KR20230127026A - Rgd 리간드 및 자성 나노입자를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체 - Google Patents

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최은숙
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Abstract

본 발명의 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체는 췌장암 세포 주변의 섬유화된 조직 투과성이 우수하며, RGD 리간드 및 MNP를 표면에 부착하여 췌장암 세포 및 조직에 특이적으로 약물을 전달할 수 있어 췌장암에 대한 우수한 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있는 바, 이를 포함하는 약학적 조성물은 췌장암 치료제 등에 이용될 수 있다.

Description

RGD 리간드 및 자성 나노입자를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체 {Drugcarrier comprising RGD ligand and MNPs for Preventing or Treating of Pancreas cancer}
본 발명은 RGD 리간드 및 자성 나노입자를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
췌장암은 암 질환 가운데 발병률은 11위에 머무르고 있으나, 발병 후 5년 생존률이 10% 밖에 되지 않은 위협적인 질환이다. 세계적으로 년간 430,000명이 췌장암으로 사망하는 것으로 알려져 있다. 췌장암은 수술로 치료가 가능한 비율도 20% 이하이며 수술 이후에 재발이 쉽게 일어나는데, 높은 치사율의 원인 가운데 하나는 현재 사용 가능한 항암제에 대한 반응성이 매우 낮기 때문이며, 이로 인한 전이율이 높기 때문으로 알려져 있다.
췌장암의 항암화학요법으로는 gemcitabine이 가장 많이 쓰이며, 단독 혹은 기타 항암제와 조합으로 gemcitabine 및 albumin bound paclitaxel (nab-paclitaxel)이 처방되고 있다. 또한, Gemcitabine 이외의 항암화학요법으로는 fluorouracil 기반의 FOLFIRINOX (Leucovorin, 5-fluorouracil, irinotecan, oxaliplatin)가 사용되고 있다.
정밀의료에 대한 임상효과가 일부 고형암에 대해 나타나면서 유전체 분석을 기반의 치료가 확대되고 있으나, 췌장암의 경우 약물 전달 자체의 문제로 승인받은 약물이 극히 적어, 유전자 변이 분석에 따른 치료가 불가능한 상황이다.
이와 같이 췌장암 치료가 특히 어려운 이유는, 항암제가 췌장암 조직에 충분한 양이 도달할 경우 암 세포 제거에 도움을 줄 수 있으나, 췌장암의 특징적인 미세환경에서 collagen과 같은 세포외 물질 (extracellular matrix, ECM)의 증가로 주변조직이 단단해지는 섬유화 (fibrosis) 현상이 나타나 약물의 직접적인 전달률이 매우 낮고, cancer-associated fibroblast (CAF)로 인한 면역억제 (immunosuppression) 현상으로 항암제 내성이 쉽게 나타나 불량한 예후의 원인이 되고 있다.
엑소좀은 생체 유래 물질로서 면역원성과 독성이 적고, 세포막지질 표면을 가지고 있어서 지질 특성을 이용할 경우 단백질(항체)과 소분자 물질(RGD 등)을 쉽게 고정화 할 수 있고 내부에 약물 탑재도 가능하며, 조직내 신호 전달물질로서의 생체내 기능이 있는 만큼, 췌장암 주변의 섬유화 조직과 결합조직 사이로 침투할 수 있는 특성이 있다.
이러한 엑소좀의 특성으로 인해, 엑소좀을 약물 전달체로 활용하고자 하는 연구가 국내외적으로 늘어나고 있으나, 하지만 현재까지 상기 질환을 치료하기 위한 적절한 치료제가 개발되지 않은 실정이다.
국제공개특허 제2020-086871호
일 양상은 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체를 유효성분으로 포함하는, 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 1) 세포배양액에서 엑소좀을 추출하는 단계; 2) 추출한 엑소좀 표면에 RGD 리간드 및 자성 나노입자 (MNP)를 개질시키는 단계; 및 3) 개질된 엑소좀 내부에 약물을 포획하는 단계;를 포함하는, 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체를 제공하는 것이다.
1. 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체를 유효성분으로 포함하는, 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 자성 나노입자(MNP)는 스트렙타비딘-접합된 산화철 나노입자 (Streptavidin-conjugated iron oxide nanoparticles, SA-IONP)인 것인, 약학적 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 약물전달체는 췌장암 환자의 췌장암 세포주 유래 자가 엑소좀인, 약학적 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 약물전달체는 내부에 파클리탁셀, 젬시타빈, 커큐민, miRNA, siRNA, 천연물 및 단백질 중 선택된 하나 이상을 담지하는 것인, 약학적 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 암 세포의 세포질 내의 인테그린 αvβ3 농도를 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
6. 위 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 암 세포의 α-SMA 및 COL1의 발현을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
7. 위 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)을 제거하는 것인, 약학적 조성물.
8. 위 1에 있어서, 상기 췌장암은 췌관 선암종, 낭종성암 및 신경내분비종양에서 선택된 하나 이상인, 약학적 조성물.
9. 1) 세포배양액에서 엑소좀을 추출하는 단계;
2) 추출한 엑소좀 표면에 RGD 리간드 및 자성 나노입자 (MNP)를 개질시키는 단계; 및
3) 개질된 엑소좀 내부에 약물을 포획하는 단계;
를 포함하는, 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체의 제조방법.
10. 위 9에 있어서,
상기 단계 2)의 단계는 DSPE-PEG-RGD 및 엑소좀을 혼합하여 4℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, SA-IONP를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 수행되는 것인, 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체의 제조방법.
11. 위 9에 있어서,
상기 단계 2)의 단계는 DSPE-PEG-RGD 및 엑소좀을 혼합하여 4℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, SA-IONP를 첨가하여 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션하여 수행되는 것인, 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체의 제조방법.
12. 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체.
본 발명의 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체를 유효성분으로 포함하는, 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 췌장암 세포 주변의 섬유화된 조직 투과성이 우수하며, RGD 리간드 및 MNP를 표면에 부착하여 췌장암 세포 및 조직에 특이적으로 약물을 전달할 수 있어 췌장암에 대한 우수한 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 세포외소포 (extracellular vesicles, EV) 약물전달체를 나타낸 도이다. 도 1A는 파클리탁셀 전달체로 사용되는 EV를 나타낸 도이다. 도 1B는 스트렙타비딘으로 표지된 magnetic nanoparticles (MNP)를 통합하도록 EV를 수정하는 데 사용되는 DSPE-PEG-비오틴 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000])을 나타낸 도이다. 도 1C는 나노입자 추적 분석 (nanoparticle tracking analysis, NTA)을 사용한 크기 및 입자 수 식별 결과를 나타낸 도이다. 도 1D는 음성으로 염색된 PANC-1 유래 bare EV(왼쪽) 및 rmExo(오른쪽)의 대표적인 투과 전자 현미경 이미지이다. 도 1E는 EV 및 세포 특이적 바이오마커의 발현을 나타내는 PANC-1 유래 EV 및 세포 용해물의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 2는 PANC-1 세포로부터 준비된 RMEXO의 세포 흡수 및 독성을 확인한 도이다. 도 2A는 Dir 염료로 표지 된 EVS를 사용하여 RGD (Mexo 대 RMEXO)로 EVS의 수정없이 흡수 효율의 비교한 도이다. MNP는 EVS 모두에 통합되었으며, RGD와의 EV의 수정시 EVS-1 세포로의 EV의 흡수가 향상되었다. 이미지는 ± 400 배율로 캡처되었다. 도 2B는 두 가지 방법을 사용한 PTX의 rmExo roading efficiency를 나타낸 도이다. 도 2C는 48 시간 동안 유리 PTX 및 PTX 담지된 rmExo로 치료할 때 PAN-1 세포의 세포 생존 능력을 비교한 도이다. 5μg/mL PTX가 적용되었을 때, 유리 ptx 및 RMEXO-PTX 처리 샘플 들간에 세포 생존력의 차이가 관찰되었다.
