞的保护功能。抗体的Fc区与细胞的Fc受体(FcR)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)来刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。根据FcR识别的抗体类型对FcR进行分类。例如，Fc-γ受体(FcγR)与IgG类抗体结合。FcγRIII-A(也被称为CD16)是与IgG抗体结合并激活ADCC的低亲和力Fc受体。FcγRIII-A通常在NK细胞上被发现。
Figure BDA00027849656600000710
细胞不表达FcγRIII-A。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域。CAR可以在T细胞或NK细胞中表达，以增加细胞毒性。通常，细胞外抗原结合结构域是对在感兴趣的细胞上发现的抗原具有特异性的scFv。基于scFv结构域的特异性，将表达CAR的
Figure BDA00027849656600000711
细胞靶向至细胞表面表达某些抗原的细胞。scFv结构域可以被工程化以识别任何抗原，包括肿瘤特异性抗原。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可以包含被修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后修饰核苷酸结构。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可在聚合后被进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子两者。除非另有说明或要求，否则多核苷酸既包括双链形式和已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个两者。
术语“表达”是指基因产物的产生。术语“瞬时”当指向表达时，其意为未将多核苷酸引入所述细胞的基因组中。
术语“细胞因子(cytokine/cytokines)”是指影响免疫系统细胞的生物分子的一般类别。示例性细胞因子包括但不限于干扰素和白细胞介素(IL)，特别是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在优选的实施方式中，细胞因子为IL-2。
如本文所用，术语“载体”是指包含完整的复制子的非染色体核酸，所述完整的复制子使得所述载体在被置于允许性(permissive)细胞内时可被复制(例如通过转化过程)。载体可以在一种细胞类型(例如细菌)中复制，但是在另一种细胞(例如哺乳动物细胞)中复制的能力有限。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸DNA；DNA与单独的阳离子脂质或阳离子脂质与阳离子聚合物的组合复合；阴离子和阳离子脂质体；DNA-蛋白质复合物和颗粒，其包含与阳离子聚合物(如异质聚赖氨酸、定长寡肽和聚乙烯亚胺)缩合的DNA，在某些情况下被包含在脂质体中；以及包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元复合物的用途。
如本文所用，术语“基本上相同”与术语“可比较的”或“相似的”互换使用，在描述细胞毒性、存活率或细胞恢复时是指对细胞毒性、存活率或细胞倍增时间的两次测量彼此之间的差异不超过25％，不超过20％，不超过15％，不超过10％，不超过8％或不超过5％。
如本文所用，术语“细胞毒性”在被用于描述效应细胞(例如NK细胞)的活性时，涉及通过多种生物、生化或生物物理机制中的任一种杀死靶细胞。
为了方便读者，可以在说明书中使用标题或副标题，其不旨在影响本公开内容的范围。另外，下文更具体地定义了本说明书中使用的一些术语。
基础培养基
本公开提供了为生长
Figure BDA0002784965660000092
细胞而定制的培养基(“所述定制的
Figure BDA0002784965660000091
培养基”)，其包含基础培养基和一种或多种补充剂，所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠或其组合。本文公开的基础培养基是指未补充的细胞培养基。基础培养基通常包含无机盐、碳源、维生素和氨基酸。合适的基础培养基包括但不限于Isocove改良的Dulbecco培养基(IMDM)和最低基础培养基Eagle alpha改良版，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基，McCoys 5A改良培养基。这些培养基中的许多培养基(例如IMDM)可通过商购获得，例如，Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,或来自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO。任选地，基础培养基包含糖类。
可在所述基础培养基中使用的示例性维生素可为一种或多种选自以下的维生素：生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、硫胺素盐酸盐、维生素B12和i-肌醇。
可在所述基础培养基中使用的示例性无机盐可为一种或多种选自以下的无机盐：CaCl2、MgSO4、KCl、KNO3、NaHCO3、NaCl、NaH2PO4和Na2O3Se。
可在所述基础培养基中使用的示例性氨基酸可为一种或多种选自以下的氨基酸：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。
任选地，所述基础培养基还可包含碳水化合物，例如包含葡萄糖的糖类。任选地，所述基础培养基包含约3-6g/L的葡萄糖。
任选地，所述基础培养基还可包含亚硒酸钠，例如约10-25μg/L，例如17μg/L。
任选地，所述基础培养基可包含缓冲剂组分，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)。任选地，所述基础培养基可包含一种或多种其他组分，例如酚红、次黄嘌呤单钠丙酮酸盐、亚油酸、硫辛酸、腐胺二盐酸盐、胸苷等。
任选地，所述基础培养基包含氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖和HEPES。
任选地，所述基础培养基包含2-6g/L的氯化钠(例如4-5g/L或4.505g/L的氯化钠)、1-5g/L的碳酸氢钠(例如2-4g/L或3.024g/L的碳酸氢钠)、0.1-0.6g/L的氯化钾(例如0.2-0.4g/L或0.33g/L的氯化钾)、0.1-0.4氯化钙(例如0.15-0.2 0.1653氯化钙)、0.05-0.2g/L的磷酸一氢钠(例如0.109g/L的磷酸二氢钠)、2-8g/L的葡萄糖(例如4.5g/L葡萄糖)、2-8g/L的HEPES(例如5.958g/L的HEPES)。
对基础培养基的补充
本文公开的定制的
Figure BDA0002784965660000101
培养基包含如上所述的基础培养基以及一种或多种补充剂，所述一种或多种补充剂包含但不限于乙醇胺、乙醇胺衍生物、胰岛素、转铁蛋白或其组合。
白蛋白是细胞培养中用于将未酯化的脂肪酸送入细胞或从细胞中释放出的蛋白补充剂；白蛋白可为，例如人白蛋白(HA)或牛血清白蛋白(BSA)。任选地，白蛋白为人白蛋白或HA。人白蛋白(HA)是人血清中最丰富的蛋白质，约3.5-5.0g/dL，其充当血液中类固醇和脂肪酸的载体蛋白。可商购人白蛋白，例如可从CSL Behring,King of Prussia,PA,Griffiols,Octapharma等商购。任选地，所述基础培养基补充有0.05-1.0％HA，例如0.1-1.0％、0.125％、0.5％、或1.0％的HA。
定制的
Figure BDA0002784965660000111
培养基可包含人AB血清。人AB血清是通过凝结人全血并将液相从凝结的固相分离而产生的。与HA相比，人AB血清含有HA中不存在的组分，例如(不被用于凝结的)其他蛋白质、电解质、抗体、葡萄糖和激素。任选地，所述基础培养基补充有1-7％(例如3-7％或5％)的人AB血清。
本申请的发明人已发现，出乎意料的是，尽管人AB血清已经含有白蛋白，但是向已经补充有5％的人AB血清的培养基添加少量的HA(例如0.05-1.0％、0.1-1.0％或0.125％-1％)仍然可以显著增加
Figure BDA0002784965660000113
细胞的细胞毒性。参见例如表3(比较E和F组)。
乙醇胺是具有式HOCH2CH2NH2的有机化合物。该分子既是伯胺又是伯醇(由于羟基)。乙醇胺为无色粘稠液体，通常被用于生产洗涤剂、乳化剂、上光剂、药物、缓蚀剂和化学中间体。乙醇胺还是对细胞质膜和细胞器的结构至关重要的磷酸甘油酯的前体。
乙醇胺衍生物是衍生自乙醇胺的化合物(例如通过化学反应)，并包含相似的化学结构。例如，乙醇胺衍生物可以是乙醇酰胺，其通过乙醇胺与羧酸之间的缩合反应形成。乙醇胺衍生物也可以是乙醇胺磷脂，例如磷脂酰乙醇胺。可被使用的乙醇酰胺的非限制性实例包括异油酸乙醇酰胺(VEA)(例如顺式异油酸乙醇酰胺)、油酸乙醇酰胺(OEA)(例如顺式油酸乙醇酰胺)、软脂酸乙醇酰胺(PAE)和硬脂酸乙醇酰胺(SEA)。这些化合物是通常可在人和大鼠血浆中被找到的脂肪酸乙醇酰胺。
为了产生所述定制的
Figure BDA0002784965660000112
培养基，可在本文公开的基础培养基中补充一种或多种补充剂。任选地，所述一种或多种补充剂包含0.2-20mg/L(例如5-10mg/L、10-20mg/L、1-10mg/L、1-5mg/L或2mg/L)的乙醇胺和/或乙醇胺衍生物。
除乙醇胺和/或其衍生物外，还可使用其他补充剂，所述其他补充剂包含胰岛素、转铁蛋白和硒中的一种或多种。胰岛素促进葡萄糖和氨基酸的摄取、脂肪生成、细胞内运输以及蛋白质和核酸的合成。转铁蛋白是一种铁载体，也可能有助于降低氧游离基和过氧化物的毒性水平。作为亚硒酸钠的硒是谷胱甘肽过氧化物酶和其他蛋白质的辅因子，其可在培养基中被用作抗氧化剂。在所述基础培养基中补充包含胰岛素、转铁蛋白、硒和乙醇胺的混合物的溶液。任选地，在所述定制的
Figure BDA0002784965660000121
培养基中的基础培养基中补充适合细胞培养的量的胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠。例如，可在所述基础培养基中补充1-20mg/L(例如5-10mg/L或10mg/L)的胰岛素、2.5-12mg/L(例如5.5mg/L)的转铁蛋白和/或6.7μg/L的亚硒酸钠。任选地，被添加到所述基础培养基中以形成所述
Figure BDA0002784965660000122
培养基的补充剂为多种组分(例如胰岛素、转铁蛋白、硒和乙醇胺)的预制浓缩混合物，其被添加到所述基础培养基中时被稀释至工作浓度。所述预制混合物可包含例如500-10,000mg/L的胰岛素、250-10,000mg/L的转铁蛋白、0.25-15.0mg/L的亚硒酸钠和100-4,000mg/L的乙醇胺，并且，可将所述预制混合物以适当的稀释度(例如1：100或1：1000)添加到所述基础培养基中。
任选地，被添加到所述基础培养基中的一种或多种补充剂包含泊洛沙姆188(泊洛沙姆188F68)。任选地，产生的定制的
Figure BDA0002784965660000128
培养基包含0.01-0.1％，例如0.05％的泊洛沙姆188。
任选地，所述定制的
Figure BDA0002784965660000123
培养基包含4.5-20g/L(例如10-20g/L、5-10g/L、约6.5g/L、约9g/L、11g/L、13g/L、15g/L、17g/L)的葡萄糖。
任选地，当所述
Figure BDA0002784965660000124
细胞是不产生内源性白细胞介素-2(IL-2)的aNKTM细胞时，仍然在所述基础培养基中补充足够支持aNKTM细胞生长的量的IL-2。任选地，在所述定制的
Figure BDA0002784965660000125
培养基中将IL-2补充至300-600IU/mL(例如500IU/mL)的量。
已经在所述定制的
Figure BDA0002784965660000129
培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000126
细胞具有与在参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000127
细胞的直接细胞毒性和/或ADCC基本相同的直接细胞毒性和/或ADCC。可以使用下文描述的方法测量不同生长周期(例如周期3、周期4和/或周期5)的直接细胞毒性和ADCC。在某些情况下，在所述定制的
Figure BDA0002784965660000131
培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000132
细胞具有比在参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000133
细胞的直接细胞毒性和/或ADCC高1-30％(例如1-15％)的直接细胞毒性和/或ADCC。在某些情况下，在所述定制的
Figure BDA0002784965660000134
培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000135
细胞具有与在参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000136
细胞的直接细胞毒性和/或ADCC基本相同的直接细胞毒性和/或ADCC。实施例2显示了一个说明性的实例，其中G组对在参考培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000137
细胞显示出基本相同的细胞毒性。
补充剂的示例性组合
任选地，所述定制的
Figure BDA0002784965660000138
培养基包含补充有乙醇胺而没有HA的基础培养基。所述乙醇胺可为0.05-40mg/L，例如0.2-20mg/L或2mg/L。实施例2的表5的D和F组中显示了一个说明性的实例，在所述示例性的例子中，在所述定制的
Figure BDA0002784965660000139
