JP2024023513A - 臨床のための、改変されたＮＫ－９２ ｈａＮＫ００３細胞 - Google Patents

Abstract

【課題】改変されたNK-92細胞の集団、該細胞を含む組成物およびキット、ならびに該細胞の集団を作製する方法および用いる方法を提供する。【解決手段】CD16およびIL-2の両方を含む異種性の核酸分子を含む、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ADCC）を有する改変されたNK-92細胞の集団であって、該細胞の集団中の90%超の細胞がCD56、CD16、CD54、およびNKp30を発現し、該細胞の集団中の5%未満の細胞がCD3を発現する、改変されたNK-92細胞の集団を提供する。【選択図】図１

Description

背景
モノクローナル抗体（mAb）を用いた抗がん治療は、がんを有する患者における臨床転帰を有意に改善してきている。治療用抗体の主要な作用機序の1つは、抗体依存性細胞傷害（ADCC）によるものである。ナチュラルキラー細胞は、ADCCの主要なエフェクター細胞であるため、細胞に基づく免疫療法のための細胞傷害性エフェクター細胞として使用され得る。

NK-92は、非ホジキンリンパ腫に罹患している対象の血液中で発見され、そしてその後エクスビボで不死化された、細胞溶解性のがん細胞株である。NK-92細胞はNK細胞に由来するが、活性化受容体の大多数を保持する一方で、正常なNK細胞によって提示される主要な抑制性受容体を欠く。NK-92細胞はしかしながら、正常な細胞を攻撃せず、ヒトにおいて好ましくない免疫拒絶応答を誘発することもない。NK-92細胞株の特徴付けは、国際公開公報第1998/49268号（特許文献１）および米国特許出願公開第2002-0068044号（特許文献２）に開示されている。NK-92細胞はまた、ある種のがんの治療において潜在的な治療剤として評価されている。

NK-92細胞は、NK細胞に関連する活性化受容体および細胞溶解経路のほぼすべてを保持するものの、その細胞表面上にCD16を発現しない。CD16は、抗体のFc部分を認識しそしてこれに結合して、ADCCエフェクター機構のためにNK細胞を活性化する、Fc受容体である。未改変のNK-92細胞は、CD16受容体を欠くため、ADCC機構を介して標的細胞を溶解することができない。

国際公開公報第1998/49268号 米国特許出願公開第2002-0068044号

概要
本明細書において、改変されたNK-92細胞の集団、該細胞を含む組成物およびキット、ならびに該細胞の集団を作製する方法および用いる方法が、提供される。
[本発明1001]
CD16（SEQ ID NO:3）およびIL-2（SEQ ID NO:5）の両方を含む異種性の核酸分子を含む、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ADCC）を有する改変されたNK-92細胞の集団であって、
該細胞の集団中の90%超の細胞がCD56、CD16、CD54、およびNKp30を発現し、該細胞の集団中の5%未満の細胞がCD3を発現する、
改変されたNK-92細胞の集団。
[本発明1002]
核酸分子がDNA分子である、本発明1001の細胞。
[本発明1003]
核酸分子が、5’から3’へ、CD16をコードする配列、IRES配列、およびIL-2をコードする配列を含む、本発明1001の細胞。
[本発明1004]
細胞が、第17番染色体上にSEQ ID NO:1を含む、本発明1001～1003のいずれかの細胞。
[本発明1005]
細胞の平均倍加時間が55～70時間である、本発明1001～1004のいずれかの細胞。
[本発明1006]
細胞の集団が、平均倍加時間を、1日から、2日、3日、4日、5日、10日、15日、20日、または25日維持する、本発明1001～1005のいずれかの細胞。
[本発明1007]
細胞の集団が、1、2、3、または4日ごとに継代されることができる、本発明1001～1006のいずれかの細胞。
[本発明1008]
細胞が、細胞100万個あたり10～60 pg／時間の濃度でIL-2を分泌する、本発明1001～1007のいずれかの細胞。
[本発明1009]
細胞が、照射された細胞である、本発明1001～1007のいずれかの細胞。
[本発明1010]
細胞が、対照と比較して、CD16発現の下方制御が減少している、本発明1001～1009のいずれかの細胞。
[本発明1011]
細胞が、対照と比較して、ADCC後により高いレベルのCD16を維持する、本発明1001～1009のいずれかの細胞。
[本発明1012]
本発明1001～1011のいずれかの細胞の集団を含む、キット。
[本発明1013]
抗体をさらに含む、本発明1012のキット。
[本発明1014]
本発明1001～1011のいずれかの細胞の集団、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1015]
本発明1014の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法。

図1AはhaNK003細胞の拡大を示すグラフである。図1BはhaNK003細胞の集団倍加レベル（PDL）を示すグラフである。生存率（%）、細胞の密度（細胞／mL）、および累積PDLは、拡大期間の間モニターされた。 aNK細胞およびhaNK003細胞における表面マーカーの発現の、代表的なヒストグラムを示す。 aNK細胞およびhaNK003細胞における表面マーカーの発現の、代表的なヒストグラムを示す。 K562細胞に対するhaNK003細胞の自然細胞傷害を示すグラフである。 Raji細胞に対するhaNK003細胞の自然細胞傷害を示すグラフである。 SKOV3細胞に対するhaNK003細胞の自然細胞傷害を示すグラフである。 SKBR3細胞に対するhaNK003細胞の自然細胞傷害を示すグラフである。 図4AはRaji細胞に対するhaNK003細胞のADCCを示すグラフである。図4BはSKOV3細胞に対するhaNK003細胞のADCCを示すグラフである。図4CはSKBR3細胞に対するhaNK003細胞のADCCを示すグラフである。 K562細胞に対する、照射されたhaNK003細胞 対 非照射のhaNK003細胞の、自然細胞傷害活性を示すグラフである。haNK003細胞は、偽照射された（実線）か、または10 Gyで照射された。照射されたhaNK003のK562細胞に対する細胞傷害活性は、照射後6時間（破線）または24時間（点線）の時点でアッセイされた。 DOHH2細胞に対する、照射されたhaNK003細胞 対 非照射のhaNK003細胞の、自然細胞傷害活性を示すグラフである。haNK003細胞は、偽照射された（実線）か、または10 Gyで照射された。照射された haNK003のDOHH2細胞に対する細胞傷害活性は、照射後6時間（破線）または24時間（点線）の時点でアッセイされた。細胞死によってhaNK003細胞の数が不十分となったため、20:1のE:T比についてのデータ点は、照射された細胞については取得されなかったことに注意。 DOHH2細胞に対する、照射されたhaNK003細胞 対 非照射のhaNK003細胞の、ADCC活性を示すグラフである。haNK003細胞は、偽照射された（黒い記号）か、または10 Gyで照射された（白い記号）。照射されたhaNK003および非照射のhaNK003のDOHH2細胞に対するADCC活性は、Rituxan（四角）もしくはDOHH2細胞と反応しないHerceptin（三角）と組み合わせて、照射後6時間（破線）または24時間（点線）の時点でアッセイされた。細胞死によってhaNK003細胞の数が不十分となったため、20:1のE:T比についてのデータ点は、24時間の時点での照射された細胞については取得されなかったことに注意。 サンドイッチELISAの実験番号1によって決定されたときの、6、12、24、および48時間（h）の時点での、照射された細胞 対 非照射の細胞の、細胞1 x 10⁶個あたりの放出されたIL-2（pg/mL）を示すグラフである。 サンドイッチELISAの実験番号2によって決定されたときの、6、12、24、および48時間（h）の時点での、照射された細胞 対 非照射の細胞の、細胞1 x 10⁶個あたりの放出されたIL-2（pg/mL）を示すグラフである。 マルチプレックスELISAの実験番号1によって決定されたときの、6、12、24、および48時間（h）の時点での、照射された細胞 対 非照射の細胞の、細胞1 x 10⁶個あたりの放出されたIL-2（pg/mL）を示すグラフである。 マルチプレックスELISAの実験番号2によって決定されたときの、6、12、24、および48時間（h）の時点での、照射された細胞 対 非照射の細胞の、細胞1 x 10⁶個あたりの放出されたIL-2（pg/mL）を示すグラフである。 サンドイッチELISAの実験番号1によって決定されたときの、6、12、24、および48時間（h）の時点での、照射された細胞 対 非照射の細胞の、細胞1 x 10⁶個あたりの全細胞内IL-2含有量（pg）を示すグラフである。 サンドイッチELISAの実験番号2によって決定されたときの、6、12、24、および48時間（h）の時点での、照射された細胞 対 非照射の細胞の、細胞1 x 10⁶個あたりの全細胞内IL-2含有量（pg）を示すグラフである。 マルチプレックスELISAの実験番号1によって決定されたときの、6、12、24、および48時間（h）の時点での、照射された細胞 対 非照射の細胞の、細胞1 x 10⁶個あたりの全細胞内IL-2含有量（pg）を示すグラフである。 マルチプレックスELISAの実験番号2によって決定されたときの、6、12、24、および48時間（h）の時点での、照射された細胞 対 非照射の細胞の、細胞1 x 10⁶個あたりの全細胞内IL-2含有量（pg）を示すグラフである。 マルチプレックスELISAおよびサンドイッチELISAによって決定されたときの、実験番号1における細胞1 x 10⁶個あたりの可溶化IL-2（pg）の量を示すグラフである。 マルチプレックスELISAおよびサンドイッチELISAによって決定されたときの、実験番号2における細胞1 x 10⁶個あたりの可溶化IL-2（pg）の量を示すグラフである。 NOD/SCIDマウスにおける、動物の体重に対する静脈内投与されたhaNK003の影響を示すグラフである。NOD/SCIDマウス（1つの群につき3匹の雄および3匹の雌）は、単回投与での、それぞれPBSか、細胞1 x 10⁷個の用量での非照射かまたは照射されたhaNK003細胞の静脈内注入によって、処置された。動物の体重は、週に2回、5週間モニターされた。値は平均 ± SEMであり、n = 6である。 NOD/SCIDマウスにおける、動物の体重に対するhaNK003細胞の影響を示すグラフである。NOD/SCIDマウス（1つの群につき3匹の雄および3匹の雌）は、PBSか、1 x 10⁷個の非照射かまたは照射されたhaNK003細胞で、週に1回、4週間処置され、動物の体重は、週に2回、5週間モニターされた。値は平均 ± SEMであり、n = 6である。 K562細胞に対する自然細胞傷害について、aNK細胞 対 haNK003細胞の比較を示すグラフである。 Daudi細胞に対する自然細胞傷害について、NK細胞 対 haNK003細胞の比較を示すグラフである。 DOHH2細胞に対する自然細胞傷害について、aNK細胞 対 haNK003細胞の比較を示すグラフである。 SKOV-3細胞に対する自然細胞傷害について、aNK細胞 対 haNK003細胞の比較を示すグラフである。 HL-60細胞に対する自然細胞傷害について、aNK細胞 対 haNK003細胞の比較を示すグラフである。 SR-91細胞に対する自然細胞傷害について、aNK細胞 対 haNK003細胞の比較を示すグラフである。 雌のNSGマウスでのMDA-MB-453皮下異種移植モデルにおける、haNK003細胞の抗腫瘍活性を示すグラフである。MDA-MB-453ヒト乳がん腫瘍を有する雌のNSGマウスは、それぞれPBSか、または細胞2.5 x 106個もしくは1 x 107個の用量での照射されたhaNK003細胞の静脈内注入によって、週に2回、4週間処置された。腫瘍の体積は週に2回モニターされた。値は平均 ± SEMである；n = 8。 雌のNSGマウスにおける、動物の体重に対するhaNK003細胞の影響を示すグラフである。MDA-MB-453ヒト乳がん腫瘍を有する雌のNSGマウスは、それぞれPBSか、または細胞2.5 x 106個もしくは1.0 x 107個の用量での照射されたhaNK003細胞の静脈内注入によって、週に2回、4週間処置された。マウスの体重は、週に2回モニターされた。値は平均 ± SEMである；n = 4。 20%酸素条件下および0%酸素（低酸素）条件下での、haNK細胞の遺伝子発現だけでなく正常なNK細胞950、962、および996の遺伝子発現について、試料のペア間の距離を示す表である。 950、962、996、およびhaNK細胞における、20%酸素条件と0%酸素条件との間で、発現における最大の変動性を示す遺伝子を示す表である。 950、962、996、およびhaNK細胞において、20%酸素条件と0%酸素条件との間で最大の変化を示す遺伝子の、発現における変化を示す表である。 haNK細胞、ならびにNK細胞950、962、および996における、20%酸素条件と0%酸素条件との間での、低酸素に関連する遺伝子の発現における変化を示す表である。 PMA処置の前後での、haNK003細胞およびドナーNK細胞におけるCD16発現のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。CD16発現の下方制御はドナーNK細胞において94.36% ± 3であり、haNK003細胞において30% ± 0.04である。aNK（CD16を有さないNK-92細胞）は対照として使用された。 K562細胞と共培養されたhaNK003細胞およびドナーNK細胞（E:T = 1:1）におけるCD16発現レベルのフローサイトメトリー分析を示すグラフである。4時間後、haNK003細胞は、ドナーNK細胞と比較して安定的なCD16発現を示した。K562との共培養の4時間後のドナーNK細胞におけるCD16下方制御は60.25% ± 09であり、haNK003細胞については4.9% ± 2.57であった。一晩の回復の後、ドナーNK細胞においては依然として57.54% ± 26.82のCD16発現の下方制御があったが、一方でhaNK003細胞においてはCD16のレベルはわずか2.78% ± 3.5の下方制御と、正常の近くまで回復した。aNK（CD16を有さないNK-92細胞）は対照として使用された。 図27Aおよび27Bは、haNK003細胞におけるADCC後のCD16の発現レベルを示すグラフである。ADCCは、1 μg/mlのリツキシマブの存在下で4時間、1:0（エフェクター単独）～1:4のE:T比でhaNK003細胞およびDoHHを共培養することによって実施された。CD16の発現レベルは、4時間の時点で、および24時間後に、フローサイトメトリーによって測定された。図27Aは、対照（E:T = 1:0）とともに、ADCC後のhaNK-003におけるCD16の発現レベルのフローサイトメトリー分析を示す。図27Bは、ADCC後の、およびADCCの24時間後の、CD16発現の蛍光強度の中央値（MFI）を示す。

