KR102552061B1 - 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 본 발명은 힘 옥시게나아제 1 억제제를 포함하는 폴리머 코어(core) 및 표적화 모이어티를 포함하는 지질 막(shell)을 포함하는 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP) 및 이를 포함하는 약학적 조성물 및 키트에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 상기 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자, 상기 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자의 제조방법, 상기 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물 및 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 제조용 키트를 제공할 수 있다.

Description

이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자{DUAL TARGETING LIPID-POLYMER HYBRID NANOPARTICLES}
본 발명은 힘 옥시게나아제 1 억제제를 포함하는 폴리머 코어(core) 및 표적화 모이어티를 포함하는 지질 막(shell)을 포함하는 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP) 및 이를 포함하는 약학적 조성물 및 키트에 관한 것이다.
최근까지도 암 치료의 주된 방법은 국소치료로 수술 및 방사선치료, 전신치료로 항암화학용법 및 분자표적치료가 주를 이르고 있다. 이러한 치료방법들은 종양의 세포형태, 병기, 재발유무 및 환자의 치료에 대한 순응도에 따라 단독, 또는 다양한 병합요법으로 환자에게 적용된다. 그러나, 다문학적 접근을 비롯하여 암 치료율을 개선하려는 다양한 노력에도 불구하고 지난 수십 년 동안 환자 생존률의 개선은 미미한 상태이다. 최근 들어 환자의 삶의 질과 관련하여 장기보존 치료방법의 비중이 커지고, 또한 원격전이가 생존율에 미치는 영향을 고려하여 암종을 전신질환으로 보는 관점이 부각됨에 따라 항암화학용법을 포함한 치료 요법이 암 치료에 있어 부각되고 있다.
기존 항암화학제의 경우에는 정상세포와 암세포의 구분 없이 비특이적으로 체내에 분포함으로써 암세포를 죽일 수 있는 충분한 종양세포 내 약물농도를 얻기가 어려우며, 동시에 정상세포에 미치는 독성으로 인하여 불충분한 치료가 이루어져 왔다. 더욱이 몇몇 불수용성 항암제의 경우 약물의 정맥투여에 어려움이 따르며, 약물을 녹이기 위해 사용되는 유기용제에 따른 다양항 부작용 또한 문제가 되고 있다.
한편, 나노입자(nanoparticles, NPs)는 마이크론 이하 크기의 입자, 기구, 또는 체계를 이르며 금속, 세라믹, 폴리머, 지방, 단백질 등 다양한 물질로 만들 수 있다. 이와 같이 크기가 매우 작기 때문에 혈관-뇌 장벽(blood-brain barrier)과 같은 체내의 다양한 장벽을 통과할 수 있으며, 또한 크기에 비해 상대적인 부피의 비율이 크지 않기 때문에 많은 양의 약물을 로딩하여 전달할 수 있다. 약물 전달 시스템(drug delivery system)에 이용되는 대부분의 나노입자들은 정맥투여가 가능하도록 수용성이며, 체내에 축적되지 않고 정상적인 대사기능을 통하여 배출될 수 있는 성질을 가지고 있다.
또한, 지질-폴리머 하이브리드 나노입자는 약물 전달 시스템에서 지질 및 폴리머 나노입자 모두의 특성을 융합하기 위한 발판으로 사용되고 있다. 지질막은 약물을 지나친 누출로부터 보호하는 장벽 역할을 하고 제어 약물 방출을 달성하도록 지원하며 폴리머는 지질막의 구조 안전성을 돕는다. 또한, 효과적인 약물 표적화를 위한 약물의 전달을 위해 하이브리드 나노입자 표면에 분자 프로브를 이용한 연구가 수행되고 있다. 예컨대, 하이브리드 나노입자 표면은 엽산, 트란스페린, 단일클론항체, 펩티드, 사이토카인, DNA 염기서열, 면역치료용 특정 항체 또는 항체의 조각으로 바꿀 수 있다.
이러한 지질-폴리머 하이브리드 나노입자는 효적 암 조직에 화합요법 약물을 전달하고 특정한 외부나 내부 자극을 통해 약물을 방출하게 하는 방법으로 치료 효과를 개선하고 부작용을 최소화하기 때문에 암 치료 분야에 있어서 화두가 되고 있는 분야이다.
Jae-Won Shim, Lorenz Studer. et al. 2011, Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 하이브리드 폴리(락티드-co-글리콜리드) 나노입자: 설계와 약물전달 시스템 전망, 한국과학기술연구원 김학주.
본 발명의 목적은 힘 옥시게나아제 1 억제제를 포함하는 폴리머 코어(core) 및 표적화 모이어티를 포함하는 지질 막(shell)을 포함하는 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 힘 옥시게나아제 1 억제제 및 폴리머 혼합물을 지질 수용액에 적가하고 소니케이션(sonication)을 수행하여 지질-폴리머 하이브리드 나노입자를 생성하는 단계; 및
상기 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 상에 표적화 모이어티를 형성하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적화 모이어티를 포함하는 용기 및 지질-폴리머 하이브리드 나노입자를 포함하는 용기를 포함하는 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP) 제조용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,
힘 옥시게나아제 1 억제제를 포함하는 폴리머 코어(core) 및 표적화 모이어티를 포함하는 지질 막(shell)을 포함하는 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)를 제공한다.
또한, 본 발명은,
힘 옥시게나아제 1 억제제 및 폴리머 혼합물을 지질 수용액에 적가하고 소니케이션(sonication)을 수행하여 지질-폴리머 하이브리드 나노입자를 생성하는 단계; 및
상기 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 상에 표적화 모이어티를 형성하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은, 또한,
상기 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은, 또한,
표적화 모이어티를 포함하는 용기 및 지질-폴리머 하이브리드 나노입자를 포함하는 용기를 포함하는 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP) 제조용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 힘 옥시게나아제 1 억제제를 포함하는 폴리머 코어(core) 및 표적화 모이어티를 포함하는 지질 막(shell)을 포함하는 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)를 제공한다.
상기 힘 옥시게나아제 1(heme oxygenase 1, HO1)은 항산화, 힘(heme) 분해성 효소로서 다양한 조직에서 세포 보호기능을 갖는 것으로 알려진 효소로서, 이러한 HO1 억제제는 면역 항암 체크포인트(checkpoint) 억제제로서 사용되고 있다.
면역 항암 체크포인트 억제제는 면역관문 억제제 또는 면역항암제로도 알려진 물질로, 암세포가 가지고 있는 체크 포인트인 면역관문 단백질이 T 세포와 결합하면 T 세포의 기능이 상실된다.
종래 암세포의 면역관문 단백질을 무력화시키는 항암 체크포인트 억제제로는 FDA가 승인한 제품들이 있다. 예컨대, 티쎈트릭(성분명: 아테졸리주맙)은 비소세포폐암, 요로상피암, 소세포폐암, 삼중음성유방암에 대한 적응증을 인정받았고, 임핀지(성분명: 두발루맙)는 방광암, 비소세포폐암에 대한 적응증을 인정받았으며, 여보이(성분명: 이필리무맙)는 흑색종, 신세포암(신장암)에 대한 적응증을 인정받았고, 키트루다(성분명: 펨브롤리주맙)는 흑색종, 비소세포폐암, 신세포암, 포지킨림프종, 두경부암, 요로상피암에 대한 적응증을 인정받았으며, 옵디보(성분명: 니볼루맙)는 흑색종, 비소세포폐암, 신세포암, 포지킨림프종, 두경부암, 위암에 대한 적응증을 인정받았다.
