KR102533061B1 - 임상용 변형된 NK-92 haNK003 세포 - Google Patents

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Abstract

변형된 NK-92 세포의 집단, 세포를 포함하는 조성물 및 키트, 및 세포의 집단을 제조하고 사용하는 방법이 본원에서 제공된다.

Description

임상용 변형된 NK-92 haNK003 세포
모노클로날 항체 (mAb)를 사용한 항암 치료는 암을 갖는 환자에서 임상적 결과를 상당히 개선시켰다. 치료 항체의 작용의 주요한 메카니즘 중 하나는 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 통한 것이다. 자연 살해 세포는 이들이 ADCC에 대한 주요한 이펙터 세포이기 때문에 세포-기재 면역요법을 위한 세포독성 이펙터 세포로서 사용될 수 있다.
NK-92는 비-호지킨 림프종을 앓고 있는 대상체의 혈액에서 발견된 후, 생체외에서 불멸화된 세포용해성 암 세포주이다. NK-92 세포는 NK 세포로부터 유래되지만, 정상 NK 세포에 의해 나타나는 주요한 억제성 수용체가 결여되는 반면, 대다수의 활성화 수용체를 보유한다. 그러나, NK-92 세포는 정상 세포를 공격하지도 않고, 이들은 인간에서 비허용가능한 면역 거부 반응을 유발하지도 않는다. NK-92 세포주의 특징화는 WO 1998/49268 및 미국 특허 출원 공개 번호 2002-0068044에 개시되어 있다. NK-92 세포는 또한 특정 암의 치료에 있어서 잠재적인 치료제로서 평가되었다.
NK-92 세포는 거의 모든 활성화 수용체 및 NK 세포와 연관된 세포용해 경로를 보유하지만, 이들은 그들의 세포 표면 상에 CD16을 발현하지 않는다. CD16은 항체의 Fc 부분을 인식하고 그에 결합하여 ADCC 이펙터 메카니즘을 위한 NK 세포를 활성화시키는 Fc 수용체이다. 이들은 CD16 수용체가 결여되기 때문에, 비변형된 NK-92 세포는 ADCC 메카니즘을 통해 표적 세포를 용해시킬 수 없다.
변형된 NK-92 세포의 집단, 세포를 포함하는 조성물 및 키트, 및 세포의 집단을 제조하고 사용하는 방법이 본원에서 제공된다.
도 1a는 haNK003 세포 확장을 제시하는 그래프이다. 도 1b는 haNK003 세포의 집단 배가 수준 (PDL)을 제시하는 그래프이다. 생존력 (%), 세포 밀도 (세포/mL), 및 누적 PDL을 확장 기간에 걸쳐 모니터링하였다.
도 2는 aNK 및 haNK003 세포에서의 표면 마커의 발현에 대한 대표적인 히스토그램을 제시한다.
도 3a는 K562 세포에 대한 haNK003 세포의 자연 세포독성을 제시하는 그래프이다. 도 3b는 Raji 세포에 대한 haNK003 세포의 자연 세포독성을 제시하는 그래프이다. 도 3c는 SKOV3 세포에 대한 haNK003 세포의 자연 세포독성을 제시하는 그래프이다. 도 3d는 SKBR3 세포에 대한 haNK003 세포의 자연 세포독성을 제시하는 그래프이다.
도 4a는 Raji 세포에 대한 haNK003 세포의 ADCC를 제시하는 그래프이다. 도 4b는 SKOV3 세포에 대한 haNK003 세포의 ADCC를 제시하는 그래프이다. 도 4c는 SKBR3 세포에 대한 haNK003 세포의 ADCC를 제시하는 그래프이다.
도 5는 K562 세포에 대한 조사된 vs. 비-조사된 haNK003 세포의 자연 세포독성 활성을 제시하는 그래프이다. haNK003 세포를 모의-조사하거나 (실선), 10 Gy에서 조사하였다. K562 세포에 대한 조사된 haNK003의 세포독성 활성을 조사후 6시간 (파선) 또는 24시간 (점선)에서 검정하였다.
도 6은 DOHH2 세포에 대한 조사된 vs. 비-조사된 haNK003 세포의 자연 세포독성 활성을 제시하는 그래프이다. haNK003 세포를 모의-조사하거나 (실선), 10 Gy에서 조사하였다. DOHH2 세포에 대한 조사된 haNK003의 세포독성 활성을 조사후 6시간 (파선) 또는 24시간 (점선)에서 검정하였다. 20:1의 E:T 비에 대한 데이터 점은 세포 사멸이 불충분한 수의 haNK003 세포를 초래하였기 때문에 조사된 세포에 대해 얻어지지 않았음을 주목한다.
도 7은 DOHH2 세포에 대한 조사된 vs. 비-조사된 haNK003 세포의 ADCC 활성을 제시하는 그래프이다. haNK003 세포를 모의 조사하거나 (실선 기호), 10 Gy에서 조사하였다 (비어있는 기호). DOHH2 세포에 대한 조사된 및 비-조사된 haNK003의 ADCC 활성을 DOHH2 세포와 반응하지 않는 리툭산(Rituxan) (정사각형)과 또는 헤르셉틴(Herceptin) (삼각형)과 조합으로, 조사후 6시간 (파선) 또는 24시간 (점선)에서 검정하였다. 20:1의 E:T 비에 대한 데이터 점은 세포 사멸이 불충분한 수의 haNK003 세포를 초래하였기 때문에 24시간 시점에서 조사된 세포에 대해 얻어지지 않았음을 주목한다.
도 8a는 샌드위치 ELISA 실행#1에 의해 결정된 바와 같은 6, 12, 24 및 48시간 (h)에서의 조사된 vs. 비-조사된 세포의 1 x 106 세포당 방출된 IL-2 (pg/mL)를 제시하는 그래프이다. 도 8b는 샌드위치 ELISA 실행#2에 의해 결정된 바와 같은 6, 12, 24 및 48시간 (h)에서의 조사된 vs. 비-조사된 세포의 1 x 106 세포당 방출된 IL-2 (pg/mL)를 제시하는 그래프이다. 도 8c는 멀티플렉스 ELISA 실행#1에 의해 결정된 바와 같은 6, 12, 24 및 48시간 (h)에서의 조사된 vs. 비-조사된 세포의 1 x 106 세포당 방출된 IL-2 (pg/mL)를 제시하는 그래프이다. 도 8d는 멀티플렉스 ELISA 실행#2에 의해 결정된 바와 같은 6, 12, 24 및 48시간 (h)에서의 조사된 vs. 비-조사된 세포의 1 x 106 세포당 방출된 IL-2 (pg/mL)를 제시하는 그래프이다.
도 9a는 샌드위치 ELISA 실행#1에 의해 결정된 바와 같은 6, 12, 24 및 48시간 (h)에서의 조사된 vs. 비-조사된 세포의 1 x 106 세포당 총 세포내 IL-2 함량 (pg)을 제시하는 그래프이다. 도 9b는 샌드위치 ELISA 실행#2에 의해 결정된 바와 같은 6, 12, 24 및 48시간 (h)에서의 조사된 vs. 비-조사된 세포의 1 x 106 세포당 총 세포내 IL-2 함량 (pg)을 제시하는 그래프이다. 도 9c는 멀티플렉스 ELISA 실행#1에 의해 결정된 바와 같은 6, 12, 24 및 48시간 (h)에서의 조사된 vs. 비-조사된 세포의 1 x 106 세포당 총 세포내 IL-2 함량 (pg)을 제시하는 그래프이다. 도 9d는 멀티플렉스 ELISA 실행#2에 의해 결정된 바와 같은 6, 12, 24 및 48시간 (h)에서의 조사된 vs. 비-조사된 세포의 1 x 106 세포당 총 세포내 IL-2 함량 (pg)을 제시하는 그래프이다.
도 10a는 멀티플렉스 및 샌드위치 ELISA에 의해 결정된 바와 같은 실행#1에서의 1 x 106 세포당 가용화된 IL-2의 양 (pg)을 제시하는 그래프이다. 도 10b는 멀티플렉스 및 샌드위치 ELISA에 의해 결정된 바와 같은 실행#2에서의 1 x 106 세포당 가용화된 IL-2의 양 (pg)을 제시하는 그래프이다.
도 11은 NOD/SCID 마우스에서의 동물 체중에 대한 정맥내로 투여된 haNK003의 효과를 제시하는 그래프이다. NOD/SCID 마우스 (군당 3마리의 수컷 및 3마리의 암컷)를 각각 PBS, 단일 용량으로서 1 x 107 세포의 용량으로의 비-조사된 또는 조사된 haNK003 세포의 정맥내 주사에 의해 처리하였다. 동물 체중을 5주 동안 매주 2회 모니터링하였다. 값은 평균 ±SEM이다, n= 6.
도 12는 NOD/SCID 마우스에서의 동물 체중에 대한 haNK003 세포의 효과를 제시하는 그래프이다. NOD/SCID 마우스 (군당 3마리의 수컷 및 3마리의 암컷)를 4주 동안 매주 1회 PBS, 1 x 107 비-조사된 또는 조사된 haNK003 세포로 처리하고, 동물 체중을 5주 동안 매주 2회 모니터링하였다. 값은 평균 ±SEM이다, n= 6.
도 13은 K562 세포에 대한 자연 세포독성에 관한 aNK vs. haNK003 세포의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 14는 Daudi 세포에 대한 자연 세포독성에 관한 aNK vs. haNK003 세포의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 15는 DOHH2 세포에 대한 자연 세포독성에 관한 aNK vs. haNK003 세포의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 16은 SKOV-3 세포에 대한 자연 세포독성에 관한 aNK vs. haNK003 세포의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 17은 HL-60 세포에 대한 자연 세포독성에 관한 aNK vs. haNK003 세포의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 18은 SR-91 세포에 대한 자연 세포독성에 관한 aNK vs. haNK003 세포의 비교를 제시하는 그래프이다.
도 19는 암컷 NSG 마우스에서의 MDA-MB-453 s.c. 이종이식 모델에서의 haNK003 세포의 항종양 활성을 제시하는 그래프이다. MDA-MB-453 인간 유방 암종 종양을 갖는 암컷 NSG 마우스를 각각 4주 동안 매주 2회 PBS 또는 2.5x 106 또는 1 x 107 세포의 용량으로의 조사된 haNK003 세포의 정맥내 주사에 의해 처리하였다. 종양 부피를 매주 2회 모니터링하였다. 값은 평균 ± SEM이다; n =8.
도 20은 암컷 NSG 마우스에서의 동물 체중에 대한 haNK003 세포의 효과를 제시하는 그래프이다. MDA-MB-453 인간 유방 암종 종양을 갖는 암컷 NSG 마우스를 각각 4주 동안 매주 2회 PBS 또는 2.5x 106 또는 1.0 x 107 세포의 용량으로의 조사된 haNK003 세포의 정맥내 주사에 의해 처리하였다. 마우스 체중을 매주 2회 모니터링하였다. 값은 평균 ± SEM이다; n=4.
도 21은 정상 NK 세포 950, 962, 및 996에서의 유전자 발현에 대한 뿐만 아니라 20% 산소 및 0% 산소 (저산소) 조건 하에서의 haNK 세포에 대한 샘플 쌍별 거리를 제시하는 표이다.
도 22는 950, 962, 996 및 haNK 세포에서의 20% 산소 조건 및 0% 산소 조건 사이의 발현의 가장 큰 가변성을 나타내는 유전자를 제시하는 표이다.
도 23은 950, 962, 996 및 haNK 세포에서의 20% 산소 조건 및 0% 산소 조건 사이의 가장 큰 변화를 나타내는 유전자에서의 발현의 변화를 제시하는 표이다.
도 24는 20% 산소 조건 및 0% 산소 조건 사이의 haNK 세포 및 NK 세포 950, 962 및 996에서의 저산소증과 연관된 유전자에서의 발현의 변화를 제시하는 표이다.
도 25는 PMA 처리 전 및 후의 haNK003 세포 및 공여자 NK 세포에서의 CD16 발현의 유동 세포측정 분석을 제시하는 그래프이다. CD16 발현의 하향 조절은 공여자 NK 세포에서 94.36%± 3 및 haNK003 세포에서 30%± 0.04이다. aNK (CD16이 없는 NK-92 세포)를 대조군으로서 사용하였다.
도 26은 K562 세포와 공동-배양된 haNK003 세포 및 공여자 NK 세포 (E:T=1:1)에서의 CD16 발현 수준의 유동 세포측정 분석을 제시하는 그래프이다. 4시간 후, haNK003 세포는 공여자 NK 세포에 비해 안정한 CD16 발현을 제시하였다. K562와의 공동-배양의 4시간 후의 공여자 NK 세포에서의 CD16 하향 조절은 haNK003 세포에 대해 60.25%± 09 및 4.9%± 2.57이었다. 밤샘 회수 후, 공여자 NK 세포에서 CD16 발현의 57.54%±26.82 하향조절이 여전히 있었던 반면, haNK003 세포에서는 CD16 수준은 정상과 가깝게 회복되었으며, 단지 2.78%±3.5의 하향 조절이 있었다. aNK (CD16이 없는 NK-92 세포)를 대조군으로서 사용하였다.
도 27a 및 27b는 ADCC 후의 haNK003 세포에서의 CD16 발현 수준을 제시하는 그래프이다. ADCC를 1:0 (이펙터 단독) 내지 1:4의 E:T 비로 4시간 동안 1 μg/ml 리툭시맙(Rituximab)의 존재 하에서 haNK003 세포 및 DoHH를 공동-배양함으로써 수행하였다. CD16 발현 수준을 4시간에서 및 24시간 후에 유동 세포측정에 의해 측정하였다. 도 27a는 ADCC 후의 haNK-003에서의 CD16 발현 수준의 유동 세포측정 분석을 대조군 (E:T=1:0)과 함께 제시한다. 도 27b는 ADCC 후 및 ADCC 후 24시간의 CD16 발현의 중위 형광 강도 (MFI)를 제시한다.
변형된 NK-92 haNK003 세포가 본원에서 제공된다. 세포는 Fc 수용체 CD16 및 IL-2의 내형질 세망 결합된 형태를 발현한다. 따라서, 세포는 성장을 위해 외부 IL-2에 의존적이지 않다. 또한, 변형된 NK-92 세포는 CD16 수용체의 고 친화도 변이체의 삽입을 갖는 증진된 세포독성 능력을 가지며, 따라서 CD16 표적화된 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)이 가능하다. ADCC는 CD16 Fc 수용체를 통한 표적-결합된 항체 (IgG)의 Fc 단편의 인식에 의해 매개된다. 따라서, 종양학적 적용을 위해, 변형된 세포에 의한 ADCC는 종양 세포-결합된 IgG의 Fc 단편에 결합하는 CD16 수용체에 의해 유발되며, 따라서 표적화된 살해를 위해 변형된 NK-92 세포를 활성화시킨다. 본원에 기재된 바와 같이, 제공된 변형된 NK-92 세포는 CD16, 고 친화도 Fc-감마 수용체 (FcγRIIIa/CD16a), 뿐만 아니라 내형질 세망에 표적화되는 IL-2에 대한 서열을 함유하는 비시스트로닉 플라스미드 기재 벡터로의 안정한 형질감염을 통해 생성되었다. 세포는 + 가닥 상의 위치 15,654,977에서의 염색체 17 상의 단일 위치에 삽입된 플라스미드 서열을 함유한다. 변형된 NK-92 세포는 내인성 IL-2를 생산하며, 표현형적으로 CD56+, CD3-, 및 CD16+이다. 본 출원에서 제공된 변형된 NK-92 haNK003 세포는 때때로 본원에서 간단히 haNK003 세포로 지칭된다.
