BR112020021826A2

BR112020021826A2 - mitocôndrias modificadas e uso das mesmas

Info

Publication number: BR112020021826A2
Application number: BR112020021826-0A
Authority: BR
Inventors: Kyuboem Han; Chun-Hyung Kim; Yu Jin KIM; Shin-Hye Yu; Nayoung Kim; Mi Jin Kim; Yong-soo Choi; Seo Eun Lee
Original assignee: Paean Biotechnology Inc.
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2021-02-23
Also published as: JP2023099118A; EP3786177A1; EP3786177A4; SG11202009787VA; US20210238249A1; CA3097108A1; KR102533834B1; KR20200077476A; KR20230074076A; JP2021521819A; WO2019209051A1; KR102126199B1; CN112020553A; KR20190124656A; AU2019257834A1

Abstract

Mitocôndrias modificadas por uma proteína de alvejamento, de acordo com uma modalidade da presente invenção, podem ser eficazmente liberadas a um alvo. Além disso, quando uma proteína de interesse ligada às mitocôndrias modificadas é liberada em uma célula, várias atividades podem ser exibidas. As mitocôndrias modificadas podem eficazmente causar morte de tecido canceroso e assim podem ser também usadas como um agente anticâncer. Além disso, várias atividades são exibidas de acordo com uma proteína de interesse carregada em mitocôndrias modificadas e assim as mitocôndrias modificadas podem ser aplicadas no tratamento de várias doenças. Adicionalmente, uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de interesse e uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de alvejamento, de acordo com uma modalidade da presente invenção, podem ser usadas de modo a modificar mitocôndrias. Além disso, mitocôndrias modificadas com as proteínas de fusão exibem vários efeitos em uma célula alvo.

Description

“MITOCÔNDRIAS MODIFICADAS E USO DAS MESMAS” Campo da Técnica

[001] A presente invenção fornece uma proteína de fusão capaz de modificar mitocôndrias, mitocôndrias modificadas pela proteína de fusão e uma composição farmacêutica compreendendo as mesmas como um ingrediente ativo.

Fundamentos da Técnica

[002] Mitocôndrias são organelas celulares de células eucarióticas envolvidas na síntese e regulação de trifosfato de adenosina (ATP), uma fonte de energia intracelular. Mitocôndrias são associadas com várias vias metabólicas in vivo, por exemplo, sinalização celular, diferenciação celular, morte celular, bem como controle do ciclo celular e crescimento celular. Mitocôndrias têm seus próprios genomas e são organelas que desempenham um papel central no metabolismo de energia das células.

Mitocôndrias produzem energia através do transporte de elétrons e do processo de fosforilação oxidativa e desempenham um papel importante em estar envolvidas em vias de sinalização de apoptose.

[003] Foi relatado que uma redução na produção de energia devido a uma diminuição na função mitocondrial causa várias doenças. Quando a função da reação em cadeia de transporte de elétrons diminui de acordo com a variação do genoma e proteoma mitocondriais, uma redução na produção de ATP, uma produção excessiva de oxigênio reativo, uma diminuição na função de regulação de cálcio e semelhantes ocorrem. Neste caso, uma mudança na permeabilidade de membrana das mitocôndrias ocorre e a função da apoptose pode ocorrer anormalmente e levar a câncer e doenças incuráveis.

[004] Como tal, doenças humanas que foram relatadas como resultantes da disfunção mitocondrial incluem doença genética relacionada a mitocôndrias (Wallace DC 1999), diabetes mellitus (Maechler P 2001), doença cardíaca (Sorescu D 2002), demência senil tal como doença de Parkinson ou doença de Alzheimer (Lin MT 2006)

e a ocorrência de vários cânceres (Petros JA, 2005) e metástase do câncer (Ishikawa K, 2008) e semelhantes foram relatadas. Além disso, características comumente encontradas em mais do que 200 tipos de vários cânceres consistiram em função de apoptose prejudicada, resposta inflamatória aumentada e metabolismo anormal aumentado. Todos estes processos estão intimamente relacionados à função mitocondrial e a correlação entre câncer e mitocôndrias está chamando atenção.

[005] Por outro lado, é conhecido que células normais produzem 36 ATP por molécula de glicose através de um processo do sistema de transporte de elétrons, mas células cancerosas, diferente de células normais, produzem 2 ATP por molécula de glicose através da glicólise sob uma condição suficiente de oxigênio (glicólise aeróbica). Como tal, é conhecido que células cancerosas, diferente de células normais, usam o processo de glicólise ineficiente em termos de energia de modo a produzir aminoácidos, lipídeos, ácidos nucleicos e semelhantes necessários para a proliferação celular rápida. Por esta razão, é conhecido que células cancerosas requerem menos oxigênio e produzem uma quantidade maior de ácido láctico do que células normais.

[006] Portanto, uma mudança na composição do microambiente do câncer devido ao metabolismo anormal que ocorre em células cancerosas, uma inibição da apoptose causada por mitocôndrias disfuncionais e um aumento na resposta inflamatória e reação metabólica anormal em células cancerosas desempenham um papel muito importante na proliferação do câncer. Assim, o desenvolvimento de agentes anticâncer relacionados ao metabolismo usando estas características pode ser uma boa maneira capaz de resolver os efeitos colaterais e problemas econômicos de agentes anticâncer convencionais.

[007] É conhecido que mitocôndrias entram em células quando as mitocôndrias presentes nas células são isoladas e as células são tratadas com as mesmas in vitro ou as mitocôndrias são injetadas no corpo. Usando-se este fenômeno,

é possível que mitocôndrias normais isoladas de células sejam injetadas no corpo para tratar doenças causadas por disfunção mitocondrial ou em particular, para tratar doenças liberando-se eficazmente uma proteína específica em células usando-se mitocôndrias como um portador, mas nenhum relato foi feito sobre isso.

Problema Técnico

[008] Um objetivo da presente invenção é fornecer um sistema de liberação de proteína eficaz mostrando-se que mitocôndrias podem ser usadas como um meio de liberar eficazmente as proteínas capazes de exibir vários efeitos farmacológicos em células. Além disso, um objetivo da presente invenção é fornecer uma proteína recombinante para liberar eficazmente um fármaco e fornecer mitocôndrias modificadas que sejam produzidas usando a mesma. Além disso, um objetivo da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica compreendendo as mitocôndrias modificadas como um ingrediente ativo.

Solução para o Problema

[009] De modo a resolver os problemas acima, são fornecidas mitocôndrias modificadas em que uma proteína estranha é ligada à membrana externa das mitocôndrias. Além disso, de modo a preparar as mitocôndrias modificadas, é fornecida uma proteína de fusão compreendendo um peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial e uma proteína farmacológica desejada. Além disso, é fornecida uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo ou um fragmento do mesmo e um peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial.

Efeito da Invenção

[010] Quando as mitocôndrias às quais a proteína estranha é ligada são administradas ao corpo humano, a proteína estranha pode ser eficazmente liberada na célula. Além disso, a função danificada da célula pode ser reparada por uma proteína farmacologicamente ativa liberada na célula. Além disso, quando as mitocôndrias às quais a proteína estranha compreendendo uma proteína farmacologicamente ativa é ligada são liberadas na célula, a proteína farmacologicamente ativa é dissociada das mitocôndrias na célula e um papel útil pode ser esperado. Além disso, as mitocôndrias modificadas compreendendo um fragmento de anticorpo podem ser eficazmente liberadas às células alvejadas. Em particular, quando um fragmento de um anticorpo que alveja uma proteína presente na superfície do tecido canceroso é ligado à superfície das mitocôndrias, as mitocôndrias modificadas podem ser eficazmente liberadas em células cancerosas.

Portanto, a introdução das mitocôndrias modificadas não apenas pode restaurar o sistema de transporte de elétrons danificado das células, mas também pode prevenir ou tratar várias doenças pela proteína farmacologicamente ativa ligada às mitocôndrias modificadas.

Breve Descrição dos Desenhos

[011] A Figura 1 é um diagrama esquemático de um método para preparar pTA-p53.

[012] A Figura 2 é um diagrama esquemático de um método para preparar um vetor de pET15b-UB-p53.

[013] A Figura 3 mostra a expressão de uma proteína UB-p53 em E. coli.

[014] A Figura 4 é um diagrama esquemático de um método para preparar um vetor de pET11C-TOM70-UB-p53.

[015] A Figura 5 mostra a expressão de uma proteína TOM70-UB-p53 em E.

coli.

[016] A Figura 6 é um diagrama esquemático de um método para preparar um vetor de pET11C-TOM70-(GGGGS)3-UB-p53.

[017] A Figura 7 mostra a expressão de uma proteína TOM70-(GGGGS)3-UB- p53 em E. coli.

[018] A Figura 8 mostra um método de preparar um vetor de pET11C-TOM70- (GGGGS)3-p53.

[019] A Figura 9 mostra a expressão de uma proteína TOM70-(GGGGS)3-p53 em E. coli.

[020] A Figura 10 mostra um método de preparar um vetor de pET15b-UB- p53-TOM7.

[021] A Figura 11 mostra a expressão de uma proteína UB-p53-TOM7 em E.

coli.

[022] A Figura 12 mostra um método de preparar um vetor de pCMV-p53- myc/His.

[023] A Figura 13 mostra a expressão de uma proteína p53-myc/His em CHO transformada.

[024] A Figura 14 mostra os resultados da purificação de uma proteína TOM70-(GGGGS)3-p53 e depois da identificação da mesma.

[025] A Figura 15 é uma vista que mostra uma proteína TOM70-(GGGGS)3- p53 purificada.

[026] A Figura 16 mostra os resultados da purificação de uma proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 e depois da identificação da mesma.

[027] A Figura 17 é uma vista que mostra uma proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-p53 purificada.

[028] A Figura 18 mostra os resultados da purificação de uma proteína UB- p53 e depois da identificação da mesma.

[029] A Figura 19 é uma vista que mostra uma proteína UB-p53 purificada.

[030] A Figura 20 mostra os resultados da purificação de uma proteína UB- p53-TOM7 e depois da identificação da mesma.

[031] A Figura 21 é uma vista que mostra uma proteína UB-p53-TOM7 purificada.

[032] A Figura 22 mostra um método de preparar um vetor de pTA-Granzima B.

[033] A Figura 23 mostra um método de preparar um vetor de pET11C- TOM70-(GGGGS)3-UB-Granzima B.

[034] A Figura 24 mostra a expressão de uma proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-Granzima B em E. coli.

[035] A Figura 25 mostra um método de preparar um vetor pET15b-UB- Granzima B-TOM7.

[036] A Figura 26 mostra a expressão de uma proteína UB-Granzima B-TOM7 em E. coli.

[037] A Figura 27 mostra os resultados da purificação de uma proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-Granzima B.

[038] A Figura 28 é uma vista que mostra uma proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-Granzima B purificada.

[039] A Figura 29 mostra um método de preparar um vetor de pTA-RKIP.

[040] A Figura 30 mostra um método de preparar um vetor de pET11C- TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP.

[041] A Figura 31 mostra a expressão de uma proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-RKIP em E. coli.

[042] A Figura 32 mostra os resultados da purificação de uma proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP.

[043] A Figura 33 é uma vista que mostra uma proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-RKIP purificada.

[044] A Figura 34 mostra um método de preparar um vetor de pTA-PTEN.

[045] A Figura 35 mostra um método de preparar um vetor de pET11C- TOM70-(GGGGS)3-UB-PTEN.

[046] A Figura 36 mostra a expressão de uma proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-PTE em E. coli.

[047] A Figura 37 mostra os resultados da purificação de uma proteína

TOM70-(GGGGS)3-UB-PTEN.

[048] A Figura 38 é uma vista que mostra uma proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-PTEN purificada.

[049] A Figura 39 mostra os resultados da purificação de uma proteína UB- GFP-TOM7 e depois da identificação da mesma.

[050] A Figura 40 é uma vista que mostra uma proteína UB-GFP-TOM7 purificada.

[051] A Figura 41 mostra os resultados da purificação de uma proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-GFP e depois da identificação da mesma.

[052] A Figura 42 é uma vista que mostra uma proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-GFP purificada.

[053] A Figura 43 mostra um método de preparar um vetor pET15b-UB- scFvHER2-TOM7.

[054] A Figura 44 mostra a expressão de uma proteína UB-scFvHER2-TOM7 em E. coli.

[055] A Figura 45 mostra um método de preparar um vetor de pCMV- scFvHER2-TOM7-myc/His.

[056] A Figura 46 mostra a expressão de uma proteína scFvHER2-TOM7- myc/His em CHO transformada.

[057] A Figura 47 mostra os resultados da purificação de uma proteína UB- ScFvHER2-TOM7.

[058] A Figura 48 é uma vista que mostra uma proteína UB-ScFvHER2-TOM7 purificada.

[059] A Figura 49 mostra um método de preparar um vetor de pET15b-UB- scFvMEL-TOM7.

[060] A Figura 50 mostra a expressão de uma proteína UB-scFvMEL-TOM7 em E. coli.

[061] A Figura 51 mostra um método de preparar um vetor de pCMV- scFvMEL-TOM7-myc/His.

[062] A Figura 52 mostra a expressão de uma proteína scFvMEL-TOM7- myc/His em CHO transformada.

[063] A Figura 53 mostra um método de preparar um vetor de pCMV-scFvPD- L1-TOM7-myc/His.

[064] A Figura 54 mostra a expressão de uma proteína scFvPD-L1-TOM7- myc/His em CHO transformada.

[065] A Figura 55 é uma vista que confirma se uma proteína fluorescente é ligada à membrana externa das mitocôndrias. Neste caso, as mitocôndrias são manchadas com MitoTracker CMXRos para mostrar a cor vermelha e TOM70-UB-GFP mostra a cor verde. A área onde as duas porções são sobrepostas mostra cor amarela.

Neste caso, a ampliação de 55a é de 200 vezes e a ampliação de 55b é de 600 vezes.

[066] A Figura 56 mostra os resultados de identificar a proteína recombinante TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 e UB-p53-TOM7 ligadas à membrana externa das mitocôndrias estranhas usando análise Western blot.

[067] A Figura 57 mostra os resultados da observação do grau de injeção intracelular de acordo com a concentração de mitocôndrias usando um microscópio de fluorescência depois do isolamento de mitocôndrias estranhas e depois injeção das mitocôndrias em células.

[068] A Figura 58 é uma vista que confirma a influência de mitocôndrias normais sobre a proliferação de células de câncer de pele.

[069] A Figura 59 é uma vista que confirma a influência de mitocôndrias normais sobre a inibição da produção de espécies de oxigênio reativo (ROS) em células de câncer de pele.

[070] A Figura 60 é uma vista que confirma a influência de mitocôndrias normais sobre a resistência medicamentosa.

[071] A Figura 61 é uma vista que confirma a influência de mitocôndrias normais sobre a expressão de um gene antioxidante em células.

[072] A Figura 62 é uma vista que mostra a influência de mitocôndrias normais sobre a expressão de um gene envolvido na metástase de célula cancerosa.

[073] A Figura 63 é um diagrama esquemático de um método para confirmar a carga da proteína recombinante p53 na membrana externa das mitocôndrias estranhas e injeção da proteína recombinante p53 na célula.

[074] A Figura 64 é uma vista que confirma que a proteína recombinante p53 é carregada na membrana externa das mitocôndrias estranhas e que a p53 é injetada na célula. Neste caso, a ampliação é de 200 vezes.

[075] A Figura 65 é uma vista que confirma que a proteína recombinante p53 é carregada na membrana externa das mitocôndrias estranhas e que a p53 é injetada na célula. Neste caso, a ampliação é de 600 vezes.

[076] A Figura 66 é um diagrama esquemático de um método para confirmar a capacidade de apoptose das mitocôndrias modificadas sobre as quais a p53 injetada nas células é carregada, usando uma linhagem celular de câncer gástrico.

[077] A Figura 67a é uma vista que confirma a capacidade de apoptose das mitocôndrias modificadas sobre as quais a p53 injetada em células de câncer gástrico é carregada, através de um ensaio TUNEL. Neste caso, a ampliação é de 600 vezes.

[078] A Figura 67b é uma vista que confirma a capacidade de apoptose das mitocôndrias modificadas sobre as quais a p53 injetada em células de câncer gástrico é carregada, através de uma medição de fluorescência.

[079] A Figura 68 é uma vista que confirma o efeito de inibir a metástase de célula cancerosa pelas mitocôndrias modificadas carregadas com RKIP em células MDA-MB-231.

[080] A Figura 69 é uma vista que confirma que um anticorpo de fragmento variável de cadeia única (ScFv) para alvejar células cancerosas é expressado em células.

[081] A Figura 70 é uma vista que confirma que um anticorpo de fragmento variável de cadeia única (ScFv) para alvejar células cancerosas é expressado e ligado às mitocôndrias presentes na célula usando um método experimental de imunocitoquímica (ICC). Neste caso, a ampliação é de 200 vezes.

[082] A Figura 71 é uma vista que confirma que um anticorpo de fragmento variável de cadeia única (ScFv) para alvejar células cancerosas é expressado e ligado às mitocôndrias presentes na célula usando um método experimental de imunocitoquímica (ICC). Neste caso, a ampliação é de 600 vezes.

[083] A Figura 72 é uma vista que compara o efeito de injetar as mitocôndrias às quais um anticorpo de fragmento variável de cadeia única para alvejar células cancerosas o ligado na linhagem celular de câncer gástrico.

[084] A Figura 73 é um diagrama esquemático de um cronograma de experimentos com animais usando as mitocôndrias modificadas.

[085] A Figura 74 é uma fotografia em que um aumento em um tecido tumoral é visualmente observado.

[086] A Figura 75 é uma vista que confirma a mudança no peso corpóreo de camundongos depois da administração das mitocôndrias e das mitocôndrias modificadas.

[087] A Figura 76 é uma vista que confirma o tamanho do tumor depois da administração das mitocôndrias e das mitocôndrias modificadas.

[088] A Figura 77 é uma vista que confirma que as mitocôndrias modificadas carregadas com a proteína TOM-UB-p53 são eficazes em inibir a proliferação de células A431.

[089] A Figura 78 é uma vista que confirma a função das mitocôndrias isoladas por teor de ATP.

[090] A Figura 79 é uma vista que confirma a função das mitocôndrias isoladas por potencial de membrana.

[091] A Figura 80 é uma vista que confirma o grau de dano de mitocôndrias isoladas medindo-se as ROS mitocondriais (produção de mROS)

[092] A Figura 81a é uma vista que mostra a estrutura da proteína presente na membrana externa das mitocôndrias e a sequência de aminoácido da região de terminal N de TOM70, TOM20 ou OM45.

[093] A Figura 81b é uma vista que mostra a sequência de aminoácido da região de terminal C de TOM5, TOM7, Fis1, VAMP1B, Cytb5, BCL-2 ou BCL-X.

[094] A Figura 82 é uma vista que confirma se a proteína desejada é dissociada de acordo com a presença ou ausência de um ligante entre o peptídeo de ancoragem de membrana externa e a ubiquitina.

[095] A Figura 83 é uma vista que confirma que a proteína desejada ligada às mitocôndrias modificadas é separada das mitocôndrias na célula.

Melhor Modo para Realizar a Invenção

[096] Em seguida, a presente invenção será descrita em detalhe.

[097] Um aspecto da presente invenção fornece mitocôndrias modificadas em que uma proteína estranha é ligada à membrana externa das mitocôndrias.

[098] As mitocôndrias podem ser obtidas de mamíferos e podem ser obtidas de seres humanos. Especificamente, as mitocôndrias podem ser isoladas de células ou tecidos. Por exemplo, as mitocôndrias podem ser obtidas de células somáticas, células germinativas ou células-tronco. Além disso, as mitocôndrias podem ser mitocôndrias normais obtidas de células em que a atividade biológica das mitocôndrias é normal. Além disso, as mitocôndrias podem ser cultivadas in vitro.

