CN104357470B - 一种HtrA2融合基因及其应用 - Google Patents
一种HtrA2融合基因及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种HtrA2融合基因，该HtrA2融合基因能应用于防治由线粒体受损引起的病症。该基因由线粒体外膜蛋白USP30的定位序列与HtrA2的蛋白酶功能域及PDZ功能域融合而成。在细胞里表达后，MOM‑HtrA2蛋白能靶向定位到线粒体表面，将企图进入线粒体的各种变性蛋白降解，防止它们在线粒体内部积累，从根本上清除引发线粒体损伤的变性蛋白，解决了现有技术的抗氧化药物“治标”不“治本”的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种HtrA2融合基因及其应用。
背景技术
线粒体受损是器官退化性疾病的共同病理特征之一。已知的退行性神经疾病中，有不少是由于变性蛋白损伤了线粒体的结构和功能所引起的。例如老年痴呆症相关的Aβ蛋白片段、帕金森氏病相关的突变α-Synuclein蛋白、肌肉萎缩性侧面硬化病相关的突变SOD1蛋白等，都可以在线粒体表面或内部积累，并形成不溶性的蛋白聚集体，破坏线粒体结构，从而导致神经元死亡。除了这些由突变基因所引起的变性蛋白积累，在老年人的神经元中，由于蛋白合成的准确率以及蛋白酶体的活力下降，部分在细胞质里合成的线粒体蛋白存在突变却不能被及时降解清除。当它们转运进入线粒体后，也能形成不溶性蛋白聚集体，引起线粒体的结构损伤，导致老年性的退行性神经元死亡。
目前已有的线粒体保护技术很少，而且都“治标”不“治本”。由于变性蛋白在线粒体中积累后往往引起氧化性自由基的大量产生，造成线粒体的进一步氧化损伤，已有各种技术主要是通过把抗氧化药物送入细胞或线粒体，以期降低氧化性自由基水平。例如文献“Protective effect of pyrroloquinoline quinone against Aβ-inducedneurotoxicity in human neuroblastoma SH-SY5Y cells”（Neurosci Lett. 464:165-169）和“Involvement of ERK1/2 pathway in neuroprotective effects ofpyrroloquinoline quinine against rotenone-induced SH-SY5Y cell injury”（Neuroscience 270:183-191），报道了吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinine，PQQ）对神经细胞线粒体的保护作用。PQQ是最近几年发现的最有效的线粒体抗氧化剂之一，能降低心肌细胞、神经细胞以及其它细胞线粒体中的氧化性自由基，也能在一定程度上缓解Aβ蛋白片段等变性蛋白所引起的线粒体损伤。但由于PQQ并不直接抑制变性蛋白的线粒体转运或清除线粒体中的变性蛋白，因此它不能改变线粒体损伤的根源，效果也往往不太理想。
因此，降低变性蛋白在线粒体内部的积累是当前退行性神经疾病预防治疗中亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明提供了一种HtrA2融合基因，能用于防止变性蛋白在线粒体内积累。该基因由线粒体外膜蛋白USP30的定位序列与HtrA2的蛋白酶功能域及PDZ功能域融合而成（以下称Mitochondrial Outer Membrane HtrA2，简称MOM-HtrA2）。在细胞里表达后，MOM-HtrA2蛋白能靶向定位到线粒体表面，将企图进入线粒体的各种变性蛋白降解，防止它们在线粒体内部积累。
为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
一种HtrA2融合基因，其特征在于：该HtrA2融合基因的DNA序列为SEQID NO:1。
本发明的HtrA2融合基因为MOM-HtrA2融合基因，5’端的201个碱基编码USP30的线粒体外膜定位系列，而3’端的975个碱基编码HtrA2的蛋白酶功能域和PDZ功能域。两段序列间由GGATCT序列链接。
本发明的HtrA2融合基因在线粒体保护中的应用。
线粒体蛋白酶HtrA2主要有两种蛋白亚型，较长的HtrA2L和较短的HtrA2S。一般认为，HtrA2S分布在线粒体内外膜间隙中，能降解其周围的变性蛋白，是保护线粒体的主要亚型。实验证明，HtrA2L虽然蛋白水平很低，但也能发挥很重要的保护功能。与HtrA2S不同，HtrA2L分布在线粒体外膜上，是线粒体蛋白转运通道的“门卫”，能把即将进入线粒体的变性蛋白在线粒体表面及时降解，防止它们在线粒体内部积累。一般细胞中的HtrA2L水平很低，因此它们抵御变性蛋白以及蛋白酶体抑制的能力有限。
