CN117838877A - 一种多肽p12-药物偶联物及其在制备治疗胰腺癌的药物中的应用 - Google Patents
一种多肽p12-药物偶联物及其在制备治疗胰腺癌的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种多肽P12‑药物偶联物及其在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，属于生物技术领域。本发明提供的多肽P12‑药物偶联物不仅保持了多肽P12对CXCR4的拮抗功能，还使得偶联的化疗药物对胰腺癌细胞的细胞毒作用得以保持，并且该多肽P12‑药物偶联物可以明显增强胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性，其治疗效果可与10倍剂量的化疗药物单药相当，因此有助于降低化疗用药剂量，减少毒副作用，具有良好的体内应用安全性。本发明提供的多肽‑药物偶联物可有效用于制备治疗胰腺癌的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多肽P12-药物偶联物及其在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，发病率和死亡率一直在持续增加。当前胰腺癌的治疗手段主要有手术切除、化学治疗、放射治疗等。其中，化学治疗是最常用的，其主要药物包括吉西他滨(GEM)等，但疗效十分有限，仍会导致高致死率，5年生存率仅为7％，因此亟需开发更为有效的治疗药物。
发明内容
本发明提供一种可有效拮抗CXCR4和/或可用于胰腺癌治疗的新型多肽-药物偶联物，并提供了该多肽-药物偶联物在制备用于治疗胰腺癌的药物中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种多肽-药物偶联物，其由多肽P12和化疗药物偶联而成，其中：
所述多肽P12的氨基酸序列为：QGCRRRNTVDDWISRRRAL，或X1-GX2G-QGCRRRNTVDDWISRRRAL，其中：X1为空、或为生物素biotin、或为荧光分子；X2为空、或为氨基酸C。
在一些实施方式中，所述化疗药物为吉西他滨(GEM)；可选地，在一个多肽P12上偶联有一个或两个GEM。
在一些实施方式中，所述化疗药物偶联至所述多肽P12的氨基酸C上；可选地，通过将所述GEM中的羟基与马来酰亚胺基丙酸中的羧基通过酯键连接，并将得到的化合物再与所述多肽P12中的氨基酸C的巯基通过硫醚键进行加成反应，进而将所述化疗药物GEM偶联至所述多肽P12的氨基酸C上。
在本发明的第二方面，提供一种多肽-药物偶联物在制备CXCR4拮抗剂中的应用。
在本发明的第三方面，提供一种多肽-药物偶联物在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
在一些实施方式中，所述药物的剂型包括液体制剂、冻干粉制剂。
在一些实施方式中，所述药物通过抑制CXCR4/CXCL12生物轴介导的胰腺癌细胞、胰腺癌肿瘤组织中基质细胞(如巨噬细胞和成纤维细胞)的下游信号通路(如Erk、p38等)的磷酸化，和/或化疗药物的细胞毒作用，来治疗胰腺癌。
在一些实施方式中，所述药物通过抑制CXCR4/CXCL12生物轴介导的胰腺癌细胞的迁移，和/或化疗药物的细胞毒作用来治疗胰腺癌。
在一些实施方式中，所述药物通过抑制CXCR4/CXCL12生物轴介导的胰腺癌细胞与胰腺癌肿瘤组织中基质细胞的粘附，和/或化疗药物的细胞毒作用，来治疗胰腺癌。
在一些实施方式中，所述药物通过促进杀伤性淋巴细胞进入到肿瘤组织内，以及逆转肿瘤微环境免疫抑制状态，和/或化疗药物的细胞毒作用，来治疗胰腺癌。
本发明将具有拮抗CXCR4功能的多肽P12与胰腺癌一线用药(例如吉西他滨(GEM))相连接，尤其是将一个或两个GEM化疗药物分子偶联至多肽P12的氨基酸C上，可以得到一种使多肽P12对CXCR4的拮抗功能和化疗药物(GEM)对肿瘤细胞的细胞毒作用均得以保持，甚至增强的多肽-药物偶联物，其中多肽P12作为该多肽-药物偶联物的靶头，可以与胰腺癌细胞表面的功能蛋白(CXCR4)特异性结合，进而阻止该蛋白与其特异性配体(CXCL12)的结合，从而抑制两者相互作用所导致的细胞活化，并可抑制CXCR4/CXCL12生物轴介导的胰腺癌细胞、胰腺癌肿瘤组织中基质细胞的下游信号通路(如Erk、p38等)的磷酸化、胰腺癌细胞的迁移、胰腺癌细胞与胰腺癌肿瘤组织中基质细胞的粘附、和/或克服CXCR4/CXCL12生物轴介导的免疫耐受以提高淋巴细胞对胰腺癌细胞的杀伤作用，同时还可以发挥偶联的化疗药物针对肿瘤细胞的细胞毒作用。实施例结果证明该多肽-药物偶联物能够延长胰腺癌小鼠的生存期，表现出抗胰腺癌治疗功效，并且不明显影响循环血液中的中性粒细胞、淋巴细胞和血小板数量，即体内应用安全性良好。实施例结果还证明该多肽-药物偶联物还能够增加肿瘤对化疗的敏感性，提高化疗效果，其治疗效果可与10倍剂量(按照GEM的剂量计)的GEM单药相当，因此有助于降低化疗用药剂量，减少毒副作用。因此，利用该多肽-药物偶联物制备治疗胰腺癌的药物将大有裨益。
附图说明
图1为胰腺癌细胞panc-1表面CXCR4表达水平，其中抗CXCR4抗体用荧光分子PE标记，用流式细胞仪检测细胞CXCR4表达荧光强度，与未标记细胞分布图比较后，得到细胞表面CXCR4阳性率。其中左侧曲线为未标记细胞的荧光强度分布图，右侧曲线为CXCR4荧光强度分布图。
图2为胰腺癌细胞pan02表面CXCR4表达水平，其中抗CXCR4抗体用荧光分子APC标记，用流式细胞仪检测细胞CXCR4表达荧光强度，与未标记细胞分布图比较后，得到细胞表面CXCR4阳性率。其中左侧曲线为未标记细胞的荧光强度分布图，右侧曲线为CXCR4荧光强度分布图。
图3为多肽P12和P12-GEM分别与人胰腺癌细胞panc-1细胞的结合统计结果。