培养基中生长的aNKTM细胞显示出了与在所述参照生长培养基中生长的aNKTM细胞的生长速率、存活率和细胞毒性基本相同的生长速率、存活率和细胞毒性。在某些情况下，在所述基础培养基中进一步补充转铁蛋白、胰岛素和亚硒酸钠。
任选地，在所述基础培养基中补充乙醇胺和HA。在某些情况下，所述定制的
Figure BDA00027849656600001311
培养基中的HA可为0.05-1.0％(例如0.125-1.0％、0.25％或0.5％)，以及乙醇胺可为2.0mg/L。实施例2的表5中显示了一个说明性的实例，例如G和I组。
任选地，在所述基础培养基中补充乙醇胺、葡萄糖、胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠。表5中显示了一个说明性的实例，例如F组。
任选地，在所述基础培养基中补充有乙醇胺、HA和葡萄糖。可以如上文所述的量补充乙醇胺和HA。可将葡萄糖添加到所述基础培养基中，使得所述的定制的
Figure BDA00027849656600001310
培养基中的最终浓度为4.5-20g/L。表7显示了一个说明性的实例，例如I组。任选地，在所述基础培养基中，以上文所公开的合适的量进一步补充胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠。
在一个说明性的实例中，所述基础培养基包含4.5g/L的葡萄糖，并在所述基础培养基中补充额外量的2.0g/L的葡萄糖(以使所述定制的
Figure BDA0002784965660000141
培养基中的最终浓度为6.5g/L)、2.0mg/L的乙醇胺和1.0％的人白蛋白。在另一个说明性的实例中，在所述基础培养基中补充0.2-20mg/L乙醇胺、0.125-0.5％的HA和一定量的葡萄糖，以使所述定制的
Figure BDA0002784965660000142
培养基中的葡萄糖浓度为约4.5-20g/L，例如6.5g/L。在又一个说明性的实例中，所述基础培养基包含4.5g/L的葡萄糖，并在所述基础培养基中补充额外量的2.0g/L的葡萄糖(以使所述定制的
Figure BDA0002784965660000143
培养基中的最终浓度为6.5g/L)、10mg/L胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、0.125％的人白蛋白和2.0mg/L的乙醇胺。
任选地，还将人AB血清和/或泊洛沙姆188添加至补充有本文所述的补充剂的多种组合的基础培养基中。
包含补充有本文公开的补充剂的多种组合的基础培养基的定制的
Figure BDA0002784965660000144
培养基支持与在所述参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000145
细胞的生长速率、存活率、直接细胞毒性和/或ADCC基本相同的生长速率、存活率、直接细胞毒性和/或ADCC。
其他促进生长的物质
其他促进细胞生长的物质也可被用于补充基础培养基以培养
Figure BDA0002784965660000146
细胞。这些物质包括但不限于核苷、2-酮戊二酸(2-氧代戊二酸)、果糖、半乳糖、甘油磷酸、柠檬酸、乙醇胺、对氨基苯甲酸、含铁化合物(例如FeSO4和血红素)、苄脒、腐胺和不饱和脂肪酸(例如油酸和亚油酸)。
此外，为了防止培养基被细菌或支原体污染，可将抗菌剂(例如链霉素、制霉菌素、庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星和左氧氟沙星)与上述补充剂组合使用。
培养
Figure BDA0002784965660000151
细胞的方法
生长
Figure BDA0002784965660000152
细胞通常开始于解冻冷冻的
Figure BDA0002784965660000153
细胞，并将其接种在装有合适培养基的容器中。允许细胞恢复直至细胞存活率达到某个值，例如大于85％。然后将细胞在容器(例如T-Flask或G-Rex容器)中扩增至所需细胞密度，例如等于或小于1.2×106个细胞/mL的密度。然后收集来自所述容器的细胞培养物，并用于在如上所述的定制的
Figure BDA0002784965660000154
培养基中接种一个或多个较大的培养容器。通常使用的这种较大的培养容器包括用于波浪生物反应器的一次性培养袋，其容量可为至少2升、至少5升、至少10升或至少25升。可使用本领域众所周知的方法(例如使用血清移液管、泵或重力进料)在无菌条件下进行细胞在不同容器之间的转移。
可通过离心收集如此产生的
Figure BDA0002784965660000155
细胞。任选地，在扩增过程结束时，使用被无菌地连接到所述培养容器的连续离心机(例如用于波浪生物反应器的一次性培养袋)进行离心。然后除去培养上清液，并将细胞重悬于洗涤缓冲液中。任选地，可重复该洗涤至少两次、至少三次，例如4-6次。在最后一次洗涤后，可再次将包含所述细胞和洗涤缓冲液的混合物离心，收集细胞并进行处理以用于治疗应用。
任选地，评估如上所述在定制的
Figure BDA0002784965660000156
培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000157
细胞的细胞毒性。产生的NK-92细胞的直接细胞毒性可以通过本领域众所周知的方法来评估，例如使用Klingemann等(Cancer Immunol.Immunother.33:395-397(1991))描述的步骤的51Cr释放测定法(Gong等，Leukemia,Apr；8(4):652-658(1994))。可以基于释放的51Cr量，计算比细胞毒性的百分比。参见美国专利号US20020068044。
或者，可以使用钙黄绿素释放测定法评估产生的
Figure BDA0002784965660000158
细胞的直接细胞毒性。例如，可以将
Figure BDA0002784965660000159
细胞(在测定法中称为效应子)与钙黄绿素负载的靶细胞(在测定法中称为靶标)混合。孵育一段时间后，可以例如通过荧光板读数器评估从靶细胞释放的钙黄绿素。测定中使用的效应子与靶标的比率可以变化，任选地，效应子与靶标的比率可以为20：1、15：1、10：1、8：1、5：1、2.5：1、1.25：1、0.625：1、0.31：1、0.16：1、0.08：1、0.04：1、0.02：1；任选地，效应子：靶标比率为10：1。靶细胞可以是表达可被
Figure BDA0002784965660000161
细胞识别的MHC分子的任何细胞，例如K562细胞或BT-474细胞。
Figure BDA0002784965660000162
细胞的细胞毒性值可能会有所不同，具体取决于所用靶细胞的类型以及
Figure BDA0002784965660000163
细胞所处的效应子：靶标比率和生长周期。通常，使用本文描述的方法产生的
Figure BDA0002784965660000164
细胞可具有至少50-100％，例如60-100％，70-100％或80-100％的直接细胞毒性。在某些情况下，当
Figure BDA0002784965660000165
细胞处于选自生长周期3-12的生长周期(例如，第3、4或5个周期)时，通过钙黄绿素释放测定法，aNKTM细胞或
Figure BDA0002784965660000166
细胞的直接细胞毒性可以为80-110％，当使用K562细胞作为靶细胞时，例如82-100％，85-100％，87-100％，88-100％或89-100％。
任选地，评估的
Figure BDA0002784965660000167
细胞例如
Figure BDA0002784965660000168
细胞的细胞毒性是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。测量
Figure BDA0002784965660000169
细胞的ADCC的方法与上述测量直接细胞毒性的方法类似，不同之处在于，添加了可以识别靶细胞的抗体。NK细胞的Fc受体识别与细胞结合的抗体，并触发溶细胞反应并杀死靶细胞。在一个说明性实例中，可在Rituxan(抗CD20抗体)存在下将细胞与Ramos(靶细胞)一起孵育，并且可通过如上所述的靶细胞内部组分(例如51Cr或钙黄绿素)的释放来测量Ramos细胞的杀死。测定中使用的效应子与靶标的比率可以变化，任选地，效应子与靶标的比率可以为20：1、15：1、10：1、8：1、5：1、2.5：1、1.25：1、0.625：1、0.31：1、0.16：1、0.08：1,0.04：1或0.02：1；优选地，效应子：靶标比率为10：1。任选地，当以10：1的效应子：靶标比率测试时，
Figure BDA00027849656600001610
细胞具有至少60％，至少70％，至少80％或至少90％的ADCC毒性。任选地，当使用效应子：靶标比率为10：1时，当
Figure BDA00027849656600001611
细胞处于选自生长周期3-12(例如周期3、4或5)的生长周期时，
Figure BDA00027849656600001612
细胞可具有60-120％，例如80-120％，90-115％，97-110％或100-120％的ADCC细胞毒性。
在定制的
Figure BDA00027849656600001613
培养基中生长的
Figure BDA00027849656600001614
细胞可以具有与在参照生长培养基中生长的
Figure BDA00027849656600001615
细胞基本相同的直接细胞毒性和/或ADCC。任选地，在定制的
Figure BDA0002784965660000171
细胞中生长的
Figure BDA0002784965660000172
细胞具有参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000173
细胞的90-120％的直接细胞毒性和/或ADCC。
可以使用细胞倍增时间，即细胞增殖并达到初始细胞数目的两倍的时间来评估
Figure BDA0002784965660000174
细胞的生长速率。倍增时间与
Figure BDA0002784965660000175
细胞的生长速度成反比。倍增时间越长，生长速率越低。在定制的
Figure BDA0002784965660000176
培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000177
细胞的倍增时间为30-50小时，例如30-40、40-50或40-47小时。
测量细胞存活率的方法也是众所周知的，例如，台盼蓝排除测定，其中死细胞被染成蓝色，并且可以通过从总细胞中减去台盼蓝染色的细胞来计算存活细胞数。细胞计数可以在血细胞计数器的计数室上进行。基于细胞显示出很大的电阻这一事实，自动细胞计数通常也用于对细胞进行计数以及测量其体积。自动细胞计数器的一个实例是可从BeckmanCoulter,Brea,CA获得的Coulter计数器。另一个实例是可从Chemometec,Denmark获得的NC-200TM Nucleocounter自动细胞计数器。该设备根据荧光存活率染料对活细胞和死细胞的染色计数活细胞和死细胞。在定制的
Figure BDA0002784965660000178
培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000179
细胞可能具有85-100％的存活率。
任选地，将在本文公开的培养基中生长的
Figure BDA00027849656600001710
细胞的细胞毒性、存活率和/或生长速率与已经在参照生长培养基中生长的
Figure BDA00027849656600001711
细胞进行比较。参照生长培养基可以是本领域普通技术人员已经用来培养
Figure BDA00027849656600001712
细胞的任何培养基。在一些实施方式中，参照生长培养基可以包含某些
Figure BDA00027849656600001713
细胞生长所必需的细胞因子，例如IL-2。在某些情况下，如果定制的
Figure BDA00027849656600001714
培养基还补充了人AB血清泊洛沙姆188，则参照生长培养基还补充了这些成分。在某些情况下，例如，在aNKTM细胞的生长依赖于白细胞介素2(IL-2)的情况下，在参照生长培养基中还补充了IL-2。在一些情况下，参照生长培养基还包含L-丝氨酸(例如浓度为0.324mmol/L)、L-天冬酰胺(例如浓度为0.036mmol/L)、L-谷氨酰胺(例如浓度为0.45mmol/L)。在某些情况下，参照生长培养基包含人AB血清、IL-2和泊洛沙姆188。如果在参照生长培养基中使用这些多种补充剂，则在同一研究中还将这些多种补充剂补充到定制的
Figure BDA0002784965660000181
培养基中。
Figure BDA0002784965660000182
细胞
可以使用通过本文公开的方法培养的
Figure BDA0002784965660000183
细胞包括aNKTM细胞，
Figure BDA0002784965660000184
细胞，
Figure BDA0002784965660000185
和
Figure BDA0002784965660000186
(例如
Figure BDA0002784965660000187
或
Figure BDA0002784965660000188
)细胞，以下将对其进行进一步说明。
Figure BDA0002784965660000189
细胞系是发现在白细胞介素2(IL-2)存在下增殖的独特细胞系。Gong等，Leukemia 8:652-658(1994)。这些细胞具有针对多种癌症的高的细胞溶解活性。
Figure BDA00027849656600001810
细胞系是均一的癌性NK细胞，具有广泛的抗肿瘤细胞毒性，且扩增后可预测产量。一期临床试验已证实其安全性。在患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液中发现
Figure BDA00027849656600001811
然后其在离体被永生化。
Figure BDA00027849656600001812
细胞源自NK细胞，但缺乏正常NK细胞所表现出的主要抑制性受体，同时保留了大多数激活性受体。但是，