[099] Além disso, as mitocôndrias podem ser obtidas de um indivíduo autólogo, alogênico ou xenogênico. Especificamente, as mitocôndrias autólogas se referem a mitocôndrias obtidas de tecidos ou células do mesmo indivíduo. Além disso, as mitocôndrias alogênicas se referem a mitocôndrias obtidas de um indivíduo que pertence à mesma espécie como o indivíduo e tem diferentes genótipos para alelos.

Além disso, as mitocôndrias xenogênicas se referem a mitocôndrias obtidas de um indivíduo que pertence às diferentes espécies do indivíduo.

[0100] Especificamente, as células somáticas podem ser células musculares, hepatócitos, células nervosas, fibroblastos, células epiteliais, adipócitos, osteócitos, leucócitos, linfócitos, plaquetas ou células mucosas. Além disso, as células germinativas são células que sofrem meiose e mitose e podem ser espermas ou óvulos. Além disso, as células-tronco podem ser qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em células-tronco mesenquimais, células-tronco adultas, células- tronco pluripotentes induzidas, células-tronco embrionárias, células-tronco da medula óssea, células-tronco neurais, células-tronco límbicas e células-tronco derivadas de tecido. Neste caso, as células-tronco mesenquimais podem ser qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em cordão umbilical, sangue do cordão umbilical, medula óssea, gordura, músculo, nervo, pele, membrana amniótica e placenta.

[0101] Por outro lado, quando as mitocôndrias são isoladas de células específicas, as mitocôndrias podem ser isoladas através de vários métodos conhecidos, por exemplo, usando uma solução tampão específica ou usando uma diferença potencial e um campo magnético e semelhantes.

[0102] Como usado aqui, o termo “proteína estranha” se refere a uma proteína que inclui uma proteína desejada capaz de funcionar dentro e for a da célula. Neste caso, a proteína estranha é uma proteína que não existe nas mitocôndrias e pode ser uma proteína recombinante. Especificamente, a proteína estranha pode compreender um peptídeo de ancoragem de mitocôndrias e uma proteína desejada. Além disso, a proteína estranha pode ser uma proteína de fusão recombinante compreendendo um peptídeo de ancoragem de mitocôndrias e uma proteína desejada. Neste caso, a proteína estranha pode compreender um peptídeo de ancoragem de mitocôndrias.

Preferivelmente, o peptídeo de ancoragem de mitocôndrias pode ser um peptídeo que pode ser localizado na membrana externa mitocondrial. Portanto, a proteína estranha pode ser ligada à membrana externa das mitocôndrias por um peptídeo de ancoragem de mitocôndrias. O peptídeo de ancoragem de mitocôndrias pode ser um peptídeo compreendendo uma região de terminal N ou uma região de terminal C de uma proteína presente em uma proteína de membrana mitocondrial e a região de terminal N ou a região de terminal C de uma proteína presente na membrana externa das mitocôndrias proteína pode ser localizada na membrana externa das mitocôndrias.

Neste caso, o peptídeo de ancoragem pode compreender ainda uma sequência de sinal de mitocôndrias.

[0103] Uma modalidade da proteína presente em uma proteína de membrana mitocondrial pode ser qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70, OM45, TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B.

Em particular, quando o peptídeo de ancoragem de mitocôndrias é derivado de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70 e OM45, a mesma pode compreender a região de terminal N de TOM20, TOM70 ou OM45.

Uma modalidade do peptídeo de ancoragem de mitocôndrias pode ser TOM70 derivado de levedura representado pela SEQ ID NO: 75 ou TOM70 derivado de ser humano representado pela SEQ ID NO: 76. Uma outra modalidade pode ser TOM20 derivado de levedura representado pela SEQ ID NO: 77 ou TOM20 derivado de ser humano representado pela SEQ ID NO: 78. Uma outra modalidade pode ser OM45 derivado de levedura representado pela SEQ ID NO: 79.

[0104] Além disso, quando o peptídeo de ancoragem de mitocôndrias é derivado de qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B, o mesmo pode compreender a região de terminal C de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B. Uma modalidade do peptídeo de ancoragem de mitocôndrias pode ser TOM5 derivado de levedura representado pela SEQ ID NO: 80 ou TOM5 derivado de ser humano representado pela SEQ ID NO: 81.

Uma outra modalidade pode ser TOM7 derivado de levedura representado pela SEQ ID NO: 82 ou TOM7 derivado de ser humano representado pela SEQ ID NO: 83. Uma outra modalidade pode ser TOM22 derivado de levedura representado pela SEQ ID NO: 84 ou TOM22 derivado de ser humano representado pela SEQ ID NO: 85. Uma outra modalidade pode ser Fis1 derivado de levedura representado pela SEQ ID NO: 86 ou Fis1 derivado de ser humano representado pela SEQ ID NO: 87. Uma outra modalidade pode ser Bcl-2 alpha derivado de ser humano representado pela SEQ ID NO: 88. Uma outra modalidade pode ser VAMP1 derivado de levedura representado pela SEQ ID NO: 89 ou VAMP1 derivado de ser humano representado pela SEQ ID NO: 90.

[0105] Neste caso, uma proteína desejada capaz de funcionar dentro e fora da célula incluída na proteína estranha pode ser qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em uma proteína ativa que exibe uma atividade em uma célula, uma proteína presente em uma célula e uma proteína tendo a capacidade de se ligar a um ligante ou receptor presente em uma membrana celular.

[0106] Uma modalidade da proteína ativa ou da proteína presente em uma célula pode ser qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em p53, Granzima B, Bax, Bak, PDCD5, E2F, AP-1(Jun/Fos), EGR-1, Retinoblastoma (RB), homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), E-caderina, Neurofibromina-2 (NF-2), poli[ADP-ribose] sintase 1 (PARP-1), BRCA-1, BRCA-2, Polipose coli adenomatosa (APC), Fator associado ao receptor do fator de necrose tumoral (TRAF), proteína inibitória de RAF cinase (RKIP), p16, KLF-10, LKB1, LHX6, C-RASSF, DKK-3PD1, Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Quando a proteína desejada é selecionada a partir do grupo acima, a proteína desejada pode ser ligada a um peptídeo de ancoragem compreendendo a região de terminal N de TOM20, TOM70 ou OM45.

[0107] Tal proteína de fusão pode ser ligada na ordem seguinte:

[0108] Terminal N-peptídeo de ancoragem compreendendo a região de terminal N de TOM20, TOM70 ou OM45-proteína desejada-terminal C.

[0109] Além disso, a proteína estranha pode compreender ainda uma sequência de aminoácido reconhecida por uma enzima proteolítica em células eucarióticas ou ubiquitina ou um fragmento da mesma entre um peptídeo de ancoragem de mitocôndrias e uma proteína desejada. A enzima proteolítica em células eucarióticas se refere a uma enzima que degrada uma proteína presente em células eucarióticas. Neste caso, porque uma proteína estranha compreende uma sequência de aminoácido reconhecida pela enzima que degrada a proteína, a proteína estranha ligada à membrana externa mitocondrial pode ser isolada em um peptídeo de ancoragem e uma proteína desejada em uma célula.

[0110] Neste caso, o fragmento de ubiquitina pode compreender a Gly-Gly de terminal C de uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71 e pode compreender 3 a 75 aminoácidos consecutivos a partir do terminal C. Além disso, a proteína estranha pode compreender ainda um ligante entre uma proteína desejada e ubiquitina ou um fragmento da mesma. Neste caso, o ligante pode ser composto de 1 a 150 aminoácidos ou ser composto de 10 a 100 aminoácidos ou ser composto de 20 a 50 aminoácidos, mas não é limitado a estes. O ligante pode ser composto de aminoácidos que são apropriadamente selecionados a partir de 20 aminoácidos, preferivelmente ser composto de glicina e/ou serina. Uma modalidade do ligante pode ser composta de 5 a 50 aminoácidos consistindo em glicina e serina. Uma modalidade do ligante pode ser (G4S)n, em que n é um número inteiro de 1 a 10 e n pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

[0111] Além disso, a proteína tendo a capacidade de se ligar a um ligante ou receptor presente em uma membrana celular pode ser um ligante ou receptor presente na superfície de uma célula tumoral. Neste caso, o ligante ou receptor presente na superfície de uma célula tumoral pode ser, mas não é limitado a, qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em CD19, CD20, antígeno de melanoma E(MAGE), NY-ESO-1, antígeno carcino-embrionário (CEA), mucina 1 associada à superfície celular (MUC-1), fosfatase ácida prostática (PAP), antígeno específico da próstata (PSA), survivina, proteína 1 relacionada à tirosina (tyrp1), proteína 1 relacionada à tirosina (tyrp2), Brachyury, Mesotelina, Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2), ERBB2, proteína do tumor de Wilms (WT1), FAP, EpCAM, PD-L1, ACPP, CPT1A, IFNG, CD274, FOLR1, EPCAM, ICAM2, NCAM1, LRRC4, UNC5H2 LILRB2, CEACAM, Nectina-3 e uma combinação dos mesmos.

[0112] Além disso, a proteína tendo a capacidade de se ligar a um ligante ou receptor presente em uma membrana celular pode ser um anticorpo ou um fragmento do mesmo que se liga a qualquer um selecionado a partir grupo acima. Em particular, um fragmento de um anticorpo se refere a um fragmento tendo a mesma região determinante de complementaridade (CDR) como aquela do anticorpo.

Especificamente, o mesmo pode ser Fab, scFv, F(ab’)2 ou uma combinação dos mesmos.

[0113] Neste caso, a proteína desejada pode ser ligada a um peptídeo de ancoragem compreendendo uma região de terminal C de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B e a proteína estranha pode ser ligada na ordem seguinte:

[0114] Terminal N-proteína desejada-peptídeo de ancoragem compreendendo uma região de terminal C de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B-terminal C.

[0115] Além disso, a proteína estranha pode compreender ainda um ligante entre uma proteína desejada e uma região de terminal C de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e

VAMP1B. Neste caso, um ligante é como descrito acima. Neste caso, uma proteína desejada, uma proteína ativa, uma proteína presente em uma célula e uma proteína tendo a capacidade de se ligar a um ligante ou receptor presente em uma membrana celular e semelhantes são como descritas acima.

[0116] Em uma modalidade da proteína desejada, um anticorpo ou um fragmento do mesmo que alveja uma célula específica pode estar em uma forma ligada ao peptídeo de ancoragem compreendendo a região de terminal C de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B. As mitocôndrias modificadas às quais a proteína desejada é ligada podem ser facilmente introduzidas em um alvo específico, de modo que as mitocôndrias possam ser eficientemente penetradas em uma célula específica.

[0117] Uma modalidade das mitocôndrias modificadas pode estar em uma forma à qual uma ou mais proteínas desejadas são ligadas. Especificamente, a mesma pode estar em uma forma à qual uma proteína desejada compreendendo p53 e uma proteína desejada compreendendo anticorpo anti-HER-2 ou um fragmento do mesmo são ligadas. Tais mitocôndrias modificadas podem liberar eficazmente as mitocôndrias em células cancerosas que expressam HER-2. Além disso, células cancerosas podem ser eficazmente mortas por p53 ligada às mitocôndrias modificadas.

[0118] Dependendo do propósito das mitocôndrias modificadas, uma proteína desejada compreendendo uma ou mais proteínas ativas podem ser construídas e ser deixadas ligadas às mitocôndrias. Além disso, uma proteína desejada que alveja uma célula pode ser construída em vários modos dependendo da célula alvejada.

[0119] Em um outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo as mitocôndrias modificadas descritas acima como um ingrediente ativo. Neste caso, o uso da composição farmacêutica pode ser para a prevenção ou tratamento do câncer. Neste caso, o câncer pode ser qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em câncer gástrico, câncer hepático, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer cervical, câncer da tireoide, câncer da laringe, leucemia mieloide aguda, tumor cerebral, neuroblastoma, retinoblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de glândulas salivares e linfoma.

[0120] Especificamente, quando a proteína ativa mata as células tumorais, como p53 ou quando uma proteína que inibe a proliferação é ligada às mitocôndrias, as mitocôndrias modificadas às quais p53 é ligada podem ser usadas como um agente anticâncer. Além disso, quando uma proteína tal como RKIP capaz de inibir a metástase de células cancerosas é ligada às mitocôndrias, as mitocôndrias modificadas às quais RKIP é ligada podem ser usadas como um inibidor da metástase tumoral. Quando qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em Granzima B, Bax, Bak, PDCD5, E2F, AP-1(Jun/Fos), EGR-1, Retinoblastoma (RB), homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), E-caderina, Neurofibromina-2 (NF-2), poli[ADP-ribose] sintase 1 (PARP-1), BRCA-1, BRCA-2, Polipose coli adenomatosa (APC), Fator associado ao receptor do fator de necrose tumoral (TRAF), p16, KLF-10, LKB1, LHX6, C-RASSF, DKK-3PD1 e uma combinação dos mesmos, que são proteínas que inibem a proliferação de células cancerosas ou controlam a reação de fosforilação em células cancerosas ou inibem a metástase de células cancerosas, é ligada às mitocôndrias, as mitocôndrias modificadas às quais a proteína ativa é ligada podem ser usadas como um agente anticâncer.

[0121] Além disso, para a composição farmacêutica, as mitocôndrias podem ser incluídas em uma concentração de 0,1 µg/mL a 500 µg/mL, 0,2 µg/mL a 450 µg/mL ou 0,5 µg/mL a 400 µg/mL, mas não é limitada a estas. A inclusão das mitocôndrias na faixa acima pode facilitar o ajuste de dose das mitocôndrias após a administração e pode realçar o grau de melhoria dos sintomas de uma doença de um paciente. Neste caso, a dose de mitocôndrias pode ser determinada através da quantificação de mitocôndrias quantificando-se a membrana proteína das mitocôndrias isoladas.

Especificamente, as mitocôndrias isoladas podem ser quantificadas através do ensaio proteico de Bradford (um documento escrito por James D. McCully (J Vis Exp. 2014; (91): 51682.).

[0122] Além disso, para a composição farmacêutica, uma proteína ativa que se liga às mitocôndrias pode ser incluída em uma concentração de 0,1 µg/mL a 500 µg/mL, 0,2 µg/mL a 450 µg/mL ou 0,5 µg/mL a 400 µg/mL, mas não é limitada a estas.

A inclusão da proteína ativa na faixa acima pode facilitar o ajuste de dose de uma proteína ativa após a administração e pode realçar o grau de melhoria dos sintomas de uma doença de um paciente.

[0123] Além disso, para a composição farmacêutica, uma proteína de alvejamento capaz de liberar mitocôndrias a uma célula específica pode ser incluída em uma concentração de 0,1 µg/mL a 500 µg/mL, 0,2 µg/mL a 450 µg/mL ou 0,5 µg/mL a 400 µg/mL, mas não é limitada a estas. A inclusão da proteína de alvejamento na faixa acima pode facilitar o ajuste de dose de uma proteína de alvejamento após a administração e pode realçar o grau de melhoria dos sintomas de uma doença de um paciente.

[0124] Em particular, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada com mitocôndrias em uma quantidade, mas não limitada a esta, de 0,01 a 5 mg/kg, 0,1 a 4 mg/kg ou 0,25 a 2,5 mg/kg por um tempo com base no peso corpóreo de um indivíduo a ser administrado. Isto é, é mais preferível em termos da atividade celular administrar a composição farmacêutica tal que a quantidade das mitocôndrias modificadas caia dentro da faixa acima com base no peso corpóreo de um indivíduo tendo tecidos cancerosos. Além disso, a composição farmacêutica pode ser administrada 1 a 10 vezes, 3 a 8 vezes ou 5 a 6 vezes e preferivelmente 5 vezes. Neste caso, o intervalo de administração pode ser 1 a 7 dias ou 2 a 5 dias e preferivelmente 3 dias.

[0125] Além disso, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada a um ser humano ou outro mamífero que é suscetível a câncer ou que sofre de câncer. Além disso, a composição farmacêutica pode ser uma preparação injetável que pode ser intravenosamente administrada ou uma preparação injetável que pode ser topicamente administrada e pode ser preferivelmente uma preparação para injeções.

[0126] Portanto, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser preparada como uma preparação injetável fisicamente ou quimicamente altamente estável ajustando-se o pH da composição por meio de uma solução tampão tal como uma solução aquosa ou fosfato ácidos que podem ser usados em uma preparação injetável, de modo a garantir a estabilidade do produto durante a distribuição de preparações injetáveis.

[0127] Especificamente, a composição farmacêutica da presente invenção pode conter água para injeção. A água para injeção é água destilada preparada para dissolver uma preparação injetável sólida ou diluir uma preparação injetável solúvel em água e pode ser injeção de glicose, injeção de xilitol, injeção de D-manitol, injeção de frutose, solução salina, injeção de dextrano 40, injeção de dextrano 70, injeção de aminoácido, solução de Ringer, ácido láctico-solução de Ringer, solução tampão de fosfato tendo um pH de 3,5 a 7,5, diidrogeno fosfato de sódio-solução tampão de citrato ou semelhantes.

[0128] Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode incluir um estabilizador ou um auxiliar de dissolução. Por exemplo, o estabilizador pode ser pirossulfito de sódio ou ácido etilenodiaminotetraacético e o auxiliar de dissolução pode ser ácido clorídrico, ácido acético, hidróxido de sódio, hidrogeno carbonato de sódio, carbonato de sódio ou hidróxido de potássio.

[0129] Além disso, a presente invenção pode fornecer um método para prevenir ou tratar câncer incluindo administrar a composição farmacêutica mencionada acima a um indivíduo. Aqui, o indivíduo pode ser um mamífero e preferivelmente um ser humano.

[0130] Um aspecto da presente invenção fornece um método para preparar as mitocôndrias modificadas, compreendendo uma etapa de misturar as mitocôndrias isoladas com uma proteína desejada compreendendo uma proteína ativa e/ou uma proteína desejada compreendendo uma proteína de alvejamento alvo.

[0131] Neste caso, a proteína desejada e as mitocôndrias podem ser misturadas em uma razão apropriada. Por exemplo, a proteína desejada:mitocôndrias podem ser misturadas em uma razão de 1:100 a 100:1 com base em uma razão em peso. Especificamente, elas podem ser misturadas em uma razão de 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 ou 1:1. Além disso, a razão pode ser 10:1, 5:1, 4:1, 3:1 ou 2:1.

[0132] Em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para preparar as mitocôndrias modificadas a partir de células transformadas injetando- se um polinucleotídeo que codifica a proteína desejada descrita acima em células eucarióticas. Especificamente, é fornecido um método para preparar a proteína de fusão descrita acima, compreendendo uma etapa de transformar o polinucleotídeo descrito acima em células procarióticas ou células eucarióticas sem uma enzima de degradação de ubiquitina ou uma enzima proteolítica em células eucarióticas; e uma etapa de obter uma proteína de fusão. Este método de preparação é adequado quando a proteína desejada não compreende uma sequência de aminoácido reconhecida por uma enzima proteolítica em células eucarióticas ou ubiquitina ou um fragmento da mesma.

[0133] Em um outro aspecto da presente invenção, uma proteína desejada pode ser preparada usando uma célula procariótica ou um extrato célula procariótica.

Além disso, é fornecido um método para preparar as mitocôndrias modificadas usando células eucarióticas sem uma enzima de degradação de ubiquitina ou uma enzima proteolítica ou um extrato de célula eucariótica.

[0134] Em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido o uso das mitocôndrias como um meio de liberação de uma proteína estranha. Especificamente, as mitocôndrias modificadas podem ser usadas como um meio de intracelular e a liberação extracelular de uma proteína estranha compreendendo uma proteína desejada capaz de funcionar dentro e fora da célula. As mitocôndrias podem ser eficazmente introduzidas em células e neste caso, uma proteína estranha desejada a ser liberada às células pode ser eficazmente liberada em células. Neste caso, as mitocôndrias podem ser usadas como um sistema de liberação de proteína eficaz. A proteína desejada é como descrita acima.

[0135] Um outro aspecto da presente invenção fornece uma proteína de fusão compreendendo um peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial e uma proteína desejada. Neste caso, a proteína desejada é como descrita acima.