詳細な説明
本明細書において、改変されたNK-92 haNK003細胞が提供される。該細胞は、Fc受容体CD16、および小胞体結合型のIL-2を発現する。したがって該細胞は、増殖に関して外部のIL-2に依存しているわけではない。さらに、改変されたNK-92細胞は、CD16受容体の高親和性変異体の挿入により強化された細胞傷害能力を有しており、そしてそれゆえに、CD16標的抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の能力を有する。ADCCは、標的に結合した抗体（IgG）のFc断片の、CD16 Fc受容体を介する認識により、媒介される。したがって、腫瘍学的な適用に関し、改変された該細胞によるADCCは、腫瘍細胞に結合したIgGのFc断片へのCD16受容体の結合により誘発され、したがって、改変されたNK-92細胞は、標的の死滅に関して活性化される。本明細書において記載されるように、提供される改変されたNK-92細胞は、小胞体へと向けられたIL-2の配列とともにCD16 高親和性Fcガンマ受容体（FcγRIIIa/CD16a）の配列をも含む、バイシストロン性プラスミドに基づくベクターの、安定的なトランスフェクションによって作製された。該細胞は、第17番染色体上の＋鎖の15,654,977位の単一の位置に挿入されたプラスミド配列を含む。該改変されたNK-92細胞は内因性IL-2を産生し、表現型としてはCD56+、CD3-、およびCD16+である。本願において提供される改変されたNK-92 haNK003細胞は、本明細書においてときおり、単にhaNK003細胞と称される。

以下の実施例においてより詳細に記載されるように、NK-92細胞はpNEUKv1_FcRIL2プラスミド（SEQ ID NO:1）で形質転換された。pNEUKv1_FcRIL2プラスミドは、アミノ酸176位（全長CD16ペプチドを参照する場合）にバリンを含む改変されたCD16、および小胞体保留シグナルを有するIL-2を発現する、バイシストロン性の構築物である。細胞の全ゲノム配列決定（WGS）が実施され、第17番染色体上の1つのプラスミド挿入部位が同定された。WGSにより、haNK003細胞株におけるバイシストロン性プラスミドの組み込みは、発がんの潜在能力を有するいかなる遺伝子からも離れた、ゲノムの一領域中にあることが確認された。5’の最も近い遺伝子TBC1D26は10,722 bp上流であり、3’の最も近い遺伝子ADORA2Bは186,828 bp下流である。3～4日ごとに継代され、細胞およそ0.3～0.5 x 10⁶個／mLの密度で播種された場合に、改変されたNK-92細胞は安定的に増殖する。平均倍加時間は、第3日～第29日で65（48～95）時間であった。フローサイトメトリーデータの分析は、改変されたNK-92細胞がCD54、CD56、NKG2D、NKp30、およびCD16表面マーカータンパク質を発現し、かつCD3を欠くことを示す。改変されたNK-92細胞は、培養培地におけるIL-2の添加無しに増殖することができる。さらに、IL-2を発現する改変されたNK-92細胞は、培養培地中に低いレベルのIL-2を放出することが確認された。非照射のhaNK003細胞は単独で、培養の6時間の時点で細胞1,000,000個あたり平均およそ276.1 pg/mLを分泌し、培養の48時間の時点で細胞1,000,000個あたり最大1403.3 pg/mLを分泌する。提供される改変されたNK-92細胞は、いくつかのがん細胞株に対して自然細胞傷害性であり、抗体と組み合わされた場合に、ADCCを介した、強化された特異的溶解の能力を有する。

NK-92細胞株は、インターロイキン2（IL-2）の存在下で増殖することが発見された。Gong et al., Leukemia 8:652-658 (1994)。これらの細胞は、多様ながんに対して高い細胞溶解活性を有する。NK-92細胞株は、拡大後の産量が予想可能である、幅広い抗腫瘍細胞傷害性を有する均質なNK細胞集団である。第I相臨床試験により、その安全性プロファイルが確認されている。NK-92は、非ホジキンリンパ腫に罹患している対象の血液中で発見され、そしてその後エクスビボで不死化された。NK-92細胞はNK細胞に由来するが、大多数の活性化受容体を保持する一方で、正常なNK細胞によって提示される主要な抑制性受容体を欠く。NK-92細胞はしかしながら、正常な細胞を攻撃せず、ヒトにおいて好ましくない免疫拒絶応答を誘発することもない。NK-92細胞株の特徴付けは、国際公開公報第1998/49268号および米国特許出願公開第2002-0068044号に開示されている。

NK-92細胞は公知であり、そして限定するものではないが、たとえば、参照によりそれらの全体においてそれらのすべてが本明細書に組み入れられる、米国特許第7,618,817号、米国特許第8,034,332号、および米国特許第8,313,943号、米国特許出願公開第2013/0040386号に記載されるもの、たとえば野生型NK-92、NK-92-CD16、NK-92-CD16-γ、NK-92-CD16-ζ、NK-92-CD16(F176V)、NK-92MI、およびNK-92CIを含む。

本明細書において、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ADCC）を有し、CD16（SEQ ID NO:3）およびIL-2（SEQ ID NO:5）を両方とも含む核酸分子を含む、改変されたNK-92 haNK003細胞の集団が提供され、ここで細胞の集団における90%超の細胞がCD56、CD16、CD54、およびNKp30を発現し、細胞の集団における5%未満の細胞がCD3を発現する。任意で、核酸分子はmRNA分子である。任意で、mRNA分子は5’から3’へ、CD16をコードする配列、IRES配列、およびIL-2をコードする配列を含む。任意で、細胞は第17番染色体上にSEQ ID NO:1を含む。任意で、細胞の平均倍加時間は55～70時間である。任意で、細胞の集団は、平均倍加時間を、1日から、2日、3日、4日、5日、10日、15日、20日、25日、またはより多い日数維持する。任意で、細胞の集団は、1日、2日、3日、4日、またはより多い日数の間継代され得る。任意で、細胞は、細胞100万個あたり10～40 pg／時間の濃度でIL-2を分泌する。任意で、細胞は照射された細胞である。

ある種の刺激に応答して、CD16は細胞膜の近くで開裂し、結果として受容体の細胞外部分の放出、および活性化に続く発現の下方制御が起こる（Jing, et al., PLOS one, 10(3):e0121788 DOI:10.1371/journal.pone.0121788 (2015)参照）。正常な条件下では、この機構はNK細胞の細胞傷害を制御するのに役立つが、腫瘍環境では、これはADCCの効力、およびがん細胞の死滅を減少させ得る。有利なことに、提供されるhaNK003細胞は、がん細胞に対して強化されたADCC活性を有する。理論に拘束されるものではないが、これは、ADCC後の、haNK003細胞におけるCD16の安定的な発現という事象によるものと考えられている。以下の実施例に示すように、ホルボール-12-ミリスタート13-アセタートでの活性化後またはK562細胞での刺激後、対照細胞と比べてCD16の発現は高いままであった。さらに、ADCC後でさえも、CD16の発現はhaNK003細胞において高いままであった。したがって、提供されるhaNK003細胞は、対照と比較して、CD16発現の下方制御が減少している。さらに、haNK003細胞はADCC後、対照と比較して増加したレベルのCD16を有する。言い換えると、該細胞はADCC後、対照と比較してより高いレベルのCD16を維持する。したがってhaNK003細胞は、対照、たとえば正常なNK細胞と比較して、より安定したCD16の発現を有する。

ナチュラルキラー（NK）細胞の溶解活性は、インビトロでの低酸素環境中（1% O₂）で抑制され、かつNKG2D、パーフォリン、およびグランザイムの下方制御に関連する。正常なドナーからのNKの低酸素（1% O₂）への感受性には、いくらかの変動性がある。しかしながら、NK細胞の溶解活性は、インビトロで、外来のIL-2での活性化（16時間、1000 IU/ml）によって部分的に復活され得る。さらに、NK細胞は1%酸素条件下でADCCの能力を保持する。以下の実施例においてより詳細に記載されるように、低酸素に関連する遺伝子は、20%酸素条件と0%酸素（低酸素）条件との間で、haNK細胞において発現に変化を示さない。しかしながら、低酸素に関連するこれらの同じ遺伝子は、正常なNK細胞において発現が減少することが示される。

上述したように、改変されたNK-92細胞はFc受容体CD16を発現する。本明細書において使用される場合、「Fc受容体」なる用語は、Fc領域として知られる抗体の一部への結合によって免疫細胞の保護機能に寄与する、ある種の細胞（たとえばナチュラルキラー細胞）の表面上に見いだされるタンパク質を指す。抗体のFc領域の、細胞のFc受容体（FcR）への結合は、抗体媒介性ファゴサイトーシスまたは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を介して細胞のファゴサイトーシス活性または細胞傷害活性を刺激する。FcRは、それらが認識する抗体のタイプによって分類される。たとえば、Fc-ガンマ受容体（FCγR）はIgGクラスの抗体に結合する。FCγRIII-A（CD16とも称される）は、IgG抗体に結合する低親和性Fc受容体であり、かつADCCを活性化する。FCγRIII-Aは典型的にはNK細胞上に見いだされる。CD16をコードする代表的なアミノ酸配列はSEQ ID NO:3に示される。CD16をコードする代表的なポリヌクレオチド配列はSEQ ID NO:4に示される。CD16の完全な配列は、エントリーP08637としてSwissProtデータベース中に見いだされ得る。

任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:3と70%、80%、90%、または95%の同一性を有する核酸配列を含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:3と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸配列を含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:4と70%、80%、90%、または95%の同一性を有するポリペプチドを含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:4と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチドを含む。

NK-92細胞の細胞傷害は、サイトカイン（たとえばインターロイキン-2（IL-2））の存在に依存する。商業規模の培養において、NK-92細胞を維持しかつ拡大させるために必要な、外部から添加するIL-2を用いるコストは著しい。NK-92細胞の活性化を継続させるために十分な量でのヒト対象へのIL-2の投与は、有害な副作用を引き起こし得る。任意で、IL-2は、IL-2を小胞体へ向けるシグナル配列とともに発現される。IL-2を小胞体に向けることで、実質的な量のIL-2を細胞外に放出することのない、オートクリンの活性化に十分なレベルでのIL-2の発現が可能になる。Konstantinidis et al “Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92 cells” Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64参照。IL-2をコードする代表的な核酸はSEQ ID NO:5に示され、IL-2の代表的なポリペプチドはSEQ ID NO:6に示される。

任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:5と70%、80%、90%、または95%の同一性を有する核酸配列を含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:5と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する核酸配列を含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:6と70%、80%、90%、または95%の同一性を有するポリペプチドを含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:6と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチドを含む。提供される改変されたNK-92細胞は、有利なことに、臨床的な有害作用を引き起こす量のIL-2を分泌することなく、IL-2の非存在下で維持されることができる。

核酸とは、本明細書において使用される場合、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ならびにそれらの重合体および相補体を指す。この語は、単鎖型もしくは二重鎖型のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む。この語は、合成、天然、および非天然であり、参照の核酸に類似した結合特性を有し、かつ参照のヌクレオチドに類似した様式で代謝される、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された主鎖残基もしくは結合を含む核酸を包含する。そのようなアナログの例は、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、キラル-メチルホスホナート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（PNA）を含む。他に指示されない限り、核酸配列の保存的に改変された変異体（たとえば縮重コドン置換）、および相補配列は、本明細書において記載される特定の核酸配列の代わりに使用され得る。具体的には、縮重コドン置換は、1つもしくは複数の選択された（またはすべての）コドンの第3位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸なる用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと、互換性をもって使用される。

核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合に、機能的に連結される。たとえば、プレ配列もしくは分泌リーダーをコードするDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードするDNAに機能的に連結されている；プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されている；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に機能的に連結されている。一般的に、機能的に連結されるとは、連結されたDNA配列が互いに近くにあり、分泌リーダーの場合には、連続的であってかつ読み取り相（reading phase）中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的でなくてもよい。たとえば、第2の核酸配列と機能的に連結される核酸配列は、任意の有効な3次元的会合が許容されるが、そのような第2の配列と、直接的または間接的のいずれかで共有結合される。単一の核酸配列は、複数の他の配列に、機能的に連結され得る。たとえば、単一のプロモーターが複数のRNA種の転写に作用し得る。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成され得る。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣行にしたがって使用される。

同一、またはパーセント同一性なる用語は、2以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈では、以下に記載されるデフォルトのパラメーターでBLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて測定された場合に、または手作業でのアラインメントおよび目視検査によって測定された場合に（たとえばNCBIのウェブサイト等を参照）、同じであるか、もしくは同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、比較ウィンドウもしくは指定された領域にわたって最大限一致するよう比較されそしてアラインされた場合の、特定の領域にわたる約60%の同一性、好ましくは65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の、もしくはより高い同一性）を有する、2以上の配列またはサブ配列を指す。そのような配列は、したがって、実質的に同一である、と言われる。この定義はまた、試験配列の相補体を指すか、またはこれに適用されてよい。該定義はまた、置換を有する配列とともに、欠失および／または付加を有する配列をも含む。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を明らかにすることができる。好ましくは同一性は、少なくとも約25アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さの領域にわたって、またはより好ましくは50～100アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さの領域にわたって存在する。

配列比較のためには、典型的には1つの配列が、それに対して試験配列が比較される参照配列の役割をはたす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され；必要であればサブ配列の座標が指定され；そして配列アルゴリズムのプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトのプログラムパラメーターが使用され得、または代替のパラメーターが指定され得る。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算定する。

比較ウィンドウとは、本明細書において使用される場合、20～600、通常約50～約200、より通常には約100～約150からなる群より選択されるいずれか1つの数の、連続的な位置のセグメントへの言及を含み、ここで配列は、同じ数の連続的な位置の参照配列と、該2つの配列が最適にアラインされた後で比較されてよい。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための、配列の最適なアラインメントは、たとえばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって；Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって；Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索の方法によって；これらのアルゴリズムのコンピューター化された遂行によって（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）；または手作業でのアラインメントおよび目視検査によって、実施され得る（たとえばCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)参照）。

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの好ましい例はBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)、およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLASTおよびBLAST 2.0は、本明細書において記載されるパラメーターを用いて、核酸またはタンパク質のパーセント配列同一性を決定するために使用される。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、当技術分野において公知であるように、the National Center for Biotechnology Informationを通じて公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインされた場合に何らかの正の値の閾値スコアTとマッチするかまたはこれを充足するかいずれかの、クエリー配列中の選択された長さ（W）の短いワードを同定することによって、高スコアリング配列ペア（high scoring sequence pair）（HSP）を同定することを、最初に含む。Tは、隣接ワードスコア閾値（neighborhood word score threshold）と称される（Altschulら、前記）。これらの、最初の隣接ワードヒット（neighborhood word hit）は、それらを含む、より長いHSPを発見するための検索を開始するための種（seed）として働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターM（マッチする残基のペアのリワードスコア（reward score）；常に ＞0）およびN（ミスマッチの残基のペナルティスコア（penalty score）；常に ＜0）を用いて算定される。アミノ酸配列に関しては、累積スコアを算定するためにスコアリングマトリックス（scoring matrix）が使用される。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大の達成値からXの量が減少した時に；累積スコアが、1つもしくは複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積のために、ゼロもしくはそれ以下となった時に；またはいずれかの配列の末端に到達した時に、停止される。BLASTアルゴリズムのパラメーター、W、T、およびXは、アラインメントの鋭敏性および速度を決定する。期待値（E）は、データベース検索において偶然に生じると予想されるものと同等またはそれより良いスコアを有する、異なるアラインメントの数を表す。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、11のワード長（W）、10の期待値（E）、M = 5、N = -4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用のBLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、10の期待値（E）、およびBLOSUM62のスコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)参照）、50のアラインメント（B）、10の期待値（E）、M = 5、N = -4、および両鎖の比較を使用する。