Figure BDA00027849656600001813
细胞不会攻击正常细胞，也不会引发人类无法接受的免疫排斥反应。在WO 1998/49268和美国专利申请公开号2002-0068044中公开了
Figure BDA00027849656600001814
细胞系的表征。
发现
Figure BDA00027849656600001815
细胞系表现出CD56bright，CD2，CD7，CD11a，CD28，CD45和CD54表面标志物。此外，它不显示CD1，CD3，CD4，CD5，CD8，CD10，CD14，CD16，CD19，CD20，CD23和CD34标志物。
Figure BDA00027849656600001816
细胞在培养中的生长取决于重组白细胞介素2(rIL-2)的存在，低至1IU/mL的剂量足以维持增殖。
Figure BDA00027849656600001817
甚至在低效应子/靶标(E：T)比率1：1的情况下仍具有很高的细胞毒性。Gong等，同上。
Figure BDA00027849656600001818
细胞被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，其名称为CRL-2407。
迄今为止，对内源性NK细胞的研究表明，IL-2(1000IU/mL)对于运输过程中NK细胞的激活至关重要，但是不必将细胞维持在37℃和5％的二氧化碳中。Koepsell等，Transfusion 53:398-403(2013)。
修饰的
Figure BDA0002784965660000191
细胞是已知的，包括但不限于，例如，美国专利号7,618,817、8,034,332和8,313,943，美国专利申请公开号2013/0040386中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文，例如野生型
Figure BDA00027849656600001916
Figure BDA00027849656600001917
(F157V)、
Figure BDA00027849656600001918
和
Figure BDA00027849656600001919
尽管
Figure BDA0002784965660000198
细胞保留了几乎所有与NK细胞相关的激活性受体和溶细胞途径，但它们在其细胞表面上不表达CD16。CD16是一种Fc受体，可识别并结合抗体的Fc部分以激活NK细胞以产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。由于缺少CD16受体，
Figure BDA0002784965660000199
细胞无法通过ADCC机制裂解靶细胞，因此无法增强内源或外源抗体(即利妥昔单抗和赫赛汀)的抗肿瘤作用。
对内源性NK细胞的研究表明，IL-2(1000IU/mL)对于运输过程中NK细胞的激活至关重要，但是不必将细胞维持在37℃和5％的二氧化碳中。Koepsell等，Transfusion 53:398-403(2013)。但是，内源性NK细胞与
Figure BDA00027849656600001910
细胞有显著差异，很大程度上是因为它们的来源不同：
Figure BDA00027849656600001911
是癌症衍生的细胞系，而内源性NK细胞是从供体(或患者)中收获的并进行处理以注入患者体内。内源性NK细胞制备是异源细胞群，而
Figure BDA00027849656600001912
细胞是同质克隆细胞系。
Figure BDA00027849656600001913
细胞易于在培养中增殖，同时保持细胞毒性，而内源性NK细胞则不然。另外，内源性NK细胞异质群体不会以高密度聚集。此外，内源性NK细胞表达Fc受体，包括
Figure BDA00027849656600001914
细胞不表达的CD-16受体。
Fc受体
Fc受体结合抗体的Fc部分。几种Fc受体是已知的，并且根据它们优选的配体、亲和力、表达和与抗体结合后的作用而不同。
表1.说明性Fc受体
Figure BDA00027849656600001915
Figure BDA0002784965660000201
Figure BDA0002784965660000211
任选地，修饰
Figure BDA0002784965660000212
细胞以在细胞表面上表达Fc受体蛋白。
任选地，Fc受体是CD16。在SEQ ID NO：2中显示编码CD16的代表性氨基酸序列。在SEQ ID NO：1中显示编码CD16的代表性多核苷酸序列。在一些实施方式中，通过引入编码CD16多肽的多核苷酸来修饰
Figure BDA0002784965660000221
细胞，编码CD16多肽的多核苷酸与编码全长(包含信号肽)的天然存在的CD16的多核苷酸序列具有至少约70％的多核苷酸序列同一性，所述天然存在的CD16在全长CD16的第176位具有苯丙氨酸。任选地，编码CD16多肽的多核苷酸与编码全长(包括信号肽)的天然存在的CD16的多核苷酸序列具有至少约70％的多核苷酸序列同一性，所述天然存在的CD16在第176位具有缬氨酸。
同源多核苷酸序列包括那些编码多肽序列的序列，所述多肽序列编码CD16变体。任选地，同源CD16多核苷酸的长度可以是约150至约700、约750或约800个多核苷酸，尽管具有多于700至800个多核苷酸的CD16变体在本公开的范围内。
在其他实例中，具有改变CD16氨基酸序列的多态性的cDNA序列被用于修饰
Figure BDA0002784965660000222
细胞，例如，在CD16基因中表现出基因多态性的个体之间的等位基因变异。在其他实例中，来自具有与人CD16的序列不同的多核苷酸序列的其他物种的CD16基因被用于修饰
Figure BDA0002784965660000223
细胞。
在实例中，使用本领域已知的方法(例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变)来制备变体多肽。可以在克隆的DNA上进行位点定点诱变(Carter,1986；Zoller和Smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等，1985)或其他已知技术以产生CD16变体(Ausubel,2002；Sambrook和Russell,2001)。
只要人CD16多肽的氨基酸序列中的保守置换(其中一种类别的一个氨基酸被相同类别的另一个氨基酸替代)没有实质性地改变所述多肽的活性，该保守置换就落入所公开的CD16变体的范围内。保守置换是本领域技术人员众所周知的。影响(1)多肽主链结构(例如β-折叠或α-螺旋构象)，(2)电荷，(3)疏水性，或(4)靶位点的侧链的大部分的非保守置换可以修饰CD16多肽的功能或免疫学特性。非保守置换需要将其中一个类别的成员交换为另一个类别。可以将置换引入保守置换位点或更优选地引入非保守位点。
任选地，CD16多肽变体的长度为至少200个氨基酸，并且与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2具有至少70％的氨基酸序列同一性，或至少80％或至少90％的同一性。在一些实施方式中，CD16多肽变体的长度为至少225个氨基酸，并且与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少70％的氨基酸序列同一性，或至少80％或至少90％的同一性。
在一些实施方式中，编码CD16多肽的核酸可以编码CD16融合蛋白。CD16融合多肽包括与非CD16多肽融合的CD16的任何部分或整个CD16。在一些实施方式中，可以产生融合多肽，其中异源多肽序列与CD16的C末端融合或位于CD16的内部。通常，至多约30％的CD16胞质结构域可被替换。这样的修饰可增强表达或增强细胞毒性(例如ADCC响应性)。在其他实例中，嵌合蛋白，例如来自其他淋巴细胞激活性受体的结构域(包括但不限于Ig-a、Ig-B、CD3-e、CD3-d、DAP-12和DAP-10)替换了CD16胞质结构域的一部分。
可以通过常规技术合成融合基因，所述常规技术包括自动化的DNA合成仪和使用锚定引物的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端，随后可以对所述互补的突出端进行退火和重新扩增以生成嵌合基因序列(Ausubel，2002)。许多载体是可商购的，其有助于将CD16框内亚克隆到融合部分。
嵌合抗原受体
如本文所述，将
Figure BDA0002784965660000231
细胞进一步工程化以在细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)。任选地，CAR对肿瘤特异性抗原具有特异性。通过U.S.2013/0189268、WO 1999024566A1、U.S.7,098,008和WO 2000020460 A1中的非限制性实例，描述了肿瘤特异性抗原，其各自的全部内容通过引用并入本文。肿瘤特异性抗原包括但不限于NKG2D、CS1、GD2、CD138、EpCAM、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、ETA、MAGE、CAGE、BAGE、HAGE、LAGE、PAGE、NY-SEO-1、GAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAB、WT-1、PSMA、NY-ESO1、AFP、CEA、CTAG1B、CD19和CD33。可在表2中找到其他非限制性的肿瘤相关抗原和与之相关的恶性肿瘤。
表2：肿瘤特异性抗原和相关的恶性肿瘤
Figure BDA0002784965660000241
Figure BDA0002784965660000251
Figure BDA0002784965660000261
Figure BDA0002784965660000271
任选地，CAR靶向CD19、CD33或CSPG-4。
在实例中，使用本领域已知的方法(例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变)来制备变体多肽。可以在克隆的DNA上进行位点定点诱变(Carter，1986；Zoller和Smith，1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等，1985)或其他已知技术以产生CD16变体(Ausubel，2002；Sambrook和Russell，2001)。
任选地，所述CAR靶向与特定癌症类型相关的抗原。任选地，所述癌症选自白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞白血病(包括髓母细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞白血病和红血球性白血病))和慢性白血病(例如慢性粒细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤(例如霍奇金病和非霍奇金病)，多发性骨髓瘤，沃尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)，重链疾病，实体瘤(包括但不限于肉瘤和癌瘤(例如纤维肉瘤、粘肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内膜肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌，卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm’s tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑血管瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在一些实施方式中，使编码CAR的多核苷酸突变以改变编码CAR的氨基酸序列，而不改变CAR的功能。例如，可以在以上公开的CAR中进行导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸置换的多核苷酸置换。可以如例如专利公开号WO 2014039523、US 20140242701、US20140274909、US 20130280285和WO 2014099671中工程化CAR，其各自的全部内容通过引用并入本文。任选地，所述CAR是CD19 CAR，CD33 CAR或CSPG-4CAR。
其他修饰-细胞因子
Figure BDA0002784965660000281
细胞的细胞毒性取决于细胞因子的存在(例如白细胞介素-2(IL-2))。在商业规模的培养中使用外源添加的IL-2来维持和扩增
Figure BDA0002784965660000282
细胞所需的成本重大。向人类受试者施用足够量的IL-2以继续激活
Figure BDA0002784965660000283
细胞会引起不良副作用。
任选地，将表达FcR的
Figure BDA0002784965660000284
细胞进一步修饰以表达至少一种细胞因子和自杀基因。在特定的实施方式中，至少一种细胞因子是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其变体。在优选的实施方式中，细胞因子是IL-2。在SEQ ID NO：3中显示代表性的编码IL-2的核酸，以及在SEQ ID NO：4中显示IL-2的代表性多肽。在一些实施方式中，IL-2是靶向内质网的变体。
在一个实施方式中，表达IL-2含有将IL-2引导至所述内质网的信号序列。虽然不受理论束缚，但是将IL-2引导至内质网允许IL-2以足以自分泌激活的水平表达，但不会在细胞外释放IL-2。参见Konstantinidis等，“Targeting IL-2to the endoplasmicreticulum confines autocrine growth stimulation to
Figure BDA0002784965660000285
cells”Exp.Hematol.2005Feb；33(2):159-64。可以(例如通过自杀基因的存在)阻止表达FcR的
Figure BDA0002784965660000286
