CN115232216A - 嵌合抗原受体、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

嵌合抗原受体、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用。该CAR的重组共刺激分子包括第一模块和第二模块；第一模块为第一N端段，第二模块为连接的第二中间段及第二C端段、或者连接的第二N端段、第二中间段及第二C端段；或者，第一模块为连接的第一N端段和第一中间段、或者连接的第一N端段、第一中间段及第一C端段，第二模块为第二C端段、连接的第二中间段及第二C端段、或者连接的第二N端段、第二中间段及第二C端段；将两类共刺激结构域从N端到C端拆分为三部分得到上述各段。上述CAR能够拓展CAR‑T细胞下游信号的功能空间。

Description

嵌合抗原受体、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种嵌合抗原受体、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T cell therapy)是近年来一种新兴的肿瘤治疗方法。与传统的手术切除、放疗、化疗等物理化学方法不同，细胞免疫疗法是利用人体本身的免疫系统对抗癌症的一种治疗手段。细胞免疫疗法的主要思路是，利用T细胞能够杀伤肿瘤细胞的功能特点，首先从患者体内抽提并分离出T细胞，通过基因编辑等手段对T细胞进行改造，以增强其杀伤肿瘤的能力，然后将改造后的T细胞在体外扩增后重新回输到患者体内，借此来增强机体对抗肿瘤的能力。
总体上看，嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，以下简称CAR)的历史发展大致分为三代，主要体现在跨膜受体胞内段的结构差异。最初第一代CAR的胞内段仅包含CD3ζ链的胞内段，尽管仅能带给细胞第一信号，第一代CAR仍被证明是有效的，但激活T细胞的能力不足，T细胞很快会进入无应答的状态，以致第一代CAR-T细胞在细胞因子分泌、增殖等方面的能力均比较有限，在体内的存续时间较短。此后，第二代和第三代CAR的胞内段则是基于T细胞激活的双信号模型，在CD3ζ链的基础上分别引入了一个或两个共刺激分子(如CD28、4-1BB)的胞内段。在引入第二信号后，CAR-T的效果有了提高，很多临床证据都显示，含有CD28和4-1BB的第二代CAR比第一代呈现出更强的增殖能力和持久性。目前报道的第二代CAR都能够在一定程度上改善第一代CAR的性能，增加细胞因子的分泌，促进细胞增殖并减少激活诱导的细胞凋亡。目前获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的五款CAR-T细胞疗法(Kymriah、Yescarta、Tecartus、Breyanzi、Abecma)均采用了第二代CAR的分子设计。
关于第三代CAR的疗效，目前的研究结果尚有一些争议。部分研究显示，第三代CAR的作用效果比第二代强。例如，在第二代CAR的基础上增加一段OX40胞内段所得到的第三代CAR，会增强其分泌细胞因子白介素2和肿瘤坏死因子TNF-α的能力；加入4-1BB的三代CAR，裂解肿瘤细胞、分泌细胞因子的能力也会增强。但也有相反的研究结果，例如曾有报道认为，28-BB-ζ的TCR信号则弱于28-ζ。
现有的CAR-T在治疗癌症，尤其是在治疗淋巴癌方面取得了重大的成功。2018年FDA批准上市了两例靶向CD19的CAR-T，临床领域关于CAR-T的实验也呈现一股热潮。但CAR-T疗法尚存在有效性、安全性等方面的问题。一方面，CAR-T细胞在肿瘤患者体内存在的时间不足限制了疗效，这是因为当T细胞在受到一段时间的刺激后，会进入耗竭状态，表现为PD-1、Lag-3、Tim-3等抑制性受体的高表达，无法继续增殖和执行杀伤肿瘤细胞的功能，最终逐渐凋亡。实体瘤的肿瘤微环境中存在的抑制性因素会使得T细胞的增殖和存活更加困难。另一方面，CAR-T细胞在患者体内的大量激活，许多和炎症相关的细胞因子(例如TNF-α，IL-1、2、6、8，以及IFN-γ)也会随之大量释放，同样会对机体造成损伤。这一现象被称为细胞因子释放综合征，大量的CAR-T细胞被激活时，细胞因子剧烈释放，会导致患者出现高烧、低血压、组织水肿等副作用，严重的甚至死亡。
CAR激活的下游信号以及T细胞最终的功能、命运与CAR胞内段的结构组成密切相关。有研究详细比较了最经典的两种二代CAR的性能，分别是靶向CD19的CD28-ζCAR(简称28-ζ)与4-1BB-ζCAR(简称BB-ζ)：28-ζ能够激活PI3K-Akt信号通路，使T细胞转入糖代谢的快速供能模式，并倾向于向效应记忆细胞方向分化，28-ζCAR-T细胞分泌细胞因子的能力比BB-ζ强，更适合应用于快速强效抑癌的治疗场景；但这种快速激活似乎导致T细胞不耐持久，一段时间后就容易因耗竭而失去增殖能力甚至死亡。而BB-ζ则是利用脂肪酸代谢这种更加类似纯真T细胞和记忆T细胞的代谢方式供能，供能缓慢但高效，细胞也更倾向中央记忆T细胞，故而BB-ζT细胞能够更加持续地增殖。也正因为此，BB-ζ具有更好的防止肿瘤复发的性质。然而，以4-1BB作为共刺激信号的CAR，虽然在增殖和分化等方面有其优势，但考虑到滋养信号带来的不利影响，4-1BB共刺激结构域的存在会增加T细胞的凋亡。另外，由于胞啃作用等原因，肿瘤细胞会出现抗原丢失，进而逃脱CAR-T细胞杀伤的现象，而BB-ζT细胞相较于28-ζT对于靶细胞抗原丢失更为敏感，并对抗原丢失导致的肿瘤逃逸抵御能力更弱。而为了融合不同共刺激信号的优势而设计出的第三代CAR也有一定的局限性。第三代CAR功能的增强使得其激活阈值降低，由此增强了副作用发生的概率和风险。
现有的CAR分子设计得到的CAR-T的下游信号与功能局限在很有限的空间，不利于CAR-T的应用。
发明内容
基于此，有必要提供一种新型的嵌合抗原受体，能够拓展CAR-T细胞下游信号的功能空间。
此外，还有必要提供一种重组载体、重组细胞及其制备方法和应用。
一种嵌合抗原受体，包括胞内域，所述胞内域含有重组共刺激分子，所述重组共刺激分子包括从N端至C端连接的第一模块和第二模块；
所述第一模块为第一N端段，所述第二模块为连接的第二中间段及第二C端段、或者连接的第二N端段、第二中间段及第二C端段；
或者，所述第一模块为连接的第一N端段和第一中间段、或者连接的第一N端段、第一中间段及第一C端段，所述第二模块为第二C端段、连接的第二中间段及第二C端段、或者连接的第二N端段、第二中间段及第二C端段；
其中，所述第一N端段、所述第一中间段及所述第一C端段为将第一共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到，所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段为将第二共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到，所述第一共刺激结构域和所述第二共刺激结构域为不同共刺激分子的胞内段。
本申请首次提出了根据功能模体拆分天然共刺激分子再进行合理重组得到重组共刺激分子，由于重组引起原有共刺激结构域的信号活性或增强或减弱，从而产生的这一系列刺激强弱不一的共刺激结构域，大大丰富了原有的信号活化范围，有利于CAR-T的应用。经实验验证，本申请的嵌合抗原受体具有激活细胞的潜能，具有特异性杀伤靶细胞的能力，不同的共刺激结构域对T细胞分泌细胞因子的相对能力具有复杂多样的影响。其中，重组共刺激分子28(NM)-BB(MC)的CAR-T细胞具有更为优异的特异性杀伤靶细胞能力，具有降低滋养信号，提高激活水平的作用，使T细胞具有温和、持久抗肿瘤的效果，并降低了CAR-T细胞的耗竭和凋亡。在此基础上，适当降低了细胞因子的分泌，从而提升了CAR-T细胞疗法的安全性。
其中一个实施例中，所述第一共刺激结构域为免疫球蛋白超家族的共刺激分子胞内段，所述第二共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段。
其中一个实施例中，所述第一共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段，所述第二共刺激结构域为免疫球蛋白超家族的共刺激分子胞内段。
其中一个实施例中，所述第一共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段，所述第二共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段。
其中一个实施例中，所述第一共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段，所述第二共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段。
其中一个实施例中，CD28胞内段从N端至C端依次拆分为CD28-N端段、CD28-中间段和CD28-C端段，ICOS胞内段从N端至C端依次拆分为ICOS-N端段、ICOS-中间段和ICOS-C端段，4-1BB胞内段从N端至C端依次拆分为4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，OX40胞内段从N端至C端依次拆分为OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、OX40-中间段、OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、OX40-中间段、OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、ICOS-C端段。
其中一个实施例中，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段的氨基酸序列如SEQID No.1～SEQ ID No.3所示；
及/或，ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.4～SEQID No.6所示；
及/或，4-1BB-N端段、4-1BB8-中间段、4-1BB-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.7～SEQ ID No.9所示；
及/或，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.10～SEQ ID No.12所示。
其中一个实施例中，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13～SEQ ID No.15所示；
及/或，ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.16～SEQ ID No.18所示；
