JP2005511086A - 新規キメラtnfリガンド - Google Patents
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Abstract
Description
TNFαには二つの生物活性型が存在する。一つの型は、膜に結合したもの(mTNFα)であり、pro‐TNFαとも呼ばれる。加えて、mTNFαの酵素分解により生じる可溶型(sTNFα)が存在する。TNFは、二つの異なる受容体、CD120a及びCD120b、を介して信号を伝達する。一般的に、CD120aを介するTNFシグナルは、CD120a中に細胞死ドメインが存在するために、細胞アポトーシスを誘発する。これに対して、細胞死ドメインを持たないCD120bは、一般的に、増殖及び共刺激性の分子発現のような細胞刺激を誘発する。この後者の効果は、TNFαがCD80及びCD54を含む重要な共刺激性分子の発現を誘発する、正常B細胞において注目されている(Ranheim and Kipps, Cell Immunol. 161: 226, 1995)。
TNFαは、CD120aを発現する細胞のアポトーシスを誘発することができると共に、CD120bを介して細胞活性化による免疫応答の増強をすることができるので、多数のグループが、抗腫瘍物質としてTNFαの使用を試みた。しかし、組換え可溶性TNFαによる癌の免疫治療のほとんどは、全身的副作用なしにサイトカインの局所濃度を高めることができなかったために、臨床効果を示すことができなかった。共通する副作用は、発熱、寒気、食欲不振、高血圧、肝機能異常、及び血液学的異常であった(Spriggs et al, Ciba Found Symp, 131: 206‐227, 1987)。さらに、膜結合pro‐TNFαとして発現する野生型(wt)TNFの遺伝子導入でさえも、それが急速に可溶性サイトカインへと代謝されるために、全身的副作用を伴わずにTNFの局所高発現を達成することはできなかった。可溶性型のTNFαは、治療薬としてのTNFαの失敗の共通の原因であったので、われわれは、膜安定化TNFαを設計することによりTNFαの局所供給を達成し、しかも可溶性TNFαによる全身的副作用を軽減することが可能であると推定した。
本発明は、細胞表面に発現した時に非キメラTNFαよりも安定である新規キメラTNFαに関するものである。この新規リガンドは、TNFスーパーファミリーの少なくとも二つの異なる構成員のドメインまたはサブドメインからなるキメラである。特に、「切断部位」を含むTNFの少なくとも一つのドメインまたはサブドメインは、TNFスーパーファミリーのほかのリガンド、望ましくはCD154 ,CD70 ,FasLまたはTRAIL、の対応するドメインまたはサブドメインで置換されている。加えて、キメラリガンドは、同族のTNFα受容体に結合できるTNFαのドメインまたはサブドメインから構成されている。
本発明はまた、キメラTNFαをコードする新規ポリヌクレオチド配列、新規ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及び新規キメラリガンドを生産する方法に関するものである。
最後に、本発明は、導入細胞の免疫反応を改善して、悪性腫瘍を治療するために発現ベクターを使用する方法に関するものである。
全ての引用した文献は、図を含めてそのまま全てを本明細書において取り入れる。
I. 定義
II. キメラTNFαリガンドをコードするキメラDNA配列
*ドメインは、cDNAの最初のメチオニンの第一ヌクレオチドをヌクレオチド番号1として、各ドメインのヌクレオチド境界により決定される。本発明によると、示されたヌクレオチド境界は、同定されたものとはかなり違うかも知れないが、そうであっても、本発明において有用なドメインを定義する。
即ち、天然TNFαの切断部位を置換したドメインIIIのサブドメイン;ドメインIIIの全部;天然TNFα切断部位を置換したドメインIIを伴うドメインIIIまたはそのサブドメイン;天然TNFα切断部位を置換したドメインIを伴うドメインIIIまたはそのサブドメイン;天然TNFα切断部位を置換したドメインIVのサブドメインを伴うドメインIII;ドメインIII、ドメインII及びドメインI、またはそのサブドメイン。望ましくは、第一ヌクレオチド配列は、CD154, CD70, FasL及びTRAILのTNFリガンドにおける一つの少なくとも一つのドメインまたはサブドメインをコードしている。本発明によると、TNFα切断部位を含むドメインまたはサブドメインを、この4個のTNFリガンドの一つのドメインまたはサブドメインで置換することにより、天然TNFαよりも著しく切断されにくいキメラTNFαを生じる。