本发明中所用的人类线粒体外膜蛋白USP30 cDNA序列中的1-201核苷酸编码它的线粒体外膜定位序列（Mitochondrial Outer Membrane Targeting Sequence，MOM-TS），而人类线粒体蛋白酶HtrA2 cDNA序列中的400-1374编码它的蛋白酶功能域（ProteaseDomain）和PDZ功能域。将USP30(1-201)与HtrA2(400-1374)片段用分子克隆方法融合，建立线粒体外膜HtrA2(MOM-HtrA2)的表达载体。提高线粒体表面的HtrA2蛋白水平，从而能更有效的防止变性蛋白在线粒体内部积累，为线粒体的保护提供新的途径。
本发明的HtrA2融合基因构建的具体步骤如下：
1）用含有Acc65I位点的引物1和含有BamHI位点的引物2 PCR扩增出人类线粒体外膜蛋白USP30 cDNA中的USP30(1-201)片段（SEQID NO:2）。
2）用含有BglII位点的引物3和XbaI位点的引物4，PCR扩增蛋白酶HtrA2 cDNA中的HtrA2(400-1374)片段（SEQID NO:3）。
3）用限制性内切酶Acc65I和BamHI对USP30(1-201)片段进行酶切，用BglII和XbaI对HtrA2(400-1374)片段进行酶切。
4）通过琼脂糖凝胶电泳纯化、回收酶切后的片段；
5）将回收的USP30(1-201)和HtrA2(400-1374)片段同时连接到经Acc65I和XbaI酶切处理的基因表达载体中，得到由USP30(1-201)和HtrA2(400-1374) 连接而成的HtrA2融合基因。
所述引物1的DNA序列为（SEQID NO:4）：
5’-GATC GGTACC GCCACC ATG ACC GCC GCC GAC AGG GCC-3’
所述引物2的DNA序列为（SEQID NO:5）：
5’-GATC GGATCC CAC AAG CCC TTT TCT ACG CTT-3’
所述引物3的DNA序列为（SEQID NO:6）：
5’-GATC AGATCT GGG GGT CGG GGT CCT CCG GCC-3’
所述引物4的DNA序列为（SEQID NO:7）：
5’-GATC TCTAGA TTC TGT GAC CTC AGG GGT CAC-3’
本发明的融合基因可以用任何常用的哺乳细胞表达载体进行表达，如瞬时转染表达载体、腺病毒载体、慢病毒载体等。
本发明提出了线粒体保护的新途径，通过建立线粒体外膜HtrA2（MOM-HtrA2）的表达载体，提高线粒体表面的HtrA2蛋白水平，从而有效的防止变性蛋白在线粒体内部积累。因此，本发明的HtrA2融合基因不同于现有技术的抗氧化药物，仅是降低由变性蛋白积累引起的氧化性自由基水平，而是从根本上清除引发线粒体损伤的变性蛋白，解决了现有技术的抗氧化药物“治标”不“治本”的问题。
附图说明
图1为实施例4的变性蛋白降解的检测结果。
图2为实施例5的变性蛋白降解的检测结果。
图3为实施例6的变性蛋白降解的检测结果。
图4为实施例7的细胞凋亡的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对MOM-HtrA2融合基因的线粒体保护功能作进一步详细的描述。
实施例1
本发明的MOM-HtrA2融合基因及其表达载体的构建
具体步骤如下：
1）用含有Acc65I位点的引物1和含有BamHI位点的引物2 PCR扩增出人类线粒体外膜蛋白USP30 cDNA中的1-201核苷酸序列，即USP30(1-201)片段。
2）用含有BglII位点的引物3和XbaI位点的引物4，PCR扩增蛋白酶HtrA2 cDNA中的400-1374核苷酸，即HtrA2(400-1374)片段。
3）用限制性内切酶Acc65I和BamHI对USP30(1-201)片段进行酶切，用BglII和XbaI对HtrA2(400-1374)片段进行酶切。
4）通过琼脂糖凝胶电泳纯化、回收酶切后的片段，连接入经过Acc65I和XbaI 酶切处理的哺乳动物细胞表达载体中。转化涂板后，挑取单菌落，抽提质粒DNA后，用Acc65I和XbaI进行酶切鉴定。
实施例2
本实施例的实施方式与实施例1基本相同，在此基础上：
所述引物1的DNA序列为：
5’-GATC GGTACC GCCACC ATG ACC GCC GCC GAC AGG GCC-3’
所述引物2的DNA序列为：
5’-GATC GGATCC CAC AAG CCC TTT TCT ACG CTT-3’
所述引物3的DNA序列为：
5’-GATC AGATCT GGG GGT CGG GGT CCT CCG GCC-3’
所述引物4的DNA序列为：
5’-GATC TCTAGA TTC TGT GAC CTC AGG GGT CAC-3’。