及/或，4-1BB-N端段、4-1BB8-中间段、4-1BB-C端段的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.19～SEQ ID No.21所示；
及/或，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.22～SEQ ID No.24所示。
其中一个实施例中，所述胞内域还包括与所述重组共刺激分子连接的胞内信号结构域，所述嵌合抗原受体还包括胞外域、铰链和跨膜区。
其中一个实施例中，所述胞内信号结构域为CD3ζ链的胞内段，所述胞外域为靶向CD19或者间皮素的单链抗体，所述铰链和跨膜区均来自CD8α。
一种嵌合抗原受体，包括胞内域，所述胞内域含有重组共刺激分子，所述重组共刺激分子包括从N端至C端连接的第一模块、第二模块和第三模块；
所述第一模块选自第一N端段及第二N端段中的一段，所述第二模块选自第一中间段及第二中间段中的一段，所述第三模块选自第一C端段及第二C端段中的一段，所述第一N端段、所述第一中间段及所述第一C端段为将第一共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到，所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段为将第二共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到，所述第一共刺激结构域和所述第二共刺激结构域为不同共刺激分子的胞内段，所述第二模块与所述第一模块分别来自不同的共刺激分子，所述第二模块与所述第三模块分别来自不同的共刺激分子。
其中一个实施例中，所述第一模块和所述第二模块来自相同的共刺激分子。
其中一个实施例中，所述第一共刺激结构域为免疫球蛋白超家族中的共刺激分子胞内段，所述第二共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段。
其中一个实施例中，所述第一共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段，所述第二共刺激结构域为免疫球蛋白超家族中的共刺激分子胞内段。
其中一个实施例中，所述第一共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段，所述第二共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段。
其中一个实施例中，所述第一共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段，所述第二共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段。
其中一个实施例中，CD28胞内段从N端至C端依次拆分为CD28-N端段、CD28-中间段和CD28-C端段，ICOS胞内段从N端至C端依次拆分为ICOS-N端段、ICOS-中间段和ICOS-C端段，4-1BB胞内段从N端至C端依次拆分为4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，OX40胞内段从N端至C端依次拆分为OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、4-1BB-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、CD28-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、OX40-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、CD28-中间段、OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、OX40-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、ICOS-中间段、OX40-C端段。
其中一个实施例中，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段的氨基酸序列如SEQID No.1～SEQ ID No.3所示；
及/或，ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.4～SEQID No.6所示；
及/或，4-1BB-N端段、4-1BB8-中间段、4-1BB-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.7～SEQ ID No.9所示；
及/或，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.10～SEQ ID No.12所示。
其中一个实施例中，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13～SEQ ID No.15所示；
及/或，ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.16～SEQ ID No.18所示；
及/或，4-1BB-N端段、4-1BB8-中间段、4-1BB-C端段的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.19～SEQ ID No.21所示；
及/或，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.22～SEQ ID No.24所示。
一种重组载体，含有上述嵌合抗原受体的编码序列。
上述重组载体的制备方法，包括如下步骤：
将上述嵌合抗原受体的编码序列克隆到基因工程载体中，得到重组载体。
其中一个实施例中，所述嵌合抗原受体包括胞内域，所述胞内域含有重组共刺激分子，所述将上述嵌合抗原受体的编码序列克隆到基因工程载体中的步骤之前还包括构建所述重组共刺激分子的步骤：
将第一共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到所述第一N端段、所述第一中间段及所述第一C端段，将第二共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段，所述第一共刺激结构域和所述第二共刺激结构域为不同共刺激分子的胞内段；
将拆分得到的各部分进行组装得到所述重组共刺激分子：
将所述第一N端段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第一C端段、所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第一C端段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第一C端段、所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第二中间段及所述第一C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第二N端段、所述第一中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子。
其中一个实施例中，还包括对所述重组载体中所述嵌合抗原受体的信号特征进行筛选的步骤：
将含有pNF-κB-mCherry序列的质粒、含有piggyBac转座酶序列的质粒转入含有pNFAT-EGFP报告系统的细胞系中，得到双报告信号细胞系；
将所述重组载体导入所述双报告信号细胞系中，进行靶细胞抗原刺激，然后检测所述双报告信号细胞系的荧光强度，获得NFAT和NF-κB信号动力学特征，筛选出具有激活细胞潜能的重组载体。
一种重组细胞，能够表达所述嵌合抗原受体或者含有上述重组载体。
其中一个实施例中，所述重组细胞为能够表达所述嵌合抗原受体的T细胞或者导入有所述重组载体的T细胞。
上述嵌合抗原受体、上述重组载体或者上述重组细胞在制备检测抗肿瘤药物中的应用。
本申请首次提出了根据功能模体拆分天然共刺激分子再进行合理重组得到重组共刺激分子，且本申请对四种天然共刺激分子拆分成N、M、C三个片段的序列以及重组获得的48种新型共刺激分子(不包含8种直接串联的)的序列均为首次提出。本申请的根据功能模体拆分天然共刺激分子再进行合理重组的设计方案也可应用推广到更多的备选分子，通过这种设计方案可产生海量的新型CAR分子设计。
本申请使用NFAT&NF-κB双报告信号细胞系对新型CAR激活信号特征的快速筛选方案：带有pNF-κB-mCherry和pNFAT-EGFP的Jurkat双报告信号细胞系能够快速、高通量地完成新型CAR分子设计的激活信号特征鉴定，是一种快速筛选CAR的强有力的实验手段。
本申请得到的重组共刺激分子中，共刺激分子28(NM)-BB(MC)的CAR-T细胞的特异性杀伤靶细胞能力更为优良。并且通过实验证明了，该共刺激结构域具有降低滋养信号，提高激活水平的作用，使T细胞具有温和、持久抗肿瘤的效果，并降低了CAR-T细胞的耗竭和凋亡。在此基础上，适当降低了细胞因子的分泌，从而提升了CAR-T细胞疗法的安全性。
附图说明
图1为本申请的技术流程图；
图2为天然共刺激分子CD28、ICOS、4-1BB和OX40胞内段的氨基酸序列和包含的模体；
图3为重组共刺激分子与CAR的结构组成；
图4为pNF-κB-mCherry的启动子结合序列；
图5为各重组型CAR在受到抗原刺激后引发Jurkat细胞中NFAT和NF-κB信号强度的变化；
图6为重组共刺激结构域的CAR刺激NFAT和NF-κB信号通路的动力学特征；
图7为CD28×4-1BB重组获得的CAR-T细胞激活水平、体外杀伤效果与分化类型检测结果图；
图8为CD28×4-1BB重组获得的CAR-T细胞分泌各种细胞因子的相对水平检测结果图；
图9为CD28(NM)-4-1BB(MC)重组片段CAR-T细胞的体外功能检测结果；
图10为CD28(NM)-4-1BB(MC)重组片段CAR-T细胞的体内杀伤功能检测。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。需要说明的是，以下内容中，“连接”可以为直接连接，也可以为间接连接。