본 발명에 있어서, 면역 항암 체크포인트 억제제(또는 면역관문 억제제)는 상기 힘 옥시게나아제 1 억제제(heme oxygenase 1 inhibitor) 외에도 당업계에 알려진 항암 체크포인트 억제제라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, CTLA-4 억제제, PD-1 및 PD-L1 억제제가 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자는 표적화 모이어티를 포함하는 지질 막을 포함한다. 상기 지질 막(shell)은 나노입자에서 약물을 지나친 누출로부터 보호하는 장벽 역할을 하고 제어 약물 방출을 달성하도록 지원하고, 또한 표적 세포에 대한 유입을 증가시킨다.
일 실시예에서, 본 발명의 지질 막을 구성하는 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000, DSPE-PEG2000), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dilauroylsn-glycero-3-phosphocholine: DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dimyristoyl-snglycero-3-phosphocholine: DMPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: DOPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine: DMPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine: DPPE), 1,2-디올레오일 -sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine: DOPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-인산(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate: DMPA-Na), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3- 인산(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate: DPPA-Na), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-인산(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate: DOPA-Na), 1,2-디미리스토일-sn 글리세로-3-포스포글리세롤(1,2-Dimyristoyl-sn glycero-3-phosphoglycerol: DMPG-Na), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol: DPPG-Na), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol: DOPG-Na), 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤-3-포스포세린(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoserine: DMPS-Na), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포세린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoserine: DPPS-Na), 1,2-디올레오일 sn-글리세로-3-포스포세린(1,2-Dioleoylsn-glycero-3-phosphoserine: DOPS-Na), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine: DOPE-Glutaryl-(Na)2), 테트라밀리스노일 카르디올리핀-(Na)2(Tetramyristoyl Cardiolipin-(Na)2), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine: DSPE-mPEG-2000-Na), DSPE-mPEG-5000-Na, DSPE- 말레이미드 PEG-2000-Na(DSPE-Maleimide PEG-2000-Na), 1,2-디올레오일-3-트리메틸 암모늄-프로판(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane: DOTAP-Cl), 및 이들의 조합 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 본 발명의 지질 막에는 표적화 모이어티가 비공유결합을 통해 고정되어 있다.
한 구체예에서, 상기 비공유결합은 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙트아비딘 결합인 것을 포함한다.
구체적으로, 상기 비오틴은 지질의 일 말단에 결합되어 있는 형태일 수 있고, 상기 아비딘 또는 스트렙트아비딘은 표적화 모이어티 일말단에 결합되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)는 힘 옥시게나아제 1 억제제를 포함하는 폴리머 코어를 포함한다.
상기 기술한 바와 같이, 면역 항암 체크포인트 억제제(또는 면역관문 억제제)로서 힘 옥시게나아제 1 억제제(heme oxygenase 1 inhibitor)가 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 힘 옥시게나아제 1 억제제는 SnMP, ZnMP, FeMP, MnMP, CrMP, SnPP, CrPP 및 MnPP로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 힘 옥시게나아제 1 억제제를 포함하는 폴리머 코어는 나노입자의 지질 막의 구조 안전성을 돕는 역할을 하고, 또한 폴리머 코어는 나노입자 내에 난용성/불용성 약물의 로딩을 위해 사용되었으며, 폴리머 코어 내에는 상기 힘 옥시게나아제 1 억제제가 로딩(loading)될 수 있다.
한 구체예에 있어서, 상기 힘 옥시게나아제 1 억제제는 표적 세포에 도달하여 유효한 효과를 나타낼 수 있는 양으로 폴리머 코어에 로딩되며, 바람직하게는 상기 폴리머 질량을 기준으로 3 내지 7w/w%, 더욱 바람직하게는 4 내지 6.3w/w%으로 상기 폴리머 코어에 로딩(loading)될 수 있다.
본 발명에 있어서, 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)에 포함되는 폴리머는 당업계에서 사용되는 생체 적합 폴리머라면 크게 제한되지 않으나, 폴리(L-락티드)(PLLA), 폴리글리톨산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리[(락틱-co-글리콜산)](PLGA), 폴리카프로락톤(PCL) 및 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이들의 공중합체를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 지질 막과 상기 폴리머 코어는 폴리머와 지질이 1 :0.15 내지 0.35 질량비, 바람직하게는 0.20 내지 0.30 질량비로 혼합될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)는 DSPE-PEG2000 (biotinylated: non-biotinylated)과 DPPC를 1:1 내지 5의 몰 비율로 혼합하여 폴리머 혼합물을 제조한 후, 상기 폴리머 혼합물을 지질 수용액에 한 방울씩 떨어뜨려 혼합한 후 소니케이션(sonication)을 진행하여 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(hNP)를 생성한다. 그 다음 상기 생성된 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 상에 표적화 모이어티를 형성시키면 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)를 제조하였다.
따라서, 본 발명은 힘 옥시게나아제 1 억제제 및 폴리머 혼합물을 지질 수용액에 적가하고 소니케이션(sonication)을 수행하여 지질-폴리머 하이브리드 나노입자를 생성하는 단계; 및
상기 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 상에 표적화 모이어티를 형성하는 단계를 포함하는 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)의 제조방법을 제공한다.
한편, 본 발명은 상기 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)는 동결건조된 형태일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)는 직경이 150 내지 200 nm인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 혈액암(acute myeloid leukaemia), 방광암(bladder cancer), 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 흑색종(melanoma), 전이성흑색종(metastatic melanoma), 폐암(lung cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 비호지킨림프종(non-Hodgkin ' s lymphoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 뇌암(brain cancer) 신경교종(glioma) 또는 교아 세포종(glioblastoma)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물에서, 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)는 앞서 기술한 모든 내용을 그대로 적용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리 식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 또는 활택제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 약학 조성물은 주사 제형일 수 있으며, 정맥내 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 약물의 제조, 사용 및 판매를 관장하는 정부 기관에 의해 지시된 형태로 포장과 연계된 지시서가 수반될 수 있으며, 상기 지시서는 조성물의 형태 또는 인간이나 동물 투여에 관하여 상기 기관의 승인을 나타내고 있고, 예를 들어, 약물의 처방에 대하여 미국 식품의약국에서 승인된 표지일 수 있다.
한편, 본 발명에서 "이중표적(dual target)"이란, 본 발명의 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)가 두 가지 종류의 세포를 표적으로 하는 것을 의미한다. 상기 두 가지 종류의 세포는 구체적으로, 암세포와 종양 환경 세포(cancer-associated environmental cell)를 의미하며, 예컨대, 암세포는 급성 골수성 혈액암 세포, 종양 환경 세포는 백혈병-관련 골수 세포(leukemia-associated myeloid cell)를 의미한다.
일 실시예에 있어서, 상기 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)가 암세포를 표적으로 할 때는 힘 옥시게나아제 1 억제제가 암세포가 항암제에 대한 반응성이 높아지도록 작용(active targeting)을 하며, 종양 환경 세포를 표적으로 할 때는 종양 환경 내의 대식세포에서 면역 항암 체크포인트(checkpoint) 물질로 작용하는 힘 옥시게나아제 1을 저해하는 작용(passive targeting)을 하는 것을 확인하였다(도 1).
따라서, 상기 약학 조성물은 항암제와 병용 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 닥티노마이신(Dactinomycin), 독소루비신(Doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin) 및 마이토마이신(Mitomycin), 블레오마이신(Bleomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "표적화 모이어티(targeting moiety)"는 항체-항원 결합에서와 같이 수용체-리간드 결합에서의 수용체가 결합할 수 있는 부분을 갖는 물질을 의미한다. 상기 표적화 모이어티는 일 말단에 상기 수용체가 결합된 형태로 표적 세포에 결합하는데, 구체적으로 상기 표적화 모이어티는 항체 및 이들의 인간화, 키메라 또는 단일사슬 형태, 및 이들의 다른 결합 단편과 변이체를 포함한다.