하기 실시예에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, NK-92 세포를 pNEUKv1_FcRIL2 플라스미드 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)로 형질전환시켰다. pNEUKv1_FcRIL2 플라스미드는 아미노산 176에 발린을 함유하는 변형된 CD16 (전장 CD16 펩티드를 지칭하는 경우) 및 내형질 세망 체류 신호를 갖는 IL-2를 발현하는 비시스트로닉 구축물이다. 세포의 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)을 수행하였으며, 이는 염색체 17에서 1개의 플라스미드 삽입 부위의 확인을 초래하였다. WGS는 haNK003 세포주에서의 비시스트로닉 플라스미드의 통합이 종양원성 잠재성을 갖는 임의의 유전자로부터 떨어진 게놈의 영역에 있음을 확인시켜 주었다. 가장 가까운 5' 유전자 TBC1D26은 10,722 bp 상류이며, 가장 가까운 3' 유전자 ADORA2B는 186,828 bp 하류이다. 변형된 NK-92 세포는 3 내지 4일마다 계대하고, 대략 0.3-0.5 x 106 세포/mL의 밀도로 시딩한 경우에 지속적으로 성장한다. 평균 배가 시간은 제3일 내지 제29일에 65시간 (48-95시간)이었다. 유동 세포측정 데이터의 분석은 변형된 NK-92 세포가 CD54, CD56, NKG2D, NKp30, 및 CD16 표면 마커 단백질을 발현하고, CD3이 결여됨을 제시한다. 변형된 NK-92 세포는 배양 배지에 IL-2의 보충 없이 성장할 수 있다. 또한, IL-2를 발현하는 변형된 NK-92 세포는 배양 배지 내로 낮은 수준의 IL-2를 방출함이 결정되었다. 비-조사된 haNK003 세포 단독은 배양에서 6시간에 1,000,000 세포당 평균적으로 대략 276.1 pg/mL 및 48시간에서 1,000,000 세포당 1403.3 pg/mL까지 분비한다. 제공된 변형된 NK-92 세포는 중증 암 세포주에 대해 자연적으로 세포독성이며, 항체와 조합되는 경우에 ADCC를 통해 증진된 비용해가 가능하다.
NK-92 세포주는 인터류킨 2 (IL-2)의 존재 하에서 증식하는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [Gong et al., Leukemia 8:652-658 (1994)]. 이들 세포는 다양한 암에 대해 높은 세포용해 활성을 갖는다. NK-92 세포주는 확장 후에 예측가능한 수율을 갖는 폭넓은 항-종양 세포독성을 갖는 동종 NK 세포 집단이다. I상 임상 시험은 그의 안전성 프로파일을 확인하였다. NK-92는 비-호지킨 림프종을 앓고 있는 대상체의 혈액에서 발견되었으며, 그 후 생체외에서 불멸화되었다. NK-92 세포는 NK 세포로부터 유래되지만, 정상 NK 세포에 의해 나타나는 주요한 억제성 수용체가 결여되는 반면, 대다수의 활성화 수용체를 보유한다. 그러나, NK-92 세포는 정상 세포를 공격하지도 않고, 이들은 인간에서 비허용가능한 면역 거부 반응을 유발하지도 않는다. NK-92 세포주의 특징화는 WO 1998/49268 및 미국 특허 출원 공개 번호 2002-0068044에 개시되어 있다.
NK-92 세포는 공지되어 있으며, 예를 들어, 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제7,618,817호, 제8,034,332호, 및 제8,313,943호, 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0040386에 기재된 것들, 예컨대 야생형 NK-92, NK-92-CD16, NK-92-CD16-γ, NK-92-CD16-ζ, NK-92-CD16(F176V), NK-92MI 및 NK-92CI를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
CD16 (서열식별번호: 3) 및 IL-2 (서열식별번호: 5) 둘 다를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 갖는 변형된 NK-92 haNK003 세포의 집단이며, 여기서 세포의 집단 중 세포의 90% 초과가 CD56, CD16, CD54, 및 NKp30을 발현하고, 세포의 집단 중 세포의 5% 미만이 CD3을 발현하는 것인 세포의 집단이 본원에서 제공된다. 임의로, 핵산 분자는 mRNA 분자이다. 임의로, mRNA 분자는 5'에서 3'로 CD16을 코딩하는 서열, IRES 서열, 및 IL-2를 코딩하는 서열을 포함한다. 임의로, 세포는 염색체 17 상에 서열식별번호: 1을 포함한다. 임의로, 세포의 평균 배가 시간은 55 내지 70시간이다. 임의로, 세포의 집단은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25일 또는 그 초과로부터 평균 배가 시간을 유지한다. 임의로, 세포의 집단은 1, 2, 3, 4일 또는 그 초과 동안 계대될 수 있다. 임의로, 세포는 세포 백만개당 10 내지 40 pg/시간의 농도로 IL-2를 분비한다. 임의로, 세포는 조사된 세포이다.
특정 자극에 반응하여, CD16은 세포막 가까이에서 절단되어 수용체의 세포외 부분의 방출 및 활성화 후의 발현의 하향 조절을 초래한다 (문헌 [Jing, et al., PLOS one, 10(3):e0121788 DOI:10.1371/journal.pone.0121788 (2015)] 참조). 정상 조건 하에서, 이 메카니즘은 NK 세포 세포독성을 제어하는 것을 돕지만, 종양 환경에서, 이는 ADCC 효능 및 암 세포 살해를 감소시킬 수 있다. 유리하게는, 제공된 haNK003 세포는 암 세포에 대한 증진된 ADCC 활성을 갖는다. 이론에 구애되지는 않지만, 이는 ADCC 후의 haNK003 세포 사건에서의 CD16의 안정한 발현에 기인한다고 믿어진다. 하기 실시예에 제시된 바와 같이, 포르볼-12-미리스테이트 13-아세테이트로의 활성화 또는 K562 세포로의 자극 후, CD16의 발현은 대조군 세포에 비해 높게 잔류하였다. 또한, CD16 발현은 심지어 ADCC 후에도 haNK003 세포에서 높게 잔류하였다. 따라서, 제공된 haNK003 세포는 대조군에 비해 CD16의 발현의 감소된 하향조절을 갖는다. 또한, haNK003 세포는 대조군에 비해 ADCC 후에 CD16의 증가된 수준을 갖는다. 또 다른 방식으로 말하자면, 세포는 대조군에 비해 ADCC 후에 CD16의 보다 높은 수준을 유지한다. 따라서, haNK003 세포는 대조군, 예를 들어, 정상 NK 세포에 비해 CD16의 보다 안정한 발현을 갖는다.
자연 살해 (NK) 세포 용해 활성은 시험관내에서 저산소 환경 (1% O2)에서 억제되며, NKG2D, 퍼포린 및 그란자임의 하향조절과 연관된다. 정상 공여자로부터의 저산소증 (1% O2)에 대한 NK 민감도에 따라 일부 가변성이 있다. 그러나, NK 세포 용해 활성은 시험관내에서 외인성 IL-2 활성화에 의해 부분적으로 구조될 수 있다 (16시간, 1000 IU/ml). 또한, NK 세포는 1% 산소 조건 하에서 ADCC 능력을 보유한다. 하기 실시예에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 저산소증과 연관된 유전자는 20% 산소 조건 및 0% 산소 (저산소) 조건 사이에 haNK 세포에서의 발현의 변화를 제시하지 않는다. 그러나, 저산소증과 연관된 이들 동일한 유전자는 정상 NK 세포에서는 감소된 발현을 갖는 것으로 제시된다.
상기 언급된 바와 같이, 변형된 NK-92 세포는 Fc 수용체 CD16을 발현한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "Fc 수용체"는 Fc 영역으로 공지된 항체의 부분에 결합함으로써 면역 세포의 보호 기능에 기여하는 특정 세포 (예를 들어, 자연 살해 세포)의 표면 상에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 세포의 Fc 수용체 (FcR)에의 항체의 Fc 영역의 결합은 항체-매개 포식작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 통해 세포의 포식 또는 세포독성 활성을 자극한다. FcR은 그들이 인식하는 항체의 유형에 의해 분류된다. 예를 들어, Fc-감마 수용체 (FCγR)는 항체의 IgG 부류에 결합한다. FCγRIII-A (CD16으로도 지칭됨)는 IgG 항체에 결합하고, ADCC를 활성화시키는 저 친화도 Fc 수용체이다. FCγRIII-A는 전형적으로 NK 세포 상에서 발견된다. CD16을 코딩하는 대표적인 아미노산 서열을 서열식별번호: 3에 제시된다. CD16을 코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드 서열을 서열식별번호: 4에 제시된다. CD16의 완전한 서열은 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스에서 엔트리 P08637로서 발견될 수 있다.
임의로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 3과 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 임의로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 3과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 임의로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 4와 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 임의로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 4와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
NK-92 세포의 세포독성은 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-2 (IL-2))의 존재에 의존한다. 상업적 규모의 배양에서 NK-92 세포를 유지하고 확장하는데 필요한 외인적으로 첨가되는 IL-2를 사용하는 비용은 상당하다. NK-92 세포의 활성화를 계속하는데 충분한 양으로 인간 대상체에의 IL-2의 투여는 유해 부작용을 유발할 것이다. 임의로, IL-2는 IL-2를 내형질 세망에 지정하는 신호 서열과 함께 발현된다. IL-2를 내형질 세망에 지정하는 것은 자가분비 활성화에 충분한 수준에서 및 세포외적으로 실질적인 양의 IL-2를 방출하지 않고 IL-2의 발현을 허용한다. 문헌 [Konstantinidis et al "Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92 cells" Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64]을 참조한다. IL-2를 코딩하는 대표적인 핵산을 서열식별번호: 5에 제시되고, IL-2의 대표적인 폴리펩티드를 서열식별번호: 6에 제시된다.
임의로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 5와 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 임의로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 5와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 임의로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 6과 70%, 80%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 임의로, 변형된 NK-92 세포는 서열식별번호: 6과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 제공된 변형된 NK-92 세포는 유리하게는 임상적 유해 효과를 유발하는 양으로 IL-2를 분비하지 않고 IL-2의 부재 하에서 유지될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체 및 보체를 지칭한다. 상기 용어는 단일- 또는 이중-가닥 형태 중 어느 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어는 합성, 자연 발생, 및 비-자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 참조 뉴클레오티드와 유시한 방식으로 대사되는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포괄한다. 이러한 유사체의 예는 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함한다. 달리 지시되지 않는다면, 핵산 서열의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열은 본원에서 인용된 특정 핵산 서열 대신 사용될 수 있다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 상호교환가능하게 사용된다.
핵산은 그것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계 내로 놓이는 경우에 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 전서열 또는 분비성 리더를 코딩하는 DNA는 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동적으로 연결되거나; 리보솜 결합 부위는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우에 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, 작동적으로 연결된은 연결되는 DNA 서열이 서로 가까이 있으며, 분비성 리더의 경우, 인접하고 리딩 상에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접한 필요는 없다. 예를 들어, 제2 핵산 서열에 작동적으로 연결된 핵산 서열은 이러한 제2 서열에 직접적으로 또는 간접적으로 공유적으로 연결되지만, 임의의 효과적인 3-차원 회합은 허용가능하다. 단일 핵산 서열은 다수의 다른 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 단일 프로모터는 다수의 RNA 종의 전사를 지정할 수 있다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성될 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 동일한 또는 퍼센트 동일성은 하기 기재된 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, NCBI 웹 사이트 등 참조)에 의해 측정된 바와 같이, 동일하거나, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정된 백분율을 갖는 (즉, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 비해 비교되고 최대 상응성에 대해 정렬되는 경우, 특정된 영역에 비해 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성) 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 이러한 서열은 그때 실질적으로 동일한 것으로 일컬어진다. 이 정의는 또한 시험 서열의 보완체를 지칭하거나, 그에 적용될 수 있다. 상기 정의는 또한 결실 및/또는 부가를 갖는 서열, 뿐만 아니라 치환을 갖는 것들을 포함한다. 하기 기재된 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 길이로 적어도 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 길이로 50-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 1개의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터 내로 넣고; 필요할 경우에 하위서열 좌표를 지정하고; 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 바람직하게는, 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 그 후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 비한 시험 서열에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
본원에 사용된 바와 같은 비교 윈도우는 20 내지 600개, 통상적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 통상적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택되는 인접한 위치의 수 중 어느 하나의 절편에 대한 언급을 포함하며, 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후에 인접한 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해; 문헌 [Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해; 문헌 [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해; 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해 (미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 (Wisconsin Genetics Software Package)에서의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA); 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참조) 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 문헌 [Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)], 및 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 핵산 또는 단백질에 대한 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해 본원에 기재된 파라미터와 함께 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 정렬되는 경우에 일부 양의 값의 역치 점수 T를 매치하거나 만족시키는, 의문 서열에서의 선택된 길이 (W)의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 점수화 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 점수 역치로 지칭된다 (Altschul et al., 상기 문헌). 이들 초기 이웃 단어 히트는 그들을 함유하는 보다 긴 HSP를 발견하기 위한 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각각의 서열과 함께 둘 다의 방향에서 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 리워드 점수; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 점수화 행렬을 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각각의 방향에서의 단어 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성된 값으로부터 양 X에 의해 저하되거나; 누적 점수가 1개 이상의 음의 점수화 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하로 가거나; 어느 하나의 서열의 마지막이 도달되는 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. 기대값 (E)는 우연히 데이터베이스 검색에서 발생할 것으로 예상되는 것과 등가이거나 더 양호한 점수를 갖는 상이한 정렬의 수를 나타낸다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대해)은 디폴트로서 11의 단어길이 (W), 10의 기대값 (E), M=5, N=-4 및 둘 다의 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이, 10의 기대값 (E), 및 BLOSUM62 점수화 행렬 (문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조), 50의 정렬 (B), 10의 기대값 (E), M=5, N=-4, 및 둘 다의 가닥의 비교를 사용한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 3개의 아미노산의 중합체의 그의 관련 기술분야에 인식된 의미를 가지며, 펩티드 및 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 그러나, 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 특정 기능적 부류, 예컨대, 예를 들어, 불포화효소, 신장효소 등을 지칭하는데 사용된다. 각각의 이러한 부류에 대해, 본 개시내용은 이러한 폴리펩티드의 공지된 서열의 몇몇 예를 제공한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 용어 폴리펩티드가 본원에 (또는 본원에 구체적으로 언급된 참고문헌 또는 데이터베이스에) 인용된 완전한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포괄할 뿐만 아니라, 이러한 완전한 폴리펩티드의 기능적 단편 (즉, 적어도 1종의 활성을 보유하는 단편)을 나타내는 폴리펩티드를 포괄하도록 충분히 일반적인 것으로 의도됨을 인정할 것이다. 더욱이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단백질 서열이 일반적으로 활성을 파괴하지 않고 일부 치환을 용인함을 이해하고 있다. 따라서, 활성을 보유하고, 동일한 부류의 또 다른 폴리펩티드와 적어도 약 30-40% 전체 서열 동일성, 종종 약 50%, 60%, 70%, 또는 80% 초과를 공유하고, 추가로 1개 이상의 고도로 보존된 영역에 통상적으로 훨씬 더 큰 동일성, 종종 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 적어도 1개의 영역을 포함하고, 통상적으로 적어도 3-4개, 종종 20개 이상까지의 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드는 본원에 사용된 바와 같은 관련 용어 폴리펩티드 내에 포괄된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 다양한 폴리펩티드의 서열의 분석에 의해 유사성 및/또는 동일성의 다른 영역을 결정할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지된 바와 같이, 동일성 및/또는 유사성의 정도를 평가하기 위해 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 비교를 수행하기 위한 다양한 전략이 공지되어 있으며, 도구가 이용가능하다. 이들 전략은, 예를 들어, 수동 정렬, 컴퓨터 보조 서열 정렬 및 이들의 조합을 포함한다. 서열 정렬을 수행하기 위한 다수의 알고리즘 (이는 일반적으로 컴퓨터 실행됨)이 폭넓게 이용가능하거나, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 생성될 수 있다. 대표적인 알고리즘은, 예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482)]의 국소 상동성 알고리즘; 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443)]의 상동성 정렬 알고리즘; 문헌 [Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1988, 85: 2444)]의 유사성 방법을 위한 검색; 및/또는 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해 (예를 들어, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹, 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리즈(Wisconsin Genetics Software Package Release) 7.0에서의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)를 포함한다. 이러한 알고리즘을 혼입하는 용이하게 이용가능한 컴퓨터 프로그램은, 예를 들어, BLASTN, BLASTP, 갭드(Gapped) BLAST, PILEUP, CLUSTALW 등을 포함한다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. 대안적으로, 실시자는 그의 또는 그녀의 실험적 및/또는 다른 요구에 따라 비-디폴트 파라미터를 사용할 수 있다 (예를 들어, URL www.ncbi.nlm.nih.gov를 갖는 웹 사이트 참조).