图4为多肽P12和P12-GEM分别与小鼠胰腺癌细胞pan02细胞的结合统计结果。
图5为使用激光共聚焦显微镜(Confocal)观察本发明应用多肽P12与胰腺癌细胞panc-1膜CXCR4结合情况，其中多肽P12用FITC标记，显示(绿色)荧光，细胞核用DAPI进行标记，显示(蓝色)荧光。
图6为使用Confocal观察本发明应用多肽P12与胰腺癌细胞pan02膜CXCR4结合情况，其中P12用FITC标记，细胞核用DAPI进行标记。
图7为不同浓度多肽P12对胰腺癌细胞panc-1增殖的影响。
图8为不同浓度多肽P12对胰腺癌细胞pan02增殖的影响。
图9为P12-GEM对人胰腺癌细胞panc-1细胞活性的影响。
图10为P12-GEM对人胰腺癌细胞SW1990活性的影响。
图11为P12-GEM对小鼠胰腺癌细胞pan02细胞活性的影响。
图12为P12-GEM对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞活性的影响。
图13为P12-GEM对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞活性的影响。
图14为使用免疫印迹方法(WB)检测多肽P12抑制CXCL12诱导的胰腺癌细胞panc-1的CXCR4下游关键信号蛋白分子Erk和p38磷酸化的情况。
图15为使用免疫印迹方法检测P12-GEM抑制CXCL12介导的人胰腺癌细胞panc-1细胞CXCR4下游关键信号蛋白分子Erk和p38磷酸化的情况。
图16为使用免疫印迹方法(WB)检测多肽P12抑制CXCL12诱导的胰腺癌细胞pan02的CXCR4下游关键信号蛋白分子Erk和p38的磷酸化的情况。
图17为使用免疫印迹方法检测P12-GEM抑制CXCL12介导的小鼠胰腺癌细胞pan02细胞CXCR4下游关键信号蛋白分子Erk和p38磷酸化的情况。
图18为使用免疫印迹方法(WB)检测多肽P12抑制CXCL12介导的巨噬细胞RAW264.7的CXCR4下游关键信号蛋白分子Erk和p38磷酸化的情况。
图19为使用免疫印迹方法(WB)检测多肽P12抑制对CXCL12介导的成纤维细胞NIH3T3的CXCR4下游关键信号蛋白分子Erk和p38磷酸化的情况。
图20为使用免疫印迹方法检测P12-GEM抑制CXCL12介导的人巨噬细胞THP-1CXCR4下游关键信号蛋白分子Erk和p38磷酸化的情况。
图21为使用免疫印迹方法检测-药物偶联物P12-GEM抑制对CXCL12介导的人成纤维细胞CCC-ESF-1CXCR4下游关键信号蛋白分子Erk和p38磷酸化的情况。
图22为细胞迁移实验用装置示意图。
图23为P12-GEM抑制CXCL12介导的胰腺癌细胞panc-1细胞迁移的效果。
图24为多肽P12抑制CXCL12介导的小鼠胰腺癌细胞pan02与小鼠成纤维细胞NIH3T3粘附。
图25为P12-GEM抑制CXCL12介导的人胰腺癌细胞panc-1与成纤维细胞CCC-ESF-1粘附。
图26为荷瘤小鼠小鼠的生存期统计结果。
图27为小鼠胰腺肿瘤组织病理图。
图28为小鼠胰腺肿瘤组织T淋巴细胞免疫荧光染色结果。杀伤性T细胞(CD8+)用绿色荧光标记，细胞核用蓝色荧光DAPI标记。
图29为胰腺肿瘤组织免疫抑制型巨噬细胞免疫荧光染色结果。免疫抑制型巨噬细胞的标志物CD206用红色荧光标记，细胞核用蓝色荧光DAPI标记。
图30为P12-GEM注射后，小鼠外周血中的白细胞、中性粒和血小板数量统计结果。
图31为多肽P12注射24h后外周血中的血小板数量统计结果。
图32为P12-2GEM对小鼠胰腺癌细胞pan02细胞活性的影响。
图33为P12-2GEM抑制CXCL12介导的胰腺癌细胞panc-1细胞迁移的效果。
图34为P12-2GEM抑制CXCL12介导的人胰腺癌细胞panc-1与成纤维细胞CCC-ESF-1粘附。
图35为P12-2GEM注射后，小鼠脾淋巴细胞对胰腺癌细胞pan02的特异性杀伤作用。
具体实施方式
鉴于现有化药吉西他滨(GEM)对胰腺癌的疗效有限，发明人分析其原因，认为：胰腺癌的病理特点是肿瘤细胞被大量基质细胞包裹，基质细胞分泌的细胞外基质形成致密屏障，阻碍药物向肿瘤组织内部的有效渗透，这是导致化疗效果很低的重要原因之一；与此同时，胰腺癌是“冷”肿瘤，即肿瘤微环境处于免疫抑制状态，其中杀伤性淋巴细胞很少，因而对肿瘤的杀伤能力很低。
并且，肿瘤细胞和基质细胞均高表达CXC趋化因子受体4(CXCR4)是导致上述病理特点的重要机制。CXCR4在胰腺癌细胞等数十种肿瘤细胞中高表达，其特异性配体为CXCL12，由成纤维细胞和巨噬细胞等基质细胞分泌，CXCL12与CXCR4结合而激活CXCR4下游信号通路，提高肿瘤细胞的存活和迁移能力，并促进肿瘤与其微环境中的成纤维细胞和巨噬细胞相互粘附。胰腺癌肿瘤组织中的成纤维细胞和巨噬细胞也表达CXCR4，可通过自分泌的CXCL12而自我激活，从而产生更多的细胞外基质和招募更多的成纤维细胞来包裹肿瘤细胞，由此形成胰腺癌肿瘤特有的紧密基质屏障，导致药物的药效不佳以及耐药的发生。
此外，骨髓、淋巴结等肿瘤外组织中的基质细胞也分泌CXCL12，肿瘤细胞会通过CXCR4/CXCL12轴而向这些组织和器官迁移和侵袭，最终导致肿瘤转移。CXCR4/CXCL12轴还通过介导肿瘤细胞与巨噬细胞相互作用，间接抑制杀伤性淋巴细胞进入肿瘤组织，从而阻止淋巴细胞对肿瘤细胞进行有效杀伤。
因此，发明人认为，阻断CXCR4/CXCL12生物轴对胰腺癌治疗是有益的(因为该生物轴CXCR4/CXCL12会通过相互作用而激活CXCR4下游信号通路，提高肿瘤细胞的存活和迁移能力，并促进其与成纤维细胞和巨噬细胞的粘附，最终导致肿瘤细胞活性增强和肿瘤微环境的免疫抑制状态)。目前虽已有少数几个CXCR4多肽拮抗剂进入胰腺癌治疗临床试验阶段，如美国礼来公司的产品LY2510924，其是由7个氨基酸组成的环肽，但经验证具有比较明显的血小板毒性。