实施例3
本发明的MOM-HtrA2融合基因及其表达载体的构建
具体步骤如下：
1）用含有Acc65I位点的引物1和含有BamHI位点的引物2 PCR扩增出人类线粒体外膜蛋白USP30 cDNA中的1-201核苷酸序列，即USP30(1-201)片段；PCR循环的条件为：94 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸1分钟，共30个循环。
2）用含有BglII位点的引物3和XbaI位点的引物4，PCR扩增蛋白酶HtrA2 cDNA中的400-1374核苷酸，即HtrA2(400-1374)片段；PCR循环的条件为：94 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸1分钟，共30个循环。
3）用限制性内切酶Acc65I和BamHI对USP30(1-201)片段进行酶切，用BglII和XbaI对HtrA2(400-1374)片段进行酶切，酶切条件为37 °C 3小时。
4）通过琼脂糖凝胶电泳纯化、回收酶切后的片段，用T4 DNA Ligase连接入经过Acc65I和XbaI 酶切处理的pcDNA3.1-Flag载体中，连接条件为16 °C 2小时。转化涂板后，挑取单菌落，抽提质粒DNA后，用Acc65I和XbaI进行酶切鉴定。
实施例4
表达MOM-HtrA2抑制Aβ片段在线粒体中的累积
1）细胞培养和转染
稳定表达变性蛋白MIM-Aβ-myc的HEK293T(HtrA2KO)细胞株是用含有MIM-Aβ-myc的慢病毒感染HtrA2基因敲除的HEK293T细胞，并用抗生素清除未感染细胞而获得的。其培养条件：DMEM培养基，10%胎牛血清，100单位/ml的青霉素，100 mg/ml的链霉素，在37℃，5%CO2孵箱培养。转染所用的试剂是MegaTran 1.0 （Origene公司），按厂家所提供的标准方法进行。
2）MOM-HtrA2表达的检测
本发明所述MOM-HtrA2融合基因的表达载体中带有Flag标签序列，在细胞中表达后，MOM-HtrA2蛋白带有Flag标记。为检测它的表达，可将细胞裂解，用SDS-PAGE分离蛋白，再用Western Blot分析进行定量。检测所用的一抗为Flag标签抗体（Prospect公司）和带有荧光标记的二抗（Thermo-Fisher公司）。依次用它们孵育含有蛋白的PVDF膜以后，用Li-CorOdyssey双色红外激光成像系统扫描获取Western图像。在Western结果中，MOM-HtrA2为55kd的单一条带。具体结果见图1。
3）变性蛋白降解的检测
本实施例中的所表达的变性蛋白为在N-端带有线粒体内膜定位序列（Mitochondrial Inner Membrane Targeting Sequence，简称MIM），并在C-端带有Myc标签的Aβ蛋白。该蛋白在细胞中合成后能转运到线粒体内膜上，以单体或多聚体形式存在。该蛋白的表达可通过SDS-PAGE和Western Blot分析进行检测。所用的抗体为Myc标签抗体（Prospect公司）与荧光标记的二抗（Thermo-Fisher公司）。Western结果用Li-Cor Odyssey双色红外激光成像系统扫描获得。
4）变性蛋白降解的检测结果（图1）
图1A. 表达MOM-HtrA2可有效降解进入线粒体的Aβ单体。
由于内源HtrA2基因也能产生少量定位在线粒体表面的HtrA2蛋白，为消除它的影响，我们用敲除了HtrA2基因的HEK293T细胞（HtrA2 KO细胞）建立了稳定表达MIM-Aβ的细胞株，用以检测MOM-HtrA2的变性蛋白清除活力。MOM-HtrA2表达能有效降低MIM-Aβ单体的水平。用蛋白酶体抑制剂Bortezomib（简称Bort，100 nM，12小时）处理细胞能明显降低蛋白酶体对MIM-Aβ的降解，使细胞中的MIM-Aβ水平升高，但表达MOM-HtrA2能抑制这种升高。Tomm70是线粒体外膜蛋白，作为线粒体总量的内参。
图1B. 图1A实验的数据统计。***表示p<0.005。
图1C. 表达MOM-HtrA2可显著降解线粒体中的MIM-Aβ多聚体。
在稳定表达MIM-Aβ的细胞中表达MOM-HtrA2能显著降低在线粒体内膜上形成的Aβ多聚体。Bortezomib（Bort）处理也会引起线粒体内部Aβ多聚体水平的明显升高，而表达MOM-HtrA2几乎完全抑制这种升高。Actin是蛋白上样量的内参。
图1D. 图1C实验的数据统计。***表示p<0.005。
实施例5
表达MOM-HtrA2能显著降低突变SOD1和突变a-Synuclein在线粒体中的累积。
1）细胞培养和转染
稳定表达变性蛋白SOD1(G93A)或α-Synuclein(A30P)的HEK293T细胞株是用含有这些突变基因的慢病毒感染HEK293T细胞，并用抗生素清除未感染细胞而获得的。细胞培养和转染条件同实施例4。