ポリペプチドなる用語は、本明細書において使用される場合、通常、少なくとも3つのアミノ酸の重合体という、当技術分野において認められているその意味を有し、かつペプチドおよびタンパク質を含むことが意図される。しかしながら、該語はまた、たとえばデサチュラーゼ、エロンガーゼ等といった、特定の機能クラスのポリペプチドを指すために使用される。そのような各クラスについて、本開示は、そのようなポリペプチドの公知の配列のいくつかの例を提供する。当業者はしかしながら、ポリペプチドなる用語が、本明細書において（または参照においてもしくは本明細書において具体的に言及されるデータベースにおいて）言及される完全な配列を有するポリペプチドを包含するのみならず、そのような完全なポリペプチドの機能的な断片（すなわち、少なくとも1つの活性を保持する断片）を表すポリペプチドを包含するほどに、十分に一般的であることが意図されることを理解するであろう。さらに、当業者は、タンパク質配列が、活性を破壊することなくいくらかの置換を一般的に許容することを、理解している。したがって、活性を保持し、かつ、同じクラスの別のポリペプチドと、少なくとも約30～40%の、しばしば約50%超、60%超、70%超、または80%超の全体的な配列の同一性を共有し、そしてさらに、少なくとも3～4アミノ酸、かつしばしば20までもしくはより多いアミノ酸を通常包含する1つまたは複数の高度に保存された領域において、しばしば90%超、または95%超、96%超、97%超、98%超、もしくは99%超でさえあるより高い同一性の少なくとも1つの領域を通常含む、任意のポリペプチドが、本明細書において使用される場合、ポリペプチドとの適切な語に包含される。当業者は、本明細書において記載されるさまざまなポリペプチドの配列の分析によって、他の領域の類似性および／または同一性を決定することができる。当業者によって公知であるように、同一性および／または類似性の程度を評価するためにアミノ酸またはヌクレオチド配列の比較を実施するための、多様な戦略が公知であり、ツールが利用可能である。これらの戦略は、たとえば、手作業でのアラインメント、コンピューターに補助される配列アラインメント、およびそれらの組み合わせを含む。配列アラインメントを実施するための多数のアルゴリズム（一般的にコンピューターで遂行される）が広く利用可能であり、または、それらは当業者によって作成されることができる。代表的なアルゴリズムは、たとえば、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482）；NeedlemanおよびWunschの相同性アラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol., 1970, 48: 443）；PearsonおよびLipmanの類似性検索の方法（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1988, 85: 2444）；ならびに／またはこれらのアルゴリズムのコンピューター化された遂行によるもの（たとえばthe Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.におけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）を含む。そのようなアルゴリズムを組み込んだ、容易に利用可能なコンピュータープログラムは、たとえば、BLASTN、BLASTP、Gapped BLAST、PILEUP、CLUSTALW等を含む。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーターが使用されてよい。あるいは実務者は、実験要件および／もしくは他の必要条件に応じて、非デフォルトのパラメーターを使用してよい（たとえば、URL www.ncbi.nlm.nih.gov を有するウェブサイト参照）。

本明細書において使用される場合、プロモーター、プロモーターエレメント、および制御配列なる用語は、プロモーターに機能的に連結される、選択されたポリヌクレオチド配列の発現を制御し、かつ細胞において該選択されたポリヌクレオチド配列の発現をもたらすポリヌクレオチドを指す。

形質転換なる用語は、本明細書において使用される場合、それによって外来のまたは異種性の核酸分子（たとえばベクターもしくは組み換え核酸分子）がレシピエント細胞または微生物に導入されるプロセスを指す。外来のもしくは異種性の核酸分子は、宿主細胞もしくは微生物のゲノムを構成する染色体DNA中に組み込まれて（すなわち、これと共有結合して）もよく、または組み込まれなくてもよい。たとえば、外来のまたは異種性のポリヌクレオチドは、プラスミドなどのエピソーム性のエレメント上で維持されてよい。あるいは、または加えて、外来のもしくは異種性のポリヌクレオチドは、それが染色体複製を通じて娘細胞に継承されるように、染色体に組み込まれてよい。形質転換のための方法は、限定するものではないが、リン酸カルシウム沈殿；組み換え核酸を含む細菌プロトプラストとのレシピエント細胞の融合；組み換え核酸を含むリポソームでのレシピエント細胞の処理；DEAEデキストラン；ポリエチレングリコール（PEG）を用いる融合；エレクトロポレーション；マグネトポレーション（magnetoporation）；バイオリスティック送達；レトロウイルス感染；リポフェクション；および細胞への直接的なDNAのマイクロインジェクションを含む。

形質転換された、なる用語は、細胞に関して使用される場合、細胞が外来のまたは異種性の遺伝的物質（たとえば組み換え核酸）を所持するように、本明細書において記載されるように形質転換を受けた細胞を指す。形質転換された、なる用語はまた、またはあるいは、外来のもしくは異種性の遺伝的物質を含む微生物、微生物の株、組織、生物等を指すために使用され得る。

改変された、なる用語、および組み換えなる用語は、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクター等に関して使用される場合、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクター等が、実験室的方法によって改変されているかまたは実験室的方法の成果であり、かつ非天然であることを示す。したがって、たとえば、改変された細胞とは、実験室的な手法、たとえば細胞に核酸を導入するための形質転換方法によって産生または改変された細胞を含む。改変された細胞は、天然（非組み換え）型の細胞中には見いだされない核酸配列を含み得るか、または変更された核酸配列、たとえば非天然のプロモーターに結合された核酸配列を含み得る。

本明細書において記載されるように、対照または標準対照とは、試験試料、試験測定値、もしくは試験値との比較のための参照、通常は既知の参照として働く、試料、測定値、または値を指す。たとえば、試験細胞、たとえばFc受容体の遺伝子をコードする核酸配列で形質転換された細胞は、既知の正常な（野生型）細胞（たとえば標準対照細胞）と比較され得る。標準対照はまた、Fc受容体を発現しないか、またはFc受容体活性を有さないかもしくは最少のレベルのFc受容体活性を有する細胞の集団（たとえば標準対照微生物）から得られる、平均的測定値または平均値を表し得る。当業者は、標準対照が、任意の数のパラメーター（たとえばRNAレベル、ポリペプチドレベル、特定の細胞タイプ等）の評価のために設計され得ることを理解するであろう。

本明細書において使用される場合、「抗体」なる用語は、免疫グロブリンまたはその断片を指す。抗体は、任意のタイプ（たとえばIgG、IgA、IgM、IgE、またはIgD）のものであってよい。好ましくは、抗体はIgGである。抗体は、非ヒト（たとえばマウス、ヤギ、もしくは任意の他の動物由来）抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であってよい。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。任意で、抗体はモノクローナルである。

「モノクローナル抗体」なる用語は、本明細書において使用される場合、培養中で生育し、かつ無限に増殖することができる細胞の単一のクローンから産生される、純粋で、標的に特異的な抗体を指す。使用され得るモノクローナル抗体は、がん性細胞上の抗原に結合しそしてこれを阻害する、ネイキッド（naked）抗体を含む。任意で、ネイキッドモノクローナル抗体は、リンパ球におけるCD52抗原に結合するアレムツズマブである。また、使用され得るモノクローナル抗体は、タグ付けされた、標識された、または付加された抗体などの、コンジュゲートされたモノクローナル抗体を含む。具体的には抗体は、薬剤もしくは毒素でタグ付けされるか、もしくはこれらが付加されてよく、または放射性標識されてよい。そのような抗体の例は、限定するものではないが、CD20抗原を標的とするイブリツモマブ；CD30抗原を標的とするブレンツキシマブ、およびHER2タンパク質を標的とするトラスツズマブを含む。使用され得る他のモノクローナル抗体は、リンパ腫細胞におけるCD19およびT細胞におけるCD3を標的とするブリナツモマブなどの二重特異性モノクローナル抗体である。

本明細書において使用される場合、「抗体断片」なる用語は、エピトープを認識する抗体の任意の部分を指す。抗体断片はグリコシル化されてよい。非限定的な例として、抗体断片は、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fv断片、rIgG断片、機能的な抗体断片、前述のものの単鎖組み換え型等であってよい。F(ab')2、Fab、Fab'、およびFvは、IgGおよびIgMの可変領域から作製され得る抗原結合断片である。これらは、サイズ、結合価、およびFcの含有量が異なる。断片は、1つの細胞もしくは細胞株または複数の細胞もしくは細胞株による構成要素（たとえば重鎖および軽鎖部分）の発現を含む、任意の方法によって作製されてよい。好ましくは、抗体断片はエピトープを認識し、かつFc受容体に結合することができるような、Fc領域の十分な部分を含む。

本明細書において使用される場合、「がん」なる用語は、哺乳類において見いだされるすべての種類のがん、新生物、または悪性腫瘍を指し、白血病、癌腫、および肉腫を含む。例示的ながんは、脳のがん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、頭頚部がん、肝臓がん、腎臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がん、および髄芽腫を含む。追加の例は、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱がん、前がん性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽腫、食道がん、尿生殖路のがん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、膵臓内分泌のおよび膵臓外分泌の新生物、ならびに前立腺がんを含む。

本明細書において記載されるように、改変されたNK-92細胞を用いて対象を処置する方法もまた提供される。任意で、対象は、改変されたNK-92細胞および抗体を用いて処置される。

改変されたNK-92細胞は細胞の絶対数によって対象に投与され得る、たとえば該対象は、1回の注入につき約、少なくとも約、もしくは最大で約1 x 10¹⁰、1 x 10⁹、1 x 10⁸、1 x 10⁷、5 x 10⁷、1 x 10⁶、5 x 10⁶、1 x 10⁵、5 x 10⁵、1 x 10⁴、5 x 10⁴、1 x 10³、5 x 10³（等々）個のNK-92細胞、またはこれらの数の端点を含む任意の2つの間の任意の範囲などの、細胞約1000個／注入から細胞約100億個／注入までを投与され得る。任意で、1 x 10⁸～1 x 10¹⁰個の細胞が対象に投与される。任意で、細胞は、1週または複数週の間、週に1回または複数回投与される。任意で、細胞は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週、またはより多い週の間、週に1回もしくは2回投与される。

任意で、対象は、1回の注入につき約、少なくとも約、もしくは最大で約1 x 10⁸個／m²、1 x 10⁷個／m²、5 x 10⁷個／m²、1 x 10⁶個／m²、5 x 10⁶個／m²、1 x 10⁵個／m²、5 x 10⁵個／m²、1 x 10⁴個／m²、5 x 10⁴個／m²、1 x 10³個／m²、5 x 10³個／m²（等々）のNK-92細胞、またはこれらの数の端点を含む任意の2つの間の任意の範囲などの、細胞約1000個／注入／m²から細胞約100億個／注入／m²までを投与される。

任意で、NK-92細胞は、細胞の相対数によってそのような個体に投与され得る、たとえば該個体は、個体1キログラムにつき約、少なくとも約、もしくは最大で約1 x 10⁸、1 x 10⁷、5 x 10⁷、1 x 10⁶、5 x 10⁶、1 x 10⁵、5 x 10⁵、1 x 10⁴、5 x 10⁴、1 x 10³、5 x 10³（等々）個のNK-92細胞、またはこれらの数の端点を含む任意の2つの間の任意の範囲などの、個体1キログラムにつき細胞約1000個から細胞約100億個までを投与され得る。

任意で、総用量は体表面積のm²によって算定されてよく、1 m²につき約1 x 10¹¹、1 x 10¹⁰、1 x 10⁹、1 x 10⁸、1 x 10⁷個を、またはこれらの数の端点を含む任意の2つの間の任意の範囲を含む。任意で、約10億～約30億個のNK-92細胞が患者に投与される。任意で、1用量あたりの注入されるNK-92細胞の量は体表面積のm2によって算定されてよく、1 m²につき1 x 10¹¹、1 x 10¹⁰、1 x 10⁹、1 x 10⁸、1 x 10⁷個を含む。

NK-92細胞、および任意で他の抗がん剤は、がんを有する患者に1回投与されることができるし、たとえば、治療の間の、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22もしくは23時間ごとに1回、または1、2、3、4、5、6もしくは7日ごとに1回、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週もしくはより多い週ごとに1回、またはこれらの数の端点を含む任意の2つの間の任意の範囲ごとに1回というように、複数回投与されることができる。

任意で、NK-92細胞は、NK-92細胞、およびヒト血清またはその等価物などの媒体を含む組成物において投与される。任意で、媒体はヒト血清アルブミンを含む。任意で、媒体はヒト血漿を含む。任意で、媒体は約1%～約15%のヒト血清またはヒト血清等価物を含む。任意で、媒体は約1%～約10%のヒト血清またはヒト血清等価物を含む。任意で、媒体は約1%～約5%のヒト血清またはヒト血清等価物を含む。任意で、媒体は約2.5%ヒト血清またはヒト血清等価物を含む。任意で、血清はヒトAB血清である。任意で、ヒト治療剤における使用のために許容される血清代替品がヒト血清の代わりに使用される。そのような血清代替品は、当技術分野において公知のものであってよい。任意で、NK-92細胞は、NK-92細胞、および細胞生存能能力を持続させる等張な液体の溶液を含む組成物中において投与される。任意で、NK-92細胞は、凍結保存された試料から再構成された組成物において投与される。

本明細書において提供される方法にしたがって、本明細書において提供される1つまたは複数の作用物質の有効量が対象に投与される。有効量なる用語および有効用量なる用語は互換性をもって使用される。有効量なる用語は、望ましい生理的応答（たとえば炎症の減少）を引き起こすのに必要な任意の量として定義される。作用物質の投与のための有効量およびスケジュールは当業者によって経験的に決定されてよい。投与のための用量の範囲は、疾患または障害の1つもしくは複数の症状に影響を及ぼす（たとえば減少させるまたは遅らせる）という望ましい効果を引き起こすのに十分大きいものである。用量は、望まれない交差反応、アナフィラキシー性反応等といった、実質的な有害な副作用を引き起こすほどに大きくするべきではない。一般的に用量は、年齢、健康状態、性別、疾患のタイプ、疾患もしくは障害の程度、投与の経路、または他の薬剤がレジメン中に含まれるかどうかによって異なり、当業者によって決定され得る。用量は、何らかの禁忌がある場合には、個々の医師によって調整され得る。用量は変えることができ、かつ1種または複数種の用量の投与で、1日に1回、1日または数日の間投与されることができる。手引きは、所定のクラスの薬学的産物のための適切な用量に関する文献に見いだされ得る。たとえば、有効量は、所定のパラメーターについて少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、40%、50%、60%、75%、80%、90%、もしくは少なくとも100%の増加または低下を示すであろう。有効性はまた、「倍」増加または低下として表現され得る。たとえば治療的有効量は、対照よりも少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、またはそれより多い効果を有し得る。厳密な用量および剤形は、処置の目的によって決まり、かつ公知の技術を用いて当業者が確認可能である（たとえば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Editor (2012)、およびPickar, Dosage Calculations (1999)参照）。

