TWI275644B - Novel chimeric TNF ligands - Google Patents

Description

1275644 ⑴ 玖、發明說明. (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說明) 技術領域 本發明係關於生物化學、免疫學、遺傳工程學及醫學等 領域。特定言之，其係有關於新穎嵌合配位體，當表現於 細胞表面時，其比相對之天然配位體更為穩定。 先前技術 免疫系統消滅惡性細胞之方法為先將之辨識為外來物後 再自體内加以清除。為完成此目標，免疫系統須同時仰賴 抗體反應及細胞反應。這二種反應皆需要免疫系統中部分 不同細胞間的交互作用（艾巴氏（Abbas), Cellular and Molecular Immunology，2000) 〇 免疫反應典型由T淋巴細胞（T細胞）開始，其表面具有一 T 細胞接受器（TCR)，其可結合源自抗原之肽（與第II類主要組 織相容複合（MHC)分子相關）。T細胞亦可於其表面表現各種 多肽，因其可與免疫-媒介反應相關細胞之接受器結合，亦 稱為”配位體"，以下將有更詳盡的敘述。當T細胞接受器結 合一 MHC-相關抗原（如源自惡性細胞之抗原）時，其可活化 並於其表面表現配位體。該配位體僅出現於細胞表面一短 暫時間，且其一旦由細胞表面移除時，該T細胞即喪失與具 接受器之細胞結合的能力。其中一種配位體稱為腫瘤壞死 因子（TNFa) 〇 當表現於活化之T細胞表面時，TNFoc可與表現於免疫細 胞、非免疫性細胞及惡性細胞表面之接受器結合，如TNF-接受器I(亦稱為”p55"或"CD120a")及TNF-接受器II(亦稱為 1275644

” p75”或” CD 120b”）。這些免疫細胞包括了統稱為”抗原表現 細胞"(AiC)者，因其能表現可結合並呈現抗原給T細胞之表 面多肽。APC之實例包含樹突細胞及B細胞。APC表面亦具 有各種可與其它免疫系統之細胞行交互反應之接受器分 子。T細胞表現之配位體及APC上之接受器分子與惡性細胞 間的交互作用所造成之細胞溶解反應可摧毀該惡性細胞並 將其自體内清除。 TNFa隸屬於較大之配位體一族，該族統稱為TNF總科（葛 魯司（Gruss)等人，細胞動力素Mol Ther, 1:75-105, 1995及拉克 司雷（Locksley)等人，Cell, 104 : 487 - 501，2001)。TNF總科成員 包含Fas配位體（"FasL”）、TNFa、LTa、淋巴細胞毒素（TNF0)、 CD154、TRAIL、CD70、CD30配位體、4-1BB配位體、APRIL、 TWEAK、RANK配位體、LIGHT、AITR配位體、艾科透迪司 普拉信（ectodysplasin)、BLYS、VEGI及 0X40配位體。TNF總科 成員皆捺有一保留性二級結構，其中包括四種功能部位： 功能部位I，即細胞内功能部位；功能部位II，其橫跨細胞 膜並亦稱為穿透膜功能部位；功能部位III，其組成鄰近細 胞膜之細胞外胺基酸；以及功能部位IV，即遠端細胞外功 能部位（吉普司（Kipps)等人，W0 98/26061，公告於1998年6月 18日）。典型上，至少一部分之功能部位IV可自親代分子分 裂出。分裂片段通常顯示與完整配位體相同之生物活性， 且慣稱為”可溶型”之TNF族成員。 I. TNFa之生物活性 TNFa具有二種生物活性型式。其中一種型式為膜-結合型 1275644

(3) (mTNFa)，亦稱為pro-TNFot。此夕卜還有一種可溶型（sTNFoc)， 其係由mTNFa經蛋白質水解分裂而產生。TNF係經由兩種不 同之接受器（CD120a及CD120b)來產生訊號。一般來說，經由 CD120a之TNF訊號引發細胞之凋零，因其表現了 一位於 CD 120a之細胞質死亡功能部位。反之，缺少死亡功能部位 之CD 120b通常引發細胞活化，如增殖及輔助刺激 (costimulatory)分子表現。後者之作用於正常B細胞中相當顯 著，其中TNFa引發表現重要的輔助剌激分子，包含CD80及 CD54(蘭罕（Ranheim)及吉普司（Kipps)，Cell Immunol· 161: 226， 1995)。 有一種稱為TACE(即TNF-α轉換酵素）之基質金屬蛋白酶 (mmp)顯示可釋出可溶型TNFa(布萊克（Black)等人，Nature, 385:729-733，1997 及摩斯（Moss)等人，Nature，385:733-736, 1997)。已發現TACE可自胺基酸殘基丙胺酸76與纈胺酸77之 間分裂pro-TNFa而釋出sTNFa。此外，此分裂係取決於一個 橫跨纈胺酸77至脯胺酸88之約12個胺基酸的mmp識別序列 (迪寇司特（Decoster)等人，J Biol Chem，270:18473-18478，1995 及譚（Tang)等人，Biochemistry，35:8226-8233，1996)，此因刪除 該mmp識別部位之9至12個胺基酸可抑制親代TNFa分子之 分裂（迪寇司特等人，J Biol Chem，270: 18473-18478，1995及 (Perez)等人，Cell，63:251-258，1990)。然而，因 TNFa 中存有 多重分裂部位，故刪除該分裂部位並不一定能完全取消 sTNFa 的產生（慕勒（Mueller)等人，J Biol Chem， 274:38112-38118， 1999)。 1275644 (4) II. 以目前之TNFa結構物治療人類疾病之缺點 由於TNFa可引發CD 120a表現細胞之細胞凋亡並藉由 CD 120b活化細胞以提高免疫反應，因此許多人嘗試使用 TNFa做為一種抗腫瘤化合物。然而，由於無法使細胞動力 素僅達到高局部濃度而不產生全身毒性，大部分使用重組 可溶型TNFa之癌症免疫療法只顯示出極小的臨床效果。常 見之副作用包含發燒、寒顫、厭食、高血壓、肝異常及血 液學變化（史普力格（Spriggs)等人，Ciba Found Symp，131: 206-227，1987)。此外，即使野生型（wt) TNF(表現成為與膜相 關之pro-TNFa)之基因轉移亦無法使TNF達到高局部表現而 不產生全身毒性，此因其可快速代謝成為可溶性細胞動力 素之故。由於可溶型式TNFa為TNFa無法做為治療性化合物 之共同因素，我們認為只要設計出膜穩定性之TNFa應可容 許TNFa局部遞送、並同時減輕與可溶型TNFa相關之全身毒 性的風險。 由於目前TNFa在應用上之缺點，因此明確地需要具有膜 穩定性之TNFa，其可維持天然TNFa之接受器結合功能但較 不易分裂並因此較不易產生可溶型式之TNFa。本發明可提 供該種具有膜穩定性之TNFa配位體。 - 發明内容 本發明係關於新穎之嵌合TNFa，當其表現於細胞表面時 較非-嵌合TNFa更加穩定。這些新穎配位體為嵌合型，因其 包括TNF總科中至少二種之不同成員的功能部位或次功能 部位。具體地，在含有”分裂部位”之TNF中至少有一功能部 1275644

位或次功能部位被另一個TNF總科配位體（較佳為CD154、 CD70、FasL或TRAIL)之相對功能部位或次功能部位所取 代。此外，該嵌合配位體中含有負責與關聯TNFa接受器結 合之TNFa的功能部位或次功能部位。本發明亦有關於可編 碼嵌合TNFa之新穎多核甞酸序列、包含該新穎多核甞酸序 列之表現性載體，及製造該新穎嵌合配位體之方法。最後， 本發明係有關於使用表現載體以增進轉移感染細胞之免疫 反應性及治療惡性腫瘤之方法。 因此，本發明特點之一係關於一種可編碼嵌合TNFa之分 離多核甞酸序列，其首先包括一種可編碼腫瘤壞死因子配 位體（除TNFa外）之功能部位或次功能部位的核甞酸序列， 其中其所編碼之功能部位或次功能部位取代了天然TNFa 的分裂部位；以及第二種可編碼能結合TNFa接受器之天然 TNFa功能部位或次功能部位的核芬酸序列。 本發明特點之一係上述之分離多核甞酸序列中之第一種 核甞酸序列可編碼另一種腫瘤壞死因子配位體之功能部位 III或功能部位III之次功能部位。 本發明特點之一係上述之分離多核甞酸序列中之第一種 核甞酸序列尚可編碼另一種腫瘤壞死因子配位體功能部位 II或功能部位II之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之分離多核甞酸序列中之第 一種核甞酸序列尚可編碼另一種腫瘤壞死因子配位體功能 部位I或功能部位I之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之分離多核甞酸序列中之第 •10- 1275644

⑻ 一種核甞酸序列尚可編碼腫瘤壞死因子配位體功能部位IV 之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之分離多核甞酸序列中之另 一種腫瘤壞死因子配位體係選自由下所組成之群：CD 154、 CD70、Fas配位體及 TRAIL。 本發明特點之一係如上所述之分離多核甞酸序列中之第 二種核甞酸序列可編碼天然TNFa之功能部位IV或功能部位 IV之次功能部位。