본원에 사용된 바와 같은 용어 프로모터, 프로모터 요소, 및 조절 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하고, 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 시행하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 형질전환은 외인성 또는 이종 핵산 분자 (예를 들어, 벡터 또는 재조합 핵산 분자)가 수용자 세포 또는 미생물 내로 도입되는 프로세스를 지칭한다. 외인성 또는 이종 핵산 분자는 숙주 세포 또는 미생물의 게놈을 구성하는 염색체 DNA 내로 통합될 (즉, 그에 공유적으로 연결될) 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 외인성 또는 이종 폴리뉴클레오티드는 에피솜 요소, 예컨대 플라스미드 상에 유지될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 외인성 또는 이종 폴리뉴클레오티드는 그것이 염색체 복제를 통해 딸 세포에 의해 유전되도록 염색체 내로 통합되게 될 수 있다. 형질전환 방법은 인산칼슘 침전, 재조합 핵산을 함유하는 박테리아 원형질체와의 수용자 세포의 융합; 재조합 핵산을 함유하는 리포솜으로의 수용자 세포의 처리; DEAE 덱스트란; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용한 융합; 전기천공; 자기천공; 비올리스틱 전달; 레트로바이러스 감염; 리포펙션; 및 세포 내로 직접적으로 DNA의 미세-주사를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
세포에 관하여 사용된 바와 같은 용어 형질저환된은 세포가 외인성 또는 이종 유전 물질 (예를 들어, 재조합 핵산)을 운반하도록 본원에 기재된 바와 같은 형질전환을 겪은 세포를 지칭한다. 용어 형질전환된은 또한 또는 대안적으로 외인성 또는 이종 유전 물질을 함유하는 미생물, 미생물의 균주, 조직, 유기체 등을 지칭하는데 사용될 수 있다.
세포, 핵산, 폴리펩티드, 벡터 등에 관하여 사용되는 경우에 용어 변형된 및 재조합은 세포, 핵산, 폴리펩티드, 벡터 등이 실험실 방법에 의해 변형되었거나, 그의 결과이고, 비-자연 발생인 것을 지시한다. 따라서, 예를 들어, 변형된 세포는 실험실 방법, 예를 들어, 핵산을 세포 내로 도입하는 형질전환 방법에 의해 생산되거나 그에 의해 변형된 세포를 포함한다. 변형된 세포는 세포의 천연 (비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 변경된, 예를 들어, 비-천연 프로모터에 연결된 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 대조군 또는 표준 대조군은 시험 샘플, 측정, 또는 값에 대한 비교를 위해 참조물, 통상적으로 공지된 참조물로서 기능하는 샘플, 측정, 또는 값을 지칭한다. 예를 들어, 시험 세포, 예를 들어, Fc 수용체에 대한 유전자를 코딩하는 핵산 서열로 형질전환된 세포는 공지된 정상 (야생형) 세포 (예를 들어, 표준 대조군 세포)와 비교될 수 있다. 표준 대조군은 또한 Fc 수용체를 발현하지 않거나, Fc 수용체 활성을 갖지 않거나 그의 최소 수준을 갖는 세포의 집단 (예를 들어, 표준 대조군 미생물)으로부터 수집한 평균 측정 또는 값을 나타낼 수 있다. 통상의 기술자는 표준 대조군이 임의의 수의 파라미터 (예를 들어, RNA 수준, 폴리펩티드 수준, 특정 세포 유형 등)의 평가를 위해 설계될 수 있음을 인식할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 이뮤노글로불린 또는 그의 단편을 지칭한다. 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD)의 것일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 IgG이다. 항체는 비-인간 (예를 들어, 마우스, 염소, 또는 임의의 다른 동물로부터), 완전히 인간, 인간화, 또는 키메라일 수 있다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 임의로, 항체는 모노클로날이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 배양에서 성장된 세포의 단일 클론으로부터 생산되고, 무한정으로 증식할 수 있는 순수한 표적-특이적 항체를 지칭한다. 사용될 수 있는 모노클로날 항체는 암성 세포 상의 항원에 부착하고 이를 차단하는 네이키드 항체를 포함한다. 임의로, 네이키드 모노클로날 항체는 림프구에서 CD52 항원에 결합하는 알렘투주맙이다. 또한, 사용될 수 있는 모노클로날 항체에는 접합된 모노클로날 항체, 예컨대 태그부착된, 표지된, 또는 로딩된 항체가 포함된다. 구체적으로, 항체는 약물 또는 독소로 태그부착되거나 로딩되거나, 방사성 표지될 수 있다. 이러한 항체의 예는 CD20 항원을 표적화하는 이브리투모맙; CD30 항원을 표적화하는 브렌툭시맙, 및 HER2 단백질을 표적화하는 트라스투주맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 다른 모노클로날 항체는 이중특이적 모노클로날 항체, 예컨대 림프종 세포에서 CD19를, 및 T 세포에서 CD3을 표적화하는 블리나투모맙이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 단편"은 에피토프를 인식하는 항체의 임의의 부분을 지칭한다. 항체 단편은 글리코실화될 수 있다. 비-제한적 예로서, 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, rIgG 단편, 기능적 항체 단편, 상기의 단일 쇄 재조합 형태 등일 수 있다. F(ab')2, Fab, Fab' 및 Fv는 IgG 및 IgM의 가변 영역으로부터 생성될 수 있는 항원-결합 단편이다. 이들은 크기, 결합가, 및 Fc 함량에 있어서 다양하다. 단편은 세포 또는 세포주, 또는 다수의 세포 또는 세포주에 의한 구성요소 (예를 들어, 중쇄 및 경쇄 부분)의 발현을 비롯한 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 항체 단편은 에피토프를 인식하며, 그것이 Fc 수용체에 결합할 수 있도록 Fc 영역의 충분한 부분을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "암"은 백혈병, 암종 및 육종을 비롯한 포유동물에서 발견되는 임의의 유형의 암, 신생물, 또는 악성 종양을 지칭한다. 예시적인 암은 뇌, 유방, 자궁경부, 결장, 두경부, 간, 신장, 폐, 비-소세포 폐, 흑색종, 중피종, 난소, 육종, 위, 자궁 및 수모세포종의 암을 포함한다. 추가의 예는 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판증가증, 원발성 마크로글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드, 방광암, 전악성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신 피질암, 내분비 및 외분비 췌장의 신생물, 및 전립선암을 포함한다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 NK-92 세포로 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 임의로, 대상체는 변형된 NK-92 세포 및 항체로 치료된다.
변형된 NK-92 세포는 세포의 절대 수에 의해 대상체에 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 대상체는 약 1000 세포/주사 내지 약 100억 세포/주사 이하로, 예컨대 주사당 약, 적어도 약, 또는 많아야 약, 1x1010, 1x109, 1x108, 1x107, 5x107, 1x106, 5x106, 1x105, 5x105, 1x104, 5x104, 1x103, 5x103개 (등) NK-92 세포, 또는 상기 수의 임의의 2개 사이의 임의의 범위 (종점 포함)로 투여될 수 있다. 임의로, 1x108 내지 1x1010 세포가 대상체에게 투여된다. 임의로, 세포는 1주 이상 동안 매주 1회 이상 투여된다. 임의로, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 또는 그 초과 동안 매주 1회 또는 2회 투여된다.
임의로, 대상체는 약 1000 세포/주사/m2 내지 약 100억 세포/주사/m2 이하, 예컨대 주사당 약, 적어도 약, 또는 많아야 약, 1x108/m2, 1x107/m2, 5x107/m2, 1x106/m2, 5x106/m2, 1x105/m2, 5x105/m2, 1x104/m2, 5x104/m2, 1x103/m2, 5x103/m2 (등) NK-92 세포, 또는 상기 수의 임의의 2개 사이의 임의의 범위 (종점 포함)로 투여된다.
임의로, NK-92 세포는 세포의 상대 수에 의해 이러한 개체에게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 상기 개체는 개체의 킬로그램당 약 1000 세포 내지 약 100억 세포 이하, 예컨대 개체의 킬로그램당 약, 적어도 약, 또는 많아야 약, 1x108, 1x107, 5x107, 1x106, 5x106, 1x105, 5x105, 1x104, 5x104, 1x103, 5x103개 (등) NK-92 세포, 또는 상기 수의 임의의 2개 사이의 임의의 범위 (종점 포함)로 투여될 수 있다.
임의로, 총 용량은 m2당 약 1x1011, 1x1010, 1x109, 1x108, 1x107, 또는 상기 수의 임의의 2개 사이의 임의의 범위 (종점 포함)를 비롯한 체표면적의 m2에 의해 계산될 수 있다. 임의로, 약 10억 내지 약 30억개 NK-92 세포가 환자에게 투여된다. 임의로, 용량당 주사되는 NK-92 세포의 양은 m2당 1x1011, 1x1010, 1x109, 1x108, 1x107을 비롯한 체표면적의 m2에 의해 계산될 수 있다.
NK-92 세포, 및 임의로 다른 항암제는 암을 갖는 환자에게 1회 투여될 수 있거나, 요법 동안 다수회, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간마다 1회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 1회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 또는 그 초과마다 1회, 또는 상기 수의 임의의 2개 사이의 임의의 범위 (종점 포함)로 투여될 수 있다.
임의로, NK-92 세포는 NK-92 세포 및 매질, 예컨대 인간 혈청 또는 그의 등가물을 포함하는 조성물로 투여된다. 임의로, 매질은 인간 혈청 알부민을 포함한다. 임의로, 매질은 인간 혈장을 포함한다. 임의로, 매질은 약 1% 내지 약 15% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 임의로, 매질은 약 1% 내지 약 10% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 임의로, 매질은 약 1% 내지 약 5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 임의로, 매질은 약 2.5% 인간 혈청 또는 인간 혈청 등가물을 포함한다. 임의로, 혈청은 인간 AB 혈청이다. 임의로, 인간 치료제에서의 사용을 위해 허용되는 혈청 대용물이 인간 혈청 대신 사용된다. 이러한 혈청 대용물은 관련 기술분야에 공지되어 있을 수 있다. 임의로, NK-92 세포는 NK-92 세포 및 세포 생존력을 뒷받침하는 등장성 액체 용액을 포함하는 조성물로 투여된다. 임의로, NK-92 세포는 동결보존된 샘플로부터 재구성된 조성물로 투여된다.
본원에서 제공된 방법에 따르면, 대상체는 본원에서 제공된 작용제 중 1종 이상의 유효량이 투여된다. 용어 유효량 및 유효 투여량은 상호교환가능하게 사용된다. 용어 유효량은 바람직한 생리학적 반응 (예를 들어, 염증의 감소)을 생성하는데 필요한 임의의 양으로 정의된다. 작용제를 투여하기 위한 유효량 및 스케줄은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 투여를 위한 투여량 범위는 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상이 영향을 받는 (예를 들어, 감소되거나 지연되는) 바람직한 효과를 생성하는데 충분히 큰 것들이다. 투여량은 실질적인 유해 부작용, 예컨대 원하지 않는 교차-반응, 아나필락시스 반응 등을 유발하도록 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 연령, 상태, 성별, 질환의 유형, 질환 또는 장애의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 레지멘에 포함되는지 여부에 따라 다양할 것이며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 금기의 경우에 개별적 의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 다양할 수 있으며, 1일 또는 수 일 동안 매일 1회 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 지침은 주어진 부류의 제약 생성물에 대한 적절한 투여량에 대한 문헌에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 주어진 파라미터에 대해, 유효량은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 또는 적어도 100%의 증가 또는 감소를 제시할 것이다. 효능은 또한 "-배" 증가 또는 감소로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 치료학적 유효량은 대조군에 비해 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 5-배 또는 그 초과의 효과를 가질 수 있다. 정확한 용량 및 제형은 치료의 목적에 의존할 것이며, 공지된 기법을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확인가능할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)]; [Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)]; [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Editor (2012)], 및 [Pickar, Dosage Calculations (1999)] 참조).
제약상 허용되는 조성물은 다양한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 완충 염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균성이며, 일반적으로 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 적합한 담체 및 부형제 및 그들의 제형은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)]에 기재되어 있다. 제약상 허용되는 담체란 생물학적으로 또는 다른 식으로 비바람직하지 않은 물질을 의미하며, 즉, 물질은 비바람직한 생물학적 효과를 유발하거나, 그것이 함유된 제약 조성물의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 대상체에게 투여된다. 대상체에게 투여되는 경우, 담체는 임의로 활성 성분의 분해를 최소화하고, 대상체에서 유해 부작용을 최소화하도록 선택된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 제약상 허용되는은 생리학적으로 허용되는 및 약리학적으로 허용되는과 동의어로 사용된다. 제약 조성물은 일반적으로 완충 및 저장에서의 보존을 위한 작용제를 포함할 것이며, 투여 경로에 따라 적절한 전달을 위한 완충제 및 담체를 포함할 수 있다.
조성물은 대략적 생리학적 조건에 요구되는 바와 같은 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 독성 조정제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형 및/또는 다른 작용제에서의 세포의 농도는 다양할 수 있으며, 일차적으로 선택된 투여의 특정 방식 및 대상체의 필요에 따라 유체 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택될 것이다.
임의로, NK-92 세포는 치료되는 암을 위한 1종 이상의 다른 치료와 함께 대상체에게 투여된다. 이론에 구애되지는 않지만, NK-92 세포 및 암을 위한 또 다른 요법으로의 대상체의 공동-치료는 NK-92 세포 및 대안적인 요법이 종전에는 이러한 내인성 작용을 압도하였던 암을 청소하는 기회를 내인성 면역계에 제공하는 것을 허용할 것이다. 임의로, 치료되는 암을 위한 2종 이상의 다른 치료는, 예를 들어, 항체, 방사선, 화학치료제, 줄기 세포 이식, 또는 호르몬 요법을 포함한다.
임의로, 항체는 NK-92 세포와 함께 환자에게 투여된다. 임의로, NK-92 세포 및 항체는 대상체에게 함께, 예를 들어, 동일한 제형으로; 별개로, 예를 들어, 별개의 제형으로, 공동으로 투여되거나; 또는 별개로, 예를 들어, 상이한 투약 스케줄로 또는 하루의 상이한 시간에 투여될 수 있다. 별개로 투여되는 경우, 항체는 임의의 적합한 경로, 예컨대 정맥내 또는 경구 투여로 투여될 수 있다.
임의로, 항체는 암성 세포 또는 암-연관된 마커를 발현하는 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 다수의 항체는 단독으로 암의 치료를 위해 승인되었다.
표 2. 예시적인 FDA 승인된 치료제 모노클로날 항체
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Figure 112019100227040-pct00002
항체는 다수의 메카니즘을 통해 암을 치료할 수 있다. ADCC는 면역 세포, 예컨대 NK 세포가 Fc 수용체, 예컨대 CD16을 통해 표적 세포에 결합된 항체에 결합할 경우에 발생한다.
따라서, CD16을 발현하는 NK-92 세포는 특이적 암-연관된 단백질에 대해 지정된 적어도 1종의 모노클로날 항체, 예를 들어, 알렘투주맙, 베바시주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 오파투무맙, 리툭시맙, 및 트라스투주맙의 유효량과 함께 대상체에게 투여된다. 임의로, 모노클로날 항체는 네이키드 모노클로날 항체, 접합된 모노클로날 항체 또는 이중특이적 모노클로날 항체이다. 임의로, 암 세포에 결합하고, 또한 NK-92 세포의 표면 상에 존재하는 세포-표면 단백질에 결합하는 이중특이적 항체가 사용될 수 있다.
암-특이적 항체는 암 세포의 표면 상에 발현되는 특정 단백질 항원에 결합한다. NK-92 세포는 항체가 NK-92 세포 표면과 회합되도록 변형될 수 있다. 임의로, 항체는 암에 대해 특이적이다. 이러한 방식에서, NK-92 세포는 암에 특이적으로 표적화될 수 있다. 중화 항체는 또한 단리될 수 있다. 예를 들어, 분비된 당단백질, YKL-40은 다수의 유형의 진행성 인간 암에서 상승된다. YKL-40에 대한 항체는 종양 성장, 혈관신생 및/또는 전이를 억제하는데 사용될 수 있음이 고려된다. 문헌 [Faibish et al., (2011) Mol. Cancer Ther. 10(5):742-751]을 참조한다.