[0136] Como usado aqui, o termo “peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial” pode ser o terminal N ou terminal C de uma proteína presente na membrana externa das mitocôndrias. O peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial pode ter uma sequência de aminoácido que é especificamente localizada na membrana externa das mitocôndrias. Neste caso, o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial permite que a proteína de fusão divulgada na presente invenção seja ligada à membrana externa das mitocôndrias.

Neste caso, o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial pode ser usado no mesmo sentido como o peptídeo de alvejamento de membrana externa mitocondrial.

[0137] Além disso, o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial impede que a proteína de fusão divulgada na presente invenção penetre nas mitocôndrias. O complexo de TOM (translocase da membrana externa) presente na membrana externa mitocondrial tem uma sequência alvo mitocondrial e um único domínio de ancoragem de membrana externa no término amino e a maioria do término carbóxi pode ter uma estrutura que é exposta ao citoplasma (Figura 81a). O Complexo de TOM (translocase da membrana externa) presente na membrana externa mitocondrial tem uma sequência alvo mitocondrial e um único domínio de ancoragem de membrana externa no término carboxila e a maioria do término amino pode ter também uma estrutura que é exposta ao citoplasma (Figura 81b). Além disso, a proteína presente na membrana externa das mitocôndrias pode ser selecionada a partir de proteínas presentes nas mitocôndrias que estão presentes em uma célula eucariótica. Por exemplo, a mesma pode ser selecionada a partir de proteínas presentes na membrana externa mitocondrial que estão presentes em levedura, células animais ou células humanas.

[0138] Neste caso, uma modalidade da proteína presente na membrana externa mitocondrial pode ser qualquer uma proteína selecionada a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70, OM45, TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B ou um fragmento da mesma. Neste caso, o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial pode ser um fragmento de qualquer uma proteína selecionada a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70, OM45, TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B. Neste caso, o peptídeo de ancoragem de membrana externa pode ser um polipeptídeo de terminal C ou terminal N de TOM20, TOM70, OM45, TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B localizado na membrana externa mitocondrial.

[0139] Em particular, quando o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial é fundido ao terminal N da proteína desejada, o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial pode compreender uma sequência de terminal de uma proteína selecionada a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70 e OM45.

Preferivelmente, a mesma pode ser uma sequência de terminal N de uma proteína selecionada a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70 e OM45. Uma modalidade do peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial é como descrita acima.

[0140] Além disso, quando o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial é fundido ao terminal C da proteína desejada, a proteína de alvejamento de membrana externa pode compreender uma sequência de terminal de uma proteína selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl- 2, Bcl-X e VAMP1B. Preferivelmente, a mesma pode ser uma sequência de terminal C de uma proteína selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-X e VAMP1B. Uma modalidade do peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial é como descrita acima.

[0141] Como usado aqui, o termo “proteína ativa” pode ser uma proteína que exibe atividade fisiológica. Uma modalidade de uma tal proteína ativa pode ser uma proteína tendo função diminuída ou uma proteína modificada presente em células cancerosas danificadas. Uma modalidade da proteína ativa pode ser uma proteína que realça a atividade das células. Uma modalidade de uma tal proteína ativa é como descrita acima.

[0142] A proteína de fusão pode ser uma proteína à qual uma proteína de alvejamento de membrana externa mitocondrial e uma proteína desejada são ligadas do terminal N ao terminal C. Neste caso, a mesma pode compreender ainda ubiquitina ou um fragmento da mesma tendo um sítio de clivagem específico de ubiquitina protease (Glicina-Glicina) entre a proteína de alvejamento de membrana externa mitocondrial e a proteína desejada. Neste caso, de modo a facilitar a clivagem pela ubiquitina protease, a mesma pode compreender ainda um ligante contendo aminoácidos hidrofílicos e polares, serina, glicina e treonina, entre a proteína de alvejamento de membrana externa mitocondrial e a proteína ubiquitina.

[0143] Como usado aqui, o termo “ubiquitina” se refere a uma proteína que participa do processo proteolítico, também referida como UB. Uma modalidade da ubiquitina pode ser a ubiquitina presente no corpo humano ou a ubiquitina presente em levedura. A ubiquitina presente no corpo humano é composta de 76 aminoácidos.

Neste caso, a ubiquitina pode ser usada em uma forma madura. Como usado aqui, o termo “forma madura” pode se referir a uma proteína em uma forma a partir da qual um peptídeo de sinal é removido.

[0144] Além disso, uma enzima referida como ubiquitina protease ou UBP (protease específica de ubiquitina) está naturalmente presente em células eucarióticas e pode induzir a dissociação natural de uma proteína desejada clivando-se o sítio de aminoácido glicina-glicina de terminal C de ubiquitina em uma célula.

[0145] Neste caso, o fragmento de ubiquitina pode compreender o aminoácido Gly-Gly do terminal C de ubiquitina e pode compreender 3 a 75 aminoácidos consecutivos a partir do terminal C. Especificamente, uma modalidade do fragmento de ubiquitina pode ser Arg-Gly-Gly, Leu-Arg-Gly-Gly, Arg-Leu-Arg-Gly-Gly ou Leu-Arg- Leu-Arg-Gly-Gly. Além disso, o fragmento de ubiquitina pode ter uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71.

[0146] A proteína de fusão compreendendo a proteína de alvejamento de membrana externa mitocondrial e a proteína desejada pode ser referida como uma proteína de fusão que modifica a atividade mitocondrial. Tal proteína de fusão pode ter qualquer uma das estruturas seguintes: <Fórmula Estrutural 1> terminal N-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial- proteína desejada-terminal C <Fórmula Estrutural 2> terminal N-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial- ubiquitina ou fragmento da mesma-proteína desejada-terminal C <Fórmula Estrutural 3> terminal N-peptídeo de alvejamento de membrana externa mitocondrial- ligante 1-ubiquitina ou fragmento da mesma-proteína desejada-terminal C

<Fórmula Estrutural 4> terminal N-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial- ubiquitina ou fragmento da mesma-ligante 2-proteína desejada-terminal C <Fórmula Estrutural 5> terminal N-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-ligante 1-ubiquitina ou fragmento da mesma-ligante 2-proteína desejada-terminal C

[0147] Nas Fórmulas Estruturais 1 a 5 acima, o peptídeo de ancoragem de membrana externa pode ser uma sequência de terminal de uma proteína selecionada a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70 e OM45 e a proteína desejada pode ser qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em p53, Granzima B, Bax, Bak, PDCD5, E2F, AP-1(Jun/Fos), EGR-1, Retinoblastoma (RB), homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), E-caderina, Neurofibromina-2 (NF-2), poli[ADP-ribose] sintase 1 (PARP-1), BRCA-1, BRCA-2, Polipose coli adenomatosa (APC), Fator associado ao receptor do fator de necrose tumoral (TRAF), proteína inibitória de RAF cinase (RKIP), p16, KLF-10, LKB1, LHX6, C-RASSF e DKK-3PD1.

[0148] Neste caso, o ligante 1 ou 2 pode ser um polipeptídeo composto de 1 a 100, 1 a 80, 1 a 50 ou 1 a 30 aminoácidos, respectivamente e pode ser preferivelmente um polipeptídeo composto de 1 a 30 aminoácidos que consistem em serina, glicina ou treonina sozinhos ou em combinação. Além disso, o ligante 1 ou 2 pode ser um polipeptídeo composto de 5 a 15 aminoácidos, respectivamente e pode ser preferivelmente um polipeptídeo composto de 5 a 15 aminoácidos que consistem em serina, glicina ou treonina sozinhos ou em combinação. Uma modalidade do ligante pode ser (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 70).

<Fórmula Estrutural 6> terminal N-proteína desejada-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-terminal C <Fórmula Estrutural 7> terminal N-proteína desejada-ubiquitina ou um fragmento da mesma-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-terminal C <Fórmula Estrutural 8> terminal N-proteína desejada-ligante 1-ubiquitina ou um fragmento da mesma- peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-terminal C <Fórmula Estrutural 9> terminal N-proteína desejada-ubiquitina ou um fragmento da mesma-ligante 2-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-terminal C <Fórmula Estrutural 10> terminal N-proteína desejada-ligante 1-ubiquitina ou fragmento da mesma- ligante 2-peptídeo de alvejamento de membrana externa mitocondrial-terminal C

[0149] Nas Fórmulas Estruturais 6 a 10 acima, o peptídeo de ancoragem de membrana externa pode ser uma sequência de terminal de uma proteína selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-X e VAMP1B e a proteína desejada pode ser qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em p53, Granzima B, Bax, Bak, PDCD5, E2F, AP-1(Jun/Fos), EGR-1, Retinoblastoma (RB), homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), E-caderina, Neurofibromina-2 (NF-2), poli[ADP-ribose] sintase 1 (PARP-1), BRCA-1, BRCA-2, Polipose coli adenomatosa (APC), Fator associado ao receptor do fator de necrose tumoral (TRAF), proteína inibitória de RAF cinase (RKIP), p16, KLF-10, LKB1, LHX6, C-RASSF, DKK-3PD1, Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Neste caso, o ligante 1 ou 2 é como descrito acima.

[0150] Um aspecto da presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão compreendendo um peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial e uma proteína desejada.

[0151] Além disso, um aspecto da presente invenção fornece um vetor carregado no polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão compreendendo uma proteína desejada.

[0152] Além disso, um aspecto da presente invenção fornece uma célula hospedeira em que um vetor carregado com um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão compreendendo a proteína desejada é introduzido.

[0153] Um aspecto da presente invenção fornece uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de alvejamento alvo e uma proteína de alvejamento de membrana externa mitocondrial.

[0154] Neste caso, a proteína de alvejamento alvo e o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial podem ser ligados do terminal N ao terminal C.

Aqui, o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial pode ser qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70, OM45, TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B.

[0155] Como usado aqui, o termo “alvo” se refere a um local onde as mitocôndrias modificadas devem ser liberadas. Uma modalidade do alvo pode ser uma célula cancerosa. Especificamente, uma modalidade do alvo pode ser um biomarcador presente na superfície de células cancerosas. Especificamente, o alvo pode ser um antígeno associado ao tumor (TAA). Neste caso, o antígeno associado ao tumor pode ser qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em CD19, CD20, antígeno de melanoma E(MAGE), NY-ESO-1, antígeno carcino-embrionário (CEA), mucina 1 associada à superfície celular (MUC-1), fosfatase ácida prostática (PAP), antígeno específico da próstata (PSA), survivina, proteína 1 relacionada à tirosina (tyrp1), proteína 1 relacionada à tirosina (tyrp2), Brachyury, Mesotelina, Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2), ERBB2, proteína do tumor de Wilms (WT1), FAP, EpCAM, PD-L1, ACPP, CPT1A, IFNG, CD274, FOLR1, EPCAM, ICAM2, NCAM1, LRRC4, UNC5H2 LILRB2, CEACAM, Nectina-3 e uma combinação dos mesmos.

[0156] Como usado aqui, o termo “proteína de alvejamento alvo” pode ser uma sequência de proteína capaz de se ligar ao alvo descrito acima. Neste caso, uma modalidade da proteína de alvejamento alvo pode ser uma proteína que se liga a um biomarcador presente na superfície de células cancerosas. Neste caso, uma modalidade do biomarcador presente na superfície de células cancerosas pode ser, mas não é limitada a, ICAM2, NCAM1, LRRC4, UNC5H2 LILRB2, CEACAM ou Nectina-3. Neste caso, a proteína de alvejamento alvo pode ser incluída na proteína estranha descrita acima.

[0157] Uma modalidade da proteína de alvejamento alvo pode ser um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Em particular, a mesma pode ser um anticorpo ou um fragmento do mesmo que especificamente se liga ao antígeno associado ao tumor. Além disso, o fragmento do anticorpo pode ser qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em Fab, Fab’, scFv e F(ab)2.

[0158] Uma modalidade da proteína de alvejamento alvo pode ser scFvHER capaz de se ligar a um receptor de fator de crescimento epidérmico. Uma outra modalidade pode ser scFvMEL capaz de alvejar melanoma. Uma outra modalidade pode ser scFvPD-L1 capaz de se ligar a PD-L1 superexpressada na superfície de células cancerosas. Uma outra modalidade pode ser PD-1 capaz de se ligar a PDL-1 superexpressada na superfície de células cancerosas.

[0159] Um aspecto da presente invenção pode compreender ainda ubiquitina ou um fragmento da mesma entre a proteína de alvejamento alvo e a proteína de alvejamento de membrana externa mitocondrial. A proteína de fusão compreendendo as mitocôndrias proteína de alvejamento alvo e a proteína desejada podem ser referidas como uma proteína de fusão que modifica a atividade mitocondrial. Tal proteína de fusão pode ter qualquer uma das estruturas seguintes: <Fórmula Estrutural 11> terminal N-proteína de alvejamento alvo-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-terminal C <Fórmula Estrutural 12> terminal N-proteína de alvejamento alvo-ubiquitina ou um fragmento da mesma-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-terminal C <Fórmula Estrutural 13> terminal N-proteína de alvejamento alvo-ligante 1-ubiquitina ou um fragmento da mesma- peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-terminal C <Fórmula Estrutural 14> terminal N-proteína de alvejamento alvo-ubiquitina ou fragmento da mesma- ligante 2-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-terminal C <Fórmula Estrutural 15> terminal N-proteína de alvejamento alvo-ligante 1-ubiquitina ou fragmento da mesma-ligante 2-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-terminal

C

[0160] Nas Fórmulas Estruturais 11 a 15 acima, o peptídeo de ancoragem de membrana externa pode ser uma sequência de terminal de uma proteína selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-X e VAMP1B e a proteína de alvejamento alvo pode ser qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em antígenos associados ao tumor, CD19, CD20, antígeno de melanoma E(MAGE), NY-ESO-1, antígeno carcino-embrionário (CEA), mucina 1 associada à superfície celular (MUC-1), fosfatase ácida prostática (PAP), antígeno específico da próstata (PSA), survivina, proteína 1 relacionada à tirosina (tyrp1), proteína 1 relacionada à tirosina (tyrp2), Brachyury, Mesotelina, Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2), ERBB2, proteína do tumor de Wilms (WT1), FAP, EpCAM, PD-L1, ACPP, CPT1A, IFNG, CD274, FOLR1, EPCAM, ICAM2, NCAM1, LRRC4, UNC5H2 LILRB2, CEACAM, Nectina-3 e uma combinação das mesmas. Além disso, a proteína de alvejamento alvo pode ser um anticorpo especificamente que se liga a um antígeno associado ao tumor ou um fragmento do mesmo. Neste caso, o ligante 1 ou 2 e a sequência de aminoácido reconhecida por uma enzima proteolítica são como descritos acima.

<Fórmula Estrutural 16> terminal N-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial- proteína de alvejamento alvo-terminal C <Fórmula Estrutural 17> terminal N-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial- ubiquitina ou um fragmento da mesma-proteína de alvejamento alvo-terminal C <Fórmula Estrutural 18> terminal N-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-ligante 1-ubiquitina ou um fragmento da mesma-proteína de alvejamento alvo-terminal C <Fórmula Estrutural 19> terminal N-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial- ubiquitina ou fragmento da mesma-ligante 2-proteína de alvejamento alvo-terminal C <Fórmula Estrutural 20> terminal N-peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial-ligante 1-ubiquitina ou fragmento da mesma-ligante 2-proteína de alvejamento alvo-terminal

C

[0161] Nas Fórmulas Estruturais 16 a 20 acima, o peptídeo de ancoragem de membrana externa pode ser qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70 e OM45. Além disso, a proteína de alvejamento alvo, ubiquitina ou um fragmento da mesma e o ligante 1 ou 2 são como descritos acima.

[0162] Um aspecto da presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de alvejamento alvo.

[0163] Além disso, um aspecto da presente invenção fornece um vetor carregado com o polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de alvejamento alvo.

[0164] Além disso, um aspecto da presente invenção fornece uma célula hospedeira em que um vetor carregado com um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão compreendendo a proteína de alvejamento alvo é introduzido. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. Neste caso, preferivelmente, a célula eucariótica pode ser uma cepa da qual uma enzima que degrada ubiquitina é removida.

[0165] Além disso, um aspecto da presente invenção fornece um método de preparar - mitocôndrias modificadas a partir das células transformadas injetando-se um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão em células eucarióticas.

MODO PARA A INVENÇÃO

[0166] Em seguida, uma modalidade preferida será apresentada para ajudar no entendimento da presente invenção. Entretanto, os exemplos seguintes são fornecidos apenas para entender facilmente a presente invenção e a presente invenção não é limitada aos exemplos seguintes. I. Preparação de proteína de fusão compreendendo peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial, ligante, ubiquitina e proteína desejada Exemplo 1. Preparação da proteína de fusão compreendendo p53 Exemplo 1.1. Amplificação do gene p53

[0167] *De modo a expressar o p53 humano em uma proteína recombinante, o RNA total foi extraído de células humanas epiteliais e o cDNA foi sintetizado a partir das mesmas. Especificamente, células de fibroblasto dérmicas humanas foram cultivadas em meio sérico a 10 % sob uma condição de dióxido de carbono a 5 % e 37 °C (1x106 células). Posteriormente, a solução de cultura foi removida e lavada duas vezes adicionando-se uma solução tampão PBS às células e 0,5 ml do extrato de RNA (reagente Trizol, Thermo Fisher Scientific) foi adicionado diretamente. A mistura à qual o extrato de RNA foi adicionado foi deixada na temperatura ambiente por 10 minutos e depois 0,1 ml de clorofórmio foi adicionado e agitado por 15 segundos e depois centrifugado em torno de 12.000 xg por 10 minutos. Em seguida, o sobrenadante separado foi tomado e o mesmo volume de álcool isopropílico foi adicionado e centrifugado novamente em 12.000 xg por 10 minutos. Posteriormente, o líquido foi removido e lavado uma vez com etanol a 75 % e o RNA foi seco na temperatura ambiente.

[0168] Cerca de 50 ul de água destilada purificada sem RNAase foi adicionado e a quantidade e a pureza do RNA foram medidas usando um espectrofotômetro. De modo a sintetizar o cDNA, 2 ug de RNA total purificado foi submetido a uma reação de ligação com oligo dT a 70 °C por 5 minutos. Posteriormente, 10X solução tampão de reação de transcrição reversa, 10 mM de dNTP, inibidor de RNAse e M-MLV transcriptase reversa (Enzynomics, Korea) foram adicionados e a reação de síntese de cDNA foi realizada a 42 °C por 60 minutos. Posteriormente, a transcriptase reversa foi inativada por aquecimento a 72 °C por 5 minutos e depois RNase H foi adicionada para remover o RNA de filamento único, que foi usado como um padrão para a reação em cadeia de polimerase do gene p53.

[0169] De modo a obter o gene de p53 em que a sequência de peptídeo de sinal foi removida das células de fibroblasto dérmicas humanas, um iniciador (T2p53) que codifica a partir do ácido glutâmico do término amino e um iniciador (Xp53) que codifica a partir do término carboxila foram sintetizados e depois PCR foi realizada usando o cDNA preparado acima como um padrão. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 1 abaixo.

[Tabela 1] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’-AAA AAA CCG CGG TGG TGA GGA GCC GCA GTC T2p53 SEQ ID NO: 1 AGA TCC TAG-3’ 5’- AAA AAA CTC GAG TGA GTC TGA GTC AGG CCC Xp53 SEQ ID NO: 2 TTC TG-3’

[0170] 0,2 pmol de iniciador T2p53 e 0,2 pmol de iniciador Xp53 foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq.

Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 40 ciclos. Depois da reação, o fragmento de DNA amplificado de cerca de 1,2 kbp foi isolado por eletroforese em gel de agarose a 1 % e depois inserido em um vetor pGEM-T easy (Promega, USA) usando T4DNA ligase. Como um resultado de sequenciar o DNA assim obtido, foi confirmado que o cDNA que codifica uma proteína de p53 humano foi obtido. O gene p53 obtido foi designado como pTA- p53 e a sequência de base do mesmo é a mesma como a sequência de base da SEQ ID NO: 3 (Figura 1).