상기 결합 단편은 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 scFv 단편이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 상기 표적화 모이어티는 예를 들어, 단일 사슬(single chain) 항체일 수 있으며, 상기 단일 사슬 항체에 상기 수용체가 결합된 형태, 즉, scFv-단일 아비딘 재조합(scFv-monomeric avidin fusion, sFVA) 단백질 형태로 표적 세포와 결합할 수 있다.
한편, 본 발명은 표적화 모이어티를 포함하는 용기 및 지질-폴리머 하이브리드 나노입자를 포함하는 용기를 포함하는 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP) 제조용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 본 발명에 기재된 조성물을 포함하는 1개 이상의 용기를 포함하며, 필요에 따라 약물의 제조, 사용 및 판매를 관장하는 정부 기관에 의해 지시된 형태로 포장과 연계된 지시서를 포함할 수 있다. 키트는 적합한 개체의 선택 또는 치료에 관한 설명을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 치료상 유효량의, 상기 힘 옥시게나아제 1 억제제를 포함하는 폴리머 코어(core) 및 표적화 모이어티를 포함하는 지질 막(shell)을 포함하는 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP) 또는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 개체는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나, 전적으로 증진시키는데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물의 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적인 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료”는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병 상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 발명은 힘 옥시게나아제 1 억제제를 포함하는 폴리머 코어(core) 및 표적화 모이어티를 포함하는 지질 막(shell)을 포함하는 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP), 상기 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자의 제조방법, 상기 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물 및 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 제조용 키트를 제공할 수 있다.
도 1: 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)가 급성 골수성 혈액암(acute myeloid leukaemia, AML) 세포를 표적으로 하여 힘 옥시게나아제 1 억제제가 암세포가 항암제에 대한 반응성이 높아지도록 작용(active targeting)하는 화학-감작화(chemo-sensitization); 및 백혈병-관련 골수 세포(leukemia-associated myeloid cell, LAM)을 표적으로 하여 종양 환경 내의 대식세포에서 면역 항암 체크포인트(checkpoint) 물질로 작용하는 힘 옥시게나아제 1을 저해하는 작용(passive targeting)을 하는 면역-재프로그래밍(immuno-reprogramming)의 도식을 보여준다.
도 2: 본 발명의 scFv-단일 아비딘 재조합(scFv-monomeric avidin fusion) 단백질의 제조 및 특성을 보여준다: a) 재조합 단백질 sFVA의 구조, b) 정제된 sFVA 단백질의 SDS-PAGE 데이터, c) sFVA의 Hig-tag 면역 검출, d) 항-CD-64 단일 항체를 사용한 경쟁 분석(competition assay), e) 비오틴 결합에 대한 아비딘-FIRC를 사용한 경쟁 분석, f) sFVA/비오틴-FITC의 농도 의존적 세포 결합.
도 3: 본 발명에 따른 지질-폴리머 하이브리드 나노입자의 최적화 및 특성을 보여준다: a) 하이브리드 나노입자 제조에서 지질 및 폴리머(PLGA) 비율의 최적화, b) 하이브리드 나노입자 제조를 위한 힘 옥시게나아제 1 억제제 및 폴리머(PLGA) 비율의 최적화, c) 비어있는 하이브리드 나노입자 및 힘 옥시게나아제 1 억제제가 로딩된 하이브리드 나노입자의 주사 전자 현미경 이미지(scanning electron microscopy image).
도 4: 본 발명에 따른 지질-폴리머 하이브리드 나노입자의 최적화 및 특성을 보여준다: a) 하이브리드 나노입자의 안정성 시험, b) sFVA-결합 하이브리드 나노입자의 최적화, c) 약물 로딩 효율 및 캡슐화 효율 시험, d) 약물 방출 시험.
도 5: 본 발명에 따른 하이브리드 나노입자의 향상된 세포 흡수율을 보여준다. 백혈병 세포에서 cys-5로딩된 하이브리드 나노입자의 시험관내(in vitro) 세포 흡수율을 보여준다.
도 6: 본 발명에 따른 하이브리드 나노입자의 향상된 세포 흡수율을 보여준다. 일정 농도로 하이브리드 나노입자를 처리한 후 세포에서, 하이브리드 나노입자의 세포 흡수에 대한 공초좀현미경 이미지(confocal microscopy image)를 보여준다.
도 7: 본 발명에 다른 sFVA 매개 골수 백혈명 세포 표적화 및 급성 골수성 혈액암 모델에서 본 발명의 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자의 생물학적 분포를 보여준다: a) 골수 세포에서 대한 실험 절차 및 FACS 게이팅(FACS gating) 전략, b) 인간 CD33 + 골수 U937 세포에 대한 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 흡수의 대표적인 도트 플롯(dot plot), c) 마우스 CD45 + CD11b + 골수 면역 세포에 대한 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 흡수의 대표적인 도트 플롯, d) U937 세포에 대한 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 흡수율에 대한 막대 그래프 및 마우스 면역 세포.
도 8: 본 발명에 따른 sFVA 매개 골수 백혈명 세포 표적화 및 급성 골수성 혈액암 모델에서 본 발명의 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자의 생물학적 분포를 보여준다: a) 본 발명에 따른 하이브리드 나노입자(지질-폴리머 하이브리드 나노입자 및/또는 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자)의 생체 분포를 위한 장기 이미지(organ image), b) 본 발명에 따른 하이브리드 나노입자 주입 후 24시간에 하이브리드 나노입자의 장기 분포에 대한 총 복사 효율(total radiant efficiency), c) 대퇴골 및 경골의 하이브리드 나노입자에 대한 평균 복사 효율.
도 9: 백혈병 세포에서 본 발명에 따른 하이브리드 나노입자의 시험관내(in vitro) 화학-감작 효과를 보여준다: a) 백혈병 세포에서 DNR 반응성 힘 옥시게나아제 1 과발현의 웨스턴 블롯 이미지, b) THP-1 백혈병 세포에서 세포 생존력 시험, c) U937 백혈병 세포에서 세포 생존력 시험.
도 10: 백혈병 세포에서 본 발명에 따른 하이브리드 나노입자의 시험관내(in vitro) 화학-감작 효과를 보여준다: 백혈병 세포에서 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자에 의한 화학-감작을 위한 세포자멸 분석.
도 11: 백혈병 세포에서 본 발명에 따른 하이브리드 나노입자의 시험관내(in vitro) 화학-감작 효과를 보여준다: 백혈병 세포에서 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자에 의한 화학-감작을 위한 세포자멸 분석의 막대 그래프를 보여준다.
도 12: 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자와 항암제(daunorubicin)의 병용 투여가 백혈병 성장을 억제하는 것을 보여준다: 생체내(in vivo) 치료를 위한 실험적 일정.
도 13: 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자와 항암제(daunorubicin)의 병용 투여가 백혈병 성장을 억제하는 것을 보여준다: a) 골수에서 백혈병의 성장, b) 간에서 백혈병의 성장, c) 비장 이미지.
도 14: 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자와 항암제(daunorubicin)의 병용 투여가 백혈병 성장을 억제하는 것을 보여준다: a) 비장 무게에 대한 막대 그래프, b1) 골수에서 인간 CD33+ U9374 세포에 대한 세포사멸 분석, b2) 살아있는 세포(Annexin V-, 7AAD-) 및 세포사멸 세포(Annexin V+) 그래프, c) qRT-PCR 분석.
도 15: 골수 세포에서 본 발명의 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자의 면역-리프로그래밍 및 활성화 효과를 보여준다: a) 골수 세포에 대한 게이팅 전략, b) CD11b + 골수 세포 대 CD45 + 총 면역 세포의 비율, c) 총 골수 세포에서 F4 / 80-hi, CD206-M1 유사 대 식세포의 비율, d) 총 골수 세포에서 Gr1-int 및 F4 / 80-int 단핵구 세포의 비율, e) 총 골수 골수 세포에서 Ly6c-int 및 Ly6c-himonocyte의 비율.