本發明特點之一係如上所述之分離多核甞酸序列中之第 二種核甞酸序列可編碼天然TMFa功能部位IV之次功能部 位，後者可產生一天然TNFa之分裂部位。

本發明特點之一係如上所述之分離多核甞酸序列中之第 一種核甞酸序列可編碼選自包括由CD154、CD70、Fas配位 體及TRAIL所組成之群的腫瘤壞死因子配位體之功能部位 I、II及III或一或多個功能部位I、II及III的次功能部位，而 第二種核甞酸序列可編碼天然TNFa之功能部位IV或功能部 位IV之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之分離多核甞酸序列中之第 一種核甞酸序列可編碼CD 154之功能部位I、II及III或一或多 個功能部位I、II及III的次功能部位，而第二種核甞酸序列 可編碼天然TNFa之功能部位IV或功能部位IV之次功能部 位。 本發明特點之一係如上所述之分離多核甞酸序列，其進 一步包括一個可編碼一種肽（至少含一胺基酸）之連結功能 -11 -

1275644 部位，該肽可連接第一種核甞酸序列與第二種核甞酸序列。 本發明特點之一係如上所述之分離多核甞酸序列，其中 之序列係選自以下所組成之群：序列鑑別編號1、序列鑑別 編號2、序列鑑別編號3及序列鑑別編號4。 本發明特點之一係如上所述之分離多核甞酸序列，其中 之嵌合TNFa包括選自以下胺基酸序列所組成之群：序列鑑 別編號5、序列鑑別編號6、序列鑑別編號7及序列鑑別編號 8 ° 本發明特點之一係嵌合TNFa，其首先包括除TNFa外之腫 瘤壞死因子配位體的功能部位或次功能部位，其中該功能 部位或次功能部位可取代天然TNFa之分裂部位；以及第二 種可結合TNFa接受器之天然TNFa的功能部位或次功能部 位。 本發明特點之一係嵌合TNFa，其較天然TNFa不易於由細 胞表面分裂。 本發明特點之一係嵌合TNFa，其分裂比例較天然TNFa配 位體減少約90%。 本發明特點之一係如上所述之嵌合TNFa，其中之功能部 位或次功能部位包括另一種腫瘤壞死因子配位體之功能部 位III或功能部位III之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之嵌合TNFa，其中之功能部 位或次功能部位進一步包括另一種腫瘤壞死因子配位體之 功能部位II或功能部位II之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之嵌合TNFa，其中之功能部 -12 - 1275644

位或次功能部位進一步包括另一種腫瘤壞死因子配位體之 功能部位I或功能部位I之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之嵌合TNFa，其中之功能部 位或次功能部位進一步包括另一種腫瘤壞死因子配位體之 功能部位IV的次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之嵌合TNFa，其中之另一種 腫瘤壞死因子配位體係選自由以下各物所組成之群： CD154、CD70、Fas配位體及 TRAIL。 本發明特點之一係如上所述之嵌合TNFa，其進一步包括 天然TNFa之功能部位IV或功能部位IV之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之嵌合TNFa，其包括天然 TNFa的功能部位IV之次功能部位，但缺少天然TNFa之分裂 部位。 本發明特點之一係如上所述之嵌合TNFa，其包括選自由 CD154、CD70、Fas配位體及TRAIL所組成之群的腫瘤壞死因 子配位體之功能部位I、II及III或一或多個功能部位I、II及 III的次功能部位，以及天然TNFa之功能部位IV或功能部位 IV之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之嵌合TNFa，其包括CD 154 之功能部位I、功能部位II及功能部位III或一或多個功能部 位I、II及III的次功能部位及天然TNFa之功能部位IV或功能 部位IV之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之嵌合TNFcx，其另包括一種 可將第一種功能部位或次功能部位連結至第二種功能部位 -13- 1275644 (9) 或次功能部位的連結功能部位。 本發明特點之一係表現性載體，其中包含一種如上所述 之分離多核甞酸序列。 本發明特點之一係上述之表現性載體，其中之多核甞酸 序列可編碼嵌合TNFot，其包括選自由CD154、CD70、Fas配 位體及TRAIL所組成之群的腫瘤壞死因子配位體之功能部 位III或功能部位III之次功能部位及天然TNFa之功能部位IV 或功能部位IV之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之表現性載體，其進一步包 括一多核甞酸序列，該多核甞酸序列可編碼選自由CD 154、 CD70、Fas配位體及TRAIL所組成之群的腫瘤壞死因子配位 體的功能部位Π或功能部位II之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之表現性載體，其進一步包 括一多核甞酸序列，該多核甞酸序列可編碼選自由CD 154、 CD70、Fas配位體及TRAIL所組成之群的腫瘤壞死因子配位 體的功能部位I或功能部位I之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之表現性載體，其進一步包 括一多核甞酸序列，該多核甞酸序列可編碼選自由CD 154、 CD70、Fas配位體及TRAIL所組成之群的腫瘤壞死因子配位 體的功能部位IV之次功能部位。 本發明特點之一係如上所述之表現性載體，其進一步包 括一多核甞酸序列，該多核荅酸序列可編碼選自由CD 154、 CD70、Fas配位體及TRAIL所組成之群的腫瘤壞死因子配位 體的功能部位IV之次功能部位。 •14- 1275644

(10) 本發明特點之一係如上所述之表現性載體，其進一步包 括病毒I>NA或細菌DNA。 本發明特點之一係如上所遂之表現性載體，其進一步包 括腺病毒DNA、反轉錄病毒dNA或其它病毒基因轉移系統。 本發明特點之一係如上所述之表現性載體，其進一步包 括啟動部位。 本發明特點之一係如上所述之表現性載體，其進一步包 括聚腺嘗酸化作用訊號部位。 本發明特點之一係一基因構造，其包括一上述分離多核苷 酸序列，後者經操作與啟動序列及聚腺甞酸化作用訊號序 列相連接。 本發明特點之一係一宿主細胞，其中包含一如上述之表 現性載體或基因構造。 本發明特點之一係上述之宿主細胞為哺乳動物細胞。 本發明特點之一係該宿主細胞為抗原表現細胞。 本發明特點之一係該宿主細胞係腫瘤細胞。 本發明特點之一係製造嵌合TNFoc之步驟，其包括於適合 有效表現蛋白質之條件狀況下培養其中一種如上述之宿主 細胞。 本發明特點之一係能增加可結合細胞表面TNFa接受器 之配U⑻濃度的方法，其包括將可編碼嵌合TNFa之分離多 核穿酸序列導入細胞中，該方法係藉由該嵌合職較天然 TNFa不易由細胞表面分裂之助。 本發明特點之一 #上述之女、土 ^ , 係上i又万去，其中之分離多核甞酸序 -15· 1275644

列包括如上述之表現性載體或基因構造其中之一 ^ 本發明特點之一係上述之方法，其中之細胞為哺乳動物 細胞。 本發明特點之一係上述之方法，其中該細胞可於其表面 表現TNFa接受器。 本發明特點之一係能於可表現TNFa接受器之細胞引發 細胞调亡的方法，其包括將可編碼能表現於細胞表面之嵌 合TNFa的分離多核甞酸序列導入細胞中。 本發明特點之一係可引發免疫系統細胞活化之方法，其 包括將可編碼能表現於細胞表面之嵌合TNFa的分離多核苷 酸序列導入細胞中。 本發明特點之一係治療病患贅瘤增生之方法，其包括將 可編碼能表現於細胞表面之嵌合TNFa的分離多核苷酸序 列導入贊瘤細胞中。 本發明特點之一係如上述之方法，其進一步包括由人類 病患獲得贅瘤性細胞、將可編碼嵌合TNFa之多核甞酸序列 導入之該贅瘤性細胞後、再將之灌注回病患體内等步驟。 本發明特點之一係治療贅瘤增生之方法，其包括將一種 可表現嵌合TNFa的分離多核：y：酸序列注射至病患之腫瘤 病灶中，該分離多核甞酸序列隨即可將嵌合TNFa表現於細 胞表面上。 圖式簡單說明 凰圖1係部分TNF總科之人類及鼠配位體的概要圖 717，其描繪這些配位體之功能部位MV(吉普司等人，w〇 -16 -

1275644 (12) 98/26061，公告於1998年6月18日）。 圖2·圖2係野生型TNFoc(稱為wt TNFoc)、TNFoc之刪除突變 體（稱為2TNFa)及部分示範性之本發明TNFa嵌合體的概要 圖示，其描繪這些配位體之功能部位I-IV及功能部位連結 子0 圖3.圖3為一系列螢光活化細胞分類（FACS)統計圖，其顯 示比較wt TNFoc、刪除型突變體2TNFa及某些示範性之本發 明TNFa嵌合體於HT1080細胞表面之表現性。陰影區代表同 型物-對照抗體之背景螢光染色。無陰影區域代表在經可編 碼DNA序列之腺病毒所感染的HT1080細胞表面上之wt TNFa、先前所述之膜穩定型2TNFa、及示範性嵌合TNFa配 位體之表現程度。 圖4.圖4為一系列FACS統計圖，其顯示比較未感染之CLL B細胞及以可編碼wt TNFa及某些示範性之本發明TNFa嵌合 體的腺病毒感染之細胞表面TNFa表現程度。陰影區代表以 同型物-對照抗體染色之細胞的背景螢光。無陰影區域代表 人類TNFa在以TNF-專一抗體染色之細胞上的表現程度。 圖5.圖5顯示以wt TNFa腺病毒、2TNFa腺病毒及示範性之 嵌合TNFa腺病毒載體感染之HT1080細胞所產生之可溶性 TNFa數量，_其係由TNF-專一 ELISA分析法所測量。 圖6.圖6代表以可編碼wt TNFoc、2TNFa及示範性嵌合 TNFa腺病毒載體之腺病毒感染WEHI164細胞後之細胞死亡 狀況。 圖7.圖7顯示WEHI164細胞之細胞凋亡狀況，該細胞係先