도 3은 EV에 담지된 PTX의 양을 LC-MS/MS에 의해 분석한 결과를 나타낸 도이다. 도 3A는 EV 및 도 3B는 PTX 표준에서 추출한 PTX에 대한 일반적인 LC-MS/MS 프로파일을 나타낸다. 상기 분석은 H2O:아세토니트릴(36:64, v/v)의 이동상이 있는 C18 컬럼을 사용하여 30℃에서 0.2mL/min의 유속으로 수행되었으며, 흡광도는 PTX의 용출을 모니터링하기 위해 227 nm에서 측정되었다.
도 4은 PTX-로드 된 rmExo (rmExo-PTX)의 PANC-1 이종 이식편 치료 효과를 나타낸 도이다. 도 4A 및 4B는 PAN-1 이종 이식 모델에서 EV 분포의 in-vivo (A) 및 ex-vivo (b) 상의 생체 내 이미지를 나타낸다. Free Dir 염료 및 Dir-Modified rmExo를 동물에게 투여하여 형광 강도의 반감기를 비교하였다. rmExo-M 기에서, rmExo 투여 후 48 시간 동안 종양 조직에 자성 나노입자가 적용되었다. 도 3C는 PAN-1 이종 이식 모델에서 PTX 로드된 EV의 치료 효과를 확인한 도이다. 도 4D는 각 그룹의 절제된 종양을 나타낸다. 도 4E는 희생 후 절제한 종양 중량을 나타낸다. 도 4F는 실험 중에 마우스의 체중을 나타낸다.
도 5는 종양을 포함한 조직의 조직학적 분석 결과를 나타낸 도이다. 주요 장기는 rmExo-PTX로 4주 동안 치료를 수행한 후 절제하였다. 종양의 점선은 아폽토시스 (Apoptosis) 세포의 외관 면적을 나타낸다.
도 6은 종양 이종 이식에서의 세포 사멸 및 조직의 EV 분포를 나타낸 도이다. 도 6A는 대조군, BEXO, PTX, RMEXO-PTX 및 RMEXO-PTX-M 그룹에서 PANC-1 이종 이식편의 종양 조직을 위한 TUNEL 분석 결과를 나타낸다 도 6B는 TUNEL 분석을 이용한 세포 사멸 세포의 정량화한 결과이다. 도 6C는 대조군 및 RMEXO-PTX 그룹에서 유기 및 종양 조직에서 CD63의 면역 형광 염색 결과를 나타낸다. CD63 염색은 셀 내부의 EV의 분포를 나타낸다.
도 7은 PANC-1 이종 이식편의 세포 사멸 관련 마커를위한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다. 도 7A는 세포 사멸 마커의 웨스턴 블랏 이미지이다. 도 7B는 웨스턴 블롯 이미지의 밴드 강도의 정량 분석 결과이다.
도 8은 HT29 이종 이식 모델에서 PTX 로드된 PAN-1 EV의 치료 효과를 확인한 도이다. 도 8A는 마우스에서 In vivo 및 ex vivo 생체 이미징 결과이다. 도 8B는 치료받은 각 그룹의 종양 부피의 변화를 나타낸 도이다. 도 8C는 실험 후 절제된 종양 중량을 나타낸다. 도 8D는 각 그룹의 절제된 종양을 나타낸다. 도 7E는 실험 중에 마우스의 체중을 나타낸다.
도 9는 PAN-1 이종 이식 모델을 위한 PTX 로드된 U937 EV의 치료 효과를 나타낸 도이다. 도 9A는 마우스에서 In vivo 및 ex vivo 생체 이미징 결과이다. 도 9B는 치료받은 각 그룹의 종양 부피의 변화를 나타낸다. 도 9C는 각 그룹의 절제된 종양을 나타낸 도이다. 도 9D는 실험 후 절제된 종양 중량을 나타낸다. 도 9E는 실험 중에 마우스의 체중을 나타낸다.
도 10은 세포, EVS 및 종양 이종 이식편에서의 인테그린 αvβ3 발현 양상을 나타낸 도이다. 도 10A는 HT29, PANC-1 및 U937의 세포 용해물에서 Integrain αv 및 β3 발현 정로를 나타낸다. 도 10B는 HT29, PANC-1 및 U937에서 유래된 EV 추출물의 Integrain αv 및 β3 발현을 나타낸다. 도 10C는 대조군 및 RMEXO-PTX 그룹의 PANC-1 이종 이식편에있는 Integrain αvβ3 분포를 확인한 도이다.
도 11은 α-Smooth Muscle Actin (α-SMA) 및 콜라겐 1 (Col1)의 α-1 이종 이식편의 면역 조직 화학 분석 결과를 나타낸 도이다. 종양은 대조군 및 RMEXO-PTX 그룹 마우스에서 절제하였다.
본 발명자들은 약물전달체 표면을 RGD 리간드 및 자성 나노입자로 개질하고, 엑소좀 내부에 약물을 포함시킴으로써, 상기 약물전달체를 포함하는 약학적 조성물이 췌장암의 예방 및 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체를 유효성분으로 포함하는, 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 "RGD 리간드"란 Arginine-Glycine-Aspartate (Arg-Gly-Asp)을 포함하는 리간드를 의미한다. RGD 리간드는 췌장암 세포 표면의 인테그린 (Integrin) 수용체에 결합할 수 있어, 약물전달체를 췌장암 세포 표면에 고정화하여 췌장암에 특이적으로 약물을 전달할 수 있다.
본 명세서에서 "자성 나노입자 (Magnetic nanoparticle, MNP)란 자기력을 띠고 있으며, 외부 자기장에 반응하는 입자로서, 나노 단위의 크기를 갖는 자성 입자를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 자성 나노입자는 철, 스칸듐, 티타늄, 크롬, 망간, 코발트, 니켈, 구리 및 아연으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 금속을 포함하는 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 자성 나노입자는 스트렙타비딘-접합된 산화철 나노입자 (Streptavidin-conjugated iron oxide nanoparticles, SA-IONP), 염화철, Permalloy (Ni80Fe20), 마게마이트(γ-Fe2O3), 마그네타이트(γ-Fe3O4), 바리움페라이트(BaxFeyOz;x, y, z는 임의의 조성), CoFe2O4, MgFe2O4, MnFe2O4, CoFe2O4 및 CoPt3FePt로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 자성 나노입자(MNP)를 약물전달체 표면에 부착하는 경우, 종양 조직 주위의 영구 자석 (permanent magnet)과 반응하여, 향상된 췌장암 세포 표적화 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 약물전달체는 엑소좀일 수 있다.
본 발명에서 용어 "엑소좀(exosome)"은 세포들로부터 분비되는 40~120nm 크기의 나노소포체로, 면역학적으로 중요한 단백질인 주조직적합체(main histocompatibility complex, MHC)와 열 충격 단백질(heat shock protein)을 포함하여 강력한 항종양 면역 반응을 유도하며, 항염증성의 마이크로 RNA(microRNA)와 콜라겐(collagen)의 축적을 조절하는 마이크로 RNA(microRNA)를 포함한다. 또한, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 엑소좀은 췌장암 세포주로부터 추출된 엑소좀으로, 이에 제한되지는 않으나, 췌장암 환자 유래 췌장암 세포주부터 추출된 것일 수 있다.
본 발명의 엑소좀은 자가 또는 동종 유래 엑소좀일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있다.
엑소좀을 약물전달체로 이용하는 경우, 생체 유래 물질로서 면역원성과 독성이 적으며, 세포막지질 표면을 가지고 있어서 지질 특성을 이용할 경우 단백질(항체)과 소분자 물질(RGD 등)을 쉽게 고정화 할 수 있으며, 약물 탑재도 가능하다. 또한, 췌장암 주변의 섬유화 조직과 결합조직 사이로 침투할 수 있으며, 뇌혈관 장벽 (Blood Brain barrier)을 통과할 수 있다.