本申请一实施方式提供一种嵌合抗原受体，包括胞内域，胞内域含有重组共刺激分子，重组共刺激分子包括从N端至C端连接的第一模块和第二模块。第一模块为第一N端段，第二模块为连接的第二中间段及第二C端段、或者连接的第二N端段、第二中间段及第二C端段；或者，第一模块为连接的第一N端段和第一中间段、或者连接的第一N端段、第一中间段及第一C端段，第二模块为第二C端段、连接的第二中间段及第二C端段、或者连接的第二N端段、第二中间段及第二C端段。其中，第一N端段、第一中间段及第一C端段为将第一共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到。第二N端段、第二中间段及第二C端段为将第二共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到。第一共刺激结构域和第二共刺激结构域为不同共刺激分子的胞内段。
其中，第一共刺激结构域为天然共刺激分子的胞内段。第二共刺激结构域为天然共刺激分子的胞内段。共刺激分子是为T细胞等免疫细胞完全活化提供共刺激信号的细胞表面分子。“天然共刺激分子”与“重组共刺激分子”是两个相对的概念，“天然共刺激分子”强调了未经改造。
目前现有的CAR分子设计主要应用了完整的天然共刺激分子的胞内段，这也导致CAR-T的下游信号与功能局限在很有限的空间。本申请首次提出了根据功能模体拆分天然共刺激分子再进行合理重组得到重组共刺激分子，由于重组引起原有共刺激结构域的信号活性或增强或减弱，从而产生的这一系列刺激强弱不一的共刺激结构域，大大丰富了原有的信号活化范围，有利于CAR-T的应用。经实验验证，本申请的嵌合抗原受体具有激活细胞的潜能，具有特异性杀伤靶细胞的能力，不同的共刺激结构域对T细胞分泌细胞因子的相对能力具有复杂多样的影响。其中，重组共刺激分子28(NM)-BB(MC)的CAR-T细胞具有更为优异的特异性杀伤靶细胞能力，具有降低滋养信号，提高激活水平的作用，使T细胞具有温和、持久抗肿瘤的效果，并降低了CAR-T细胞的耗竭和凋亡。在此基础上，适当降低了细胞因子的分泌，从而提升了CAR-T细胞疗法的安全性。
其中，共刺激结构域的拆分原则为：第一、不破坏功能模体和共同发挥作用的模体组合；第二、保证各个功能模体尽可能分散在不同部分中。本申请开发了一类新型的人工重组嵌合抗原受体分子设计，基于合成生物学蛋白质模块重组的方法对嵌合抗原受体的共刺激结构域进行了重新设计，实现了人体T细胞下游信号与细胞命运的多样化控制，改善了嵌合抗原受体工程化T细胞在肿瘤免疫治疗中的不足。
在其中一个实施例中，第一共刺激结构域为免疫球蛋白超家族的共刺激分子胞内段，第二共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段。具体地，第一共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段，第二共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段。
在其中一个实施例中，第一共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段，第二共刺激结构域为免疫球蛋白超家族的共刺激分子胞内段。具体地，第一共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段，第二共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段。
CD28是T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，对T细胞的活化起到重要作用。它与APC(抗原递呈细胞)上的B7分子结合，介导T细胞的共刺激并促进其存活、增殖以及产生细胞因子。
ICOS是一种重要的新型诱导共刺激分子，可诱导共刺激分子配体(ICOSL)及其受体可诱导共刺激分子(ICOS)在免疫应答和调节中发挥重要作用。
4-1BB即CD137，属肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF9)，主要表达于活化的T细胞，是T细胞协同刺激分子，其配体为4-1BBL，二者结合可刺激T细胞(和B细胞)活化和增殖。
OX40，又名TNFRSF4(Tumor necrosis factor receptor superfamily,member4)，主要在表达于激活的CD4+和CD8+T细胞表面，和OX40配体结合可以刺激CD8+T细胞的活化。通过OX40/OX40L信号的共激活效应，T细胞的功能，包括细胞因子的产生、增殖和T细胞的存活等作用被进一步加强。OX40抗体激活剂(Agonist)可降低肿瘤内调节性T细胞，提高抗肿瘤活性。
免疫球蛋白超家族中的共刺激分子CD28、ICOS和肿瘤坏死因子受体超家族中的4-1BB、OX40在CAR中的应用更加常见，且人们对这些受体的功能和工作机制研究也更加充分，因此本申请选择它们的胞内段作为重组的原材料。需要说明的是，第一共刺激结构域或者第二共刺激结构域不限于为CD28或者ICOS的胞内段，也可以选择免疫球蛋白超家族中其他共刺激分子的胞内段。需要说明的是，第一共刺激结构域或者第二共刺激结构域不限于为不限于为4-1BB、OX40的胞内段，也可以为肿瘤坏死因子受体超家族中其他共刺激分子的胞内段。
在其中一个实施例中，CD28胞内段从N端至C端依次拆分为CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段。进一步地，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段的氨基酸序列如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.3所示。更进一步地，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-N端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13～SEQ ID No.15所示。
在其中一个实施例中，ICOS胞内段从N端至C端依次拆分为ICOS-N端段、ICOS-中间段和ICOS-C端段。进一步地，ICOS-N端段、ICOS-中间段和ICOS-C端段的氨基酸序列如SEQID No.4～SEQ ID No.6所示。更进一步地，ICOS-N端段、ICOS-中间段和ICOS-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.16～SEQ ID No.18所示。
在其中一个实施例中，4-1BB胞内段从N端至C端依次拆分为4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段。进一步地，4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.7～SEQ ID No.9所示。更进一步地，4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.19～SEQ ID No.21所示。
在其中一个实施例中，OX40胞内段从N端至C端依次拆分为OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段。进一步地，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的氨基酸序列如SEQ IDNo.10～SEQ ID No.12所示。更进一步地，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.22～SEQ ID No.24所示。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，简写为CD28-4-1BB。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段，简写为4-1BB-CD28。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段，简写为CD28-4-1BB(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、CD28-中间段、CD28-C端段，简写为4-1BB-CD28(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，简写为CD28(NM)-4-1BB。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段，简写为4-1BB(NM)-CD28。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，简写为CD28(NM)-4-1BB(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、CD28-中间段、CD28-C端段，简写为4-1BB(NM)-CD28(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段，简写为4-1BB(N)-CD28(M)-CD28(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、4-1BB-C端段，简写为CD28(N)-CD28(M)-4-1BB(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，简写为CD28(N)-4-1BB(M)-4-1BB(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、CD28-C端段，简写为4-1BB(N)-4-1BB(M)-CD28(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段，简写为CD28-OX40。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段，简写为OX40-CD28。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、OX40-中间段、OX40-C端段，简写为CD28-OX40(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、CD28-中间段、CD28-C端段，简写为OX40-CD28(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段，简写为CD28(NM)-OX40。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段，简写为OX40(NM)-CD28。