1275644 (13) 與以可編碼CD154: TNFoc嵌合體的腺病毒所感染之HeLa細胞 共同培養；同時並與以wt TNFoc感染之細胞相比較。深色橫 條代表經由細胞-對-細胞接觸後所造成之細胞凋亡，而淺色 橫條代表經由可溶型之TNFa作用所媒介之細胞凋亡。 圖8.圖8為一系列FACS統計圖，其顯示比較表現型標記 CD25、CD54、CD96、CD95及CD70在CLL B細胞之表面表現 性，該細胞係事先與可表現wt TNFa及本發明示範性之嵌合 TNFa構造之HeLa細胞共同培養。

圖9·圖9顯示經腺病毒載體感染之HeLa細胞所產生的可 溶性TNFa數量，其中該腺病毒載體可編碼wt TNFa、CD154 : TNFa嵌合體、於嵌合體連接部位含推定CD154 mmp識別序 列之CD 154 : TNFa或於嵌合體連接部位缺乏連結功能部位 之 CD154 : TNFa 〇 圖10.圖10顯示經質體轉移感染之HeLa細胞所產生的可 溶性TNFa數量，其中該質體所編碼之CD70 : TNFa嵌合體具 有各種變型之連結功能部位。 圖11·圖11顯示隨時間進行之感染腫瘤老鼠百分比，其中 供注射之預先培養腫瘤中含有對照組腺病毒（LacZ)、可編碼 wt TNFa之腺病毒、或可編碼CD154: TNFa之嵌合體腺病毒。 發明詳細說明 所有引用之參考文獻全文，包含其任何圖式，在此皆以 引用的方式併入本文中。 1.定義 在此所用之”嵌合TNFa” 一詞係指該配位體包含至少一個 •18·

1275644 (14) TNFoc之功能部位或次功能部位及至少一個除TNFoc外之另 一種TNF-配位體的功能部位或次功能部位。 在此所用之”次功能部位’’ 一詞係指一組含有至少二種胺 基酸之序列，其係TNF配位體之功能部位的一部分。”次功 能部位”亦包含一胺基酸序列，其中之一或多個胺基酸已經 刪除，其包括自該序列之一端截短一或多個胺基酸。 在此所用之”分裂部位”及mmp識別部位"等詞係指一可由 蛋白酶辨識之胺基酸序列，典型為基質金屬蛋白酶（mmp)， 如TNFa轉換酵素（TACE)，該蛋白酶可將TNFa自表現細胞之 表面分離。已發現TACE可釋出TNFoc，其係自胺基酸殘餘物 丙胺酸76至纈胺酸77之間分裂pro-TNF而得。此外，此分裂 係仰賴於橫跨纈胺酸77至脯胺酸88之約12個胺基酸之mmp 識別序列。TNFa分裂部位典型上見於或接近TNFa之功能部 位III及IV的分界線。 在此所用之"連結功能部位” 一詞係指一種至少含一胺基 酸的序列，其並非天然TNFa配位體之一部分，但可連結 TNFa嵌合構造之功能部位或次功能部位。雖然於實例中所 述之連結功能部位典型長度為二至四個胺基酸，該連結子 可為任何數目之胺基酸（一至更多個胺基酸），只要其不影響 TNFa嵌合構造結合至其關聯接受器即可。此種連結可由未 帶電荷胺基酸（如丙胺酸及甘胺酸）或帶電荷胺基酸（如天冬 胺酸）所組成。此外，由於移除連結功能部位不會影響TNFa 嵌合體之功能或代謝處理過程，故連結功能部位並非嵌合 TNFa構造所絕對需要。連結功能部位之用法描述於文獻中 -19- 1275644 (15) (雷杜納（Ladurner)等人，J Mol Biol，273: 330-337，1997及吳（Wu) 等人，々J Nucl Med，44: 268-283，2000)。 在此所用之”較不易分裂”一詞係指與天然TNFa相較之 下、對蛋白水解分裂有較高抵抗性之嵌合TNFa，其評估方 法可利用測量隨時間推移、由已知數量細胞所產生可溶TNF 之量。據此，本發明之嵌合TNFa"較不易分裂”，因其分裂 速率較佳至少比天然TNFa低90%。 在此所用之”表現性載體”一詞係指一種可表現重組核甞 酸序列之核酸且其可感染細胞並於其中複製其本體。典型 的表現性載體包含用於重組DNA技術中之質體及各種可於 細菌或動物細胞内複製之病毒。部分表現性載體已描述於 文獻中。坎特威（Cantwell)等人，Blood. (1996)，標題為 "Adenovirus Vector Infection of Chronic Lymphocytic Leukemia B Cells” ；華爾（Woll)，P. J.及 I. R.哈特（Hart)，Ann. Oncol· ,f6 Suppl 1·· 73 (1995);史密司（Smith)，K. T.、A· J.薛佛德（Shepherd)、J· E. 玻依德（Boyd)及 G. M.里司（Lees)，Gene Ther.· 3:190 (1996);庫 伯（Cooper)，M. J·，Semin. Oncol·· 23:172 (1996);蕭尼士 (Shaughnessy)，E·，D·陸（Lu)， S·闕特吉（Chatterjee)及 K.K.王 (Wong), Semin· Oncol·· 23 : 159 (1996);葛羅力歐叟（Glorioso)，J· C.，N· A.-迪路卡（DeLuca)及 D. J.芬克（Fink)，Annu. Rev· Microbiol., 49:675 (1995);符婁特（Flotte)，T. R·及 B. J·卡爾特 (Carter), Gene Ther. 2:357 (1995);朗德安那力森-朱托可夫 (Randrianarison-Jewtoukoff), V.及 Μ.培力可爹（Perricaudet)， Biologicals.，23 : 145 (1995) ； iL (Kohn), D. B., Curr. Opin. Pediatr.. •20· 1275644

(16) 7:56 (1995);維爾（Vile)，R· G.及 S. J.盧梭（Russell)，Br, MecL Bull.· 5 1: 12 (1995);盧梭，S.J.，Semin Cancer Biol·.· 5:437 (1994);及 阿里（Ali)，M·，N. R·黎夢尹（Lemoine)及 C. J·儉（Ring), Gene Ther·, 1:367 (1994)。 II.可編碼嵌合TNFa配位體之嵌合DNA序列 如上所述，TNF總科配位體（"TNF配位體”）具有由數個功能 部位所構成之類似次級構造（吉普司等人，WO 98/76061，公 告於1998年6月18曰）。於表I中顯示許多TNF總科配位體之功 能部位範圍。以人類TNFa之X-射線結晶構造為基礎，已推 論出CD40配位體預期之接受器-結合部分的次級構造（佩祖 (Peitsch)等人，Int Immunol，5:233-238, 1993)。使用電腦分析比 較人類TNFa，可推測其它TNF配位體之接受器-結合部分的 次級構造。

-21- 1275644 (17)

表I -TNF總科中之各配位體功能部位的結賴 功能部位I 功能部位II 功能部位III 功能部位IV (細胞質中） (穿透膜） (細胞外近侧） (細胞外遠侧） 人類CD154 1-42 42-135 135-330 330-786 鼠 CD154 1-42 42-135 135-327 327-783 牛 CD154 1-42 42-135 135-330 330-786 人類TNFa 1-87 87-168 168-228 228-699 鼠 TNFa 1-87 87-168 168-237 237-705 豬 TNFa 1-87 87-168 168-228 228-696 人類Fas配位體 1-237 237-315 315-390 390-843 鼠Fas配位體 1-237 237-309 309-384 384-837 人類CD70 1-45 45-117 117-132 132-579 人類CD30配位體 1-117 117-186 186-240 240-702 人類TRAIL 1-42 42-111 111-345 345-843 *辨識功能部位時係根據各功能部位之核甞酸範圍，其中使 用cDNA之起始甲硫胺酸的第一個核甞酸做為一號核荅 酸。如本發明中所顯示之核甞酸範圍可能遠遠異於這些已 經辨識出者，但仍為適用於本發明之功能部位。 如考慮TNF總科成員間構造之類似性及可編碼這些TNF 總科成員的核甞酸序列之類似性，則可編碼TNFcc功能部位 或次功能部位之核苷酸序列應可與另一種相當之TNF配位 體之核嘗酸序列相互交換以產生可編碼嵌合TNFa之雜交 多核芬酸序列。 • 22 - 1275644 (18) 不同TNF配位體基因在選擇交換相對的序列之核甞酸序 列時可基於機能上的原因，亦即新的序列所編碼之功能部 位或次功能部位可提供或修改出所欲之功能或去除標的配 位體基因所不欲之功能。如眾所皆知的，至少有部分的 TNFa會由親代分子分裂出並成為可溶型。如上所述，可溶 型通常不受歡迎。因此，如自不含TNFa分裂部位（即不致分 裂產生可溶型TNFa)的TNF配位體交換其序列，則至少可部 分改善此問題。 如本發明，TNFa之功能部位III包含可藉蛋白酶分裂之胺 基酸序列。例如，已發現TNFa分裂部位介於胺基酸ALA76 至VAL77間。此部位之分裂能產生可溶型TNFa分子。如上 所述，天然TNFa之功能部位MV可能擁有更多的分裂部位 (慕勒等人，J Biol Chem，274:381 12-381 18，1999)。 此外，如本發明，TNFa之功能部位IV包含一或多種胺基 酸，其為結合TNFa接受器時所必需，且必須加以保留以維 持TNFa接受器結合能力。 因此，本發明較佳之具體實施例係一種嵌合TNFa多核甞 酸序列，其首先包括一種可編碼除天然TNFa外之TNF配位 體的功能部位或次功能部位之核甞酸序列，其中所編碼之 功能部位或次功能部位可取代含有分裂部位之天然TNFa 的功能部位或次功能部位。因此，第一種序列可（但非限定 於）編碼任何下述之功能部位、次功能部位或其混合物：可 取代天然TNFa之分裂部位的功能部位III之次功能部位、完 整功能部位III、功能部位IH(其中含可取代天然TNFa分裂部 23·