2）HtrA2表达的检测
同实施例4，检测结果见图2。
3）变性蛋白降解的检测
SOD1(G93A)或α-Synuclein(A30P)蛋白上也带有Myc标签，其检测方法同实施例4。
4）变性蛋白降解的检测结果（图2）
图2A. MOM-HtrA2能显著降解进入线粒体的变性蛋白SOD1(G93A)。
在稳定表达了突变SOD1，即SOD1(G93A)的HEK293T细胞中表达MOM-HtrA2能显著降低SOD1(G93A)蛋白在线粒体中积累。SOD1(G93A)是引起肌肉萎缩性侧面硬化病的突变蛋白，容易在线粒体内部形成不溶性蛋白聚集体。Tomm70是线粒体外膜蛋白，作为线粒体总量的内参。
图2B. 图2A实验数据的统计结果。***表示p<0.005。
图2C. MOM-HtrA2能显著降解进入线粒体的变性蛋白α-Synuclein(A30P)。
在稳定表达突变α-Synuclein，即α-Synuclein(A30P)的HEK293T细胞中表达MOM-HtrA2能显著降低α-Synuclein(A30P)蛋白在线粒体中积累。α-Synuclein(A30P)是引起帕金森氏病的突变蛋白。部分α-Synuclein(A30P)蛋白能进入线粒体，形成不溶性蛋白聚集体。Tomm70是线粒体外膜蛋白，作为线粒体总量的内参。
图2D. 图2C实验数据的统计结果。***表示p<0.005。
实施例6
表达MOM-HtrA2能显著降低突变的线粒体蛋白endoG(N174A) 和OTCΔ30-114的累积。
1）细胞培养和转染
稳定表达变性蛋白endoG(N174A) 和OTCΔ30-114的HEK293T细胞株是用含有这些突变基因的慢病毒感染HEK293T细胞，并用抗生素清除未感染细胞而获得的。细胞培养和转染条件同实施例4。
2）HtrA2表达的检测
同实施例4，检测结果见图3。
3）变性蛋白降解的检测
变性蛋白endoG(N174A) 和OTCΔ30-114上也带有Myc标签，其检测方法同实施例4。
4）变性蛋白降解的检测结果（图3）
图3A. MOM-HtrA2能有效降解突变的线粒体蛋白endoG(N174A)。
在稳定表达线粒体突变蛋白endoG(N174A)的HEK293T细胞株中表达MOM-HtrA2能有效降低endoG(N174A)在线粒体中的积累。endoG(N174A)是含有N174A点突变的endoG蛋白，容易在线粒体内外膜间隙中形成不溶性蛋白聚集体。Tomm70是线粒体外膜蛋白，作为线粒体总量的内参。
图3B. 图3A实验数据的统计结果。***表示p<0.005。
图3C. MOM-HtrA2能有效降解突变的线粒体蛋白OTCΔ30-114。
在稳定表达线粒体突变蛋白OTCΔ30-114的HEK293T细胞株中表达MOM-HtrA2能有效降低OTCΔ30-114在线粒体中的积累。OTC是线粒体基质蛋白，而OTCΔ30-114是缺失了第30位至第114位DNA的突变OTC蛋白，它容易在基质中形成不溶性蛋白聚集体。Tomm70是线粒体外膜蛋白，作为线粒体总量的内参。
图3D. 图3C实验数据的统计结果。**表示p<0.01
实施例7
MOM-HtrA2表达和PQQ处理对蛋白酶体抑制剂所引起细胞凋亡的影响
1、细胞培养
稳定表达MOM-HtrA2的HEK293T细胞株是用携带MOM-HtrA2基因的慢病毒感染HEK293T细胞，并用抗生素清除未感染细胞而获得的。其培养条件与HEK293细胞相同。运用蛋白酶体抑制剂Bortezomib 50 nM处理HEK293T、HEK293T(MOM-HtrA2)细胞24 h，部分细胞质中不能被及时降解的变性蛋白会转运进入线粒体，在线粒体中的积累，导致细胞凋亡。
作为对比，另一组HEK293T细胞在Bortezomib处理过程中同时加入100 mM PQQ。
2、HtrA2表达的检测
同实施例4，检测结果见图4A。
3、细胞凋亡的检测方法
采用FITC-Annexin V荧光染色方法检测Bortezomib处理的HEK293T、HEK293T(MOM-HtrA2)细胞以及Bortezomib/PQQ处理的HEK293T细胞的凋亡情况。将处理后的细胞消化成单个细胞之后，在细胞悬浮液中加入FITC-Annexin标记凋亡细胞，通过荧光显微镜成相，统计细胞凋亡率。
4、细胞凋亡的检测结果（图4）
图4A.Western Blot 分析检测MOM-HtrA2在各实验细胞中的表达。
图4B.MOM-HtrA2比PQQ更有效地降低蛋白酶体抑制所引起的细胞凋亡。
用FITC-Annexin V荧光染色方法分析表明用蛋白酶体抑制剂Bortezomib处理HEK293T细胞（浓度50 nM，时间24小时）能诱导大量细胞凋亡，而表达MOM-HtrA2能显著降低这种细胞凋亡。PQQ处理也能降低细胞凋亡，但效果不如MOM-HtrA2。