본 발명에서 자가 엑소좀을 약물전달체로 이용하는 경우, 췌장암 세포에 효과적으로 침투 및 내재화할 수 있어 우수한 췌장암 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약물전달체는 내부에 약물을 담지 할 수 있다. 예를 들어, 항암제, 핵산 치료제, 천연물 및 단백질 치료제 중 선택된 하나 이상을 담지할 수 있다.
상기 항암제는 본 분야에서 사용 가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 커큐민 (curcumin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 파클리탁셀(paclitaxel), 젬시타빈 (gemcitabine), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin), 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 약물은 파클리탁셀 및 젬시타빈 중 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약물은 핵산 치료제 일 수 있으며, 구체적으로 안티센스 뉴클레오티드, 앱타머, 작은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로 RNA (miRNA) 및 RNA 간섭(RNAi)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 siRNA는 생체 내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막기 위하여 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 화학적으로 변형되는 것을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어 siRNA에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 당(ribose ring)의 2'-위치의 수산기를 수소 원자, 할로겐 원자, -O-알킬기, -O-아실기 또는 아미노기, 구체적으로는 H, OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, I 등으로 수식하거나 (이 때 R 은 알킬 또는 아릴, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬기, R'은 알킬렌, 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬렌일 수 있다), 인산 백본을 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로아미데이트, 또는 보라노포스페이트 등으로 수식할 수 있다.
또한, 상기 화학적 변형은, 본 발명의 siRNA에 포함되는 적어도 하나의 뉴클레오티드가 LNA (locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), 몰포리노(morpholino), PNA (peptide nucleic acid) 중 어느 하나의 핵산 유사체 형태를 가지도록 치환된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이들 LNA, UNA, PNA, 몰포리노 등의 제조는 본 발명에서 제공하는 siRNA 서열 정보를 바탕으로 당업계에 알려진 지식에 의하여 제조할 수 있으며, 기존의 문헌을 참고할 수 있다 (Veedu RN, Wengel J.Chem Biodivers. 7(3):536-42, 2010; Demidov VV. Trends Biotechnol. 21(1):4-7, 2003; Shantanu Karkare, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 71:575-586, 2006).
또한, 본 발명의 siRNA는 이의 활성을 저하시키지 않는 변화를 갖는 기능적 등가물인, 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 및 이들의 조합을 갖는 변형체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA는 각 해당 서열번호의 siRNA 와 80% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오타이드의 서열을 표적 유전자의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에서 상기 약물전달체 내에 약물을 담지할 경우, 췌장암 세포 주변 섬유화 조직에도 불구하고, 췌장암 세포로의 약물 전달 효과가 우수한 효과가 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체는 암 세포의 세포질 내의 인테그린 αv3 농도를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체는 암 세포의 α-SMA 및 COL1의 발현을 감소시킬 수 있다. 췌장암은 고도로 섬유성이며, α-SMA 및 COL1의 과발현은 더 높은 종양 성장에 관여할 수 있다. 따라서, 암 세포의 α-SMA 및 COL1의 발현을 감소시킴으로써, 췌장암을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체는 상기 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)을 제거함으로써, 담지된 약물을 췌장암 세포에 효과적으로 전달하여 췌장암을 효과적으로 예방, 치료 또는 개선할 수 있도록 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 "췌장암"은 췌관 선암종, 낭종성암 및 신경내분비종양에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물에 의해 골 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물에 의해 골 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 비강 내, 흡입 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다. 또한, 그 주기에 있어서 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 탈유비퀴틴화 효소는 상기 약학적 조성물에 0.1 ㎍ 내지 3.0 ㎍, 0.1 ㎍ 내지 2.5㎍, 0.1 ㎍ 내지 2.0㎍, 0.15 ㎍ 내지 2.0㎍, 0.2 ㎍ 내지 2.0㎍, 0.25 ㎍ 내지 2.0㎍, 0.25 ㎍ 내지 1.5㎍ 또는 0.25 ㎍ 내지 1.0㎍으로 포함될 수 있다.
상기 화합물이 조성물로서 투여되는 경우, 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.
한편, 상기 조성물은 약학적 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 담체는 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다.
또한 부형제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제형, 주입제형, 분무제형, 흡입제형 또는 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 사용될 수 있고, 상기 고형제제는 상기 텍토리게닌과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또한, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있고, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 사용될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체를 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
이때, 상기 건강기능식품 조성물은 상기 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서, 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적 (예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들면, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
"RGD 리간드", "자성 나노입자", "약물전달체", "췌장암", "예방" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는, 췌장암 예방 또는 치료용 약학 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 표면에 RGD 리간드 및 자성 나노입자 (MNP)를 포함하는, 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 약물전달체는 하기의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
1) 세포배양액에서 엑소좀을 추출하는 단계;
2) 추출한 엑소좀 표면에 RGD 리간드 및 자성 나노입자 (MNP)를 개질시키는 단계; 및
3) 개질된 엑소좀 내부에 약물을 포획하는 단계.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 단계 2)의 단계는 DSPE-PEG-RGD 및 엑소좀을 혼합하여 4℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, SA-IONP를 첨가하여 실온에서 1시간 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 단계 2)의 단계는 DSPE-PEG-RGD 및 엑소좀을 혼합하여 4℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, SA-IONP를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 단계 2)의 단계는 DSPE-PEG-RGD 및 엑소좀을 혼합하여 4℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, SA-IONP를 첨가하여 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션하여 수행될 수 있다.
상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
"RGD 리간드", "자성 나노입자", "약물전달체", "췌장암", "투여", "예방", "치료" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
또한, 본 발명은 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 췌장암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 췌장암 치료용 약제를 제조하기 위한 탈유비퀴틴화 효소 억제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 췌장암 치료용 약제를 제조하기 위한 탈유비퀴틴화 효소 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실험예
1. 재료 및 방법
1.1. 시약 및 항체
Centricon Plus-70 원심 필터 유닛은 Merck Millipore Ltd.(Kenilworth, NJ, USA)로부터 구입하였다. 제노라이트 DiR은 Caliper Life Sciences (Hopkinton, MA, USA)로부터 구입하였다.
마트리겔 (Matrigel®) 매트릭스(기저막, 페놀-적색 유리)는 코닝 인코포레이티드(Corning Inc.)(미국 뉴욕주 코닝)로부터 구입하였고, EV-고갈된 소 태아 혈청(FBS)은 시스템 바이오사이언시즈(System Biosciences)(EXO-FBSTM, 팔로 알토, CA, 미국)로부터 구입하였다.
스트렙타비딘-접합된 산화철 나노입자 (Streptavidin-conjugated iron oxide nanoparticles, SA-IONP) 및 포르볼 미리스테이트 아세테이트 (phorbol myristate acetate, PMA)를 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000], DSPE-PEG-비오틴)을 Nanocs Inc. (New York, NY, USA)로부터 구입하는 한편, RGD-개질된 1,2-디stearo-3-포스포에탄올아민-N-(polyethylene glycol) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(polyethylene glycol), DSPE-PEG-RGD)을 Biochempeg Scientific Inc.(Watertown, MA, USB)로부터 얻었다.
파클리탁셀은 LC Laboratories(Woburn, MA, USA)로부터 구입하였다. RIPA 용해 완충액 및 프로테아제 억제제 칵테일을 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)로부터 구입하였다.
미니-Protean174; TGXTM 프리캐스트 겔 및 다른 전기영동 시약을 Bio-Rad(Hercules, CA, USA)로부터 구입하였다.
면역블롯팅에 사용된 일차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX, USA)로부터의 마우스 모노클로날 TSG101 (클론 S1), Alix (클론 1A12), 칼넥신 (클론 AF-18), GM130 (클론 B10), 및 β-액틴 (클론 C-4), 및 System Biosciences로부터의 CD63이었다. 호르세라디쉬 퍼옥시다제-커플링된 항-마우스 2차 항체를 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다.