암에 대한 항체는 시판되는 공급원으로부터 구입할 수 있거나, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체는 암에 의해 감염되고, 회복되었거나, 샘플이 취해진 때 회복되고 있었던 이전에 1명 이상의 환자로부터 B 세포, 골수, 또는 다른 샘플을 얻음으로써 생산될 수 있다. 이들 샘플로부터 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)를 확인하고, 스크리닝하고, 성장시키는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 파지 제시 라이브러리는 관심의 샘플 또는 세포로부터 RNA를 단리하고, 단리된 RNA로부터 cDNA를 제조하고, cDNA를 중쇄 및/또는 경쇄 cDNA에 대해 풍부화하고, 파지 제시 벡터를 사용하여 라이브러리를 생성함으로써 제조될 수 있다. 라이브러리는, 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Maruyama, et al.]에 기재된 바와 같이 제조되고, 스크리닝될 수 있다. 항체는 재조합 방법 또는 임의의 다른 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 단리, 스크리닝, 특징화, 및 생산은 또한 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Beerli, et al., PNAS (2008) 105(38):14336-14341]에 기재되어 있다.
작용제 또는 조성물의 조합은 병용하여 (예를 들어, 혼합물로서), 별개로 그러나 동시에 (예를 들어, 별개의 정맥내 라인을 통해) 또는 순차적으로 (예를 들어, 1종의 작용제가 먼저 투여되고, 제2 작용제의 투여가 이어짐) 투여될 수 있다. 따라서, 용어 조합은 2종 이상의 작용제 또는 조성물의 병용, 동시, 또는 순차 투여를 지칭하기 위해 사용된다. 치료의 과정은 대상체의 특정 특징 및 선택되는 치료의 유형에 따라 개체 기초로 가장 양호하게 결정된다. 치료, 예컨대 본원에 개시된 것들은 매일, 1일 2회, 격주로, 매월, 또는 치료학적으로 유효한 임의의 적용가능한 기초로 대상체에게 투여될 수 있다. 치료는 단독으로 또는 본원에 개시되거나 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 치료와 조합으로 투여될 수 있다. 추가의 치료는 제1 치료와 동시에, 상이한 시간에, 또는 전체적으로 상이한 치료 스케줄로 (예를 들어, 제1 치료는 매일일 수 있는 반면, 추가의 치료는 매주임) 투여될 수 있다.
또한, 제공된 변형된 NK-92 세포를 포함하는 키트가 개시된다. 임의로, 키트는 1종 이상의 추가의 작용제, 예컨대 항체를 추가로 포함한다. 키트의 성분은 1개 또는 상이한 용기, 예컨대 1개 이상의 바이알에 함유될 수 있다. 항체는 저장-수명을 증진시키기 위해 액체 또는 고체 형태 (예를 들어, 동결건조 후)일 수 있다. 액체 형태인 경우, 성분은 첨가제, 예컨대 안정화제 및/또는 보존제, 예컨대 프롤린, 글리신, 또는 수크로스 또는 저장-수명을 증진시키는 다른 첨가제를 포함할 수 있다.
임의로, 키트는 변형된 NK-92 세포 또는 NK-92 세포 및 항체의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여되는 추가의 화합물, 예컨대 치료학적 활성 화합물 또는 약물을 함유할 수 있다. 이러한 화합물의 예는 비타민, 미네랄, 플루드로코르티손, 이부프로펜, 리도카인, 퀴니딘, 화학치료제 등을 포함한다.
임의로, 키트의 사용에 대한 지침서는 암의 치료에 있어서 키트 성분을 사용하는 지시를 포함할 것이다. 지침서는 항체 및 NK-92 세포 (예를 들어, 해동 및/또는 배양)를 제조하는 (예를 들어, 동결-건조된 단백질의 경우, 희석하거나 재구성하는) 방법에 관한 정보를 더 함유할 수 있다. 지침서는 투여량 및 투여의 빈도에 관한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
개시된 방법 및 조성물에 대해 사용될 수 있거나, 그와 함께 사용될 수 있거나, 그를 위한 제조에 사용될 수 있거나, 그의 생성물인 물질, 조성물, 및 성분이 개시된다. 이들 및 다른 물질은 본원에 개시되어 있으며, 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 군 등이 개시되는 반면, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 순열에 대한 구체적 언급이 명확하게 개시되지 않을 수 있는 경우, 각각은 본원에 구체적으로 고려되고, 기재됨이 이해된다. 예를 들어, 방법이 개시되고, 논의되며, 방법을 포함하는 다수의 분자에 이루어질 수 있는 다수의 변형이 논의되는 경우, 방법 및 가능한 변형의 각각의 및 모든 조합 및 순열은 반대로 구체적으로 지시되지 않는다면 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 하위세트 또는 조합은 또한 구체적으로 고려되고, 개시된다. 이 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법에서의 단계를 포함하나 이에 제한되지는 않는 이 개시내용의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가의 단계가 있는 경우, 이들 추가의 단계의 각각은 임의의 구체적인 방법 단계 또는 개시된 방법의 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있으며, 각각의 이러한 조합 또는 조합의 하위세트는 구체적으로 고려되고, 개시된 것으로 간주되어야 함이 이해된다.
본원에 인용된 간행물 및 그들이 인용된 물질은 그 전문이 본원에 구체적으로 참조로 포함된다.
하기 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물의 특정 측면을 추가로 예시하는 것으로 의도되며, 청구범위의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1. haNK003의 구조적 및 기능적 특징.
NK-92 [CD16.176V, ER IL-2] (haNK003)는 NK-92 세포의 변형을 통해 생성되었다. NK-92 세포는 원래 1992년에 급속 진행성 비-호지킨 림프종을 갖는 50세 남성 환자로부터 단리되었다 (Gong, et al., Leukemia, 8(4):652-8 (1994)). NK-92 세포주는 이어서 특징화되었으며, 표현형적으로 CD56+, CD3-, 및 CD16-, 뿐만 아니라 IL-2 의존적인 것으로 제시되었다. haNK003은 CD16 및 IL-2에 대한 서열을 함유하는 비시스트로닉 플라스미드-기재 벡터로의 NK-92 세포의 전기천공에 의한 안정한 형질감염을 통해 생성된 동종이형 세포주이다. 형질감염된 플라스미드는 도 1에 제시되어 있으며, 진아트 아게(GeneArt AG)에 의해 구축되었다. CD16 서열은 아미노산 176에서 발린을 코딩하며 (176V), 이는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)에 대한 증가된 잠재성을 허용한다. IL-2 서열은 내형질 세망 체류 신호, KDEL로 태그부착되어 내형질 세망 (ER)으로부터의 IL-2 단백질 분비를 방지한다. IL-2 서열의 포함은 haNK™가 IL-2 독립적임을 허용한다.
오이페츠 게엠베하(EUFETS GmbH) (독일 레겐스부르크)는 전기천공에 의한 형질감염을 수행하였으며, 1 라운드의 제한 희석에 의해 다수의 클론을 선택하였다. 오이페츠로부터의 단일 클론은 GMP 마스터 세포 은행, haNK003을 확립하기 위해 바이오릴라이언스(BioReliance)로 보내졌다. 선택된 클론에 대한 전체 게놈 시퀀싱은 플라스미드 삽입 부위가 위치 15,654,977 - 15,661,403에서 염색체 17 상의 단일 위치에 있음을 확인시켜 주었다.
형질감염 플라스미드
플라스미드를 제공된 명세에 기초하여 진아트 아게에 의해 구축하였다. 합성 유전자 pNEUKv1_FcRIL2를 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 생성물로부터 어셈블리하였다. 단편을 EcoRI 및 NotI 제한 부위를 사용하여 pNEUKv1_O059 벡터 골격 내로 클로닝하였다. pNEUKv1_O059는 암피실린 저항성 카세트를 함유하는 합성 벡터이다. 트랜스진의 발현에 사용된 프로모터는 SV40 폴리아데닐화 서열을 갖는 EF-1알파이다. 생성된 플라스미드는 길이로 5,491 염기 쌍 (bp)이며, CD16 및 IL-2에 대한 인간 기원 서열을 함유한다. CD16도 IL-2도 임의의 형질전환 특성을 갖지 않는다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고, 그의 농도를 UV 분광법에 의해 결정하였다. 최종 구축물을 시퀀싱에 의해 확인하였다. 사용된 제한 부위 내의 서열 일치는 100%였다. 플라스미드를 TSE-무함유 생산 조건 하에서 제조하였다.
pNEUKv1_FcRIL2 플라스미드의 전체 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 1)을 여기에 제시한다:
Figure 112019100227040-pct00003
Figure 112019100227040-pct00004
haNK003 세포주를 생성하기 위해, NK-92 (aNK) 마스터 세포 은행(Master Cell Bank) (MCB) (aNK COA) 및 250 mg의 pNEUKv1_FcRIL2 플라스미드의 바이알을 오이페츠 게엠베하로 보내었다. 오이페츠는 MCB 바이알을 해동하고, NK-92 세포를 플라스미드로의 형질감염을 위한 적당한 수로 배양하였다. 형질감염된 세포를 형지감염 후 처음 2일 동안 IL-2, X-비보(X-Vivo) 10, 및 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청을 갖는 배지에서 성장시켰다. 2일 후, IL-2는 성장 배지에 더 이상 첨가되지 않았으며, 형질감염되고 적당한 양의 IL-2를 생산하는 임의의 세포는 계속 성장하였다. 다수의 클론을 제한 희석에 의해 단리하고, 표현형 및 Fc 수용체 발현에 대해 예비적으로 스크리닝하였다. 양호한 생존력 (> 70%), 허용가능한 배가 시간, 예상된 표현형 및 양성 Fc 수용체 발현을 나타낸 6개의 클론을 보다 광범위한 스크리닝 및 단일 클론의 최종 선택을 위해 독일 적십자 GMP 시험 실험실 (German Red Cross GMP Testing Laboratory) (GRC)로 보내었다. GRC에서, 모든 클론을 표현형 (Fc 수용체 발현을 포함함), ADCC, 시토카인 프로파일, 성장 특징, 및 방사선 민감도에 대해 시험하였다. 선택된 세포주, haNK003을 사용하여 마스터 세포 은행를 생성하였다.
난트케이웨스트 마스터 세포 은행(NantKwest Master Cell Bank) (MCB haNK003)을 선택된 세포주로부터 제조하고, 바이오릴라이언스에 의해 시험하였다. MCB를 순도, 효능, 동일성, 멸균성 및 바이러스/우발성 작용제에 대해 시험하였다. MCB를 1 x 107 세포/바이알의 분취액으로 10% DMSO, 40% X-비보 10, 50% 인간 AB 혈청의 제형에서 냉동보존한다. MCB에 대한 냉동보존으로부터 생성된 바이알의 총수는 218이었다.
통합 부위
haNK003으로부터의 DNA 추출물을 전체 게놈 시퀀싱을 위해 CLIA/CAP 공인 난트오믹스 시퀀싱 랩(NantOmics Sequencing Lab) (미국 캘리포니아주 컬버 시티)에 제공하였다. 전체 게놈 라이브러리를 KAPA 하이퍼(Hyper) 프렙 키트를 사용하여 세포주 샘플에 대해 제조하고, 일루미나 하이섹(Illumina HiSeq) 기기 상에서 시퀀싱하여 25x의 최소 커버리지를 제공하고, haNK003에 대해 완료하였다. DNA 시퀀싱 데이터를 bwa-mem에 의해 보고된 혈장 서열을 함유하는 증강된 게놈 참조 컨소시움 휴먼 빌드(Genome Reference Consortium Human Build) 37 (GRCh37, hg19로도 공지됨, 원래 유니버시티 오브 캘리포니아(University of California)로부터 얻어짐, 산타 크루즈 게놈 브라우저(Santa Cruz Genome Browser) - http://genome.ucsc.edu)에 대해 정렬하고, 샘블라스터에 의해 이중 마킹하고, indel 재정렬하고, 게놈 분석 툴키트(Genome Analysis Toolkit) (GATK)에 의해 염기 품질 재보정하였다. 변이체 분석을 난트오믹스 콘트라스터(NantOmics Contraster) 분석 파이프라인을 사용하여 수행하여 단일-뉴클레오티드 변화, 작은 삽입 또는 결실 (indel), 카피-수 변화, 재배열, 및 통합 부위를 비롯한 변이체를 결정하였다. 통합된 플라스미드 및 생성된 통합 부위를 난트오믹스 게놈 브라우저에 의해 가시화하고, 추가의 비교 및 가시화를 UCSC 게놈 브라우저 상에서 수행하여 기존의 게놈 요소와의 임의의 잠재적 상호작용을 확인하였다.
haNK003은 chr17:15654977-15661403에 대한 지도화의 부조화된 판독 증거를 제시하였다. 가장 가까운 5' 유전자 TBC1D26 (chr17:15,635,591-15,644,255)은 10,722 bp 상류이고, 가장 가까운 3' 유전자 ADORA2B (chr17:15,848,231-15,871,210)는 186,828 bp 하류이다. 유니프롯(UniProt)에서 Rab 패밀리 단백질(들)에 대한 GTPase-활성화 단백질로서 주석화된 것 외에는 TBC1D26에 대해 거의 공지된 바가 없다. ADORA2B는 아데노신의 존재 하에서 아데닐레이트 시클라제 활성을 자극하는 막 단백질로서 주석화되어 있다 (Strohmeier, et al., J. Biol. Chem. 270(5):2387-2394 (1995)). 코딩 서열 표지된 pNEUKv1_FcRIL에 대한 2가지 주석화된 ORF에서 코딩 변이체는 발견되지 않았다. UCSC 엔코드(Encode) 트랙 및 lincRNA는 삽입 부위 (TCONS_12_00011108)의 하류의 lincRNA 전사체의 증거를 제시하지만, 이는 3' 통합 부위의 대략 2,450 bp 하류이며, 이는 이 전사체가 가능하게는 여전히 무손상임을 지시한다. 척추동물 종의 100-원 다중 정렬의 조사는 통합 부위에 걸쳐 염기-수준 보존이 거의 없음을 지시하며, 음의 로그 p-값은 0.01의 보존 평균 및 0.58의 표준 편차로 -3.874 내지 1.507의 범위이다.
haNK003은 인간 게놈 통합 부위에서 유전자, 전사체 또는 조절 파손의 증거를 함유하지 않았다. 세포주 haNK003의 통합은 임의의 유전자로부터 적어도 10 kbp 떨어져 있었다. 세포주는 표적 세포주 인간 게놈에서 임의의 공지된 게놈 특색에 대한 파괴의 증거가 없다는 점에서 허용가능하다.
성장 특징
MCB haNK003을 생성하는데 사용된 클론성 세포주 haNK003의 성장 특징을 도 1a 및 1b에 제시된다. 데이터를 마스테 세포 은행 냉동보존을 위해 세포주 haNK003을 성장시키는 경우에 세포 배양 내력으로부터 분석하였다. 평균 배가 시간은 제3일 내지 제29일에 65시간 (48 - 95시간)이었다. 필적하는 세포 밀도는 계대 동안 달성되었으며, 이는 haNK003 세포가 3 내지 4일마다 계대되고, 대략 0.3-0.5 x 106 세포/mL의 밀도로 시딩되는 경우에 지속적으로 성장함을 입증한다.
표현형
haNK003 세포의 표면 상의 6가지 단백질 마커의 패널의 발현을 정량화하고, haNK003 프로파일을 모 세포주 NK-92 (aNK)의 프로파일과 비교하기 위한 연구를 수행하였다. 표면 마커의 패널은 자연 살해 (NK) 세포의 대표인 것으로 선택되었다.
aNK 세포는 NKG2D 및 NKp30을 비롯한 다수의 활성화 수용체를 발현하지만, FcγRIIIa (CD16) 및 억제성 KIR (살해 이뮤노글로불린 유사 수용체)이 결여된, 초기 분화 단계에서의 NK 세포에 전형적인 표면 마커를 발현한다. aNK 세포의 이 특정 표면 마커 발현 프로파일은 그들에게 그들의 고유한 세포독성 특성을 부여한다. 따라서, 고-친화도 FcγRIIIa 및 세포내로 보유된 IL-2 (ERIL-2)를 코딩하는 플라스미드의 안정한 형질감염에 의한 haNK003 세포주의 생성이 모 aNK 세포주의 핵심 표면 마커의 발현 프로파일을 변경시키지 않았음을 확립하는 것이 중요하였다. 표면 마커 CD54, CD56, NKG2D, NKp30, CD3, 및 CD16을 분석하고, 세포를 특이적 플루오로크롬-접합된 항체로 염색하고, 결합된 항체를 유동 세포측정에 의해 검출함으로써 마커 발현을 결정하였다.
유동 세포측정 분석의 결과를 표 1에 요약하고, 대표적인 히스토그램을 도 2에 제공한다.
표 1. 표면 마커의 발현.