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、OX40-中间段和OX40-C端段，简写为CD28(NM)-OX40(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、CD28-中间段、CD28-C端段，简写为OX40(NM)-CD28(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段，简写为OX40(N)-CD28(M)-CD28(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、OX40-C端段，简写为CD28(N)-CD28(M)-OX40(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段，简写为CD28(N)-OX40(M)-OX40(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、CD28-C端段，简写为OX40(N)-OX40(M)-CD28(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，简写为ICOS-4-1BB。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段，简写为4-1BB-ICOS。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段，简写为ICOS-4-1BB(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段，简写为4-1BB-ICOS(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，简写为ICOS(NM)-4-1BB。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段，简写为4-1BB(NM)-ICOS。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，简写为ICOS(NM)-4-1BB(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-中间段、ICOS-C端段，简写为4-1BB(NM)-ICOS(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段，简写为4-1BB(N)-ICOS(M)-ICOS(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-C端段，简写为ICOS(N)-ICOS(M)-4-1BB(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，简写为ICOS(N)-4-1BB(M)-4-1BB(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-C端段，简写为4-1BB(N)-4-1BB(M)-ICOS(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段，简写为ICOS-OX40。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段，简写为OX40-ICOS。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、OX40-中间段、OX40-C端段，简写为ICOS-OX40(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段，简写为OX40-ICOS(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段，简写为ICOS(NM)-OX40。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段，简写为OX40(NM)-ICOS。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、OX40-中间段和OX40-C端段，简写为ICOS(NM)-OX40(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、ICOS-中间段、ICOS-C端段，简写为OX40(NM)-ICOS(MC)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段，简写为OX40(N)-ICOS(M)-ICOS(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、OX40-C端段，简写为ICOS(N)-ICOS(M)-OX40(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段，简写为ICOS(N)-OX40(M)-OX40(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、ICOS-C端段，简写为OX40(N)-OX40(M)-ICOS(C)。
在其中一个实施例中，胞内域还包括与重组共刺激分子连接的胞内信号结构域。嵌合抗原受体还包括胞外域、铰链和跨膜区。优选地，胞内信号结构域为CD3ζ链的胞内段。胞外域为靶向CD19或者间皮素的单链抗体。铰链和跨膜区均来自CD8α。需要说明的是，胞外域不限于为靶向CD19或者间皮素的单链抗体，也可以为靶向其他抗原的单链抗体。
本申请首次提出了根据功能模体拆分天然共刺激分子再进行合理重组得到重组共刺激分子，且本申请对四种天然共刺激分子拆分成N、M、C三个片段的序列以及重组获得的各种新型共刺激分子的序列均为首次提出。本申请的根据功能模体拆分天然共刺激分子再进行合理重组的设计方案也可应用推广到更多的备选分子，通过这种设计方案可产生海量的新型CAR分子设计。本申请得到的嵌合抗原受体能够用于制备具有特异性杀伤靶细胞能力的CAR-T细胞，能够用于制备抗肿瘤药物。
本申请得到的重组共刺激分子中，共刺激分子28(NM)-BB(MC)的CAR-T细胞的特异性杀伤靶细胞能力更为优良。并且通过实验证明了，该共刺激结构域具有降低滋养信号，提高激活水平的作用，使T细胞具有温和、持久抗肿瘤的效果，并降低了CAR-T细胞的耗竭和凋亡。在此基础上，适当降低了细胞因子的分泌，从而提升了CAR-T细胞疗法的安全性。
通过本申请获得的新型重组共刺激分子CD28(NM)-4-1BB(MC)所组成的CAR-T细胞表现出更加优良的功能属性，这得益于其独特的重组结构，具体表现在：第一，删除CD28的PYAP模体，破坏了部分CD28的功能，有利于减少过度激活导致的细胞凋亡；同时削弱其分泌IL-2的能力，从而避免因此而产生大量的调节性T细胞，减弱了对辅助性T细胞和杀伤性T细胞的抑制作用。第二，删除了4-1BB的N端模块，该模块中没有模体，且存在大量碱性氨基酸，潜在地可能与细胞膜之间发生相互作用从而抑制CAR的活化；采用4-1BB远离细胞膜的位置顺序，有助于避免4-1BB的滋养信号导致NF-κB基底活化水平过高并引起细胞凋亡的问题。第三，保留了CD28和4-1BB的绝大部分模体，从而保证了其产生功能的有效性，但就片段长度而言，与三代CAR相比，大大缩短了CD3ζ与细胞膜之间的距离，有利于CD3ζ的磷酸化，对胞外刺激的响应更加灵敏。
本申请一实施方式还提供一种嵌合抗原受体，包括胞内域，胞内域含有重组共刺激分子，重组共刺激分子包括从N端至C端连接的第一模块、第二模块和第三模块；第一模块选自第一N端段及第二N端段中的一段，第二模块选自第一中间段及第二中间段中的一段，第三模块选自第一C端段及第二C端段中的一段，第一N端段、第一中间段及第一C端段为将第一共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到，第二N端段、第二中间段及第二C端段为将第二共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到，第一共刺激结构域和第二共刺激结构域为不同共刺激分子的胞内段，第二模块与第一模块分别来自不同的共刺激分子，第二模块与第三模块分别来自不同的共刺激分子。
其中，共刺激结构域的拆分原则为：第一、不破坏功能模体和共同发挥作用的模体组合；第二、保证各个功能模体尽可能分散在不同部分中。本申请开发了一类新型的人工重组嵌合抗原受体分子设计，基于合成生物学蛋白质模块重组的方法对嵌合抗原受体的共刺激结构域进行了重新设计，实现了人体T细胞下游信号与细胞命运的多样化控制，改善了嵌合抗原受体工程化T细胞在肿瘤免疫治疗中的不足。
其中，第一模块和第二模块来自相同的共刺激分子。
其中，第一共刺激结构域为天然共刺激分子的胞内段。第二共刺激结构域为天然共刺激分子的胞内段。共刺激分子是为T细胞等免疫细胞完全活化提供共刺激信号的细胞表面分子。“天然共刺激分子”与“重组共刺激分子”是两个相对的概念，“天然共刺激分子”强调了未经改造。
在其中一个实施例中，第一共刺激结构域为免疫球蛋白超家族的共刺激分子胞内段，第二共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段。具体地，第一共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段，第二共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段。
在其中一个实施例中，第一共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段，第二共刺激结构域为免疫球蛋白超家族的共刺激分子胞内段。具体地，第一共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段，第二共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段。
CD28是T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，对T细胞的活化起到重要作用。它与APC(抗原递呈细胞)上的B7分子结合，介导T细胞的共刺激并促进其存活、增殖以及产生细胞因子。
ICOS是一种重要的新型诱导共刺激分子，可诱导共刺激分子配体(ICOSL)及其受体可诱导共刺激分子(ICOS)在免疫应答和调节中发挥重要作用。
4-1BB即CD137，属肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF9)，主要表达于活化的T细胞，是T细胞协同刺激分子，其配体为4-1BBL，二者结合可刺激T细胞(和B细胞)活化和增殖。