Exemplo 1.2. Preparação do vetor de expressão de E. coli para p53 Exemplo 1.2.1. Preparação de um plasmídeo, pET15b-UB-p53

[0171] De modo a preparar uma proteína de p53 em uma forma à qual a ubiquitina é fundida, o vetor de expressão seguinte foi preparado. De modo a obter o gene de ubiquitina, o iniciador NdeUB e o iniciador T2UB foram preparados. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 2 abaixo.

[Tabela 2] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’-GGA TTC CAT ATG CAA CTT TTC GTC AAA AGE CTA NdeUB SEQ ID NO: 4 AC-3’ T2UB 5’-ATG ACC ACC GCG GAG TCT CAA CAC CAA-3’ SEQ ID NO: 5

[0172] 0,2 pmol de iniciador NdeUB e 0,2 pmol de iniciador T2UB foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq.

Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter o gene de ubiquitina (UB). O gene de ubiquitina amplificado foi clivado pelas enzimas de restrição NdeI e SacII e o plasmídeo pTA-p53 foi clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI.

Posteriormente, os fragmentos de DNA de cerca de 210 bp e 1.200 bp foram obtidos por eletroforese em gel de agarose a 2 %, respectivamente e depois inseridos em um vetor de pET15b clivado pelas enzimas de restrição NdeI e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET15b-UB-p53 (Figura 2). Neste caso, UB-p53 foi representada pela sequência de base da SEQ ID NO: 6.

[0173] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando o plasmídeo pET15b-UB-p53. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB sob uma condição de 37 °C. Posteriormente, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 1 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0174] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 3, foi confirmado que uma proteína de p53 fundida à ubiquitina tendo um tamanho de cerca de 60 kDa foi expressada. Neste caso, a faixa M na Figura 3 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra o precipitado centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG e a faixa 2 mostra o sobrenadante centrifugado depois que E. coli foi triturada.

Exemplo 1.2.2. Preparação de um plasmídeo, pET11C-TOM70-UB-p53

[0175] De modo a preparar a proteína de p53 na forma à qual TOM70 que se liga à membrana externa mitocondrial e ubiquitina foram fundidas, o vetor de expressão capaz de expressar p53 na forma à qual TOM70 e ubiquitina foram fundidas foi preparado. De modo a obter os genes de TOM70 e ubiquitina, iniciador NdeTOM70,

iniciador TOM70-AS, iniciador TOM70UB-S e iniciador T2UB-AS foram preparados. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 3 abaixo.

[Tabela 3] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’-GAA TTC CAT ATG AAA AGT TTT ATA AGE CGG NdeTOM70 SEQ ID NO: 7 AAT AAA AGE GCA ATT TTC GCA AGE GTT GC -3’ 5’- GGT GCA TAC TAC TAT TAT CAAA CTT TTC TOM70-AS SEQ ID NO: 8 GTC AAA AGE C-3’ 5’- GGC TAC GT ATT TAT TTC CAA CTT TTC GTC TOM70UB-S SEQ ID NO: 9 AAA AGE C-3’ T2UB-AS 5’- GGC ACC ACC GCG GAG TCT CAA CAC 3’ SEQ ID NO: 10

[0176] De modo a obter o gene de TOM70, 0,2 pmol de iniciador NdeTOM70 e 0,2 pmol de iniciador TOM70-AS foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter um gene de TOM70. O fragmento de DNA amplificado foi referido como N-TOM70. O plasmídeo pET15b-UB-p53 obtido no Exemplo 1.2.1. acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador TOM70UB-S e 0,2 pmol de iniciador T2UB-AS foram adicionados e dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq foram misturados.

Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter um gene de UB. O fragmento de DNA amplificado foi referido como C-UB.

[0177] O N-TOM70 e C-UB de DNA amplificado foram usados como padrões e 0,2 pmol de iniciador NdeTOM70, 0,2 pmol de iniciador T2UB-AS foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de

95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter o gene de ubiquitina TOM70-UB ao qual o TOM70 amplificado foi fundido.

[0178] O gene de TOM70-UB amplificado foi clivado pelas enzimas de restrição NdeI e SacII e o plasmídeo pTA-p53 foi clivado pelas SacII e XhoI e os fragmentos de DNA de 330 bp e 1.500 bp foram obtidos por eletroforese em gel de agarose a 2 %, respectivamente. Posteriormente, o mesmo foi inserido em um vetor de pET11c clivado pelas enzimas de restrição NdeI e SalI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET11c-TOM70-UB-p53 (Figura 4). Neste caso, TOM70-UB- p53 foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 11.

[0179] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando um plasmídeo pET11c-TOM70-UB-p53. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB em uma incubadora de agitação a 37 °C. Posteriormente, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 1 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0180] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 5, foi confirmado que a proteína de p53 tendo um tamanho de cerca de 62 kDa na forma à qual TOM70 e ubiquitina foram fundidas foi expressada.

Neste caso, a faixa M mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra o sobrenadante centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG.

Exemplo 1.2.3. Preparação de um plasmídeo, pET11c-TOM70-(GGGGS)3- UB-p53

[0181] De modo a preparar uma proteína de p53 na forma à qual TOM70 que se liga à membrana externa mitocondrial, um ligante (GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 70)) e ubiquitina foram fundidos, um vetor de expressão capaz de expressar uma proteína de p53 na forma à qual TOM70, o ligante e ubiquitina foram fundidos foi preparado. De modo a obter um gene ligante ligado a TOM70, iniciador TOM70(G)3- AS, iniciador (G)3UB-S e iniciador Xp53 (noT) foram preparados. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 4 abaixo.

[Tabela 4] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’-GCC CCC GGA TCC TCC ACC CCC GCT TOM70(G)3- SEQ ID NO:

TCC GCC ACC TCC ATA ATA GT AGT ATG CAC AS 12 CAA TAG -3’ 5’-GGT GGA GGA TCC GGG GGC GC GGA SEQ ID NO: (G)3UB-S AGC CAA ATC-3’ 13 5’- AAA AAA CTC GAG GTC TGA GTC AGG SEQ ID NO: Xp53(noT) CCC TTC TG-3’ 14

[0182] O plasmídeo pET11c-TOM70-UB-p53 obtido no Exemplo 1.2.2. acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador NdeTOM70 e 0,2 pmol de iniciador TOM70(G)3-AS foram adicionados e dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq foram misturados. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter um gene TOM70-G3 em que um gene TOM70 e um ligante foram ligados. Além disso, o plasmídeo pET15b-UB-p53 obtido no Exemplo 1.2.1. acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador (G)3UB-S e 0,2 pmol de iniciador Xp53 (noT) foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq.

[0183] Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter UB-p53, p53 fundidos com o gene ubiquitina. O gene de TOM70-G3 amplificado foi clivado pelas enzimas de restrição NdeI e BamHI e o gene de UB-p53 amplificado foi clivado por BamHI e XhoI e os fragmentos de DNA de 100 bp e 1.500 bp foram obtidos por eletroforese em gel de agarose a 2 %, respectivamente. Posteriormente, o mesmo foi inserido em um vetor de pET11c clivado pelas enzimas de restrição NdeI e SalI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET11c-TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 (Figura 6). Neste caso, TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO:

15.

[0184] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando o plasmídeo pET11c-TOM70-(GGGGS)3-UB-p53. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB sob uma condição de 37 °C. Posteriormente, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 1 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0185] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 7, foi confirmado que proteína de p53 tendo um tamanho de cerca de 62 kDa na forma à qual TOM70, o ligante e ubiquitina foram fundidos foi expressada. Neste caso, a faixa M mostra um marcador de peso molecular proteico, a faixa 1 mostra o precipitado centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG e a faixa 2 mostra o sobrenadante centrifugado depois de triturar E. coli.

Exemplo 1.2.4. Preparação de um plasmídeo, pET11c-TOM70-(GGGGS)3- p53

[0186] De modo a preparar uma proteína de p53 na forma à qual TOM70 que se liga à membrana externa mitocondrial e um ligante (GGGGSGGGGSGGGGS) foram fundidos, um vetor de expressão capaz de expressar uma proteína de p53 na forma à qual TOM70 e o ligante foram fundidos foi preparado. De modo a obter um gene p53 ao qual TOM70 e o ligante foram fundidos, um iniciador (B(G)3p53) foi preparado. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 5 abaixo.

[Tabela 5] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’-GGT GGA GGA TCC GGG GGC GGC GGA AGC B(G)3p53 SEQ ID NO: 16 GAG GAG CCG CAG TCA GAT CCT AGC -3’

[0187] O plasmídeo pET11c-TOM70-UB-p53 obtido no Exemplo 1.2.2. acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador NdeTOM70 e 0,2 pmol de iniciador TOM70(G)3-AS foram adicionados e dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq foram misturados. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter um gene TOM70. O fragmento de DNA amplificado foi referido como TOM70-G3.

[0188] O plasmídeo pET15b-UB-p53 obtido no Exemplo 1.2.1. acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador B(G)3p53 e 0,2 pmol de iniciador Xp53 (noT) foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos. O fragmento de DNA amplificado foi referido como G3-p53.

[0189] O fragmento de DNA amplificado, TOM70-G3, foi clivado por NdeI e BamHI e o fragmento de DNA G3-53 foi clivado pelas enzimas de restrição BamHI e XhoI. Depois, os fragmentos de DNA de cerca de 150 bp e 1.300 bp foram obtidos por eletroforese em gel de agarose a 2 %, respectivamente e depois inseridos em um vetor de pET11c clivado pelas enzimas de restrição NdeI e SalI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET11c-TOM70-(GGGGS)3-p53 (Figura 8). Neste caso, TOM70-(GGGGS)3-p53 foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 17.

[0190] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando o plasmídeo pET11c-TOM70-(GGGGS)3-p53. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB em uma incubadora de agitação a 37 °C. Posteriormente, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 1 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0191] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 9, foi confirmado que uma proteína de p53 tendo um tamanho de cerca de 60 kDa na forma à qual TOM70 foi fundido foi expressada. Neste caso, a faixa M mostra um marcador de peso molecular proteico, a faixa 1 mostra o precipitado centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG e a faixa 2 mostra o sobrenadante centrifugado depois de triturar E. coli.

Exemplo 1.2.5. pET15b-UB-p53-TOM7

[0192] De modo a preparar uma proteína de p53 na forma à qual ubiquitina e TOM7 que se ligam à membrana externa mitocondrial foram fundidos, um vetor de expressão capaz de expressar p53 em uma forma à qual ubiquitina, p53 e TOM foram fundidos na ordem foi preparado. De modo a obter um gene p53 ao qual TOM7 e ubiquitina foram fundidos, iniciador Xp53(noT), iniciador XTOM7 e iniciador LTOM7 foram preparados. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 6 abaixo.

[Tabela 6] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’-AAA AAA CTC GAG GTC TGA GTC AGG CCC TTC Xp53(noT) SEQ ID NO: 18 TG -3’

XTOM7 5’-AAA AAA CTC GAG ttt gcc att cgc tgg ggc ttt atc-3’ SEQ ID NO: 19 5’-AAA AAA GTC GAC TTA TCC CCA AAG TAG GCT LTOM7 SEQ ID NO: 20 CAA AAC AG-3’

[0193] O plasmídeo pET15b-UB-p53 obtido no Exemplo 1.2.1. acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador NdeUB e 0,2 pmol de iniciador Xp53(noT) foram adicionados e dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq foram misturados. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter um gene UB-p53. Além disso, o cDNA preparado acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador XTOM7 e 0,2 pmol de iniciador LTOM7 foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq.

[0194] Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 40 ciclos para obter um gene TOM7. O fragmento de DNA amplificado, UB-p53, foi clivado pelas enzimas de restrição, NdeI e XhoI e o gene de TOM7 amplificado foi clivado pelas enzimas de restrição XhoI e SalI. Os fragmentos de DNA de cerca de 1.500 bp e 150 bp foram obtidos por eletroforese em gel de agarose a 2 %, respectivamente e depois inseridos em um vetor de pET15b clivado pelas enzimas de restrição NdeI e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET15b-UB-p53-TOM7 (Figura 10). Neste caso, UB-p53-TOM7 foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 21.

[0195] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando o plasmídeo pET15b-UB-p53-TOM7. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB sob uma condição de 37 °C. Posteriormente, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 0,5 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0196] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 11, foi confirmado que uma proteína de p53 tendo um tamanho de cerca de 60 kDa na forma à qual ubiquitina e TOM7 foram fundidos foi expressada. Neste caso, a faixa M mostra um marcador de peso molecular proteico, a faixa 1 mostra o precipitado centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG e a faixa 2 mostra o sobrenadante centrifugado depois de triturar E. coli.

Exemplo 1.2.6. Construção de um vetor de expressão mamífero, pCMV-p53- myc/His

[0197] Um vetor de expressão para células animais capazes de expressar p53 foi preparado. De modo a obter um gene p53, o iniciador Rp53 foi preparado. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 7 abaixo.

[Tabela 7] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’-AAA AAA GAA TTC ATG GTC TGA GTC AGG SEQ ID NO: Rp53 CCC TTC TG -3’ 23

[0198] O plasmídeo pET-UB-p53 obtido no Exemplo 1.2.1. acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador Rp53 e 0,2 pmol de iniciador Xp53(noT) foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq foram misturados. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter um gene p53.

[0199] O gene p53 amplificado foi clivado pelas enzimas de restrição EcoRI e XhoI e o fragmento de DNA de cerca de 1.300 bp foi obtido por eletroforese em gel de agarose a 2 % e depois o mesmo foi inserido em um vetor de pcDNA3,1-myc/His A clivado pelas enzimas de restrição EcoRI e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pCMV-p53-myc/His (Figura 12). Neste caso, p53-myc/His foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 23.

[0200] O mesmo foi transfectado em uma célula CHO animal usando o plasmídeo pCMV-p53-myc/His e as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada e isto foi mostrado por Western blot usando um anticorpo anti-c-myc. Como mostrado na Figura 13, foi confirmado que uma proteína de p53 tendo um tamanho de cerca de 55 kDa foi expressada. Neste caso, a faixa M mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra que o mesmo foi transfectado em uma célula CHO animal e as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada e depois isto foi confirmado por Western blot usando um anticorpo anti-c-myc.

Exemplo 1.3. Isolamento e purificação de proteína de fusão compreendendo p53 Exemplo 1.3.1. Isolamento e purificação de proteína recombinante TOM70- (GGGGS)3-p53 derivada de E. coli

[0201] A cepa de produção de E. coli BL21(DE3) que expressa a proteína recombinante TOM70-(GGGGS)3-p53 foi inoculada em um meio líquido LB e cultivada sob uma condição de 37 °C. Posteriormente, quando a absorbância atingiu 0,4 em OD600, IPTG a 0,5 mM foi adicionado e a cultura em agitação foi realizada ainda por 4 horas para expressar a proteína TOM70-(GGGGS)3-p53.

[0202] Depois que a cultura foi concluída, as células foram recuperadas usando centrifugação e as células recuperadas foram lavadas uma vez usando PBS e depois as células foram colocadas em suspensão usando uma solução de PBS e as células em suspensão foram submetidas a um processo de trituração usando um sonificador. As células trituradas foram centrifugadas usando uma centrífuga de alta velocidade e depois frações insolúveis foram recuperadas e as frações insolúveis recuperadas foram lavadas três vezes usando solução de 50 mM de Tris, 100 mM de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) no pH 8,0. Posteriormente, a mesma foi dissolvida em solução de 6 M de guanidina, 100 mM de fosfato de sódio, 10 mM de Tris no pH 8,0 e filtrada usando um filtro de 0,45 µm e depois carregada em uma coluna cromatográfica de níquel pré-empacotada para realizar a purificação primária.

[0203] A solução compreendendo a proteína TOM70-(GGGGS)3-p53 foi carregada e depois até que as impurezas não ligadas não fossem detectadas, uma solução de lavagem foi fluida usando solução de 8 M de ureia, 50 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 8,0 e a proteína foi eluída usando solução de 8 M de ureia, 50 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 500 mM de imidazol, pH 8,0 enquanto mudando a concentração de imidazol para 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500 mM (Figura 14). Neste caso, a faixa M na Figura 14 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma amostra de carga de cromatografia de afinidade por níquel. A faixa 2 mostra que a mesma não foi ligada a uma resina de afinidade por níquel. As faixas 3 a 4 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/50 mM de imidazol. As faixas 5 a 7 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/100 mM de Imidazol. As faixas 8 a 9 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/250 mM de Imidazol. As faixas 10 a 11 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/500 mM de Imidazol.

[0204] A solução eluída recuperada da cromatografia com níquel foi trocada de solução com PBS usando o princípio de pressão osmótica. Depois que a troca de solução foi concluída, a solução eluída foi submetida à centrifugação para recuperar o sobrenadante e uma quantidade de proteína da solução eluída recuperada foi medida pelo método de quantificação proteica e confirmada usando SDS-PAGE.

Como mostrado na Figura 15, depois que a confirmação foi concluída, a proteína TOM70-(GGGGS)3-p53 foi extinta com o nitrogênio líquido e armazenada em um congelador criogênico a -80 °C. Neste caso, a faixa M mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra a proteína TOM70-(GGGGS)3-p53 obtida depois da diálise em solução tampão PBS.

Exemplo 1.3.2. Isolamento e purificação da proteína recombinante TOM70- (GGGGS)3-UB-p53 derivada de E. coli

[0205] E. coli que expressa a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 recombinante foi usada para isolar e purificar a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 no mesmo método como no Exemplo 1.3.1. Como um resultado, a proteína TOM70- (GGGGS)3-UB-p53 foi eluída (Figura 16). Neste caso, a faixa M na Figura 16 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma amostra de carga de cromatografia de afinidade por níquel. A faixa 2 mostra que a mesma não foi ligada a uma resina de afinidade por níquel. A faixa 3 mostra os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/50 mM de Imidazol. As faixas 4 a 7 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/100 mM de Imidazol. As faixas 8 a 11 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/250 mM de Imidazol.

[0206] A quantidade de proteína da solução eluída recuperada foi medida pelo método de quantificação proteica e confirmada usando SDS-PAGE. Como mostrado na Figura 17, depois que a confirmação foi concluída, a proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-p53 foi extinta com o nitrogênio líquido e armazenada em um congelador criogênico a -80 °C. Neste caso, a faixa M na Figura 17 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 obtida depois da diálise em solução tampão PBS.

Exemplo 1.3.3. Isolamento e purificação da proteína recombinante UB-p53 derivada de E. coli

[0207] A cepa de produção BL21(DE3) que expressa a proteína UB-p53 na forma madura à qual a ubiquitina foi fundida foi inoculada em um meio líquido LB e cultivada em uma incubadora de agitação a 37 °C. Quando a absorbância atingiu 0,4 em OD600, IPTG a 0,5 mM foi adicionado e a cultura em agitação foi realizada ainda por 4 horas para expressar a proteína UB-p53 na forma madura à qual a ubiquitina foi fundida.

[0208] Depois, a proteína UB-p53 foi isolada e purificada no mesmo método como no Exemplo 1.3.1. Como um resultado, a proteína UB-p53 foi eluído (Figura 18).

Neste caso, a faixa M na Figura 18 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma amostra de carga de cromatografia de afinidade por níquel. A faixa 2 mostra que a mesma não foi ligada a uma resina de afinidade por níquel. A faixa 3 mostra os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/50 mM de Imidazol. As faixas 4 a 6 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/100 mM de Imidazol. A faixa 7 a 9 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/250 mM de Imidazol. As faixas 10 a 11 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/500 mM de Imidazol.

[0209] A quantidade de proteína da solução eluída recuperada foi medida pelo método de quantificação proteica e confirmada usando SDS-PAGE. Como mostrado na Figura 19, depois que a confirmação foi concluída, a proteína UB-p53 foi extinta com o nitrogênio líquido e armazenada em um congelador criogênico a -80 °C. Neste caso, a faixa M na Figura 19 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra a proteína UB-p53 obtida depois de diálise em solução tampão PBS.

