CN1316022C - 新型的嵌合tnf配体 - Google Patents

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CN1316022C CNB028267559A CN02826755A CN1316022C CN 1316022 C CN1316022 C CN 1316022C CN B028267559 A CNB028267559 A CN B028267559A CN 02826755 A CN02826755 A CN 02826755A CN 1316022 C CN1316022 C CN 1316022C
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Abstract

本发明是关于编码嵌合TNFα的分离的多聚核苷酸序列，包括编码非TNFα的肿瘤坏死因子配体的结构域或亚结构域的第一核苷酸序列，其中被编码的结构域或亚结构域替换了天然TNFα的切割位点，和编码结合于TNFα受体的天然TNFα的结构域或亚结构域的第二核苷酸序列。被编码的嵌合TNFα明显地对来自细胞表面的切割不敏感，导致可以在细胞表面增加能够结合于TNFα受体的TNFα的浓度。通过往感兴趣的细胞中导入编码在细胞表面表达的嵌合TNFα的分离的多聚核苷酸序列，嵌合TNFα因此可以用于诱导表达TNFα受体的细胞的凋亡，诱导免疫系统细胞的活化和治疗瘤形成细胞。

Description

新型的嵌合TNF配体
技术领域
本发明涉及生物化学、免疫学、基因工程和药学领域。特别地，本发明与新型的嵌合配体有关，当该嵌合配体在细胞的表面表达时，比相应的天然配体更稳定。
背景技术
免疫系统通过把恶性细胞识别为外来物，然后把它排除出身体，从而清除恶性细胞。为了完成这一过程，免疫系统产生抗体应答和细胞应答。这两种应答需要免疫系统的很多不同的细胞间的相互作用(Abbas，Cellular and Molecular Immunology，2000)。
免疫反应通常始于T淋巴细胞(T细胞)，在T淋巴细胞表面有T细胞受体(TCR)，该受体与同II类主要组织相容性复合物(MHC)分子联合的由抗原衍生的肽结合。T细胞还在其表面表达各种多肽，它们被称作“配体”，因为它们与免疫介导的应答相关的细胞上的受体结合，如以下更详细的描述。当T细胞受体结合于MHC联合抗原，如来源于恶性细胞的抗原时，细胞被活化，而且在其表面表达配体。配体仅仅在细胞表面存在很短的时间，一旦它从细胞表面去除，T细胞结合于含有受体的细胞的能力就会丧失。其中一个这样的配体被称为肿瘤坏死因子(TNFα)。
当表达于活化的T细胞表面时，TNFα结合于受体，例如表达于免疫细胞、非免疫细胞和恶性细胞表面的TNF受体I(也称为“p55”或者“CD120a”)和TNF受体II(也称为“p75”或者“CD120b”)。在这些免疫细胞中包括统称为“抗原呈递细胞”(APC)的细胞，因为它们表达可以结合抗原并且将抗原呈递给T细胞的表面多肽。APC的例子包括树突细胞和B细胞。APC的表面还具有各种受体分子，可以与免疫系统的其它细胞相互作用。T细胞表达的配体与APC和恶性细胞上的受体分子之间的相互作用导致细胞裂解反应，破坏恶性细胞并将它们从体内清除。
TNFα是配体大家族中的一员，统称为TNF超家族(Gruss等，Cytokines Mol Ther，1：75-105，1995和Locksley等，Cell，104：487-501，2001)。TNF超家族的成员包括Fas配体(“FasL”)，TNFα，LTα，淋巴毒素(TNFβ)，CD154，TRAIL，CD70，CD30配体，4-1BB配体，APRIL，TWEAK，RANK配体，LIGHT，AITR配体，ectodysplasin，BLYS，VEGl和OX40配体。TNF超家族成员具有保守的二级结构，包括四个结构域：结构域I，细胞内结构域；结构域II，跨越细胞膜的结构域，被称为跨膜结构域；结构域III，由最靠近细胞膜的细胞外氨基酸组成；和结构域IV，远端的细胞外结构域(Kipps等，WO98/26061出版于1998年6月18日)。典型地，结构域IV的至少一部分可以从母体分子中切除。被切除的片段通常表现出与完整的配体相同的生物学活性，它通常被称为TNF家族成员的“可溶形式”。
1.TNFα的生物学活性