图4C.图4B实验数据的分析结果。*表示p<0.05，**表示p<0.01。
序列表
<110> 四川大学华西第二医院
<120> 一种HtrA2融合基因及其应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1185
<212> DNA
<213> MOM-HtrA2融合基因
<400> 1
atgctgagct cccgggccga ggcggcgatg accgcggccg acagggccat ccagcgcttc 60
ctgcggaccg gggcggccgt cagatataaa gtcatgaaga actggggagt tataggtgga 120
attgctgctg ctcttgcagc aggaatatat gttatttggg gtcccattac agaaagaaag 180
aagcgtagaa aagggcttgt gggatctgcc gtccctagcc cgccgcccgc ttctccccgg 240
agtcagtaca acttcatcgc agatgtggtg gagaagacag cacctgccgt ggtctatatc 300
gagatcctgg accggcaccc tttcttgggc cgcgaggtcc ctatctcgaa cggctcagga 360
ttcgtggtgg ctgccgatgg gctcattgtc accaacgccc atgtggtggc tgatcggcgc 420
agagtccgtg tgagactgct aagcggcgac acgtatgagg ccgtggtcac agctgtggat 480
cccgtggcag acatcgcaac gctgaggatt cagactaagg agcctctccc cacgctgcct 540
ctgggacgct cagctgatgt ccggcaaggg gagtttgttg ttgccatggg aagtcccttt 600
gcactgcaga acacgatcac atccggcatt gttagctctg ctcagcgtcc agccagagac 660
ctgggactcc cccaaaccaa tgtggaatac attcaaactg atgcagctat tgattttgga 720
aactctggag gtcccctggt taacctggat ggggaggtga ttggagtgaa caccatgaag 780
gtcacagctg gaatctcctt tgccatccct tctgatcgtc ttcgagagtt tctgcatcgt 840
ggggaaaaga agaattcctc ctccggaatc agtgggtccc agcggcgcta cattggggtg 900
atgatgctga ccctgagtcc cagcatcctt gctgaactac agcttcgaga accaagcttt 960
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gctggtctgc ggcctggtga tgtgattttg gccattgggg agcagatggt acaaaatgct 1080
gaagatgttt atgaagctgt tcgaacccaa tcccagttgg cagtgcagat ccggcgggga 1140
cgagaaacac tgaccttata tgtgacccct gaggtcacag aatga 1185
<210> 2
<211> 201
<212> DNA
<213> USP30(1-201)片段
<400> 2
atgctgagct cccgggccga ggcggcgatg accgcggccg acagggccat ccagcgcttc 60
ctgcggaccg gggcggccgt cagatataaa gtcatgaaga actggggagt tataggtgga 120
attgctgctg ctcttgcagc aggaatatat gttatttggg gtcccattac agaaagaaag 180
aagcgtagaa aagggcttgt g 201
<210> 3
<211> 978
<212> DNA
<213> HtrA2(400-1374)片段
<400> 3
gccgtcccta gcccgccgcc cgcttctccc cggagtcagt acaacttcat cgcagatgtg 60
gtggagaaga cagcacctgc cgtggtctat atcgagatcc tggaccggca ccctttcttg 120