Exemplo 1.3.4. Isolamento e purificação de proteína recombinante UB-p53-

TOM7 derivada de E. coli

[0210] A cepa de produção de E. coli BL21(DE3) que expressa a proteína UB- p53-TOM7 na forma madura à qual a ubiquitina foi fundida foi inoculada em um meio líquido LB e cultivada sob uma condição de 37 °C. Quando a absorbância atingiu 0,4 em OD600, IPTG a 0,5 mM foi adicionado e a cultura em agitação foi realizada ainda por 4 horas para expressar a proteína UB-p53-TOM7 na forma madura à qual a ubiquitina foi fundida.

[0211] Depois, a proteína UB-p53-TOM7 foi isolada e purificada no mesmo método como no Exemplo 1.3.1. Como um resultado, a proteína UB-p53-TOM7 foi eluída (Figura 20). Neste caso, a faixa M na Figura 20 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma amostra de carga de cromatografia de afinidade por níquel. A faixa 2 mostra que a mesma não foi ligada a uma resina de afinidade por níquel. A faixa 3 mostra os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/10 mM de Imidazol. A faixa 4 mostra os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/50 mM de Imidazol. As faixas 5 a 7 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/100 mM de Imidazol. As faixas 8 a 9 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/250 mM de Imidazol. As faixas 10 a 11 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/500 mM de Imidazol.

[0212] A quantidade de proteína da solução eluída recuperada foi medida pelo método de quantificação proteica e confirmada usando SDS-PAGE. Como mostrado na Figura 21, depois que a confirmação foi concluída, a proteína UB-p53 foi extinta com o nitrogênio líquido e armazenada em um congelador criogênico a -80 °C. Neste caso, a faixa M na Figura 21 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra a proteína UB-p53-TOM7 obtida depois da diálise em solução tampão PBS.

Exemplo 2. Preparação de proteína de fusão compreendendo Granzima B Exemplo 2.1. Amplificação do gene de Granzima B

[0213] De modo a expressar a Granzima B humana em uma proteína recombinante, o RNA total foi extraído de células exterminadoras naturais humanas e o cDNA foi sintetizado a partir das mesmas. Especificamente, células exterminadoras naturais humanas foram cultivadas em meio sérico a 10 % sob uma condição de dióxido de carbono a 5 % e 37 °C (1x106 células). Posteriormente, o RNA foi obtido no mesmo método como no Exemplo 1.1. e depois o mesmo foi usado como um padrão para a reação em cadeia de polimerase do gene de Granzima B.

[0214] De modo a obter o gene de Granzima B em que a sequência de peptídeo de sinal foi removida de células exterminadoras naturais humanas, iniciador T2GZMB que codifica a partir da isoleucina de término amino e iniciador XGZMB(noT) que codifica a partir do término carboxila foram sintetizados e depois PCR foi realizada usando o cDNA preparado acima como um padrão. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 8 abaixo.

[Tabela 8] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’-AAA AAA CCG CGG TGG TAT CAT CGG GGG T2GZMB SEQ ID NO: 24 ACA TGA GGC ACA TGA GGC CAA GCC -3’ 5’-AAA AAA CTC GAG GTA GCG TTT CAT GGT TTT XGZMB(noT) SEQ ID NO: 25 CTT TAT CC-3’

[0215] O cDNA preparado acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador T2GZMB e 0,2 pmol de iniciador XGZMB(noT) foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 40 ciclos. Depois da reação, o fragmento de DNA amplificado de cerca de 700 bp foi isolado por eletroforese em gel de agarose a 1 % e depois inserido em um vetor pGEM-T easy (Promega, USA) usando uma T4DNA ligase. Como um resultado de sequenciar o DNA assim obtido, foi confirmado que o cDNA que codifica uma proteína Granzima B humana foi obtido. O gene de Granzima B obtido foi designado como pTA- Granzima B e o gene de Granzima B foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 26 (Figura 22).

Exemplo 2.2. Preparação de um vetor de expressão de E. coli para a proteína Granzima B Exemplo 2.2.1. Preparação de um plasmídeo, pET11c-TOM70-(GGGGS)3- UB-Granzima B

[0216] De modo a preparar uma proteína Granzima B na forma à qual TOM70 que se liga à membrana externa mitocondrial, um ligante (GGGGSGGGGSGGGGS) e ubiquitina foram fundidos, o vetor de expressão capaz de expressar Granzima B na forma à qual TOM70, o ligante e ubiquitina foram fundidos foi preparado.

[0217] O gene de pTA-Granzima B plasmídico obtido no Exemplo 2.1. acima foi clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI e o fragmento de DNA de cerca de 700 bp foi obtido por eletroforese em gel de agarose a 2 %. Posteriormente, o mesmo foi inserido em um vetor de pET11c-TOM70-(GGGGS)3-UB-(p53) clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET11c-TOM70-(GGGGS)3-UB-Granzima B (SEQ ID NO: 27) (Figura 23).

[0218] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando um plasmídeo pET11c-TOM70-(GGGGS)3-UB-Granzima B. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB em uma incubadora de agitação a 37 °C. Depois, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 0,5 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0219] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 24, foi confirmado que uma proteína Granzima B tendo um tamanho de cerca de 35 kDa na forma à qual TOM70, um ligante e ubiquitina foram fundidos foi expressada. Neste caso, a faixa M na Figura 24 mostra um marcador de peso molecular proteico, a faixa 1 mostra o precipitado centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG e a faixa 2 mostra o sobrenadante centrifugado depois que E. coli foi triturada.

Exemplo 2.2.2. Preparação de um plasmídeo, pET15b-UB-Granzima B-TOM7

[0220] De modo a preparar uma proteína Granzima B na forma à qual ubiquitina e TOM7 que se ligam à membrana externa mitocondrial foram fundidos, o vetor de expressão capaz de expressar a proteína Granzima B na forma à qual ubiquitina, Granzima B e TOM7 foram fundidos na ordem foi preparado.

[0221] O gene de pTA-Granzima B plasmídico obtido no Exemplo 2.1. acima foi clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI e o fragmento de DNA de cerca de 700 bp foi obtido por eletroforese em gel de agarose a 2 %. Posteriormente, o mesmo foi inserido em um vetor de pET15b-UB-(p53)-TOM7 clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET15b-UB- Granzima B-TOM7(Figura 25). Aqui, o UB-Granzima B-TOM7 foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 28.

[0222] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando o plasmídeo pET15b-UB-Granzima B-TOM7. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB sob uma condição de 37 °C. Depois, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 0,5 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0223] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 26, foi confirmado que uma proteína Granzima B tendo um tamanho de cerca de 35 kDa na forma à qual ubiquitina e TOM70 foram fundidos foi expressada. Neste caso, a faixa M na Figura 26 mostra um marcador de peso molecular proteico, a faixa 1 mostra o precipitado centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG e a faixa 2 mostra o sobrenadante centrifugado depois que E. coli foi triturada.

Exemplo 2.3. Isolamento e purificação de proteína recombinante TOM70- (GGGGS)3-UB-Granzima B derivada de E. coli

[0224] A proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-Granzima B foi isolada e purificada no mesmo método como no Exemplo 1.3.1. Como um resultado, a proteína TOM70- (GGGGS)3-UB-Granzima B foi eluída (Figura 27). Neste caso, a faixa M na Figura 27 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma amostra de carga de cromatografia de afinidade por níquel. A faixa 2 mostra que a mesma não foi ligada a uma resina de afinidade por níquel. As faixas 3 e 4 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/50 mM de Imidazol. As faixas 5 a 7 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/100 mM de Imidazol. As faixas 8 a 9 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/250 mM de Imidazol.

[0225] A quantidade de proteína da solução eluída recuperada foi medida pelo método de quantificação proteica e confirmada usando SDS-PAGE. Como mostrado na Figura 28, depois que a confirmação foi concluída, a proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-Granzima B foi extinta com o nitrogênio líquido e armazenada em um congelador criogênico a -80 °C. Neste caso, a faixa M na Figura 28 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-Granzima B obtida depois de diálise em solução tampão PBS.

Exemplo 3. Preparação de proteína de fusão compreendendo RKIP Exemplo 3.1. Amplificação do gene de RKIP

[0226] De modo a expressar o gene de RKIP humana (Proteína Inibitória de Raf Cinase) em uma proteína recombinante, o RNA total foi extraído de células humanas epiteliais e o cDNA foi sintetizado a partir das mesmas. Células de fibroblasto dérmicas humanas foram cultivadas em meio sérico a 10 % sob uma condição de dióxido de carbono a 5 % e 37 °C (1x106 células). Posteriormente, o RNA foi obtido no mesmo método como no Exemplo 1.1. e depois o mesmo foi usado como um padrão para a reação em cadeia de polimerase do gene de RKIP.

[0227] De modo a obter o gene de RKIP em que a sequência de peptídeo de sinal foi removida das células de fibroblasto dérmicas humanas, iniciador T2RKIP que codifica a partir da prolina do término amino e iniciador XRKIP(noT) que codifica a partir do término carboxila foram sintetizadas e depois PCR foi realizada usando o cDNA preparado acima como um padrão. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 9 abaixo.

[Tabela 9] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’-AAA AAA CCG CGG TGG Tcc ggt gga cct cag caa T2RKIP SEQ ID NO: 29 gtg gtc-3’ 5’- AAA AAA CTC GAG CTT CCC AGA CAG CTG CTC XRKIP(noT) SEQ ID NO: 30 GTA CAG TTT GG-3’

[0228] O cDNA preparado acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador T2RKIP e 0,2 pmol de iniciador XRKIP(noT) foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 40 ciclos. Depois da reação, o fragmento de DNA amplificado de cerca de 560 bp foi isolado por eletroforese em gel de agarose a 1 % e depois inserido em um vetor pGEM-T easy (Promega, USA) usando uma T4DNA ligase. Como um resultado de sequenciar o DNA assim obtido, foi confirmado que o cDNA que codifica uma proteína RKIP humana foi obtido. O gene de RKIP obtido foi designado como pTA-RKIP (Figura 29) e a sequência de base do gene de RKIP foi representada pela sequência de base da SEQ ID NO: 31.

Exemplo 3.2. Preparação de um vetor de expressão de E. coli para proteína

RKIP Exemplo 3.2.1. Preparação de um plasmídeo, pET11c-TOM70-(GGGGS)3- UB-RKIP

[0229] De modo a preparar a proteína RKIP na forma à qual TOM70 que se liga à membrana externa mitocondrial, um ligante (GGGGSGGGGSGGGGS) e ubiquitina foram fundidos, o vetor de expressão capaz de expressar RKIP na forma à qual TOM70, um ligante e ubiquitina foram fundidos foi preparado.

[0230] O gene de pTA-RKIP plasmídico obtido no Exemplo 3.1. foi clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI e o fragmento de DNA de cerca de 560 bp foi obtido por eletroforese em gel de agarose a 2 % e depois o mesmo foi inserido em um vetor de pET11c-TOM70-(GGGGS)3-UB-(p53) clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET11-TOM70- (GGGGS)3-UB-RKIP (Figura 30). Aqui, TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 32.

[0231] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando o plasmídeo pET11c-TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB em uma incubadora de agitação a 37 °C. Depois, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 0,5 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0232] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 31, foi confirmado que uma proteína RKIP tendo um tamanho de cerca de 33 kDa na forma à qual TOM70, um ligante e ubiquitina foram fundidos foi expressada. Neste caso, a faixa M na Figura 31 mostra um marcador de peso molecular proteico, a faixa 1 mostra o precipitado centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG e a faixa 2 mostra o sobrenadante centrifugado depois que E. coli foi triturada.

Exemplo 3.3. Isolamento e purificação de proteína recombinante TOM70- (GGGGS)3-UB-RKIP derivada de E. coli

[0233] A cepa de produção de E. coli BL21(DE3) que expressa um TOM70- (GGGGS)3-UB-RKIP recombinante foi inoculada em um meio líquido LB e cultivada sob uma condição de 37 °C. Quando a absorbância atingiu 0,3 em OD600, a mesma foi colocada em um refrigerador para reduzir a temperatura da solução de cultura e a temperatura da incubadora foi mudada para 18 °C e depois IPTG a 0,5 mM foi adicionado e a cultura em agitação foi realizada ainda por 1 dia para expressar a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP.

[0234] Depois, a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP foi isolada e purificada no mesmo método como no Exemplo 1.3.1. Como um resultado, a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP foi eluída (Figura 32). Neste caso, a faixa M na Figura 32 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma amostra de carga de cromatografia de afinidade por níquel. A faixa 2 mostra que a mesma não foi ligada a uma resina de afinidade por níquel. A faixa 3 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/10 mM de Imidazol. As faixas

4 a 6 mostram os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/50 mM de Imidazol. As faixas 7 a 8 mostram os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/100 mM de Imidazol. As faixas 9 a 10 mostram os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/175 mM de Imidazol. As faixas 11 a 13 mostram os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/250 mM de Imidazol. As faixas 14 a 16 mostram os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/500 mM de Imidazol.

[0235] A quantidade de proteína da solução eluída recuperada foi medida pelo método de quantificação proteica e confirmada usando SDS-PAGE. Como mostrado na Figura 33, depois que a confirmação foi concluída, a proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-RKIP foi extinta com o nitrogênio líquido e armazenada em um congelador criogênico a -80 °C. Neste caso, a faixa M na Figura 33 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP obtida depois de diálise em solução tampão PBS.

Exemplo 4. Preparação da proteína de fusão compreendendo PTEN Exemplo 4.1. Amplificação do gene de PTEN

[0236] De modo a expressar o PTEN humano (Homólogo de fosfatase e tensina) em uma proteína recombinante, o RNA total foi extraído de células humanas epiteliais e o cDNA foi sintetizado a partir das mesmas. Células de fibroblasto (células de fibroblasto dérmicas humanas) foram cultivadas em meio sérico a 10 % sob uma condição de dióxido de carbono a 5 % e 37 °C (1x106 células). Posteriormente, o RNA foi obtido no mesmo método como no Exemplo 1.1. e depois o mesmo foi usado como um padrão para a reação em cadeia de polimerase do gene de PTEN.

[0237] De modo a obter o gene de PTEN em que a sequência de peptídeo de sinal foi removida de células de fibroblasto dérmicas humanas, iniciador T2PTEN que codifica a partir da treonina do término amino e iniciador XPTEN(noT) que codifica a partir do término carboxila foram sintetizados e depois PCR foi realizada usando o cDNA preparado acima como um padrão. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 10 abaixo.

[Tabela 10] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’-AAA AAA CCG CGG TGG Tac agc cat cat caa aga T2PTEN SEQ ID NO: 33 gat cgt tag -3’ 5’- AAA AAA CTC GAG GAC TTT TGT AAT TTG TGT XPTEN(noT) SEQ ID NO: 34 ATG CTG -3’

[0238] O cDNA preparado acima foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador T2PTEN e 0,2 pmol de iniciador XPTEN(noT) foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 40 ciclos. Depois da reação, o fragmento de DNA amplificado de cerca de 1.200 bp foi isolado por eletroforese em gel de agarose a 1 % e depois inserido em um vetor pGEM-T easy (Promega, USA) usando uma T4DNA ligase. Como um resultado de sequenciar o DNA assim obtido, foi confirmado que o cDNA que codifica uma proteína RKIP humana foi obtido. O gene de PTEN obtido foi designado como pTA-PTEN (Figura 34) e a sequência de base do PTEN foi representada pela sequência de base da SEQ ID NO: 35.

Exemplo 4.2. Preparação de um vetor de expressão de E. coli para proteína de PTEN Exemplo 4.2.1. Preparação de um plasmídeo, pET11c-TOM70-(GGGGS)3- UB-PTEN

[0239] De modo a preparar uma proteína de PTEN na forma à qual TOM70 que se liga à membrana externa mitocondrial, um ligante (GGGGSGGGGSGGGGS) e ubiquitina foram fundidos, o vetor de expressão capaz de expressar o gene de PTEN na forma à qual TOM70, o ligante e ubiquitina foram fundidos foi preparado.

[0240] O gene de pTA-PTEN plasmídico obtido no Exemplo 4.1. acima foi clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI e o fragmento de DNA de cerca de

1.200 bp foi obtido por eletroforese em gel de agarose a 2 %. Posteriormente, o mesmo foi inserido em um vetor de pET11c-TOM70-(GGGGS)3-UB-(p53) clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET11c-TOM70-(GGGGS)3-UB-PTEN (Figura 35). Aqui, TOM70- (GGGGS)3-UB-PTEN foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 36.

[0241] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando o plasmídeo pET11c-TOM70-(GGGGS)3-UB-PTEN. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB sob a condição de 37 °C. Depois, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 0,5 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0242] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 36, foi confirmado que uma proteína de PTEN tendo um tamanho de cerca de 73 kDa na forma à qual TOM70, um ligante e ubiquitina foram fundidos foi expressada. Neste caso, a faixa M na Figura 36 mostra um marcador de peso molecular proteico, a faixa 1 mostra o precipitado centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG e a faixa 2 mostra o sobrenadante centrifugado depois que E. coli foi triturada.

Exemplo 4.3 Isolamento e purificação de proteína recombinante TOM70- (GGGGS)3-UB-PTEN derivada de E. coli

[0243] A proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-PTEN foi isolada e purificada no mesmo método como no Exemplo 1.3.1. Como um resultado, a proteína TOM70-

(GGGGS)3-UB-PTEN foi eluída (Figura 37). Neste caso, a faixa M na Figura 37 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma amostra de carga de cromatografia de afinidade por níquel. A faixa 2 mostra que a mesma não foi ligada a uma resina de afinidade por níquel. A faixa 3 mostra os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/10 mM de Imidazol. A faixa 4 mostra os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/50 mM de Imidazol. As faixas 5 a 8 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/100 mM de Imidazol. As faixas 9 a 10 mostram os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/250 mM de Imidazol. A faixa 11 mostra os resultados da eluição com solução de 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/500 mM de Imidazol.

[0244] A quantidade de proteína da solução eluída recuperada foi medida pelo método de quantificação proteica e confirmada usando SDS-PAGE. Como mostrado na Figura 38, depois que a confirmação foi concluída, a proteína TOM70-(GGGGS)3- UB-PTEN foi extinta com o nitrogênio líquido e armazenada em um congelador criogênico a -80 °C. Neste caso, a faixa M na Figura 38 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-PTEN obtida depois da diálise em solução tampão PBS.

Exemplo 5. Preparação de proteína de fusão compreendendo proteína de membrana externa mitocondrial, ubiquitina e GFP Exemplo 5.1. Isolamento e purificação de proteína recombinante UB-GFP- TOM7 derivada de E. coli

[0245] A cepa de produção de E. coli BL21(DE3) que expressa uma proteína UB-GFP-TOM7 na forma madura à qual a ubiquitina foi fundida foi inoculada em um meio líquido LB e cultivada sob uma condição de 37 °C. Quando a absorbância atingiu 0,3 em OD600, a mesma foi colocada em um refrigerador para reduzir a temperatura da solução de cultura e a temperatura da incubadora foi mudada para 18 °C e depois IPTG a 0,5 mM foi adicionado e a cultura em agitação foi realizada ainda por 1 dia para expressar a proteína de GFP-TOM7 na forma madura à qual a ubiquitina foi fundida.

[0246] Depois que a cultura foi concluída, as células foram recuperadas usando centrifugação e as células recuperadas foram lavadas uma vez usando PBS e depois as células foram colocadas em suspensão usando solução de 50 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 8,0 e as células em suspensão foram submetidas a um processo de trituração usando um sonificador. As células trituradas foram centrifugadas usando uma centrífuga de alta velocidade e depois o sobrenadante foi recuperado e o sobrenadante recuperado foi filtrado usando um filtro de 0,45 µm e depois carregado em uma coluna cromatográfica de níquel pré- empacotada para realizar a purificação primária.