1275644 位之功能部位II或其次功能部位）、功能部位ΠΙ(其中含可取 代天然Τ-NFa分裂部位之功能部位I或其次功能部位）、功能 部位111(其中含可取代天然TNFa分裂部位之功能部位IV的 次功能部位）、功能部位III、功能部位II及功能部位I或其次 功能部位。較佳地，第一種核甞酸序列可編碼至少一種下 列TNF配位體之一的功能部位或次功能部位：CD154、CD70、 FasL及TRAIL。如本發明，以這四種不同TNF配位體之功能 部位或次功能部位取代包含TNFa分裂部位之功能部位或 次功能部位可產生一種明顯較天然TNFa不易分裂之嵌合 TNFa。 第一種核甞酸序列經操作連接至第二種核甞酸序列，後 者可編碼與結合至TNFa接受器有關之天然TNFa細胞外功 能部位或次功能部位。該功能部位或次功能部位包括整個 天然TNFa之功能部位IV或其可結合TNF-R1、TNF-R2或其它 TNFa接受器之次功能部位。以此方式，本發明所提供之嵌 合多核芬酸序列可編碼一種能與可表現TNFa接受器之細 胞結合的嵌合TNFa。 一種可編碼天然TNFa次功能部位IV的較佳多核甞酸序列 可經操作連接至另一種選自以下各配位體所組成之群： CD154、CD70、FasL及 TRAIL之功能部位 I、II及 III。如於一 較佳具體實施例中，將可編碼人類TNFoc功能部位IV或功能 部位iv之次功能部位的核：y：酸經操作連接至可編碼人類 CD154功能部位I、II及次功能部位III，而該人類CD154亦缺 乏CD154分裂部位之核甞酸（CD154 : TNFa)。在此將該多核 -24-

1275644 (20) 甞酸序列稱為序列鑑別編號：1。亦或，可編碼人類CD154 次功能部位III之核甞酸中可包含CD154分裂部位（稱為 CD154 + mmp: TNFoc)。目前較佳具體實施例之另一實例為將 可編碼人類TNFa功能部位IV或功能部位IV之次功能部位的 核荅酸序列經操作連接至可編碼人類CD70之功能部位I、II 及III之核甞酸序列（序列鑑別編號：2)。序列鑑別編號：3 則提供目前較佳之多核甞酸序列之另一實例，其中可編碼 人類TNFa功能部位IV或功能部位IV之次功能部位的核苷酸 序列係經操作連接可編碼人類FasL之功能部位I、II及III的 核荅酸序列。最後，序列鑑別編號：4，是另一目前本發明 較佳具體實施例，其提供一可編碼人類TNFa之功能部位IV 或功能部位IV之次功能部位的核芬酸序列，其可經操作連 接可編碼人類TRAIL功能部位I、II及III之核苷酸序列。於所 有這些具體實施例中，核芬酸所編碼之人類TNFa的功能部 位IV之次功能部位較佳為缺乏TNFa分裂部位。此外，描述 於序列鑑別編號：1-4之TNF家族成員的功能部位I、Π及in 係藉由可編碼由二至四個胺基酸之肽的連結功能部位連結 至TNFa之功能部位iv。目前最佳之本發明多核甞酸序列為 序列鑑別編號：1。圖2顯示上述嵌合TNFa之具體實施例的 功能部位MV。此外，下表π顯示這些嵌合TNFa序列之核甞 酸範圍。 -25- 1275644

(21)

表II 構造 功能部位I-III TNF之功能部位IV CD154 ： TNFa 1-321 265-699 CD70 ： TNFa 1-132 265-699 FasL ： TNFa 1-390 265-699 TRAIL ： TNFa 1-345 265-699 CD154+mmp : TNFa 1-35 1 265-699 雖然上述多核甞酸所包含者皆為人類之TNF配位體序 列，本發明亦涵蓋來自其它物種之多核甞酸序列，如（但不 限於）鼠之多核甞酸序列。 因此，經編碼之嵌合TNFa包括一除TNFa之外之TNF配位 體的多肽功能部位或次功能部位，其可取代天然TNFa之分 裂部位。結果所產生的嵌合TNFa比天然TNFa較不易由細胞 表面分裂。較佳地，交換功能部位係取自CD154、CD70.、FasL 或TRAIL。較佳構造為：人類CD154之功能部位I、II及次功 能部位III與人類TNFa之功能部位IV或功能部位IV之次功能 部位（序列鑑別編號：5);人類CD70之功能部位I、II及III及 人類TNFa之功能部位IV或功能部位IV之次功能部位（序列 鑑別編號·· 6);人類FasL之功能部位I、II及III及人類TNFa 之功能部位_IV或功能部位[V之次功能部位（序列鑑別編號： 7);以及人類TRAIL之功能部位I、II及III及人類TNFa功能部 位IV或功能部位IV之次功能部位（序列鑑別編號：8)。本發 明嵌合TNFa之目前最佳具體實施例為序列鑑別編號：5。 III.基因構造 -26- 1275644 (22) 本發明亦涵蓋表現性載體或任何其它基因構造，該載體 或基因結構中包括可於標的細胞表現嵌合⑺以之本發明 多核荅酸序列。 適用於本發明之表現性載體包含一可編碼嵌合TNFai 多核甞酸序列，其經操作連接至適當之轉錄或轉譯調節核 答酸序列，如源自哺乳動物、微生物、病毒、或昆蟲之基 因者。該調節序列包含於基因表現時具有調節作用之序列 (如轉錄啟動子或增強基因）、控制轉錄之操縱序列、可編碼 L使RNA之核糖體結合部位的序列、以及可控制轉錄、轉 澤開始或轉錄結束之適當序列。 特別適用之調節序列包含源自各種哺乳動物病毒、微生 物及昆蟲基因之啟動子部位。啟動子部位可指揮完成轉錄 啟始並包含可編碼本發明嵌合TNFa之多核甞酸序列。有用 之啟動子部位包含見於勞氏（R〇us)肉瘤病毒（RSV)長終端重 覆區域（LTR)之啟動子、人類巨大細胞病毒（CMV)增強子/啟 動子部位、lac啟動子、由腺病毒分離之啟動子以及任何其 ^為猜於本技藝一般技巧者所知可適用於真核生物、原核 生物、病毒或微生物細胞之基因表現的啟動子。其它特別 適用於真核細胞表現基因及蛋白質之啟動子包含哺乳動物 細胞啟動序-列及增強子序列，如源自多瘤病毒、腺病毒、 私病毒40 (SV40)及人類細胞巨大病毒者。特別適用者為病 母早期及後期啟動子，其典型上常見於病毒中（如SV40)之病 母複製起點附近。具備本技藝一般技巧者應暸解選擇特定 匕用之啟動子係取決於確切的細胞株及其它各種運用於特 -27· 1275644 (23) 定細胞株； 因此某 經操作連 可經操作 聚腺荅酸 啟動子及 IV.宿主乡 本發明 體或其它 細胞可為 於某些 抗原呈現 於其它具 明之多核 胞。本發 統者，但 以改造， 胞。接著 造抗原呈 抗原呈現 製造淋巴 以測定。 除上述 TNFoc之多 丨^丨 内表現多核甞酸序列之基因構造等因素。 些本發明所涵蓋之基因構造包含多核甞酸序列可 接至一啟動子序列或啟動子及增強子序列’且亦 連接至可指揮信使RNA結束及聚腺甞酸化作用之 化作用序列。較佳地，多核甞酸序列係使用CMV 牛生長激素聚腺荅酸化作用序列來建構。 田胞 亦涵蓋經包含本發明之多核菸酸序列的表現性載 基因構造轉化或轉移感染之各種宿主細胞。這些 原核或真核細胞。 較佳具體實施例中，該細胞可為哺乳動物之正常 細胞，如單核細胞、巨噬細胞、B細胞及類似物。 體實施例中，該細胞可為正常細胞，當導入本發 荅酸序列後，這些細胞可刺激旁觀之抗原呈現細 明亦涵蓋體細胞，其非天生可呈現抗原給免疫系 其通常能以可編碼抗原呈現需要分子之基因來加 並因此使這些細胞可作用為人造之抗原呈現細 可將能編碼嵌合TNFa之多核甞酸序列導入這些人 現細胞中。文獻中有測定特定細胞是否可作用為 細胞之各種试驗已為吾人所熟知，如細胞増殖或 細胞活素，因此本發明此項觀點可以很容易地加 正吊人類細胞外，本發明亦涵蓋將可編碼嵌合 核甞酸序列導入至各種赘瘤性或惡性細胞中，如 -28- 1275644 (24) 免疫系統細胞及實質腫瘤細胞。所涵蓋之贅瘤性細胞包 白血病細胞，如急性單核血球性白血病（AML)、急性骨髓 核細胞性白血病（AMML)、慢性淋巴球性白血病（CLL)、慢 骨髓性或慢性骨髓單核細胞性白血病（CMML)。亦涵蓋源 淋巴瘤、神經膠質瘤、乳癌、子宮頸癌、卵巢癌、肺癌 膀胱癌或前列腺癌之細胞。 最後，於本發明一較佳具體實施例中，將可編碼嵌 TNFa之多核甞酸序列導入至可於細胞表面表現TNFoc關 接受器（如TNF-R1及TNF-R2)之細胞。 V.包含附加分子配位體基因之基因載體及構造的使用方法 因確認了 TNFa及其關聯接受器於調節免疫反應之交 作用，本發明亦涵蓋增力口可結合TNF-R1、TNF-R2或某些 它TNFa關聯接受器的膜穩定型配位體濃度之方法，其係 由將可編碼嵌合TNFa之多核芬酸序列導入至細胞内，而 嵌合TNFa較不易（相對於天然TNFa)由細胞表面分裂。由 該嵌合TNFa較不易為蛋白水解分裂，其可增加結合關聯 受器並引發細胞溶解反應或免疫反應之能力。此外，可 加以可編碼本發明嵌合TN Fa配位體之多核答酸序列轉 感染細胞以引發細胞凋亡以及清除含有TNFa接受器細 的能力。- 本發明係用於任何參加免疫反應之人類細胞，該類細 可為免疫系統之標的或為免疫系統對外來標的反應的一 分。該方法包含活體外方法、活體内方法及各種其它牽 到將多核甞酸或載體注射至宿主細胞之方法。本方法亦 含 單 性 白 、 合 聯 互 其 藉 此 於 接 增 移 胞 胞 部 涉 包 -29- (25) 1275644 含直接注射至腫瘤或腫瘤病灶中。 本發明因此涵蓋活辦k --良2匕法’其方法包栝由動物或人類等 •ί象刀離細胞 '再將本發明之可編碼嵌合的多核甞酸 導至所刀離之細胞中。接著再將該細胞導入至特定 部位或直接導人對象之循環中。#本發明—較佳具體實施 例中Τ特別採用細胞表面標記(包含如腫瘤標記或抗原等 可識別細胞之分子）自目標對象牛特定分離出這些細胞。