1.2. 세포 배양
인간 췌장관 암종으로부터 개발된 PANC-1 세포주는 American Type Culture Collection (Manasas, VA, USA)으로부터 구입하였다. 세포를 10% FBS(Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Welgene, Gyeongsangbuk-do, South Korea)이 보충된 둘베코(Dulbecco)의 변형된 이글(Eagle) 배지(DMEM)에서 37℃에서 5% CO2 인간 결장직장 선암종 HT29 세포 및 인간 전-단구성 U937 세포를 각각 PMA (100 ng/mL, 162 nM)를 함유하는 RPMI 1640 및 RPMI 1640에서 배양하였다. 모든 부착성 세포를 0.25% 트립신 및 1 mg/mL EDTA(Hyclone Laboratories Inc.)로 트립신처리하였다.
1.3. EV 분리 및 수정
PANC-1 및 U937 세포 (100 mm 배양 플레이트 당 0.5 X 106세포)를 10% EV-고갈 FBS를 함유하는 DMEM에서 72시간 동안 배양하였다. 수확시, 배양 배지를 1500 X g에서 30분 동안 원심분리하여 파편 및 죽은 세포를 제거하였다. 상청액을 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과하여 큰 소포를 제거하였다. 이어서, 여과액 (60 mL)을 Centricon® Plus-70 필터에 넣고 3500 X g에서 40분 동안 4 ℃에서 원심분리하여 EV를 농축시켰다. 농축물을 회수하기 위해, 필터를 여액 수집 컵에 역방향으로 넣고, 4℃에서 5분 동안 1000 X g에서 다시 원심분리하였다. 그 후, 농축된 매질을 TLA120.1 로터용 초원심분리 튜브로 옮기고, Optima MAX-TL 초원추분리기 (Beckman Coulter Inc., Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 4℃에서 70분 동안 100,000 X g에서 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, EV 펠릿을 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세정한 후, 초원심 분리 공정을 반복했다. 마지막으로, 상등액을 제거하고, EV 펠릿을 추가 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 펠릿을 추가 분석을 위해 100 μL PBS에 재현탁시켰다. 동일한 EV 격리 프로토콜이 U937 셀에 적용되었다.
100 마이크로리터의 단리된 EV 샘플을 900 μL의 PBS에 첨가하였다. DSPE-PEG-RGD 및 DSPE-PEG-비오틴을 1 mM의 최종 농도로 순수한 무수 에탄올에 용해시키고, -20℃에서 저장하였다. 10 μL의 DSPE-PEG-RGD를 EV 샘플에 첨가하였다. 샘플을 부드럽게 혼합하고 4℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 mExo (MNPs만 도입된 EV)을 제조하였다.
rmExo (RGD 및 MNPs가 도입된 EV)를 제조하기 위해, 10 L DSPE-PEG-비오틴 및 DSPE-PEG-RGD를 EV 샘플에 첨가하고, 4℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 50 μL SA-IONP를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, SA-IONP-결합된 EV를 13,000 X g에서 60분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 마지막으로, 상청액을 폐기하고 EV 펠릿을 수집하였다. 펠릿을 100 μL의 PBS에 재현탁시켰다.
1.4. EV 특성화
세포-유래 EV를 나노입자 추적 분석(NTA)을 위해 증류수에 100배 희석하였다. 청색(488 nm) 레이저 및 과학적 상보성 금속-산화물 반도체 카메라가 장착된 Nanosight NS300(영국 말번 소재의 Malvern Instruments) 시스템을 사용하여 크기 분포를 분석하고 EV의 수를 정량화하였다. 30초 비디오는 최적화된 세트 파라미터(검출 임계치, 5; 블러 크기, 자동; 최대 점프 거리, 자동, 픽셀, 10.8)와 함께 샘플당 3회 복제로 기록되었다. 온도는 22℃ 내지 25℃ 범위였다. 충분한 수의 유효 궤적이 측정될 때 비디오를 분석하였다. 데이터를 캡처하고, NTA 소프트웨어 버전 3.2(Malvern Instruments)를 사용하여 추가 분석을 수행하였다.
EV를 투과 전자 현미경(TEM, TecnaiTM G2 Spirit, FEI Company, Hillsboro, OR, USA)을 사용하여 가시화하여 이들의 형태학 및 분산 정도를 분석하였다. EV 샘플을 TEM 관찰 전에 메탄올성 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트로 염색하였다.
1.5. 면역블롯 분석
전형적인 아폽토시스 조절 단백질을 결정하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 상이한 아폽토시스 관련 마커의 발현을 비교하였다. 프로테아제 억제제 칵테일을 갖는 RIPA 용해 완충액을 사용하여 대표적인 치료군의 종양 조직으로부터 단백질을 제조하고, 20 μg의 단백질을 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 위해 로딩한 후, 블롯 전달 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 니트로셀룰로오스 막으로 전달하였다. 관심 표적 단백질을 검출하기 위해, 막을 각각의 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 적절한 양고추냉이 퍼옥시다제-연결된 2차 항체와 인큐베이션하였다. 화학발광 기판을 사용하여 신호를 개발하고, ChemiDocTM XRS 영상화 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 관찰하였다. 마지막으로, 상대 강도를 ImageJ 소프트웨어, ver. 1.51j (National Institute of Health, USA)를 이용하여 분석하였다.
1.6. TUNEL 분석을 이용한 아폽토시스 (Apoptosis) 검출
TUNEL 분석 키트 (DeadendTM Fluorometric TUNell System, Promega)를 사용하여 상이한 치료 군으로부터의 파라핀-포매된 종양 조직 절편에서 아폽토시스 세포를 검출하였다. 제조업체에 의해 권장되는 TUNEL 시약의 적용 전에, 절편을 크실렌에서 탈왁스시키고, 하강하는 일련의 에탄올에서 세척하고, PBS에서 재수화시켰다. 핵을 DAPI로 염색하였다. 아포토시스 세포를 공초점 레이저-주사 현미경(FV1200; 올림푸스)을 사용하여 가시화하였다.
1.7. 통계학적 분석
결과 및 측정은 평균 ± SEM으로서 제시되는 종양 부피의 계산을 제외하고는 평균 ± SD로서 제시된다. 2-꼬리 t-시험 (two-tailed t-test)을 사용하여 유의한 차이를 확인하였고, p-값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험예 2. PANC-1 세포에서 rmExo의 증가된 세포 흡수
mExo (MNPs만 도입된 EV) 및 rmExO를 DiR 염료로 라벨링하였다. PANC-1 세포(1 X 104 세포/웰)를 4-웰 챔버 슬라이드(Millipore, Burlington, MA, USA)에 시딩하였다. 24시간 인큐베이션 후, 1 X 108 DiR-표지된 EV를 500 μL의 신선한 배양 배지에 첨가하고, PANC-1 세포와 48시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 ProLongTM Gold Antifade Mountant 용액(Thermo Fisher Scientific)으로 장착하고, 이미지를 레이저-스캐닝 공초점 현미경(FV1200, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 분석하였다.
그 결과, rmExo는 mExos와 비교하여 PANC-1 세포의 세포질 공간에서 향상된 축적을 나타내었다 (도 2A). 이러한 결과는 세포 표면 상의 인테그린 3과 rmExo 상의 RGD의 상호작용에 기인하였으며, 이는 수용체-매개된 세포내이입에 의한 RGD 리간드의 세포로의 내재화 동안 발생하는 것으로 확인되었다.
실험예 3. PANC-1 세포에서 rmExo의 세포독성
PTX를 EV에 담지하기 위해, 100 μL의 각각의 EV 전달체(-1012 EV)를 900 μL PBS에 첨가하였다. 이어서, PTX의 스톡 용액 100 마이크로리터(에탄올 중 10 mg/mL)를 PBS 중 각각의 전달체에 첨가하여 PTX-담지된 EV를 제조하였다.
파클리탁셀 (PTX)을 2개의 상이한 방법을 사용하여 EV에 담지하였다. 한 방법에서, EV 및 PTX를 단순히 실온에서 인큐베이션한 반면, 다른 방법은 혼합물의 초음파처리 후 37℃에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션하는 것을 포함하였다.