OX40，又名TNFRSF4(Tumor necrosis factor receptor superfamily,member4)，主要在表达于激活的CD4+和CD8+T细胞表面，和OX40配体结合可以刺激CD8+T细胞的活化。通过OX40/OX40L信号的共激活效应，T细胞的功能，包括细胞因子的产生、增殖和T细胞的存活等作用被进一步加强。OX40抗体激活剂(Agonist)可降低肿瘤内调节性T细胞，提高抗肿瘤活性。
免疫球蛋白超家族中的共刺激分子CD28、ICOS和肿瘤坏死因子受体超家族中的4-1BB、OX40在CAR中的应用更加常见，且人们对这些受体的功能和工作机制研究也更加充分，因此本申请选择它们的胞内段作为重组的原材料。需要说明的是，第一共刺激结构域或者第二共刺激结构域不限于为CD28或者ICOS的胞内段，也可以选择免疫球蛋白超家族中其他共刺激分子的胞内段。需要说明的是，第一共刺激结构域或者第二共刺激结构域不限于为不限于为4-1BB、OX40的胞内段，也可以为肿瘤坏死因子受体超家族中其他共刺激分子的胞内段。
在其中一个实施例中，CD28胞内段从N端至C端依次拆分为CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段。进一步地，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段的氨基酸序列如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.3所示。更进一步地，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-N端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13～SEQ ID No.15所示。
在其中一个实施例中，ICOS胞内段从N端至C端依次拆分为ICOS-N端段、ICOS-中间段和ICOS-C端段。进一步地，ICOS-N端段、ICOS-中间段和ICOS-C端段的氨基酸序列如SEQID No.4～SEQ ID No.6所示。更进一步地，ICOS-N端段、ICOS-中间段和ICOS-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.16～SEQ ID No.18所示。
在其中一个实施例中，4-1BB胞内段从N端至C端依次拆分为4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段。进一步地，4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.7～SEQ ID No.9所示。更进一步地，4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.19～SEQ ID No.21所示。
在其中一个实施例中，OX40胞内段从N端至C端依次拆分为OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段。进一步地，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的氨基酸序列如SEQ IDNo.10～SEQ ID No.12所示。更进一步地，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.22～SEQ ID No.24所示。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、4-1BB-中间段、CD28-C端段，简写为CD28(N)-4-1BB(M)-CD28(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、CD28-中间段、4-1BB-C端段，简写为4-1BB(N)-CD28(M)-4-1BB(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、OX40-中间段、CD28-C端段，简写为CD28(N)-OX40(M)-CD28(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、CD28-中间段、OX40-C端段，简写为OX40(N)-CD28(M)-OX40(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-C端段，简写为ICOS(N)-4-1BB(M)-ICOS(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-C端段，简写为4-1BB(N)-ICOS(M)-4-1BB(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、OX40-中间段、ICOS-C端段，简写为ICOS(N)-OX40(M)-ICOS(C)。
在其中一个实施例中，重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、ICOS-中间段、OX40-C端段，简写为OX40(N)-ICOS(M)-OX40(C)。
在其中一个实施例中，胞内域还包括与重组共刺激分子连接的胞内信号结构域。嵌合抗原受体还包括胞外域、铰链和跨膜区。优选地，胞内信号结构域为CD3ζ链的胞内段。胞外域为靶向CD19或者间皮素的单链抗体。铰链和跨膜区均来自CD8α。需要说明的是，胞外域不限于为靶向CD19或者间皮素的单链抗体，也可以为靶向其他抗原的单链抗体。
本申请首次提出了根据功能模体拆分天然共刺激分子再进行合理重组得到重组共刺激分子，且本申请对四种天然共刺激分子拆分成N、M、C三个片段的序列以及重组获得的各种新型共刺激分子的序列均为首次提出。本申请的根据功能模体拆分天然共刺激分子再进行合理重组的设计方案也可应用推广到更多的备选分子，通过这种设计方案可产生海量的新型CAR分子设计。本申请得到的嵌合抗原受体能够用于制备具有特异性杀伤靶细胞能力的CAR-T细胞，能够用于制备抗肿瘤药物。
本申请一实施方式还提供一种重组载体，含有上述嵌合抗原受体的编码序列。
其中，重组载体为克隆载体或表达载体。
具体地，重组载体为含有上述嵌合抗原受体的编码序列的慢病毒表达载体。具体例如为：含有上述嵌合抗原受体的编码序列的pHR载体。需要说明的是，重组载体不限于为含有上述嵌合抗原受体的编码序列的pHR载体，也可以将上述嵌合抗原受体的基因整合到其他载体上，例如可以为pET21b、pET22b、pET32a、pQE30等载体。
本申请得到的含有上述嵌合抗原受体的重组载体能够用于制备具有特异性杀伤靶细胞能力的CAR-T细胞，能够用于制备抗肿瘤药物。
上述重组载体的制备方法，包括如下步骤：将上述嵌合抗原受体的编码序列克隆到基因工程载体中，得到重组载体。
其中，嵌合抗原受体包括胞内域，胞内域含有重组共刺激分子，将上述嵌合抗原受体的编码序列克隆到基因工程载体中的步骤之前还包括构建重组共刺激分子的步骤S110-S120：
S110、将第一共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到第一N端段、第一中间段及第一C端段，将第二共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到第二N端段、第二中间段及第二C端段，第一共刺激结构域和第二共刺激结构域为不同共刺激分子的胞内段。
其中，共刺激结构域的拆分原则为：第一、不破坏功能模体和共同发挥作用的模体组合；第二、保证各个功能模体尽可能分散在不同部分中。本申请开发了一类新型的人工重组嵌合抗原受体分子设计，基于合成生物学蛋白质模块重组的方法对嵌合抗原受体的共刺激结构域进行了重新设计，实现了人体T细胞下游信号与细胞命运的多样化控制，改善了嵌合抗原受体工程化T细胞在肿瘤免疫治疗中的不足。
需要说明的是，第一共刺激结构域和第二共刺激结构域的具体介绍详见上文，此处不再赘述。
S120、将拆分得到的各部分进行组装得到重组共刺激分子。
具体地，将第一N端段、第二中间段及第二C端段从N端至C端连接得到重组共刺激分子；
或者，将第一N端段、第二N端段、第二中间段及第二C端段从N端至C端连接得到重组共刺激分子；
或者，将第一N端段、所述第一中间段、所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将第一N端段、第一中间段、第二中间段及第二C端段从N端至C端连接得到重组共刺激分子；
或者，将第一N端段、第一中间段、第二N端段、第二中间段及第二C端段从N端至C端连接得到重组共刺激分子；
或者，将第一N端段、第一中间段、第一C端段、第二C端段从N端至C端连接得到重组共刺激分子；
或者，将第一N端段、第一中间段、第一C端段、第二中间段及第二C端段从N端至C端连接得到重组共刺激分子；
或者，将第一N端段、第一中间段、第一C端段、第二N端段、述第二中间段及第二C端段从N端至C端连接得到重组共刺激分子；
或者，将第一N端段、第二中间段及第一C端段从N端至C端连接得到重组共刺激分子；
或者，将第二N端段、第一中间段及第二C端段从N端至C端连接得到重组共刺激分子。
需要说明的是，重组共刺激分子的具体说明详见上文，此处不再赘述。
在其中一个实施例中，重组载体的制备方法还包括对重组载体中嵌合抗原受体的信号特征进行筛选的步骤S130-S140：
S130、将含有pNF-κB-mCherry序列的质粒、含有piggyBac转座酶序列的质粒转入含有pNFAT-EGFP报告系统的细胞系中，得到双报告信号细胞系。
在一个具体示例中，含有pNFAT-EGFP的细胞系为含有pNFAT-EGFP的Jurkat细胞系。需要说明的是，含有pNFAT-EGFP的细胞系不限于为Jurkat细胞系，也可以为其他细胞系，例如可以为HUT78，H9等。
获得新型CAR分子设计后，需对其进行功能鉴定，传统的体内、体外实验验证手段需要耗费大量的人力、物力以及时间成本等，不利于新型CAR分子库的快速筛选鉴定。因此，根据T细胞的激活信号特征，本申请构建了一个能够初步反映T细胞下游信号激活的双报告信号细胞系。具体设计思路为：以转录因子NFAT(活化T细胞核因子，nuclear factor ofactivated T cells)和NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer ofactivated B cells)的启动子分别启动荧光蛋白EGFP和mCherry的表达，通过荧光蛋白的表达量反映相应信号通路的激活程度。利用电转化将含有piggyBac转座酶和pNF-κB-mCherry(NF-κB结合序列：GGGACTTTCC)的质粒转入到含有pNFAT-EGFP报告系统的Jurkat细胞系中。然后利用流式细胞术筛选出低本底水平、高响应水平(即(TNFα或αCD3/CD28)刺激前为低响应，刺激后有明显响应)的单克隆细胞，通过体外扩增培养，获得含有双报告信号系统的稳定细胞系。