III. 遺伝子構築体
IV. 宿主細胞
免疫応答の調節におけるTNFαと同族受容体の相互作用を認識して、本発明は、天然TNFαに比較して細胞表面からの切断を受けにくいキメラTNFαをコードするポリヌクレオチド配列を細胞中に導入することにより、TNF‐R1, TNF‐R2,または一部のその他のTNFα同族受容体に結合できる膜安定化リガンドの濃度を上昇させる方法も考慮している。キメラTNFαは、タンパク分解切断を受けにくいので、同族受容体に結合する能力が増加し、細胞分解反応または免疫応答を誘発する。さらに、本発明のキメラTNFαリガンドをコードするポリヌクレオチドを導入された細胞のアポトーシスを誘発し、TNFα受容体を持つ細胞を排除する能力は増加する。
VI. 腫瘍の治療方法
SEQ ID NO. 1‐SEQ ID NO. 4のキメラアクセサリー分子リガンド遺伝子は下記のように構築しそしてクローニングした。
リガンド(CD154, CD70, FasL,及びTRAIL)のドメインI‐IIIをコードするDNAフラグメントを、全長cDNA鋳型からリガンドのドメインI‐IIIに隣接する5’及び3’領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCRにより増幅した。さらに、TNFαのサブドメインIVをコードするDNAフラグメントをPCR増幅した。ドメインI‐IIIフラグメントとドメインIVフラグメントを連結できるようにドメインIII‐IV連結PCRプライマーセットにBamHI制限酵素部位を組み込んだ。さらに、pcDNA3ベクターに連結できるように、ドメインI及びIVを挟む5’及び3’プライマーに制限エンドヌクレアーゼ部位を加えた。ドメインI‐IIIフラグメント及びドメインIVフラグメントのPCR増幅に続いて、DNAフラグメントをBamHI及びドメインI及びIVの5’及び3’隣接領域に対応する制限酵素で消化した。消化の後、ドメインI‐IIIフラグメント及びドメインIVフラグメントをBamHI部位で連結し同時に真核発現プラスミドpcDNA3(Invitrogen, San Diego, CA)の多重クローニング部位に連結した。キメラTNFα(以降例の中では、TNFαは単に「TNF」と称す)DNA挿入を強力な異種CMVプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列で挟んだ。
キメラTNF‐pcDNA3プラスミドを制限酵素NruI及びSmaIで消化して、pCDNA3のCMVプロモーター、キメラTNF遺伝子、及びpCDNA3のポリアデニル化シグナルを切り出す。1%アガロースゲル上で消化DNAを分離してこのフラグメントをゲル精製した後、このDNAフラグメントをアデノウイルスシャトルベクターMCS (SK) pXCX2のEcoRV部位に連結した。このプラスミドは、pBluescriptポリリンカー配列がE1領域にクローニングされているプラスミドpXCX2の変形である(J. R. Tozer, UCSD,未公開データ、1993年9月)。キメラTNF‐MCS (SK) pXCX2プラスミドを精製した後、このシャトルプラスミドの5ugをJM17プラスミドの5ugとともにリン酸カルシウムProfectionキットを使用して293AC2細胞に導入した。導入の後、細胞を5日間培養して、相同組換え及びウイルス合成を行わせた。全細胞及び上清を回収し、凍結‐解凍を3回行い細胞結合アデノウイルスを遊離した。
II. キメラアクセサリー分子リガンド遺伝子のCLL細胞及びHeLa細胞への導入と発現
i. 発現
2. 可溶性TNF生成:ELISA定量