本發明亦涵蓋將可編碼嵌合TNFa之多核甞酸序列導入 需要之動物或人類目標對象體内細胞中而不需先由目標對 象内將細胞移出。將多核荅酸序列導入至特定活體内細胞 或目標對象體内之方法已為吾人所熟知，其包含使用表現

性載體’及直接注射各種基因構造至病患體内。於一典型 應用方法中，將包含本發明多核苍酸序列之表現性載體導 入至病患之循環或局部部位中以使載體特定感染目標細 胞。於其它較佳具體實施例中係將載體直接注入至出現於 目標對象之腫瘤病灶中，其中包含將本發明多核荅酸序列 導入至少部份細胞内。 本發明亦涵蓋將包含可編碼嵌合TNFa之多核甞酸序列 的基因構造直接注射至動物或人類目標對象，並可另外包 含啟動子及-聚腺甞酸化作用序列。該實用方法之實例見述 於（維爾（Vile)等人，Ann Oil col, 5:59-65，1994)。該基因構造亦 可直接注射至動物或人類病患之肌肉或其它部位或直接注 射至病患腫瘤或腫瘤病灶中。 VI. 治療警瘤增生之方法 -30·

1275644 (26) 本發明亦有關於將本發明之可編碼嵌合TNFa的多核菩 酸序列基因加以轉移以引發腫瘤細胞之細胞调亡。除藉由 TNFa及其接受器TNF-R1及TNF-R2間之交互作用直接造成這 些腫瘤細胞凋亡之外，本發明亦涵蓋以嵌合TNFa感染腫瘤 細胞，以使配位體以膜穩定方式表現，故本發明亦與免疫 反應相關。 因此本發明涵蓋治療贅瘤增生之方法，其包括將本發明 之多核甞酸序列插入至贅瘤性細胞中，使編碼出的嵌合 TNFa表現於贅瘤性細胞表面上。本發明涵蓋活體内及活體 I治療人類赘瘤增生的方法。 於一較佳治療贅瘤增生之方法中，其可進一步包括下列 步驟：首先由目標對象採取贅瘤性細胞，將本發明之多核 菩酸序列插入其中以便嵌合TNFa表現於贅瘤性細胞表 面’再將該細胞投予目標對象。熟悉本技藝一般技巧者應 瞭解可應用許多方法將經轉化之贅瘤性細胞投入病患體 内。 a.實例 L 嵌合附加分子配位體基因之基因構造及某Ξ 療法載體_ 以如下步·驟建構並選殖序列鑑別編號1至序列鑑別編號4 之嵌合附加分子配位體基因·· κ 二種不同附加分子配位體基因之功能部值爽 基備欣合歷j口分子配位體基因 由未刪節之eDN A模板、藉PCR法使用對配位體之5,及3·部

1275644 (27) 位側列功能部位Mil專一的寡核甞酸引子來放大可編碼配 位體（CD454、CD70、FasL及TRAIL)之功能部位I-III的DNA片 段。此外，再將可編碼TNFoc次功能部位IV之DNA片段以PCR 法加以放大。將BamHI限制性核酸内切酶部位編入功能部位 III-IV連結PCR引子組中，使功能部位ι-ιπ片段與功能部位IV 片段得以連結。此外，將限制性核酸内切酶部位附加到分 別侧列於功能部位I及IV之5’及3’引子上，使其能連接至 pcDNA3載體中。以PCR法放大功能部位Ι-ΠΙ片段及功能部位 IV片段後，將DNA片段以BamHI及相關於功能部位I及IV之5* 或3’側列部位的限制酶加以消化。消化完成後，將功能部位 I-III片段及功能部位IV片段於BamHI部位加以連接並同時連 結進入真核生物表現質體pcDNA3 (Invitrogen，San Diego，CA) 之多重選殖部位。嵌合TNFa(以下實例中TNFa將簡稱為 TNF)DNA插入物之側列者為強力-異種CMV啟動子及牛生長 激素聚腺甞酸化作用序列。 ii.膝病毒合成 以限制酶Nrul及Sma 1消化嵌合TNF-pcDNA3質醴以便釋出 來自pCDNA3之含CMV啟動子之DNA片段、嵌合TNF基因及源 自pCDNA3之聚腺甞酸化作用訊號。在1%瓊脂上進行凝膠純 化將已消化-之各DNA片段分離後，將DNA片段連接進入腺病 毒往返載體MCS (SK) pXCX2之EcoRV部位中《該質體為質體 pXCX2之變型，其中已將pBliiescript多連結序列選殖入E1部 位中（J.R·托熱（Tozer), UCSD, unpublished data，九月，1993年）。 嵌合之THF-MCS (SK) pXCX2質體經純化後，將5pg之該往返 -32- 1275644 (28)

質體與5gg之JM17質體共同轉移感染至293AC2細胞中，此步 驟係使用Promega公司之磷酸ί弓增殖感染組（Profection Kit)、 依據廠商指示方法進行。轉移感染後，將細胞培養5天，以 便進行同源性重組及病毒合成。接著採集全部細胞及上清 液並加以冰凍融化三次以釋出細胞-相關之腺病毒。 於最初之病毒產生後，可藉噬菌斑純化法獲得選殖之病 毒分離株。簡言之，將冰；東-融化之病毒上清液於桌面型離 心機中以1000 rpm離心5分鐘以清除碎屑。接著以連績稀釋 之病毒上清液感染群集生長於6孔組織培養皿中之293AC2 細胞卜2小時。於感染後，吸出培養基並以含4%胎牛血清及 0.65%瓊脂之DMEM培養基覆蓋於細胞上，溫度保持於56 °C。於培育4-6日後，將分離嗟菌斑挑選入lml之培養基中並 隨後運用於病毒放大作用。 大規模腺病毒製備係藉由連續感染增量之293AC2。純化 後之腺病毒接著通過氯化铯梯度進行純化。此方法係利用 氯化铯梯度來濃縮病毒顆粒，梯度密度範圍為1.45 g/cm3至 I. 20 g/cm3，其中先將經293AC2散佈之病毒樣本於4°C中、利 用 SW40離心機（Beckman，Brea，CA)以 25,000 rpm離心 2小時。使 用27號注射針及針筒分離出病毒帶，並使用Sephadex G-25 DNA分級圓柱試管（Pharmacia，Piscataway，NJ)去除鹽份。以含 10%甘油之磷酸鹽緩衝食鹽水將該病毒脫鹽並貯存於-70 °C。病毒之最終滴度可藉由陰離子交換HPLC來測定。 II. 於CLL細胞及HeLa導入及表現細胞嵌合附加分子配位體 基因 •33 · 1275644