[0247] A solução de trituração compreendendo a proteína UB-GFP-TOM7 na forma madura à qual a ubiquitina foi fundida foi carregada e depois até que as impurezas não ligadas não fossem detectadas, uma solução de lavagem foi fluida usando solução de 50 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 8,0 e a proteína foi eluída de acordo com o gradiente de concentração usando solução de 50 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 500 mM de imidazol, pH 8,0 (Figura 39). Neste caso, a faixa M na Figura 39 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma amostra de carga de cromatografia de afinidade por níquel. A faixa 2 mostra que a mesma não foi ligada a uma resina de afinidade por níquel. A faixa 3 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/20 mM de Imidazol. A faixa 4 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/55 mM de Imidazol. A faixa 5 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/60 mM de Imidazol. A faixa 6 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/65 mM de Imidazol. A faixa 7 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/70 mM de Imidazol. A faixa 8 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/75 mM de Imidazol. A faixa 9 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/80 mM de Imidazol. A faixa 10 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/85 mM de Imidazol. A faixa 11 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/90 mM de Imidazol. A faixa 12 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/95 mM de Imidazol. A faixa 13 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/100 mM de Imidazol. A faixa 14 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/105 mM de Imidazol.

[0248] De modo a remover o imidazol na solução eluída, a diálise foi realizada usando o princípio de pressão osmótica em uma solução de 50 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, pH 8,0 (Figura 40). A proteína final UB-GFP-TOM7 que foi identificada foi extinta com o nitrogênio líquido e armazenada em um congelador criogênico a -80 °C. Neste caso, a faixa M na Figura 40 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma proteína obtida depois que a diálise foi realizada em uma solução de 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl depois de misturar uma fração de proteína de fusão.

Exemplo 5.2. Isolamento e purificação da proteína recombinante TOM70- (GGGGS)3-UB-GFP derivada de E. coli

[0249] A cepa de produção de E. coli BL21(DE3) que expressa uma proteína recombinante TOM70-(GGGGS)3-UB-GFP foi inoculada em um meio líquido LB e cultivada sob uma condição de 37 °C. Quando a absorbância atingiu 0,3 em OD600, a mesma foi colocada em um refrigerador para reduzir a temperatura da solução de cultura e a temperatura da incubadora foi mudada para 18 °C e depois IPTG a 0,5 mM foi adicionado e a cultura em agitação foi realizada ainda por 1 dia para expressar a proteína recombinante TOM70-(GGGGS)3-UB-GFP.

[0250] Depois que a cultura foi concluída, as células foram recuperadas usando centrifugação e as células recuperadas foram lavadas uma vez usando PBS e depois as células foram colocadas em suspensão usando solução de 50 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 8,0 e as células em suspensão foram submetidas a um processo de trituração usando um sonificador. As células trituradas foram centrifugadas usando uma centrífuga de alta velocidade e depois o sobrenadante foi recuperado e o sobrenadante recuperado foi filtrado usando um filtro de 0,45 µm e depois carregado em uma coluna cromatográfica de níquel pré- empacotada para realizar a purificação primária.

[0251] A solução de trituração compreendendo a proteína recombinante TOM70-(GGGGS)3-UB-GFP foi carregada na coluna contendo resinas de níquel e depois até que as impurezas não ligadas não fossem detectadas, uma solução de lavagem foi fluida usando solução de 50 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 8,0. Depois, a proteína foi eluída usando solução de 50 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 500 mM de imidazol, pH 8,0, enquanto mudando a concentração de imidazol para 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500 mM (Figura 41). Neste caso, a faixa M na Figura 41 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma amostra de carga de cromatografia de afinidade por níquel. A faixa 2 mostra que a mesma não foi ligada a uma resina de afinidade por níquel. A faixa 3 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/20 mM de Imidazol. A faixa 4 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/50 mM de Imidazol. As faixas 5 a 8 mostram os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/100 mM de Imidazol. As faixas 9 a 11 mostram os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/250 mM de Imidazol. A faixa 12 mostra os resultados da eluição com 50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/500 mM de Imidazol.

[0252] A solução eluída recuperada da cromatografia com níquel foi trocada de solução com solução tampão PBS usando o princípio de pressão osmótica. Depois que a troca de solução foi concluída, a proteína final TOM70-(GGGGS)3-UB-GFP que foi recuperada foi identificada usando quantificação proteica e SDS-PAGE. Como mostrado na Figura 42, depois que a identificação foi concluída, a proteína TOM70- (GGGGS)3-UB-GFP foi extinta com o nitrogênio líquido e armazenada em um congelador criogênico a -80 °C. Neste caso, a faixa M na Figura 42 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra a proteína TOM70- (GGGGS)3-UB-GFP obtida depois que a diálise foi realizada em uma solução tampão PBS.

II. Preparação de proteína de fusão compreendendo proteína de alvejamento de membrana externa mitocondrial e proteína de alvejamento alvo Exemplo 6. Preparação de proteína de fusão compreendendo scFvHER2 Exemplo 6.1. Síntese do gene scFvHER2

[0253] De modo a expressar o scFvHER2 humano em uma proteína recombinante, o gene scFvHER2 obtido requerendo-se a síntese gênica da Bionics Co., Ltd. foi designado como pUC57-scFvHER2 e a sequência de base de scFvHER2 foi a mesma como a sequência de base da SEQ ID NO: 37.

Exemplo 6.2. Preparação do vetor de expressão de proteína scFvHER2 Exemplo 6.2.1. pET15b-UB-scFvHER2-TOM7

[0254] De modo a preparar uma proteína scFvHER2 na forma à qual ubiquitina e TOM7 que se ligam à membrana externa mitocondrial foram fundidos, o vetor de expressão capaz de expressar o gene de scFvHER2 na forma à qual ubiquitina e TOM7 foram fundidos foi preparado.

[0255] O gene de pUC57-scFvHER2 plasmídico obtido no Exemplo 6.1. foi clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI e o fragmento de DNA de cerca de

750 bp foi obtido por eletroforese em gel de agarose a 2 % e depois o mesmo foi inserido em um vetor de pET15b-UB-(p53)-TOM7 clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET15b-UB- scFvHER2-TOM7 (Figura 39). Neste caso, UB-scFvHER2-TOM7 foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 38.

[0256] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando o plasmídeo pET15b-UB-scFvHER2-TOM7. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB sob a condição de 37 °C. Depois, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 1 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0257] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 44, foi confirmado que uma proteína scFvHER2 tendo um tamanho de cerca de 35 kDa na forma à qual ubiquitina e TOM7 foram fundidos foi expressada. Neste caso, a faixa M na Figura 44 mostra um marcador de peso molecular proteico, a faixa 1 mostra o precipitado centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG e a faixa 2 mostra o sobrenadante centrifugado depois que E. coli foi triturada.

Exemplo 6.2.2. Preparação de pCMV-scFvHER2-TOM7-myc/His

[0258] De modo a preparar uma proteína scFvHER2 na forma à qual TOM7 que se liga à membrana externa mitocondrial foi fundido, um vetor de expressão para células animais capazes de expressar scFvHER2 na forma à qual TOM7 foi fundido foi preparado. De modo a obter os genes de TOM7 e scFvHER2, iniciador RscFvHER2 e iniciador XTOM7(noT) foram preparados. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 11 abaixo.

[Tabela 11] iniciador sequência seq id no.

rscfvher2 5’-aaa aaa gaa ttc atg gaa gtg caa ctt gtt gag agt gg -3’ seq id no: 39 xtom7(not) 5’- aaa aaa ctc gag tcc cca aag tag gct caa aac ag-3’ seq id no: 40

[0259] O plasmídeo pET15b-UB-scFvHER2-TOM7 obtido no Exemplo 6.2.1.

foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador (RscFvHER2) e 0,2 pmol de iniciador (XTOM7(noT)) foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, as reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter um gene scFvHER2-TOM7. O gene scFvHER2-TOM7 amplificado foi clivado pelas enzimas de restrição EcoRI e XhoI e os fragmentos de DNA de cerca de 850 bp, respectivamente, foram obtidos por eletroforese em gel de agarose a 1 % e depois inseridos em um vetor de pcDNA3,1-myc/His A clivado pelas enzimas de restrição EcoRI e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pCMV-scFvHER2-TOM7-myc/His (Figura 45).

[0260] Neste caso, scFvHER2-TOM7-myc/His foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 41. O mesmo foi transfectado em uma célula CHO animal usando o plasmídeo pCMV-scFvHER2-TOM7-myc/His e as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada e isto foi mostrado por Western blot usando um anticorpo anti-c-myc. Como mostrado na Figura 46, foi confirmado que uma proteína scFvHER2 tendo um tamanho de cerca de 35 kDa na forma à qual TOM7 foi fundido foi expressada. Neste caso, a faixa M na Figura 46 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra que o mesmo foi transfectado em uma célula CHO animal e as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada e depois isto foi confirmado por Western blot usando um anticorpo anti-c-myc.

Exemplo 6.3. Isolamento e purificação de proteína recombinante UB- ScFvHER2-TOM7 derivada de E. coli

[0261] A proteína UB-ScFvHER2-TOM7 foi isolada e purificada no mesmo método como no Exemplo 1.3.1. Como um resultado, a proteína UB-ScFvHER2- TOM7 foi eluída (Figura 47). Neste caso, a faixa M na Figura 47 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra uma amostra de carga de cromatografia de afinidade por níquel. A faixa 2 mostra que a mesma não foi ligada a uma resina de afinidade por níquel. A faixa 3 mostra os resultados da eluição com 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/10 mM de Imidazol. As faixas 4 a 5 mostram os resultados da eluição com 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/50 mM de Imidazol. As faixas 6 a 8 mostram os resultados da eluição com 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/100 mM de Imidazol. As faixas 9 a 10 mostram os resultados da eluição com 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/250 mM de Imidazol. A faixa 11 mostra os resultados da eluição com 8 M de UREIA/50 mM de fosfato de Na/500 mM de NaCl/500 mM de Imidazol.

[0262] A quantidade de proteína da solução eluída recuperada foi medida pelo método de quantificação proteica e confirmada usando SDS-PAGE. Como mostrado na Figura 48, depois que a confirmação foi concluída, a proteína UB-ScFvHER2- TOM7 foi extinta com o nitrogênio líquido e armazenada em um congelador criogênico a -80 °C. Neste caso, a faixa M na Figura 48 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra a proteína UB-ScFvHER2-TOM7 obtida depois da diálise em solução tampão PBS.

Exemplo 7. Preparação de proteína de fusão compreendendo scFvMEL Exemplo 7.1. Síntese do gene scFvMEL

[0263] De modo a expressar o scFvMEL humano em uma proteína recombinante como um fragmento de anticorpo contra melanoma, o gene scFvMEL obtido requerendo-se a síntese gênica da Bionics Co., Ltd. foi designado como pUC57-scFvMEL e a sequência de base de scFvMEL foi a mesma como a sequência de base da SEQ ID NO: 42.

Exemplo 7.2. Preparação do vetor de expressão de proteína de scFvMEL Exemplo 7.2.1. Preparação de pET15b-UB-scFvMEL-TOM7

[0264] De modo a preparar uma proteína de scFvMEL na forma à qual ubiquitina e TOM7 que se ligam à membrana externa mitocondrial foram fundidos, um vetor de expressão capaz de expressar scFvMEL na forma à qual ubiquitina e TOM7 foram fundidos foi preparado.

[0265] O gene de pUC57-scFvMEL plasmídico obtido no Exemplo 7.1. foi clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI e o fragmento de DNA de cerca de 750 bp foi obtido por eletroforese em gel de agarose a 2 % e depois inserido em um vetor de pET15b-UB-(p53)-TOM7 clivado pelas enzimas de restrição SacII e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pET15b-UB-scFvMEL-TOM7 (Figura 49). Neste caso, UB-scFvMEL-TOM7 foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 43.

[0266] A cepa de E. coli BL21(DE3) foi transformada usando o plasmídeo pET15b-UB-scFvMEL-TOM7. Posteriormente, a cepa transformada foi cultivada em um meio sólido Luria-Bertani (LB) ao qual o antibiótico ampicilina foi adicionado e depois as colônias obtidas aqui foram cultivadas em um meio líquido LB em uma incubadora de agitação a 37 °C. Posteriormente, quando a densidade celular atingiu cerca de 0,2 de absorbância em OD600, IPTG foi adicionado de modo que uma concentração final de 1 mM fosse preparada e depois a cultura em agitação foi realizada ainda por cerca de 4 horas.

[0267] Uma porção de células de E. coli foi obtida por centrifugação e depois as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada.

Como mostrado na Figura 50, foi confirmado que uma proteína de scFvMEL tendo um tamanho de cerca de 35 kDa na forma à qual ubiquitina e TOM7 foram fundidos foi expressada. Neste caso, a faixa M na Figura 50 mostra um marcador de peso molecular proteico, a faixa 1 mostra o precipitado centrifugado depois que E. coli foi triturada 4 horas depois de adicionar IPTG e a faixa 2 mostra o sobrenadante centrifugado depois que E. coli foi triturada.

Exemplo 7.2.2. Preparação de pCMV-scFvMEL-TOM7-myc/His

[0268] De modo a preparar uma proteína de scFvMEL na forma à qual TOM7 que se liga à membrana externa mitocondrial foi fundido, um vetor de expressão para células animais capazes de expressar scFvMEL na forma à qual TOM7 foi fundido foi preparado. De modo a obter os genes de TOM7 e scFvMEL, um iniciador (RscFvMEL) foi preparado. A sequência de cada iniciador é como descrita na Tabela 12 abaixo.

[Tabela 12] Iniciador Sequência SEQ ID NO. 5’- AAA AAA GAA TTC ATG AAA ACA AGT AAC CCA RscFvMEL SEQ ID NO: 44 GGA GTG-3’

[0269] O plasmídeo pET15b-UB-scFvMEL-TOM7 obtido no Exemplo 6.2.1. foi usado como um padrão e 0,2 pmol de iniciador RscFvMEL e 0,2 pmol de iniciador XTOM7(noT) foram misturados com dNTP a 0,2 nM, 1x solução tampão de reação em DNA polimerase AccuPrime Taq (Invitrogen, USA) e 1 unidade de DNA polimerase AccuPrime Taq. Posteriormente, em um aparelho de reação em cadeia de polimerase, reações de amplificação de 95 °C por 40 segundos, 58 °C por 30 segundos, 72 °C por 1 minuto foram realizadas em 25 ciclos para obter scFvMEL-TOM7. O gene de scFvMEL-TOM7 amplificado foi clivado pelas enzimas de restrição EcoRI e XhoI e o fragmento de DNA de cerca de 850 bp foi obtido por eletroforese em gel de agarose a 1 %. Depois, o mesmo foi inserido em um vetor de pcDNA3,1-myc/His A clivado pelas enzimas de restrição EcoRI e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pCMV-scFvMEL-TOM7-myc/His (Figura 51). Aqui, scFvMEL-TOM7-myc/His foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 45.

[0270] O mesmo foi transfectado em uma célula CHO animal usando o plasmídeo pCMV-scFvMEL-TOM7-myc/His e as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada e isto foi mostrado por Western blot usando um anticorpo anti-c-myc. Como mostrado na Figura 52, foi confirmado que uma proteína de scFvMEL tendo um tamanho de cerca de 35 kDa na forma à qual TOM7 foi fundido foi expressada. Neste caso, a faixa M na Figura 52 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra que o mesmo foi transfectado em uma célula CHO animal e as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada e depois isto foi confirmado por Western blot usando um anticorpo anti-c-myc.

Exemplo 8. Preparação de proteína de fusão compreendendo scFvPD-L1 Exemplo 8.1. Síntese do gene scFvPD-L1

[0271] De modo a expressar o scFvPD-L1 humano em uma proteína recombinante, o gene de scFvPD-L1 obtido requerendo-se a síntese gênica da Bionics Co., Ltd. foi designado como pUC57-scFvPD-L1, cuja sequência de base foi a mesma como a sequência de base da SEQ ID NO: 46.

Exemplo 8.2. Preparação do vetor de expressão de proteína de scFvPD-L1 Exemplo 8.2.1. Preparação de pCMV-scFvPD-L1-TOM7-myc/His

[0272] De modo a preparar uma proteína de scFvPD-L1 na forma à qual TOM7 que se liga à membrana externa mitocondrial foi fundido, um vetor de expressão para células animais capazes de expressar scFvPD-L1 na forma à qual ubiquitina e TOM7 foram fundidos foi preparado.

[0273] O plasmídeo pUC57-scFvPD-L1 foi clivado pelas enzimas de restrição EcoRI e XhoI e o fragmento de DNA de cerca de 760 bp foi obtido por eletroforese em gel de agarose a 1 %. Depois, o mesmo foi inserido em um vetor de pCMV-(scFvMEL)- TOM7-myc/His clivado pelas enzimas de restrição EcoRI e XhoI usando uma T4DNA ligase para obter o plasmídeo pCMV-scFvPD-L1-TOM7-myc/His (Figura 53). Neste caso, scFvPD-L1-TOM7-myc/His foi representado pela sequência de base da SEQ ID NO: 47.

[0274] O mesmo foi transfectado em uma célula CHO animal usando o plasmídeo pCMV-scFvPD-L1-TOM7-myc/His e as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada e isto foi mostrado por Western blot usando um anticorpo anti-c-myc. Como mostrado na Figura 54, foi confirmado que uma proteína de scFvPD-L1 tendo um tamanho de cerca de 35 kDa na forma à qual TOM7 foi fundido foi expressada. Neste caso, a faixa M na Figura 54 mostra um marcador de peso molecular proteico e a faixa 1 mostra que o mesmo foi transfectado em uma célula CHO animal e as células foram trituradas e depois eletroforese em SDS-poliacrilamida foi realizada e depois isto foi confirmado por Western blot usando um anticorpo anti-c-myc.

III. Preparação de mitocôndrias modificadas às quais a proteína de fusão foi ligada Exemplo 9. Preparação de mitocôndrias modificadas

[0275] O experimento seguinte foi conduzido para confirmar se a proteína fluorescente fundida com o sítio de ligação à membrana externa mitocondrial se liga à membrana externa das mitocôndrias. Primeiro, as mitocôndrias foram isoladas de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical (UC-MSCs) pelo método de centrifugação. Posteriormente, as mesmas foram manchadas com MitoTracker CMXRos Red. As mesmas foram misturadas com a proteína recombinante TOM70- (GGGGS)3-UB-GFP purificada a partir de E. coli no acima e incubadas na temperatura ambiente por cerca de 30 minutos.

[0276] Posteriormente, a proteína não reagida foi removida por centrifugação e lavada duas vezes com solução tampão PBS. Posteriormente, a proteína fluorescente na forma ligada às mitocôndrias foi observada usando um microscópio de fluorescência. Como um grupo de controle, a proteína GFP purificada que não compreende um sítio de ligação à membrana externa mitocondrial foi usada. Como um resultado, foi confirmado que a proteína fluorescente fundida com o sítio de ligação à membrana externa mitocondrial (TOM70-(GGGGS)3-UB-GFP) foi localizada no mesmo local como as mitocôndrias de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical (UC-MSC) (Figura 55a, Figura 55b).

Exemplo 10. Confirmação da capacidade da proteína recombinante p53 de se ligar à membrana externa mitocondrial estranha

[0277] As mitocôndrias que foram isoladas de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical usando método de centrifugação foram misturadas com a proteína recombinante purificada TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 ou UB-p53-TOM7 e foram deixadas ligadas em uma razão de 1:1 sob uma condição de reação de 4 °C por 1 hora. Como um grupo de controle, as mitocôndrias que não foram misturadas com a proteína foram usadas. A capacidade de ligação entre as mitocôndrias e p53 foi confirmada através de um método experimental de Western blot (Figura 56).

[0278] Primeiro, as mitocôndrias e a proteína de p53 foram ligadas e depois a centrifugação foi realizada em 13.000 rpm por 10 minutos para obter as mitocôndrias ou as mitocôndrias às quais p53 foi ligada na forma de um precipitado. A proteína que não foi ligada às mitocôndrias foi removida através de um processo de lavagem de PBS duas vezes e o precipitado lavado foi submetido à proteína eletroforese (SDS- PAGE) e depois Western Blot. Anticorpo anti-p53 de coelho foi usado como um anticorpo primário e HRP anti-IgG de coelho foi usado como um anticorpo secundário.