S140、将重组载体导入双报告信号细胞系中，进行靶细胞抗原刺激，然后检测双报告信号细胞系的荧光强度，获得NFAT和NF-κB信号动力学特征，筛选出具有激活细胞潜能的重组载体。
在一个实施例中，通过慢病毒转染的手段，将含有上述嵌合抗原受体的重组表达载体导入双报告信号细胞系中。需要说明的是，不限于通过慢病毒转染的手段将含有上述嵌合抗原受体的重组表达载体导入双报告信号细胞系中，也可以通过其他手段将含有上述嵌合抗原受体的重组表达载体导入双报告信号细胞系中体，例如可以为基因编辑敲入等。
本申请使用NFAT&NF-κB双报告信号细胞系对新型CAR激活信号特征的快速筛选方案：带有pNF-κB-mCherry和pNFAT-EGFP的Jurkat双报告信号细胞系能够快速、高通量地完成新型CAR分子设计的激活信号特征鉴定，是一种快速筛选CAR的强有力的实验手段。
本申请一实施方式还提供一种重组细胞，能够表达上述嵌合抗原受体或者含有上述重组载体。
通过构建重组细胞，有利于嵌合抗原受体的应用。上述重组细胞能够用于制备抗肿瘤药物。
其中，重组细胞为能够表达上述嵌合抗原受体的T细胞或者导入有重组载体的T细胞。在一个具体示例中，T细胞为人原代T细胞。
本申请至少具有如下有益效果：
本申请首次提出了根据功能模体拆分天然共刺激分子再进行合理重组得到重组共刺激分子，且本申请对四种天然共刺激分子拆分成N、M、C三个片段的序列以及重组获得的48种新型共刺激分子(不包含8种直接串联的)的序列均为首次提出。本申请的根据功能模体拆分天然共刺激分子再进行合理重组的设计方案也可应用推广到更多的备选分子，通过这种设计方案可产生海量的新型CAR分子设计。
本申请使用NFAT&NF-κB双报告信号细胞系对新型CAR激活信号特征的快速筛选方案：带有pNF-κB-mCherry和pNFAT-EGFP的Jurkat双报告信号细胞系能够快速、高通量地完成新型CAR分子设计的激活信号特征鉴定，是一种快速筛选CAR的强有力的实验手段。
本申请得到的重组共刺激分子中，共刺激分子28(NM)-BB(MC)的CAR-T细胞的特异性杀伤靶细胞能力更为优良。并且通过实验证明了，该共刺激结构域具有降低滋养信号，提高激活水平的作用，使T细胞具有温和、持久抗肿瘤的效果，并降低了CAR-T细胞的耗竭和凋亡。在此基础上，适当降低了细胞因子的分泌，从而提升了CAR-T细胞疗法的安全性。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
具体实施例部分以目前广为应用的靶向CD19的CAR作为主要模型，并参考第一至第三代CAR的结构，设计具有重组共刺激结构域的CAR：受体胞外识别域(即胞外域)为靶向CD19的单链抗体，铰链和跨膜区均来自CD8α，胞内域由不同的共刺激结构域和CD3ζ链的胞内段组成。技术流程详见图1。
实施例1天然共刺激分子的拆分及重组
1.对天然共刺激分子进行结构拆分
免疫球蛋白超家族中的共刺激分子CD28、ICOS和肿瘤坏死因子受体超家族中的4-1BB、OX40在CAR中的应用更加常见，且人们对这些受体的功能和工作机制研究也更加充分，因此本发明选择它们的胞内段作为重组的原材料。通过文献调研，明确其中已报道的模体，在不破坏功能模体和共同发挥作用的模体组合、且保证各个功能模体尽可能分散在不同部分中的前提下，将每个共刺激结构域拆分为N(N端或N端段)、M(Middle或中间段)、C(C端或C端段)三个部分。具体地，CD28、ICOS、4-1BB、OX40的拆分详见图2。图2为天然共刺激分子CD28、ICOS、4-1BB和OX40胞内段的氨基酸序列和包含的模体，其中，下划线部分为所包含的模体。CD28、ICOS、4-1BB、OX40拆分后各部分的氨基酸序列如表1所示。CD28、ICOS、4-1BB、OX40拆分后各部分的DNA序列如表2所示。
表1 CD28、ICOS、4-1BB、OX40拆分后各部分的氨基酸序列
名称 氨基酸序列
CD28(N) RSKRSRLLHSD(如SEQ ID No.1所示)
CD28(M) YMNMTPRRP(如SEQ ID No.2所示)
CD28(C) GPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(如SEQ ID No.3所示)
ICOS(N) CWLTKKKYSSSVHDPNGE(如SEQ ID No.4所示)
ICOS(M) YMFM(如SEQ ID No.5所示)
ICOS(C) RAVNTAKKSRLTDVTL(如SEQ ID No.6所示)
4-1BB(N) KRGRKKLLYIFKQPFMRPV(如SEQ ID No.7所示)
4-1BB(M) QTTQEED(如SEQ ID No.8所示)
4-1BB(C) GCSCRFPEEE(如SEQ ID No.9所示)
OX40(N) ALYLLRRDQRLPPDAHKPPG(如SEQ ID No.10所示)
OX40(M) GGSFRTPIQEE(如SEQ ID No.11所示)
OX40(C) QADAHSTLAKI(如SEQ ID No.12所示)
表2 CD28、ICOS、4-1BB、OX40拆分后各部分的DNA序列
Figure BDA0003666719190000381
2.理性设计人工重组获得一类新型的非天然共刺激分子
将来自不同家族的共刺激分子胞内段进行两两重组(即CD28×4-1BB、CD28×OX40、ICOS×4-1BB和ICOS×OX40)，得到重组共刺激分子。具体详见图3。图3为重组共刺激分子与CAR的结构组成。
通过拆分重组，这四种天然的共刺激分子衍生出56种不同的重组共刺激分子，具体详见表3。需要说明的是，“CD28-4-1BB”表示表示从N端至C端，CD28的N端段、中间段和C端段与4-1BB的N端段、中间段和C端段依次连接，其他重组共刺激分子也为类似含义，以此类推，此处不再赘述。“CD28-4-1BB(MC)”表示从N端至C端，CD28的N端段、中间段和C端段与4-1BB的中间段和C端段依次连接，其他重组共刺激分子也为类似含义，以此类推，此处不再赘述。
表3重组共刺激分子
Figure BDA0003666719190000391
Figure BDA0003666719190000401
实施例2
构建CAR表达载体，利用双报告信号细胞系进行T细胞信号激活的快速鉴定
1、双报告信号细胞系的构建
获得新型CAR分子设计后，需对其进行功能鉴定，传统的体内、体外实验验证手段需要耗费大量的人力、物力以及时间成本等，不利于新型CAR分子库的快速筛选鉴定。因此，根据T细胞的激活信号特征，本申请构建了一个能够初步反映T细胞下游信号激活的双报告信号细胞系。具体设计思路为：以转录因子NFAT(活化T细胞核因子，nuclear factor ofactivated T cells)和NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer ofactivated B cells)的启动子分别启动荧光蛋白EGFP和mCherry的表达，通过荧光蛋白的表达量反映相应信号通路的激活程度。利用电转化将含有piggyBac转座酶和pNF-κB-mCherry(NF-κB结合序列：GGGACTTTCC)(Lenardo and Baltimore,1989)的质粒转入到含有pNFAT-EGFP报告系统的Jurkat细胞系中。然后利用流式细胞术筛选出低本底水平、高响应水平(即(TNFα或αCD3/CD28)刺激前为低响应，刺激后有明显响应)的单克隆细胞，通过体外扩增培养，获得含有双报告信号系统的稳定细胞系。
具体过程如下：
带有pNFAT-EGFP报告系统的Jurkat细胞(简称JATN)来自于UCSF的Arthur Weiss实验室。在此基础上，本申请构建了7×pNF-κB-mCherry的质粒，与piggyBac转座酶的表达质粒一同通过电转转入JATN细胞中。经过为期2月的单克隆扩增培养后，通过流式细胞术进行双向筛选：即选择本底红色荧光表达较弱、经TNFα或α-CD3、α-CD28抗体刺激后有较高响应的单克隆细胞。其中，pNF-κB-mCherry的启动子结合序列详见图4。
2、抗原激活CAR后T细胞的激活特征验证
通过慢病毒转染的手段，将构造好的CAR表达载体导入双报告信号细胞系中，体外实验初步验证在抗原激活CAR后T细胞的激活特征。
具体过程如下：
将表达不同CAR的双报告细胞与表达相应抗原(例如CD19)的K562细胞按照数量比1:1混合，在圆底96孔板中培养(每孔细胞数约为1×105个-2×105个)。在靶细胞抗原刺激后不同的时间点(8h，12h，24h，36h，48h)，用4％多聚甲醛固定细胞，并用流式细胞仪检测双报告细胞的荧光强度，获得NFAT和NF-κB信号动力学特征。检测结果如图5所示。图5为各重组型CAR在受到抗原刺激后引发Jurkat细胞中NFAT和NF-κB信号强度的变化。
从图5可以看出，大部分CAR具有激活细胞的潜能(刺激一段时间后，荧光蛋白表达水平较之0时刻有一定程度的提高)。
为了更清楚地展示重组片段对于CAR激活NFAT和NF-κB信号能力的影响规律，以刺激12小时的数据绘制NFAT-NF-κB双信号散点图。具体图示详见图6。图6为重组共刺激结构域的CAR刺激NFAT和NF-κB信号通路的动力学特征。
从图6可以看出，由于重组引起原有共刺激结构域的信号活性或增强或减弱，从而产生的这一系列刺激强弱不一的共刺激结构域，大大丰富了原有的信号活化范围。
实施例3
在人原代T细胞中验证新型CAR分子的效果
在Jurkat双报告信号细胞系中获得56种重组CAR分子的信号特征后，利用同样的方法将构造好的CAR表达载体导入人原代T细胞中，得到CAR-T细胞，分别检测T细胞的激活水平、体外杀伤、持续能力、细胞因子等功能实验。
具体过程如下：
(1)人原代T细胞取自人外周血单个核细胞(hPBMC)，利用包被在细胞培养板底部的α-CD3和α-CD28的抗体对细胞进行活化处理。激活之前，用终浓度为1μg/mLα-CD3 andα-CD28 antibodies的水溶液预处理24孔板(400μL/孔)2-4小时。随后将复苏后恢复24h的hPBMC加入预处理后的24孔板中(0.5-2×106个细胞/孔)，并按6ng/mL的比例在培养基中加入IL-2。活化1天后，利用慢病毒感染hPBMC，将CD28×4-1BB这一组重组片段的14种CAR转化到细胞中。感染12小时后撤去病毒并换上新鲜的加入IL-2(比例同上)的培养基。连续培养10-15天，使T细胞大量扩增并进入静息状态。静息状态下的细胞将被用于进行后续实验，以检测重组获得的CAR-T细胞激活水平、体外杀伤效果与分化类型、以及CAR-T细胞分泌各种细胞因子的相对水平。检测结果详见图7和图8。图7为CD28×4-1BB重组获得的CAR-T细胞激活水平、体外杀伤效果与分化类型检测结果图。图8为CD28×4-1BB重组获得的CAR-T细胞分泌各种细胞因子的相对水平检测结果图。