细胞的持续激活。
其他修饰-自杀基因
术语“自杀基因”是允许对细胞的阴性选择的基因。自杀基因被用作安全系统，其允许通过引入选择剂杀死表达该基因的细胞。如果重组基因引起导致细胞生长不受控制的突变，这是期望的。已经鉴定出许多自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌(Escherichia coli)gpt基因和大肠杆菌(E.coli)Deo基因(另参见，例如Yazawa K,FisherW E,Brunicardi F C:Current progress in suicide gene therapy for cancer.WorldJ.Surg.2002年7月；26(7):783-9)。如本文所用，自杀基因在
Figure BDA0002784965660000291
细胞中具有活性。通常，自杀基因编码对细胞没有不良影响的蛋白质，但是在存在特定化合物的情况下会杀死细胞。因此，自杀基因通常是系统的一部分。
在一个实施方式中，自杀基因是胸苷激酶(TK)基因。TK基因可以是野生型或突变TK基因(例如tk30、tk75、sr39tk)。可以使用更昔洛韦(ganciclovir)杀死表达TK蛋白的细胞。
在另一个实施方式中，自杀基因是胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase)，其在存在5-氟胞嘧啶的情况下对细胞有毒。Garcia-Sanchez等，“Cytosine deaminaseadenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells1million-fold when they contaminate hematopoietic cells:a potential purgingmethod for autologous transplantation.”Blood 1998年7月15日；92(2)：672-82。
在另一个实施方式中，自杀基因是在存在异环磷酰胺或环磷酰胺的情况下有毒的细胞色素P450。参见例如，Touati等，“A suicide gene therapy combining theimprovement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of ananti-tumor immune response.”Curr Gene Ther.2014；14(3):236-46。
在另一个实施方式中，所述自杀基因是iCas9。Di Stasi,(2011)“Inducibleapoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.”N Engl J Med 365:1673–1683。另参见Morgan,“Live and Let Die:A New Suicide Gene Therapy Moves tothe Clinic”Molecular Therapy(2012)；20:11–13。所述iCas9蛋白在存在小分子API903的情况下诱导凋亡。API903是在临床研究中已被证明具有良好的耐受性并已在过继细胞疗法的背景下被使用的生物惰性小分子。
在一个实施方式中，在向患者施用之前，对经修饰的
Figure BDA0002784965660000303
细胞进行辐照。例如在美国专利号8,034,332中描述了
Figure BDA0002784965660000304
细胞的辐照，其全部内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，辐照未经工程化以表达自杀基因的经修饰的
Figure BDA0002784965660000301
细胞。
转基因表达
可通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因(例如，CD19.CAR和CD16)工程化成表达载体。可以将转基因工程化到相同的表达载体或不同的表达载体中。在优选的实施方式中，将转基因工程化到相同的载体中。
在一些实施方式中，载体允许将转基因引入细胞的基因组中。在一些实施方式中，载体具有正选择标志物。正选择标志物包括在会杀死不表达所述基因的细胞的条件下允许细胞生长的任何基因。非限制性实例包括抗生素抗性，例如遗传霉素(来自Tn5的Neo基因)。
可以使用任何数量的载体来表达Fc受体和/或CAR。在一些实施方式中，载体是质粒。在一个实施方式中，载体是病毒载体。病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体等。
可使用本领域已知的任何转染方法(包括但不限于感染、电穿孔、脂转染、核转染或“基因枪”)将转基因引入
Figure BDA0002784965660000302
细胞中。
公开的是材料、组合物和组分，所述材料、组合物和组分可以用于所公开的方法和组合物，可以与所公开的方法和组合物结合使用，可用于制备所公开的方法和组合物，或是所公开方法和组合物的产物。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解的是，虽然在公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时可能没有明确地公开这些化合物的各个单独的和集体的组合和排列中的每一个的具体引用，但是本文特别考虑并描述了每一个。例如，如果公开并讨论了一种方法，并且讨论了可以对包括所述方法在内的许多分子进行的许多修饰，则所述方法的每种组合和排列以及可能的修饰都被特别考虑，除非存在特别的相反指示。同样地，也特别考虑并公开了这些的任何子集或组合。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所述公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果可以执行多种附加步骤，则应理解的是，这些附加步骤中的每一个都可以用所公开的方法中的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来执行，以及每个这样的组合或子集都被特别考虑并应该被认为是公开的。
实施方式
本文公开的方法和组合物包括以下示例性实施方式。
实施方式1。一种培养
Figure BDA0002784965660000311
细胞的方法，其包括在定制的
Figure BDA0002784965660000312
培养基中培养
Figure BDA0002784965660000313
细胞，所述定制的
Figure BDA0002784965660000314
培养基包括基础培养基和一种或多种补充剂，其中所述一种或多种补充剂包括乙醇胺、乙醇胺衍生物、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、HA或其组合；和其中所述基础培养基包含无机盐、维生素和氨基酸。
实施方式2。实施方式1所述的方法，其中所述乙醇胺衍生物为乙醇酰胺。
实施方式3。实施方式2所述的方法，其中所述乙醇酰胺为异油酸乙醇酰胺或油酸乙醇酰胺，软脂酸乙醇酰胺或硬脂酸乙醇酰胺。
实施方式4。实施方式1所述的方法，其中所述乙醇胺衍生物是磷脂酰乙醇胺。
实施方式5。实施方式1-4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂包含1-7％的人AB血清。
实施方式6。实施方式1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂进一步包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。
实施方式7。实施方式1-6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂进一步包含300-600IU/mL白细胞介素-2。
实施方式8。实施方式1-7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂进一步包含0.01％至0.1％的泊洛沙姆188。
实施方式9。实施方式1-8中任一项所述的方法，其中在所述定制的
Figure BDA0002784965660000321
培养基中培养的
Figure BDA0002784965660000322
细胞相比于在参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000323
细胞具有基本相同或更高的细胞毒性、生长速率和存活率。
实施方式10。实施方式1-9中任一项所述的方法，其中在所述定制的
Figure BDA0002784965660000324
培养基中培养的
Figure BDA0002784965660000325
细胞具有85-100％的存活率。
实施方式11。实施方式1-10中任一项所述的方法，其中在所述定制的
Figure BDA0002784965660000326
培养基中培养的
Figure BDA0002784965660000327
细胞在效应子与靶标比率为10：1时显示60-100％的直接细胞毒性和/或ADCC。
实施方式12。实施方式1-11中任一项所述的方法，其中在所述定制的
Figure BDA0002784965660000328
培养基中培养的
Figure BDA00027849656600003216
细胞具有30-50小时的倍增时间。
实施方式13。实施方式1-12中任一项所述的方法，其中所述
Figure BDA0002784965660000329
细胞表达细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
实施方式14。实施方式1-13所述的方法，其中所述定制的
Figure BDA00027849656600003210
培养基包含0.05-40mg/L的乙醇胺、乙醇胺衍生物或其组合。
实施方式15。实施方式1-14所述的方法，其中所述定制的
Figure BDA00027849656600003211
培养基4.5-20g/L的葡萄糖。
实施方式16。实施方式1-15中任一项所述的方法，其中在所述定制的
Figure BDA00027849656600003212
培养基中进一步补充0.05％至1.0％的HA。
实施方式17。一种细胞培养物，其包含在定制的
Figure BDA00027849656600003213
培养基中的
Figure BDA00027849656600003214
细胞，所述定制的
Figure BDA00027849656600003215
培养基包含基础培养基和一种或多种补充剂，其中所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、HA或其组合；和其中所述基础培养基包含无机盐、维生素和氨基酸。
实施方式18。一种细胞培养物，其包含在定制的
Figure BDA0002784965660000331
培养基中的
Figure BDA0002784965660000332
细胞，所述定制的
Figure BDA00027849656600003312
培养基包含基础培养基和一种或多种补充剂，其中所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物或其组合；和其中所述基础培养基包含无机盐、维生素和氨基酸。
实施方式19。实施方式17或18所述的细胞培养物，其中所述乙醇胺衍生物为乙醇酰胺。
实施方式20。实施方式19所述的细胞培养物，其中所述乙醇酰胺为顺式异油酸乙醇酰胺或油酸乙醇酰胺。
实施方式21。实施方式18所述的细胞培养物，其中所述一种或多种补充剂进一步包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。
实施方式22。实施方式17-21中任一项所述的细胞培养物，其中所述一种或多种补充剂进一步包含0.01％至0.1％的泊洛沙姆188。
实施方式23。实施方式17-22中任一项所述的细胞培养物，其中所述定制的
Figure BDA0002784965660000333
培养基包含4.5-20g/L的葡萄糖。
实施方式24。实施方式17-23中任一项所述的细胞培养物，其中所述一种或多种补充剂包含0.05％至1.0％的HA。
实施方式25。实施方式17-24中任一项所述的细胞培养物，其中所述
Figure BDA0002784965660000334
细胞表达细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
实施方式26。实施方式17-25中任一项所述的细胞培养物，其中所述定制的
Figure BDA0002784965660000335
培养基包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。
实施方式27。实施方式17-26中任一项所述的细胞培养物，其中所述
Figure BDA0002784965660000336
细胞相比于对照
Figure BDA0002784965660000337
细胞具有基本相同或更高的细胞毒性、生长速率和/或存活率。
实施方式28。实施方式17-27中任一项所述的细胞培养物，其中已在所述定制的
Figure BDA0002784965660000338
培养基中培养的
Figure BDA0002784965660000339
细胞具有85-100％的存活率。
实施方式29。实施方式17-28中任一项所述的细胞培养物，其中已在所述定制的
Figure BDA00027849656600003310
培养基中培养的
Figure BDA00027849656600003311
细胞的倍增时间为30-50小时。
实施方式30。实施方式17-29中任一项所述的细胞培养物，其中当使用10：1的效应子：靶标比率时，所述
Figure BDA0002784965660000341
细胞显示60-100％的直接细胞毒性和/或ADCC。
实施方式31。实施方式1-16中任一项所述的方法，其中所述定制的
Figure BDA0002784965660000342
培养基的体积至少为5升。
实施方式32。实施方式17-30中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物的体积至少为5升。