A banda foi confirmada na mesma posição como um tamanho de 60 kDa, que é um peso molecular esperado no grupo experimental para mitocôndrias se ligaram a TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 ou UB-p53-TOM7, comparado ao grupo de controle para mitocôndrias sozinhas que não se ligaram à proteína (Figura 56).

IV. Confirmação da atividade de mitocôndrias modificadas às quais a proteína ativa foi ligada

Exemplo 11. Isolamento e injeção intracelular de mitocôndrias estranhas

[0279] As mitocôndrias foram isoladas de células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical (UC-MSCs) usando o método de centrifugação. As mitocôndrias isoladas foram manchadas com Mitotracker CMX Ros e a concentração e a quantidade total das mitocôndrias isoladas foi confirmada por método de quantificação de BCA e 0 ug, 1 ug, 5 ug, 10 ug, 50 ug, 100 ug de mitocôndrias foram injetadas em células SNU-484, uma linhagem celular de câncer gástrico, usando o método de centrifugação. Como um resultado do experimento, foi confirmado que o grau de mitocôndrias injetadas nas células foi dependente da concentração na quantidade de mitocôndrias por um microscópio de fluorescência (Figura 57).

Exemplo 12. Confirmação da influência de mitocôndrias normais sobre células cancerosas

[0280] O experimento seguinte foi conduzido para investigar como as mitocôndrias derivadas de células normais têm uma influência sobre a proliferação de células cancerosas e produção de ROS. Primeiro, células hepáticas (WRL-68), fibroblastos e células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical (UC-MSCs) foram selecionadas como células doadoras de mitocôndrias. As mitocôndrias foram isoladas das células por um método de fracionamento por centrifugação, respectivamente. A célula cancerosa usada como uma célula receptora de mitocôndrias foi uma célula cancerosa epidérmica, linhagem de célula A431. Neste caso, as mitocôndrias foram liberadas nas células cancerosas epidérmicas usando força centrífuga de acordo com a concentração (consultar o Pedide de Patente Coreano No 10-2017-0151526).

[0281] Depois de 24, 48 e 72 horas depois da introdução, a proliferação de células cancerosas epidérmicas e a produção de espécies de oxigênio reativo (ROS) foram observadas. Como um resultado, foi confirmado que quando mitocôndrias obtidas de células normais de várias origens foram injetadas em células cancerosas,

houve um efeito de inibir a proliferação de células cancerosas dependendo da concentração. Além disso, foi confirmado que a produção de ROS em células cancerosas foi inibida dependendo da concentração de mitocôndrias normais (Figuras 58 e 59).

Exemplo 13. Confirmação da influência de mitocôndrias normais sobre a resistência medicamentosa

[0282] Foi investigado como influenciar sobre a resistência medicamentosa, a expressão de um gene antioxidante, metástase do câncer (metástase), que são características de células cancerosas, quando mitocôndrias derivadas de células normais foram injetadas em células cancerosas, pelos métodos seguintes. Primeiro, células hepáticas normais (WRL-68) foram estabelecidas como células doadoras de mitocôndrias e as mitocôndrias foram isoladas das células por método de fracionamento por centrifugação e as mitocôndrias foram usadas. Células HepG2, uma linhagem celular de câncer hepático, foram usadas como células cancerosas usadas como células receptoras de mitocôndrias. As mitocôndrias foram liberadas nas células de câncer hepático usando força centrífuga de acordo com a concentração e depois foi confirmado que como um resultado da observação da resistência medicamentosa à doxorrubicina, um agente anticâncer, linhagens de célula cancerosa que receberam mitocôndrias mostraram sensibilidade mais alta ao fármaco (Figura 60).

Exemplo 14. Confirmação da influência de mitocôndrias normais sobre o efeito antioxidante

[0283] Visto que as mitocôndrias isoladas de células normais foram injetadas em células HepG2, uma linhagem celular de câncer hepático, de acordo com a concentração, foi confirmada que a expressão de enzima catalase, uma proteína antioxidante e genes de SOD-2 (superoxide dismutase-2) em células cancerosas foram aumentadas (Figura 61).

Exemplo 15. Confirmação da influência de mitocôndrias normais sobre a metástase de célula cancerosa

[0284] Em relação à metástase, foi confirmado se houve a expressão do gene de α-actina do músculo liso (α-SMA), um dos genes envolvidos em EMT (transcrição epitelial a mesenquimal). Neste caso, foi descoberto que, no caso de células do câncer hepático que receberam mitocôndrias, a expressão da proteína α-SMA foi significativamente reduzida dependendo da concentração das mitocôndrias, comparado às células de câncer hepático que não receberam mitocôndrias. Ao contrário, foi descoberto que a proteína E-caderina, uma das proteínas de adesão celular, foi aumentada dependendo da concentração de mitocôndrias (Figura 62). Foi confirmado que as mudanças de proteínas conhecidas como envolvidas na metástase do câncer são feitas por mitocôndrias normais injetadas nas células cancerosas e assim também influenciam a metástase de células cancerosas.

Exemplo 16. Confirmação da carga de proteína recombinante p53 sobre membrana externa mitocondrial estranha e injeção em células

[0285] As mitocôndrias foram isoladas de células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical usando método de centrifugação e depois foram manchadas com Mitotracker CMX Ros e foram misturadas com a proteína recombinante purificada TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 ou UB-p53-TOM7 e foram incubadas em uma razão de 1:1 sob uma condição de reação de 4 °C por 1 hora e depois foram centrifugadas para remover as proteínas não reagidas e depois foram lavadas duas vezes com solução tampão PBS e depois as mitocôndrias na forma à qual proteína de p53 foi ligada foram injetadas em células SNU-484, uma linhagem celular de câncer gástrico, pelo método de centrifugação (Figura 63). Neste caso, um grupo de controle foi estabelecido a um grupo que não usou mitocôndrias e um grupo que usou mitocôndrias sozinhas. Depois de um dia de cultura, a proteína de p53 carregada nas mitocôndrias estranhas injetadas nas células foi observada com um microscópio de fluorescência usando imunocitoquímica (ICC).

[0286] Anticorpo anti-p53 de coelho foi usado como um anticorpo primário e Alexa Fluor 488 anti-IgG de coelho de cabra foi usado como um anticorpo secundário.

Como um resultado, foi confirmado que a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 (manchada de verde) ou UB-p53-TOM7 (manchada de verde) carregada nas mitocôndrias estranhas (manchadas de vermelho) foi localizada no citoplasma nas células que foram injetadas junto com as mitocôndrias estranhas durante a injeção nas células (Figura 64, ampliação de 200 e Figura 65, ampliação de 400). Como um resultado, foi descoberto que a proteína recombinante foi facilmente injetada na célula por intermédio das mitocôndrias.

Exemplo 17. Confirmação da atividade de mitocôndrias carregadas com p53 em linhagem de célula cancerosa Exemplo 17.1. Confirmação da capacidade de apoptose de mitocôndrias carregadas com p53 estranhas injetadas em células usando linhagem celular de câncer gástrico

[0287] As mitocôndrias isoladas de células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical usando o método de centrifugação foram misturadas com a proteína recombinante TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 ou UB-p53-TOM7 que foi purificada a partir de E. coli e foram deixadas ligadas em uma razão de 1:1 sob uma condição de reação de 4 °C por 1 hora. Como um grupo de controle, a proteína UB- p53 que não compreende TOM70 e TOM70-(GGGGS)3-p53 que não compreende ubiquitina foram usadas. As proteínas não ligadas foram removias por processo de centrifugação e lavagem de PBS e as mitocôndrias às quais as proteínas foram ligadas foram injetadas em uma linhagem celular de câncer gástrico SNU-484, que carece de capacidade de p53 devido à variação do gene p53, por centrifugação (Figura 66). Depois de um dia de cultura, a fixação foi realizada com paraformaldeído a 4 % por 1 hora e depois a permeabilização das células foi induzida usando a solução de permeabilização (0,1 % de tampão de citrato de sódio compreendendo 0,1 % de Triton-X-100, pH 7,4) e reagida com solução TUNEL (Kit de detecção de morte celular in situ, TMR RED, Roche) a 37 °C por 1 hora.

[0288] No método de análise TUNEL, a porção onde a fragmentação de ácido nucleico (fragmentação de DNA) ocorreu é manchada em cor vermelha, indicando que a apoptose ocorre. Comparado ao grupo de controle, nas células injetadas com as mitocôndrias às quais TOM70-(GGGGS)3-ub-p53 ou p53-TOM7 foi ligada, uma grande quantidade de porção manchada de vermelho foi encontrada, diferente do grupo de controle, indicando que a apoptose ocorreu pelas mitocôndrias às quais TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 ou UB-p53-TOM7 foi ligada. Em particular, foi confirmado que mais apoptose ocorreu nas mitocôndrias às quais a proteína na forma de TOM70- (GGGGS)3-UB-p53 foi ligada (Figura 67a).

Exemplo 17.2. Confirmação da capacidade de apoptose de mitocôndrias carregadas com p53 estranhas às quais a luciferase foi ligada

[0289] De modo a confirmar se a atividade biológica da proteína liberada TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 em uma célula receptora foi mantida depois que a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 na forma ligada às mitocôndrias obtidas no Exemplo 5.2. acima foi liberada nas células receptoras, uma análise com base em célula usando um gene repórter foi realizada. Visto que a proteína de p53 é um fator de transcrição, um gene em que a sequência de base RRRCWWGYYY (em que R representa G ou A, W representa A ou T e Y representa C ou T) à qual o fator de transcrição de p53 pode se ligar é repetida 6 vezes foi sintetizado com a sequência seguinte. A sequência de base de P53-promotor-S é como segue (5’-GGG CAT GCT

CGG GCA TGC CCG GGC ATG CTC GGG CAT GCC CGG GCA TGC TCG GGC ATG CCC-3’) (SEQ ID NO: 91) e a sequência de base de P53-promotor-AS é como segue (5’-GGG CAT GCC CGA GCA TGC CCG GGC ATG CCC GAG CAT GCC CGG GCA TGC CCG AGC ATG CCC-3’) (SEQ ID NO: 92).

[0290] 5 ug do gene P53-promotor-S sintetizado e 5 ug do gene P53- promotor-AS sintetizado foram incubados a 70 °C por 20 minutos para promover a síntese de gene de dupla hélice e depois a reação de fosforilação foi induzida usando uma enzima T4 cinase de polinucleotídeo. O gene de dupla hélice em que a fosforilação foi induzida foi inserido em um vetor de pGL3 clivado pela enzima de restrição Sma I e um gene em que a sequência de base (RRRCWWGYYY) à qual o fator de transcrição de p53 pode se ligar é repetida 6 vezes foi deixado ligado à luciferase, um gene repórter, para preparar o plasmídeo p6xp53-Luc. O plasmídeo p6xp53-Luc e o plasmídeo pRSVb-gal, um vetor de expressão de beta-galactosidase, foram transformados em células HEK293, células renais humanas, por método de lipofectamina.

[0291] Subsequentemente, depois de 6 horas, as células HEK293 foram tratadas com uma combinação em que 10 ug das mitocôndrias e 5 ug, 10 ug e 20 ug da proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 foi ligada, respectivamente. Neste caso, como um grupo de controle, as células foram tratadas com 10 ug das mitocôndrias às quais PBS ou a proteína de p53 foi ligada, respectivamente. As células tratadas foram cultivadas por 18 horas e depois a atividade de luciferase foi medida e analisada.

Neste caso, de modo a corrigir a eficiência de transformação, o valor de luciferase dividido pelo valor obtido medindo-se a atividade de beta-galactosidase foi determinado como um valor de luciferase corrigido.

[0292] Foi confirmado que o valor de luciferase foi aumentado nas células tratadas com uma combinação em que 10 ug das mitocôndrias e 5 ug, 10 ug e 20 ug da proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 foi ligado, respectivamente. Assim, foi confirmado que a proteína de p53 penetrou nas células e exibiu a atividade (Figura 67b).

Exemplo 18. Confirmação da capacidade de mitocôndrias estranhas carregadas com RKIP injetadas em células para reduzir a metástase da linhagem de célula cancerosa

[0293] As mitocôndrias isoladas de células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical usando o método de centrifugação foram misturadas com a proteína recombinante purificada TOM70-(GGGGS)3-UB-RKIP e foram deixadas ligadas em uma razão de 1:1 sob uma condição de reação de 4 °C por 1 hora. As mitocôndrias às quais a proteína foi ligada foram injetadas por centrifugação na linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231, que é conhecida como tendo capacidade de metástase aumentada devido a uma diminuição na proteína RKIP.

[0294] De modo a confirmar a capacidade de metástase de células cancerosas, um ensaio de invasão celular usando uma placa transwell foi realizado. A câmara superior transwell tendo um tamanho de poro de 8 μm foi revestida com matrigel por 30 minutos a 37 °C. Como um grupo de teste, as células MDA-MB-231 injetadas com mitocôndrias sozinhas e células MDA-MB-231 injetadas com mitocôndrias às quais a proteína RKIP foi ligada foram usadas. Cada célula em 1x105 células foi colocada em uma câmara superior transwell contendo meio isento de soro e um meio compreendendo soro bovino a 10 % foi colocada em uma câmara inferior. Depois de cultivar a 37 °C por 12 horas, a fixação foi realizada com paraformaldeído a 4 % por 1 hora e depois as células que passaram através de matrigel foram manchadas com violeta cristal a 1 %.

[0295] Como um resultado da observação sob um microscópio, as células manchadas em roxo foram observadas na membrana abaixo da câmara superior e este pode ser referido como um processo em que a metástase das células ocorreu.

Foi confirmado que as células manchadas em roxo foram reduzidas no grupo experimental tratado com mitocôndrias sozinhas e o grupo experimental tratado com mitocôndrias às quais RKIP foi ligada, comparado ao grupo de controle que não foi tratado com nada. Quatro partes foram aleatoriamente selecionadas e depois o número de células manchadas foi medido e foi plotado no gráfico (Figura 68).

IV. Confirmação da taxa de liberação de mitocôndrias modificadas às quais a proteína de alvejamento alvo foi ligada Exemplo 19. Confirmação da expressão intracelular de anticorpo de fragmento variável de cadeia única (ScFv) para alvejar células cancerosas e confirmação da ligação com mitocôndrias em células

[0296] De modo a expressar pCMV-ScFv-HER2-TOM7 ou pCMV-ScFv-MEL- TOM7 ou pCMV-ScFv-PD-L1-TOM7 em células animais, o DNA foi transfectado em células CHO usando Lipofectamina LTX e PLUS ou Lipofectamina 2000. O DNA de GFP-TOM7 foi usado como um grupo de controle. De modo a confirmar que as mesmas são expressadas em uma célula e se ligam às mitocôndrias na mesma célula, citosol e mitocôndrias foram isolados das células transfectadas usando o método de centrifugação e ajustados para a mesma quantidade de proteína usando um ensaio de BCA e depois PAGE eletroforese foi realizada e depois os resultados foram observados por Western blot. Anticorpo monoclonal c-myc foi usado como um anticorpo primário e HRP anti-IgG de camundongo foi usado como um anticorpo secundário.

[0297] As bandas de proteínas ScFv-HER2-TOM7 ou ScFv-MEL-TOM7 foram identificadas no tamanho esperado de 35 kDa. Com base em que todas foram identificadas na camada mitocondrial, pode ser esperado que as proteínas transfectadas e expressadas proteínas foram ligadas às mitocôndrias em células por TOM7 (Figura 69).

[0298] Em seguida, de modo a confirmar a ligação da proteína alvo expressada em uma célula às mitocôndrias na mesma célula, a proteína ScFv-HER2- TOM7, ScFv-MEL-TOM7 ou ScFv-PD-L1-TOM7 expressada na célula foi observada com um microscópio de fluorescência usando um método experimental de imunocitoquímica (ICC). O anticorpo monoclonal c-myc foi usado como um anticorpo primário e Alexa Fluor 488 anti-IgG de camundongo de cabra foi usado como um anticorpo secundário. As mitocôndrias na célula foram manchadas com Mitotracker CMX Ros. Como um resultado, foi confirmado que as proteínas ScFv-HER2-TOM7, ScFv-MEL-TOM7 ou ScFv-PD-L1-TOM7 expressadas foram colocalizadas com as mitocôndrias e foram ligadas às mitocôndrias na célula (Figuras 70 e 71).

Exemplo 20. Isolamento de mitocôndrias às quais o anticorpo de fragmento variável de cadeia única para alvejar células cancerosas foi ligado e comparação da injeção de mitocôndrias em linhagem celular de câncer gástrico

[0299] As mitocôndrias foram isoladas de células CHO em que pCMV-ScFv- HER2-TOM7 ou pCMV-ScFv-PD-L1-TOM7 foi transfectada. Como um grupo de controle, as mitocôndrias de células CHO que não foram transformadas foram isoladas e usadas. As mitocôndrias isoladas de cada célula foram manchadas com Mitotracker CMX Ros. SNU-484, uma linhagem celular de câncer gástrico, foi tratada com a mesma quantidade de mitocôndrias e no dia seguinte, o grau de mitocôndrias injetadas nas células foi comparado e confirmado usando um microscópio de fluorescência. Foi confirmado que, comparado ao grupo de controle, as mitocôndrias às quais ScFv-HER2-TOM7 ou ScFv-PD-L1-TOM7 foi ligada foram injetadas em células cancerosas mais do que as mitocôndrias obtidas do grupo de controle (Figura 72). Portanto, foi descoberto que as mitocôndrias às quais a proteína alvo foi ligada são mais facilmente injetadas em células cancerosas quando do uso de mitocôndrias sozinhas.

VI. Confirmação da atividade in vivo de mitocôndrias modificadas às quais a proteína ativa foi ligada Exemplo 21. Construção de modelo de xenoenxerto (SNU-484) e administração da substância de teste Exemplo 21.1. Preparação de células cancerosas

[0300] No dia do experimento, a linhagem de célula SNU-484, uma linhagem celular de câncer gástrico, foi preparada para ser 5 x 106 células por camundongo. O meio das células foi removido e depois PBS foi adicionada para lavar as células. As células foram dissociadas usando uma solução de Tripsina-EDTA e depois as células foram colocadas em um tubo de 50 mL e lavadas duas vezes com solução tampão PBS e depois 20 mL de PBS foram adicionados e o número de células e a viabilidade foram medidos. Com base no número medido de células, o número de células foi ajustado para ser 5 x 106 células por camundongo e as células foram preparadas dividindo-as em grupos. O volume a ser transplantado por camundongo foi ajustado para a mesma quantidade de 100 μL. Como um grupo de controle, 100 μL de um grupo de célula cancerosa sozinha foram preparados.

Exemplo 21.2. Preparação da substância de teste

[0301] As mitocôndrias isoladas das células-tronco mesenquimais do sangue do cordão umbilical como descrito acima foram preparadas para o transplante em uma quantidade de 50 μg por camundongo com base na concentração proteica. No caso de um grupo ao qual as mitocôndrias sozinhas foram administradas, as mitocôndrias foram preparadas misturando-se bem com 100 μL de PBS em que as células cancerosas foram misturadas. No caso do grupo de mitocôndrias modificadas, a proteína TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 foi misturada entre si em uma razão de concentração de 1:1 com a quantidade de mitocôndrias preparadas no tubo Eppendorf antes de misturar com células cancerosas e foi deixada na temperatura ambiente por 1 hora. Depois que o tempo de reação foi superior, o sobrenadante foi removido depois da centrifugação em 20.000 xg por 10 minutos e a pelota das mitocôndrias (MT+TOM70-(GGGGS)3-UB-p53) à qual uma proteína foi ligada foi obtida. A mesma foi lavada duas vezes usando solução tampão PBS e depois as mitocôndrias (MT+TOM70-(GGGGS)3-UB-p53) às quais a proteína de p53 foi ligada foram preparadas misturando-se bem com 100 μL de PBS em que células cancerosas foram misturadas.