从图7和图8可以看出，当CAR-T细胞受到靶细胞刺激24小时后，检测到与T细胞激活相关的CD69蛋白在细胞表面的表达水平显著提升，并且都具有特异性杀伤靶细胞的能力。通过CCR7和CD45RO细胞表面染色，对T细胞分化的类型进行区分，其中，CCR7+CD45RO+的中央记忆T细胞(central memory T cell，Tcm)与T细胞消灭肿瘤的能力相关，在所有重组CAR中均占据明显的比例。另外，不同的共刺激结构域对T细胞分泌细胞因子的相对能力具有复杂多样的影响。
(2)根据CAR-Jurkat细胞被靶细胞刺激12小时NFAT-NF-κB信号强度的散点图结果进行聚类分析，除了以4-1BB为代表和CD28为代表的两群外，产生了一类全新信号特征的类群，其中最具结构代表性的即CD28(NM)-4-1BB(MC)。将其与经典的第一至第三代CAR，即ζ、28-ζ，BB-ζ和28-BB-ζ转化到T细胞中，进行功能检测后发现，在受到靶细胞表面的抗原刺激后CD69的表达均有显著提高，证明它们能有效激活T细胞，并且都具有特异性杀伤靶细胞的能力。另外，受到靶细胞刺激的CAR-T细胞均能向培养基中分泌大量包括IFN-γ、IL-2在内的多种细胞因子。CD28(NM)-4-1BB(MC)-ζ与28-ζ，BB-ζ和28-BB-ζ相较而言，在受到刺激后，T细胞分泌细胞因子的水平明显较低，这意味着CD28(NM)-4-1BB(MC)在临床治疗当中，是降低细胞因子风暴、提高CAR-T细胞疗法安全性的优良选择。进一步检测不同CAR对T细胞存活和持久度等方面的影响，分别对体外活化并培养14天的CAR-T细胞进行PD-1抗体染色，对体外培养14天、21天的CAR-T细胞进行Annexin-V/PI染色检测细胞的凋亡情况，CD28(NM)-4-1BB(MC)都表现出良好的T细胞指标。具体检测结果详见图9。图9为CD28(NM)-4-1BB(MC)重组片段CAR-T细胞的体外功能检测结果。
(3)通过构建NSG小鼠肿瘤模型，将CD28(NM)-4-1BB(MC)重组片段CAR-T细胞注射到荷瘤小鼠(皮下注射CD19-K562靶细胞)体内，检测其是否在体内环境中消除肿瘤的能力。经过48天的观测，注射CD28(NM)-4-1BB(MC)的小鼠有4/5存活，而对照组(注射不表达CAR的T细胞)小鼠全部死亡。说明CD28(NM)-4-1BB(MC)重组片段CAR-T能有效消除体内的肿瘤细胞。具体检测结果详见图10。图10为CD28(NM)-4-1BB(MC)重组片段CAR-T细胞的体内杀伤功能检测。
本申请提供一类新型的人工重组嵌合抗原受体分子设计，基于合成生物学蛋白质模块重组的方法对嵌合抗原受体的共刺激结构域进行了重新设计，并开发了使用NFAT&NF-κB双报告信号细胞系对这些新型嵌合抗原受体的信号特征进行快速筛选鉴定的流程方案。通过本申请的新型嵌合抗原受体设计实现了人体T细胞下游信号与细胞命运的多样化控制，改善了嵌合抗原受体工程化T细胞在肿瘤免疫治疗中的不足。
本申请得到的重组共刺激分子中，共刺激分子28(NM)-BB(MC)的CAR-T细胞的特异性杀伤靶细胞能力更为优良。并且通过实验证明了，该共刺激结构域具有降低滋养信号，提高激活水平的作用，使T细胞具有温和、持久抗肿瘤的效果，并降低了CAR-T细胞的耗竭和凋亡。在此基础上，适当降低了细胞因子的分泌，从而提升了CAR-T细胞疗法的安全性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 嵌合抗原受体、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
1 5 10
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
1 5
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Arg Ser
20
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Tyr Met Phe Met
1
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
1 5 10 15
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
1 5 10
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His
1 5 10 15
Lys Pro Pro Gly
20
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
1 5 10
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gac 33
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tacatgaaca tgactccccg ccgcccc 27
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 60
tcc 63
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgttggctta caaaaaagaa gtattcatcc agtgtgcacg accctaacgg tgaa 54
<210> 17
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tacatgttca tg 12
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agagcagtga acacagccaa aaaatctaga ctcacagatg tgacccta 48
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagta 57
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caaactactc aagaggaaga t 21
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactg 48
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gccctgtacc tgctccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 60
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gag 33
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caggccgacg cccactccac cctggccaag atc 33

Claims (21)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括胞内域，所述胞内域含有重组共刺激分子，所述重组共刺激分子包括从N端至C端连接的第一模块和第二模块；
所述第一模块为第一N端段，所述第二模块为连接的第二中间段及第二C端段、或者连接的第二N端段、第二中间段及第二C端段；
或者，所述第一模块为连接的第一N端段和第一中间段、或者连接的第一N端段、第一中间段及第一C端段，所述第二模块为第二C端段、连接的第二中间段及第二C端段、或者连接的第二N端段、第二中间段及第二C端段；
其中，所述第一N端段、所述第一中间段及所述第一C端段为将第一共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到，所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段为将第二共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到，所述第一共刺激结构域和所述第二共刺激结构域为不同共刺激分子的胞内段。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一共刺激结构域为免疫球蛋白超家族的共刺激分子胞内段，所述第二共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段；
或者，所述第一共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段，所述第二共刺激结构域为免疫球蛋白超家族的共刺激分子胞内段。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段，所述第二共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段；
或者，所述第一共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段，所述第二共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，CD28胞内段从N端至C端依次拆分为CD28-N端段、CD28-中间段和CD28-C端段，ICOS胞内段从N端至C端依次拆分为ICOS-N端段、ICOS-中间段和ICOS-C端段，4-1BB胞内段从N端至C端依次拆分为4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，OX40胞内段从N端至C端依次拆分为OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段、OX40-中间段、OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、CD28-中间段、OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、4-1BB-C端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段、OX40-中间段、OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、ICOS-中间段、OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、OX40-中间段、ICOS-C端段。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示；
及/或，ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.4～SEQ IDNo.6所示；