实施方式33。实施方式17-30中任一项所述的细胞培养物，其中所述
Figure BDA0002784965660000343
细胞在被冷冻保存并融化后维持基本相同的存活率和/或细胞毒性。
实施例
以下实施例仅用于说明目的，不应理解为限制。本领域技术人员可以使用将类似地允许他们成功地执行以下实施例的多种替代技术和程序。
实施例1：乙醇胺和HA补充对aNKTM细胞的作用
将aNKTM细胞在含有不同补充剂的基于IMDM的培养基(基础培养基)中的生长与在参照生长培养基中生长的aNKTM细胞进行比较。
目前，在补充有人AB血清和IL-2的参照生长培养基中培养白细胞介素2(IL-2)依赖性
Figure BDA0002784965660000344
亲代细胞系(aNKTM)。在这项研究中，确定了补充人AB血清和IL-2以及其他补充剂的Iscove改良Dulbeco培养基(IMDM)是否可以以与参照生长培养基相似的方式支持aNKTM细胞系的生长、存活率和功能活性。
将在包含人AB血清和IL-2以及其他补充剂(表3)的IMDM基础培养基中培养的aNKTM细胞系的生长、存活率和功能与参照生长培养基进行比较。在每种培养基配方中，在T75组织培养瓶中将aNKTM细胞系培养五个3至4天的生长周期。对于每个生长周期，细胞从～0.3x106个细胞/mL生长至～0.8-1.2x106个细胞/mL每个生长周期。通过接种和收获时的自动细胞计数来确定生长速率和存活率。按照标准方法在第三、第四和第五个生长周期结束时，使用钙黄绿素AM释放测定法以针对K562细胞的细胞毒性来测量功能活性。
表3显示了本研究中使用的多种培养基的配方。
Figure BDA0002784965660000351
1.所有培养基均补充有人AB血清和泊洛沙姆188。
2.亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7μg/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。
3.葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。
在该研究中，两种培养基均补充有人AB血清和白细胞介素2。亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7g/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。
结果示于表4。
Figure BDA0002784965660000361
1.除表中所示的补充剂外，所有培养基均补充了人AB血清和白细胞介素-2。
2.通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器确定的每个生长周期开始和结束时的aNKTM细胞培养物的活细胞密度(VCD)，计算了五个生长周期的平均±标准差倍增时间：Ln2/(Ln(VCD周期结束/VCD周期开始)/周期长度))。
3.根据通过使用NC200自动细胞计数器确定的每个生长周期开始和结束时的aNKTM细胞培养物的细胞存活率，计算了五个生长周期的平均±标准差存活率。
4.按照标准方法使用钙黄绿素释放测定法，测定了针对K562细胞的细胞毒性。
在该研究中，除了表中所示的补充剂外，所有基础培养基均补充有人AB血清和白细胞介素-2。通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器确定的每个生长周期开始和结束时的aNKTM细胞培养物的活细胞密度(VCD)，计算了五个生长周期的平均±标准差倍增时间：Ln2/(Ln(VCD周期结束/VCD周期开始)/周期长度))。根据通过使用NC200自动细胞计数器确定的每个生长周期开始和结束时的aNKTM细胞培养物的细胞存活率，计算了五个生长周期的平均±标准差存活率。按照标准方法使用钙黄绿素释放测定法，测定了对K562细胞的细胞毒性。
如表4所示，虽然aNKTM细胞系在没有特定补充剂的IMDM基础培养基(B组)中生长，但倍增时间和存活率却比在aNKTM参照生长培养基(A组)中生长的对照细胞所显示的更长。此外，在单独的IMDM基础培养基中生长后，aNKTM细胞的细胞毒性就明显不足(B组相比于A组)。
仅补充10.0mg/L胰岛素，5.5mg/L转铁蛋白，6.7μg/L亚硒酸钠(C和H组)的IMDM基础培养基不能恢复aNKTM细胞的细胞毒性。但是，通过向培养基中添加10.0mg/L胰岛素，5.5mg/L转铁蛋白，6.7μg/L亚硒酸钠和2.0mg/L乙醇胺(D和F组)可以恢复细胞毒性。向含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺的IMDM基础配方中添加1％人白蛋白(E组)，可进一步增强细胞毒性。该配方中的葡萄糖浓度从4.5g/L增加到6.5g/L可以提高aNKTM细胞的生长速率(G组)。值得注意的是，在这种最佳IMDM配方中培养的aNKTM细胞系的细胞毒性优于aNKTM参照生长培养基。
该配方中乙醇胺的缺乏增加了平均倍增时间，并略微降低了存活率(I组相比于G组)。此外，在不含乙醇胺的组中，在循环3和5中功能活性降低(I组相比于G组)。
该研究中显示的数据表明补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖、1.0％人白蛋白的IMDM基础培养基相比有包含人AB血清的参照生长培养基具有同等的aNKTM生长速率和存活率，并具有出色的功能活性。
数据显示，在IMDM基础培养基的配方中不存在1％人白蛋白的补充的情况下，乙醇胺增强了aNKTM的功能活性；而在存在1％人白蛋白的情况下，乙醇胺增强了aNKTM的生长速率，并略微增强了aNKTM细胞的功能活性。
实施例2：补充HA和乙醇胺的作用(
Figure BDA0002784965660000381
细胞研究)
在该实施例中，
Figure BDA0002784965660000382
参照生长培养基或补充有多种组分的IMDM被用于生长
Figure BDA0002784965660000383
细胞。除表4中的成分外，所有培养基均补充了人AB血清和泊洛沙姆188。在第三生长周期(周期3)和在第五生长周期(周期5)评估了平均倍增时间，平均存活率，直接细胞毒性和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)进行了评估，并列于表5。
Figure BDA0002784965660000384
Figure BDA0002784965660000391
如表5所示，除了在C组中存在胰岛素、转铁蛋白、硒外具有相同培养基组成的C组和F组显示出良好的并且基本相同的生长速率、存活率、直接细胞毒性和ADCC。相反的是，具有与F组相同的培养基组成但没有乙醇胺的D组的细胞生长速率比F组慢16％(相比于F组的细胞倍增时间44小时，D组的细胞倍增时间为51小时，)。这表明乙醇胺对于维持所需的生长速率是有用的。培养基组成与F组相同但缺少HA的E组显示出较差的细胞毒性，在第3个周期相比于90％仅为55％，而在第5个周期相比于77％仅为57％，表明在定制的
Figure BDA0002784965660000392
培养基中包含HA可以增强
Figure BDA0002784965660000393
细胞的细胞毒性。
实施例3：HA滴定和其他补充剂的作用：胰岛素，转铁蛋白和亚硒酸钠(
Figure BDA0002784965660000394
细 胞研究)
将
Figure BDA0002784965660000395
细胞在含有不同补充剂的IMDM中的生长与参照生长培养基中的
Figure BDA0002784965660000396
细胞进行比较。
在包含人AB血清和泊洛沙姆188的参照生长培养基中培养
Figure BDA0002784965660000397
细胞(经工程化以表达CD16和IL-2的
Figure BDA0002784965660000398
细胞)。在这项研究中，确定了补充人AB血清、泊洛沙姆188和其他补充剂的Iscove的改良Dulbecos培养基(IMDM)可以以类似于
Figure BDA0002784965660000399
参照生长培养基的方式支持
Figure BDA00027849656600003910
细胞的生长、存活率和功能活性。先前的研究表明，补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖和1.0％的人白蛋白的IMDM配方可支持aNKTM细胞系的生长和功能。在这些研究中，乙醇胺和人白蛋白在支持aNKTM的生长和/或功能活性中起着关键作用。因此，进行本研究以确定最佳的基于IMDM的配方是否将支持
Figure BDA0002784965660000401
细胞的生长和功能。
将在包含人AB血清、泊洛沙姆188和其他补充剂(表6)的IMDM基础培养基中培养的
Figure BDA0002784965660000402
细胞系的生长、存活率和功能与
Figure BDA0002784965660000403
参照生长培养基进行比较。由于该实验的主要目的是确定人白蛋白在支持细胞功能中的作用，因此在C至F组中，该试剂的浓度从0.125％依次增加至1.0％。将
Figure BDA0002784965660000404
细胞在多种培养基配方中在T75组织培养瓶中培养五个3至4天的生长周期。对于每个生长周期，将细胞从～0.3x106个细胞/mL生长至～0.8-1.2x106个细胞/mL每个生长周期。通过接种和收获时的自动细胞计数来确定生长速率和存活率。按照标准方法在第三和第五个生长周期结束时，使用钙黄绿素AM释放测定法以针对Ramos细胞系的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和针对K562细胞的直接细胞毒性来测量功能活性。
Figure BDA0002784965660000405
Figure BDA0002784965660000411
1.所有培养基均补充有人AB血清和泊洛沙姆188。
2.亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7μg/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。
3.葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。
在该研究中，两种基础培养基均补充有人AB血清和泊洛沙姆188。亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7g/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。
Figure BDA0002784965660000412
Figure BDA0002784965660000421
1.除表中所示的补充剂外，所有培养基均补充了人AB血清和泊洛沙姆188。
2.通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNKTM细胞培养物的活细胞密度(VCD)，计算了五个生长周期的平均±标准差倍增时间：Ln2/(Ln(VCD周期结束/VCD周期开始)/周期长度))。
3.根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNKTM细胞培养物的细胞存活率，计算了五个生长周期的平均±标准差存活率。
4.按照标准方法使用钙黄绿素AM释放测定法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。
在该研究中，除表中所示的补充剂外，所有基础培养基均补充有人AB血清和泊洛沙姆188。通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNKTM细胞培养物的活细胞密度(VCD)，计算了五个生长周期的平均±标准差倍增时间：Ln2/(Ln(VCD周期结束/VCD周期开始)/周期长度))。根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNKTM细胞培养物的细胞存活率，计算了五个生长周期的平均±标准差存活率。按照标准方法使用钙黄绿素AM释放测定法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。
结果表明，当在含有0.125％人白蛋白的IMDM基础培养基中生长时(C组相比于A组)，
Figure BDA0002784965660000431
细胞表现出与在参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000432
细胞相似的生长速率、存活率和功能活性。尽管增加人白蛋白浓度可增强
Figure BDA0002784965660000433
细胞的功能活性，但随着人白蛋白浓度的升高，细胞系的生长速率降低，且变化更大(D-G组)。相反的是，缺乏人白蛋白(B组)导致可接受的生长速率，但导致了功能活性稍差，表明需要包含该试剂。
最佳IMDM配方中缺少胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺的补充(G组相比于F组)导致
Figure BDA0002784965660000434
细胞的功能活性降低和生长速率略有降低，这表明这些成分中的一种或多种是支持生长和功能活动所需要的。通过补充乙醇胺(G组相比于I组)可以稍微恢复
Figure BDA0002784965660000435
细胞的生长速率和功能活性，这表明该化合物应与人白蛋白一起纳入IMDM配方中。
该研究的结果表明补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖、0.125％的人白蛋白的IMDM基础培养基支持
Figure BDA0002784965660000441
细胞具有与在参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000442
细胞相比同等的生长速率、存活率和功能活性。这些数据还表明，补充人白蛋白可增强在IMDM基础培养基配方中生长的
Figure BDA0002784965660000443