초음파처리 방법은 혼합물을 초음파처리기(Sonics Vibro Cell, Sonics & Materials Inc., New Town, CT, USA)를 사용하여, 20% 진폭, 펄스 10s on 및 50s off로 10 사이클 반복하여 초음파처리하였다. 이어서, 용액을 37℃에서 초음파 처리시 1시간 동안 인큐베이션하여 EV 막을 회수하였다.
완충액 중의 PTX의 정량을 측정하기 위해, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 분석을 사용하여 PTX 농도를 측정하였다 (도 3).
그 결과, EV에 대한 PTX의 부하 효율은 초음파 처리를 수행할 때 거의 10배 증가하였다 (3.5% VS 37.5%, 도 2B). 마지막으로, PTX를 EV에 담지하는 공정에 초음파처리 단계를 포함하여 rmExo-PTX를 제조하였다.
베어 EV, 유리 PTX 및 rmExo-PTX 제제의 세포독성을 CCK-8 검정 키트 (Dojindo Molecular Technologies Inc., Kumamoto, Japan)를 사용하여 PANC-1 세포에 대해 측정하였다. PANC-1 세포(1 X 104 세포/웰)를 폴리스티렌 96-웰 배양 플레이트에 접종하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배지로 처리된 세포는 대조군으로서 제공되었다. 48시간의 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고 37℃에서 4시간 동안 10 μL의 CCK-8 시약을 함유하는 100 μL DMEM과 인큐베이션하였다. 분광광도 마이크로플레이트 판독기(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 450 nm의 파장에서 광학 밀도를 측정하였다. 모든 실험을 3회 수행하였고, 상대적인 세포 생존력을 비처리된 대조군에 대한 백분율로서 표현하였다.
표면 상의 RGD 모이어티에 의한 변형시 rmExo의 증가된 세포 흡수에 의해 강조된, rmFxo-PTX의 세포독성 효과를 유리 pTX의 것과 비교하였다 (도 2C). 0.5 μg/mL의 PTX 농도에서, 유리 PTX- 및 rmExo-PTX-처리된 세포 둘 모두는 대조군의 것의 거의 50%까지 감소된 세포 생존력을 나타냈다. 그러나, 5 μg/mL PTX가 유리 PTX 및 rmExo-PTX의 형태로 PANC-1 세포에 적용되었을 때, rmExo-PTX-처리된 세포는 용량-의존성 방식으로 유리 PTX와 비교하여 상당히 감소된 세포 생존력을 나타냈다. 수용액에서 PTX의 제한된 용해도는 PANC-1 세포에 대해 고농도의 유리 PTX에서 용량-반응 관계가 달성되지 않았기 때문일 수 있으며; 반응은 전달체 없이 0.5 및 5 μg/mL PTX에서 매우 유사하였다. PTX의 rmExo로의 캡슐화는 0.5 및 5 μg/mL PTX에서 용량-의존성 세포독성, 및 유리 PTX보다 더 높은 세포독성을 나타냈다.
이들 데이터는 RGD에 의한 EV 전달체의 변형이 RGD-인테그린의 상호작용 및 후속 내재화로 인해 향상된 흡수 효율을 초래하였다는 것을 의미한다. 또한, EV에 의한 PTX 캡슐화는 PANC-1 세포에서 유리 PTX의 것과 비교하여 증진된 세포독성 효과를 야기하였다. 이는 항암 약물의 치료 효과를 개선하기 위한 약물 전달체로서 이용될 수 있음을 의미한다.
실험예 4. 췌장암 이종이식 모델 마우스에서 PTX-담지된 rmExo의 생체분포
생체내 (In vivo)에서 rmExo-PTX의 생체분포를 조사하기 위해, 본 발명자들은 PANC-1 세포를 사용하여 이종이식 종양-보유 BALB/c 누드 마우스를 제조하였다.
Balb/C nu-nu 누드 암컷 마우스 (4주 연령)를 중앙 동물 연구소 (Soul, Korea)로부터 구입하였다. 마우스는 동물 사용 위원회(Animal Use Committee of DGIST)에 의해 승인된 프로토콜(승인 번호: DGIST-IACUC-19041201)에 따라 동물 센터의 DGST에서 사육되었다. 마우스를 음식 및 물을 공급하면서 12/12시간 명/암 주기로 유지시켰다. PANC-1 및 HT29 세포를 10% FBS로 보충된 고-글루코스 DMEM에서 유지시켰다. 마우스(8주령)에서 이종이식편을 개발하기 위해, 총 2 X 106개의 세포를 100 μL의 빙냉 마트리겔(코닝 인코포레이티드)에서 1:1로 혼합하고, 각각의 마우스의 우측 플랭크 영역 내로 피하 주입한 후, 종양 크기를 2주 동안 모니터링하였다. 하기 식을 사용하여 종양 부피를 측정하였다: 부피 (mm3) = 1/2 (길이 X 폭2), 여기서 길이는 가장 큰 종양 직경을 나타내고 폭은 수직 종양 직경을 나타낸다. 종양 부피가 100 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 상이한 실험 그룹으로 무작위로 나누어 치료 효과를 관찰하였다.
종양-보유 마우스에서 EV의 생체내 (In vivo) 생체분포를 관찰하기 위해, EV를 제조자의 지시에 따라 DiR 형광 염료로 표지하고, 100 μL의 DiR-표지된 rmExo (rmEXo-DiR)를 정맥내 투여하고 48시간까지 순환시키고, 1, 4, 24, 및 48시간에서 관찰하였다.
그 결과, 유리 DiR 시약으로부터의 대부분의 형광 강도는 마우스에서 사라졌으나, rmExo로부터의 형광은 48시간 후에도 여전히 관찰되었다 (도 4A). 유리 PTX의 경우, 래트에서의 반감기는 혈장 및 폐에서 각각 7.12 시간 및 5.75 시간으로 결정하였다. 이는 유리 POX가 수 시간 이내에 신체로부터 배설되었음을 의미한다. 그러나, PTX를 EV로 캡슐화할 때, 체액 중 PTX의 체류 시간은 rmExo의 분포 패턴에 의해 지지되는 48시간 정도로 길어질 것으로 예측된다.
종양 이종이식편 (rmExo-M 그룹) 근처의 자성 나노입자의 처리는 48시간 동안 전신에서 rmEXo 그룹보다 강한 형광 강도를 보였다. 생체외 (Ex vivo) 생체분포는 rmExo 처리된 마우스가 유리 DiR 처리된 마우스에 비해 장기에서 더 강한 형광 강도를 보였다.
rmExo는 또한 형광 강도를 측정함으로써 기관뿐만 아니라 종양 이종이식을 포함하는 전신에 분포되는 것으로 나타났다. 이는 EV 전달체가 도 4A에 도시된 바와 같이 전신에서의 순환에 대해 안정성을 가지며, 다양한 유기 조직에 도달하기 위해 트랜스사이토시스(transcytosis)에 의해 혈액 장벽을 관통하거나 막 접합부를 통과할 수 있음을 의미한다 (도 4B).
실험예 5. 췌장암 이종이식 모델 마우스에서 PTX-담지된 rmExo의 치료 효과
PTX-담지된 EV의 치료 효과를 평가하기 위해, PANC-1 이종이식 마우스를 임의로 5개의 군으로 나누었다: (1) 음성 대조군으로서의 PBS, (2) 베어 EV, (3) 유리 PTX, (4) rmExo-PTX, 또는 (5) rmExo-PTX와 함께 자성나노입자를 24시간 동안 적용하였다.
PTX를 HT29 이종이식편에 전달하는 PANC-1-유도된 EV의 능력을 평가하기 위해, 마우스를 4개의 군으로 무작위로 나누고, (1) 음성 대조군으로서의 PBS, (2) 베어 EV, (3) 유리 PTX, 및 (4) rmExo-PTX로 처리했다. PANC-1 이종이식에 대한 U937-유래 EV의 치료 효과를 결정하기 위해, 마우스를 4개의 그룹으로 나누고, (1) 음성 대조군으로서의 PBS, (2) 베어 EV, (3) 유리 PTX, 및 (4) rExo-PTX-U로 처리하였다.