薬学的に許容される組成物は多様な担体および賦形剤を含み得る。多様な水性担体、たとえば緩衝生理的食塩水等が使用され得る。これらの溶液は滅菌され、かつ一般的に、望ましくない物質を含まない。適切な担体および賦形剤、ならびにそれらの調合は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)に記載されている。薬学的に許容される担体は、生物学的にも他の点でも有害でない材料を意味する。すなわち、該材料は、有害な生物学的影響を引き起こすことも、それが含まれる薬学的組成物の他の構成要素と有害な様式で相互作用することもなく、対象に投与される。対象に投与される場合、担体は任意で、有効成分の分解を最小限にするように、かつ対象における有害な副作用を最小限にするように、選択される。本明細書において使用される場合、薬学的に許容される、なる用語は、生理学的に許容される、および薬理学的に許容される、と同義語として使用される。薬学的組成物は、一般的に緩衝剤および保管中の保存剤を含み、かつ、投与の経路に応じて、適切な送達のための緩衝液および担体を含み得る。

組成物は、たとえば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等の、pH調整および緩衝剤、毒性調整剤等といった、生理的条件に近づけるために必要とされる、許容される補助的な物質を含んでよい。これらの製剤中の細胞の濃度、および／または他の作用物質の濃度は変えることができ、かつ、選択された特定の投与方法、および対象の必要性にしたがって、主として流体の量、粘性、体重等に基づいて選択される。

任意で、NK-92細胞は、処置されるがんのための1つまたは複数の他の治療とともに対象に投与される。理論に拘束されるものではないが、NK-92細胞およびがんに対する別の療法での対象の共処置は、NK-92細胞および該もう一方の療法が、内在性免疫系に、そのような内在性作用をこれまで圧倒していたがんを排除する機会をもたらすことを可能にすると考えられる。任意で、処置されるがんのための2以上の他の処置は、たとえば、抗体療法、放射線療法、化学療法、幹細胞移植療法、またはホルモン療法を含む。

任意で、抗体がNK-92細胞とともに患者に投与される。任意で、NK-92細胞および抗体は、対象に、たとえば同じ製剤中で、一緒に投与される；たとえば別々の製剤中で同時に、別々に投与される；またはたとえば異なる投与スケジュールでもしくは1日のうちの異なる時刻で、別々に投与され得る。別々に投与される場合、抗体は、静脈内投与または経口投与などの、任意の適した経路で投与され得る。

任意で、抗体は、がん性細胞またはがんに関連するマーカーを発現する細胞を標的とするために使用されてよい。多数の抗体が、がんの処置のみのために承認されている。

（表２）FDAに承認された治療用モノクローナル抗体の例

抗体はいくつかの機構を介してがんを処置し得る。ADCCは、NK細胞などの免疫細胞が、CD16などのFc受容体を介して標的細胞に結合する抗体と結合するときに生じる。

したがって、CD16を発現するNK-92細胞は、特定のがん関連タンパク質に対する少なくとも1つのモノクローナル抗体、たとえばアレムツズマブ、ベバシズマブ、イブリツモマブ チウキセタン、オファツムマブ、リツキシマブ、およびトラスツズマブの有効量とともに対象に投与される。任意で、モノクローナル抗体は、ネイキッドモノクローナル抗体、コンジュゲートされたモノクローナル抗体、または二重特異性モノクローナル抗体である。任意で、がん細胞に結合し、かつNK-92細胞の表面上に存在する細胞表面タンパク質にも結合する二重特異性抗体が使用され得る。

がん特異的抗体は、がん細胞の表面上に発現する特定のタンパク質抗原に結合する。NK-92細胞は、抗体がNK-92細胞の表面に結合するように改変され得る。任意で、抗体はがんに特異的である。このような方法で、NK-92細胞は、がんを特異的に標的とし得る。中和抗体もまた単離され得る。たとえば、分泌型糖タンパク質、YKL-40は、複数の種類の進行したヒトがんにおいて上昇する。YKL-40に対する抗体が、腫瘍の増殖、血管新生、および／または転移を抑制するために使用できることが考えられる。Faibish et al., (2011) Mol. Cancer Ther. 10(5):742-751参照。

がんに対する抗体は、市販している供給源から購入することができ、または当技術分野において公知の任意の方法によって製造されることができる。たとえば抗体は、以前にがんに罹患しそして回復した、もしくは試料が採取された時に回復中であった、1人もしくは複数人の患者由来のB細胞、骨髄、または他の試料を入手することによって製造されることができる。これらの試料から、抗体（たとえばモノクローナル抗体）を同定する、スクリーニングする、および増大させる方法は、公知である。たとえば、ファージディスプレイライブラリーは、試料または関心対象の細胞からRNAを単離し、単離したRNAからcDNAを調製し、重鎖および／または軽鎖cDNAについてcDNAを濃縮し、ならびにファージディスプレイベクターを用いてライブラリーを作製することによって、製造され得る。ライブラリーは、たとえば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるMaruyamaらに記載されるように調製され、そしてスクリーニングされ得る。抗体は、組み換え手法または任意の他の方法によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の単離、スクリーニング、特徴付け、および産生はまた、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Beerli, et al., PNAS (2008) 105(38):14336-14341にも記載されている。

作用物質もしくは組成物の組み合わせは、一緒に（たとえば混合物として）、別々だが同時に（たとえば別々の静脈経路を介して）、または連続的に（たとえば、1つの作用物質が先に投与され、それに第2の作用物質の投与が続く）のいずれかで投与され得る。したがって、組み合わせなる用語は、2つ以上の作用物質または組成物の、一緒の、同時の、または連続的な投与を指すために使用される。一連の処置は、対象の特定の特徴、および選択される処置のタイプに応じて、個々に最善に決定される。本明細書において開示されるものなどの処置は、対象に、1日に1回、1日に2回、2週間に1回、月に1回、または治療的に有効な任意の適切な基準で投与され得る。処置は、単独で、または本明細書において開示される、もしくは当技術分野において公知の、任意の他の処置との組み合わせで投与され得る。追加の処置は、第1の処置と同時に、異なる時間に、または完全に異なる治療スケジュールで（たとえば第1の処置は1日に1回であってよく、一方で追加の処置は1週間に1回である）投与され得る。

提供される改変されたNK-92細胞を含むキットもまた開示される。任意で、キットは、抗体などの1つまたは複数の追加の作用物質をさらに含む。キットの構成要素は、1つまたは複数のバイアルなどの、1つのまたは異なる容器中に含まれてよい。抗体は、貯蔵寿命を増すために、液体または固体の形態（たとえば凍結乾燥後）であってよい。液体の形態にある場合、成分は、プロリン、グリシン、もしくはスクロース、または貯蔵寿命を増す他の添加剤といった、安定剤および／または防腐剤などの添加剤を含んでよい。

任意で、キットは、改変されたNK-92細胞の投与またはNK-92細胞および抗体の投与の前に、同時に、または後に投与されるべき、治療的に有効な化合物または薬剤などの追加の化合物を含んでよい。そのような化合物の例は、ビタミン、ミネラル、フルドロコルチゾン、イブプロフェン、リドカイン、キニジン、化学療法剤等を含む。

任意で、キットの使用のための指示書は、がんの処置における、キットの構成要素を使用するための指示を含む。指示書は、調製（たとえば、凍結乾燥されたタンパク質の場合には希釈または再構成）を、抗体ならびにNK-92細胞（たとえば解凍および／または培養）についてどのように行うかに関する情報を、さらに含んでよい。指示書は、投与の用量および頻度に関する手引きをさらに含んでよい。

開示される方法および組成物のために使用され得る、それらとともに使用され得る、それらの調製のために使用され得る、またはそれらの産物である、材料、組成物、および構成要素が開示される。これらおよび他の材料が本明細書において開示される、そして、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示されていて、これら化合物のさまざまな個々のおよび集合的な組み合わせのならびに変更のそれぞれへの具体的な言及が明示的に開示されていないかもしれない場合にも、それぞれは具体的に意図され、本明細書において記載されることが理解される。たとえば、ある方法が開示および考察されており、かつ該方法を含むいくつかの分子に対してなされ得るいくつかの改変が考察される場合、該方法の、それぞれのおよびすべての組み合わせならびに変更、ならびに可能な改変が、そうでないことが具体的に指示されない限り、具体的に意図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に意図されかつ開示される。この概念は、限定するものではないが、開示される組成物を用いる方法における工程を含む、本開示のすべての局面に適用される。したがって、実施され得る多様な追加の工程が存在する場合、これら追加の工程のそれぞれは、開示される方法の、任意の特定の方法の工程でまたは方法の工程の組み合わせで実施され得ること、およびそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットのそれぞれが、具体的に意図され、かつ開示されているとみなされるべきであることが、理解される。

本明細書において引用される刊行物、および引用される資料は、本明細書によって明確に、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

以下の実施例は、本明細書において記載される方法および組成物のある局面をさらに説明することを意図したものであり、請求の範囲を限定することを意図したものではない。

実施例1 haNK003の構造的および機能的特徴
NK-92 [CD16.176V、ER IL-2]（haNK003）は、NK-92細胞の改変によって作製された。NK-92細胞は当初、急速進行性の非ホジキンリンパ腫を有する50歳の男性患者から1992年に単離された（Gong, et al., Leukemia, 8(4):652-8 (1994)）。NK-92細胞株はその後特徴付けされ、そして、IL-2依存性であるとともに、表現型としてはCD56+、CD3-、およびCD16-であることが示された。haNK003は、CD16およびIL-2の配列を含む、バイシストロン性プラスミドに基づくベクターでの、NK-92細胞のエレクトロポレーションによる安定的なトランスフェクションによって作製された、同種異系の細胞株である。トランスフェクトされたプラスミドは図1に示されており、GeneArt AGによって構築された。CD16配列はアミノ酸176位においてバリンをコードしており（176V）、これは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の潜在能力を高めることを可能にする。IL-2配列は、小胞体（ER）からのIL-2タンパク質分泌を阻害するために、小胞体保留シグナル、KDELでタグ付けされている。IL-2配列を含有させることで、haNK（商標）をIL-2非依存性にすることが可能になる。

EUFETS GmbH（Regensburg, Germany）はエレクトロポレーションによってトランスフェクションを実施し、そして1ラウンドの限界希釈によって複数のクローンを選択した。EUFETSからの1つのクローンは、GMPマスターセルバンク、haNK003を確立するため、BioRelianceへ送付された。選択されたクローンにおける全ゲノム配列決定により、プラスミド挿入部位は、15,654,977～15,661,403位における第17番染色体上の単一の位置であることを確認した。

プラスミドのトランスフェクション
プラスミドは、提供された仕様書に基づきGeneArt AGによって構築された。合成遺伝子pNEUKv1_FcRIL2は、合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から組み立てられた。断片は、EcoRIおよびNotI制限部位を用いてpNEUKv1_O059ベクターバックボーンにクローニングされた。pNEUKv1_O059は、アンピシリン耐性カセットを含む合成ベクターである。導入遺伝子の発現のために使用されるプロモーターは、SV40ポリアデニル化配列を有するEF-1alphaである。結果としてもたらされたプラスミドは5,491塩基対（bp）の長さであり、かつCD16およびIL-2についてのヒト起源の配列を含む。CD16もIL-2も、いかなる形質転換特性も有さない。プラスミドDNAは形質転換された細菌から精製され、そしてその濃度がUV分光法によって決定された。最終的な構築物は配列決定によって確認された。使用された制限部位内の配列の一致は100%であった。プラスミドは、TSE非存在の産生条件下で作製された。

pNEUKv1_FcRIL2プラスミドの全ヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1）を以下に示す。

haNK003細胞株を作製するため、NK-92（aNK）マスターセルバンク（MCB）（aNK COA）のバイアルおよび250 mgのpNEUKv1_FcRIL2プラスミドがEUFETS GmbHに送付された。EUFETSはMCBバイアルを解凍し、そしてNK-92細胞を、プラスミドでのトランスフェクションのために適切な数まで培養した。トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション後の最初の2日間、IL-2、X-Vivo 10、および5%熱不活性化ヒトAB血清を加えた培地中で増殖した。2日後、IL-2はもはや増殖培地には添加されず、そしてトランスフェクトされかつ適切な量のIL-2を産生する細胞は増殖し続けた。複数のクローンが限界希釈により単離され、そして表現型およびFc受容体発現に関して予備的にスクリーニングされた。優れた生存率（＞70%）、許容できる倍加時間、予想された表現型、およびFc受容体発現陽性を示す六（6）個のクローンが、より詳細なスクリーニングおよび単一のクローンの最終選択のため、the German Red Cross GMP Testing Laboratory（GRC）に送付された。GRCにおいて、すべてのクローンは、表現型（Fc受容体発現を含む）、ADCC、サイトカインプロファイル、増殖の特徴、および放射線感受性に関して試験された。選択された細胞株、haNK003が、マスターセルバンクを作製するために使用された。

NantKwestマスターセルバンク（MCB haNK003）は、選択された細胞株から製造され、そしてBioRelianceによって試験された。MCBは、純度、効力、同一性、無菌性、およびウイルス性／外来の作用物質に関して試験された。MCBは、細胞1 x 107個／バイアルのアリコートで、10% DMSO、40% X-Vivo 10、50%ヒトAB血清の調合物中で凍結保存される。MCBのために凍結保存から製造されたバイアルの総数は、218本であった。