细胞的功能活性。但是，该试剂的浓度较高会减慢细胞生长。此外，结果提供了证据，证明乙醇胺是胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺中的关键成分，有助于维持IMDM基础培养基配方中
Figure BDA0002784965660000444
的生长速率和功能活性。
实施例4：确定人白蛋白和乙醇胺的最佳浓度(
Figure BDA0002784965660000445
细胞研究)：
确定了在IMDM基础培养基中用于
Figure BDA0002784965660000446
细胞(经工程化以表达CD16和IL-2的
Figure BDA0002784965660000447
)的生长和功能的人白蛋白和乙醇胺的最佳浓度。培养基不含胰岛素、转铁蛋白或亚硒酸钠。
先前的研究表明，含有人AB血清和泊洛沙姆188，并另外补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖、0.125％的人白蛋白的IMDM基础培养基将支持
Figure BDA0002784965660000448
细胞的生长和功能活性。此外，这些研究表明，人白蛋白和乙醇胺是该配方在支持
Figure BDA0002784965660000449
细胞生长和/或功能中的潜在关键成分。因此，本研究试图确定在不补充胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠的IMDM基础培养基配方中这些试剂的最佳浓度。
在多参数格式中在24孔G-Rex板中测试了在补充有人AB血清、泊洛沙姆188、2.0g/L葡萄糖和一定范围浓度的乙醇胺和人白蛋白的IMDM基础培养基配方中培养的
Figure BDA00027849656600004410
细胞的生长和存活率(表8)。研究中包括的对照组包括对照生长培养基和还补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖、1.0％的人白蛋白的含人AB血清和泊洛沙姆188的IMDM基础培养基的重复孔。在G-Rex平板中在每种培养基配方中将
Figure BDA0002784965660000451
细胞系培养五个3至4天的生长周期。对于每个生长周期，将细胞从～0.3x106个细胞/mL生长至～0.8-1.2x106个细胞/mL每个生长周期。细胞生长速率和存活率通过使用NC-200TM进行自动细胞计数来确定。
在第五个生长周期后，将选择的组转移至T75烧瓶中并培养单个生长周期，并使用钙黄绿素AM释放测定法以针对Ramos细胞系的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和针对K562细胞的直接细胞毒性来测量功能活性。
Figure BDA0002784965660000452
在该研究中，第1-5列的孔含有补充了人AB血清、泊洛沙姆188、2.0g/L葡萄糖以及指定浓度的乙醇胺(EA)和人白蛋白(HA)的IMDM基础培养基。对照孔A6和B6含有参照生长培养基；对照孔C6和D6包含补充了人AB血清、泊洛沙姆188、10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖和1.0％的人白蛋白的IMDM基础培养基。
表9总结了培养基配方中
Figure BDA0002784965660000453
细胞的生长速率和存活率。
Figure BDA0002784965660000454
Figure BDA0002784965660000461
1.使用以下方程式，根据通过使用自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的
Figure BDA0002784965660000462
细胞培养物的活细胞密度(VCD)，计算五个生长周期的平均±标准差倍增时间：Ln2/(Ln(VCD周期结束/VCD周期开始)/周期长度))。倍增时间显示在表格中每个单元格的顶部。
2.根据使用自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的
Figure BDA0002784965660000463
细胞培养物的细胞存活率，计算五个生长周期的平均±标准差存活率。存活率显示在表中每个单元格的底部。
3.第1-5列中的孔含有补充了人AB血清、泊洛沙姆188、2g/L的葡萄糖以及指定浓度的乙醇胺(EA)和人白蛋白(HA)的IMDM基础培养基。
4.对照孔A6和B6包含
Figure BDA0002784965660000464
参照生长培养基；对照孔C6和D6包含补充了人AB血清、泊洛沙姆188、10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖和1.0％的人白蛋白的IMDM基础培养基。
在这项研究中，使用以下方程式，根据通过使用自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的
Figure BDA0002784965660000465
细胞培养物的活细胞密度(VCD)，计算了五个生长周期的平均±标准差倍增时间：Ln2/(Ln(VCD周期结束/VCD周期开始)/周期长度))。倍增时间显示在表格中每个单元格的顶部。
根据使用使用自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的
Figure BDA0002784965660000471
细胞培养物的细胞存活率，计算五个生长周期的平均±标准差存活率。存活率显示在表9中每个单元格的底部。
第1-5列的孔包含补充有人AB血清、泊洛沙姆188、2g/L葡萄糖和指定浓度的乙醇胺(EA)和人白蛋白(HA)的IMDM基础培养基。对照孔A6和B6包含参照生长培养基；对照孔C6和D6包含补充了人AB血清、泊洛沙姆188、10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖和1.0％的人白蛋白的IMDM基础培养基。
在包含0-20mg/L乙醇胺和0.0％-0.5％人白蛋白的IMDM基础培养基配方中生长的
Figure BDA0002784965660000472
细胞之间的倍增时间和存活率相似。但是，含有200mg/L的乙醇胺的培养基配方显示出更高且更可变的倍增时间，表明在此浓度的乙醇胺会抑制
Figure BDA0002784965660000473
细胞的生长。
没有一种测试配方显示出比参照生长培养基对照更高的生长速率或存活率，表明补充乙醇胺和人白蛋白的组合不能弥补IMDM基础配方中胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠的缺乏。
IMDM对照配方表现出比参照生长培养基对照和测试配方更长的倍增时间，这与先前较高浓度的人白蛋白抑制
Figure BDA0002784965660000474
细胞的生长的观察结果一致。
为了进行功能测试，将选择的组在T75烧瓶中扩增一个生长周期，并测试针对K562细胞的直接细胞毒性和针对Ramos细胞的ADCC(表10)。
Figure BDA0002784965660000475
Figure BDA0002784965660000481
1.除所列补充剂外，IMDM基础培养基还补充了人AB血清、泊洛沙姆188、2g/L的葡萄糖。
2.按照标准方法通过使用钙黄绿素AM释放测定法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。
在该研究中，除了所列补充剂外，基础培养基还补充有人AB血清、泊洛沙姆188、2.0g/L的葡萄糖。通过使用钙黄绿素AM释放测定法按照标准方法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。
在含有0.25％人白蛋白且具有浓度降低的乙醇胺的IMDM基础培养基中培养的
Figure BDA0002784965660000482
细胞系显示出相似的针对Ramos细胞的ADCC和针对K562靶细胞的直接细胞毒性。相反，当培养基中不含乙醇胺时，在含有0.125％的人白蛋白的IMDM基础培养基中培养的细胞显示出针对K562的直接细胞毒性下降。因此，在不补充胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠的情况下，当IMDM基础配方中的人白蛋白降低时，乙醇胺可能支持
Figure BDA0002784965660000491
的功能活性。
结果表明，在IMDM基础培养基(包含人AB血清和泊洛沙姆188)中补充0.2-20mg/L的乙醇胺和0.125％-0.5％的HA不会改变
Figure BDA0002784965660000492
细胞的存活率。2或20mg/L的乙醇胺增强了在补充有0.125％的人白蛋白的IMDM基础培养基中的
Figure BDA0002784965660000493
细胞的直接细胞毒性。
在本研究中测试的IMDM基础配方中的
Figure BDA0002784965660000494
细胞的生长速率和功能活性低于参照生长培养基对照中的细胞的生长速率和功能活性，这表明胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠补充剂的存在对于维持所述细胞系的功能活性和生长速率是有用的。
实施例5：在有和没有乙醇胺补充的情况下评估
Figure BDA0002784965660000495
细胞的生长
在具有和不具有乙醇胺补充的IMDM基础培养基的当前配方中评估了
Figure BDA0002784965660000496
细胞的生长，并与参照生长培养基中的
Figure BDA0002784965660000497
细胞的生长和功能进行了比较。
如实施例3所示，包含人AB血清和泊洛沙姆188并另外补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0mg/L的乙醇胺、2.0g/L的葡萄糖、0.125％的人白蛋白的的IMDM基础培养基将支持
Figure BDA0002784965660000498
细胞的生长和功能活性。如实施例4所示，乙醇胺在添加有人AB血清、泊洛沙姆188和2.0g/L葡萄糖的IMDM基础培养基中在存在0.125％人白蛋白的情况下增强了
Figure BDA0002784965660000499
细胞的功能活性。因此，本研究想证实，不论是否另外补充2.0mg/L的乙醇胺，包含人AB血清和泊洛沙姆188并另外补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0g/L的葡萄糖、0.125％人白蛋白的基于IMDM的配方都将支持
Figure BDA00027849656600004910
细胞的生长和功能。
将在含有人AB血清、泊洛沙姆188和其他补充剂的IMDM基础培养基中培养的
Figure BDA00027849656600004911
细胞的生长、存活率和功能与在
Figure BDA00027849656600004912
参照生长培养基中培养的
Figure BDA00027849656600004913
细胞进行比较。由于该实验的关键目标是确定乙醇胺在支持细胞生长和功能中的作用，因此将该试剂从C组中使用的培养基配方中排除(表11)。将
Figure BDA0002784965660000501
细胞在每种培养基配方中在T75组织培养瓶中培养五个3至4天的生长周期。对于每个生长周期，将细胞从～0.3x106个细胞/mL生长至～0.8-1.2x106个细胞/mL每个生长周期。通过接种和收获时的自动细胞计数来确定生长速率和存活率。按照标准方法在第三和第五个生长周期结束时，使用钙黄绿素AM释放测定法以针对Ramos细胞系的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和针对K562细胞的直接细胞毒性来测量功能活性。
Figure BDA0002784965660000502
1.两种基础培养基均补充了人AB血清和泊洛沙姆188。
2.亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7μg/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。
3.葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。
在本研究中，两种基础培养基均补充有人AB血清和泊洛沙姆188。亚硒酸钠以17μg/L存在于IMDM基础培养基配方。向培养基中补充6.7g/L的亚硒酸钠以获得最终浓度为23.7μg/L的亚硒酸钠。葡萄糖以4.5g/L存在于IMDM基础培养基配方中。向培养基中补充2.0g/L的葡萄糖以获得最终浓度为6.5g/L的葡萄糖。
表12中总结了本研究的结果。
Figure BDA0002784965660000511
1.除表中所示的补充剂外，所有基础培养基均补充了人AB血清和泊洛沙姆188。
2.通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的
Figure BDA0002784965660000512
细胞培养物的活细胞密度(VCD)，计算了五个生长周期的平均±标准差倍增时间：Ln2/(Ln(VCD周期结束/VCD周期开始)/周期长度))。
3.根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNKTM细胞培养物的细胞存活率，计算了五个生长周期的平均±标准差存活率。
4.按照标准方法使用钙黄绿素AM释放测定法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。
除表中所示的补充剂外，所有基础培养基均补充了人AB血清和泊洛沙姆188。
通过使用以下方程式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的
Figure BDA0002784965660000513
细胞培养物的活细胞密度(VCD)，计算了五个生长周期的平均±标准差倍增时间：Ln2/(Ln(VCD周期结束/VCD周期开始)/周期长度))。