及/或，4-1BB-N端段、4-1BB8-中间段、4-1BB-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.7～SEQID No.9所示；
及/或，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.10～SEQ IDNo.12所示。
6.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13～SEQ ID No.15所示；
及/或，ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.16～SEQ ID No.18所示；
及/或，4-1BB-N端段、4-1BB8-中间段、4-1BB-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.19～SEQ ID No.21所示；
及/或，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.22～SEQ ID No.24所示。
7.根据权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内域还包括与所述重组共刺激分子连接的胞内信号结构域，所述嵌合抗原受体还包括胞外域、铰链和跨膜区；
优选地，所述胞内信号结构域为CD3ζ链的胞内段，所述胞外域为靶向CD19或者间皮素的单链抗体，所述铰链和跨膜区均来自CD8α。
8.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括胞内域，所述胞内域含有重组共刺激分子，所述重组共刺激分子包括从N端至C端连接的第一模块、第二模块和第三模块；
所述第一模块选自第一N端段及第二N端段中的一段，所述第二模块选自第一中间段及第二中间段中的一段，所述第三模块选自第一C端段及第二C端段中的一段，所述第一N端段、所述第一中间段及所述第一C端段为将第一共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到，所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段为将第二共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到，所述第一共刺激结构域和所述第二共刺激结构域为不同共刺激分子的胞内段，所述第二模块与所述第一模块分别来自不同的共刺激分子，所述第二模块与所述第三模块分别来自不同的共刺激分子。
9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一模块和所述第二模块来自相同的共刺激分子。
10.根据权利要求8-9任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一共刺激结构域为免疫球蛋白超家族中的共刺激分子胞内段，所述第二共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段；
或者，所述第一共刺激结构域为肿瘤坏死因子受体超家族的共刺激分子胞内段，所述第二共刺激结构域为免疫球蛋白超家族中的共刺激分子胞内段。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段，所述第二共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段；
或者，所述第一共刺激结构域为4-1BB或OX40的胞内段，所述第二共刺激结构域为CD28或ICOS的胞内段。
12.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体，其特征在于，CD28胞内段从N端至C端依次拆分为CD28-N端段、CD28-中间段和CD28-C端段，ICOS胞内段从N端至C端依次拆分为ICOS-N端段、ICOS-中间段和ICOS-C端段，4-1BB胞内段从N端至C端依次拆分为4-1BB-N端段、4-1BB-中间段和4-1BB-C端段，OX40胞内段从N端至C端依次拆分为OX40-N端段、OX40-中间段和OX40-C端段；
所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、4-1BB-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、CD28-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的CD28-N端段、OX40-中间段、CD28-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、CD28-中间段、OX40-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、4-1BB-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的4-1BB-N端段、ICOS-中间段、4-1BB-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的ICOS-N端段、OX40-中间段、ICOS-C端段；
或者，所述重组共刺激分子包括从N端至C端依次连接的OX40-N端段、ICOS-中间段、OX40-C端段。
13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其特征在于，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示；
及/或，ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.4～SEQ IDNo.6所示；
及/或，4-1BB-N端段、4-1BB8-中间段、4-1BB-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.7～SEQID No.9所示；
及/或，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的氨基酸序列如SEQ ID No.10～SEQ IDNo.12所示。
14.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其特征在于，CD28-N端段、CD28-中间段、CD28-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.13～SEQ ID No.15所示；
及/或，ICOS-N端段、ICOS-中间段、ICOS-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.16～SEQ ID No.18所示；
及/或，4-1BB-N端段、4-1BB8-中间段、4-1BB-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.19～SEQ ID No.21所示；
及/或，OX40-N端段、OX40-中间段、OX40-C端段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.22～SEQ ID No.24所示。
15.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1-14任一项所述的嵌合抗原受体的编码序列。
16.权利要求15所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1-14任一项所述的嵌合抗原受体的编码序列克隆到基因工程载体中，得到重组载体。
17.权利要求16所述的重组载体的制备方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括胞内域，所述胞内域含有重组共刺激分子，所述将权利要求1-12任一项所述的嵌合抗原受体的编码序列克隆到基因工程载体中的步骤之前还包括构建所述重组共刺激分子的步骤：
将第一共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到所述第一N端段、所述第一中间段及所述第一C端段，将第二共刺激结构域从N端至C端依次拆分为三部分而得到所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段，所述第一共刺激结构域和所述第二共刺激结构域为不同共刺激分子的胞内段；
将拆分得到的各部分进行组装得到所述重组共刺激分子：
将所述第一N端段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第一C端段、所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第一C端段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第一中间段、所述第一C端段、所述第二N端段、所述第二中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第一N端段、所述第二中间段及所述第一C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子；
或者，将所述第二N端段、所述第一中间段及所述第二C端段从N端至C端连接得到所述重组共刺激分子。
18.权利要求16-17任一项所述的重组载体的制备方法，其特征在于，还包括对所述重组载体中所述嵌合抗原受体的信号特征进行筛选的步骤：
将含有pNF-κB-mCherry序列的质粒、含有piggyBac转座酶序列的质粒转入含有pNFAT-EGFP报告系统的细胞系中，得到双报告信号细胞系；
将所述重组载体导入所述双报告信号细胞系中，进行靶细胞抗原刺激，然后检测所述双报告信号细胞系的荧光强度，获得NFAT和NF-κB信号动力学特征，筛选出具有激活细胞潜能的重组载体。
19.一种重组细胞，其特征在于，能够表达权利要求1-14任一项所述的嵌合抗原受体或者含有权利要求15所述的重组载体。
20.根据权利要求19所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为能够表达所述嵌合抗原受体的T细胞或者导入有所述重组载体的T细胞。
21.权利要求1-14任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求15所述的重组载体或者权利要求19-20任一项所述的重组细胞在制备检测抗肿瘤药物中的应用。
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