도 16: 골수 세포에서 본 발명의 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자의 면역-리프로그래밍 및 활성화 효과를 보여준다: a) 골수 CD11b + Ly6c + 단핵구에서 세포 내 IL-12p70 발현의 유세포 분석, b) 골수 CD11b + Ly6c + 단핵구에서 세포 내 TNF-α 발현의 유세포 분석, c) 골수에서 면역 활성화 및 단핵구 / 대식세포 활성화 마커 유전자 발현 수준, d) 골수에서 면역 억제 및 M2 유사 대 식세포 마커 유전자 발현 수준.
도 17: 골수 세포에서 본 발명의 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자의 면역-리프로그래밍 및 활성화 효과를 보여준다: CD11b + 골수 세포에 대한 자기 세포 분류 및 생체외(ex vivo) 분석을 위한 실험 계획, C57BL / 6 마우스로부터 골수 세포를 수확하고 분류 전후에 유세포 분석으로 분석하였다.
도 18: 골수 세포에서 본 발명의 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자의 면역-리프로그래밍 및 활성화 효과를 보여준다: a) 세포사멸성 백혈병에 대한 반응으로 힘 옥시게나아제 1이 억제된 CD11b + 골수 세포에서 마커 유전자 발현 수준, b) 화학 요법에 반응하는 HO1- 억제 된 CD11b + 골수성 세포에서의 마커 유전자 발현 수준.
도 19: 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자에 의한 화확- 및 면역- 이중표적 치료의 생존 연구 및 치료 메커니즘을 보여준다: a) 생존 연구를 위한 실험 일정, b) 생존 연구, c) 체중 그래프.
도 20: 본 발명에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자에 의한 화확- 및 면역- 이중표적 치료의 생존 연구 및 치료 메커니즘을 보여준다: 본 발명에 따른 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자에 의한 치료 메커니즘.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예]
- 재료
SnMP, DNR hydrochloride, poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA, lactide: glycolide 50:50, 7000-17000 Da), 및 biotin-FITC는 시그마 알드리치로부터 구매 (St. Louis, MO, USA) 하였다.
n-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000] (DSPEPEG2000-Biotin), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000)는 아반티 폴라 지질 (Alabaster, AL, USA)에서 구매하였다. CD33, CD64, CD11b, CD45, CD206, ly6c, Gr1, TNF-a, IL12p70, Rat IgG1 isotype 항체는 BD Biosciences (USA)에서 구매하였다.
F4/80, Avidin-FITC는 Biolegend (San Diego, CA, USA)에서 구매하였고, CCR2 항체는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구매하였으며. His-Tag, HO1 (P249), β-actin (13E5) 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers MA, USA)로부터 구매하였다.
- 벡터(vector)의 제작
429, 888 base pair의 monomeric Avidin과 CD64 단일사슬 항체 재조합 단백질 발현 서열 각각은 박테리아 발현용 pET21a (Novagen, Madison, WI) 벡터의 NotI, XhoI 사이트 사이, XbaI, NotI 사이트 사이에 삽입되었다.
-하이브리드 나노입자의 제조
DSPE-PEG2000 (biotinylated: non-biotinylated, 5:1의 비율)와 DPPC는 몰 비율 1:3으로 섞은 후, 상온에서 1시간 보관하여 클로로폼(Chloroform)을 날려 제거하였다.
준비된 지질에 10ml의 증류스 (4% EtOH)를 넣어 지질 수용액을 준비하고 (0.2 mg mL-1) 골고루 섞어주었다.
SnMP (400 μg)는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 4 mg mL-1로 준비하고 PLGA (7.2 mg)는 다이클로로메테인(dichloromethane)에 2.4 mg mL-1 농도로 각각 준비하였다.
SnMP 용액 36μl와 PLGA 용액 800μl를 섞어 총 836 μL 부피로 섞고, 천천히 한 방울씩 떨어뜨려 2.4 mL의 지질 용액에 섞어준 후 (PLGA:지질 부피비=1:3), 소니케이션(sonication)을 진행하고, 상온에서 천천히 교반(stirring)하여 다이클로로메테인을 날려 제거하였다.
준비된 나노입자 (1 mg mL-1)는 cellulose membrane (MWCO 30,000 Da)을 이용하여 농축, 세척하여 최종 2.5 내지 10 mg mL-1의 농도로 보관하였다.
- sFVA 재조합 단백질의 발현 및 정제
BL21 (DE3) 박테리아 세포 (Novagen, Madison, WI)를 sFVA 발현용 pET21a 벡터를 이용하여 형질 전환하였고, 20mL의 Amp+ lysogeny broth (LB), 37 ℃에서 증식시켰다.
또한, 2 내지 4시간의 박테리아 증식 이후 0.5L의 LB medium으로 옮겨 증식시켰다. Optical density (600nm)에서의 흡광도가 0.2 내지 0.3이 되었을 때, 1 mM 농도로 isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside (IPTG)을 넣어 주어 37 ℃에서 4시간동안 박테리아의 단백질 발현을 유도하였다.
4시간의 단백질 발현 후 박테리아를 원심분리를 이용하여 모은 후 lysis buffer (pH 8.0)에 풀어준 후, 소니케이션을 하여 세포막을 붕괴하여, 발현된 단백질 용액을 얻었다. 얻어진 용액을 27,500g force에서 원심분리하여 0.45μm로 필터링하였다.
- 크로마토그라피 이용 단백질 정제
얻어진 단백질 용액은 Ni-NTA 아가로즈 레진 (Qiagen)을 이용하여 His-Tag - Ni-NTA 결합하고 세척 버퍼(buffer)로 비특이적 박테리아 단백질들은 제거하였다.
Ni-NTA 아가로즈 레진에 붙은 단백질을 250mM의 이미다졸 용출 버퍼(imidazole elution buffer)를 이용하여 용출시키고 sFVA 단백질을 얻었다.
정제된 sFVA 단백질은 Slide-A-Lyzer 투석 카세트 (Thermo Fisher Scientific, 12mL, CA;MWCO 10,000Da)를 이용하여 투석하고 항원 결합 기능을 복구하여 최종적으로 Phosphate buffered saline (PBS, pH7.4)에 보관하였다.
얻어진 sFVA 단백질은 셀룰로오스 멤브레인(cellulose membrane) (MWCO 10,000Da)를 이용하여 농축하였다.
- 세포 배양
인간 세포주 THP-1과 U937 혈액암 세포는 ATCC (Virginia, USA)로부터 구매하였다.
37 ℃, 5% 이산화탄소, 세포 배양액 RPMI1640 medium (Welgene, Korea, 10% fetal bovine serum and 1% penicillin)에서 배양하였다.
- SDS-PAGE & 웨스턴 블롯(Western Blotting)
정제, 투석된 PBS 상의 단백질은 Laemmli buffer (5mM dithiothreitol)와 부피비 1:1로 섞어주고 15분간 95 ℃로 가열하여 12% SDS-PAGE 겔에 로딩, 전기영동하였다.
전기영동 후 겔을 코마지 블루(Coomassie blue)로 염색하거나, PVDF 막으로 이동시켜 His-Tag 항체 (Cell Signaling Technology, Danvers MA, USA), 항 rabbit IgG 항체-HRP (Santa Cruz, Texas, DA, USA)로 면역 검출하였다.
- 경쟁적 결합 실험
THP-1 세포 (2 Х 100,000 cells well-1)를 CD64 항체-FITC (BD Pharmingen)와 반응시키고 sFVA 단백질 (10 μg mL-1)로 경쟁적 결합을 하였다 (PBS, 4 ℃, 20분).