ggccgcgagg tccctatctc gaacggctca ggattcgtgg tggctgccga tgggctcatt 180
gtcaccaacg cccatgtggt ggctgatcgg cgcagagtcc gtgtgagact gctaagcggc 240
gacacgtatg aggccgtggt cacagctgtg gatcccgtgg cagacatcgc aacgctgagg 300
attcagacta aggagcctct ccccacgctg cctctgggac gctcagctga tgtccggcaa 360
ggggagtttg ttgttgccat gggaagtccc tttgcactgc agaacacgat cacatccggc 420
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gatggggagg tgattggagt gaacaccatg aaggtcacag ctggaatctc ctttgccatc 600
ccttctgatc gtcttcgaga gtttctgcat cgtggggaaa agaagaattc ctcctccgga 660
atcagtgggt cccagcggcg ctacattggg gtgatgatgc tgaccctgag tcccagcatc 720
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ttggccattg gggagcagat ggtacaaaat gctgaagatg tttatgaagc tgttcgaacc 900
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cctgaggtca cagaatga 978
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物1
<400> 4
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<211> 31
<212> DNA
<213> 引物2
<400> 5
gatcggatcc cacaagccct tttctacgct t 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物3
<400> 6
gatcagatct gggggtcggg gtcctccggc c 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物4
<400> 7
gatctctaga ttctgtgacc tcaggggtca c 31
Claims (4)
1.一种HtrA2融合基因，其特征在于：该HtrA2融合基因的DNA序列为SEQID NO:1。
2.根据权利要求1所述的一种HtrA2融合基因，其特征在于：该HtrA2融合基因构建的具体步骤如下：
1）用含有Acc65I位点的引物1和含有BamHI位点的引物2 PCR扩增出人类线粒体外膜蛋白USP30 cDNA中的DNA序列为SEQIDNO:2片段；
2）用含有BglII位点的引物3和XbaI位点的引物4，PCR扩增出蛋白酶HtrA2 cDNA中的DNA序列为SEQIDNO:3片段；
3）用限制性内切酶Acc65I和BamHI对DNA序列为SEQIDNO:2片段进行酶切，用BglII和XbaI对DNA序列为SEQIDNO:3片段进行酶切；
4）通过琼脂糖凝胶电泳纯化、回收酶切后的片段；
5）将回收的DNA序列为SEQIDNO:2和DNA序列为SEQIDNO:3片段同时连接到经Acc65I和XbaI酶切处理的基因表达载体中，得到由DNA序列为SEQIDNO:2和DNA序列为SEQIDNO:3 连接而成的HtrA2融合基因。
3.根据权利要求2所述的一种HtrA2融合基因，其特征在于：
所述引物1的DNA序列为：
5’-GATC GGTACC GCCACC ATG ACC GCC GCC GAC AGG GCC-3’
所述引物2的DNA序列为：
5’-GATC GGATCC CAC AAG CCC TTT TCT ACG CTT-3’
所述引物3的DNA序列为：
5’-GATC AGATCT GGG GGT CGG GGT CCT CCG GCC-3’
所述引物4的DNA序列为：
5’-GATC TCTAGA TTC TGT GAC CTC AGG GGT CAC-3’。
4.根据权利要求1所述的一种HtrA2融合基因的应用，其特征在于：该HtrA2融合基因在制备防治由线粒体受损引起的病症中的药物中的应用，所述的病症为退行性神经疾病。
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