図5は、キメラTNFαアデノウイルスベクターに感染したHT1080細胞により生成した可溶性TNFの量を示す。細胞は、感染多重度10で感染させた。感染後2日、上清を採取し、死亡細胞及び破片を遠心分離により除去した。可溶性TNFはPharmingen, Inc. (La Jolla, CA)のTNF特異的ELISA検定をメーカー説明書に従って使用して固相酵素免疫検定(ELISA)により測定した。TNFの相対的量は組換えTNF(Biosource International)の既知量の検量線に基づいて算出した。このデータは、キメラTNF構築では野生型TNF(wt TNF)または推定mmpタンパク分解部位を持たない前記膜安定化□TNFのいずれよりも可溶性TNFの生成が有意に少ないことを示している。さらに、他の構築全てに比較してCD154:TNFの表面発現レベルは最も高く、その一方でCD154:TNFは可溶性TNFの生成が最も少ない。この可溶性TNF放出パターンは、HeLa, 293, A549, COLO205, HCT‐15, 及びBT‐20を含む、他の細胞系においても観察された。
1. WEHI164繊維肉腫細胞のTNFキメラによる死:共培養検定
図6は、既述(Espevik et al, J Immunol Methods, 95: 99‐105,1986)の生物学的アポトーシス検定を使用してTNFキメラが機能していることを示す。感染多重度10で2日間アデノウイルスにHeLa細胞を感染させた後、WEHI164細胞、TNF感受性細胞系、を感染したHeLa細胞上に積層し、さらに18時間インキュベートした。WEHI164細胞は予めPKH26(Sigma, Inc)、HeLa 細胞からWEHI164を区別することができる赤い蛍光色素、で標識した。WEHI細胞をヨードプロピジウムで染色し、フローサイトメトリーで細胞死を分析した。このデータは、TNFを発現するHeLa細胞と共培養することによりWEHI細胞が死滅することを示している。
図7は、TNFキメラによるWEHI164細胞の接触依存的細胞死を示している。これはTNFキメラの膜安定発現を示している。要約すると、HeLa細胞を感染多重度10で1日アデノウイルスに感染させた。次いでWEHI164細胞を感染HeLa細胞と直接混合するか、または0.2ミクロントランスウエル挿入管によりHeLa細胞と分離した。挿入管は細胞‐細胞の直接接触を妨げるが、可溶性分子(例えば、可溶性TNF)の細胞間拡散は可能である。混合後18時間、WEHI164細胞を図6に既述したようにアポトーシスについて分析した。トランスウエル挿入管によって分離されているWEHI164細胞を殺すことができる可溶性TNFを放出するwt TNFに対して、TNFキメラはアポトーシスを誘発する可溶性TNFを放出しない。
図8は、キメラTNFを発現するHeLa細胞と共培養したCLL B細胞の活性化を示す。HeLa細胞を感染多重度10でアデノウイルスに感染させた。感染後2日、CLL細胞をHeLa細胞上に積層し、1日共培養した。CD19+CLL細胞を表現型マーカー(CD25, CD54, CD86, CD95及びCD70)の発現の変化について分析した。太線のヒストグラムは各列の左に示すAd‐TNFベクターと共培養したCLL細胞を示す。細線のヒストグラムはAd‐LacZウイルスとの共培養を示す。薄いヒストグラムは無関係の特異性を持つアイソタイプ対照モノクロナール抗体による染色を示す。このデータは、キメラTNF構築がリンパ球活性化に特徴的なCLL細胞上の一群の表現型マーカーの発現を調節する機能を持つことを示している。
図9は、以下のキメラCD154で感染させたHeLa細胞により生産された可溶性TNFの量を示す:推定CD154 mmp認識部位を欠くCD154含むTNFαアデノウイルスベクター:図3‐8に記述されたTNFキメラ。
この構築体をCD154+mmp:TNF(SEQUENCE ID#9)と表す。細胞を感染多重度10でアデノウイルスに感染させた。感染後2日、上清を採取し、死亡細胞及び破片を遠心分離により除去した。可溶性TNFは、Pharmingen, Inc. (La Jolla, CA)のTNF特異的ELISA検定をメーカー説明書に従って使用して固相酵素免疫検定(ELISA)により測定した。TNFの相対的量は組換えTNF(Biosource International)の既知量の検量線に基づいて算出した。このデータは、元のCD154に対する上記の修飾を示す:TNFキメラは、可溶性分子へのタンパク分解切断に対する感受性について影響を受けなかった。