결합 이후 세포를 세척하여 유세포 분석 (FACSCalibur, BD Biosciences, USA)하였다. 비오틴(Biotin) 결합 기능을 확인하기 위해, CCR2 항체-비오틴을 부착한 세포에 대해 아비딘(avidin)-FITC를 sFVA 단백질과 경쟁적 결합시켰다.
- 약물 로딩 효율과 방출 거동 실험
SnMP가 로딩된 0.6 내지 0.7 mg의 하이브리드 나노입자 (10mg mL-1)를 이용하여 약물 로딩 효율과 방출 거동을 측정하였다.
0.6 내지 0.7mg의 나노입자를 PBS (10% DMSO)에 1 mg mL-1로 풀어주고 6, 12, 24, 48, 72시간에 각각 방출된 약물을 포함한 PBS를 얻어 냈으며, 동결 건조를 사용하여 샘플을 준비, 399 nm에서 흡광도를 측정 함으로서 SnMP의 양을 검출하였다.
- 하이브리드 나노입자의 특성 분석
준비된 나노입자 (1 mg mL-1)를 증류수(distilled water)에 희석하여 Zeta-Sizer (Malvern)으로 분석하고, 지질/PLGA, 입자/drug, 입자/sFVA 비율을 최적화하였다. 하이브리드 나노입자의 크기를 정해진 날짜 별로 측정하여 나노입자의 안정성을 검증하였다.
- 세포 유입과 형광 현미경 실험
THP-1과 U937 세포 (1 Х 106 cells mL-1)에 Cy5 형광이 로딩된 PLGA 나노입자 또는 하이브리드 나노입자를 각각 처리 (5 μg mL-1)하고, 1시간 이후 유세포 형광 분석으로 형광의 양을 측정하거나, 또는 세포를 DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech)로 핵염색한 후 형광 현미경 (Leica)으로 관찰하였다.
- 다우노루비신(Daunorubicin, DNR)에 의한 혈액암 세포 HO1 유전자 발현 증가 실험
THP1, U937 세포 (4 Х 100,000 cells mL-1)에 다양한 농도의 다우노루비신을 처리하고 24시간 뒤 세포를 RIPA buffer로 처리, 총 단백질을 전기영동하여 힘옥시게나아아제 1(HO1) 항체, β-actin 항체 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)로 면역 검출하였다.
- 세포 생존율 & 세포 사멸 실험
THP-1, U937 세포 (4-5 Х 100,000 cells mL-1, 24 well plate)에 하이브리드 나노입자 (SnMP 농도 1, 3, 5 μM)를 5시간 동안 선 처리 후 DNR을 처리하여 추가로 24시간 또는 30시간 동안 세포 배양하였다. 이후 총 세포 수는 hemocytometer로 측정하거나 Annexin V, 7AAD (BD Biosciences, USA)를 염색하여 세포 사멸을 유세포 분석하였다.
- 인간 급성 골수성 혈액암 이종 동물 모델
4-6주령의 NOD-SCID il2r gamma-/-(NSG) 마우스 (Jackson Laboratory)에 1-2 Х 1,000,000 U937 세포를 꼬리 정맥 주입하고 생존율을 SPF 조건 하에 모니터링하였다. 모든 동물 실험 방법 및 과정은 한양대학교 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)로부터 검증, 승인 받았으며 적절한 동물실험 가이드에 따라 진행하였다 (2019-0076A).
- 생체내 혈액암 표적 하이브리드 나노입자 전달 실험
U937 세포 주입 1주일 뒤, NSG 마우스의 꼬리 정맥으로 Cy5 형광이 로딩된 hNP 또는 T-hNP (Cy5 dose: 0.6 mg Kg-1)를 주입하였고, 2시간 뒤에 골수 세포를 대퇴골과 경골로부터 얻어 100 μm 크기로 필터링하였다. 적혈구 제거 후 인간 CD33 항체, 마우스 CD11b 항체, 마우스 CD45 항체 등으로 염색하여 유세포 분석하였다.
- 생체내 하이브리드 나노입자 생체 분포 실험
U937 세포 주입 10일 뒤, NSG 마우스의 꼬리정맥으로 hNP 또는 T-hNP (Cy5, 0.6 mg kg-1)를 주입하였다. 4, 24시간 뒤 마우스를 안락사 하여 주요 장기들의 형광을 VISQUE InVivo Smart (Viewworks Co, Korea)로 측정하였다. (Korea Basic Science Institute, Chuncheon).
- 생체내 혈액암 치료 효과
인간 AML 이종 동물 모델의 꼬리 정맥으로 hNP 또는 T-hNP (SnMP dose: 1.4 mg kg-1)를 4, 6, 8, 10일 째에 주입하였고 11일에 주요 혈액암 축적 장기들을 얻어 추가 분석에 사용하였다.
- 골수 내 골수성 세포 분석 및 유전자 발현 분석
4회의 hNP 또는 T-hNP, DNR 주입 후 얻어낸 총 골수 세포들을 대퇴골과 경골로부터 얻었으며 100 μm로 필터 하였다. 적혈구 제거 이후 골수성 세포 형질 분석 마커들로 염색하여 유세포 형광분석 하였다. 또한 총 RNA를 얻어 cDNA로 역전사하여 유전자 발현 분석 실험에 사용하였다. 모든 프라이머(Primer)들은 IDT DNA로부터 구매하여 사용하였다.
- 생체외(Ex vivo) 골수성 세포 재구성 실험
총 골수 세포들을 5 내지 7주령의 C57BL/6 마우스 (Orient Bio)로 부터 얻어 마그네틱 EasySep CD11b 키트 (STEMCELL Technologies, USA)로 CD11b+ 세포들만 얻어 사용하였다. 24시간 동안 hNP를 처리한 후, DNR 또는 'DNR이 처리된 U937 세포'를 배양액에 추가처리 하였다. 총 RNA를 얻어 cDNA (iScript cDNA synthesis kit, BioRad)로 역전사하여 유전자 발현 변화를 분석하였다. 'DNR이 처리된 U937'은, U937 세포를 DNR에 5시간동안 노출시킨 후 PBS로 2회 세척하여 사용하였다 (8 Х 10,000 cells mL-1).
- In vivo 치료 효과 및 생존율 향상 실험
4 내지 6 주령의 NSG 마우스의 꼬리정맥으로 1,000,000 개의 U937 세포를 주입하여 동물 모델링을 구축하였고 세포 주입 1, 3, 5, 7, 9, 11일 후에 각각 T-hNP 또는 hNP, DNR을 꼬리정맥으로 주입하여 생존율을 모니터링 하였다.
- 통계적 분석
모든 데이터는 평균(mean)±SD이나 SEM으로 표현하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism 7 Project software를 사용하여 Student's t-test, one-way ANOVA (Tukey's post-hoc test) 방법으로 분석하였다. 모든 동물 실험 데이터는 non-parametric Kruskal-Wallis test 방법으로 분석하였다.
- 결과
1. 단백질 sFVA의 제조와 특성
항 CD64 단일 사슬항체가 인간 혈액암 세포 표적 전달에 효과적인 것이 검증되었기 때문에, 항 CD64 단일사슬항체가 본연구에서 사용, 단일형태의 avidin과 재조합 되었다.
sFVA 단백질은 박테리아 발현 시스템으로부터 발현, 정제되었고 투석을 통해 항원 결합 기능을 복구하였다. 도 2b, c의 내용과 같이, sFVA 단백질의 분자량은 대략 ~43kDa로서 이론적으로 계산한 분자량과 같았다. 인간 CD64 결합과 비오틴 결합 기능을 분석하기 위해 sFVA 단백질을 상용화된 항체들과 경쟁적 분석를 하였다.