모든 실험 세트에서, 동일한 양의 PTX(5 mg/kg)를 유리 PTX 및 EV로의 제형을 통해 처리하였다.
정맥내 주사는 100 μl 당 108 개의 입자로 4주의 실험 기간 동안 주 2회 수행하였다. 치료 기간 동안 격일로 종양 부피를 측정함으로써 치료된 마우스에서 종양 발달의 진행을 모니터링하였다. 최종 EV 치료 2일 후, 마우스를 희생시키고, 이들의 종양 및 조직을 절제하여 모든 군의 종양 부피를 확인하였다 (도 4C).
그 결과, 종양 부피의 성장은 대조군 (p<0.01), bExo (p <0.001), 및 PTX(p<0.05) 그룹에서의 것과 비교하여 rmExO-PTX 그룹에서 유의하게 지연되었다. rmExo-PTX-M 그룹의 종양 부피는 또한 대조군의 종양 부피보다 유의하게 낮았다 (p < 0.01), bEx0, 및 PTX 그룹 (p< 0.05). bExo 그룹의 평균 종양량은 대조군과 비교하여 감소되었지만, 유의하지 않았다(p=0.19). PTX 그룹에서의 종양 진행은 또한 대조군에서의 종양 진행보다 낮았지만, 차이는 유의하지 않았다 (p = 0.061). 이러한 결과는 베어 EV 및 유리 PTX가 특정 정도의 치료 효과를 끌어올릴 수 있지만, 차이가 통계적으로 유의하지 않음을 나타낸다.
PTX가 rmExo 전달체 내로 캡슐화되는 경우, 치료 효과는 유리 PTX의 것보다 유의하게 더 높았다 (p<0.05). rmExo-PTX 치료시 종양 성장의 억제를 절제된 종양 중량을 통해 확인하였다 (도 4D 내지 E). 치료의 마지막에, rmExo-PTX 및 rmFo- PTX-M 그룹으로부터의 종양 중량은 서로 유의한 차이를 나타내지 않았다 (p = 0.25, 도 4E). 그러나, rmExo-PTX 그룹의 종양 중량은 대조군의 종양 중량보다 상당히 낮았다 (p<0.001). 또한, rmExo-PTX-M 그룹의 종양 중량은 또한 대조군 (p<0.05) 및 PTX (p <0.05) 그룹의 것과 유의한 차이를 나타내었다. 상이한 치료군에서 마우스의 체중은 유의한 차이를 나타내지 않았다 (도 4F).
이러한 결과는 rmExo-PTX의 항-신생물 효능이 유리 PTX의 것에 비해 증진되었음을 나타내었다. 본 연구에서 종양 조직 내부에 rmExo-PTX를 모으기 위한 자성 나노입자의 사용시 표적화 효율에 대한 개선 효과는 확인되지 않았다.
실험예 6. PTX-부하된 EV로의 치료 후 조직의 조직학적 분석
실험의 종료시 (28일째), 종양 절편을 H&E 염색을 사용하여 확인하였다 (도 5).
조직 수준에서의 병리학적 변화를 평가하기 위해, 종양 및 다른 주요 기관의 일부를 10% 중성 완충 포르말린 (시그마-알드리치)에 고정시켰다. 처리된 파라핀 포매 조직을 5μm 두께의 절편으로 슬라이스하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색, 면역형광 염색 및 면역조직화학 분석을 전술한 바와 같이 수행하였다. H&E 염색 영상을 포착하고, 200 배율로 광 현미경(Leica DM 2500, Leica Microsystem, Germany)을 사용하여 처리하였다.
마우스 조직에서 CD63 및 인테그린 αvβ3을 검출하기 위해, 항-CD63(Invitrogen, Waltham, MA, USA) 및 항-αvβ3 (Bioss, Woburn, MA 및 USA) 항체를 사용하여 면역형광 분석을 수행하였다. 염소 항-토끼 (Goat anti-rabbit) IgG 알렉사 플루오르(Alexa Fluor®) 488을 CD63 검출을 위하여, 췌장을 제외한 실험에서 2차 항체로서 사용하였다. 염소 항-토끼 IgG 알렉사 플루오르(Alexa Fluor®) 568 항체를 사용하여 췌장에서 CD63을 검출하였다. 종양 조직에서 αvβ3의 검출을 위해, 염소 항-토끼 IgG 알렉사 플루오르 488을 2차 항체로서 사용하였다. α-평활근 액틴(α-SMA, Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 콜라겐 타입 1(COL1, Cell Signaling Technology)의 면역조직화학적 분석을 위해 항-토끼 IgG를 사용하였다.
대조군 및 bExo 그룹은 아폽토시스가 거의 없는 고도로 증식성인 종양 세포를 나타냈다. 그러나, 아폽토시스 세포는 자성 나노입자 부착과 무관하게 rmExo-PTX 및 rmFo- PTX-M 그룹의 종양 조직에서 검출되었다. PTX 그룹에서, 아폽토시스 세포는 종양 이종이식편에서 부분적으로 관찰되었고, 이는 전달체를 사용하는 경우와 비교하여 영향이 제한되었음에도 불구하고, 유리 PTX가 암 세포로 수송될 수 있음을 나타낸다. rmExo 분포의 생체내 (in vivo) 영상화시 강한 형광을 나타내는 것으로 밝혀진 기관인 폐, 간 및 비장에서의 조직학적 변화를 분석할 때 (도 4A 내지 4B), 유리 PTX를 사용한 반복 치료시 rm Exo-PTX의 제제(도 5)가 변경되지 않았음을 확인할 수 있었다.
종양 덩어리에서 관찰된 아폽토시스의 결과는 각 그룹에서 TUNEL 분석의 결과에 의해 확인되었다. PTX 및 rmExo-PTX 그룹의 종양 조직에서는 대조군 및 bExos 그룹의 것과 비교하여 자성 나노입자를 포함하거나, 자성 나노입자 없이 아폽토시스 세포의 수가 증가하였다(도 6A).
아폽토시스 세포의 수를 정량하여 비교하였다 (도 6B). 그 결과, PTX 그룹에서의 아폽토시스 세포수는 대조군 그룹에서의 세포수보다 2.5배 더 높았지만, 이 수는 대조군 그룹과 비교하여 각각 rmExo-PTX 및 rmRo- PTX-M 그룹에서 6.0배 및 4.4-배 증가를 나타냈다. 또한, rmExo-PTX 그룹에서 아폽토시스 세포의 수는 PTX 그룹보다 2.4배 더 높았다. 이 결과는 RGD-변형된 EV를 사용하는 것이 종양 세포를 제거하는 치료 효과를 향상시킬 수 있는 종양 부위로의 PTX의 전달을 위한 효율적인 방법일 수 있음을 나타낸다.
도 6C는 가장 흔한 EV-연관 마커인 것으로 보고된 테트라스파닌인 CD63으로 염색시 관찰된 EV의 분포를 나타낸다. CD63은 후기 엔도좀 및 리소좀에 국재화되는 것으로 보고되지만, CD63는 면역형광 염색시 대조군으로부터의 종양 조직에서 관찰되지 않았다 (도 6C). 그러나, rmExo-PTX 그룹에서, CD63은 종양 조직 전체에 걸쳐 (도 6C), 특히 세포질 공간 (도 2)에 널리 퍼지는 것으로 관찰되었다. CD63의 분포에 대해 분석된 조직 중에서, 비장 및 췌장이 EV의 분포에 대하여 관찰될 때, 이들은 이들 조직의 제한된 영역에 편재되는 것으로 밝혀졌다. 폐 및 간에서, 형광 강도가 IVIS174; (도 4A)를 사용한 전신 영상화 분석시 매우 강하더라도, CD63은 명확하게 염색되지 않았다.