組み込み部位
haNK003からのDNA抽出物は、全ゲノム配列決定のため、CLIA/CAP認証されているNantOmics Sequencing Lab（Culver City, CA）に提供された。全ゲノムライブラリーは、KAPA Hyper prep kitを用いて、細胞株試料に関して調製され、そしてhaNK003を網羅する25xの最少のカバレッジを提供するようにIllumina HiSeq機器において配列決定された。DNA配列決定データは、bwa-memにより報告された血漿の配列を含み、samblasterによって重複がマークされ、かつGenome Analysis Toolkit（GATK）によってインデルが再アラインされかつ塩基の質が再較正された、改良されたGenome Reference Consortium Human Build 37（GRCh37、hg19としても公知、元々はthe University of California, Santa Cruz Genome Browser - http://genome.ucsc.eduから取得された）に対してアラインされた。変異体分析が、the NantOmics Contraster 分析パイプラインを用いて、単一のヌクレオチド変化、小規模の挿入または欠失（インデル）、コピー数変化、転位、および組み込み部位を含む変異体を確認するために実施された。組み込まれたプラスミドおよび結果的に生じた組み込み部位は、the NantOmics Genome Browserによって視覚化され、そしてさらなる比較および視覚化が、既存のゲノム要素との、何らかの潜在的な相互作用を同定するために、the UCSC Genome Browser上で実施された。

haNK003は、第17番染色体：15654977～15661403へのマッピングの、不整合な読み取りの形跡を示した。5’の最も近い遺伝子TBC1D26（第17番染色体：15,635,591～15,644,255）は10,722 bp上流であり、3’の最も近い遺伝子ADORA2B（第17番染色体：15,848,231～15,871,210）は186,828 bp下流であった。TBC1D26については、UniProtにおいてRabファミリータンパク質のためのGTPアーゼ活性化タンパク質として注釈付けされている以外はほとんど知られていない。ADORA2Bは、アデノシンの存在下でアデニル酸シクラーゼ活性を刺激する膜タンパク質として注釈付けされている（Strohmeier, et al., J. Biol. Chem. 270(5):2387-2394 (1995)）。コーディング変異体は、pNEUKv1_FcRILと名付けられたコード配列に関して、2つの注釈付けされたORF中には見いだされなかった。UCSC EncodeトラックおよびlincRNAは、挿入部位（TCONS_12_00011108）の下流にlincRNA転写物の形跡を示すが、しかしながらそれは3’組み込み部位のおよそ2,450 bp下流であり、この転写物が依然として無傷である可能性が高いことを示す。脊椎動物種の、100通りの、複数でのアラインメントの調査は、負の対数のp値が-3.874～1.507の範囲であって、保存の平均が0.01、および標準偏差が0.58と、組み込み部位にわたる塩基レベルの保存がほとんど無いことを示す。

haNK003はヒトゲノム組み込み部位において、遺伝子の破損についても、転写物の破損についても、制御的な破損についても、いかなる形跡も含まなかった。細胞株haNK003の組み込みは、いかなる遺伝子からも少なくとも10 kbp離れていた。該細胞株は、標的細胞株のヒトゲノムにおいて、公知のゲノム上のいかなる特徴に対しても破壊の形跡がないという点で許容される。

増殖の特徴
MCB haNK003を作製するために使用されるクローン細胞株haNK003の増殖の特徴は図1Aおよび1Bに示される。データは、マスターセルバンクの凍結保存のために細胞株haNK003を増殖させた際の細胞培養歴から分析された。平均倍加時間は、第3日～第29日で65（48～95）時間であった。同等の細胞密度が継代の間中達成され、これは、3～4日ごとに継代され、かつ細胞およそ0.3～0.5 x 10⁶個／mLの密度で播種された場合に、haNK003細胞が安定的に増殖することを証明する。

表現型
haNK003細胞の表面上の6つのタンパク質マーカーのパネルの発現を定量化するため、およびhaNK003プロファイルを親の細胞株であるNK-92（aNK）のプロファイルと比較するため、1つの研究が実施された。表面マーカーのパネルは、ナチュラルキラー（NK）細胞の代表的なものとなるよう選択された。

aNK細胞は、初期の分化段階にあるNK細胞に典型的な表面マーカーを発現しており、これはNKG2DおよびNKp30を含む多数の活性化受容体を発現するが、FcγRIIIa（CD16）および抑制性KIR（キラー免疫グロブリン様受容体）を欠く。aNK細胞の、この特別な表面マーカー発現プロファイルは、当該細胞に、独特な細胞傷害特性を付与する。したがって、高親和性FcγRIIIaおよび細胞内に保持されるIL-2（ERIL-2）をコードするプラスミドの安定的なトランスフェクションによるhaNK003細胞株の作製が、親のaNK細胞株の重要な表面マーカーの発現プロファイルを変化させないことを確立することが重要であった。表面マーカーのCD54、CD56、NKG2D、NKp30、CD3、およびCD16が分析され、そしてマーカー発現は、蛍光色素をコンジュゲートさせた特異的な抗体を用いた細胞の染色、およびフローサイトメトリーによる結合した抗体の検出によって決定された。

フローサイトメトリー分析の結果は表1に要約され、代表的なヒストグラムは図2に提供される。

（表１）表面マーカーの発現

% = 発現について陽性の細胞のパーセンテージ ± 標準偏差

haNK003およびaNKは、蛍光強度の中央値によって決定されたように、同等の量のCD54、CD56、NKG2D、およびNKp30を発現する。加えて、これらのマーカーを発現する細胞のパーセンテージは同等である。haNK003もaNKも、T細胞マーカーであるCD3を発現しない。予想されたように、haNK003はCD16マーカーを発現する一方、aNKは発現しない。

haNK003細胞株の作製は、親のaNK細胞株の重要な表面マーカーの発現を変化させず、CD16の発現という形での追加の機能性を付与したのみである。

細胞傷害
haNK003細胞株の自然細胞傷害は、細胞株K562、Raji、SKOV3、およびSKBR3に対して、さまざまなエフェクター 対 標的比（E:T）で評価された。haNK003のADCC活性はまた、細胞株Raji、SKOV3およびSKBR3に対して、さまざまなE:T比で評価された。haNKでの自然細胞傷害による死滅への感受性は、異なる標的細胞株で異なっており、K562細胞株は最も感受性であり、固形腫瘍細胞株（SKOV3およびSKBR3）はより感受性が低い（図3A、3B、3C、および3D）。異なる標的細胞株に対するhaNK003のADCC活性のいくらかの差異もまた観察され、Raji細胞において、リツキシマブとの組み合わせで、最大の特異的溶解が観察された（図4A、4B、および4C）。

結果は、haNK003細胞が、いくつかのがん細胞の存在下で自然細胞傷害を示すこと、および抗体を用いるADCCを介した、強化された特異的溶解の能力を有することを証明する。haNK（商標）MCB（haNK003）の仕様および成績が表2に提供される。

（表２）haNK003細胞の仕様

^a - EBVウイルスゲノムが検出されるが、NK-92（aNK）を用いた試験により、細胞がEBVの感染を引き起こさないことを確認した。感染性の研究は、aNK細胞が正常な細胞に感染することができるウイルス粒子を放出するかどうかを確認するための、aNK細胞（照射および非照射）のBリンパ球との共培養によって実施された。結果は、Bリンパ球の増殖の徴候も生長の徴候も示さず、aNK細胞がEBV感染に関するリスクを引き起こさないことを示す。

実施例2 インビトロでの増殖能力および機能性に対する照射の影響
haNK（商標）細胞は、無制限の増殖のリスクを軽減するために、照射される。インビトロでの増殖能力および機能性に対する照射の影響が評価された。これらの研究は、10 Gyでの照射が少なくとも99.9%のhaNK細胞の増殖能力を抑制する一方で、照射後少なくとも6時間の間は機能的な活性が依然として維持されることを証明する。

haNK003細胞は、自然（直接）細胞傷害および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）の両方を示す。両方の場合において、標的細胞の抗原は、NK細胞上の活性化受容体によって認識される。自然細胞傷害に関し、これらの標的細胞の抗原は、ウイルスに感染されたかまたは形質転換された細胞に特徴的な、ストレス抗原である。ADCCに関し、抗原は、抗体によって認識される腫瘍特異的抗原であり、抗体は次に、その定常（Fc）領域を介してNK細胞活性化受容体、FcγRIIIa（CD16）に結合する。

NK細胞と標的細胞のリガンドとの相互作用（直接的な相互作用を介するかまたは抗体媒介性相互作用を介するかのいずれか）は、細胞連結部の形成、ならびにそれに続くパーフォリンおよびグランザイムの放出をもたらす。これは次に、細胞膜の崩壊および標的細胞死をもたらす、標的細胞内でのアポトーシスのプロセスを誘導する。

予備的に製剤化された細胞における、自然細胞傷害およびADCCの活性のレベル、ならびに10 Gyでのガンマ線照射後のその活性の期間を決定するため、1つの研究が実施された。この研究のため、フラスコあたり1.5 x 107個の細胞が照射された。照射を受けた細胞の数は、臨床的用量の製造において使用されるものと同等ではなかったが、照射後の機能性のアッセイは、製品化の可能性に関する見識をもたらす。

これらの実験の目的のため、haNK003細胞は、X線照射器を用いて10 Gyで照射された。非照射の細胞は、照射無しで同じ処置を受けた。標的細胞は、NK細胞による死滅の異なる機構への感受性を表すように選択された。たとえば、K562細胞は自然細胞傷害による死滅に対して高度に感受性であり、一方でDOHHは、自然細胞傷害を介する死滅には不完全に感受性であるが、適切な抗体を用いるADCCには感受性である。照射された細胞および非照射の細胞は、自社で開発したフローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて、特異的細胞傷害に関して並行してアッセイされた。標的細胞は、長い脂肪族尾部を有する緑色蛍光色素（PKH67）で標識されて、該色素が細胞膜の脂質領域に安定的に組み込まれた。細胞溶解は、ヨウ化プロピジウム染色によりモニターされた。

自然細胞傷害活性の分析は、標的細胞により、および照射後の時間により、照射の影響力が異なることを証明する。K562などの感受性の細胞に関して、自然細胞傷害活性は照射の6時間以内は維持されたが、すべてのエフェクター 対 標的比（E:T）にわたって、24時間後には40%以上減少した（図5）。DOHH2に関して、自然細胞傷害活性はまた、照射後6時間の時点では保持されたが、すべてのエフェクター 対 標的比にわたって、24時間後には14%以上減少し、10:1のE:T比で50%も減少した（図6）。

DOHH2標的についてのリツキシマブ媒介性ADCC活性のレベルはまた、6時間の時点で、照射された細胞によって維持された。しかしながら、24時間の時点での照射された細胞のリツキシマブ媒介性ADCC活性は、6時間の時点での細胞、および24時間の時点での非照射の細胞で観察された活性から、約16%以上減少した（図7）。予想されたように、Herceptin（トラスツズマブ）は、haNK003との組み合わせにおいて、DOHH2標的細胞のいかなるADCC死滅も誘導せず（図4）、抗体単独（リツキシマブまたはトラスツズマブ）でも、いかなるDOHH2標的細胞の死滅も誘導しない（データは示さない）。

細胞傷害活性およびADCC活性の適切なレベルは、予備的に製剤化されたhaNK003細胞の照射後、少なくとも6時間維持された。

実施例3 IL-2放出の特徴付け
haNK003細胞において細胞内に保持されるIL-2の量とともに、haNK003細胞によって培養培地中に放出されるIL-2の量をも、さまざまな時点で分析するために、1つの研究が実施された。IL-2の量は、haNK003からのIL-2の放出を決定するために上清において測定された。IL-2の量は、haNK003における細胞内IL-2の総レベルを決定するために細胞ペレット溶解物において測定された。試料は、IL-2放出および細胞内IL-2レベルに対する照射の影響力を決定するために照射前および照射後に分析された。

2つの別々のアッセイが実施され（実験番号1および実験番号2）、ここでhaNK003細胞はT-75フラスコ中で培養され、そしてX線照射器を用いて0 Gy（非照射）で、または10 Gy（照射）で照射された。haNK003細胞（非照射および照射）はその後、5%熱不活性化ヒトAB血清が添加されたX-Vivo 10中で48時間まで培養された。分析のため、細胞ペレットとともに培養上清からも、試料がさまざまな時点で回収された。細胞ペレットは、全細胞内IL-2を定量化するために、界面活性剤を基材とする溶液を用いて溶解された。培養上清中のおよび細胞溶解物試料中のIL-2濃度は、NantKwestにおいてまたはAllCells, LLCによって、2つの異なる検出方法（サンドイッチELISAまたはマルチプレックスELISA）を用いて独立して測定された。

2つの異なる方法によって測定されたIL-2濃度の値は、同じ試料について、平均で5倍異なる。両方法は、照射された細胞および非照射の細胞の両方について、経時的なIL-2放出の線形増加を示す（表3、ならびに図8A、8B、8C、および8D）。実験番号1と実験番号2とのアッセイ間で差異は異なったものの、照射された細胞の培養上清におけるIL-2濃度は、すべての時点で、非照射の細胞よりも高い傾向にある。

（表３）照射されたhaNK003 対 非照射のhaNK003の、異なる時点での細胞1 x 10⁶個あたりの放出されたIL-2（pg/mL）（2回の読み取りの平均および標準偏差[StDev]）

h－時間

2つの異なる方法によって測定された全細胞内IL-2濃度の値は、同じ試料について、平均で5倍異なる（表4、ならびに図9A、9B、9C、および9D）。両方法は、非照射の細胞溶解物において経時的な全細胞内IL-2の増加を示し、一方で照射された細胞溶解物における全細胞内IL-2の量は経時的に低下する。培養の6時間の時点で、全細胞内IL-2のレベルは、両方法で測定された際、照射された細胞と非照射の細胞との間で同等であった。照射された細胞において、これらのレベルは培養の48時間後では低下する。

（表４）照射されたhaNK003 対 非照射のhaNK003の、異なる時点での細胞1 x 10⁶個あたりの全細胞内IL-2含有量（pg）（2回の読み取りの平均および標準偏差[StDev]）

h－時間

細胞のネクローシス時のIL-2の放出を刺激するため、細胞は低浸透圧ショックにさらされた。このレベルは、界面活性剤に基づく方法を用いて調製された細胞溶解物において測定された全細胞内IL-2濃度と比較された。2つの方法（サンドイッチELISAまたはマルチプレックスELISA）によって測定された、可溶化されたIL-2濃度の値は、同じ試料についておよそ10倍異なる（表5、ならびに図10Aおよび10B）。低浸透圧ショックからの溶解物におけるIL-2濃度は、181.93～289.54 pg／細胞106個（サンドイッチELISA）か、2619.15～3301.02 pg／細胞106個（マルチプレックスELISA）のいずれかであった、これは、界面活性剤に基づく溶解を用いて調製された細胞溶解物において測定された全細胞内IL-2濃度の、平均で14%（サンドイッチELISA）と27%（マルチプレックスELISA）とに相当する。

（表５）haNK003細胞の、細胞1 x 10₆個あたりの可溶化IL-2の量（pg）（2回の読み取りの平均および標準偏差[StDev]）

マルチプレックスELISAのIL-2定量化の値は、サンドイッチELISA法からのデータよりも5～10倍高かった。これら2つの方法からの絶対値は変動性を有するが、傾向は両方のデータセットの間で一致しており、以下に要約される。このデータは、該産物をさらに発展させる際に、haNK003細胞からのIL-2分泌および細胞内IL-2レベルをNantKwestが特徴付けし続けることを可能にするために有用であろう。

要約すると、haNK003細胞は培養培地中に検出可能な量のIL-2を放出し（細胞100万個あたり10～40 pg／時間）、定常状態の培養条件下で生細胞によって放出されたIL-2の量は、全細胞内IL-2貯蔵量の平均で10%未満に相当する。