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% = 발현에 대해 양성인 세포의 백분율 ± 표준 편차
haNK003 및 aNK는 중위 형광 강도에 의해 결정된 바와 같은 필적하는 양의 CD54, CD56, NKG2D 및 NKp30을 발현한다. 또한, 이들 마커를 발현하는 세포의 백분율은 등가이다. haNK003도 aNK도 T 세포 마커인 CD3을 발현하지 않는다. 예상된 바와 같이, haNK003은 CD16 마커를 발현하는 반면, aNK는 그렇지 않다.
haNK003 세포주의 생성은 모 aNK 세포주의 핵심 표면 마커의 발현을 변경시키지 않았으며, 단지 CD16의 발현의 형태로 추가의 기능성을 첨가하였다.
세포독성
haNK003 세포주의 자연 세포독성을 세포주 K562, Raji, SKOV3, 및 SKBR3에 대해 다양한 이펙터 대 표적 비 (E:T)에서 평가하였다. haNK003의 ADCC 활성을 또한 세포주 Raji, SKOV3, 및 SKBR3에 대해 다양한 E:T 비에서 평가하였다. 자연 세포독성에 의한 haNK 살해에 대한 상이한 표적 세포주의 민감도는 다양하며, K562 세포주가 가장 민감하고, 고형 종양 세포주 (SKOV3 및 SKBR3)가 덜 민감하다 (도 3a, 3b, 3c 및 3d). 상이한 표적 세포주에 대한 haNK003 ADCC 활성의 일부 변이는 또한 관찰되었으며, 가장 높은 비용해는 리툭시맙과 조합으로의 Raji 세포에서 관찰되었다 (도 4a, 4b 및 4c).
결과는 haNK003 세포가 몇몇 암 세포의 존재 하에서 자연 세포독성을 제시하며, 항체와 함께 ADCC를 통한 증진된 비용해가 가능함을 입증한다.
haNK™ MCB (haNK003)에 대한 명세 및 결과를 표 2에 제공한다.
표 2. haNK003 세포의 명세.
Figure 112019100227040-pct00006
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a - EBV 바이러스 게놈이 검출되지만, NK-92 (aNK)로의 시험은 세포가 EBV의 감염을 유발하지 않음을 결정하였다. 감염성 연구는 aNK 세포 (조사된 및 비-조사된)를 B-림프구와 공동-배양하여 aNK 세포가 정상 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 방출하는지를 결정함으로써 수행하였다. 결과는 B-림프구의 증식 또는 성장의 지시가 없음을 나타내었으며, 이는 aNK 세포가 EBV 감염에 대한 위험성을 제기하지 않음을 지시한다.
실시예 2. 시험관내 증식 능력 및 기능성에 대한 조사의 효과
haNK™ 세포를 조사하여 비억제된 증식의 위험성을 완화시킨다. 시험관내 증식 능력 및 기능성에 대한 조사의 효과를 평가하였다. 이들 연구는 10 Gy에서의 조사가 조사후 적어도 6시간 동안 기능적 활성을 여전히 유지하면서 haNK 세포의 적어도 99.9%의 증식 능력을 억제함을 입증한다.
haNK003 세포는 자연 (직접) 세포독성 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 둘 다를 나타낸다. 둘 다의 경우, 표적 세포 항원은 NK 세포 상의 활성화 수용체에 의해 인식된다. 자연 세포독성에 대해, 이들 표적 세포 항원은 바이러스 감염되거나 형질전환된 세포에 특징적인 스트레스 항원이다. ADCC에 대해, 항원은 항체에 의해 인식되는 종양 특이적 항원이며, 이는 따라서 그의 불변 (Fc) 영역을 통해 NK 세포 활성화 수용체, FcγRIIIa (CD16)에 결합한다.
NK 세포와 표적 세포 리간드의 상호작용 (직접 상호작용을 통해 또는 항체-매개 상호작용을 통해)은 세포 연접의 형성 및 후속의 퍼포린 및 그란자임의 방출을 초래한다. 이는 따라서 세포막의 분해 및 표적 세포 사멸을 초래하는 표적 세포 내의 세포자멸사 프로세스를 유도한다.
자연 세포독성 및 ADCC 활성의 수준 및 예비-제형화된 세포 상의 10 Gy에서의 감마 조사 후의 그 활성의 지속기간을 결정하기 위한 연구를 수행하였다. 이 연구를 위해, 플라스크당 1.5 x 107 세포를 조사하였다. 조사로 처리된 세포의 수는 임상적 용량의 제조에 사용될 것과 등가이지는 않았지만, 조사 후의 기능성의 검정은 제조 능력에 대한 통찰을 제공할 것이다.
이들 실험의 목적을 위해, haNK003 세포를 X-선 조사기를 사용하여 10 Gy에서 조사하였다. 비-조사된 세포를 조사 없이 동일한 조작으로 처리하였다. NK 세포의 살해의 상이한 메카니즘에 민감성을 제시하는 표적 세포를 선택하였다. 예를 들어, K562 세포는 자연 세포독성에 의한 살해에 매우 민감성인 반면, DOHH는 자연 세포독성을 통한 살해에 부분적으로 민감성이지만, 적절한 항체로의 ADCC에 민감성이다. 조사된 및 비-조사된 세포를 인-하우스 개발된 유동 세포측정 기재 검정을 사용하여 비세포독성에 대해 나란히 검정하였다. 표적 세포를 긴 지방족 꼬리를 갖는 녹색 형광 염료 (PKH67)로 표지하여 세포막의 지질 영역 내로 염료를 안정하게 혼입시켰다. 세포 용해를 아이오드화프로피듐 염색에 의해 모니터링하였다.
자연 세포독성 활성의 분석은 조사의 영향이 표적 세포 및 조사후 시간에 따라 다양함을 입증한다. 민감성 세포, 예컨대 K562에 대해, 자연 세포독성 활성은 모든 이펙터 대 표적 비 (E:T)에 걸쳐 조사의 6시간 내에 유지되었지만, 24시간 후에 40% 이상 감소되었다 (도 5). DOHH2에 대해, 자연 세포독성 활성은 또한 모든 이펙터 대 표적 비에 걸쳐 조사후 6시간에서 보유되었지만, 24시간 후에 14% 이상 감소되었으며, 10:1의 E:T 비에서 50%만큼 많이 감소되었다 (도 6).
DOHH2 표적으로의 리툭시맙-매개된 ADCC 활성의 수준은 또한 6시간에서 조사된 세포에 의해 유지되었다. 그러나, 24시간에서 조사된 세포에 대한 리툭시맙-매개 ADCC 활성은 6시간에서의 세포, 및 24시간에서의 비-조사된 세포로 나타난 활성으로부터 약 16% 이상 감소되었다 (도 7). 예상된 바와 같이, 헤르셉틴 (트라스투주맙)은 haNK003과 조합으로 DOHH2 표적 세포의 임의의 ADCC 살해를 유도하지 않았으며 (도 4), 항체 단독 (리툭시맙 또는 트라스투주맙)도 임의의 DOHH2 표적 세포 살해를 유도하지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
세포독성 활성 및 ADCC 활성의 관련 수준은 예비-제형화된 haNK003 세포의 조사 후 적어도 6시간 동안 유지된다.
실시예 3. IL-2 방출의 특징화
배양 배지 내로 haNK003 세포에 의해 방출된 IL-2의 양 뿐만 아니라 다양한 시점에서 haNK003 세포에서의 세포내-보유된 IL-2의 양을 분석하기 위한 연구를 수행하였다. IL-2의 양을 상청액에서 측정하여 haNK003에 의한 IL-2 방출을 결정하였다. IL-2의 양을 세포 펠릿 용해물에서 측정하여 haNK003 중의 세포내 IL-2의 총 수준을 결정하였다. 샘플을 조사전 및 조사후 분석하여 IL-2 방출 및 세포내 IL-2 수준에 대한 조사의 영향을 결정하였다.
haNK003 세포를 T-75 플라스크에서 배양하고, X-선 조사기를 사용하여 0 Gy (조사 없음) 또는 10 Gy (조사)에서 조사한 2가지 별개의 검정을 수행하였다 (실행 #1 및 실행 #2). 그 후, haNK003 세포 (비-조사된 및 조사된)를 5% 열-불활성화된 인간 AB 혈청을 갖는 X-비보 10에서 48시간 이하 동안 배양하였다. 배양 상청액 뿐만 아니라 세포 펠릿으로부터의 샘플을 다양한 시점에서 분석을 위해 수집하였다. 세포 펠릿을 세재-기재 용액을 사용하여 용해시켜 총 세포내 IL-2를 정량화하였다. 배양 상청액 중 및 세포 용해물 샘플 중의 IL-2 농도를 2가지 상이한 검출 방법 (샌드위치 ELISA 또는 멀티플렉스 ELISA)을 사용하여 난트케이웨스트에서 또는 올셀즈, 엘엘씨 (AllCells, LLC)에 의해 독립적으로 측정하였다.
2가지 상이한 방법에 의해 측정된 IL-2 농도 값은 동일한 샘플에 대해 평균적으로 5의 역가만큼 상이하다. 둘 다의 방법은 조사된 및 비-조사된 세포 둘 다에 대해 시간 경과에 따라 IL-2 방출의 선형 증가를 제시한다 (표 3 및 도 8a, 8b, 8c, 및 8d). 조사된 세포의 배양 상청액 중의 IL-2 농도는 모든 시점에서 비-조사된 세포보다 더 높은 경향이 있지만, 차이는 검정 실행 #1 및 #2 사이에 다양하였다.
표 3. 상이한 시점에서의 조사된 vs. 비-조사된 haNK003의 1 x 10 6 세포당 방출된 IL-2 (pg/mL) (이중 판독에 대한 평균 및 표준 편차 [StDev])
Figure 112019100227040-pct00008
h-시간
2가지 상이한 방법에 의해 측정된 총 세포내 IL-2 농도 값은 동일한 샘플에 대해 평균적으로 5의 역가만큼 상이하다 (표 4 및 도 9a, 9b, 9c 및 9d). 둘 다의 방법은 시간 경과에 따른 비-조사된 세포 용해물 중의 총 세포내 IL-2의 증가를 제시하는 반면, 조사된 세포 용해물 중의 총 세포내 IL-2의 양은 시간 경과에 따라 감소한다. 배양에서의 6시간에서, 총 세포내 IL-2의 수준은 둘 다의 방법에 의해 측정된 바와 같이 조사된 및 비-조사된 세포 사이에 필적하였다. 조사된 세포에서, 이들 수준은 배양에서의 48시간 후에 감소한다.
표 4 상이한 시점에서의 조사된 vs. 비-조사된 haNK003의 1 x 10 6 세포당 총 세포내 IL-2 함량 (pg) (이중 판독에 대한 평균 및 표준 편차 [StDev])
Figure 112019100227040-pct00009
h-시간
세포 괴사 시 IL-2의 방출을 자극하기 위해, 세포를 저장성 쇼크로 처리하였다. 이 수준을 세제-기재 방법을 사용하여 제조된 세포 용해물에서 측정된 총 세포내 IL-2 농도와 비교하였다. 2가지 방법 (샌드위치 또는 멀티플렉스 ELISA)에 의해 측정된 가용화된 IL-2 농도 값은 동일한 샘플에 대해 역가 약 10만큼 상이하다 (표 5 및 도 10a 및 10b). 저장성 쇼크로부터의 용해물 중의 IL-2 농도는 181.93 - 289.54 pg/106 세포 (샌드위치 ELISA) 및 2619.15 - 3301.02 pg/106 세포 (멀티플렉스 ELISA)였으며, 이는 세제-기재 용해를 사용하여 제조된 세포 용해물에서 측정된 총 세포내 IL-2 농도의 평균적으로 14% (샌드위치 ELISA) 내지 27% (멀티플렉스 ELISA)를 나타낸다.
표 5. haNK003 세포의 1 x 10 6 세포당 가용화된 IL-2의 양 (pg) (이중 판독에 대한 평균 및 표준 편차 [StDev]).
Figure 112019100227040-pct00010
멀티플렉스 ELISA IL-2 정량화 값은 샌드위치 ELISA 방법으로부터의 데이터보다 5 내지 10배 더 높았다. 이들 2가지 방법으로부터의 절대 값에 가변성이 있지만, 경향은 둘 다의 데이터 세트 사이에 일관되며, 하기 요약되어 있다. 이 데이터는 제품이 더 개발됨에 따라 난트케이웨스트가 haNK003 세포로부터의 IL-2 분비 및 세포내 IL-2 수준을 특징화하는 것을 계속하는 것을 허용하는데 유용할 것이다.
요약하면, haNK003 세포는 배양 배지 내로 검출가능한 양의 IL-2를 방출하며 (세포 백만개당 10 내지 40 pg/시간), 안정 상태 배양 조건 하에서 살아 있는 세포에 의해 방출된 IL-2의 양은 평균적으로 총 세포내 IL-2 스톡의 10% 미만을 나타낸다.
10 Gy의 용량으로의 haNK003 세포의 조사는 48시간의 기간에 걸쳐 방출된 IL-2의 양을 증가시키며, 이는 가능하게는 죽는 세포의 존재를 반영한다. 더욱이, 조사는 시간 경과에 따라 모두 즉시, 그러나 점차적으로 IL-2의 방출을 초래하지 않는다.
괴사성 세포 사멸 시 IL-2의 방출을 자극하기 위해, haNK003 세포를 저장성 쇼크로 처리하였다. 이들 조건 하에서 방출된 IL-2의 양은 트리톤(Triton) X-100 용해물 (이는 모든 세포내 구획으로부터의 단백질을 가용화함)에서 결정된 총 세포내 IL-2의 14 내지 27%를 나타낸다.
전체적으로, haNK003 세포는 낮은 수준의 IL-2를 분비한다 (둘 다의 방법으로부터의 모든 실행에 걸쳐 평균될 경우에 6시간에 걸쳐 조사된 세포에 대해 493.8 pg/mL 및 비-조사된 세포에 대해 276.1 pg/mL). 함께 취해져, haNK003 세포에 의해 분비된 낮은 수준의 IL-2, 혈장에서의 IL-2의 극도로 짧은 반감기, 및 생체내에서 조사된 haNK003 세포의 존속의 결여는 주입된 haNK003에 의한 IL-2 방출이 임상적 유해 효과를 유발하지 않을 것임을 시사한다.
예비-제형화된 세포로의 개발 연구에서 시험된 바와 같은 시험관내 증식 능력 및 기능성에 대한 조사의 효과는 haNK003 세포가 시험관내에서 제한된 증식 (세포의 0.1% 미만)을 가지며, 세포독성 활성 및 ADCC 활성의 수준이 조사 후 적어도 6시간 동안 유지됨을 입증한다.
조사전 및 조사후 haNK003 세포의 IL-2 분비 및 세포내 IL-2 수준은 haNK003 세포가 낮은 수준의 IL-2를 분비함을 입증한다. 조사된 또는 비-조사된 haNK003 세포는 인간에서 유해 효과를 갖는 것으로 예상될 IL-2의 양을 방출하지 않는다.
실시예 4. 정맥내로 투여된 단일-용량 haNK003 세포의 내약성 및 종양발생성.
자연 살해 (NK) 세포는 암 요법에 대한 및 잠재적으로 바이러스 감염에 대한 강력한 세포독성 이펙터 세포이다. 난트케이웨스트는 GMP-등급 활성화된 NK (aNK 세포)를 생산하기 위한 고유한 NK 세포-기재 플랫폼을 성공적으로 확립하였다. aNK 세포는 다양한 진행성 혈액 악성종양 및 고형 종양을 갖는 환자의 세포 요법을 위해 임상에서 활발하게 추구되고 있다. 최근, 고-친화도 CD16 수용체를 발현하는 NK-92의 GMP-등급 플라스미드-형질감염된 변이체가 ER IL-2 유전자를 함유하는 신규한 형질감염 벡터를 이용하여 개발되었으며, 이는 생성된 haNK003 세포가 IL-2와 독립적으로 성장하는 것을 가능하게 한다. 고-친화도 CD16 수용체의 발현은 haNK003 세포가 모 NK-92 세포에 의해 살해되지 않은 표적 세포주에 대해 리툭시맙 및 트라스투주맙 및 다라투무맙과 조합으로 높은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 나타내는 것을 가능하게 한다. 임상적으로 개발중인 마스터 세포 은행, haNK003을 생성하기 위해 1개의 세포 클론을 선택하였다.