根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的aNKTM细胞培养物的细胞存活率，计算了五个生长周期的平均±标准差存活率。
按照标准方法使用钙黄绿素AM释放测定法，测定了针对Ramos细胞的ADCC和针对K562细胞的直接细胞毒性。
当细胞在含有具有(B组相比于A组)和不具有(C组相比于A组)乙醇胺的补充剂的IMDM基础培养基中生长时，
Figure BDA0002784965660000521
细胞表现出与在参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000522
细胞相似的生长速率和存活率。但是，在不添加乙醇胺补充的情况下，在第3个周期
Figure BDA0002784965660000523
细胞系的直接细胞毒性功能受到了一定程度的损害，而在第5个周期则受到了更严重的损害(表12和图1)，这表明乙醇胺对于维持在当前基于IMDM的培养基配方中的功能活性很重要。如图1所示，
Figure BDA0002784965660000524
细胞在指定的培养基中生长五个生长周期，并在基于钙黄绿素AM的细胞毒性试验中以指定的效应子与靶标比率评估其对K562细胞的直接细胞毒性活性。在补充了乙醇胺的培养基(“IMDM+胰岛素，转铁蛋白、硒、乙醇胺”)中，
Figure BDA0002784965660000525
细胞系的直接细胞毒性功能显著高于未补充乙醇胺的培养基(“IMDM+胰岛素、转铁蛋白、硒”)。
结果表明，含有人AB血清和泊洛沙姆188并另外补充有10mg/L的胰岛素、5.5mg/L的转铁蛋白、6.7μg/L的亚硒酸钠、2.0g/L的葡萄糖、0.125％的人白蛋白和2.0mg/L乙醇胺的IMDM基础培养基支持
Figure BDA0002784965660000526
细胞具有与在
Figure BDA0002784965660000527
参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000528
细胞同等的生长速率、存活率和功能活性。结果还表明，补充乙醇胺可增强在IMDM基础培养基配方中生长的
Figure BDA0002784965660000529
细胞的功能活性。
实施例6：表型(
Figure BDA00027849656600005210
细胞研究)
通过流式细胞术测定在表13中所述的培养基组合物中生长的
Figure BDA00027849656600005211
细胞的
Figure BDA00027849656600005212
细胞的多种标志物，CD56、CD3、CD54、CD16、NKG2D和NKp30的表面表达。表13中显示了标志物的细胞表面标志物表达的百分比。
Figure BDA0002784965660000541
*请注意
Figure BDA0002784965660000551
参照是指在含有人AB血清和泊洛沙姆188的参照生长培养基中生长的
Figure BDA0002784965660000552
细胞。
结果显示，C-F组中的细胞均具有在目标范围内的标志物的表达，这表明本文所公开的
Figure BDA0002784965660000553
培养基不影响
Figure BDA0002784965660000554
细胞表型。
实施例7：
Figure BDA0002784965660000555
细胞在
Figure BDA0002784965660000556
培养基中的大规模扩增
为了确定培养基配方的稳健性和可扩展性，将
Figure BDA0002784965660000557
细胞在生物反应器中在表14和15中所述的
Figure BDA0002784965660000558
培养基中以等于或大于5升的大规模培养体积生长。使细胞从～0.3x106个细胞/mL生长到～0.8-1.2x106个细胞/mL每个生长周期，并通过接种和收获时的自动细胞计数来确定生长速率(倍增时间)和存活率。按照标准方法在生产过程中和冻存及解冻后使用钙黄绿素AM释放测定法在1μg的Rituxan存在下以针对Ramos细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)测量细胞活性。使用流式细胞术测量NK-92细胞多种标志物，CD56、CD3、CD54、CD16、NKG2D、NKp30的表面表达。标志物的细胞表面标志物表达的百分比在下表15中显示。
表14–按比例放大
Figure BDA0002784965660000559
细胞：生长、存活率和细胞毒性功能
Figure BDA00027849656600005510
1除了表中所示的补充配方外，还在
Figure BDA00027849656600005511
培养基中补充了5％的人AB血清和0.05％的泊洛沙姆188。
2通过使用以下公式，并根据通过使用NC200自动细胞计数器而确定的每个生长周期开始和结束时的细胞培养物的活细胞密度(VCD)，计算了每个生长周期中的平均±标准差倍增时间：Ln2/(Ln(VCD周期结束/VCD周期开始)/周期长度))。
3平均存活率是使用NC200自动细胞计数器在指定的过程阶段进行测量的。
4按照标准方法使用钙黄绿素AM释放测定法在1μg的Rituxan存在下，在指定的过程阶段测量了在针对Ramos靶细胞的效应子/靶标(E：T)的比率为10的平均±标准偏差％ADCC。
表15–按比例放大
Figure BDA0002784965660000561
细胞：免疫表型特征
Figure BDA0002784965660000562
1除表中所示的补充剂外，还在定制的
Figure BDA0002784965660000563
基础培养基中补充了5％的人AB血清和0.05％的泊洛沙姆188。
应当理解的是，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明性目的，并且本领域技术人员将提出基于其的各种修改或改变，这些修改或改变将被包括在本申请的精神和范围之内以及所附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文。
非正式序列表
SEQ ID NO:1高亲和力变体免疫球蛋白γFc区受体III-A核酸序列(全长形式)。
ATGTGGCA GCTGCTGCTG CCTACAGCTC TCCTGCTGCT GGTGTCCGCC GGCATGAGAACCGAGGATCT GCCTAAGGCC GTGGTGTTCC TGGAACCCCA GTGGTACAGA GTGCTGGAAA AGGACAGCGTGACCCTGAAG TGCCAGGGCG CCTACAGCCC CGAGGACAAT AGCACCCAGT GGTTCCACAA CGAGAGCCTGATCAGCAGCC AGGCCAGCAG CTACTTCATCGACGCCGCCA CCGTGGACGA CAGCGGCGAG TATAGATGCCAGACCAACCT GAGCACCCTGAGCGACCCCG TGCAGCTGGA AGTGCACATC GGATGGCTGC TGCTGCAGGCCCCCAGATGGGTGTTCAAAG AAGAGGACCC CATCCACCTG AGATGCCACT CTTGGAAGAACACCGCCCTGCACAAAGTGA CCTACCTGCA GAACGGCAAG GGCAGAAAGT ACTTCCACCA CAACAGCGACTTCTACATCC CCAAGGCCAC CCTGAAGGAC TCCGGCTCCT ACTTCTGCAG AGGCCTCGTGGGCAGCAAGAACGTGTCCAG CGAGACAGTG AACATCACCA TCACCCAGGG CCTGGCCGTGTCTACCATCA GCAGCTTTTTCCCACCCGGC TACCAGGTGT CCTTCTGCCT CGTGATGGTGCTGCTGTTCG CCGTGGACAC CGGCCTGTACTTCAGCGTGA AAACAAACAT CAGAAGCAGCACCCGGGACT GGAAGGACCA CAAGTTCAAG TGGCGGAAGGACCCCCAGGA CAAGTGA
SEQ ID NO:2高亲和力变体免疫球蛋白γFc区受体III-A氨基酸序列(全长形式)。以下划线标记第176位处的Val。
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala GlyMet Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr ArgVal Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu AspAsn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser TyrPhe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn LeuSer Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu GlnAla Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser TrpLys AsnThr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys TyrPhe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly SerTyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn IleThr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly TyrGln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu TyrPhe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys PheLys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
SEQ ID NO:3ER IL-2核酸序列
ATGTACCGGATG CAGCTGCTGA GCTGTATCGC CCTGTCTCTG GCCCTCGTGA CCAACAGCGCCCCTACCAGC AGCAGCACCA AGAAAACCCA GCTGCAGCTG GAACATCTGC TGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGGCA TCAACAACTA CAAGAACCCC AAGCTGACCC GGATGCTGACCTTCAAGTTC TACATGCCCAAGAAGGCCAC CGAACTGAAA CATCTGCAGT GCCTGGAAGAGGAACTGAAG CCCCTGGAAG AAGTGCTGAACCTGGCCCAG AGCAAGAACT TCCACCTGAGGCCCAGGGAC CTGATCAGCA ACATCAACGT GATCGTGCTGGAACTGAAAG GCAGCGAGACAACCTTCATG TGCGAGTACG CCGACGAGAC AGCTACCATC GTGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTC TGCCAGAGCA TCATCAGCAC CCTGACCGGC TCCGAGAAGG ACGAGCTGTGA
SEQ ID NO:4ER IL-2(ER保留信号以下划线标记)氨基酸序列
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu ValThr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu HisLeu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro LysLeu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu LysHis Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu AlaGln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val IleVal Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu ThrAla Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile SerThr Leu Thr Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu

Claims (33)

1.一种培养
Figure FDA0002784965650000011
细胞的方法，其包括在定制的
Figure FDA0002784965650000012
培养基中培养
Figure FDA0002784965650000013
细胞，所述定制的
Figure FDA0002784965650000014
培养基包含基础培养基和一种或多种补充剂，
其中所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、HA或其组合；和
其中所述基础培养基包含无机盐、维生素和氨基酸。
2.权利要求1所述的方法，其中所述乙醇胺衍生物为乙醇酰胺。
3.权利要求2所述的方法，其中所述乙醇酰胺为异油酸乙醇酰胺或油酸乙醇酰胺，软脂酸乙醇酰胺或硬脂酸乙醇酰胺。
4.权利要求1所述的方法，其中所述乙醇胺衍生物是磷脂酰乙醇胺。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂包含1-7％的人AB血清。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂进一步包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂进一步包含300-600IU/mL白细胞介素-2。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种补充剂进一步包含0.01％至0.1％的泊洛沙姆188。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在所述定制的