近年来，多肽-药物偶联物(peptide-drug conjugate,PDC)在肿瘤靶向治疗中显示出诱人的潜力和开发价值。PDC与抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate,ADC)类似，本质上都是利用分子靶向策略递送药物。与ADC相比，PDC的优势在于其分子量低、组织穿透性更强、免疫原性较低、系统毒性较低等优势；此外，多肽可以采用商业化的通用技术化学合成，因而制备成本较低。迄今获美国FDA批准进入临床用于肿瘤治疗的PDC有两个，一是以Melflufen为靶标治疗多发性骨髓瘤的Pepaxto，二是以生长抑制素受体SSTR为靶标治疗胃肠胰腺神经内分泌肿瘤的Lu-dotatate。此外，有几款用于肿瘤治疗的PDC处于临床I/II期阶段，如以GnRH为靶标治疗卵巢癌的EP-100、以MMP14为靶标治疗食道癌和非小细胞癌的BT1718、以生长抑素受体SSTR为靶标治疗非小细胞癌和神经内分泌肿瘤的PEN-221、以LRP-1为靶点的治疗乳腺癌、脑胶质瘤和脑转移性非小细胞肺癌的SNG1005/ANG1005。目前还没有针对胰腺癌的PDC进入临床研究阶段。
本发明提供一种新的具有拮抗CXCR4功能，且保持对肿瘤细胞的细胞毒作用的多肽P12与化疗药物的偶联物(多肽-药物偶联物，PDC)，利用其可以阻断肿瘤细胞中高表达的CXCR4与基质细胞分泌的其配体CXCL12之间的相互作用，从而抑制肿瘤细胞增殖、转移和耐药等，而且还可以发挥化疗药物针对肿瘤细胞的细胞毒作用，以及该多肽-药物偶联物在制备治疗胰腺癌药物中的应用；该PDC中的杀伤成分为化疗药，多肽的作用是特异性识别肿瘤细胞表面蛋白抗原，介导杀伤成分进入肿瘤细胞，同时发挥其对CXCR4的拮抗功能。其中多肽P12的氨基酸序列为：QGCRRRNTVDDWISRRRAL，或X1-GX2G-QGCRRRNTVDDWISRRRAL，其中：X1为空、或为生物素biotin、或为荧光分子；X2为空、或为氨基酸残基C。化疗药物可为吉西他滨(GEM)。
关于多肽P12，本申请的发明人在先前的研究(专利文献CN112442113A，以下称文献1)中提出：多肽P12可以特异性地与高表达CXCR4的细胞特异性结合，如人慢性髓系白血病细胞细胞系(K562)、人急性T细胞白血病细胞系(Jurkat)和乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)，具有较高的亲和力。但该多肽P12对高表达CXCR4的细胞活性没有显著影响(参见文献1说明书第[0029]段)，即该多肽12并不影响CXCR4/CXCL12生物轴，也就是说，该文献1公开的是多肽P12对CXCR4没有拮抗功能，仅可作为一种靶向CXCR4而不干扰细胞功能的多肽，因此可为细胞筛选、靶向治疗和/或分子成像提供新型载体(参见文献1说明书第[0004]和[0037]段)，或者将该多肽P12用于载药的温敏脂质体中，作为靶向探针使用，进而有效提高脂质体中药物对癌组织和癌细胞的特异选择性和靶向渗透能力(参见专利文献CN111298116A)。
然而令人惊讶的是，当发明人将该多肽P12应用于高表达CXCR4的胰腺癌肿瘤细胞时，发现该多肽P12针对胰腺癌细胞表面高表达的CXCR4表现出显著的拮抗作用，包括：可以有效抑制CXCR4/CXCL12生物轴介导的胰腺癌细胞和胰腺癌肿瘤组织中基质细胞的下游信号通路(如Erk、p38等)的磷酸化、胰腺癌细胞的迁移、以及胰腺癌细胞与胰腺癌肿瘤组织中基质细胞的粘附，进而可以用于抗胰腺癌治疗，并且该多肽P12对CXCR4的拮抗作用还可以克服CXCR4/CXCL12生物轴介导的免疫耐受，提高淋巴细胞对胰腺癌细胞的杀伤作用，并且没有明显的血小板毒性。而且这种拮抗功能使多肽P12作为单药即可显著延长胰腺癌小鼠的生存期，亦可与化疗药物连接成多肽-药物偶联物，实施例结果证明，当将多肽P12与化疗药物GEM连接成多肽-药物偶联物应用时，具体为将一个或两个GEM偶联至多肽P12的氨基酸C上，偶联物不仅可以保持上述的多肽P12对CXCR4的拮抗功能，还可以保持化疗药物针对胰腺癌细胞的细胞毒作用，并提高化疗药物针对胰腺癌细胞的化疗敏感性，其治疗效果可与10倍剂量(按照GEM的剂量计)的GEM单药的治疗效果相当，因此可有助于降低化疗用药剂量，减少毒副作用，并同时改善治疗效果。而且尤为重要的是该多肽-药物偶联物不会明显影响循环血液中的中性粒细胞、淋巴细胞和血小板数量，表现出良好的体内应用安全性。因此该多肽-药物偶联物在治疗胰腺癌方面可作为一种有效的治疗药物。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
下文公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方面。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:ALaboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，MolecularCloning:ALaboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
以下以具体实施例详述本发明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的公开内容不限于下述的实施例。
除非特别指明，以下实施例中所用的细胞株均购自国家实验细胞资源共享平台；
除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液；
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂；