물질 및 방법
18마리의 NOD.CB17-Prkdcscid/J (NOD/SCID) 마우스 (9마리의 수컷 및 9마리의 암컷)를 사용하여 NOD/SCID 마우스에서 정맥내로 투여된 단일-용량 haNK003 세포의 내약성 및 종양발생성을 조사하였다. 마우스는 잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory) (미국 04609 메인주 메인 스트리트 바 하버 610)로부터 얻었다.
18마리의 NOD/SCID 마우스를 선택하고, 동물 체중에 기초하여 군당 6마리의 마우스 (3마리의 수컷 및 3마리의 암컷)를 갖는 3개의 군으로 무작위로 할당하였다. 마우스를 표 6에 지시된 바와 같이 PBS, 비-조사된 또는 10-Gy 조사된 haNK003 세포의 단일 용량으로 정맥내로 투여하였다. 그 후, 동물을 매일 관찰 및 매주 2회 동물 체중 측정에 의해 모니터링하였다. 5주 후, 동물을 안락사시키고, 주요 기관을 수확하고, 추가의 조직병리학적 검사 및 항-CD56 항체로의 면역조직화학 분석을 위해 프로세싱하였다.
표 6. 연구 설계
Figure 112019100227040-pct00011
세포 배양을 위해, haNK003 세포를 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 (카탈로그# IPLA-SERAB-HI, 이노베이티브 리서치(Innovative Research)), 100 U 페니실린/ml 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (코닝(Corning), 카탈로그# 30-002-CI)으로 보충된 X-비보10 배지 (카탈로그# BE02-055Q)에서 배양하였다.
조사를 위해, 지수적 성장 상으로 성장하는 haNK003 세포를 수확하고, 생존성 세포 수 및 생존력에 대해 카운팅하였다. 적절한 날에, haNK003 세포의 반을 JL 쉐퍼드 마크 1 모델(JL Shephard Mark 1 Model) 68 137Cs 조사기 (미국 92697 캘리포니아주 얼바인에 소재하는 유니버시티 오브 캘리포니아 방사선 종양학과에 의해 제공된 서비스)를 사용하여 1000 cGy의 용량으로 조사하였다.
투약을 위한 세포 제조를 위해, 비-조사된 또는 조사된 haNK003 세포를 동물 설비 (미국 90502 캘리포니아주 토란스 더블유. 칼슨 스트리트 1124)로의 수송 동안 얼음 상에서 유지하였다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후, 적절한 양의 차가운 PBS에 재-현탁시키고, 40 μm 세포 여과기를 통해 통과시켜 5 x 107 생존성 세포/ml의 최종 세포 밀도로 단일 세포 제제를 제조하였다. 세포 생존력을 바이-셀(Vi-CELL) 세포 생존력 분석기로 결정하였으며, 단지 85% 초과의 생존력을 갖는 세포만을 이 연구에 사용하였다. 그 후, 이들 비-조사된 또는 조사된 haNK003 세포를 각각 적절한 군에서의 동물을 IV 투약하기 위해 실온에서 저장하였다.
18마리의 NOD/SCID 마우스를 선택하고, 동물 체중에 기초하여 군당 6마리의 마우스 (3마리의 수컷 및 3마리의 암컷)를 갖는 3개의 군으로 무작위로 할당하였다.
적절한 날에, 군 A에서의 각각의 동물은 각각 특정량의 PBS를 받았다. 투약 부피는 개별적 동물 체중과 무관하게 200 μl였다. 투약 경로는 꼬리 정맥을 통한 IV 주사이고, 투약 스케줄은 연구 프로토콜에 지시된 바와 같이 단일 용량이었다. 적절한 날에, 군 B 및 C에서의 각각의 동물은 각각 200 μl PBS 중 1 x 107 비-조사된 및 조사된 haNK003 세포를 받았다. 투약 부피는 200 μl이고, 투약 경로는 꼬리 정맥을 통한 IV 주사이며; 투약 스케줄은 단일 용량이었다.
동물을 일반적 외관에 대해 매일 1회 관찰하였다. 임상적 관찰을 매일 2회 수행하고, 기록하였다. 동물을 정상 거동, 예컨대 이동성, 음식 및 물 소비 (육안 추정에 의해), 및 체중 (증가/감소)에 대한 효과에 대해 치료 후에 일상적으로 모니터링하였다.
평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)를 비롯한 요약 통계를 각각의 시점에서 각각의 군의 동물 체중에 대해 제공하였다. 군 간의 동물 체중 변화의 차이의 통계적 분석을 반복된 측정을 갖는 2-원 ANOVA, 이어서 본페로니 검정을 사용하여 평가하였다. 모든 데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 버전 5를 사용하여 분석하였다. p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
단일 작용제로서 정맥내로 투여된 1 x 107 세포의 용량으로의 비-조사된 또는 조사된 haNK003 세포는 각각 5.2% 및 4.4%의 최대 평균 체중 감소로 양호하게 내성화되었다. 표 7, 도 11에 지시된 바와 같이, PBS-처리된 대조군에 비해, 조사된 또는 비-조사된 haNK003 세포 (1x107)의 단일 용량으로 투여된 경우에 NOD/SCID 마우스에서 유의한 체중 감소는 없었다. 표 7에 제시된 바와 같이, 모든 처리군에서 관찰의 5-주에 걸쳐 발생한 임의의 치료 관련된 사망은 없었다.
수컷 또는 암컷 마우스와 무관하게, 모든 처리군에서 뇌, 심장, 간, 폐, 신장, 비장 및 흉선을 비롯한 평가된 모든 조직 및 기관에서 임의의 가시적인 종양 덩어리는 없었다. 조직학 분석 및 항-CD56 항체를 사용한 IHC 염색으로부터의 결과는 뇌, 골수, 심장, 간, 폐, 신장, 비장 및 흉선을 비롯한 조직 및 기관에서 임의의 haNK003 세포-관련된 림프 응집체가 없었음을 확인시켜 주었으며, 이는 비-조사된 및 조사된 haNK003 세포 둘 다가 NOD/SCID 마우스에서 종양발생 잠재성을 갖지 않음을 시사한다.
뇌, 골수, 심장, 간, 폐, 신장, 비장 및 흉선을 비롯한 연구에서 얻어진 모든 시편의 병리학적 검사는 PBS 처리된 군에 비해 비-조사된 또는 조사된 haNK003 세포-처리된 군에서 임의의 유의한 haNK003 처리 관련된 독성이 없었음을 지시하였다.
표 7. NOD/SCID 마우스에서의 동물 체중, 사망률 및 종양발생성에 대한 정맥내로 투여된 haNK003의 효과.
Figure 112019100227040-pct00012
주: aMWL: 최대 체중 감소; p-값 (반복된 측정을 갖는 2-원 ANOVA, 이어서 본페로니 검정) vs. bPBS 처리; c(n/총): 개별적 군에서의 동물의 총수당 처리 관련된 동물 사망의 수.
1 x 107 세포의 용량으로 정맥내로 투여된 단일 작용제로서의 조사된 또는 비-조사된 haNK003 세포는 수컷 및 암컷 NOD/SCID 마우스 둘 다에서 양호하게 내성화되었다. 조사된 또는 비-조사된 haNK003 처리와 연관된 유의한 체중 감소는 없었다. 모든 처리군에서 관찰의 5-주에 걸쳐 발생한 임의의 처리 관련된 사망은 없었다. 뇌, 골수, 심장, 간, 폐, 신장, 비장 및 흉선을 비롯한 주요 기관에서 임의의 유의한 병리학적 변화는 없었다. 가장 중요하게는, 수컷 및 암컷 NOD/SCID 마우스 둘 다에서 조사된 또는 비-조사된 haNK003 세포의 종양발생 잠재성은 없었다.
실시예 5. 정맥내로 투여된 반복된-용량 haNK003 세포의 내약성 및 종양발생성.
물질 및 방법
18마리의 NOD.CB17-Prkdcscid/J (NOD/SCID) 마우스 (9마리의 수컷 및 9마리의 암컷)를 사용하여 NOD/SCID 마우스에서 정맥내로 투여된 단일-용량 haNK003 세포의 내약성 및 종양발생성을 조사하였다. 마우스는 잭슨 래버러토리 (미국 04609 메인주 메인 스트리트 바 하버 610)로부터 얻었다.
18마리의 NOD/SCID 마우스를 선택하고, 동물 체중에 기초하여 군당 6마리의 마우스 (3마리의 수컷 및 3마리의 암컷)를 갖는 3개의 군으로 무작위로 할당하였다. 마우스를 표 8에 지시된 바와 같이 각각 4주 동안 매주 1회 PBS, 비-조사된 또는 10-Gy 조사된 haNK003 세포의 반복된 용량으로 정맥내로 투여하였다. 그 후, 동물을 매일 관찰 및 매주 2회 동물 체중 측정에 의해 모니터링하였다. 5주 후, 동물을 안락사시키고, 주요 기관을 수확하고, 추가의 조직병리학적 검사 및 항-CD56 항체로의 면역조직화학 (IHC) 분석을 위해 프로세싱하였다.
표 8. 연구 설계.
Figure 112019100227040-pct00013
세포 배양을 위해, haNK003 세포를 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 (카탈로그# IPLA-SERAB-HI, 이노베이티브 리서치), 100 U 페니실린/ml 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (코닝, 카탈로그# 30-002-CI)으로 보충된 X-비보10 배지 (카탈로그# BE02-055Q)에서 배양하였다.
조사를 위해, 지수적 성장 상으로 성장하는 haNK003 세포를 수확하고, 생존성 세포 수 및 생존력에 대해 카운팅하였다. 적절한 날에, haNK003 세포의 반을 JL 쉐퍼드 마크 1 모델 68 137Cs 조사기 (미국 92697 캘리포니아주 얼바인에 소재하는 유니버시티 오브 캘리포니아 방사선 종양학과에 의해 제공된 서비스)를 사용하여 1000 cGy의 용량으로 조사하였다.
투약을 위한 세포 제조를 위해, 비-조사된 또는 조사된 haNK003 세포를 동물 설비 (미국 90502 캘리포니아주 토란스 더블유. 칼슨 스트리트 1124)로의 수송 동안 얼음 상에서 유지하였다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후, 적절한 양의 차가운 PBS에 재-현탁시키고, 40 μm 세포 여과기를 통해 통과시켜 5 x 107 세포/ml의 최종 세포 밀도로 단일 세포 제제를 제조하였다. 세포 생존력을 바이-셀 세포 생존력 분석기로 결정하였으며, 단지 85% 초과의 생존력을 갖는 세포만을 이 연구에 사용하였다. 그 후, 이들 비-조사된 또는 조사된 haNK003 세포를 각각 적절한 군에서의 동물을 IV 투약하기 위해 실온에서 저장하였다.
18마리의 NOD/SCID 마우스를 선택하고, 동물 체중에 기초하여 군당 6마리의 마우스 (3마리의 수컷 및 3마리의 암컷)를 갖는 3개의 군으로 무작위로 할당하였다.
적절한 날에, 군 A에서의 각각의 동물은 개별적 동물 체중과 무관하게 200 μl의 PBS를 받았다. 투약 경로는 꼬리 정맥을 통한 IV 주사이고, 투약 스케줄은 연구 프로토콜 (부록 1)에 지시된 바와 같이 총 4주 동안 매주 1회였다. 군 B 및 C에서의 각각의 동물은 각각 200 μl PBS 중 1 x 107 비-조사된 및 조사된 haNK003 세포를 받았다. 투약 부피는 200 μl이고, 투약 경로는 꼬리 정맥을 통한 IV 주사이며, 투약 스케줄은 연구 프로토콜에 지시된 바와 같이 총 4주 동안 매주 1회였다.
동물을 일반적 외관에 대해 매일 1회 관찰하였다. 임상적 관찰을 매일 2회 수행하고, 기록하였다. 동물을 정상 거동, 예컨대 이동성, 음식 및 물 소비 (육안 추정에 의해), 및 체중 (증가/감소)에 대한 효과에 대해 치료 후에 일상적으로 모니터링하였다.
평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)를 비롯한 요약 통계를 각각의 시점에서 각각의 군의 동물 체중에 대해 제공하였다. 군 간의 동물 체중 변화의 차이의 통계적 분석을 반복된 측정을 갖는 2-원 ANOVA, 이어서 본페로니 검정을 사용하여 평가하였다. 모든 데이터를 그래프패드 프리즘 소프트웨어 버전 5를 사용하여 분석하였다. p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
단일 작용제로서 정맥내로 4주 동안 매주 1회 투여된 비-조사된 또는 조사된 haNK003 세포는 각각 3.4% 및 4.9%의 최대 평균 체중 감소로 양호하게 내성화되었다. 표 9, 도 12에 지시된 바와 같이, PBS-처리된 대조군에 비해, 비-조사된 또는 조사된 haNK003 세포 (1x107)로 투여된 경우에 NOD/SCID 마우스에서 유의한 체중 감소는 없었다. 표 9에 요약된 바와 같이, 모든 처리군에서 관찰의 5-주에 걸쳐 발생한 임의의 치료 관련된 사망은 없었다.
표 9. NOD/SCID 마우스에서의 동물 체중, 사망률 및 종양발생성에 대한 haNK003 세포의 효과.
Figure 112019100227040-pct00014
주: aMWL: 최대 체중 감소; p-값 (반복된 측정을 갖는 2-원 ANOVA, 이어서 본페로니 검정) vs. bPBS 처리; c(n/총): 개별적 군에서의 동물의 총수당 처리 관련된 동물 사망의 수.
뇌, 골수, 심장, 간, 폐, 신장, 비장 및 흉선을 비롯한 이 연구에서 얻어진 모든 시편의 거시병리학 및 조직병리학 검사는 PBS-처리된 대조군에 비해 비조사된 또는 조사된 haNK003 세포 처리된 군에서 이들 기관에서 임의의 유의한 haNK003 처리 관련된 독성이 없었음을 지시하였다. 모든 동물에서 확인된 비장비대증은 없었다. 모든 처리군에서 육안 발견에 의해 발견된 종양 덩어리는 없었다. 항-CD56 항체를 사용한 IHC로부터의 결과는 5-주의 추적기간에 걸친 골수, 뇌, 간, 폐, 심장, 신장, 비장, 흉선 등을 비롯한 조직 및 기관에서 임의의 haNK003 세포-관련된 림프 응집체가 없었음을 확인시켜 주었으며, 이는 이들 5주에 걸쳐 NOD/SCID 마우스에서 조사된 또는 비-조사된 haNK003 세포 관련된 백혈병 또는 종양 발달이 없었음을 시사한다.
모든 이들 조직에서 존재하는 부종, 퇴행, 및 괴사가 없었다. PBS 대조군에 비해, 간 조직에서 매우 초점성 경도 및 최소 지방 변화가 각각 비-조사된 및 조사된 haNK003 처리군에서 주목되었다. 또한, PBS, 비-조사된 또는 조사된 haNK003 처리군에서 간 실질은 호중구 및 단핵 세포를 비롯한 혼합된 염증성 세포의 드문 미세한 초점을 제시하였는데, 이는 이들 작은 클러스터 세포가 CD56 음성이었기 때문이며, 이는 이들 혼합된 염증성 세포가 매우 가능하게는 haNK003 처리와 관련되지 않고, 반복된 절차 (꼬리 정맥 주사)로부터 초래되었음을 시사한다.
요약하면, 비-조사된 및 조사된 HaNK003 세포는 양호하게 내성화되었다. 이 투약 레지멘에서 NOD/SCID 마우스에서 임의의 유의한 haNK003 처리 관련된 독성 또는 종양발생성 문제는 없었다.
실시예 6. aNK 및 haNK003 자연 세포독성 활성의 비교
자연 살해 (NK) 세포가 표적 세포를 살해하는 주요한 메카니즘은 세포 연접의 형성 및 후속의 퍼포린 및 그란자임의 분비를 통해서이다. 이는 따라서 형질막의 분해 및 세포 사멸을 초래하는 표적 세포 내의 세포자멸사 프로세스를 유도한다. 표적 세포는 바이러스 감염된 세포 및/또는 형질전환된 세포에 특징적인 스트레스 항원의 발현에 의해 인식될 수 있다. NK 세포 상의 활성화 수용체와의 스트레스 항원의 결속을 통한 표적 세포의 인식 및 후속의 살해는 자연 (또는 직접) 세포독성으로 용어화된다.