(29) i表現 藉流式細胞技術檢測TNFa表面表現。簡言之，藉吸出培 養基並添加脫離溶液（含lOmM EDTA之PBS，pH 8)將附著的細 胞由孔槽中脫離出。細胞由試盤脫離後，將各樣本之一半 量藉由流式細胞技術分析其配位體表現程度。簡言之，將 細胞於FACS染色緩衝溶液（由3% FCS及0.05%疊氮化鈉所組 成之PBS)中沖洗一次，再懸浮於FACS緩衝溶液至約每毫升 107個細胞，將5xl05 (50ul)細胞塗鍍於96-孔之u型底塑膠微孔 試盤（microwell plates)中。進行人類TNFa特異性染色時，於4 °C加入TNFa特異性之PE-結合抗體（Pharmingen) 30分鐘。接著 以FACS緩衝溶液沖洗細胞二次，再懸浮於FACS緩衝溶液並 移至FACS管中以便測量數據資料。為控制非特異性抗體結 合，所有樣本皆以適當同型控制抗體染色。此外，藉由添 加10ng/mU典化丙錠（propidium iodide)至所有染色反應將死細 胞及碎屠排除於分析之外。藉流式細胞技術、使用 FACSCaliber流式細胞儀（Becton Dickinson)分析細胞之TNFa表 現。 (圖3)顯示各種不同嵌合TNF構造與野生型TNF及先前所 述之膜穩定型TNF(稱為mTNF)於HT1080細胞感染腺病毒後 之表現比較-。簡言之，以漸增力價之腺病毒感染HT1080細 胞，病毒力價如圖示。於感染二日後，藉流式細胞技術分 析細胞TNF表面表現程度。此數據顯示出使用具TNF特異性 之螢光染料結合抗體所檢測出可編碼嵌合TNF構造之腺病 毒載體表現於細胞表面之狀況。除此之外，此數據顯示不 -34- 1275644

同TNF構造間之表面表現程度的差異。特定言之， Ad-CD154 : TNF感染可產生最高程度之TNF表面表現。由其 它細胞株（包含 293、HeLa、COLO205、A549、HCT15、PC3、 RPM18226及BT20)所獲得之相似圖形表現表示TNF構造間表 現的差異並不受細胞種類所限制。 (圖4)顯示於腺病毒感染慢性淋巴球性白血病（CLL) B細胞 後各種不同嵌合TNF構造之表現。依各統計圖上方所示配位 體，以腺病毒感染CLL細胞，感染倍率（M.O.I·)為1000。於感 染二日後，藉流式細胞技術檢測CD 19+ B細胞之TNF表面表 現性。此外，該圖顯示出與前述細胞株所觀察到相同形態 之TNF構造間的表現差異性。亦即，TNF嵌合體表現較野生 型TNF為佳。同樣地，TNF表面表現性最佳者為hCD154 : TNF 嵌合體。 ϋ.產生可溶分t 2·可溶性TNF產生：ELISA定量 (圖5)顯示以嵌合TNFa腺病毒載體感染之HT1080細胞所 產生之可溶TNF的數量。以1〇感染倍率感染細胞。於感染二 曰後，採集上清液並藉離心清除死細胞及碎屑。藉蘇標記 免疫吸附測定法（ELISA)，使用來自Pharmingen，Inc.(La Jolla， CA)之TNF-_特異性ELISA，依照原廠指示進行分析測量可溶 性TNF。根據已知量之重組TNF (Biosource International)的力 價測定結果來計算特定TNF之量。此數據顯示嵌合TNF構造 所產生的可溶性TNF明顯少於野生型TNF (wt TNF)或先前所 述缺乏推定mmp蛋白水解部位之膜穩定性mTNF。此外，儘 -35 - 1275644

(31) 管CD154:TNF有最高之表面表現水平，與所有其它構造相較 之下，CD 154 : TNF除了表面表現程度最佳以外，其所產生 之可溶TNF也最少。此形態之可溶性TNF釋出情況亦見於其 它細胞株，包含 HeLa、293、A549、COLO205、HCT-15及 BT-20。 iii.嵌合附加分子配位體之功能性分析 1. TNF嵌合體殺死WEHI164纖維肉瘤細胞之狀況：共同培養 分析 (圖6)顯示TNF嵌合體之功能性；其使用先前所述之生物 細胞凋亡分析（艾司皮維克（Espevik)等人，J Immunol Methods， 95:99-105，1986)。於以10感染倍率之腺病毒感染HeLa細胞二 曰後，將WEHI164細胞（一種TNF敏感性細胞株）覆蓋於受感 染之HeLa細胞上並再培育18小時。WEHI164細胞以PKH26 (Sigma，Inc.)預先標記，PKH26係一種可使自HeLa細胞劃分出 WEHI164細胞之紅色螢光化學物。WEHI細胞以碘化丙錠染 色並藉流式細胞技術分析細胞死亡情形。該數據顯示WEHI 細胞於與可表現TNF之HeLa細胞共同培養後被殺死。 2. 由TNF嵌合體所引起之WEH1164的接觸依賴性細胞凋亡 (圖7)顯示由TNF嵌合物引起之WEH1164的接觸依賴性細 胞死亡。其顯示TNF嵌合物之膜穩定表現程度。簡言之， HeLa細胞以10感染倍率之腺病毒感染一天。接著將WEHI164 細胞直接與經感染之HeLa細胞混合或以一具有0.2微米穿透 孔之插入物隔開He La細胞。該插入物可預防細胞·細胞之直 接接觸，但可容許細胞間可溶性分子（如可溶性TNF)之擴 散。混合18小時後，如描述於圖6方法分析WEHI164細胞之 •36- 1275644 _ (32) 發明說、f绩買 細胞凋亡。相較之下，wt TNF所釋出之可溶性TNF可殺死以 穿孔插入物隔開之WEHI164細胞，但TNF嵌合體並未釋出類 似能引發細胞凋亡之可溶性TNF。 3. CLL B細胞之TNF嵌合體活化 (圖8)顯示與可表現嵌合TNF之HeLa細胞共同培養之CLL B 細胞的活化狀況。HeLa細胞以10感染倍率之腺病毒感染。 於感染後二日，將CLL細胞覆蓋於HeLa細胞上並共同培養1 日。接著分析CD19+ CLL細胞之表型標記（CD25、CD54、 CD86、CD95及CD70)表現性的變化。粗線統計圖代表與 Ad-TNF載體共同培養之CLL細胞，如各列左側標示。細線統 計圖則代表與Ad-LacZ病毒共同培養。陰影統計圖代表以非 相關專一性之同型對照單株抗體進行染色。此資料顯示嵌 合TNF構造具有功能性，因其可調節一組表型標記在CLL細 胞上的表現，而後者可代表淋巴球活化。 4. 經修改mmp部位TNF嵌合體可溶性TNF之產生

(圖9)顯示由以嵌合CD154:TNFa腺病毒載體感染之HeLa細 胞所產生之可溶性TNF數量，該嵌合CD154:TNFa腺病毒載體 含推定CD 154 mmp識別部位，此部位係描述於圖3-8中之 CD154 : TNF嵌合體所缺乏者。該構造稱為CD154 + mmp : TNF (序列鑑別編號9)。細胞以10感染倍率之腺病毒感染。於感 染2日後，採集上清液並藉離心清除死亡細胞及碎屑。可溶 性TNF之測量可藉由酶標記免疫吸附測定法（ELISA)，依廠商 之使用說明，以來自Pharmingen，Inc.(La Jolla，CA)之TNF-特異 性ELISA組進行分析。根據對於已知數量之重組TNF -37- 1275644

(Biosource International)所檢定力價之結果來計算特異數量 之TNF該數據顯示上述對原始CD154 : TNF嵌合體的修改 並不會影響其被蛋白水解分裂成為可溶分子之敏感性。 5. 經修改連結功能部位產生可溶性TNF之影響

(圖10)顯示由以可編碼CD70 : TNF嵌合體之質體轉移感染 的HeLa細胞所產生之可溶性TNF數量，其中TNF嵌合體之連 結功能部位經過各種的修改。除了描述於圖3-4之CD70: TNF 構造外，亦顯示具有經過截斷的連結功能部位（連結子 CD70 : TNF，序列鑑別編號10)及含修改之胺基酸序列的連 結子功能部位（連結子DP_〉GA CD70 : TNF，序列鑑別編號11) 之構造。根據原廢指示、使用Lipofectamine20i)0 (Gibco-BRL)、 以質體轉移感染HeLa細胞。於轉移感染二0後，收集上清 液並藉如上述之ELISA法測量可溶性TNF。該數據顯示改變 TNF嵌合體之連結功能部位並不會影響這些構造之穩定性。 6. 以嵌合TNF治療預先建立之鼠科WEHI164腫瘤

(圖11)顯示在預先建立之WEHI164腫瘤感染腫瘤之鼠身 上，經過以可編碼β-半乳糖备酶（LacZ)、wt TNF、或嵌合 CD154 : TNF之腺病毒進行腫瘤内注射後，仍存有腫瘤之比 例。簡言之，以皮下注射3xl06 WEHI164細胞接種Balb/c鼠並 讓腫瘤結節形成10天。於腫瘤接種後第10、12及14日，將5xl06 遂菌斑形成單位（pfu)之病毒藉腫瘤内注射投藥。接著每週 監測動物之腫瘤出現狀況。當腫瘤直徑達2 cm以上時將動 物安樂死。該數據顯示75%以嵌合CD154 ·· TNF治療之鼠的 腫瘤完全退化，相較之下以wt TNF處理之鼠僅有50%腫瘤退 •38- 1275644 (34) 化。以控制組腺病毒（Ad-LacZ)處理之鼠腫瘤並無退化。該 數據顯示嵌合TNF具有對抗腫瘤之治療活性且其活性大於 wt TNF 〇 雖經過前所顯示及描述之較佳具體實施例，但對熟悉本 技藝一般技巧者而言明顯仍可變化出許多其它實施例而不 偏離本發明之精神或範園。本發明除了下列申請專利範圍 以外並不受任何限制。