除非特别指明，以下实施例中所用的磷酸盐缓冲液(PBS)的pH为7.4。
以下实施例中，多肽P12的氨基酸序列为：QGCRRRNTVDDWISRRRAL，或X1-GX2G-QGCRRRNTVDDWISRRRAL，其中：X1为空、或为生物素biotin、或为荧光分子；X2为空、或为氨基酸残基C；药物为吉西他滨(GEM)；将多肽P12与一个GEM偶联的药物偶联物命名为P12-GEM，与两个GEM偶联的药物偶联物命名为P12-2GEM，具体连接方式为：将GEM中的羟基与马来酰亚胺基丙酸中的羧基通过酯键连接，将得到的化合物再与多肽P12中的氨基酸C的巯基通过硫醚键进行加成反应，进而得到多肽-药物偶联物。
多肽P12的合成参见专利文献CN112442113A；多肽-药物偶联物P12-GEM和P12-2GEM可具有但不限于如下所示的结构信息：
(1)P12-GEM
序列：Biotin-GG-QG-(吉西他滨-3-马来酰亚胺基丙酸)C-RRRNTVDDWISRRRAL
化学分子式:C126H200F2N48O39S2
分子量：3113.3998
化学结构式如下式(I)所示。
(2)P12-2GEM
序列：Biotin-GC(吉西他滨-3-马来酰亚胺基丙酸)G-QGC(吉西他滨-3-马来酰亚胺基丙酸)RRRNTVDDWISRRRAL
化学分子式：C145H221F4N53O47S3
分子量：3630.8606
化学结构式如下式(II)所示。
实施例1：胰腺癌细胞表面高表达CXCR4
将胰腺癌细胞panc-1(1×105个)和pan02(1×105个)分别与PE标记的或APC标记的抗CXCR4抗体在室温下避光孵育30min。孵育完毕后，用PBS溶液洗1遍，加入100μL PBS溶液重悬细胞后过筛网，利用流式细胞仪检测并收集1×104个细胞，分析细胞表面CXCR4的表达水平，得到的结果如图1和图2所示，其中从图1可见panc-1细胞CXCR4表达阳性率为71.1％，从图2可见pan02细胞CXCR4表达阳性率为70.14％，表明两种胰腺癌细胞均高表达CXCR4。
实施例2：多肽P12以及P12-GEM与胰腺癌细胞的结合
将生物素(biotin)标记的多肽P12或P12-GEM加入到pan02和panc-1细胞培养系统中，多肽的终浓度分别为1、5、10μM。在37℃、5％CO2培养箱中避光孵育1h，加入1mL PBS溶液，1500rpm/min条件下离心5min，去上清，加入100μL PBS溶液重悬细胞后过筛网，利用流式细胞仪检测多肽P12或P12-GEM与细胞的结合情况，结果分别如图3和图4所示。可见多肽P12以及P12-GEM与两种胰腺癌细胞均有结合，且具有浓度依赖效应，证明多肽P12以及P12-GEM均具有特异性识别表达CXCR4的胰腺癌细胞并与其相结合的能力，而且P12-GEM与两种细胞的结合量与多肽P12与两种细胞的结合量相当。
实施例3：激光共聚焦显微镜观察多肽P12与胰腺癌细胞的结合
制备panc-1和pan02细胞的爬片，PBS洗一遍，加入4％多聚甲醛室温固定15min，固定完毕后，PBS洗2遍，加入10μM的多肽P12，于37℃温箱中孵育1h。PBS洗2遍后，加入FITC标记的链霉亲和素，在4℃下孵育30min。经PBS洗涤后，用含DAPI的荧光封片剂封片。利用激光共聚焦显微镜观察P12与细胞的结合，结果如图5和图6所示，其中“对照”表示未经任何处理的细胞。可见，多肽P12具有特异性识别表达CXCR4的胰腺癌细胞并与其相结合的能力。
实施例4：多肽P12抑制胰腺癌细胞增殖
分别将panc-1细胞和pan02接种到96孔板中，待细胞过夜贴壁后，将不同浓度(1、5、10、50μM)的P12多肽加入孔中，孵育72小时后加入CCK-8试剂，在37℃温箱中孵育1.5h，用酶标仪检测450nm处的吸光度值。按下列公式计算多肽P12对细胞活性的影响：细胞相对活性(％)＝(多肽处理组OD值-背景OD值)/(对照组OD值-背景OD值)×100％。其中“对照”表示未经任何处理的细胞。相对活性越低，细胞增殖抑制程度越强。结果如图7和图8所示。
从检测结果可以看出，多肽P12在浓度为50μM时均明显抑制了两种胰腺癌细胞的增殖，细胞相对活性显著降低。这说明高浓度(例如50μM及以上)的多肽P12具有显著抑制胰腺癌细胞增殖的作用。
实施例5：P12-GEM抑制人胰腺癌细胞Panc-1的活性
将panc-1细胞按照每孔1×104个接种到96孔板中，待细胞过夜贴壁后，将不同浓度的GEM或P12-GEM加入相应孔中(终浓度0、10、20、30、40μM)，孵育72小时后加入CCK-8试剂，在37℃温箱中孵育2h，用酶标仪检测450nm的吸光度值，按下列公式计算GEM或P12-GEM对panc-1细胞活性的影响：细胞相对活性(％)＝(药物处理组OD值-背景OD值)/(对照组OD值-背景OD值)×100％。其中对照为未经任何处理、正常培养的panc-1细胞。细胞相对活性越低，说明抑制细胞生长程度越强。结果如图9所示。
从图9所示的检测结果可以看出，P12-GEM在10μM及以上浓度时显著抑制了panc-1细胞的活性，且与GEM作用相当，说明P12-GEM具有GEM的细胞毒作用。
通常情况下，药物与多肽偶联后，其细胞毒性会受到损失。例如，GnRH-GEM偶联物对前列腺癌细胞的抑制增殖作用明显低于游离药GEM：对于前列腺癌细胞DU145，游离药与偶联药的IC50值分别是231±34nM和1171±83nM；对于PC3细胞，游离药与偶联药的IC50分别是585±68nM和1161±130nM(参见Bioconjug Chem.2014Apr 16；25(4):813-23)。靶向热休克蛋白90(HSP90)的多肽P7与多烯紫杉醇偶联物DTX-P7在0.1-1μM浓度范围内对肺癌细胞A549的毒性都低于游离药(参见J Hematol Oncol.2022；15:73)。本发明利用硫醚键将P12连接到GEM上，结果发现该偶联物没有影响GEM对胰腺癌细胞的毒性作用，P12-GEM与游离GEM在panc-1肿瘤细胞上抑制细胞活性作用相当，这种意想不到的效果与所选择靶点、P12-GEM进入细胞的方式及偶联物连接方式有关：首先，硫醚键对肿瘤细胞中的ROS和GSSH具有双敏感响应性，可以被断开而快速释放药物。此外，CXCR4与其配体结合后会发生内吞而进入细胞，这是CXCR4蛋白的生物功能。因此，多肽-药物偶联物P12-GEM通过P12与胰腺癌细胞结合后，P12介导偶联物通过内吞途径进入细胞；而如果是通过分子扩散途径进入细胞，由于多肽-药物偶联物分子量比小分子药物显著增加，扩散进入细胞的效率就会低于内吞，这也是影响药物发挥毒性作用的一个原因。