비경쟁군 대비, sFVA와 경쟁적으로 적용한 항 CD64 항체는 3.75배 적은 THP1 세포 결합을 보였고, 항 CCR2 항체는 sFVA와 경쟁적으로 기능하지 않았다 (도 2d). 항 CCR2 항체-비오틴과 아비딘-FITC를 이용한 경쟁적 분석에서도 sFVA와 경쟁적으로 작용한 군에서는 2.6배 적은 세포 결합을 보임으로서 sFVA의 비오틴 결합 능력을 검증하였다 (도 2e). 또한 비오틴-FITC와 결합된 sFVA는 농도에 비례하는 세포 결합을 보였다 (도 2f).
2. 지질-폴리머(PLGA) 하이브리드 나노입자의 최적화 및 특성
지질이 씌워진 폴리머 기반 하이브리드 나노입자는 암세포와 T세포에서 효율적인 약물 전달체로서 연구되었다.
힘 옥시게나아제 (heme oxygenase 1, HO1) 억제제를 포함하는 하이브리드 나노입자를 제작하기 위해 PLGA 고분자 코어는 다양한 비율의 DSPE-PEG2000, DPPC (몰비율 1:3) 지질과 하이브리드 나노입자를 형성하였다.
-39.86 ±2.85mV 전하와 198.5 ±2.06nm의 평균 크기를 갖는 PLGA 나노입자 대비, PLGA 질량 비 0.25배의 지질을 함께 사용하여 제작한 하이브리드 나노입자는 약간 증가된 -33.7 ±2.71mV의 전하와 평균 크기 162.9 ±8.64nm의 크기를 보였다 (도 3a). SnMP는 FDA로부터 승인된 HO1 저해제로서 고빌리루빈혈증(hyper bilirubinemia) 치료에 적용되어 왔다. 다양한 SnMP/나노입자 비 중에서 4 내지 6%의 SnMP 질량비가 최적의 약물 로딩된 양으로 검증되었고, 6%의 약물이 로딩된 하이브리드 나노입자는 214.5±0.7nm의 평균 크기를 보였다(도 3b). 도 3c에서 Scanning electron microscopy 실험은 폴리머(PLGA) 입자가 얇은 지질 막에 씌워져 있는 것을 보여준다 (화살표 표시). 제작되어, 농축 보관된 하이브리드 나노입자는 약 한달 이상 구형의 모양과, 크기, 0.1-0.2의 Poly dispersity index를 보이고, 약물이 로딩된 하이브리드 나노입자는 약물이 로딩되지 않은 빈 나노입자의 144.1 ±2.4nm 대비 약간 더 큰 181 ±3nm의 크기를 보였다 (도 4a). sFVA는 나노입자 질량 비 2.5 내지 5%의 양을 사용하는 것이 최적인 것으로 보인다 (도 4b). 도 4c에서 약물 로딩 효율은 나노입자 질량 비 5.6%의 약물을 사용하였을 때 4.99±0.15%, 나노입자 질량비 6.4%의 약물을 로딩 시 사용하였을 때는 4.98±0.21%의 효율을 보였으며 나노입자의 질량비 5%로 수렴하는 것을 검증하였다. 도 4d에서의 약물 방출 실험은 37 ℃에 보관된 나노입자로부터 72시간 뒤 약 47.08±5.45%의 약물이 방출된 것을 확인하였다.
3. 하이브리드 나노입자의 향상된 혈액암 세포 유입 기능
지질 막과 sFVA 부착에 의해 향상된 세포 유입 능력을 검증하기 위해 Cy5 형광이 로딩된 나노입자를 THP1과 U937 세포에 처리한 후, 유세포 형광분석으로 분석하였다.
Cy5 형광이 로딩된 나노입자의 크기와 표면 전하는 SnMP가 로딩된 나노입자와 비슷하였다. CD64를 발현하는 인간 AML 세포주 THP1과 U937 세포에 나노입자를 처리하였을 ?, 하이브리드 나노입자는 PLGA 나노입자 대비 각각의 세포주에서 1.62배, 3.2배의 높은 세포 유입 기능을 보였다. 하지만 1.25 내지 5%의 sFVA 부착에 의한 세포 유입 향상은 두 세포 사이에서 다른 양상을 보였다 (도 5). 형광 현미경 분석 실험은 유세포 분석 실험과 비슷한 양상의 Cy5 형광 유입을 보여주었다. 폴리머(PLGA) 나노입자 대비, sFVA가 부착되거나 그렇지 않은 하이브리드 나노입자 군들의 경우 상대적으로 높은 세포 유입을 보이고 대부분 세포질에 나노입자가 분포하였다 (도 6).
총괄적으로, 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(hNP)와 sFVA가 부착된 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP) 모두 폴리머(PLGA) 나노입자 대비 높은 세포 유입율을 보였다. 비록 5%의 sFVA 부착이 in vitro에서는 하이브리드 나노입자의 세포 유입을 방해하였으나, in vivo에서는 항체에 의한 표적 기능이 더욱 중요할 것이라고 생각하여 나노입자 질량 비 2.5%와 5% sFVA 부착이 in vivo 연구에서 사용되었다.
4. sFVA 부착에 의한 골수 내 혈액암 세포 표적 능력과 하이브리드 나노입자의 생체 분포
NSG 마우스의 꼬리정맥으로 CD64, CD33을 발현하는 U937 세포 (CD64+ CD33+)가 주입되었고, 인간 AML 이종 동물 모델 형성을 검증하였다.
인간 U937 세포는 NSG 마우스의 간과 골수에 주로 축적, 증식하며 비장 비대증과 같은 인간 AML의 병리적 현상들을 재현했다. 골수는 혈액암의 주요 장기이며, 임상과 높은 연관성이 있는 장기이기 때문에 나노입자에 의한 혈액암 표적 능력을 골수내 혈액암 세포를 통해 검증하였다.
하이브리드 나노입자 (hNP)와 sFVA가 부착된 하이브리드 나노입자 (T-hNP)를 AML 이종 동물모델에 주입하였고, 경골과 대퇴골의 골수 내 세포 유입을 유세포 형광 분석을 통해 분석하였다 (도 7a). 도 7b와 같이, sFVA가 부착된 T-hNP는 인간 CD64+ CD33+ U937 혈액암 세포에 대해 79.8±7.2%의 세포 유입을 보인 반면, hNP는 35 ±6.9%의 세포 유입을 보였다. 또한, 5%의 sFVA가 부착된 T-hNP는 2.5%의 sFVA가 부착된 T-hNP 대비 더욱 높은 혈액암 세포 표적 능력을 보였다. 도 7c에서 hNP는 마우스 CD11b+ 비혈액암 골수성 세포로 33.5±4.3%의 세포 유입을 보였으며 T-hNP는 약간 낮은, 27.5 ±3.3%의 세포유입을 보였다. 이러한 결과는 하이브리드 나노입자가 sFVA 부착에 의해 인간 혈액암 세포로 표적 전달이 향상된 것을 증명한다.
CD11b를 발현하지 않는 다른 종류의 마우스 유래 면역 세포(CD45+ CD11b-)는 약 10.1±1.7%의 나노입자 세포 유입을 보였다 (도 7d). 대식세포와 단핵구는 단핵 식세포(mononuclear phagocyte)로서 다른 종류의 세포들 보다 나노입자를 잘 유입하는 것으로 알려져 왔다.
또한, NSG 마우스에 U937 세포를 주입하고 10일 뒤, 마우스의 꼬리정맥으로 Cy5 형광이 로딩된 나노입자를 주입하였다. 주요 장기들과 대퇴골, 경골의 Cy5 형광양을 측정하였고, hNP와 T-hNP 둘다 간, 신장과 같은 주요 배출 장기 내에 높은 분포를 하는 것을 확인하였다 (도 8a). hNP와 T-hNP의 장기 분포를 비교하였을 때, T-hNP는 간, 폐, 대퇴골, 경골에 상대적으로 높은 분포를 보였고, 이것은 혈액암 표적 효과에 의한 것으로 설명할 수 있다 (도 8b).