자연 세포독성은 NK 세포의 주요한 기능적 특징이기 때문에, 세포 변이체에서 이 기능성의 분석 및 활성화된 NK-92 세포 (aNK) 활성과의 비교는 aNK 세포의 특정 유전적 변형의 영향을 확립하는 것을 도울 수 있다.
물질 및 방법
액상 및 고형 종양의 대표적인 6종의 세포주를 표적으로서 선택하였다. 표적은 또한 aNK 세포 살해의 다양한 민감도를 나타내도록 선택되었으며, SR-91은 살해에 대해 상대적으로 불감성이고, K562는 살해에 대해 매우 민감성이며, 다른 것들은 그 사이의 어딘가에 해당한다. 표적 및 이펙터 세포 (haNK003 또는 aNK)를 37℃에서 4시간 동안 공동-인큐베이션하고, 표적 세포 살해를 인-하우스 개발된 방법을 사용한 유동 세포측정에 의해 결정하여 PKH67 형광 염료 염색으로 로딩된 표적 세포에 대한 이펙터 세포의 비세포독성을 결정하였다. PKH67 형광 세포 링커 키트는 등록상표 막 표지화 기술 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 사용하여 세포막의 지질 영역 내로 긴 지방족 꼬리를 갖는 녹색 형광 염료 (PKH67)를 안정하게 혼입시킨다. 그의 보다 긴 지방족 탄소 꼬리로 인해, PKH67은 감소된 세포-세포 전달을 나타낸다. PKH67은 생존력 프로브로서 아이오드화프로피듐을 사용하는 세포독성 검정에 매우 적합하다. 아이오드화프로피듐으로의 염색은 죽은 표적 세포 (이중으로 염색될 것임)를 죽은 이펙터 세포 (aNK 또는 haNK 세포)로부터 구별한다.
세포 배양을 위해, aNK 세포를 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 (CMV-음성 시험된 공여자로부터) 및 500 IU/ml 재조합 인간 IL-2로 보충된 X-비보 10 배지에서 배양하였다. aNK 배양물을 세포 밀도 >10e5 세포/mL 및 <10e6 세포/mL를 유지하기 위해 1-4일마다 계대하였다. haNK003 세포를 IL-2 없이, 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 (CMV-음성 시험된 공여자로부터)으로 보충된 X-비보 10 배지에서 배양하였다. haNK003 배양물을 세포 밀도 >10e5 세포/mL 및 <10e6 세포/mL를 유지하기 위해 1-4일마다 계대하였다. K562, Daudi, DOHH2, HL-60, SR-91, 및 SKOV3 세포를 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청 (FBS) 및 항생제/항진균제의 칵테일로 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다. 현탁액에서 성장하는 세포를 단순 희석에 의해 계대한 반면, 부착성 세포 (SKOV3)는 트립(Tryp)LE™를 사용하여 배양의 트립신화에 의해 계대하였다. 계대를 2-5일마다 (세포주의 특정 배가 시간에 따라), 또는 배양 배지가 소모된 배지를 지시하는 황색 (산성)을 나타내었을 때마다 계대하였다.
샘플 제조를 위해, 현탁액-성장 세포주를 세포 배양물의 위아래 피펫팅에 의해 재현탁시켰다. 부착성 표적 세포주 (SKOV3)를 트립LE™를 사용하여 배양 용기로부터 효소적으로 분리하고, 트립신화된 세포 펠릿의 위아래 피펫팅에 의해 재현탁시켰다. 세포 생존력을 수동 카운팅 (트리판 블루 배제 방법)에 의해 결정하였다. 요구된 세포 농도로의 표적 및 이펙터 세포의 희석을 10% 열-불활성화된 FBS 및 항생제/항진균제로 보충된 RPMI-1640에서 수행하였다. 이펙터 및 표적 세포를 96-웰 플레이트에서 상이한 이펙터 대 표적 (20:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1, 0.62:1, 0.31:1, 및 0.15:1의 E:T) 비로 혼합하고, 5% CO2 분위기 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 공동-인큐베이션하였다.
샘플을 B1 (FITC) 및 B3 (PerCP-Vio700/PI) 형광 채널을 사용하여 막스콴트(MACSQuant) 유동 세포측정기 (밀테니(Miltenyi)) 상에서 분석하였다. 표적 단독 - PI 및 +PI를 사용하여 B1/B3 보상 파라미터를 결정하였다.
세포독성 %를 식 = [(샘플에서의 %FITC+/PI+ 세포) - (표적에서의 %FITC+/PI+ +PI 단독)] / [100 - (표적에서의 %FITC+/PI+ + PI 단독)]에 의해 계산하였다.
결과
이 연구에 사용된 aNK 및 haNK003 세포를 2016년 7월 22일에 해동시켰다. 이 연구에 사용된 모든 표적 세포 배양물은 8주령 미만이었다. 표적 세포 및 이펙터 세포 배양물을 검정 전에 많아야 48시간 계대하였다.
도 13-18에 제시된 결과는 aNK에 의한 살해에 대한 표적 세포주의 민감도를 확인시켜 주며, K562가 가장 민감하다 (1:1의 낮은 이펙터 대 표적 비에서 75% 비용해). Daudi, DOHH2 및 HL-60은 65 내지 80% 비용해를 달성하는 보다 높은 이펙터 대 표적 비 (10:1)를 요구하는 중간 민감도를 입증하였다. SKOV3 및 SR-91은 대략 40%의 비용해를 달성하는 10:1 초과의 이펙터 대 표적 비를 요구하는 가장 저항성이었다. 각각의 경우, haNK003의 자연 세포독성 활성은 aNK의 그것과 필적하였으며, 일반적으로 실험의 오차 범위 내에서 동일한 활성 프로파일을 따랐다.
aNK 및 haNK003 세포는 시험된 6가지 암 세포주에 대해 필적하는 세포독성 활성을 제시하며, 이는 aNK 세포의 자연 세포독성 활성이 haNK003 세포를 생성하는데 사용된 유전적 변형에도 불구하고 본질적으로 동일함을 입증한다. haNK003 세포 및 aNK 세포는 자연 세포독성 활성에 관한 기능성에 있어서 필적한다.
실시예 7. MDA-MB-453 인간 유방 암종 피하 마우스 모델에서의 haNK003의 항-종양 활성의 평가.
이 연구에서, 단일 작용제로서의 haNK003 세포의 항-종양 활성을 암컷 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid 감마, NSG) 마우스에서의 MDA-MB-453 인간 유방 암종 피하 이종이식 모델에서 평가하였다.
물질 및 방법
열두 마리의 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid 감마, NSG) 마우스를 사용하여 MDA-MB-453 인간 유방 암종 피하 (s.c.) 이종이식 모델에서의 haNK003의 항-종양 활성을 평가하였다. 마우스는 잭슨 래버러토리 (미국 04609 메인주 메인 스트리트 바 하버 610)로부터 얻었다.
MDA-MB-453 HER2- 양성 인간 유방 암종 s.c. 이종이식 모델을 암컷 NSG 마우스에서 확립하였다. 종양의 평균 크기가 약 100 mm3에 도달하면, 처리를 개시하고, 단일 작용제로서의 haNK003 세포의 항-종양 활성을 이 이종이식 모델에서 평가하였다. 다른 시험 물품을 프로토콜 LABC-X01612 하에서 평행하게 평가하였지만, 단지 PBS와 비교하여 haNK003의 결과만을 본원에 제시한다. haNK003 처리군 및 투약 레지멘 설계를 표 10에 기재한다.
표 10. 연구 설계.
Figure 112019100227040-pct00015
종양 세포 배양을 위해, MDA-MB-453 인간 유방 암종 세포 (ATCC, 카탈로그# HTB-131)를 10% 열-불활성화된 FBS (진텍스(GeneTex), 카탈로그# GTX73252), 100 U 페니실린/ml 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (코닝, 카탈로그# 30-002-CI)으로 보충된 ATCC-제형화된 라이보비츠 L-15 배지 (ATCC, 카탈로그# 30-2008)에서 배양하였다.
종양 세포 주사를 위해, 각각의 동물을 칭량한 후, 25-게이지 바늘로 50% 마트리겔(Matrigel) (코닝, 카탈로그# 354234) 중 mL당 1.0 x 108 MDA-MB-453 인간 유방암 세포 0.1 ml로 좌측 및 우측 옆구리 영역에 피하로 주사하였다. 세포 생존력을 바이-셀 세포 생존력 분석기로 결정하였으며, 단지 95% 초과의 생존력을 갖는 세포만을 이 생체내 연구에 사용하였다.
haNK003 세포 배양을 위해, haNK003 세포를 5% 열 불활성화된 인간 AB 혈청 (이노베이티브 리서치, 카탈로그# IPLA-SERAB-HI), 100 U 페니실린/ml 및 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 X-비보10 배지 (론자(Lonza), 카탈로그# BE02-055Q)에서 배양하였다.
조사를 위해, 지수적 성장 상으로 성장하는 haNK003 세포를 수확하고, 생존성 세포 수 및 생존력에 대해 카운팅하였다. 적절한 날에, haNK003 세포를 JL 쉐퍼드 마크 1 모델 68 137Cs 조사기 (미국 92697 캘리포니아주 얼바인에 소재하는 유니버시티 오브 캘리포니아 방사선 종양학과에 의해 제공된 서비스)를 사용하여 1000 cGy의 용량으로 조사하였다.
투약을 위한 세포 제조를 위해, 조사된 haNK003 세포를 동물 설비 (미국 90502 캘리포니아주 토란스 더블유. 칼슨 스트리트 1124)로의 수송 동안 얼음 상에서 유지하였다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후, 적절한 양의 PBS에 재-현탁시키고, 40 μm 세포 여과기 (코닝, 카탈로그#431750)를 통해 통과시켜 각각 1.25 x 107 또는 5 x 107 세포/ml의 최종 세포 밀도를 갖는 단일 세포 제제를 제조하였다. 그 후, 이들 조사된 haNK003 세포를 각각 적절한 군에서의 동물에 대한 IV 투약을 위해 실온에서 저장하였다.
12마리의 NSG 마우스를 선택하고, 적절한 종양 크기에 기초하여 군당 4마리의 마우스를 갖는 3개의 연구군으로 무작위로 할당하였다. 무작위화는 각각의 동물에 대한 총 종양 부피 및 동물 체중에 기초하였다. 이 효능 연구를 위해, 종양의 평균 크기가 약 100 mm3에 도달되면, 무작위화를 수행하고, 처리를 개시하였다.
투약 부피는 개별적 동물 체중과 무관하게 200 μl였다. 투약 경로는 꼬리 정맥을 통한 IV 주사이고, 투약 스케줄은 연구 프로토콜에 지시된 바와 같이 총 4주 동안 매주 2회였다. 적절한 날에, 군 F 및 G에서의 각각의 동물은 각각 200 μl PBS 중 2.5 x 106 및 1 x 107 조사된 haNK003 세포를 받았다. 투약 부피는 200 μl이고, 투약 경로는 꼬리 정맥을 통한 IV 주사이며, 투약 스케줄은 총 4주 동안 매주 2회였다.
동물을 일반적 외관에 대해 매일 1회 관찰하였다. 임상적 관찰을 매일 2회 수행하고, 기록하였다. 동물을 정상 거동, 예컨대 이동성, 음식 및 물 소비 (육안 추정에 의해), 및 체중 (증가/감소)에 대한 효과에 대해 처리 후에 일상적으로 모니터링하였다.
종양 크기를 제1 투약 전에 디지털 핸드 헬드 캘리퍼스를 사용하여 3차원으로 매주 2회 (종양이 나타나면), 그 후 안락사 전에 매주 2회 측정하였다. 주요 종점은 종양 성장의 억제 및 감소였다. 종양 부피를 식: V = 0.5xLxWxH (여기서 L, W 및 H는 각각 종양의 길이, 폭 및 높이임)를 사용하여 mm3으로 표현하였다. 그 후, 종양 부피를 T/C 값의 계산에 사용하였다. T/C (%) = ΔT/ΔC x 100 (여기서 ΔT 및 ΔC는 각각 처리군 및 대조군에 대한 관찰일 및 측정의 제1일 사이의 평균 종양 부피의 변화임).
평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)를 비롯한 요약 통계를 각각의 시점에서 각각의 군의 종양 부피 또는 동물 체중에 대해 제공하였다. 군 간의 종양 부피 또는 동물 체중 변화의 차이의 통계적 분석을 반복된 측정을 갖는 2-원 ANOVA, 이어서 본페로니 검정을 사용하여 평가하였다. 모든 데이터를 그래프패드 프리즘 소프트웨어 버전 5를 사용하여 분석하였다. p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
암컷 NSG 마우스에서의 s.c.MDA-MB-453 HER2- 양성 인간 유방 암종 이종이식에서의 단일 작용제로서의 haNK003의 항종양 활성에 대한 데이터가 제시된다. 결과의 요약을 표 11에 표로 작성한다. 4주 동안 매주 2회 2.5 x 106 또는 1.0 x 107 세포의 용량으로 단일 작용제로서 정맥내로 투여된 haNK003 세포는 표 11, 도 19에 제시된 바와 같이, 각각 17.4% 및 1.3%의 T/C 값 (PBS 군에 비해 p = 0.043 및 p = 0.006)으로 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 2.5 x 106 또는 1.0 x 107 세포의 용량으로의 HaNK003은 표 11, 도 20에 지시된 바와 같이, 각각 0.6% 및 5.6%의 최대 평균 체중 감소 (PBS 군에 비해 p = 0.203 및 p = 0.085)로 양호하게 내성화되었다. 표 11에 요약된 바와 같이, 이 연구에서 발생한 임의의 haNK003 처리 관련된 사망은 없었다.
표 11. 암컷 NSG 마우스에서의 MDA-MB-453 인간 유방 암종 s.c. 이종이식 모델에서의 haNK003 세포의 항-종양 활성.
Figure 112019100227040-pct00016
주: a T/C (%)는 식: T/C (%) = ΔT/ΔC x 100 (여기서 ΔT 및 ΔC는 각각 처리군 및 대조군에 대한 제26일 및 측정의 제1일 사이의 평균 종양 부피의 변화임)을 사용하여 계산하였다. b MWL: 최대 동물 체중 감소. c P-값 (반복된 측정을 갖는 2-원 ANOVA, 이어서 본페로니 검정) vs. bPBS 처리.
2.5 x 106 또는 1.0 x 107 세포의 용량으로 단일 작용제로서의 조사된 haNK003 세포는 암컷 NSG에서 MDA-MB-453 HER2- 양성 인간 유방 암종 이종이식 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 둘 다의 용량에서의 조사된 haNK003 세포는 양호하게 내성화되었다. 발생한 임의의 haNK003 처리 관련된 사망은 없었다.
실시예 8. 저산소증과 연관된 유전자의 발현은 haNK 세포에서 감소되지 않는다.
자연 살해 (NK) 세포 용해 활성은 시험관내에서 저산소 환경 (1% O2)에서 억제되며, NKG2D, 퍼포린 및 그란자임의 하향조절과 연관된다. 정상 공여자로부터의 저산소증 (1% O2)에 대한 NK 민감도에 따라 일부 가변성이 있다. 그러나, NK 세포 용해 활성은 시험관내에서 외인성 IL-2 활성화에 의해 부분적으로 구조될 수 있다 (16시간, 1000 IU/ml). 또한, NK 세포는 1% 산소 조건 하에서 ADCC 능력을 보유한다.
저산소 조건이 haNK 세포에서 유전자 발현을 변경시키는지 여부를 결정하기 위해, RNA 발현을 20% 또는 0% O2에 5시간 동안 노출된 3가지 정상 공여자 NK 세포 집단 및 haNK 세포에서 결정하였다. 3가지 환자 공여자 NK 세포 집단 (950, 962, 996)을 2가지 조건, 즉, 0% 산소 및 20% 산소 하에서 haNK 세포와 비교하였다. 쌍별 샘플 클러스터링은 공여자 NK 세포로부터 haNK를 분리하는 별개의 클러스터를 밝혀낸다 (도 21 참조). 1개의 환자 샘플은 저산소 또는 전-저산소 조건 하에서 발현의 변화를 거의 갖지 않는 것으로 나타난다. 구체적으로, 20% 산소 조건 하에서의 962에서의 발현은 996 0% 산소 및 962 0% 산소 조건과 매우 유사하게 보인다. 도 21을 참조한다. 샘플에 걸쳐 가장 큰 가변성을 나타내는 유전자를 도 22에 제시된다. 20% 산소 조건 및 0% 산소 조건 사이에 가장 큰 변화를 나타내는 유전자를 도 23에 제시된다. 20% 산소 조건 및 0% 산소 조건 사이에 haNK 세포에서의 발현의 변화를 제시하지 않는 저산소증과 연관된 유전자를 도 24에 제시된다. 저산소증과 연관된 이들 동일한 유전자는 비록 950 샘플에 대해서는 덜 그럴지라도, 950, 962, 및 996 샘플에서는 감소된 발현을 갖는 것으로 제시된다. 도 24를 참조한다.