实施例6：P12-GEM抑制人胰腺癌细胞SW1990的活性
将SW1990细胞按照每孔1×104个接种到96孔板中，待细胞过夜贴壁后，将不同浓度的GEM或P12-GEM加入相应孔中(终浓度0、5、10、15、20μM)，孵育72小时后加入CCK-8试剂，在37℃温箱中孵育2h，用酶标仪检测450nm吸光度值，按下列公式计算GEM或P12-GEM对SW1990细胞活性的影响：细胞相对活性(％)＝(药物处理组OD值-背景OD值)/(对照组OD值-背景OD值)×100％。其中对照为未经任何处理、正常培养的SW1990细胞。结果如图10所示。
从图10所示的检测结果可以看出，P12-GEM在5μM及以上浓度时显著抑制了SW1990细胞的活性，且与GEM作用相当，说明P12-GEM具有GEM的细胞毒作用。
实施例7：P12-GEM抑制小鼠胰腺癌细胞pan02细胞的活性
将pan02细胞按照每孔1×104个接种到96孔板中，待细胞过夜贴壁后，将不同浓度的P12、GEM或P12-GEM加入相应孔中(终浓度0、1、5、10μM)，孵育48小时后加入CCK-8试剂，在37℃温箱中孵育2h，用酶标仪检测450nm吸光度值，按下列公式计算GEM和P12-GEM对pan02细胞活性的影响：细胞相对活性(％)＝(药物处理组OD值-背景OD值)/(对照组OD值-背景OD值)×100％。其中对照为未经任何处理、正常培养的pan02细胞。结果如图11所示。
从图11所示的检测结果可以看出，P12-GEM在1μM及以上浓度时显著抑制pan02细胞的活性，且与GEM作用相当，说明P12-GEM具有GEM对细胞毒性作用。
实施例8：P12-GEM对巨噬细胞RAW264.7活性的抑制作用
将RAW264.7细胞按照每孔1×104个接种到96孔板中。将不同浓度的GEM或P12-GEM加入相应孔中(终浓度0、1、5和10μM)，孵育48小时后加入CCK-8试剂，在37℃温箱中孵育2h，用酶标仪检测450nm吸光度值，按下列公式计算GEM和P12-GEM对RAW264.7细胞活性的影响：细胞相对活性(％)＝(药物处理组OD值-背景OD值)/(对照组OD值-背景OD值)×100％。其中对照为未经任何处理、正常培养的RAW264.7细胞。结果如图12所示。
从图12所示的检测结果可以看出，P12-GEM在所检测浓度范围内均显著抑制RAW264.7细胞的活性，浓度为5μM和10μM时，与GEM的细胞毒作用相当。
实施例9：P12-GEM抑制成纤维细胞NIH3T3的活性
将NIH3T3细胞按照每孔1×104个接种到96孔板中，待细胞过夜贴壁后。将不同浓度的GEM或P12-GEM加入相应孔中(终浓度0、1、5和10μM)，孵育48小时后加入CCK-8试剂，在37℃温箱中孵育2h，用酶标仪检测450nm吸光度值，按下列公式计算GEM和P12-GEM对NIH3T3细胞活性的影响：细胞相对活性(％)＝(药物处理组OD值-背景OD值)/(对照组OD值-背景OD值)×100％。其中对照为未经任何处理、正常培养的NIH3T3细胞。结果如图13所示。
从图13所示的检测结果可以看出，P12-GEM对NIH3T3细胞的活性有显著的抑制作用。
实施例10：多肽P12和P12-GEM抑制panc-1细胞CXCR4的下游信号蛋白活化
将4×105个panc-1细胞接种到6孔板中，分为对照组(Ctrl)、CXCL12组、CXCL12+P12组和CXCL12+P12-GEM组，其中P12的终浓度为10μM，P12-GEM的终浓度为10μM，CXCL12的终浓度为100ng/mL。共孵育和PBS洗涤后，采用常规免疫印记(WB)实验对蛋白表达水平进行检测，结果如图14和图15所示。
从图14和图15所示的检测结果可以看出，CXCL12使panc-1细胞内p-Erk和p-p38蛋白条带强度增加，表明上述两种蛋白的磷酸化水平提高，说明CXCL12可以通过与CXCR4结合而启动细胞内信号通路(CXCL12组)；而使用多肽P12预处理可以使CXCL12+P12组的p-Erk和p-p38的蛋白表达水平显著低于CXCL12组，其中p-Erk蛋白水平可降低到与对照组相当，表明P12可有效抑制CXCL12/CXCR4介导的下游信号通路的活化；使用P12-GEM预处理也可以使CXCL12+P12-GEM组的p-Erk和p-p38的蛋白表达水平显著低于CXCL12组，其中p-Erk蛋白水平可降低到与对照组相当，p-P38蛋白水平低于对照组，表明P12-GEM也可有效抑制CXCL12介导的CXCR4下游信号蛋白的活化。
实施例11：多肽P12和P12-GEM抑制pan02细胞CXCR4的下游信号蛋白活化
将4×105个的pan02细胞接种到6孔板中，分为对照组(Ctrl)、CXCL12组、CXCL12+P12组和CXCL12+P12-GEM组，其中P12的终浓度为10μM，P12-GEM的终浓度为10μM，CXCL12的终浓度为100ng/mL，共孵育和PBS洗涤后，采用常规免疫印记(WB)实验对蛋白表达水平进行检测。结果如图16和图17所示。