앞서 설명되었듯, 간과 골수는 주요한 U937 축적 장기이며 폐는 세포가 가지는 크기로 인해 축적의 가능성이 있는 장기이다. 추가로, 면적당 평균 형광 값 측정 결과를 확인하였을 때 T-hNP 군이 hNP 대비 대퇴골과 경골 내에서 1.3배 높은 형광 값이 검출되었고 이것은 sFVA 부착에 의한 혈액암 표적 효과로 설명하는 것이 적합하다 (도 8c).
총괄적으로, sFVA 부착은 나노입자의 CD64+ 혈액암 세포로의 active targeting 전달 기능을 향상시키고 CD11b+ 마우스 골수성 세포로는 passive targeting 전달을 가능하게 함을 확인하였다.
5. 혈액암 세포에서 HO1 저해제가 로딩된 하이브리드 나노입자의 항암제 반응성 향상 효과 검증 실험 in vitro
HO1 억제성 하이브리드 나노입자에 의한 항암제 반응성 향상 효과를 측정하기 위해, THP1과 U937 세포에 약물이 로딩되지 않은 빈 T-hNP (T-hNP/Empty)와 SnMP가 로딩된 T-hNP (T-hNP/SnMP)를 안트라사이클린(Anthracycline) 계 약물인 다우노루비신(Daunorubicin)과 함께 처리하였다.
HO1 유전자는 THP1과 U937에서 Daunorubicin 농도 비례하게 과발현되었다 (도 9a). 도 9b, c에서 T-hNP/SnMP는 SnMP 농도 기준 1 내지 5uM로 사용되었을 때 다우노루비신의 세포 독성을 향상시키는 것으로 나타났다.
하지만 다우노루비신이 함께 처리되지 않았을 시에는 독성을 나타내지 않았다. 유세포 형광 분석 결과, 약물이 로딩되지 않은 빈 T-hNP 그룹 대비, T-hNP/SnMP를 다우노루비신과 함께 처리한 군에서 향상된 세포 사멸 반응이 검출되었다(도 10 및 11).
6. HO1 저해 T-hNP와 Daunorubicin 병용 치료에 의한 AML 이종 동물 모델 내 혈액암 성장 억제 효과
본 연구에서 인간 U937 세포를 마우스에 주입하여 이종 동물 모델을 사용함으로서, 마우스 골수 세포를 인간 세포와 구분하여 분석이 용이, 가능하도록 하였다.
여러 선행 연구들에 기반하여, HO1의 '항암제' 내성 기능과 면역 checkpoint로서의 기능 모두 항암제와의 병용 치료 시에 작용할 것이라는 가설에 기반하여 AML 이종 동물 모델에 T-hNP/SnMP 나노입자와 다우노루비신(Daunorubicin, DNR)을 함께 병용 치료하여 연구를 진행하였다.
약물이 로딩되지 않은 빈 T-hNP (T-hNP/Empty)와 DNR의 병용 치료 그룹은 DNR에 의한 화학 항암 효과만을 가질 군으로서 설정하였고 T-hNP/SnMP와 DNR의 병용 치료 그룹은 화학 항암 효과와 면역 항암에 의한 병용 치료 효과를 나타낼 것으로 가정하였다.
우선, HO1 저해 T-hNP 나노입자의 항암 효과를 동물모델 내 혈액암 세포를 분석하는 것에서 시작하였다. 인간 AML 이종 동물 모델에 4회간 다우노루비신과 나노입자를 주입하였고 동물 모델링 11일 째에 장기를 적출하여 분석하였다(도 12). 도 13a에서, T-hNP/SnMP와 Daunorubicin을 처리한 군의 골수 내 혈액암 세포의 성장이 타 그룹대비 3.68배 (hNP/SnMP +DNR), 3.56배 (T-hNP/Empty +DNR) 낮은, 상당한 감소 효과를 보였다. 간에서도 비슷한 양상의 혈액암 세포 성장 억제 효과를 보였다(도 13b). 도 13c와 도 14a에서, T-hNP/SnMP +DNR 그룹은 혈액암 세포 축적에 의한 비장 비대증이 가장 감소한 것을 확인했다. 게다가, 타그룹 대비 T-hNP/SnMP +DNR 그룹은 1.63배, 1.87배 높은 혈액암 세포 사멸율이 검출되었다(도 14b1 및 14b2). 도 13a의 유세포 형광 분석 결과와 일관성 있게, 골수 내 인간 GAPDH mRNA 양 역시 T-hNP/SnMP +DNR 그룹에서 가장 낮게 검출되었다.
7. HO1 저해 나노입자에 의한 골수내 비혈액암 골수성 세포의 면역 재구성 및 활성 효과
HO1 저해 T-hNP에 의한 면역 재구성 및 활성 효과를 검증하기 위해 마우스 골수 세포들을 유세포 형광 분석하였다. 도 15a에서, CD11b+ 세포들을 골수 내 비혈액암 골수성 세포들로 분류하였다. 총 CD45+ 면역 세포 내 CD11b+ 골수성 면역 세포의 비중은 그룹간 차이가 없었다 (도 15b). F4/80의 발현양이 높고 (F4/80-high), CD206을 발현하지 않는 (CD206-negative), M1 형질의 대식세포와 F4/80-high, CD206을 발현하는 (CD206+), M2 형질 대식세포 간의 비율을 분석하였을 때, CD206-negative한 M1 형질의 대식세포들이 T-hNP/SnMP 처리 그룹에서 12.1 ±2%로 타그룹의 7.83±0.66% (T-hNP/Empty), 7.9±1.7% (hNP/SnMP) 대비 높은 것으로 나타났다 (도 15c). 하지만 F4/80-high, CD206+ M2 형질 대식세포의 비율은 그룹간 차이가 없었으며, M1 형질/M2 형질의 비율 역시 T-hNP/SnMP +DNR 그룹에서 가장 높았다. Gr1의 발현양이 중간정도이고 (Gr1-int), F4/80 역시 중간정도 발현하는 (F4/80-int), 골수 세포는 보통 단핵구 계열의 세포로 알려져 있고, CJ Perry는 골수성 세포 표적 면역 항암 치료시에 흑색종 조직으로 다기능성의, 염증성 형질을 띄는 Chi3l3+ Ly6c+ F4/80-int 단핵구가 이끌려오고 축적되는 것을 보고한 바 있다.
총 Ly6c+ 단핵구 세포가 골수성 세포에서 차지하는 비율은 그룹간 차이가 없었으나, T-hNP/SnMP +DNR 그룹에서는 Ly6c-int / Ly6c-high 단핵구 세포 간의 비율이 타그룹의 0.5 ±0.09, 0.6 ±0.1 대비 1.26 ±0.1로 증가한 것을 확인하였다 (도 15e). 이러한 결과는 Ly6c-int 단핵구의 축적과, 단핵구 세포들의 형질에 변화가 나타난 것을 의미한다. 게다가, 도 7f, g에서 T-hNP/SnMP +DNR 그룹의 단핵구 세포는 타 그룹 대비 2.2배, 2.3배 높은 염증성 사이토카인 (IL12p70, TNF-a) 발현 비율을 보이는 것으로 확인되었다. 비단핵구 골수세포 Ly6c-negative, CD11b+ 세포들 역시 비슷한 양상을 보였으나, 덜 뚜렷한 차이를 나타냈다.