상기 결과를 종합하면, rmExo-PTX가 비장 및 췌장과 같은 몇몇 기관에서 세포의 일부 부분으로 전달될 수 있음에도 불구하고, 중요한 기관의 조직학적 분석은 종양 이외의 기관에서 명백한 조직 손상을 나타내지 않았음을 확인할 수 있었다 (도 5 참조). 종양 조직에서 rmExo-PTX의 광범위한 분포는 EPR 및 종양 조직의 혈관을 통과하는 트랜스사이토시스 효과에 따른 암 세포로의 RGD-특이적 세포내이입과 관련될 수 있다. 따라서, 이들 데이터는 rmExo-PTX에 의한 종양 진행의 표적화된 전달 및 후속적인 억제를 지지하고, 종양-표적화에 대한 특이성의 관점에서 유리 PTX와 비교하여 개선된 기능성을 갖음을 나타낸다.
실험예 7. 종양 이종이식편에서 아폽토시스-관련 마커의 분석
분자 수준에서 rmExo-PTX 치료의 치료 효과를 지원하기 위해, 본 발명자들은 상이한 아폽토시스-관련 단백질 마커의 발현을 분석하였다. 종양 조직으로부터의 단백질 추출물을 각각의 군으로부터 제조하고, BCL-2, BAX, 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP), 카스파제-3 (CASP3), 및 카스페제-9 (CASP9)의 발현을 웨스턴 블롯을 사용하여 분석하였으며 (도 7A), 밴드 강도를 정량화하였다 (도 7B).
BCL-2의 발현은 대조군과 비교하여, 각각 rmExo-PTX 및 rmFo-PTX-M 그룹에서 0.23- 및 0.16-배 현저히 감소하였다 (도 7B). 따라서, 이들 그룹에서 BAX 발현은 각각 4.6배 및 4.3-배 증가되었음을 확인할 수 있었다. PTX 그룹은 또한 대조군 그룹과 비교하여 BAX에서 2.7배 증가를 나타내었다. 또한, rmExo-PTX 그룹에서의 BAX 발현 수준은 PTX 그룹보다 유의하게 더 높았다(1.6배). BCL-2 및 BAX의 전체 발현은 rmExo 전달체를 갖는 제제에서 PTX 처리시 아폽토시스가 유도됨을 나타낸다.
전장 PARP의 발현 수준이 유의하게 변하지 않았지만, 대조군과 비교하여 PTX(3.6배) 및 rmExo-PTX(4.22배) 그룹에서 절단된 PARP 수준이 유의하게 증가하였다 (도 7A 내지 7B). rmExo-PTX-M의 경우, PARP의 절단된 형태에서 평균 3.1배 증가가 있었지만, 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(p=0.17). 또한, 대조군과 비교하여 rmExo-PTX 및 rmERo-PTX-M 그룹의 평균값이 감소되었지만, 전장 CSAP3 발현의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 절단된 CASP3은 rmExo-PTX (10.1배) 및 rmFo- PTX-M (4.4배) 그룹에서 유의하게 증가하였다. CASP9의 경우, 대조군과 비교하여, rmExo-PTX(0.41배) 및 rm Exo-PTX-M(0.57배) 그룹에서 전장 CASP 9의 수준이 상당히 감소되었고 (p<0.05), PTX(1.9배), rmExos -POX(2.4배) 또는 rm ECxo PTX -M(2.3배) 그룹들에서 절단된 CASP-9의 수준이 증가되었다.
상기 결과들을 종합하면, PARP, CASP3, 및 CASP9의 분자 발현은, 유리 PTX 또는 rmExo와의 PTX 제제가 췌장암 마우스 모델을 치료하는데 사용될 때, 암세포의 아폽토시스를 유도할 수 있는 이들의 활성 형태로 변화되었음을 나타낸다. 대조군에서의 마커 발현과 비교하여, rmExo-PTX 및 rmFo-PTX-M 그룹에서의 마커 발현의 정도는 rmGxo 제제의 효능의 지표로서 사용될 수 있다. BCL-2/BAX 비, 절단된 형태의 PARP, CSAP3, 및 CASP9, 및 전장 CASP 9의 변화는 PTX 제형을 위한 rmExo를 사용하여 관찰되었으며, 이는 전달체에 의한 PTX의 향상된 전달 및 후속 치료 효과에 기인할 수 있다. 이들 데이터는 rmExo-PTX 치료가 대조군 치료와 비교하여 아폽토시스를 증가시켜 종양 크기를 감소시킴을 나타내었다. 종양 조직 근처의 자성 나노입자는 rmExo-PTX-M 그룹에서의 아폽토시스 마커의 발현에 영향을 미치지 않았으며, 이는 rmFo-PTX 그룹에서의 것과 필적하였다.
실험예 8. 종양 이종이식편에 동종이식 EV를 투여하는 치료 효과
상이한 종양 유형에서 rmExo-PTX의 치료 효과에서의 차이를 조사하기 위해, HT29 (인간 결장 선암종) 세포-유래 이종이식 마우스를 제조하고, 이들에게 rm Exo -PTX를 정맥내 투여하였다. 자가 EV가 종양 질량의 현저한 감소에만 영향을 미치는 경우, 이는 종양 부위로의 EV 귀소에서 RGD-인테그린 상호작용 이외의 다른 인자가 관여함을 나타낸다.
HT29 이종이식편의 형광-표지된 rmExo 분포의 전신 영상화 및 생체외 형광 강도의 패턴은 PANC-1 이종 이식편의 것과 매우 유사하였다 (도 8A). 그러나, 종양 중량의 전체 진행은 동종이식 이종이식편이 표적화될 때 완전히 상이하였다. 치료 그룹 중에서, PTX 그룹은 19일째 평균 종양 부피(p=0.073)의 측면에서 가장 높은 항신생물 효과를 나타내었으며, 이는 rmExo-PTX가 HT29 종양에 대한 약물 전달체로서 효과적이지 않았음을 의미한다 (도 8B).
또한, rmExo-PTX는 종양 중량으로 측정하였을 때 HT29 이종이식편에서 임의의 유의한 종양-억제 효과를 나타내지 않았다 (도 8C). 절제된 종양 덩어리는 도 8D에서 비교되었으며, 이는 bExo, PTX 및 rmExO-PTX 그룹뿐만 아니라 대조군에서 높은 증식 진행이 있었음을 보여준다. 이들 데이터는 rmExo-PTX가 HT29 이종이식편과 비교하여 PANC-1 이종이식으로의 표적화 능력을 향상시켰음을 나타내었다. 모든 그룹의 체중은 PTX 또는 rmExo-PTX 처리 후 유의하게 변하지 않았다 (도 8E).
또한, PANC-1 이종이식 마우스에 대한 U937 세포 (인간 골수 세포주) 배양 배지로부터 단리된 EV의 효과를 조사하였다. EV의 농축은 CD63 및 TSG101과 같은 EV 마커를 분석하여 확인하였다 (도 4). RGD를 U937-유도된 EV (rExo-U)에 혼입시킨 후, PTX를 각각 담지하여 rEx0-PTX-U를 생성하였다. rExo-U의 생체내 (in vivo) 분포는 또한 PANC-1 이종이식 모델에서 rmExO 분포와 유사한 패턴을 나타냈다 (도 9A). 4주 동안 종양 부피를 확인한 결과, rExo-PTX-U 그룹의 종양 부피가 대조군의 종양 부피에 비해 0.51배 감소한 것으로 관찰되었으며, 이는 통계적으로 유의한 차이로 확인되었다 (p<0.05, 도 9B). 그러나, PANC-1 세포로부터의 자가 rmExo-PTX를 사용한 결과와는 달리, PTX와 rEx0-PTX-U 그룹 사이의 종양 질량의 차이는 없었다. 또한, 도 9C에 나타낸 절제된 종양 덩어리는 종양 중량(도 9D)에 의해 결정되었으며, 이는 서로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 모든 그룹의 체중은 크게 다르지 않았다(도 9E). 이 결과는 U937-유래된 EV의 RGD 변형이 PTX를 PANC-1 이종이식편에 전달할 수 있었지만, PANO-1 세포로부터 기원하는 rmExo만큼 효율적이지는 않았다는 것을 의미한다.