从图16和图17所示的检测结果可以看出，CXCL12使pan02细胞内p-Erk、p-p38蛋白条带强度增加，表明上述两种蛋白的磷酸化水平得到提高，说明CXCL12可以通过与CXCR4结合而启动细胞内信号通路(CXCL12组)；而使用多肽P12预处理可以使CXCL12+P12组的p-Erk和p-p38的蛋白表达水平显著低于CXCL12组，其中p-Erk蛋白水平可降低到与对照组相当，表明P12可有效抑制CXCL12/CXCR4介导的下游信号通路的活化；使用P12-GEM预处理也可以使CXCL12+P12-GEM组的p-Erk和p-p38的蛋白表达水平显著低于CXCL12组，其中p-Erk蛋白水平可降低到与对照组相当，表明P12-GEM也可有效抑制CXCL12介导的CXCR4下游信号蛋白的活化。
实施例12：多肽P12拮抗基质细胞CXCR4的下游信号通路
分别将4×105个的巨噬细胞RAW264.7和成纤维细胞NIH3T3细胞接种到6孔板中，分为对照组、CXCL12组、和CXCL12+P12组，其中P12的终浓度为10μM，CXCL12的终浓度为100ng/mL，PBS洗涤后，用免疫印记(WB)实验对目标蛋白的表达进行检测。结果如图18和图19所示。
由检测结果可见，CXCL12使RAW264.7和NIH3T3细胞内p-Erk、p-p38蛋白条带强度增加，表明上述蛋白的磷酸化水平得到提高，说明CXCL12可以通过与CXCR4结合而启动细胞内信号通路(CXCL12组)；而使用多肽P12预处理可以使CXCL12+P12组的p-Erk和p-p38的蛋白表达水平显著低于CXCL12组，其中p-Erk蛋白水平可降低到与对照组相当，表明P12可有效抑制CXCL12/CXCR4介导的下游信号通路的活化，说明多肽P12具有拮抗基质细胞CXCR4的下游信号通路的作用。
实施例13：P12-GEM抑制人巨噬细胞THP-1CXCR4下游信号蛋白活化
将1×106个THP-1细胞接种到6孔板中，分为对照组(Ctrl)、CXCL12组、CXCL12+P12-GEM组，其中P12-GEM的终浓度为10μM，CXCL12的终浓度为100ng/mL。共孵育和用PBS洗涤后，采用免疫印记(WB)方法检测目标蛋白的表达，结果如图20所示。
由图20所示的检测结果可以看出，CXCL12使THP-1细胞内p-Erk和p-P38蛋白条带强度增加，表明上述两种蛋白的磷酸化水平得到提高，说明CXCL12可以通过与CXCR4结合而启动细胞内信号通路(CXCL12组)；而使用P12-GEM预处理可以使CXCL12+P12-GEM组的p-Erk和p-P38的蛋白表达水平显著低于CXCL12组，其中p-Erk蛋白水平可降低到与对照组相当，p-P38蛋白水平低于对照组，说明P12-GEM可显著抑制CXCL12介导的CXCR4下游信号蛋白活化。
实施例14：P12-GEM抑制CCC-ESF-1细胞CXCR4下游信号蛋白活化
将4×105个CCC-ESF-1细胞接种到6孔板中，分为对照组(Ctrl)、CXCL12组、CXCL12+P12-GEM组，其中P12-GEM的终浓度为10μM，CXCL12的终浓度为100ng/mL。共孵育和用PBS洗涤后，采用免疫印记(WB)方法检测目标蛋白的表达。结果如图21所示。
由图21所示的检测结果可以看出，CXCL12使CCC-ESF-1细胞内p-Erk和p-P38蛋白条带强度增加，表明上述两种蛋白的磷酸化水平得到提高，说明CXCL12可以通过与CXCR4结合而启动细胞内信号通路(CXCL12组)；而使用P12-GEM预处理可以使CXCL12+P12-GEM组的p-Erk和p-P38的蛋白表达水平显著低于CXCL12组，其中p-Erk蛋白水平低于对照组，说明P12-GEM可显著抑制CXCL12介导的CXCR4下游信号蛋白活化。
实施例15：多肽P12以及P12-GEM抑制CXCL12介导的人胰腺癌细胞迁移
panc-1细胞与不同浓度的多肽P12或P12-GEM共孵育1h，终浓度分别为0、1、5和10μM，对照组仅在完全培养基中孵育。随后，将细胞接种到Transwell小室中(5×104个/孔)，再将小室放置到24孔板中。对照组的Transwell小室下方孔板中加入完全培养基，其他组中加入含100ng/mL CXCL12的完全培养基，于37℃培养箱中孵育24h。弃去培养基，将小室用PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛室温固定15min，PBS洗3遍，再加入0.1％结晶紫染液处理1h，PBS洗3遍，再加入脱色液处理10min。最后，收集洗脱液，利用酶标仪测量570nm处吸光度值(OD)，计算各组相对于对照组的迁移率，计算公式为：相对迁移率＝(处理组OD值-对照组OD值)/对照组OD值。细胞迁移实验装置示意图如图22所示，细胞迁移结果如图23所示。
由图23所示的结果可以看出，当在Transwell小室下方孔板中加入100ng/mL的CXCL12后，OD值明显增加，细胞迁移率升高，表明panc-1细胞迁移到小室膜外层的细胞数量明显增多，说明CXCL12能显著促进panc-1细胞的迁移，而预先与1、5和10μM的P12或P12-GEM共孵育的panc-1细胞的迁移率均显著降低，说明P12和P12-GEM均抑制了panc-1细胞响应CXCL12介导的迁移能力；而且与同浓度的P12相比，P12-GEM的迁移抑制率无显著性差异，说明P12-GEM具有与P12相当的抑制CXCL12介导的胰腺癌细胞迁移的功能。
实施例16：多肽P12抑制胰腺癌细胞pan02与成纤维细胞NIH3T3粘附
成纤维细胞是胰腺癌中分泌CXCL12的主要基质细胞，将1×104个成纤维细胞NIH3T3接种到96孔板中培养，使细胞在孔板中形成细胞层。实验组将P12(终浓度10μM)加入到pan02细胞中孵育1h，对照组pan02细胞中仅加入完全培养基孵育1h，用PBS洗涤，再加入钙黄绿素标记pan02细胞，共培养15min后，用PBS轻轻洗去未粘附的细胞，在荧光显微镜下观察细胞粘附情况。结果如图24所示。由图24可见，对照组中成纤维细胞层上有较多荧光标记的pan02细胞粘附，而实验组的荧光细胞数量明显较少，表明P12处理可以显著抑制pan02细胞与成纤维细胞的粘附，说明多肽P12能够拮抗CXCR4/CXCL12生物轴介导的胰腺癌细胞与基质细胞的粘附。