골수 내 면역 재구성 효과를 확인하기 위해 면역 활성, 억제, 단핵구/대식세포 면역 활성에 관련된 유전자들의 발현양을 비교 분석하였고, IL-12a, IL-1b, Aldh2, IRF8, CCR2와 같은 면역 활성 유전자들의 발현 증가를 확인하였다. 앞선 연구에서, IRF8 유전자 발현의 활성은 인간 혈액암 모델에서 면역 항암 효과를 보인 바 있다. 또한 증가된 Chi3l3 유전자의 경우 Chi3l3+ Ly6c+ 다기능성 염증성 단핵구의 축적과 연관지어 설명하는 것이 적합하다. M2 형질의 대식세포와 면역 억제에 관련된 유전자들의 경우 IL-10, Mgl-1, Mrc1 등이 T-hNP/SnMP +DNR 그룹에서 발현양이 감소한 것으로 측정되었다(도 16d).
IL-10은 주요한 면역 억제성 사이토카인으로 알려져 있고 Mgl-1은 C-type lectin 수용체로서 종양 면역 억제 M2 형질 대식세포와 연관이 있다. 감소된 또다른 케모카인으로, CCL17은 종양의 좋지 않은 예후와 연관이 있고 regulatory T 세포의 축적과 연관이 있는 것으로 보고된 바 있다. 흥미로운 점은 T-hNP/SnMP 그룹 대비, hNP/SnMP 그룹은 미미한 유전자 발현 변화를 보였다. HO1 저해는 화학항암제와 병용 치료되었을 때만 면역 항암 치료 효과를 보인 바 있고 이 점은 결국 화학항암제에 의해 유도된 특정 반응이 HO1 저해에 의한 면역 활성, 항암 효과의 요구 조건일 것이라고 가정할 수 있다. hNP/SnMP 그룹 대비, T-hNP/SnMP 그룹의 향상된 항암 효과, 면역 활성 효과 기작을 이해하기 위해 CD11b+ 골수성 세포들을 마그네틱 비드로 분리, ex vivo 상에서 실험 분석하였다(도 17). 마그네틱 비드로 분리된 CD11b+ 골수성 세포는 분리 전 샘플 대비 98.6%의 순도를 보였고 이 세포들에 DNR을 직접 처리하거나, 'DNR이 처리된 U937'을 처리하여 HO1 저해 나노입자에 대한 효과를 확인하였다. DNR을 직접 처리한 골수성 세포군은 HO1 저해에 의한 면역 활성이 DNR 화학 항암에 의한 것인지를 확인하는 그룹이고, 'DNR이 처리된 U937'을 처리한 골수성 세포군은 HO1 저해에 의한 면역 활성이 사멸중인 혈액암 세포에 의한 반응인지를 확인하기 위한 군이다. 도 18a와 18b에서, HO1이 저해된 골수성 세포들에 'DNR이 처리된 U937'을 처리하였을 시에 in vivo 결과와 비슷한 유전자 발현 변화 양상을 보이는 것으로 확인할 수 있었다. 그에 반해, DNR을 처리한 골수성 세포에서는 상반되는 양상의 유전자 발현 변화를 보였다. 총괄적으로, HO1 저해 T-hNP는 DNR과의 병용 치료시에 골수 내 단핵구와 대식세포의 형질을 변화시키고, 염증성 유전자 발현을 증가시킨다. 또한 HO1 저해에 의한 골수성 세포의 면역 활성은 DNR에 대한 반응이 아닌, DNR에 의해 사멸중인 혈액암 세포에 대한 반응이다.
8. HO1 저해 T-hNP의 화학, 면역 항암 효과에 의한 생존율 연구 및 치료 기작
마지막으로, AML 이종 동물 모델에서 생존율 향상 효과를 검증하였다. 이종 동물 모델에 나노입자와 DNR을 6회 주입한 후 생존율과 몸무게를 지속적으로 관찰하였다 (도 19a). 총 생존 기간은 19일 (PBS), 24일 (T-hNP/Empty +DNR), 23일 (hNP/SnMP +DNR), 28일 (T-hNP/SnMP +DNR)로 측정되었다 (도 19b 및 19c). 면역 항암 효과에서 중요하게 작용하는 T 세포, B 세포에 의한 적응 면역이 NSG 마우스에서는 결핍되어 있고, 이러한 이유로 적절한 생존율 향상 결과를 나타낸 것으로 생각된다.
총괄적으로, 우리 연구는 HO1를 표적으로한 T-hNP/SnMP을 개발하였고 DNR 병용 치료를 통해, 본 발명의 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)가 암세포를 표적으로 할 때는 힘 옥시게나아제 1 억제제가 암세포가 항암제에 대한 반응성이 높아지도록 작용(active targeting)을 하며, 종양 환경 세포를 표적으로 할 때는 종양 환경 내의 대식세포에서 면역 항암 체크포인트(checkpoint) 물질로 작용하는 힘 옥시게나아제 1을 저해하는 작용(passive targeting)하는 기작을 갖는다(도 20).

Claims (15)

  1. 힘 옥시게나아제 1 억제제를 포함하는 폴리머 코어(core) 및
    표적화 모이어티를 포함하는 지질 막(shell)을 포함하되,
    상기 지질막을 구성하는 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000, DSPE-PEG2000) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: DPPC)을 1: 1~5의 몰 비로 포함하고,
    상기 힘 옥시게나아제 1 억제제는 상기 폴리머 질량을 기준으로 3 내지 7w/w%으로 상기 폴리머 코어에 로딩(loading)되며,
    상기 지질 막과 상기 폴리머 코어는 폴리머와 지질이 1 :0.15 내지 0.35 질량비로 포함되는,
    암세포와 종양환경 세포를 이중 표적하는 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 비공유결합을 통해 지질에 고정되어 있는 것인, 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP).
  4. 제3항에 있어서, 상기 비공유결합은 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙트아비딘 결합인, 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP).
  5. 제4항에 있어서, 상기 비오틴은 지질의 일 말단에 결합되어 있고, 상기 아비딘 또는 스트렙트아비딘은 표적화 모이어티 일말단에 결합되어 있는 것인, 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP).
  6. 제1항에 있어서, 상기 힘 옥시게나아제 1 억제제는 SnMP, ZnMP, FeMP, MnMP, CrMP, SnPP, CrPP 및 MnPP로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP).
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리머는 폴리(L-락티드)(PLLA), 폴리글리톨산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리[(락틱-co-글리콜산)](PLGA), 폴리카프로락톤(PCL) 및 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)](PHBV)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 또는 이들의 공중합체인 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP).
  9. 삭제
  10. 힘 옥시게나아제 1 억제제 및 폴리머 혼합물을 지질 수용액에 적가하고 소니케이션(sonication)을 수행하여 지질-폴리머 하이브리드 나노입자를 생성하는 단계; 및
    상기 지질-폴리머 하이브리드 나노입자 상에 표적화 모이어티를 형성하는 단계를 포함하되,
    상기 지질막을 구성하는 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000, DSPE-PEG2000) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)을 1: 1~5의 몰 비로 포함하고,
    상기 힘 옥시게나아제 1 억제제는 상기 폴리머 질량을 기준으로 3 내지 7w/w%으로 상기 폴리머 코어에 로딩(loading)되며,
    상기 지질 막과 상기 폴리머 코어는 폴리머와 지질이 1 :0.15 내지 0.35 질량비로 혼합되는,
    제1항에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)의 제조방법.
  11. 제1항에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP)를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 혈액암(acute myeloid leukaemia), 방광암(bladder cancer), 난소암(ovarian cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 흑색종(melanoma), 전이성흑색종(metastatic melanoma), 폐암(lung cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 비호지킨림프종(non-Hodgkin ' s lymphoma), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 뇌암(brain cancer) 신경교종(glioma) 또는 교아 세포종(glioblastoma)인 항암용 약학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 항암제와 병용 투여되는 것인 항암용 약학적 조성물.
  15. 표적화 모이어티를 포함하는 용기 및 지질-폴리머 하이브리드 나노입자를 포함하는 용기를 포함하는 제1항에 따른 이중표적 지질-폴리머 하이브리드 나노입자(T-hNP) 제조용 키트.
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