-39· 1275644 序列表

<110> Prussak，Charles E 普魯察克，查爾斯E Kipps，irhomas J吉普司，湯馬斯J Cantwell，Mark J 坎特威，馬克 J <120〉新穎嵌合TNF配位體 <130> UCSD 263/092 <140> 091135421 <141> 2002-12-06 <160> 8 <170〉Patentln3.1 版 <210〉 1 <211〉 771 <212〉DNA <213〉人工序列 <220> <223>包含與hCD154功能部位I、II及III連接之hTNFa功能部位IV 之嵌合DNA結構 <400> 1 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttafcgfcattt: acttactgtt tttcttatca cccagatgat cgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 130 gaagstttctg tattcatgaa aacgsttaicag agatgcaaca cagg在gaaag afcccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300

aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctgtagccc atgttgtagc aaaccctcaa 3SO gctgaggggc agctccagtg gctgaaccgc cgggccaatg ccctcctggc caatggcgtg 420 gagctgagag ataaccagct ggtggtgcca tcagagggcc tgtacctcat ctactcccag 480 gtcctcttca agggccaagg ctgcccctcc acccatgtgc tcctcaccca caccatcagc 540 cgcatcgccg tctcccacca gaccaaggtic aacctcctct ctgccatcaa gagcccctgc 600

cagagggaga ccccagaggg ggctgaggcc aagccctggt atgagcccat ctatctggga GGQ ggggtcttcc agctggagaa gggtgaccga ctcagcgctg agaccaatcg gcccgactat 720 ctcgactttg cggagcctgg gcaggtctac tttggaatca ttgctccgcg a 771 <210> 2 <211〉 580 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 1275644

<223>包含與hCD70功能部位I、II及III連接之hTNFa功能部位IV之嵌合DNA結構 c400> 2 atgccggagg agggttcggg ctgctcggtg cggcgcaggc cctatgggtg cgtcctgcgg €0 gctgctccgg tcccattggt cgcgggcttg gtgatctgcc tcgtggtgtg catccagcgc 120 ttcgcacagg ctgcggatcc tgtagcccat gttgtagcaa accctcaagc tgaggggrcag 180 ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc cccctggcca atggcgtgga gctgagagat 240 aaccagctgg fcggtgccatc agagggcctg tacctcatct actcccaggt cctcttcaag 300

ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc cccacccaca ccatcagccg catcgccgtc 3 SO ccctaccaga ccaaggtcaa cctcctcccc gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc 420 ccagaggggg ctgaggccaa.gccctggtat gagcccatct atccgggagg ggtcttccag 480 ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag atcaatcggc ccgactatct cgactttgcg 540 gagtctgggc aggtctactt tggaatcatc gctctgtgaa 580 <210> 3 <211> 837 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223：>包含與hFasL功能部位I、Π及III連接之hTNFa功能部位IV之嵌合DNA結構 <40Q> 3 atgcagcagc ccttcaatta cccatatccc cagatctact gggtggacag cagtgccagc 60 tctccctggg cccctccagg cacagttctt ccctgtccaa cctccgtgcc cagaaggcct 120 ggtcaaagga ggccaccacc accaccgcca ccgccaccac taccacctcG gccgccgccg 180 ccaccactgc ccccactacc gctgrccaccc ctgaagaaga gagggaacca cagcacaggc 240 ctgtgtctcc ttgtgatgtt tttcatggtt ctggttgcct tggtaggatt gggcctgggg 300 atrgtttcagc tcttccacct acagaaggag ctggcagaac tccgagagtc taccagccag 360 atgcacacag catcatcttt: ggagaagcaa gcggatcctg tagcccatgc tgtagcaaac 420 cctcaagctg aggggcagct ccagtggctg aaccgccggg ccaacgccct cctggccaat 480 ggcgtggagc tgagagataa ccagctggtg gtgccatcag agggcctgta cctcatctac 540 tcccaggtcc tcttcaaggg ccaaggctgc ccctccaccc atgtgctcct cacccacacc 600 atcagccgca tcgccgcccc ctaccagacc aaggtcaacc tcctctctgc catcaagagc 660 ccccgccaga gggagacccc agagggggct gaggccaagc cctggcacga gcccatctat 720 ctgggagggg tcttccagct ggagaagggt gaccgactca gcgctgagat caatcggccc 780 gaccatctcg actttgcgga gtctgggcag gtctactttg gaatcatcgc tctgtga 837 <210> 4 <211> 813 ' <212> DNA c213>人工序列 <220> <223>包含與hTRAIL功能部位I、II及III連接之hTNFa功能部位IV之嵌合DNA結構 1275644

<400> 4

atggctatga tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg SO atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac 120 gagctgaagc agatgcagga caagtacccc aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa 180 gatgacagtt attgggaccc caacgacgaa gagagtatga acagcccctsr ctggcaagtc 240 aagtggcaac tccgtcagct cgtcagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt 300 tccacagttc aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtcctcag 350 agagtagcgg atcctgtagc ccatgttgta gcaaaccccc aagctgaggg gcagctccag 420 tggctgaacc gccgggccaa tgccctcctg gccaatggcg tggagctgag agataaccag 430 ctggtggtgc catcagaggg cctgtacctc atctactccc aggtcctctt caagggccaa 540 ggctgcccct ccacccatgc gctcctcacc cacaccatca gccgcatcgc cgtctcccac S00 cagaccaagg tcaacctcct ctctgccatc aagagcccct gccagaggga gaccccagag 6S0 ggggctgagg ccaagccctg gtatgagccc atctatctgg gaggggtctt ccagctggag 720 aagggtgacc gactcagcgc tgagatcaat cggcccgact atctcgactt tgcggagtct 780 gggcaggtct actttggaat cattgctctg cga 813 <210> 5

<211> 25S <212> PRT <213 >人工序列 <220> <223>由序列鑑別編號：1之DNA序列所編碼之嵌合TNFa多核甞酸 <400> 5

Met He Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly i 5 10· 15

Leu Pro lie Ser Met Lys lie Phe Met Tyr Levi Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 lie Thr Gin Met lie Gly* Ser Ala lieu Phe Ala Vail Tyr Leu His Arg 3S 40 45

Arg Leu Asp Lys lie Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60

Phe Met Lys Thr lie Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu lie Lys Ser Gin Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95

Asp lie Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Val- 1275644 100 105 110

Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu 115 120 12S

Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asa Gly Val Glu Leu Arg Asp 130 135 140

Asn Gin Leu Vai Val Pro S苟r Glu Gly Leu Tyr Leu lie Tyr Ser Gin 145 ISO 1SS 160

Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr 165 170 175

His Thar 工le Ser Arg lie Ala Vdl Ser Tyr Gin Thx Lys Val Asn Leu 180 135 190

Leu Ser Ala lie Lys Ser Pro Cys Glxi Arg Glu Thr £>r*o Glu <51y Ala 195 200 20S

Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin 210 215 220

Leu Glu Lys Gly Asp Arg* Sex: Ala Glu lie Asn Arg Pro Asp Tyr 225 230 23S 240

Leu Asp Pha Ala Glu Sar Gly Gin Val Tyr Phe Gly lie lie Ala I^eu 245 2SO 255 <210> 6 <211> 192 <212> PRT <213 >人工序列 <220> <223>由序列鑑別編號：2之DNA序列所編碼之嵌合TNFa多核苷酸 <400> 6

Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly 1 5 10 15

Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val lie 20 25 30

Cys Leu Val Val Cys lie Gin Arg Phe Ala Gin Ala Ala Asp Pro Val 3S 40 45

-4- 1275644

Ala Hi3 Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu 50 55 SO

Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp

6S 70 7S SO

Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu He Tyr Ser Gin 85 90 95

Val Leu Phe Lys Gl，/ Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr 100 105 HO

His Thr lie Ser Arg lie Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu 115 120 12S

Leu Ser Ala lie Lys Ser* Pro Cys Gla Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala 130 13S 140

Glu Ala Lys Pro Trp Jyr Glu Pro lie Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin 145 150 155 1^0

Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu lie Asn Arg Pro Asp Tyr 165 170 ♦ 175

Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly He He Ala Leu ISO 13S 190 <210> 7 <2U> 278

<212> PRT <2U>人工序列 <220> <223>由序列鑑別編號：3之DNA序列所編碼之嵌合TNFa多核答酸 <400> 7

Met Gin Gin Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gin lie Tyr Trp Val Asp IS 10 IS

Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys 20 25 30

Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gin Arg Arg 35 40

Pro Pro Pro Pro 45 1275644

Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro SO 55 SO

Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly 65 70 7S 80

Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Lsu Val Ala Leu Val Gly

85 90 9S

Leu Gly Leu Gly Met Phe Gin Leu Phe His Leu Gin Lys Glu l»eu Ala 100 105 110

Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gin Mec His Thr Ala Ser Ser Leu Glu 115 120 12S

Lys Gin Ala Asp Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu 130 135 140

Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn 145 150 1SS 160

Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu

1SS 170 17S

Tyr Leu lie Tyr Ser Gin Val. Leu Phe Lys Gly Gin Gly. Cys Pro Ser 180 185 190

Thr His Val Leu Leu Thr His Thr lie Ser Arg He Ala Val Ser Tyr IBS 200 205

Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala lie Lyg Ser Pro Cys Gin Arg 210 215 220

Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro lie Tyr 225 230 235 240

Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu 245 .250 2S3 lie Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr '260 265 270