실시예 9. CD16 발현은 hank003 세포에서 보다 안정하다.
항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 동안 표적 세포의 일련의 살해에 의한 우수한 세포독성을 부여하기 위해 CD16의 안정한 발현을 갖는 것이 바람직하다. HaNK-003 (ER-IL-2를 가짐)은 말초 혈액 NK 세포 (공여자 NK 세포)에 비해 PMA (포르볼-12-미리스테이트 13-아세테이트)로의 활성화 후 또는 K562 표적 세포로의 자극 시 높은 수준으로 CD16을 발현한다. 또한, hank003 세포에서의 CD16 수준은 ADCC 후, CD16 수준을 유동 세포측정에 의해 측정함으로써 ADCC 동안 및 후에 상당하게 영향을 받지 않았다.
NK 세포에서의 PMA/이노마이신 활성화는 CD16-특이적 프로테아제의 활성화 및 CD16의 절단을 초래하며, 이는 NK 세포에서 CD16 발현 수준의 하향조절을 초래하는 것으로 공지되어 있다. PMA/이노마이신의 효과를 결정하기 위해, haNK003 세포 및 공여자 NK 세포 둘 다를 40 nM PMA 및 669 nM 이노마이신과 1시간 동안 접촉시킨 후, CD16 발현 수준에 대해 확인하였다. PMA/이노마이신 처리는 공여자 NK 세포에서 CD16 발현의 94.36%± 3.00 하향조절을 초래한 반면, haNK003 세포에서, 처리는 단지 30%± 0.04 하향-조절, 즉, 공여자 NK 세포에서보다 3배 더 적은 CD16 하향 조절을 초래하였다 (도 25).
NK 세포와 K562 세포를 공동-배양하는 것은 NK 세포에서 CD16 표면 발현의 쉐딩을 초래하는 CD16 절단 프로테아제를 자극하는 것으로 또한 공지되어 있다. 따라서, 공여자 NK 세포 및 haNK003 세포 둘 다를 K562 세포와 함께 배양한 후, 공동-배양의 4시간 후에 CD16 발현에 대해 측정하였다. haNK003 세포와 K562 (이펙터 : 표적=1:1)의 정상 공동-배양 조건은 4시간 내에 표적 세포의 완전한 세포독성 살해를 초래한다. CD16 발현을 haNK003 세포 및 공여자 NK 세포에서의 CD16 발현의 회복을 허용하는 추가의 24시간 후에 다시 측정하여 haNK003 세포 및 공여자 NK 세포에서의 CD16 회수의 백분율을 결정하였다. CD16 발현 수준은 공동-배양의 4시간 후에 공여자 NK 세포에서 60.25%± 09만큼 하향 조절된 것으로 관찰되었다. 그러나, hank003 세포에서는 CD16 발현은 단지 4.9%± 2.57만큼 하향 조절되었다. 24시간 후, 공여자 NK 세포에서의 CD16의 하향조절은 57.54% ± 26.82인 반면, haNK003 세포에서는 이는 단지 2.78%±3.5, 즉, 원래 CD16 수준에 가까웠다 (도 26).
haNK003 세포에서의 CD16 발현 수준을 또한 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 후에 측정하였다. ADCC를 haNK003 세포를 리툭시맙 (CD20-지정된 세포용해성 모노클로날 항체)의 존재 하에서 DOHH-2 (CD20+ 인간 림프종 B-세포주)와 함께 인큐베이션함으로써 수행한 후, CD16 발현을 측정하였다. ADCC 후, CD16 발현은 haNK003 세포에서 10% 미만만큼 하향 조절되었다 (도 27a 및 27b). 심지어 ADCC 후에도 높은 수준의 CD16의 존재는 haNK003 세포에서의 CD16 발현이 매우 안정함을 지시하였다.
SEQUENCE LISTING <110> NantKwest, Inc. <120> Modified NK-92 haNK003 Cells for the Clinic <130> 099083-1043035-6000US <150> 62/468,890 <151> 2017-03-08 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5491 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 1 tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 60 gacgtcgacg gatcgggaga tctcccgatc ccctatggtg cactctcagt acaatctgct 120 ctgatgccgc atagttaagc cagtatctgc tccctgcttg tgtgttggag gtcgctgagt 180 agtgcgcgag caaaatttaa gctacaacaa ggcaaggctt gaccgacaat tgcatgaaga 240 atctgcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgggatcc gctgaccaaa agagcaccaa 300 aggcgccctg accttcagcc cctacctgcg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac 360 atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag 420 aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga 480 gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg 540 gtttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac 600 gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccacctgg ctgcagtacg tgattcttga 660 tcccgagctt cgggttggaa gtgggtggga gagttcgagg ccttgcgctt aaggagcccc 720 ttcgcctcgt gcttgagttg aggcctggcc tgggcgctgg ggccgccgcg tgcgaatctg 780 gtggcacctt cgcgcctgtc tcgctgcttt cgataagtct ctagccattt aaaatttttg 840 atgacctgct gcgacgcttt ttttctggca agatagtctt gtaaatgcgg gccaagatct 900 gcacactggt atttcggttt ttggggccgc gggcggcgac ggggcccgtg cgtcccagcg 960 cacatgttcg gcgaggcggg gcctgcgagc gcggccaccg agaatcggac gggggtagtc 1020 tcaagctggc cggcctgctc tggtgcctgg cctcgcgccg ccgtgtatcg ccccgccctg 1080 ggcggcaagg ctggcccggt cggcaccagt tgcgtgagcg gaaagatggc cgcttcccgg 1140 ccctgctgca gggagctcaa aatggaggac gcggcgctcg ggagagcggg cgggtgagtc 1200 acccacacaa aggaaaaggg cctttccgtc ctcagccgtc gcttcatgtg actccacgga 1260 gtaccgggcg ccgtccaggc acctcgatta gttctcgagc ttttggagta cgtcgtcttt 1320 aggttggggg gaggggtttt atgcgatgga gtttccccac actgagtggg tggagactga 1380 agttaggcca gcttggcact tgatgtaatt ctccttggaa tttgcccttt ttgagtttgg 1440 atcttggttc attctcaagc ctcagacagt ggttcaaagt ttttttcttc catttcaggt 1500 gtcgtgataa tacgactcac tatagggaga cccaagctgg aattcgccac catgtggcag 1560 ctgctgctgc ctacagctct cctgctgctg gtgtccgccg gcatgagaac cgaggatctg 1620 cctaaggccg tggtgttcct ggaaccccag tggtacagag tgctggaaaa ggacagcgtg 1680 accctgaagt gccagggcgc ctacagcccc gaggacaata gcacccagtg gttccacaac 1740 gagagcctga tcagcagcca ggccagcagc tacttcatcg acgccgccac cgtggacgac 1800 agcggcgagt atagatgcca gaccaacctg agcaccctga gcgaccccgt gcagctggaa 1860 gtgcacatcg gatggctgct gctgcaggcc cccagatggg tgttcaaaga agaggacccc 1920 atccacctga gatgccactc ttggaagaac accgccctgc acaaagtgac ctacctgcag 1980 aacggcaagg gcagaaagta cttccaccac aacagcgact tctacatccc caaggccacc 2040 ctgaaggact ccggctccta cttctgcaga ggcctcgtgg gcagcaagaa cgtgtccagc 2100 gagacagtga acatcaccat cacccagggc ctggccgtgt ctaccatcag cagctttttc 2160 ccacccggct accaggtgtc cttctgcctc gtgatggtgc tgctgttcgc cgtggacacc 2220 ggcctgtact tcagcgtgaa aacaaacatc agaagcagca cccgggactg gaaggaccac 2280 aagttcaagt ggcggaagga cccccaggac aagtgaaatt ccgcccctct cccccccccc 2340 cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg 2400 cgtttgtcta tatgttattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga 2460 aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa 2520 tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa 2580 caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct 2640 gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg 2700 ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg 2760 ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg cctcggtgca 2820 catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg 2880 acgtggtttt cctttgaaaa acacgataac cgccaccatg taccggatgc agctgctgag 2940 ctgtatcgcc ctgtctctgg ccctcgtgac caacagcgcc cctaccagca gcagcaccaa 3000 gaaaacccag ctgcagctgg aacatctgct gctggacctg cagatgatcc tgaacggcat 3060 caacaactac aagaacccca agctgacccg gatgctgacc ttcaagttct acatgcccaa 3120 gaaggccacc gaactgaaac atctgcagtg cctggaagag gaactgaagc ccctggaaga 3180 agtgctgaac ctggcccaga gcaagaactt ccacctgagg cccagggacc tgatcagcaa 3240 catcaacgtg atcgtgctgg aactgaaagg cagcgagaca accttcatgt gcgagtacgc 3300 cgacgagaca gctaccatcg tggaatttct gaaccggtgg atcaccttct gccagagcat 3360 catcagcacc ctgaccggct ccgagaagga cgagctgtga gcggccgccc gctgatcagc 3420 ctcgaacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt 3480 ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc 3540 caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 3600 ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 3660 gtatcttatc atgtctgtgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg 3720 ggctctaggg ggtatccccg gatcctgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 3780 aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 3840 tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 3900 ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 3960 cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 4020 ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 4080 ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 4140 gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 4200 agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg 4260 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 4320 aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 4380 aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 4440 ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 4500 aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 4560 ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 4620 agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 4680 cagtgctgca atgataccgc gagaaccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 4740 ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 4800 gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 4860 cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 4920 cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 4980 ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 5040 catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 5100 tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 5160 ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 5220 catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 5280 cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 5340 cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 5400 acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 5460 ttattgtctc atgagcggat acatatttga a 5491 <210> 2 <211> 1872 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 gaattcgcca ccatgtggca gctgctgctg cctacagctc tcctgctgct ggtgtccgcc 60 ggcatgagaa ccgaggatct gcctaaggcc gtggtgttcc tggaacccca gtggtacaga 120 gtgctggaaa aggacagcgt gaccctgaag tgccagggcg cctacagccc cgaggacaat 180 agcacccagt ggttccacaa cgagagcctg atcagcagcc aggccagcag ctacttcatc 240 gacgccgcca ccgtggacga cagcggcgag tatagatgcc agaccaacct gagcaccctg 300 agcgaccccg tgcagctgga agtgcacatc ggatggctgc tgctgcaggc ccccagatgg 360 gtgttcaaag aagaggaccc catccacctg agatgccact cttggaagaa caccgccctg 420 cacaaagtga cctacctgca gaacggcaag ggcagaaagt acttccacca caacagcgac 480 ttctacatcc ccaaggccac cctgaaggac tccggctcct acttctgcag aggcctcgtg 540 ggcagcaaga acgtgtccag cgagacagtg aacatcacca tcacccaggg cctggccgtg 600 tctaccatca gcagcttttt cccacccggc taccaggtgt ccttctgcct cgtgatggtg 660 ctgctgttcg ccgtggacac cggcctgtac ttcagcgtga aaacaaacat cagaagcagc 720 acccgggact ggaaggacca caagttcaag tggcggaagg acccccagga caagtgaaat 780 tccgcccctc tccccccccc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 840 gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 900 ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 960 tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 1020 tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 1080 cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 1140 cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 1200 cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 1260 ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 1320 taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgataa ccgccaccat 1380 gtaccggatg cagctgctga gctgtatcgc cctgtctctg gccctcgtga ccaacagcgc 1440 ccctaccagc agcagcacca agaaaaccca gctgcagctg gaacatctgc tgctggacct 1500 gcagatgatc ctgaacggca tcaacaacta caagaacccc aagctgaccc ggatgctgac 1560 cttcaagttc tacatgccca agaaggccac cgaactgaaa catctgcagt gcctggaaga 1620 ggaactgaag cccctggaag aagtgctgaa cctggcccag agcaagaact tccacctgag 1680 gcccagggac ctgatcagca acatcaacgt gatcgtgctg gaactgaaag gcagcgagac 1740 aaccttcatg tgcgagtacg ccgacgagac agctaccatc gtggaatttc tgaaccggtg 1800 gatcaccttc tgccagagca tcatcagcac cctgaccggc tccgagaagg acgagctgtg 1860 agcggccgcc cg 1872 <210> 3 <211> 765 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 3 atgtggcagc tgctgctgcc tacagctctc ctgctgctgg tgtccgccgg catgagaacc 60 gaggatctgc ctaaggccgt ggtgttcctg gaaccccagt ggtacagagt gctggaaaag 120 gacagcgtga ccctgaagtg ccagggcgcc tacagccccg aggacaatag cacccagtgg 180 ttccacaacg agagcctgat cagcagccag gccagcagct acttcatcga cgccgccacc 240 gtggacgaca gcggcgagta tagatgccag accaacctga gcaccctgag cgaccccgtg 300 cagctggaag tgcacatcgg atggctgctg ctgcaggccc ccagatgggt gttcaaagaa 360 gaggacccca tccacctgag atgccactct tggaagaaca ccgccctgca caaagtgacc 420 tacctgcaga acggcaaggg cagaaagtac ttccaccaca acagcgactt ctacatcccc 480 aaggccaccc tgaaggactc cggctcctac ttctgcagag gcctcgtggg cagcaagaac 540 gtgtccagcg agacagtgaa catcaccatc acccagggcc tggccgtgtc taccatcagc 600 agctttttcc cacccggcta ccaggtgtcc ttctgcctcg tgatggtgct gctgttcgcc 660 gtggacaccg gcctgtactt cagcgtgaaa acaaacatca gaagcagcac ccgggactgg 720 aaggaccaca agttcaagtg gcggaaggac ccccaggaca agtga 765 <210> 4 <211> 254 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 4 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 5 <211> 483 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 5 atgtaccgga tgcagctgct gagctgtatc gccctgtctc tggccctcgt gaccaacagc 60 gcccctacca gcagcagcac caagaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggac 120 ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 180 accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 240 gaggaactga agcccctgga agaagtgctg aacctggccc agagcaagaa cttccacctg 300 aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa aggcagcgag 360 acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 420 tggatcacct tctgccagag catcatcagc accctgaccg gctccgagaa ggacgagctg 480 tga 483 <210> 6 <211> 160 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 6 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu 145 150 155 160

Claims (15)

  1. 서열식별번호: 3으로 이루어지는 CD16 및 서열식별번호: 5로 이루어지는 IL-2 둘 다를 포함하는 이종 핵산 분자를 포함하는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 갖는 변형된 NK-92 세포의 집단이며, 여기서 세포의 집단 중 세포의 90% 초과가 CD56, CD16, CD54, 및 NKp30을 발현하고, 세포의 집단 중 세포의 5% 미만이 CD3을 발현하고, 세포가 염색체 17 상에 서열식별번호: 1을 포함하는 것인 변형된 NK-92 세포의 집단.
  2. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 DNA 분자인 변형된 NK-92 세포의 집단.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포의 평균 배가 시간이 55 내지 70시간인 변형된 NK-92 세포의 집단.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 또는 25일로부터 평균 배가 시간을 유지하는 변형된 NK-92 세포의 집단.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1, 2, 3, 또는 4일마다 계대될 수 있는 변형된 NK-92 세포의 집단.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 세포 백만개당 10 내지 60 pg/시간의 농도로 IL-2를 분비하는 것인 변형된 NK-92 세포의 집단.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 조사된 세포인 변형된 NK-92 세포의 집단.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 대조군에 비해 CD16의 발현의 감소된 하향조절을 갖는 것인 변형된 NK-92 세포의 집단.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 대조군에 비해 ADCC 후에 CD16의 보다 높은 수준을 유지하는 것인 변형된 NK-92 세포의 집단.
  10. 제1항 또는 제2항의 변형된 NK-92 세포의 집단을 포함하는 키트.
  11. 제10항에 있어서, 항체를 추가로 포함하는 키트.
  12. 제1항 또는 제2항의 변형된 NK-92 세포의 집단 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 대상체에서 암을 치료하기 위해 사용되는 제약 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
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