10 Gyの線量でのhaNK003細胞の照射は、48時間の期間にわたって放出されるIL-2の量を増加させ、これは死細胞の存在を反映している可能性が高い。さらに、照射はIL-2をいっせいに放出させるわけではなく、徐々に、経時的に放出させる。

ネクローシス細胞死の際のIL-2の放出を刺激するため、haNK003細胞は低浸透圧ショックにさらされた。これらの条件下で放出されたIL-2の量は、Triton X-100溶解物（すべての細胞内区画からのタンパク質を可溶化する）において決定された全細胞内IL-2の、14%か27%のいずれかに相当する。

全体的に、haNK003細胞は低レベルのIL-2を分泌する（両方法からのすべての実験にわたって平均された場合に、6時間にわたって、照射された細胞で493.8 pg/mL、および非照射の細胞で276.1 pg/mL）。総合すると、haNK003細胞によって分泌される低レベルのIL-2、血漿でのIL-2の極度に短い半減期、および照射されたhaNK003細胞のインビボでの持続性の欠如は、注入されたhaNK003によるIL-2放出が臨床的な有害作用を引き起こす可能性は低いことを示唆する。

インビトロでの増殖能力および機能性に対する照射の影響は、予備的に製剤化された細胞を用いた開発の研究において試験されたように、haNK003細胞はインビトロで増殖が制限されること（細胞の0.1%未満）、ならびに細胞傷害活性のレベルおよびADCC活性のレベルは照射後少なくとも6時間の間維持されることを証明する。

照射前および照射後のhaNK003細胞のIL-2分泌および細胞内IL-2レベルは、haNK003細胞が低いレベルのIL-2を分泌することを証明する。haNK003細胞は、照射されても非照射でも、ヒトにおいて有害作用を有すると予想され得る量のIL-2を放出しない。

実施例4 静脈内投与された、単回投与haNK003細胞の許容性および腫瘍形成性
ナチュラルキラー（NK）細胞は、がん療法に関して有効な細胞傷害エフェクター細胞であり、かつウイルス感染に関して潜在的に有効である。NantKwestは、GMPグレードの活性化NK（aNK細胞）を製造するための、NK細胞に基づく独自のプラットフォームを成功裏に確立した。aNK細胞は、多様な進行した血液性悪性腫瘍および固形腫瘍を有する患者の細胞療法のため、臨床において積極的に推し進められている。最近、結果的に得られるhaNK003細胞がIL-2に依存せずに増殖することを可能にするER IL-2遺伝子を含む新規なトランスフェクションベクターを利用して、GMPグレードの、プラスミドがトランスフェクトされた、高親和性CD16受容体を発現するNK-92の変異体が、開発された。高親和性CD16受容体の発現は、haNK003細胞が、リツキシマブおよびトラスツズマブおよびダラツムマブとの組み合わせにおいて、親のNK-92細胞によっては死滅させられなかった標的細胞株に対して高い抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を示すことを可能にする。1つの細胞クローンが、マスターセルバンクhaNK003を作製するために選択された、これは臨床開発中である。

材料および方法
十八（18）匹のNOD.CB17-Prkdc^scid/J（NOD/SCID）マウス（9匹の雄および9匹の雌）は、NOD/SCIDマウスにおいて静脈内投与される単回投与haNK003細胞の許容性および腫瘍形成性を調査するために、使用された。マウスはJackson Laboratory (610 Main Street Bar Harbor, ME 04609 US)から取得された。

18匹のNOD/SCIDマウスが選択され、そして動物の体重に基づき、1つの群につき6匹のマウス（3匹の雄および3匹の雌）を有する3つの群へと無作為に割り当てられた。マウスは、表6に示されるように、単回投与の、PBS、非照射のhaNK003細胞、または10 Gyで照射されたhaNK003細胞を静脈内投与された。動物はその後、毎日の観察、および週に2回の動物の体重測定によってモニターされた。5週間後、動物は安楽死させられ、主要な器官は回収され、そしてさらなる組織病理学的検査および抗CD56抗体を用いた免疫組織化学的分析のために処理された。

（表６）研究の設計

細胞培養に関し、haNK003細胞は、5%熱不活性化ヒトAB血清（カタログ番号IPLA-SERAB-HI、Innovative Research）、100 Uペニシリン／mlおよび100 μg/mlストレプトマイシン（Corning、カタログ番号30-002-CI）が添加されたX-Vivo 10培地（カタログ番号BE02-055Q）中で培養された。

照射に関し、指数増殖期で増殖中のhaNK003細胞が回収され、そして生細胞数および生存率が計算された。適切な日に、haNK003細胞の半分は、JL Shephard Mark 1 Model 68 ₁₃₇Cs照射器を用いて1000 cGyの線量で照射された（the Department of Radiation Oncology, the University of California, Irvine, CA 92697によって提供される業務）。

投与用の細胞調製物に関し、非照射の、または照射されたhaNK003細胞は、動物施設（1124 W. Carson Street, Torrance, CA, 90502）への輸送の間、氷上で維持された。細胞は冷PBSで2回洗浄され、そしてその後、適切な量の冷PBS中に再懸濁され、そして40 μmのセルストレーナーを通過させて、生細胞5 x 10₇個／mlの最終細胞密度の単一細胞調製物が作製された。細胞生存率はVi-CELL cell viability analyzerを用いて決定され、85%超の生存率を有する細胞のみが、この研究のために使用された。その後、これらの非照射のまたは照射されたhaNK003細胞は、適切な群それぞれの動物への静脈内投与のため、室温で保管された。

18匹のNOD/SCIDマウスが選択され、そして動物の体重に基づき、1つの群につき6匹のマウス（3匹の雄および3匹の雌）を有する3つの群へと無作為に割り当てられた。

適切な日に、A群の各動物はそれぞれ、特定の量のPBSを受けた。投与量は、個々の動物の体重にかかわらず200 μlであった。研究プロトコルに示されるように、投与経路は尾静脈を介した静脈内注入であり、投与スケジュールは単回投与であった。適切な日に、B群およびC群の各動物は、200 μlのPBS中の1 x 10⁷個の、非照射のhaNK003細胞および照射されたhaNK003細胞を、それぞれ受けた。投与量は200 μlであり、投与経路は尾静脈を介した静脈内注入であり；投与スケジュールは単回投与であった。

動物は、1日に1回、全体的な外観について観察された。臨床観察は1日に2回実施され、そして記録された。動物は処置後、移動力などの正常な行動、食物および水消費（目測によって）、ならびに体重（増加／減少）に対する影響に関して慣例どおりにモニターされた。

平均および平均の標準誤差（SEM）を含む要約統計量は、各時点での各群の動物の体重に関してもたらされた。群の間での動物の体重変化における差異の統計学的分析は、ボンフェローニ検定が後に続く、反復測定の二元配置ANOVAを用いて評価された。すべてのデータはGraphPad Prismソフトウェア バージョン5を用いて分析された。p ＜ 0.05が統計学的に有意とみなされた。

結果
単剤として静脈内投与された、細胞1 x 10⁷個の用量の、非照射のまたは照射されたhaNK003細胞は、それぞれ5.2%および4.4%の最大の平均体重減少で、良好に許容された。表7、図11に示されるように、PBS処置された対照群と比較して、照射されたhaNK003細胞と非照射のhaNK003細胞（1 x 10⁷個）のどちらが単回投与で投与された場合でも、NOD/SCIDマウスにおいて有意な体重減少は無かった。表7に示されるように、すべての処置群において、5週間の観察の間、処置に関連するいかなる死亡も生じなかった。

マウスが雄か雌かにかかわらず、すべての処置群で、脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、および胸腺を含む評価されたすべての組織ならびに器官において、いかなる可視の腫瘍塊も無かった。組織学的分析および抗CD56抗体を用いたIHC染色からの結果は、脳、骨髄、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、および胸腺を含む組織ならびに器官において、haNK003細胞に関連するいかなるリンパ性凝集塊も無かったことを確認し、これは非照射のおよび照射されたhaNK003細胞の両方とも、NOD/SCIDマウスにおいて腫瘍形成能力を有さないことを示唆する。

脳、骨髄、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、および胸腺を含む、この研究で取得されたすべての検体の病理学的検査は、PBS処置された群と比較して、非照射のhaNK003細胞で処置された群と照射されたhaNK003細胞で処置された群のどちらにおいても、haNK003処置に関するいかなる有意な毒性も無かったことを示した。

（表７）NOD/SCIDマウスにおける、静脈内投与されたhaNK003の、動物の体重、死亡数、および腫瘍形成性に対する影響

注： ^aMWL：最大の体重減少； ^bPBS処置に対するp値（ボンフェローニ検定が後に続く、反復測定の二元配置ANOVA）； ^c（n／総数）：個々の群における動物の総数のうちの、処置に関連する動物死の数。

単剤として静脈内投与された、細胞1 x 10⁷個の用量の照射されたhaNK003細胞と非照射のhaNK003細胞のどちらも、雄および雌両方のNOD/SCIDマウスにおいて良好に許容された。照射されたhaNK003での処置と非照射のhaNK003での処置の、どちらに関連する有意な体重減少も無かった。すべての処置群において、5週間の観察の間、処置に関連するいかなる死亡も生じなかった。脳、骨髄、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、および胸腺を含む主要な器官において、いかなる有意な病理学的変化も無かった。最も重要なことに、雄および雌両方のNOD/SCIDマウスにおいて、照射されたhaNK003細胞も非照射のhaNK003細胞も、腫瘍形成能力は無かった。

実施例5 静脈内投与された、反復投与haNK003細胞の許容性および腫瘍形成性
材料および方法
十八（18）匹のNOD.CB17-Prkdcscid/J（NOD/SCID）マウス（9匹の雄および9匹の雌）は、NOD/SCIDマウスにおいて静脈内投与される単回投与haNK003細胞の許容性および腫瘍形成性を調査するために、使用された。マウスはJackson Laboratory (610 Main Street Bar Harbor, ME 04609 US)から取得された。

18匹のNOD/SCIDマウスが選択され、そして動物の体重に基づき、1つの群につき6匹のマウス（3匹の雄および3匹の雌）を有する3つの群へと無作為に割り当てられた。マウスは、表8に示されるように、PBS、非照射のhaNK003細胞、または10 Gyで照射されたhaNK003細胞それぞれの反復投与を、週に1回、4週間、静脈内投与された。動物はその後、毎日の観察、および週に2回の動物の体重測定によってモニターされた。5週間後、動物は安楽死させられ、主要な器官は回収され、そしてさらなる組織病理学的検査および抗CD56抗体を用いた免疫組織化学的（IHC）分析のために処理された。

（表８）研究の設計

細胞培養に関し、haNK003細胞は、5%熱不活性化ヒトAB血清（カタログ番号IPLA-SERAB-HI、Innovative Research）、100 Uペニシリン／mlおよび100 μg/mlストレプトマイシン（Corning、カタログ番号30-002-CI）が添加されたX-Vivo 10培地（カタログ番号BE02-055Q）中で培養された。

照射に関し、指数増殖期で増殖中のhaNK003細胞が回収され、そして生細胞数および生存率が計算された。適切な日に、haNK003細胞の半分は、JL Shephard Mark 1 Model 68 ₁₃₇Cs照射器を用いて1000 cGyの線量で照射された（the Department of Radiation Oncology, the University of California, Irvine, CA 92697によって提供される業務）。

投与用の細胞調製物に関し、非照射の、または照射されたhaNK003細胞は、動物施設（1124 W. Carson Street, Torrance, CA, 90502）への輸送の間、氷上で維持された。細胞は冷PBSで2回洗浄され、そしてその後適切な量の冷PBS中に再懸濁され、そして40 μmのセルストレーナーを通過させて、細胞5 x 10₇個／mlの最終細胞密度の単一細胞調製物が作製された。細胞生存率はVi-CELL cell viability analyzerを用いて決定され、85%超の生存率を有する細胞のみが、この研究のために使用された。その後、これらの非照射のまたは照射されたhaNK003細胞は、適切な群それぞれの動物への静脈内投与のため、室温で保管された。

18匹のNOD/SCIDマウスが選択され、そして動物の体重に基づき、1つの群につき6匹のマウス（3匹の雄および3匹の雌）を有する3つの群へと無作為に割り当てられた。

適切な日に、A群の各動物は、個々の動物の体重にかかわらず200 μlのPBSを受けた。研究プロトコル（付録1）に示されるように、投与経路は尾静脈を介した静脈内注入であり、投与スケジュールは週に1回、全4週間であった。B群およびC群の各動物は、200 μlのPBS中の1 x 10₇個の、非照射のhaNK003細胞および照射されたhaNK003細胞を、それぞれ受けた。研究プロトコルに示されるように、投与量は200 μlであり、投与経路は尾静脈を介した静脈内注入であり、投与スケジュールは週に1回、全4週間であった。

動物は、1日に1回、全体的な外観について観察された。臨床観察は1日に2回実施され、そして記録された。動物は、処置後、移動力などの正常な行動、食物および水消費（目測によって）、ならびに体重（増加／減少）に対する影響に関して慣例どおりにモニターされた。

平均および平均の標準誤差（SEM）を含む要約統計量は、各時点での各群の動物の体重に関してもたらされた。群の間での動物の体重変化における差異の統計学的分析は、ボンフェローニ検定が後に続く、反復測定の二元配置ANOVAを用いて評価された。すべてのデータはGraphPad Prismソフトウェア バージョン5を用いて分析された。p ＜ 0.05が統計学的に有意とみなされた。

結果
単剤として、週に1回、4週間静脈内投与された、非照射のまたは照射されたhaNK003細胞は、それぞれ3.4%および4.9%の最大の平均体重減少で、良好に許容された。表9、図12に示されるように、PBS処置された対照群と比較して、マウスが雄か雌かにかかわらず、非照射のhaNK003細胞と照射されたhaNK003細胞（1 x 10⁷個）のどちらが投与された場合でも、NOD/SCIDマウスにおいて有意な体重減少は無かった。表9に要約されるように、すべての処置群において、5週間の観察の間、処置に関連するいかなる死亡も生じなかった。

（表９）NOD/SCIDマウスにおける、動物の体重、死亡数、および腫瘍形成性に対するhaNK003細胞の影響

注： ^aMWL：最大の体重減少； ^bPBS処置に対するp値（ボンフェローニ検定が後に続く、反復測定の二元配置ANOVA）； ^c（n／総数）：個々の群における動物の総数のうちの、処置に関連する動物死の数。