Exemplo 21.3. Preparação do animal experimental e transplante da substância de teste

[0302] Para a amostra de transplante preparada pelos grupos, matrigel (BD) foi adicionado na mesma quantidade como aquela de PBS e levemente misturado com as células para preparar 200 μL de substância de teste por camundongo. Neste caso, todas as operações foram realizadas em gelo. Para a construção do modelo, camundongos nus Balb/c (fêmeas, 7semanas de idade) foram adquiridos da RAONBIO e anestesiados pela inalação de isoflurano para o transplante de células cancerosas e depois a área traseira direita (com base em animal) foi esterilizada com um algodão embebido em álcool. Posteriormente, 200 μL foram administrados subcutaneamente à área traseira direita do animal experimental usando uma seringa de 1 mL contendo a solução de injeção. Depois da administração, o peso do animal e o tamanho do tumor foram medidos duas vezes por semana e a análise dos resultados procedeu enquanto observando até 3 semanas (Figura 73).

Exemplo 21.4. Confirmação da formação do tumor

[0303] O volume do tumor foi calculado medindo-se o comprimento do eixo longo e o comprimento do eixo curto do tumor e aplicando-os à equação seguinte.

<Equação matemática 1> eixo longo X eixo curto X eixo curto X 0,5 = volume do tumor (mm^3) Exemplo 21.5. Observação da mudança fisiológica e morfológica

[0304] De modo a observar a mudança fisiológica e morfológica de camundongos por administração de candidatos anticâncer, as mudanças no peso corpóreo e no tamanho do tumor foram medidas duas vezes por semana a partir do momento da administração de células cancerosas e substâncias de teste (Figura 74).

[0305] O peso do camundongo foi medido usando uma escala e a mudança por grupo foi analisada usando os valores medidos duas vezes por semana (Figura 75). Foi confirmado que não houve nenhuma diferença significativa na mudança no peso corpóreo por 3 semanas entre o grupo em que as mitocôndrias não foram injetadas, o grupo ao qual as mitocôndrias foram administradas sozinhas e o grupo em que as mitocôndrias modificadas foram injetadas. O tamanho do tumor foi calculado medindo-se o comprimento do eixo longo (comprimento) e eixo curto (largura) do tumor usando um calibre e depois aplicando-os à equação da Equação matemática 1 acima. A mudança por grupo foi analisada usando os valores medidos duas vezes por semana (Figura 76). Foi descoberto que o tamanho do tumor foi significativamente aumentado com o passar do tempo no grupo que não foi tratado com mitocôndrias, ao passo que no caso de camundongos que foram administrados com mitocôndrias, o aumento no tamanho do tumor reduziu com o passar do tempo.

Além disso, foi confirmado que o aumento no tamanho do tumor foi significativamente diminuído no grupo que foi administrado com mitocôndrias sobre as quais a proteína de p53 foi carregada, comparado ao grupo que foi administrado com mitocôndrias sozinhas (Figura 76).

Exemplo 22. Confirmação do efeito de mitocôndrias modificadas sobre a inibição da proliferação de células de câncer de pele

[0306] As mitocôndrias obtidas acima às quais p53 foi ligada foram liberadas às células A431, que são células de câncer de pele, pelo método de centrifugação e depois a proliferação de células A431 foi observada. Neste caso, solução salina fisiológica foi usada como um grupo de controle e uma quantidade equivalente de mitocôndrias às quais a proteína de p53 não foi fundida foi usada como um grupo de teste de controle. Foi confirmado que as mitocôndrias sobre as quais a proteína de p53, uma proteína que induz apoptose, foi carregada podem inibir significativamente a proliferação de células A431, comparado ao grupo de controle e ao grupo em que apenas as mitocôndrias foram usadas (Figura 76).

V. Confirmação da atividade de mitocôndrias isoladas Exemplo 23. Confirmação da função de mitocôndrias isoladas: teor de ATP

[0307] De modo a isolar as mitocôndrias intracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical (UC-MSCs), a homogeneização foi realizada usando uma seringa para romper as células e depois centrifugação contínua foi realizada para obter as mitocôndrias. De modo a confirmar a função das mitocôndrias isoladas, a concentração proteica mitocondrial das mitocôndrias isoladas foi quantificada através de um ensaio BCA para preparar 5 μg das mitocôndrias. A quantidade de ATP nas mitocôndrias foi confirmada usando um kit de luminescência CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI).

[0308] As mitocôndrias preparadas foram misturadas em 100 ul de PBS e depois preparadas em uma placa de 96 poços e comparadas a 100 ul de PBS não continha mitocôndrias como um grupo de controle. 100 µL da solução de teste que foi incluída no kit foram adicionados da mesma maneira e reagidos e misturados bem por 2 minutos em um agitador e depois reagidos na temperatura ambiente ou 10 minutos e depois a quantidade de ATP foi medida usando um Leitor de microplaca de luminescência. Foi confirmado que ATP foi aumentada quando mitocôndrias foram incluídas comparado ao grupo de controle e a função das mitocôndrias foi confirmada (Figura 78).

Exemplo 24. Confirmação da função das mitocôndrias isoladas: potencial de membrana

[0309] De modo a confirmar o potencial de membrana das mitocôndrias isoladas, corante JC-1 (molecular probes, cat no1743159) foi usado. As mitocôndrias preparadas foram misturadas em 50 µL de PBS e depois preparadas em uma placa de 96 poços. O grupo de PBS (50 µL) não continha mitocôndrias como um grupo de controle e grupo de tratamento de CCCP (R&D systems, CAS 555-60-2) foram preparados. CCCP, um ionóforo de mitocôndrias, inibe a função mitocondrial por despolarização do potencial de membrana mitocondrial. O grupo de CCCP foi reagido com as mitocôndrias isoladas em 50 μM por 10 minutos na temperatura ambiente.

[0310] Posteriormente, o mesmo foi reagido com corante JC-1 (2 μM) da mesma maneira e depois a absorbância foi medida usando uma propriedade tendo um diferente espectro de acordo com a concentração gerada por uma mudança no potencial de membrana. Em concentrações baixas, o mesmo existe como um monômero e exibe fluorescência verde e em concentrações altas, o corante agrega (agregado de J) para inibir fluorescência vermelha. O potencial de membrana mitocondrial foi analisado calculando-se a razão de absorbância de verde para absorbância de vermelho. Depois que a reação foi concluída, o potencial de membrana mitocondrial foi medido usando um leitor de microplaca de fluorescência (Monômero: Ex 485/In 530, agregado de J: Ex 535/In 590). Os resultados são mostrados na Figura 79.

Exemplo 25. Confirmação do grau de dano de mitocôndrias isoladas através da confirmação da produção de mROS

[0311] De modo a confirmar se 5 μg de mitocôndrias preparadas como descrito acima é danificado, um corante indicador de vermelho MitoSOX (Invitrogen, cat no M36008) capaz de analisar espécies de oxigênio reativo mitocondriais nas mitocôndrias isoladas foi usado. As mitocôndrias preparadas foram misturadas em 50 µL de PBS e depois preparadas em uma placa de 96 poços e comparadas a 50 µL de PBS não continham mitocôndrias como um grupo de controle. O corante vermelho MitoSOX foi misturado em 50 µL de PBS para ser uma concentração de 10 μM e colocado em uma placa de 96 poços (concentração final de 5 μM) e depois reagido em uma incubadora de CO2 a 37 °C por 20 minutos. Depois que a reação foi concluída, a quantidade de ROS nas mitocôndrias foi medido usando um leitor de microplaca (Ex 510/In 580). Os resultados são mostrados na Figura 80.

VI. Confirmação da dissociação de proteína desejada ligada à proteína de membrana externa mitocondrial fora e dentro das células Exemplo 26. Confirmação da dissociação de proteína desejada ligada à proteína de membrana externa mitocondrial fora das células

[0312] De modo a obter uma proteína desejada em uma forma livre quando a proteína ativa ligada com as mitocôndrias foi injetada na célula, uma proteína de fusão (TOM70-UB-p53 ou TOM-UB-GFP) na forma em que a proteína ubiquitina foi inserida entre a proteína de membrana externa mitocondrial e a proteína desejada foi preparada a partir de E. coli. De modo a confirmar se a sequência de ubiquitina foi clivada por UBP1, uma enzima de clivagem de ubiquitina, a proteína de fusão recombinante TOM70-UB-p53 foi reagida com a enzima UBP1 a 37 °C por 1 hora.

[0313] Posteriormente, como um resultado da análise por eletroforese SDS- PAGE, foi confirmado que a dissociação da proteína ubiquitina da proteína de fusão não ocorreu de forma alguma por UBP1. Este foi considerado um fenômeno de interferência da proteína de membrana externa mitocondrial estruturalmente e assim, um composto de proteína ligante do aminoácido glicina e serina foi inserido entre a proteína de membrana externa mitocondrial e a proteína ubiquitina e uma nova proteína de fusão (TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 ou TOM70-(GGGGS)3-UB-GFP) foi obtida por purificação a partir de E. coli e depois reagida com a enzima UBP1 a 37 °C por 1 hora como descrito acima. Como um resultado, isto foi confirmado através de eletroforese SDS-PAGE que a extremidade 3’ de ubiquitina foi clivada pela enzima UBP1 e apenas a proteína de p53 foi dissociada como esperado (Figura 82).

Exemplo 26. Confirmação da dissociação de proteína desejada ligada à proteína de membrana externa mitocondrial dentro das células

[0314] Quando a proteína de fusão (TOM70-(GGGGS)3-UB-p53 ou TOM70- (GGGGS)3-UB-GFP) obtida no exemplo acima penetra na célula em um estado de ser ligada às mitocôndrias, foi observado se a proteína ativa foi dissociada pela enzima de clivagem de ubiquitina presente na célula. Primeiro, as mitocôndrias obtidas de células mesenquimais do sangue do cordão umbilical e a proteína de fusão TOM70- (GGGGS)3-UB-GFP foram reagidas por 1 hora em um microtubo para permitir ser ligada e depois a proteína de fusão não ligada foi removida por centrifugação e depois lavada duas vezes com uma solução tampão PBS. Neste caso, a proteína de fusão (TOM70-(GGGGS)3-GFP) da qual a ubiquitina foi removida foi usada como um grupo de controle.

[0315] Posteriormente, a proteína ligada às mitocôndrias foi injetada em células MDA-MB-231, uma linhagem celular de câncer de mama, pelo método de centrifugação. Depois de um dia, as células MDA-MB-231 foram trituradas e fracionadas em uma parte mitocondrial e uma parte citosólica, respectivamente, usando gravidade diferenciada. Como um resultado da análise por eletroforese SDS- PAGE e análise Western blot, foi descoberto que no caso da proteína de fusão em que ubiquitina foi incluída, proteínas GFP dissociadas da proteína de membrana externa mitocondrial, uma proteína ligante e ubiquitina foram principalmente detectadas em uma parte citosólica e foi descoberto que no caso da proteína de fusão da qual a ubiquitina foi removida, proteínas GFP na forma à qual a proteína de membrana externa mitocondrial e uma proteína ligante foram ligadas foram principalmente detectadas em uma parte parcial mitocondrial (Figura 83).

[0316] Como um resultado, foi descoberto que quando a proteína de membrana externa mitocondrial-ligante-ubiquitina-proteína ativa ligada às mitocôndrias foi injetada nas células, o sítio de conexão de ubiquitina e proteína ativa foi clivado e a proteína ativa dissociada foi liberada para o citoplasma e foi descoberto que através disto, as mitocôndrias podem ser usadas como um veículo de liberação como um dos métodos para liberar eficazmente uma proteína útil nas células.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Mitocôndrias modificadas, CARACTERIZADAS pelo fato de que uma proteína estranha é ligada à membrana externa das mitocôndrias.

2. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADAS pelo fato de que as mitocôndrias são isoladas de células ou tecidos.

3. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADAS pelo fato de que a célula é qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em células somáticas, células germinativas, células-tronco e uma combinação das mesmas.

4. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha compreende uma proteína desejada capaz de funcionar dentro e fora da célula.

5. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha compreende um peptídeo de ancoragem de mitocôndrias.

6. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha é ligada à membrana externa das mitocôndrias por um peptídeo de ancoragem de mitocôndrias.

7. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADAS pelo fato de que o peptídeo de ancoragem de mitocôndrias compreende uma região de terminal N ou uma região de terminal C de uma proteína presente na proteína de membrana mitocondrial.

8. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADAS pelo fato de que a região de terminal N ou a região de terminal C da proteína presente na proteína de membrana mitocondrial está localizada na membrana externa das mitocôndrias.

9. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína presente na proteína de membrana mitocondrial é qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70, OM45, TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B.

10. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADAS pelo fato de que o peptídeo de ancoragem compreende uma região de terminal N de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70 e OM45.

11. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADAS pelo fato de que o peptídeo de ancoragem de mitocôndrias compreende uma região de terminal C de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B.

12. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha é uma proteína de fusão compreendendo um peptídeo de ancoragem de mitocôndrias e uma proteína desejada capaz de funcionar dentro e fora da célula.

13. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína desejada é qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em uma proteína ativa que exibe uma atividade em uma célula, uma proteína presente em uma célula e uma proteína tendo a capacidade de se ligar a um ligante ou receptor presente em uma membrana celular.

14. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína desejada é qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em p53, Granzima B, Bax, Bak, PDCD5, E2F, AP-1(Jun/Fos), EGR-1, Retinoblastoma (RB), homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), E-caderina, Neurofibromina-2 (NF-2), poli[ADP-ribose] sintase 1 (PARP-1), BRCA-1, BRCA-2, Polipose coli adenomatosa (APC), Fator associado ao receptor do fator de necrose tumoral (TRAF), proteína inibitória de RAF cinase (RKIP), p16, KLF- 10, LKB1, LHX6, C-RASSF, DKK-3PD1, Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc.

15. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha é uma proteína desejada ligada à região de terminal N de TOM20, TOM70 ou OM45.

16. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha é ligada na ordem seguinte: terminal N-região de terminal N de TOM20, TOM70 ou OM45-proteína desejada-terminal C.

17. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha compreende ainda uma sequência de aminoácido reconhecida por uma enzima proteolítica em células eucarióticas ou ubiquitina ou um fragmento da mesma entre o peptídeo de ancoragem e a proteína desejada.

18. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADAS pelo fato de que o fragmento de ubiquitina compreende o Gly- Gly de terminal C de uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71 e compreende 3 a 75 aminoácidos consecutivos a partir do terminal C.

19. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha compreende ainda um ligante entre uma proteína desejada e ubiquitina ou um fragmento da mesma.

20. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADAS pelo fato de que o ligante é composto de 1 a 150 aminoácidos.

21. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADAS pelo fato de que o ligante é composto de 5 a 50 aminoácidos consistindo em glicina e serina.

22. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 21,

CARACTERIZADAS pelo fato de que o ligante é (G4S)n, em que n é um número inteiro de 1 a 10.

23. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína tendo a capacidade de se ligar a um ligante ou receptor presente em uma membrana celular é um ligante ou receptor presente na superfície de uma célula tumoral.

24. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADAS pelo fato de que o ligante ou receptor presente na superfície de uma célula tumoral é qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em CD19, CD20, antígeno de melanoma E(MAGE), NY-ESO-1, antígeno carcino-embrionário (CEA), mucina 1 associada à superfície celular (MUC-1), fosfatase ácida prostática (PAP), antígeno específico da próstata (PSA), survivina, proteína 1 relacionada à tirosina (tyrp1), proteína 1 relacionada à tirosina (tyrp2), Brachyury, Mesotelina, Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2), ERBB2, proteína do tumor de Wilms (WT1), FAP, EpCAM, PD-L1, ACPP, CPT1A, IFNG, CD274, FOLR1, EPCAM, ICAM2, NCAM1, LRRC4, UNC5H2 LILRB2, CEACAM, Nectina-3 ou uma combinação dos mesmos.

25. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha é ligada a uma região de terminal C de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B.

26. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha é ligada na ordem seguinte: terminal N-proteína desejada-região de terminal C de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl- 2, Bcl-x e VAMP1B-terminal C.

27. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADAS pelo fato de que a proteína estranha compreende ainda um ligante entre a proteína desejada e a região de terminal C de qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl- 2, Bcl-x e VAMP1B.

28. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADAS pelo fato de que o ligante é composto de 1 a 150 aminoácidos.

29. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADAS pelo fato de que o ligante é composto de 5 a 50 aminoácidos consistindo em glicina e serina.

30. Mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADAS pelo fato de que o ligante é (G4S)n, em que n é um número inteiro de 1 a 10.

31. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendendo uma mitocôndria modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30 como um ingrediente ativo.

32. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição farmacêutica é para a prevenção ou tratamento do câncer.

33. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em câncer gástrico, câncer hepático, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer cervical, câncer da tireoide, câncer da laringe, leucemia mieloide aguda, tumor cerebral, neuroblastoma, retinoblastoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de glândulas salivares e linfoma.

34. Uso de uma mitocôndria modificada, CARACTERIZADO pelo fato de ser como um meio de intracelular e liberação extracelular de uma proteína estranha compreendendo uma proteína desejada capaz de funcionar dentro e fora da célula.

35. Uso das mitocôndrias modificadas, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína estranha compreende um peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial e é ligada à membrana externa das mitocôndrias pelo peptídeo de ancoragem de membrana externa e é liberada dentro e fora da célula.

36. Proteína de fusão, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial e uma proteína desejada capaz de funcionar dentro e fora da célula.

37. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial compreende uma sequência de terminal N ou terminal C de uma proteína presente na membrana externa de mitocôndrias.

38. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial é qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em TOM20, TOM70, OM45, TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B.

39. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína desejada é qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em p53, Granzima B, Bax, Bak, PDCD5, E2F, AP-1(Jun/Fos), EGR-1, Retinoblastoma (RB), homólogo de fosfatase e tensina (PTEN), E-caderina, Neurofibromina-2 (NF-2), poli[ADP-ribose] sintase 1 (PARP-1), BRCA-1, BRCA-2, Polipose coli adenomatosa (APC), Fator associado ao receptor do fator de necrose tumoral (TRAF), proteína inibitória de RAF cinase (RKIP), p16, KLF-10, LKB1, LHX6, C-RASSF, DKK-3PD1, Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc.

40. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que quando o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial é TOM20, TOM70 ou OM45, o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial e a proteína desejada são ligados do terminal N ao terminal C.

41. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que quando o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial é qualquer uma selecionada a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B, a proteína desejada e o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial são ligados do terminal N ao terminal C.

42. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão compreende ainda ubiquitina ou um fragmento da mesma entre o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial e a proteína desejada.

43. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão compreende ainda uma sequência de aminoácido reconhecida por uma enzima proteolítica em células eucarióticas entre o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial e a proteína desejada.

44. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 43.

45. Método para preparar a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 43, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma etapa de transformar o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 44 em células procarióticas ou células eucarióticas sem uma enzima de degradação de ubiquitina ou uma enzima proteolítica em células eucarióticas; e uma etapa de obter uma proteína de fusão.

46. Proteína de fusão, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a proteína de alvejamento alvo tendo a capacidade de se ligar a um ligante ou receptor presente em uma membrana celular e o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial.

47. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial é qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em TOM5, TOM6, TOM7, TOM22, Fis1, Bcl-2, Bcl-x e VAMP1B.

48. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de alvejamento alvo tendo a capacidade de se ligar a um ligante ou receptor presente em uma membrana celular e o peptídeo de ancoragem de membrana externa mitocondrial são ligados do terminal N ao terminal C.

49. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de alvejamento alvo tendo a capacidade de se ligar a um ligante ou receptor presente em uma membrana celular é um anticorpo ou um fragmento do mesmo.

50. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento do anticorpo é qualquer um selecionado a partir do grupo consistindo em Fab, Fab’, scFv e F (ab)2.

51. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50.

52. Método para preparar mitocôndrias modificadas, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma etapa de misturar as mitocôndrias isoladas com a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 43 e/ou a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50.

53. Método, CARACTERIZADO pelo fato de ser para preparar mitocôndrias modificadas a partir das células transformadas injetando-se um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 41 e/ou a proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50 em células eucarióticas.