약물 전달체로서 동종 EV를 사용하는 상기 2가지 경우에서, 전체 신체에서의 분포가 매우 유사하더라도(도 4A, 8A 및 9A), 치료 효과는 자가 EV가 사용되는 경우만큼 두드러지지 않았다.
유리 PTX는 마우스에서 PANC-1 및 HT29 이종이식편 둘 다에서 종양 성장을 감소시키는데 통계적으로 효과적이지는 않았으나, PANAC-1 세포로부터의 rmExo-PTX를 PANAc-1 이종이식으로 투여하는 것은 마우스 모델에서 종양 덩어리의 제거에 명백하게 효과적인 것으로 확인되었다.
실험예 9. 모세포 및 EVs에서의 인테그린 발현
PANC-1 이종이식편에서 rmExo의 증가된 흡수의 배경 기작을 조사하기 위해, PANO-1, HT29 및 U937 세포에서 인테그린 αvβ3의 발현을 웨스턴 블롯을 사용하여 분석하였다.
그 결과, 상대 강도의 정량은 αv 및 β3 인테그린이 모두 PANC-1 세포에서 발현되었지만, HT29 및 U937 세포는 αv와 β3 인테그린의 발현을 극적으로 감소시켰다는 것을 확인하였다 (도 10A). HT29 세포에서 감소된 αv 및 β3 발현 수준은 각각 PANC-1 세포에서의 발현 수준의 0.59배 및 0.14배였다. 이는 rmExo-PTX로 치료시 HT29 이종이식편에서 치료 효과의 결여와 가능한 연관성을 가질 수 있으며, 이는 HT 29 세포 표면 상의 감소된 αvβ3 인테그린이 rmECxo 상의 RGD를 약하게 끌어당겨 rmERo-PTX의 수용체-매개 세포내이입을 부착 및 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 그러나, RGD-αvβ3 상호작용은 PANC-1 이종이식편에 대한 rExo-PTX-U의 감소된 치료 효과를 설명할 수 없었는데, 그 이유는 rExo-U가 또한 RGD로 변형되었기 때문으로 확인되었다.
EV 상의 인테그린은 또한 PANC-1, HT29, 및 U937 세포에서 농축되었고, 모든 3가지 유형의 EV는 웨스턴 블롯 분석에서 αv 및 β3 인테그린의 명백한 밴드 강도를 나타냈다 (도 10B). 통계적 유의성을 고려하면, U937 EV의 β3만이 PANC-1 EV에 비해 상당히 감소되었기 때문에, EV에 대한 αvβ3는 세포 용해물에서의 αvβ3와 차이를 나타냈다. 웨스턴 블롯 이미지의 정량화는 U937-유도된 EV가 PANC-1 세포에서의 것보다 상당히 더 낮은 수준의 β3 인테그린 (0.22 배)을 갖지만, HT29-유도된 EV는 PANAC-EV에 비해 αv 및 β3의 상이한 발현 수준을 나타내지 않았음을 나타내었다. 실험 결과, αv 및 β3 발현의 정확한 수준이 HT29, PANC-1, 및 U937로부터의 세포와 EV 사이에서 엄격하게 매칭되지 않았지만, 전체 패턴은 서로에 대해 거의 대칭으로 나타났다 (도 10A 내지 10B).
종합하면, 세포 및 EV 상의 인테그린 β3의 발현은 세포에 대한 알로스테릭 EV의 차별적 표적화와 관련성이 있음을 확인할 수 있었다. HT29 세포에서 인테그린 3 수용체의 강한 결핍은 RGD 상호작용을 통해 PANC-1 EV의 지연된 내재화를 야기할 수 있고, U937 EV에서 인테그린 β3의 결핍된 발현은 인테그린 β3-풍부 PANc-1 세포 내로의 지연된 내재화에 연결될 수 있음을 나타낸다. 상기 결과는 EV 인테그린이 EV의 생체내(in vivo) 조직 분포를 조절하였고, EV 분포의 인테그린-지시된 결정이 암 세포의 특정 목적지로의 귀소를 매개하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 의미한다.
인테그린 αvβ3-풍부 rmExo-PTX가 췌장 종양 세포 내로 내재화되었음을 확인하기 위해, PANC-1 이종이식편의 rmFo- PTX 그룹에 대해 αvβ3의 면역형광 염색을 수행하였다. 인테그린 αvβ3이 대조군에서 종양 세포의 표면 영역 상에 편재되어 있지만, rmExo-PTX의 투여 후 종양 세포의 세포질 영역에서 관찰되었다 (도 10C). 이는 반복된 치료에 의한 rmExo-PTX의 흡수는 특히 종양 세포의 세포질 공간에서 인테그린 αvβ3의 강도의 증가를 야기할 수 있음을 나타낸다.
실험예 10. 췌장암 이종이식편에서 ECM의 형성 및 rmExo-PTX에 의한 ECM의 제거
대조군 샘플의 면역조직화학적 염색을 통해 이종이식 조직에서 α-SMA 및 COL11의 발현을 확인하였다 (도 11). 이는 이종이식 모델이 췌장암의 미세환경을 실질적으로 모방함을 나타낸다. rmExo-PTX 치료 후, 종양 조직은 대조군에서의 종양과 비교하여 α-SMA 및 COL1의 더 적은 발현을 나타냈다. 이는 rmExo-PTX 치료가 종양의 치료 과정 동안 췌장암 진행 동안 형성된 ECM의 제거 역할을 할 수 있음을 의미한다.
결과적으로, rmExo-PTX가 췌장암의 미세환경에 침투할 수 있음을 나타내었으며, 췌장암에 대한 항암 약물의 사용에서 주요 장애물을 극복할 수 있음을 나타낸다. 또한, 결합 조직의 제거는 rmExo-PTX가 섬유성 미세환경의 침투 및 제거에 의해 원발성 암의 전이성 이동을 억제할 수 있음을 나타내는 결과이다.

Claims (12)

  1. 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체를 유효성분으로 포함하는, 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 자성 나노입자(MNP)는 스트렙타비딘-접합된 산화철 나노입자 (Streptavidin-conjugated iron oxide nanoparticles, SA-IONP)인 것인, 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 약물전달체는 췌장암 환자의 췌장암 세포주 유래 자가 엑소좀인, 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 약물전달체는 내부에 파클리탁셀, 젬시타빈, 커큐민, miRNA, siRNA, 천연물 및 단백질 중 선택된 하나 이상을 담지하는 것인, 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 암 세포의 세포질 내의 인테그린 αvβ3 농도를 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 암 세포의 α-SMA 및 COL1의 발현을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)을 제거하는 것인, 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 췌장암은 췌관 선암종, 낭종성암 및 신경내분비종양에서 선택된 하나 이상인, 약학적 조성물.
  9. 1) 세포배양액에서 엑소좀을 추출하는 단계;
    2) 추출한 엑소좀 표면에 RGD 리간드 및 자성 나노입자 (MNP)를 개질시키는 단계; 및
    3) 개질된 엑소좀 내부에 약물을 포획하는 단계;
    를 포함하는, 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체의 제조방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 단계 2)의 단계는 DSPE-PEG-RGD 및 엑소좀을 혼합하여 4℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, SA-IONP를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 수행되는 것인, 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체의 제조방법.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 단계 2)의 단계는 DSPE-PEG-RGD 및 엑소좀을 혼합하여 4℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, SA-IONP를 첨가하여 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션하여 수행되는 것인, 췌장암 예방 또는 치료용 약물전달체의 제조방법.
  12. 표면상에 RGD 리간드 및 자성 나노입자(MNP)를 포함하는 약물전달체.
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