实施例17：P12-GEM抑制胰腺癌细胞panc-1与成纤维细胞CCC-ESF-1粘附
将1×104个成纤维细胞CCC-ESF-1接种到96孔板中培养，使细胞在孔板中形成细胞层。实验组panc-1细胞与P12-GEM共孵育1h(终浓度10μM)，对照组panc-1细胞与完全培养基孵育1h。PBS洗涤后，分别加入钙黄绿素共孵育15min以标记绿色荧光。将各组panc-1细胞加入到成纤维细胞培养孔中，共培养30min后，用PBS轻轻洗去未粘附的细胞，在荧光显微镜下观察细胞粘附情况。结果如图25所示。
由图25所示的结果可见，对照组中成纤维细胞层上有较多荧光标记的panc-1细胞粘附，而P12-GEM组的荧光细胞数量显著减少，说明P12-GEM可以显著抑制panc-1细胞与成纤维细胞的粘附。
实施例18：P12-GEM对小鼠原位胰腺癌的治疗作用
C57小鼠经异氟烷麻醉后手术开腹，暴露胰腺，将pan02细胞(5×105个)与基质胶混合后注射到小鼠胰腺头部，胰腺复位后逐层缝合腹膜和皮肤，建立原位胰腺癌小鼠模型。肿瘤细胞植入后第14天对小鼠称重，根据体重将小鼠随机分成3组，每组7只：对照组(Ctrl，腹腔注射100μL 5％葡萄糖溶液)、GEM组(腹腔注射10mg/kg)和P12-GEM组(腹腔注射10mg/kg P12-GEM，其中含P12约为9mg/kg，GEM为1mg/kg)。每周给药2次，持续4周，监测小鼠生存情况，结果如图26所示。
由图26所示的结果表明，与对照组相比，P12-GEM组和GEM组小鼠生存期得到显著延长，两组治疗效果相当，表明GEM含量为1mg/kg的P12-GEM组的治疗效果与GEM含量为10mg/kg的GEM组具有可比性。上述结果说明，P12-GEM的治疗效果与按GEM剂量计的10倍剂量的GEM单药可比，因此有助于大幅降低化疗用药剂量，从而大大减少化药导致的毒副作用。
实施例19：P12-GEM逆转胰腺癌肿瘤免疫抑制微环境
根据实施例14所述，建立C57小鼠原位胰腺癌模型，根据体重将小鼠随机分成3组，每组4只：对照组(Ctrl，腹腔注射100μL 5％葡萄糖溶液)、GEM组(腹腔注射10mg/kg)和P12-GEM组(腹腔注射10mg/kg P12-GEM，其中P12约为9mg/kg，GEM为1mg/kg)。每周给药2次，持续4周。最后一次注射后的第3天，处死各组小鼠，分离肿瘤组织进行H&E和免疫荧光染色，结果分别如图27、图28和图29所示，其中图27是小鼠原位胰腺肿瘤组织H&E染色结果；图28和图29分别是肿瘤组织中T淋巴细胞和免疫抑制型巨噬细胞的免疫荧光染色结果。
由图27可见，对照组肿瘤细胞排列紧密，细胞核大深染。与对照组相比，P12-GEM和GEM组的小鼠的肿瘤区域(白色虚线)均较对照组明显减小。GEM组肿瘤组织内有一定的坏死区域，有较多的纤维组织形成，炎症细胞浸润量较少；P12-GEM组肿瘤组织面积明显减少，尤其重要的是肿瘤组织内有较多炎症细胞浸润，表明P12-GEM具有促进抗肿瘤免疫反应的功能。
由图28可见，与对照组相比，P12-GEM组的肿瘤组织中CD8+阳性杀伤性T细胞数量显著增多，表明P12-GEM促进杀伤性淋巴细胞进入到肿瘤组织内，特异性杀伤肿瘤细胞。
由图29可见，与对照组相比，P12-GEM组肿瘤组织内CD206+的免疫抑制型巨噬细胞数量明显减少，说明P12-GEM具有逆转肿瘤微环境免疫抑制状态的作用。
实施例20：P12-GEM未影响循环血液中性粒细胞和血小板数量
将健康成年C57小鼠分为三组，每组4只：对照组(腹腔注射100μL 5％葡萄糖溶液)、GEM组(腹腔注射，10mg/kg)和P12-GEM组(腹腔注射，10mg/kg)。给药24h后剪尾取外周血，用血细胞计数仪检测血液中血小板的数量，结果如图30所示。
由图30可见，与对照组相比，GEM组小鼠外周血的中性粒细胞降低了40％，淋巴细胞降低了30％，血小板降低了20％；而P12-GEM组中性粒细胞、淋巴细胞和血小板的降低程度明显低于GEM，说明P12-GEM对造血系统的影响更小，体内应用安全性更好。
在该实施例中，还研究了多肽P12和LY2510924对循环血液中血小板数量中的影响，具体包括以下操作：
将健康成年小鼠分为三组：对照组(腹腔注射100μL 5％葡萄糖溶液)、LY2510924组(皮下注射，2mg/kg)、和P12组(腹腔注射，2mg/kg)，每组4只。给药24h后剪尾取小鼠外周血，用血细胞计数仪检测血液中血小板的数量，结果如图31所示。由图可见，对照组小鼠外周血中血小板数量为9.6±1.5，注射LY2510924后，小鼠血液中血小板数量降低到5.7±1.2，血小板数减少到正常对照的60％，而注射P12后，小鼠外周血中血小板的数量为9.7±1.3，与对照组没有差别，说明多肽P12没有血小板毒性，而LY2510924对血小板数量产生了显著影响，具有明显的血小板毒性。
实施例21：P12-2GEM抑制小鼠胰腺癌细胞pan02细胞的活性
将pan02细胞按照每孔1×104个接种到96孔板中，待细胞过夜贴壁后，将不同浓度的P12-2GEM加入相应孔中(终浓度0、0.25、1、5μM)，孵育48小时后加入CCK-8试剂，在37℃温箱中孵育2h，用酶标仪检测450nm吸光度值，按下列公式计算P12-2GEM对细胞活性的影响：细胞相对活性(％)＝(药物处理组OD值-背景OD值)/(对照组OD值-背景OD值)×100％。其中对照为未经任何处理、正常培养的细胞。结果如图32所示。