脳、骨髄、心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、および胸腺を含む、この研究で取得されたすべての検体のマクロ病理学的ならびに組織病理学的検査は、PBS処置された対照群と比較して、非照射のhaNK003細胞で処置された群と照射されたhaNK003細胞で処置された群のどちらにおいても、これらの器官において、haNK003処置に関するいかなる有意な毒性も無かったことを示した。すべての動物において、脾腫は確認されなかった。すべての処置群において、肉眼的所見で腫瘍塊は見つからなかった。抗CD56抗体を用いるIHCからの結果は、骨髄、脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、脾臓、胸腺等を含む組織および器官において、5週間の追跡調査の間、haNK003細胞に関連するいかなるリンパ性凝集塊も無かったことを確認し、これは、NOD/SCIDマウスにおいて、これらの5週間にわたり、照射されたhaNK003細胞に関連する白血病または腫瘍発生も、非照射のhaNK003細胞に関連する白血病または腫瘍発生も無かったことを示唆する。

すべてのこれらの組織において、浮腫も、変性も、ネクローシスも存在しなかった。PBS対照群と比較して、肝臓組織における、極めて限局性の軽微な脂肪化、および最小限の脂肪化が、非照射のhaNK003処置群および照射されたhaNK003処置群においてそれぞれ認められた。PBS処置群、非照射haNK003処置群、または照射されたhaNK003処置群における肝実質が、好中球および単核細胞を含む混合された炎症性細胞の、わずかな微細な病巣を示したこともまた注目に値する。これらの小さいクラスター細胞はCD56陰性であったので、これらの混合された炎症性細胞は繰り返された処置（尾静脈注入）に起因するものであって、haNK003処置に関連しない可能性が極めて高いことを示唆する。

要約すると、非照射のHaNK003細胞、および照射されたHaNK003細胞は良好に許容された。この投与レジメンにおいて、NOD/SCIDマウスでの、haNK003処置に関連するいかなる有意な毒性も腫瘍形成性問題も無かった。

実施例6 aNKとhaNK003との自然細胞傷害活性の比較
ナチュラルキラー（NK）細胞が標的細胞を死滅させる主要な機構は、細胞連結部の形成、ならびにそれに続くパーフォリンおよびグランザイムの分泌を介するものである。これは次に、形質膜の崩壊および細胞死をもたらす、標的細胞内でのアポトーシスのプロセスを誘導する。標的細胞は、ウイルスが感染した細胞および／または形質転換された細胞に特徴的であるストレス抗原を発現することによって認識されることができる。NK細胞上の活性化受容体でのストレス抗原の関与を介する標的細胞の認識およびそれに続く死滅は、自然（または直接）細胞傷害と称される。

自然細胞傷害はNK細胞の主要な機能的特徴であるため、細胞変異体におけるこの機能性の分析、および活性化されたNK-92細胞（aNK）活性との比較は、aNK細胞の特定の遺伝学的改変の影響力を確認する助けとなる。

材料および方法
液性腫瘍および固形腫瘍の代表的な六つ（6）の細胞株が標的として選択された。標的はまた、aNK細胞での死滅に対して一定の範囲の感受性を示すように選択された、SR-91は死滅に対して比較的非感受性であり、K562は死滅に対して高度に感受性であり、他のものはそれらの間のところに位置する。標的細胞およびエフェクター細胞（haNK003またはaNK）は、4時間、37度で共インキュベートされ、そして標的細胞の死滅は、PKH67蛍光色素染色を付加された標的細胞に対するエフェクター細胞の特異的細胞傷害を決定するための自社で開発した方法を用いるフローサイトメトリーによって決定された。PKH67 Fluorescent Cell Linker Kitsは、専有の膜標識技術（Sigma-Aldrich）を使用して、長い脂肪族尾部を有する緑色蛍光色素（PKH67）を細胞膜の脂質領域内へと安定的に組み込む。そのより長い脂肪族炭素尾部のため、PKH67は減少した細胞－細胞移行を示す。PKH67は、ヨウ化プロピジウムを生存性のプローブとして使用する細胞傷害アッセイに好適である。ヨウ化プロピジウムを用いた染色は、死標的細胞（二重に染色される）を、死エフェクター細胞（aNKまたはhaNK細胞）と区別する。

細胞培養に関し、aNK細胞は、5%熱不活性化ヒトAB血清（CMV陰性の試験ドナーから）および500 IU/ml組み換えヒトIL-2が添加されたX-Vivo 10培地中で培養された。aNK培養は、細胞密度を、細胞 ＞10e5個／mLかつ細胞 ＜10e6個／mLに維持するため、1～4日ごとに継代された。haNK003細胞は、5%熱不活性化ヒトAB血清（CMV陰性の試験ドナーから）が添加されたX-Vivo 10培地中で、IL-2無しで培養された。haNK003培養は、細胞密度を、細胞 ＞10e5個／mLかつ細胞 ＜10e6個／mLに維持するため、1～4日ごとに継代された。K562、Daudi、DOHH2、HL-60、SR-91、およびSKOV3細胞は、10%熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、および抗生物質／抗真菌剤の混合物が添加されたRPMI-1640中で培養された。浮遊状態で増殖する細胞は単純な希釈によって継代され、一方で接着細胞（SKOV3）は、TrypLE（商標）を用いて培養をトリプシン処理することによって継代された。継代は、2～5日ごと（細胞株に特有の倍加時間に応じて）か、または培養培地が、培地の消費を示す黄色（酸性）になった時であった。

試料の調製に関し、浮遊状態で増殖する細胞株は、細胞培養物を上下にピペッティングすることによって再懸濁された。接着性の標的細胞株（SKOV3）は、TrypLE（商標）を用いて酵素的に培養容器から分離され、そしてトリプシン処理された細胞ペレットを上下にピペッティングすることによって再懸濁された。細胞生存率は、手作業での計測（トリパンブルー排除法）により決定された。標的細胞およびエフェクター細胞の、必要とされる細胞濃度への希釈は、10%熱不活性化FBSおよび抗生物質／抗真菌剤が添加されたRPMI-1640中で実施された。エフェクター細胞および標的細胞は、96ウェルプレート中で、異なるエフェクター 対 標的（20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.62:1、0.31:1、および0.15:1のE:T）比で混合され、そして5%のCO₂雰囲気、37度のインキュベーター中で4時間共インキュベートされた。

試料は、MACSQuantフローサイトメーター（Miltenyi）上で、B1（FITC）およびB3（PerCP-Vio700/PI）の蛍光チャンネルを用いて分析された。PI非存在下およびPI存在下の標的単独は、B1/B3補正パラメーターを決定するために使用された。

細胞傷害%は、式 = [(試料での、FITC+/PI+細胞の%) - (PI存在下の標的単独での、FITC+/PI+の%)] / [100 - (PI存在下の標的単独での、FITC+/PI+の%)]によって算定された。

結果
この研究で使用されたaNK細胞およびhaNK003細胞は2016年7月22日に解凍された。この研究で使用されたすべての標的細胞培養物は8週齢未満であった。標的細胞およびエフェクター細胞の培養物は、アッセイの最大でも48時間前に継代された。

図13～18に示される結果は、K562が最も感受性（低いエフェクター 対 標的比の1:1で75%の特異的溶解）であるという、aNKによる死滅への標的細胞株の感受性を確認する。Daudi、DOHH2、およびHL-60は、65～80%の特異的溶解を達成するためにより高いエフェクター 対 標的比（10:1）を必要とする、中間の感受性を示した。SKOV3およびSR-91は、およそ40%の特異的溶解を達成するために10:1を超えるエフェクター 対 標的比を必要とし、最も耐性であった。それぞれの場合で、haNK003の自然細胞傷害活性はaNKのそれと同等であり、かつ全体的に、実験の誤差範囲内で、同じ活性プロファイルに沿っていた。

aNK細胞およびhaNK003細胞は、試験された6つのがん細胞株に対して同等の細胞傷害活性を示し、aNK細胞の自然細胞傷害活性は、haNK003細胞を作製するために使用された遺伝的改変にもかかわらず、本質的に同じであることを証明する。haNK003細胞およびaNK細胞は、自然細胞傷害活性に関して同等の機能性である。

実施例7 MDA-MB-453ヒト乳がん皮下マウスモデルにおける、haNK003の抗腫瘍活性の評価
この研究において、単剤としてのhaNK003細胞の抗腫瘍活性が、雌NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ（NOD scid gamma、NSG）マウスでのMDA-MB-453ヒト乳がん皮下異種移植モデルにおいて評価された。

材料および方法
12匹のNOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ（NOD scid gamma、NSG）マウスは、MDA-MB-453ヒト乳がん皮下（s.c.）異種移植モデルにおいて、haNK003の抗腫瘍活性を評価するために使用された。マウスはJackson Laboratory (610 Main Street Bar Harbor, ME 04609 US)から取得された。

MDA-MB-453 HER2陽性ヒト乳がん皮下異種移植モデルは、雌のNSGマウスにおいて構築された。腫瘍の平均サイズが約100 mm³に達したら処置が開始され、そして単剤としてのhaNK003細胞の抗腫瘍活性が、この異種移植モデルにおいて評価された。他の試験物が、プロトコルLABC-X01612のもとで並行して評価されたが、PBSとの比較におけるhaNK003の成績のみが本明細書において示される。haNK003処置群、および投与レジメンの設計は、表10に記載される。

（表１０）研究の設計

腫瘍細胞の培養に関し、MDA-MB-453ヒト乳がん細胞（ATCC、カタログ番号HTB-131）は、10%熱不活性化FBS（GeneTex、カタログ番号GTX73252）、100 Uペニシリン／mlおよび100 μg/mlストレプトマイシン（Corning、カタログ番号30-002-CI）が添加された、ATCCにより調合されたLeibovitz’s L-15培地（ATCC、カタログ番号30-2008）中で培養された。

腫瘍細胞の注入に関し、各動物は計量され、そしてその後、50% Matrigel（Corning、カタログ番号354234）中の、1 mLあたり1.0 x 10₈個のMDA-MB-453ヒト乳がん細胞の0.1 mlが、25ゲージの針で、左右の脇腹の部分において皮下に注入された。細胞生存率はVi-CELL cell viability analyzerを用いて決定され、95%超の生存率を有する細胞のみが、このインビボ研究のために使用された。

haNK003細胞の培養に関し、haNK003細胞は、5%熱不活性化ヒトAB血清（Innovative Research、カタログ番号IPLA-SERAB-HI）、100 Uペニシリン／mlおよび100 μg/mlストレプトマイシンが添加されたX-Vivo 10培地（Lonza、カタログ番号BE02-055Q）中で培養された。

照射に関し、指数増殖期で増殖中のhaNK003細胞が回収され、そして生細胞数および生存率が計算された。適切な日に、haNK003細胞は、JL Shephard Mark 1 Model 68 ₁₃₇Cs照射器を用いて1000 cGyの線量で照射された（the Department of Radiation Oncology, the University of California, Irvine, CA 92697によって提供される業務）。

投与用の細胞調製物に関し、照射されたhaNK003細胞は、動物施設（1124 W. Carson Street, Torrance, CA, 90502）への輸送の間、氷上で維持された。細胞は冷PBSで2回洗浄され、そしてその後、適切な量の冷PBS中に再懸濁され、そして40 μmのセルストレーナー（Corning、カタログ番号431750）を通過させて、それぞれ細胞1.25 x 10₇個／ml、または細胞5 x 10₇ 個／mlの最終細胞密度の単一細胞調製物が作製された。その後、これらの照射されたhaNK003細胞は、適切な群それぞれの動物への静脈内投与のため、室温で保管された。

12匹のNSGマウスが選択され、そして適切な腫瘍サイズに基づき、1つの群につき4匹のマウスを有する3つの研究群へと無作為に割り当てられた。無作為化は各動物の総腫瘍体積、および動物の体重に基づいて行った。この有効性研究のため、腫瘍の平均サイズが約100 mm₃に達したら、無作為化が実施され、そして処置が開始された。

投与量は、個々の動物の体重にかかわらず200 μlであった。研究プロトコルに示されるように、投与経路は尾静脈を介した静脈内注入であり、投与スケジュールは週に2回、全4週間であった。適切な日に、F群およびG群の各動物は、200 μlのPBS中の、それぞれ2.5 x 10₆個、および1 x 10₇個の照射されたhaNK003細胞を受けた。投与量は200 μlであり、投与経路は尾静脈を介した静脈内注入であり、投与スケジュールは週に2回、全4週間であった。

動物は、1日に1回、全体的な外観について観察された。臨床観察は1日に2回実施され、そして記録された。動物は、処置後、移動力などの正常な行動、食物および水消費（目測によって）、ならびに体重（増加／減少）に対する影響に関して慣例どおりにモニターされた。

腫瘍サイズは、（腫瘍が出現したら）最初の投与の前に、デジタルの手持ち式測径器を用いて、週に2回、3次元で測定され、そしてその後、安楽死の前には週に2回測定された。主な終了点は、腫瘍増殖の抑制または減少であった。腫瘍の体積は、以下の式を用いてmm₃で表現された：V = 0.5 x L x W x H、ここでL、W、およびHは、それぞれ、腫瘍の長さ、幅、および高さである。腫瘍の体積はその後、T/C値の算定のために使用された。T/C (%) = ΔT / ΔC x 100、ここでΔTおよびΔCは、処置群および対照群それぞれの、観察日と測定の第1日との間の、平均腫瘍体積における変化である。

平均および平均の標準誤差（SEM）を含む要約統計量は、各時点での各群の腫瘍体積または動物の体重に関してもたらされた。群の間での、腫瘍体積または動物の体重変化における差異の統計学的分析は、ボンフェローニ検定が後に続く、反復測定の二元配置ANOVAを用いて評価された。すべてのデータはGraphPad Prismソフトウェア バージョン5を用いて分析された。p ＜ 0.05が統計学的に有意とみなされた。

結果
雌のNSGマウスでの皮下MDA-MB-453 HER2陽性ヒト乳がん異種移植における、単剤としてのhaNK003の抗腫瘍活性についてのデータが示される。結果の要約が表11にまとめられる。表11、図19に示されるように、細胞2.5 x 10⁶個または1.0 x 10⁷個の用量で、週に2回、4週間、単剤として静脈内投与されたhaNK003細胞は、それぞれ17.4%および1.3%（PBS群と比較して、p = 0.043、およびp = 0.006）のT/C値で、腫瘍増殖を有意に抑制した。表11、図20に示されるように、細胞2.5 x 10⁶個または1.0 x 10⁷個の用量のHaNK003は、それぞれ0.6%および5.6%（PBS群と比較して、p = 0.203およびp = 0.085）の最大の平均体重減少で、良好に許容された。表11に要約されるように、この研究において、haNK003処置に関連するいかなる死亡も生じなかった。

（表１１）雌のNSGマウスでのMDA-MB-453ヒト乳がん皮下異種移植モデルにおけるhaNK003細胞の抗腫瘍活性

注： a T/C (%)は以下の式を用いて算定された：T/C (%) = ΔT / ΔC x 100、ここでΔTおよびΔCは、処置群および対照群それぞれの、測定の第26日と第1日との間の、平均腫瘍体積における変化である。 b MWL：動物の最大の体重減少。 c PBS処置に対するP値（ボンフェローニ検定が後に続く、反復測定の二元配置ANOVA）。