図10は、CD70:種々の修飾を加えたリンカードメインを持つTNFキメラ:をコードするプラスミドに感染させたHeLa細胞により生成する可溶性TNFの量を示す。CD70:図3‐4に記述したTNF構築に加えて、短縮したリンカードメイン(□Linker CD70:TNF, Sequence ID#10)及び修飾アミノ酸配列のリンカードメイン(LinkerDP->GA CD70:TNF, Sequence ID#11)を持つ構築を示す。HeLa 細胞はLipofectamine2000(Gibco-BRL)をメーカー説明書に従って使用してプラスミドに感染させた。感染後2日、上清を採取し、可溶性TNFを上記のようにELISAにより測定した。このデータは、TNFキメラのリンカードメインの修飾がこれらの構築の安定性に影響しないことを示している。
図11は、β‐ガラクトシダーゼ(LacZ),野生型TNF, またはキメラCD154:TNFのいずれかをコードするアデノウイルスを腫瘍の中に注射した後、予め作成したWEHI164腫瘍を持つマウスのパーセンテージを示す。簡単に記すと、Balb/cマウスの皮下に3×106個のWEHI164細胞を接種し、10日間腫瘍塊を作らせた。接種後10,12,および14日に、5×108プラーク形成単位(pfu)のウイルスを腫瘍内注射により投与した。動物を毎週腫瘍の存在について検査した。腫瘍径が>2 cmに達したら、動物を殺処理した。このデータは、野生型TNFで処置したマウスのわずか50%で腫瘍の消失があったのに対して、キメラCD154:TNFでは75%のマウスで完全に腫瘍が消失したことを示している。対照のアデノウイルス(Ad‐LacZ)で処置したマウスでは腫瘍は消失しなかった。このデータは、キメラTNFは腫瘍に対して治療作用を有しており、この作用は野生型TNFより強い。
Claims (51)
- TNFα以外の腫瘍壊死因子リガンドのドメインまたはサブドメインをコードし、コードされたドメインまたはサブドメインが天然TNFαの切断部位を置換している第一ヌクレオチド配列と、
TNFα受容体に結合する天然TNFαのドメインまたはサブドメインをコードする第二ヌクレオチド配列と
を含む、キメラTNFαをコードする単離ポリヌクレオチド配列。 - TNFα以外の腫瘍壊死因子リガンドのドメインIIIまたはドメインIIIのサブドメインをコードし、コードされたドメインまたはサブドメインが天然TNFαの切断部位を置換している第一ヌクレオチドと、
TNFα受容体に結合する天然TNFαのドメインまたはサブドメインをコードする第二ヌクレオチド配列と
を含む、キメラTNFαをコードする単離ポリヌクレオチド配列。 - 第一ヌクレオチド配列が、さらに他の腫瘍壊死因子リガンドのドメインII, またはドメインIIのサブドメインをコードする、請求項1または請求項2に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
- 第一ヌクレオチド配列が、さらに他の腫瘍壊死因子のリガンドのドメインI、またはドメインI のサブドメインをコードする、請求項1,2または3に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
- 第一ヌクレオチド配列が、さらに他の腫瘍壊死因子リガンドのドメインIVのサブドメインをコードする、請求項1,2,3または4に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
- 他の腫瘍壊死因子リガンドが、CD154, CD70, Fasリガンド及びTRAILから成る群から選択される、請求1または2に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
- 第二ヌクレオチド配列が、天然TNFαのドメインIVまたはドメインIVのサブドメインをコードする、請求項1または2に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
- 第二ヌクレオチド配列が、天然TNFαの切断部位を欠く天然TNFαのドメインIVのサブドメインをコードする、請求項7に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
- 第一ヌクレオチド配列が、CD154, CD70, Fasリガンド及びTRAILから成る群から選択される腫瘍壊死因子リガンドのドメインI, II及びIII、またはドメインI, II及びIIIの一つ以上のサブドメインをコードし、
第二ヌクレオチド配列が、天然TNFαのドメインIVまたはドメインIVのサブドメインをコードする、請求項1または請求項2に記載の単離ポリヌクレオチド配列。 - 第一ヌクレオチド配列が、CD154のドメインI, II及びIII、またはドメインI, II及びIIIの一つ以上のサブドメインをコードし、