从图32所示的检测结果可以看出，P12-2GEM在0.25μM及以上浓度时显著抑制胰腺癌细胞活性，说明P12-2GEM具有GEM的细胞毒作用，且毒性强于P12-GEM(见图11)，表明相对于在多肽P12上偶联一个GEM分子，在多肽P12上偶联两个GEM分子的P12-2GEM可以发挥更强的细胞毒作用。
实施例22：P12-2GEM抑制CXCL12介导的panc-1细胞的迁移
panc-1细胞与不同浓度的P12-2GEM共孵育1h，终浓度分别为0、1、5和10μM，对照组加入完全培养基孵育。随后，将细胞接种到Transwell小室中(5×104个/孔)，再将小室放置到24孔板中。对照组的Transwell小室下方孔板中加入完全培养基，其他组中加入含100ng/mL CXCL12的完全培养基，于37℃培养箱中孵育24h。弃去培养基，将小室用PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛室温固定15min，PBS洗3遍，再加入0.1％结晶紫染液处理1h，PBS洗3遍，再加入脱色液处理10min。最后，收集洗脱液，利用酶标仪测量570nm处吸光度值(OD)，计算各组相对于对照组的迁移率，计算公式为：相对迁移率＝(处理组OD值-对照组OD值)/对照组OD值。细胞迁移实验装置示意图如图22所示，细胞迁移结果如图33所示。
由图33所示的结果表明，在Transwell小室下方孔板中加入100ng/mL的CXCL12后，OD值明显增加，细胞迁移率增加，说明CXCL12显著促进panc-1细胞的迁移。预先与1、5和10μM的P12-2GEM共孵育的panc-1细胞的迁移率均显著降低，说明P12-2GEM抑制了CXCL12介导的panc-1细胞的迁移能力。
实施例23：P12-2GEM抑制CXCL12介导的panc-1细胞与成纤维细胞CCC-ESF-1的粘
附
将1×104个成纤维细胞CCC-ESF-1接种到96孔板中培养，使细胞在孔板中形成细胞层。实验组panc-1细胞与P12-2GEM共孵育1h(终浓度10μM)，对照组panc-1细胞在完全培养基中孵育1h。PBS洗涤后，分别加入钙黄绿素共孵育15min以标记绿色荧光。将标记的各组panc-1细胞加入到成纤维细胞层中，共孵育30min后，用PBS轻轻洗去未粘附的细胞，在荧光显微镜下观察细胞粘附情况。结果如图34所示。
由图34可见，对照组中成纤维细胞层上有较多荧光标记的panc-1细胞粘附，而P12-2GEM组的荧光细胞数量明显较少，表明P12-2GEM可以显著抑制panc-1细胞与成纤维细胞的粘附。
实施例24：P12-2GEM增强淋巴细胞杀伤Pan02细胞作用
将pan02细胞(5×105)与基质胶混合后，注射到小鼠胰腺头部，建立原位胰腺癌小鼠模型。在模型建立14天时称重，根据体重将小鼠随机分成2组：对照组(Ctrl，腹腔注射100μL 5％葡萄糖溶液)和P12-2GEM组(腹腔注射10mg/kg P12-2GEM)，每组4只。每周给药2次，持续4次。最后一次注射第3天，处死小鼠，分离小鼠脾脏。脾脏经研磨后，用淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，加入到预先贴壁的pan02细胞中，培养4h后，检测pan02细胞活性。图35给出了对照组和P12-2GEM组小鼠脾淋巴细胞对pan02细胞杀伤作用。
由图35可见，P12-2GEM组脾淋巴细胞对pan02细胞的杀伤作用显著提升，说明P12-2GEM可提高淋巴细胞杀伤肿瘤细胞作用，促进荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应属于本发明的内容。
Claims (10)
1.一种多肽-药物偶联物，其由多肽P12和化疗药物偶联而成，其中：
所述多肽P12的氨基酸序列为：QGCRRRNTVDDWISRRRAL，或X1-GX2G-QGCRRRNTVDDWISRRRAL，其中：X1为空、或为生物素biotin、或为荧光分子；X2为空、或为氨基酸C。
2.根据权利要求1所述的多肽-药物偶联物，其中所述化疗药物为吉西他滨(GEM)；可选地，在一个多肽P12上偶联有一个或两个GEM。
3.根据权利要求2所述的多肽-药物偶联物，其中所述化疗药物偶联至所述多肽P12的氨基酸C上；可选地，通过将所述GEM中的羟基与马来酰亚胺基丙酸中的羧基通过酯键连接，并将得到的化合物再与所述多肽P12中的氨基酸C的巯基通过硫醚键进行加成反应，进而将所述化疗药物GEM偶联至所述多肽P12的氨基酸C上。
4.权利要求1-3中任一项所述的多肽-药物偶联物在制备CXCR4拮抗剂中的应用。
5.权利要求1-3中任一项所述的多肽-药物偶联物在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述药物的剂型包括液体制剂、冻干粉制剂。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其中所述药物通过抑制CXCR4/CXCL12生物轴介导的胰腺癌细胞、胰腺癌肿瘤组织中基质细胞(如巨噬细胞和成纤维细胞)的下游信号通路(如Erk、p38等)的磷酸化，和/或化疗药物的细胞毒作用，来治疗胰腺癌。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其中所述药物通过抑制CXCR4/CXCL12生物轴介导的胰腺癌细胞的迁移，和/或化疗药物的细胞毒作用来治疗胰腺癌。
9.根据权利要求5或6所述的应用，其中所述药物通过抑制CXCR4/CXCL12生物轴介导的胰腺癌细胞与胰腺癌肿瘤组织中基质细胞的粘附，和/或化疗药物的细胞毒作用，来治疗胰腺癌。
10.根据权利要求5或6所述的应用，其中所述药物通过促进杀伤性淋巴细胞进入到肿瘤组织内，以及逆转肿瘤微环境免疫抑制状态，和/或化疗药物的细胞毒作用，来治疗胰腺癌。
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