Figure FDA0002784965650000015
培养基中培养的
Figure FDA0002784965650000016
细胞相比于在参照生长培养基中生长的
Figure FDA0002784965650000017
细胞具有基本相同或更高的细胞毒性、生长速率和存活率。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述定制的
Figure FDA0002784965650000018
培养基中培养的
Figure FDA0002784965650000019
细胞具有85-100％的存活率。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在所述定制的
Figure FDA00027849656500000110
培养基中培养的
Figure FDA00027849656500000111
细胞在效应子与靶标比率为10：1时显示60-100％的直接细胞毒性和/或ADCC。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在所述定制的
Figure FDA0002784965650000021
培养基中培养的
Figure FDA0002784965650000022
细胞具有30-50小时的倍增时间。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述
Figure FDA0002784965650000023
细胞表达细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
14.权利要求1至13所述的方法，其中所述定制的
Figure FDA0002784965650000024
培养基包含0.05-40mg/L的乙醇胺、乙醇胺衍生物或其组合。
15.权利要求1-14所述的方法，其中所述定制的
Figure FDA0002784965650000025
培养基4.5-20g/L的葡萄糖。
16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在所述定制的
Figure FDA0002784965650000026
培养基中进一步补充0.05％至1.0％的HA。
17.一种细胞培养物，其包含在定制的
Figure FDA0002784965650000027
培养基中的
Figure FDA0002784965650000028
细胞，所述定制的
Figure FDA0002784965650000029
培养基包含基础培养基和一种或多种补充剂，
其中所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、HA或其组合；和
其中所述基础培养基包含无机盐、维生素和氨基酸。
18.一种细胞培养物，其包含在定制的
Figure FDA00027849656500000210
培养基中的
Figure FDA00027849656500000211
细胞，所述定制的
Figure FDA00027849656500000212
培养基包含基础培养基和一种或多种补充剂，
其中所述一种或多种补充剂包含乙醇胺、乙醇胺衍生物或其组合；和
其中所述基础培养基包含无机盐、维生素和氨基酸。
19.权利要求17或18所述的细胞培养物，其中所述乙醇胺衍生物为乙醇酰胺。
20.权利要求19所述的细胞培养物，其中所述乙醇酰胺为顺式异油酸乙醇酰胺或油酸乙醇酰胺。
21.权利要求18所述的细胞培养物，其中所述一种或多种补充剂进一步包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。
22.权利要求17-21中任一项所述的细胞培养物，其中所述一种或多种补充剂进一步包含0.01％至0.1％的泊洛沙姆188。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的细胞培养物，其中所述定制的
Figure FDA0002784965650000031
培养基包含4.5-20g/L的葡萄糖。
24.权利要求17-23中任一项所述的细胞培养物，其中所述一种或多种补充剂包含0.05％至1.0％的HA。
25.权利要求17至24中任一项所述的细胞培养物，其中所述
Figure FDA0002784965650000032
细胞表达细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
26.权利要求17-25中任一项所述的细胞培养物，其中所述定制的
Figure FDA0002784965650000033
培养基包含胰岛素、转铁蛋白、硒或其组合。
27.权利要求17-26中任一项所述的细胞培养物，其中所述
Figure FDA0002784965650000034
细胞相比于对照
Figure FDA0002784965650000035
细胞具有基本相同或更高的细胞毒性、生长速率和/或存活率。
28.权利要求17-27中任一项所述的细胞培养物，其中已在所述定制的
Figure FDA0002784965650000036
培养基中培养的
Figure FDA0002784965650000037
细胞具有85-100％的存活率。
29.权利要求17-28中任一项所述的细胞培养物，其中已在所述定制的
Figure FDA0002784965650000038
培养基中培养的
Figure FDA0002784965650000039
细胞的倍增时间为30-50小时。
30.权利要求17-29中任一项所述的细胞培养物，其中当使用10：1的效应子：靶标比率时，所述
Figure FDA00027849656500000310
细胞显示60-100％的直接细胞毒性和/或ADCC。
31.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述定制的
Figure FDA00027849656500000311
培养基的体积至少为5升。
32.权利要求17至30中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物的体积至少为5升。
33.权利要求17至30中任一项所述的细胞培养物，其中所述
Figure FDA00027849656500000312
细胞在被冷冻保存并融化后维持基本相同的存活率和/或细胞毒性。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3829605A4 (en) 2018-08-01 2022-10-19 ImmunityBio, Inc. QUADRICISTRONIC SYSTEM WITH A HOMING RECEPTOR OR A CYTOKINE AND A CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR GENETIC MODIFICATION OF IMMUNOTHERAPIES
US11230699B2 (en) 2020-01-28 2022-01-25 Immunitybio, Inc. Chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells targeting EGFR super-family receptors
KR102420141B1 (ko) 2021-03-17 2022-07-13 구스타 주식회사 Nk세포 배양 배지 조성물을 이용한 여성 면역활성 및 안정성이 향상된 신바이오틱스 유산균 제조방법
KR102445491B1 (ko) * 2021-06-30 2022-09-21 엔케이젠 주식회사 자연살해세포 배양용 배지 및 이를 이용한 자연살해세포 대량증식방법
WO2023075346A1 (ko) * 2021-10-25 2023-05-04 재단법인대구경북과학기술원 항산화 기전 조절을 통한 자연살해세포의 항암 기능 향상
WO2023146008A1 (ko) * 2022-01-28 2023-08-03 엔케이메딕스 주식회사 알로페론으로 배양된 nk 세포를 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR102626708B1 (ko) * 2022-01-28 2024-01-18 엔케이메딕스 주식회사 알로페론을 포함하는 nk세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 nk 세포 배양방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107674860A (zh) * 2017-07-14 2018-02-09 上海源培生物科技股份有限公司 Nk92细胞无血清培养基

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE323756T1 (de) 1997-04-30 2006-05-15 Hans Klingemann Natürliche killerzelllinien und verfahren zu ihrer verwendung
US8034332B2 (en) 1997-04-30 2011-10-11 Conkwest, Inc. Interleukin-secreting natural killer cell lines and methods of use
WO1999024566A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Roche Diagnostics Gmbh Tumor-specific antigens, methods for their production and their use for immunization and diagnosis
EP1117691A1 (en) 1998-10-05 2001-07-25 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for producing human tumor antigen specific antibodies
US7098008B2 (en) 2000-04-25 2006-08-29 Ic&G Do. Ltd. Selected primers for detection of MAGE or GAGE genes for diagnosis of cancer and methods of use
DK2921500T3 (da) 2004-07-10 2023-09-18 The Institute For Cancer Res Genetisk modificerede, humane, naturlige dræbercellelinjer
US20130189268A1 (en) 2010-06-22 2013-07-25 Precision Biologics, Inc. Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies
EP3012268B1 (en) 2010-09-08 2017-11-15 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Chimeric antigen receptors with an optimized hinge region
WO2013051718A1 (ja) 2011-10-07 2013-04-11 国立大学法人三重大学 キメラ抗原受容体
AU2012325915A1 (en) 2011-10-20 2014-04-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD22 chimeric antigen receptors
ES2714523T3 (es) 2012-09-04 2019-05-28 Cellectis Receptor quimérico de antígenos multicatenario y usos del mismo
US20150329640A1 (en) 2012-12-20 2015-11-19 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107674860A (zh) * 2017-07-14 2018-02-09 上海源培生物科技股份有限公司 Nk92细胞无血清培养基

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NOWAKOWSKA P: "Establishment of a good manufacturing practice-compliant procedure for expansion of therapeutic doses of genetically modified, CAR expressing NK-92 cells for the treatment of ErbB2-positive malignancies", VOM FACHBEREICH BIOLOGIE DER TECHNISCHEN UNIVERSITÄT DARMSTADT *
YK TAM 等: "Ex vivo expansion of the highly cytotoxic human natural killer-92 cell-line under current good manufacturing practice conditions for clinical adoptive cellular immunotherapy", CYTOTHERAPY, pages 259 - 272 *

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