第二ヌクレオチド配列が、天然TNFαのドメインIVまたはドメインIVのサブドメインをコードする、請求項9に記載の単離ポリヌクレオチド配列。 - 第一ヌクレオチド配列と第二ヌクレオチド配列とを連結する少なくとも一個のアミノ酸のペプチドをコードするリンカードメインを含む、請求項1または請求項2に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
- 配列が、SEQ. ID. NO. 1. SEQ. ID. NO. 2. SEQ. ID. NO. 3及び SEQ. ID. NO. 4からなる群から選択される、請求項1または請求項2に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
- キメラTNFαが、SEQ. ID. NO. 5. SEQ. ID. NO. 6. SEQ. ID. NO. 7及び SEQ. ID. NO. 8からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項2に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
- TNFα以外の腫瘍壊死因子リガンドの第一ドメインまたはサブドメインであって、該ドメインまたはサブドメインが、天然TNFαの切断部位を置換している、第一ドメインまたはサブドメインと、TNFα受容体に結合する天然TNFαの第二ドメインまたはサブドメインとを含む、キメラTNFα。
- TNFα以外の腫瘍壊死因子リガンドの第一ドメインIIIであって、当該ドメインまたはサブドメインが天然TNFαの切断部位を置換している、第一ドメインIIIと、TNFα受容体に結合する天然TNFαの第二ドメインまたはサブドメインとを含む、キメラTNFα。
- 天然TNFαより細胞の表面からの切断を受けにくい、請求項14または請求項15に記載のキメラTNFα。
- キメラTNFαの切断速度が、天然TNFαより少なくとも90%遅い、請求項16に記載のキメラTNFα。
- ドメインまたはサブドメインが、さらに他の腫瘍壊死因子リガンドのドメインIIまたはドメインIIのサブドメインを含む、請求項14または請求項15に記載のキメラTNFα。
- ドメインまたはサブドメインが、さらに他の腫瘍壊死因子リガンドのドメインIまたはドメインIのサブドメインを含む、請求項14,15または18に記載のキメラTNFα。
- ドメインまたはサブドメインが、さらに他の腫瘍壊死因子リガンドのドメインIVのサブドメインを含む、請求項14,15,18または19に記載のキメラTNFα。
- 他の腫瘍壊死因子リガンドが、CD154, CD70, Fasリガンド及びTRAILから成る群から選択される、請求項14または請求項15に記載のキメラTNFα。
- さらに天然TNFαのドメインIVまたはドメインIVのサブドメインを含む、請求項14または請求項15に記載のキメラTNFα。
- 天然TNFαの切断部位を欠く天然TNFαのドメインIVのサブドメインを含む、請求項22に記載のキメラTNFα。
- CD154, CD70, Fasリガンド及びTRAILから成る群から選択される腫瘍壊死因子リガンドのドメインI, II及びIII、またはドメインI, II及びIIIの一つ以上のサブドメインと、天然TNFαのドメインIVまたはドメインIVのサブドメインとを含む、請求項14または請求項15に記載のキメラTNFα。
- CD154ドメインI, II及びIII、またはドメインI, II及びIIIの一つ以上のサブドメインと、天然TNFαのドメインIVまたはドメインIVのサブドメインとを含む、請求項14または請求項15に記載のキメラTNFα。
- 第一ドメインまたはサブドメインと第二ドメインまたはサブドメインとを連結する少なくとも1個以上のアミノ酸のペプチドをコードするリンカードメインを含む、請求項14または請求項15に記載のキメラTNFα。
- 請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
- 前記ポリヌクレオチド配列が、CD154, CD70, Fasリガンド及びTRAILから成る群から選択される腫瘍壊死因子リガンドのドメインIIIまたはドメインIIIのサブドメインと、天然TNFαのドメインIVまたはドメインIVのサブドメインとを含む、キメラTNFαをコードする、請求項27に記載の発現ベクター。