Phe Gly lie lie Ala Leu 275 <210> 8 <211> 270 -6- 1275644 <212> PRT <213 >人工序列 <220> <223> 由序列鑑別編號：4之DNA序列所編碼之嵌合TNFa多核答酸 <400> 8

Met Ala Met Met Glu Val Gin Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gin Thr Cys 1 5 10 15

Val L«u He Val lie Phe Thr Val Leu Leu Gin Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asti Glu Leu Lys Qlxi Met Gin Asp Lys 35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly He Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr SO 5S 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gin Val 65 70 75 80

Lys Trp Gin Leu Arg Gin Leu Val Arg Lys Met He Leu Arg Thr Ser

* * 85 90 9S

Glu Glu Thr He Ser Thr Val Gin Glu Lys Glxi Gin Asn lie Ser Pro 100 103 110#

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gin Arg Val Ala Asp Pro Val Ala His 115 120 125

Val Val Ala Agn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg 130 X3S 140

Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin 145 150 155 160

Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu lie Tyr Ser Gin Val Leu ' 165 170 175

Pile Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr 180 1S5 190 lie Ser Arg lie Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser 195 200 203 1275644

Ala He Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala GIu Ala 210 215 220

Lys Pro Trp Tyx: Glu Pro lie Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu 22S 230 235 240

Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu lie Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp

245 250 2SS

Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ue He Ala Leu 260 265 270

Claims (1)

1275^^35^號專利申請案 公告本I 中文申請專利範隻換Κ25^:9·牙;)--------一^] ί條正本 拾、申請專利範圍 種可編碼嵌合TNFot配位體多肽之核酸分子，其包括編 碼選自由 CD154、CD70、Fas配位體、NGF、TNFp、CD30、 4-1BBL及TRAIL所組成之群之腫瘤壞死因子配位體之功 也邵位III片段之第一核贫酸序列，其中功能部位hi片段 缺少金屬蛋白酶分裂部分；以及第二核苷酸序列，其可 編碼能與TNFa接受器結合之TNFa蛋白質的功能部位IV 片段，其中該核酸分子當於細胞膜表現時，係實質穩定 的0 2·如申請專利範圍第1項之核酸分子，其進一步包括可編碼 其它腫瘤壞死因子配位體之功能部位Η片段之第三多核 菩酸。 3·如申請專利範圍第1或2項之核酸分子，其進一步包括可 編碼其它腫瘤壞死因子配位體之功能部位I片段之第四 多核苷酸。 4.如申請專利範圍第丨或2項之核酸分子，其中第一多核：y： 酸進一步可編碼其它腫瘤壞死因子配位體之功能部位 IV片段。 5.如申請專利範圍第丨項之核酸分子，其中第二多核甞酸可 編碼天然TNFa功能部位IV片段，但不含TNFoc蛋白質之分 裂邵位。 6·如申請專利範圍第1項之核酸分子，其中第一多核替酸可 進一步編碼腫瘤壞死因子配位體之功能部位I、π或III片 段，且該腫瘤壞死因子配位體係選自由下所組成之群： 1275644 CD154、CD70、Fas配位體、NGF、TNFp、4-1BBL及 TRAIL， 且第二多核菩酸可編碼TNFoc蛋白質之功能部位IV。 7.如申請專利範圍第6項之核酸分子，其中第一多核嘗酸可 進一步編碼CD154蛋白質之功能部位I、π或m片段。 ' 8·如申請專利範圍第1項之核酸分子，其另包括連結子功能-邵位’其可編碼至少含一個胺基酸之肽，且可將第一多 核嘗酸連接至第二多核嘗酸。 9·如申請專利範圍第1項之核酸分子，其包括選自以下組成儀 之群之核善故序列：序列鑑別編號：1、序列鑑別編號： 2、序列鑑別編號：3及序列鑑別編號：4。 10·如申請專利範圍第1項之核酸分子，其中之嵌合TNFa包 括選自以下所組成之群的胺基酸序列：序列鑑別編號： 5、序列鑑另”編號：6、序歹鑑另,j編號：7及序歹鑑另,】編號： 8 ° 11· 一種嵌合TNFa，其包括選自由CD 154、CD70、Fas配位體、 NGF、TNFp、CD3 0、4-1BBL及TRAIL所組成之群之腫瘤_ 壞死因子配位體的功能部位ΙΠ片段，其中功能部位ΙΠ 片段缺少金屬蛋白酶分裂部分；以及可結合TNFa接受器 之TNFa的功能部位iv片段，其中該TNFa蛋白質當於細胞 膜表現時，係實質穩定的。 12·如申請專利範圍第11項之嵌合TNFa，其較天然TNFa不易 由細胞表面分離。 13·如申請專利範圍第12項之嵌合TNFa，其中嵌合TNFa之分 離比例較天然TNFa配位體少約90%。

1275644 14. 如申請專利範圍第11項之嵌合TNF〇C ’其進一步包括其它 腫瘤壞死因子配位體之功能部位11片段。 15. 如申請專利範圍第11或14項之歲合TNFa ’其進一步包括 其它腫瘤壞死因子配位體之功能部位1片段。 16. 如申請專利範圍第11或14項之嵌合TNFa，其進一步包括 其它腫瘤壞死因子配位體之第四功能部位IV片段。 17. 如申請專利範圍第11項之嵌合TNFa，其中該功能部位IV 片段缺乏TNFa蛋白質之分裂部位。 18. 如申請專利範圍第11項之嵌合TNFa，其包括腫瘤壞死因 子配位體之功能部位I、II及III ;其中該腫瘤壞死因子配 位體係選自由以下所組成之群：CD 154、CD70、fas配位 體、NGF、CD30、TNFp、4-1BBL及 TRAIL。 19. 如申請專利範圍第11項之嵌合TNFa，其中一或多個功能 部位I、II及III係為CD154蛋白質者。 20·如申請專利範圍第11項之嵌合TNFa，其進一步包括可編 碼至少一個胺基酸的肽之連結子功能部位，該連結子功 能部位可將功能部位III片段連接至功能部位IV片段。 21. —種表現載體，其中包括如申請專利範圍第j至3、6及8 項中任一項之核酸分子。 22. 如申請專利範圍第21項之表現載體，其進一步包括病毒 DNA或細菌DNA。 23·如申請專利範圍第22項之表現載體，其中該病毒DNA. 選自由腺病毒DNA或反轉錄病毒dna所組成之群。 24.如申叫專利範圍第22項之表現載體，其中爻少部分載體 包括腺病毒DNA。 1275644 25. 如申 子區 26. 如申 菩酸 27. 一 種 子， 訊號 28. 一 種 體或 29. 如申 動物 30·如申 細胞 請專利範圍第21項之表現 域。 ’其進一步包括啟動 請專利範圍第21項之表 化作用訊號區域。 體，其進一步包括聚腺 基因構築體，其包括如申社 後者妳奸从* ％專利範圍第1項之核酸分 佼耆I操作連接至啟動 序列。 序列以及聚腺茹酸化作用 宿主細胞，其包括如申 ,^ ，專利範圍第21項之表現載 如申請專利範圍第27項之 月心基因構築體。 請專利範圍第28項之宿主細 土、、，田胞，其中 < 細胞係哺乳 細胞。 請專利範圍第29項之宿主鈿除 甘山、 、、、田胞，其中 < 細胞係腫瘤 3L如申請專利範圍第29項之宿主細胞，其中之細胞係抗原 呈現細胞。 32. —種製造如申請專利範圍第u項之嵌合τΝρα的方法，其 包括在適於有效表現該蛋白質之條件狀況下培養如申請 專利範圍第28項之宿主細胞。 33· 種用於增加能於哺乳動物細胞表面結合tnFoc接受器 之配位體濃度的醫藥組合物，其包括有效量之如申請專 利範圍第1項之可編碼嵌合TNFa多肽之核酸分子，藉此 該嵌合TNFa多肽較TNFa蛋白質不易由細胞表面分裂。 34.如申請專利範圍第33項之醫藥組合物，其中之該核酸分 子包括如申請專利範圍第21項之表現載體或如申請專利 1275644

範圍第27項之基因構築體。 35. 如申請專利範圍第34項之醫藥組合物，其中之細胞為哺 乳動物細胞。 36. 如申請專利範圍第34項之醫藥組合物，其中該細胞於其 表面表現TNFoc接受器。 37. —種用於促進可表現TNFoc接受器之細胞的細胞凋亡之 醫藥組合物，其中包括有效量之如申請專利範圍第1項之 可編碼嵌合TNFa多肽之核酸分子，其中之嵌合TNFa係表 現於細胞表面。 38. —種用於謗發免疫系統細胞活化的醫藥組合物，其包括 有效量之如申請專利範圍第1項之可編碼嵌合TNFa多肽 之核酸分子，其中之嵌合TNFa係表現於細胞表面。 39. —種用於治療病患贅瘤之醫藥組合物，其包括有效量之 如申請專利範圍第1項之可編碼嵌合TNFa多肽之核酸分 子，其中之嵌合TNFa係表現於細胞表面。 40. 如申請專利範圍第39項之醫藥組合物，其應用方式為將 可編碼嵌合TNFa之多核茹酸分子導入贅瘤性細胞後再 將該細胞灌注回病患體内。 41. 一種用於治療贅瘤之醫藥組合物，其包括有效量之如申 請專利範圍第1項之可編碼嵌合TNFa多肽之核酸分子， 其中之嵌合TNFoc係表現於腫瘤病灶中。