細胞2.5 x 10⁶個または1.0 x 10⁷個の用量の、単剤としての照射されたhaNK003細胞は、雌NSGでのMDA-MB-453 HER2陽性ヒト乳がん異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を有意に抑制した。照射されたhaNK003細胞は両用量とも良好に許容された。haNK003処置に関連するいかなる死亡も生じなかった。

実施例8 低酸素に関連する遺伝子の発現は、haNK細胞において減少しない
ナチュラルキラー（NK）細胞の溶解活性は、インビトロでの低酸素環境下（1% O₂）で抑制され、かつNKG2D、パーフォリン、およびグランザイムの下方制御に関連する。正常なドナーからのNKの低酸素（1% O₂）への感受性には、いくらかの変動性がある。しかしながら、NK細胞の溶解活性は、インビトロで、外来のIL-2での活性化（16時間、1000 IU/ml）によって部分的に復活され得る。さらに、NK細胞は、1%酸素の条件下でADCCの能力を保持する。

低酸素条件がhaNK細胞における遺伝子発現を変化させるかどうかを決定するため、20%のまたは0%のO₂に5時間曝露された、3人の正常なドナーのNK細胞集団およびhaNK細胞において、RNA発現が決定された。3人の患者ドナーのNK細胞集団（950、962、996）は、0%酸素および20%酸素の2つの条件下でhaNK細胞と比較された。ペア間での試料のクラスタリングは、haNKをドナーNK細胞から区別する明瞭なクラスターを明らかにする（図21参照）。1人の患者の試料は、低酸素条件下または低酸素前条件下で、発現においてほとんど変化を有さないように見受けられる。具体的には、20%酸素条件下での962の発現は、0%酸素条件での996と、および0%酸素条件での962と、極めて類似するように見える。図21参照。試料にわたって最大の変動性を示す遺伝子は図22に示される。20%酸素条件と0%酸素条件との間で最大の変化を示す遺伝子は図23に示される。haNK細胞において、20%酸素条件と0%酸素条件との間で発現の変化を示さない、低酸素に関連する遺伝子は、図24に示される。これらの、低酸素に関連する同じ遺伝子は、950の試料についてはそれほどでもないとはいえ、950、962、および996の試料において減少した発現を有することが示される。図24参照。

実施例9 CD16の発現は、hank003細胞においてより安定である
抗体依存性細胞傷害（ADCC）の間に標的細胞を連続的に死滅させることによる優れた細胞傷害性を付与するためには、CD16の安定的な発現を有することが望ましい。HaNK-003（ER-IL-2を有する）は、PMA（ホルボール-12-ミリスタート13-アセタート）での活性化に続いて、またはK562標的細胞での刺激に対して、末梢血NK細胞（ドナーNK細胞）と比較して高いレベルでCD16を発現する。さらに、ADCCの後でのフローサイトメトリーによるCD16レベルの測定によれば、hank003細胞におけるCD16レベルは、ADCCの間およびADCCの後であまり影響を受けなかった。

NK細胞におけるPMA／イオノマイシンでの活性化はCD16特異的プロテアーゼの活性化およびCD16の開裂を誘導し、NK細胞におけるCD16発現レベルの下方制御をもたらすことが公知である。PMA／イオノマイシンの影響を決定するため、haNK003細胞およびドナーNK細胞は両方とも、40 nM PMAおよび669 nMイオノマイシンと1時間接触させ、そしてその後CD16発現レベルが調べられた。PMA／イオノマイシン処置は、ドナーNK細胞において94.36% ± 3.00のCD16発現の下方制御をもたらし、一方でhaNK003細胞においては該処置は、30% ± 0.04のみの下方制御、すなわちドナーNK細胞と比べて3倍少ないCD16下方制御をもたらした（図25）。

NK細胞とK562細胞との共培養が、NK細胞におけるCD16表面発現の脱落をもたらすCD16開裂プロテアーゼを刺激することもまた、公知である。そこで、ドナーNK細胞およびhaNK003細胞を両方とも、K562細胞とともに培養し、そしてその後、共培養の4時間後にCD16発現を測定した。haNK003細胞とK562との標準的な共培養条件（エフェクター：標的 = 1:1）は4時間以内に、標的細胞の、細胞傷害性の完全な死滅をもたらす。CD16発現は、haNK003細胞およびドナーNK細胞におけるCD16発現の回復を可能にするためのさらなる24時間の後に再び測定され、haNK003細胞およびドナーNK細胞におけるCD16回復のパーセンテージが決定された。CD16発現レベルは、共培養の4時間後に、ドナーNK細胞において60.25% ± 09下方制御されることが観察された。しかしながら、hank003細胞においてはCD16発現は、わずか4.9% ± 2.57だけ下方制御された。24時間後、ドナーNK細胞におけるCD16の下方制御は57.54% ± 26.82であったが、一方でhaNK003細胞においては、それはわずか2.78% ± 3.5であり、すなわち本来のCD16レベルに近かった（図26）。

haNK003細胞におけるCD16発現レベルはまた、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）後にも測定された。ADCCは、リツキシマブ（CD20に対する細胞溶解性モノクローナル抗体）の存在下で、haNK003細胞をDOHH-2（CD20+ ヒトリンパ腫B細胞株）とインキュベートすることによって実施され、その後にCD16発現の測定が続いた。ADCC後、CD16の発現は、haNK003細胞において10%未満下方制御された（図27Aおよび27B）。ADCC後でさえも高レベルのCD16が存在することは、haNK003細胞におけるCD16発現が高度に安定であることを示した。

配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> IMMUNITYBIO, INC.
<120> Modified NK-92 haNK003 Cells for the Clinic
<150> US 62/468,890
<151> 2017-03-08
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 5491
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 1
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 60
gacgtcgacg gatcgggaga tctcccgatc ccctatggtg cactctcagt acaatctgct 120
ctgatgccgc atagttaagc cagtatctgc tccctgcttg tgtgttggag gtcgctgagt 180
agtgcgcgag caaaatttaa gctacaacaa ggcaaggctt gaccgacaat tgcatgaaga 240
atctgcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgggatcc gctgaccaaa agagcaccaa 300
aggcgccctg accttcagcc cctacctgcg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac 360
atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag 420
aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga 480
gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg 540
gtttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac 600
gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccacctgg ctgcagtacg tgattcttga 660
tcccgagctt cgggttggaa gtgggtggga gagttcgagg ccttgcgctt aaggagcccc 720
ttcgcctcgt gcttgagttg aggcctggcc tgggcgctgg ggccgccgcg tgcgaatctg 780
gtggcacctt cgcgcctgtc tcgctgcttt cgataagtct ctagccattt aaaatttttg 840
atgacctgct gcgacgcttt ttttctggca agatagtctt gtaaatgcgg gccaagatct 900
gcacactggt atttcggttt ttggggccgc gggcggcgac ggggcccgtg cgtcccagcg 960
cacatgttcg gcgaggcggg gcctgcgagc gcggccaccg agaatcggac gggggtagtc 1020
tcaagctggc cggcctgctc tggtgcctgg cctcgcgccg ccgtgtatcg ccccgccctg 1080
ggcggcaagg ctggcccggt cggcaccagt tgcgtgagcg gaaagatggc cgcttcccgg 1140
ccctgctgca gggagctcaa aatggaggac gcggcgctcg ggagagcggg cgggtgagtc 1200
acccacacaa aggaaaaggg cctttccgtc ctcagccgtc gcttcatgtg actccacgga 1260
gtaccgggcg ccgtccaggc acctcgatta gttctcgagc ttttggagta cgtcgtcttt 1320
aggttggggg gaggggtttt atgcgatgga gtttccccac actgagtggg tggagactga 1380
agttaggcca gcttggcact tgatgtaatt ctccttggaa tttgcccttt ttgagtttgg 1440
atcttggttc attctcaagc ctcagacagt ggttcaaagt ttttttcttc catttcaggt 1500
gtcgtgataa tacgactcac tatagggaga cccaagctgg aattcgccac catgtggcag 1560
ctgctgctgc ctacagctct cctgctgctg gtgtccgccg gcatgagaac cgaggatctg 1620
cctaaggccg tggtgttcct ggaaccccag tggtacagag tgctggaaaa ggacagcgtg 1680
accctgaagt gccagggcgc ctacagcccc gaggacaata gcacccagtg gttccacaac 1740
gagagcctga tcagcagcca ggccagcagc tacttcatcg acgccgccac cgtggacgac 1800
agcggcgagt atagatgcca gaccaacctg agcaccctga gcgaccccgt gcagctggaa 1860
gtgcacatcg gatggctgct gctgcaggcc cccagatggg tgttcaaaga agaggacccc 1920
atccacctga gatgccactc ttggaagaac accgccctgc acaaagtgac ctacctgcag 1980
aacggcaagg gcagaaagta cttccaccac aacagcgact tctacatccc caaggccacc 2040
ctgaaggact ccggctccta cttctgcaga ggcctcgtgg gcagcaagaa cgtgtccagc 2100
gagacagtga acatcaccat cacccagggc ctggccgtgt ctaccatcag cagctttttc 2160
ccacccggct accaggtgtc cttctgcctc gtgatggtgc tgctgttcgc cgtggacacc 2220
ggcctgtact tcagcgtgaa aacaaacatc agaagcagca cccgggactg gaaggaccac 2280
aagttcaagt ggcggaagga cccccaggac aagtgaaatt ccgcccctct cccccccccc 2340
cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg 2400
cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga 2460
aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa 2520
tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa 2580
caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct 2640
gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg 2700
ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg 2760
ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg cctcggtgca 2820
catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg 2880
acgtggtttt cctttgaaaa acacgataac cgccaccatg taccggatgc agctgctgag 2940
ctgtatcgcc ctgtctctgg ccctcgtgac caacagcgcc cctaccagca gcagcaccaa 3000
gaaaacccag ctgcagctgg aacatctgct gctggacctg cagatgatcc tgaacggcat 3060
caacaactac aagaacccca agctgacccg gatgctgacc ttcaagttct acatgcccaa 3120
gaaggccacc gaactgaaac atctgcagtg cctggaagag gaactgaagc ccctggaaga 3180
agtgctgaac ctggcccaga gcaagaactt ccacctgagg cccagggacc tgatcagcaa 3240
catcaacgtg atcgtgctgg aactgaaagg cagcgagaca accttcatgt gcgagtacgc 3300
cgacgagaca gctaccatcg tggaatttct gaaccggtgg atcaccttct gccagagcat 3360
catcagcacc ctgaccggct ccgagaagga cgagctgtga gcggccgccc gctgatcagc 3420
ctcgaacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt 3480
ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc 3540
caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 3600
ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 3660
gtatcttatc atgtctgtgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg 3720
ggctctaggg ggtatccccg gatcctgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 3780
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 3840
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 3900
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 3960
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 4020
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 4080
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 4140
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 4200
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 4260
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 4320
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 4380
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 4440
ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 4500
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 4560
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 4620
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 4680
cagtgctgca atgataccgc gagaaccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 4740
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 4800
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 4860
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 4920
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 4980
ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 5040
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 5100
tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 5160
ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 5220
catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 5280
cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 5340
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 5400
acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 5460
ttattgtctc atgagcggat acatatttga a 5491

<210> 2
<211> 1872
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 2
gaattcgcca ccatgtggca gctgctgctg cctacagctc tcctgctgct ggtgtccgcc 60
ggcatgagaa ccgaggatct gcctaaggcc gtggtgttcc tggaacccca gtggtacaga 120
gtgctggaaa aggacagcgt gaccctgaag tgccagggcg cctacagccc cgaggacaat 180
agcacccagt ggttccacaa cgagagcctg atcagcagcc aggccagcag ctacttcatc 240
gacgccgcca ccgtggacga cagcggcgag tatagatgcc agaccaacct gagcaccctg 300
agcgaccccg tgcagctgga agtgcacatc ggatggctgc tgctgcaggc ccccagatgg 360
gtgttcaaag aagaggaccc catccacctg agatgccact cttggaagaa caccgccctg 420
cacaaagtga cctacctgca gaacggcaag ggcagaaagt acttccacca caacagcgac 480
ttctacatcc ccaaggccac cctgaaggac tccggctcct acttctgcag aggcctcgtg 540
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ctgctgttcg ccgtggacac cggcctgtac ttcagcgtga aaacaaacat cagaagcagc 720
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tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 1020
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<220>
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<211> 254
<212> PRT
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<220>
<223> synthetic construct
<400> 4
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250

<210> 5
<211> 483
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 5
atgtaccgga tgcagctgct gagctgtatc gccctgtctc tggccctcgt gaccaacagc 60
gcccctacca gcagcagcac caagaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggac 120
ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 180
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 240
gaggaactga agcccctgga agaagtgctg aacctggccc agagcaagaa cttccacctg 300
aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa aggcagcgag 360
acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 420
tggatcacct tctgccagag catcatcagc accctgaccg gctccgagaa ggacgagctg 480
tga 483

<210> 6
<211> 160
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 6
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu
145 150 155 160

Claims (15)

1. CD16（SEQ ID NO:3）およびIL-2（SEQ ID NO:5）の両方を含む異種性の核酸分子を含む、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ADCC）を有する改変されたNK-92細胞の集団であって、
   該細胞の集団中の90%超の細胞がCD56、CD16、CD54、およびNKp30を発現し、該細胞の集団中の5%未満の細胞がCD3を発現する、
   改変されたNK-92細胞の集団。
2. 核酸分子がDNA分子である、請求項1記載の細胞。
3. 核酸分子が、5’から3’へ、CD16をコードする配列、IRES配列、およびIL-2をコードする配列を含む、請求項1記載の細胞。
4. 細胞が、第17番染色体上にSEQ ID NO:1を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の細胞。
5. 細胞の平均倍加時間が55～70時間である、請求項1～4のいずれか一項記載の細胞。
6. 細胞の集団が、平均倍加時間を、1日から、2日、3日、4日、5日、10日、15日、20日、または25日維持する、請求項1～5のいずれか一項記載の細胞。
7. 細胞の集団が、1、2、3、または4日ごとに継代されることができる、請求項1～6のいずれか一項記載の細胞。
8. 細胞が、細胞100万個あたり10～60 pg／時間の濃度でIL-2を分泌する、請求項1～7のいずれか一項記載の細胞。
9. 細胞が、照射された細胞である、請求項1～7のいずれか一項記載の細胞。
10. 細胞が、対照と比較して、CD16発現の下方制御が減少している、請求項1～9のいずれか一項記載の細胞。
11. 細胞が、対照と比較して、ADCC後により高いレベルのCD16を維持する、請求項1～9のいずれか一項記載の細胞。
12. 請求項1～11のいずれか一項記載の細胞の集団を含む、キット。
13. 抗体をさらに含む、請求項12記載のキット。
14. 請求項1～11のいずれか一項記載の細胞の集団、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
15. 請求項14記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法。

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