- CD154, CD70, Fasリガンド及びTRAILから成る群から選択される腫瘍壊死因子リガンドのドメインIIまたはドメインIIのサブドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載の発現ベクター。
- CD154, CD70, Fasリガンド及びTRAILから成る群から選択される腫瘍壊死因子リガンドのドメインIまたはドメインIのサブドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項28または請求項29に記載の発現ベクター。
- CD154, CD70, Fasリガンド及びTRAILから成る群から選択される腫瘍壊死因子リガンドのドメインIVのサブドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項28または請求項29に記載の発現ベクター。
- ウイルスDNAまたは細菌DNAを含む、請求項28に記載の発現ベクター。
- 前記ウイルスDNAが、アデノウイルスDNAまたはレトロウイルスDNAからなる群から選択される請求項32に記載の発現ベクター。
- ベクターの少なくとも一部に、アデノウイルスDNAを含む、請求項32に記載の発現ベクター。
- さらにプロモーター領域を含む、請求項27に記載の発現ベクター。
- さらにポリアデニル化シグナル領域を含む、請求項27に記載の発現ベクター。
- プロモーター配列及びポリアデニル化シグナル配列に作動的に連結した請求項1または請求項2に記載の単離ポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子構築体。
- 請求項27に記載の発現ベクターまたは請求項37に記載の遺伝子構築体を含む、宿主細胞。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項38に記載の宿主細胞。
- 細胞が腫瘍細胞である、請求項39に記載の宿主細胞。
- 細胞が抗原提示細胞である、請求項39に記載の宿主細胞。
- タンパクの発現を行うのに適した条件下に請求項38に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項14または請求項15に記載するキメラTNFαの製造方法。
- 細胞表面のTNFα受容体に結合することができるリガンドの濃度を増加させる方法であって、
請求項1または請求項2に記載のキメラTNFαをコードする単離ポリヌクレオチド配列を細胞に導入することより、キメラTNFαを天然TNFαよりも細胞表面からの切断を受け難くすることを含む、上記方法。 - 単離ポリヌクレオチド配列が、請求項27に記載の発現ベクターまたは請求項37に記載の遺伝子構築体を含む、請求項43に記載の方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項44に記載の方法。
- 細胞がその表面にTNFα受容体を発現する、請求項44に記載の方法。
- 請求項1または請求項2に記載のキメラTNFαをコードする単離ポリヌクレオチド配列を細胞に導入し、その細胞の表面にキメラTNFαを発現させることを含む、TNFα受容体を発現する細胞のアポトーシスを誘発する方法。
- 請求項1または請求項2に記載のキメラTNFαをコードする単離ポリヌクレオチド配列を細胞に導入し、その細胞の表面にキメラTNFαを発現させることを含む、免疫系細胞の活性化を誘発する方法。
- 請求項1または請求項2に記載のキメラTNFαをコードする単離ポリヌクレオチド配列を腫瘍細胞に導入し、その細胞の表面にキメラTNFαを発現させることを含む、患者における腫瘍の治療方法。
- ヒト患者から腫瘍細胞を取り出し、その細胞の中にキメラTNFαをコードするポリヌクレオチド配列を導入し、その後、患者の体内に腫瘍細胞を戻すことを含む、請求項49に記載の方法。
- 請求項1または請求項2に記載のキメラTNFαをコードする単離ポリヌクレオチド配列を患者の腫瘍患部に直接注射し、腫瘍患部にキメラTNFαを発現させることを含む、腫瘍の治療方法。
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