TNFα具有两种活性形式。一种是与膜整连的形式(mTNFα)，也称为前TNFα。此外，有一种通过mTNFα蛋白裂解切割产生的可溶形式(sTNFα)。TNF通过两种不同的受体CD120a和CD120b进行信号传导。总的来说，由于CD120a中存在细胞质死亡结构域，藉由CD120a的信号传导诱导细胞凋亡。与之相反，CD120b缺乏死亡结构域，它一般诱导细胞的活化，如增殖和共刺激分子的表达。后面的这些效应在正常的B细胞中很突出，其中TNFα诱导重要的共刺激分子的表达，包括CD80和CD54(Ranheim和Kipps，Cell lmmunol.161：226，1995)。
已经表明一种称作TACE(TNFα转化酶)的间质金属蛋白酶(mmp)释放TNFα的活性形式(BIack等，Nature，385：729-733，1997和Moss等，Nature，385：733-736，1997)。已经发现TACE通过在氨基酸残基丙氨酸76和缬氨酸77之间切割前TNFα而释放sTNFα。此外，切割依赖于从缬氨酸77到脯氨酸88的大约12个氨基酸的mmp识别序列(Decoster et al，J.Biol.Chern，270：18473-18478，1995和Tang et al，Biochemistry，35：8226-8233，1996)，因为缺失这一mmp识别位点的9到12个氨基酸会抑制母体TNFα分子的切割(Decoster等，J Biol Chem，270：18473-18478，1995和Perez等，Cell，63：251-258，1990)。然而，由于在TNFα中存在多个切割位点，缺失这一切割位点并不完全消除sTNFα的产生。(Mueller等，J.Biol.Chem，274：38112-38118，1999)。
II.在治疗人类疾病中目前的TNFα构造的缺点
由于TNFα可以诱导表达CD120a的细胞的凋亡，同时通过藉由CD120b的细胞激活增强免疫应答，研究组试图使用TNFα作为抗肿瘤化合物。然而，由于在不引起系统毒性的情况下细胞因子不能达到高的局部浓度，所以使用重组的可溶性TNFα对于大多数癌症的免疫治疗表现出很小的临床效果。一般的副作用包括发热，寒战，食欲缺乏，高血压，肝脏异常，血液学变化(Spriggs等，Ciba Found Symp，131：206-227，1987)。而且，甚至表达为与膜整连的前TNFα的野生型(wt)TNFα的基因转移，在不引起系统毒性的情况下，也不能达到高的TNF局部表达，因为它很快代谢成可溶性的细胞因子。由于TNFα的可溶形式是TNFα作为治疗化合物失败的一般原因，我们假设膜稳定的TNFα的设计可能允许局部传送TNFα分子而同时降低与可溶性TNFα相关的系统毒性的风险。
已知目前TNFα应用的缺点，因此明显地需要膜稳定的TNFα，它既保持天然TNFα的受体结合功能，但又对切割不敏感，因此较不可能产生可溶性的TNFα。本发明提供了这样的膜稳定的TNFα配体。
发明概述
本发明涉及新颖的嵌合TNFα，这种新颖的嵌合TNFα在表达于细胞表面时较未嵌合的TNFα稳定。这些新颖的配体是嵌合的，因为它们包含TNF超家族至少两种不同成员的结构域或亚结构域。具体的，至少一个含有“切割位点”的TNF结构域或亚结构域用TNF超家族另一个配体相应的结构域或亚结构域替换，优选的是CD154，CD70，FasL或者TRAIL。此外，嵌合的配体包含TNFα的结构域或亚结构域，主要用于结合同源的TNFα受体。本发明也涉及新颖的编码嵌合TNFα的多核苷酸序列，含有新颖的多聚核苷酸序列的表达载体，以及产生新颖的嵌合配体的方法。最后，本发明涉及应用表达载体，改善转染细胞的免疫学活性和治疗恶性肿瘤的方法。
所以，本发明的一个方面是涉及编码嵌合TNFα的分离的多聚核苷酸序列，包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，第一核苷酸序列编码非TNFα的肿瘤坏死因子配体的结构域或亚结构域，其中编码的结构域或亚结构域替换了天然TNFα的切割位点，第二核苷酸序列编码天然TNFα的结构域或亚结构域，它结合于TNFα受体。
本发明的一个方面是以上的分离的多聚核苷酸序列，其中第一核苷酸序列编码其它的肿瘤坏死因子配体的结构域III，或结构域III的亚结构域。
本发明的一个方面是以上的分离的多聚核苷酸序列，其中第一核苷酸序列额外地编码其它的肿瘤坏死因子配体的结构域II，或结构域II的亚结构域。
本发明的一个方面是分离的多聚核苷酸序列，如那些以上所描述的，其中的第一核苷酸序列额外地编码其它的肿瘤坏死因子配体的结构域I，或结构域I的亚结构域。
本发明的一个方面是分离的多聚核苷酸序列，如那些以上所描述的，其中的第一核苷酸序列额外地编码其它的肿瘤坏死因子配体的结构域IV的亚结构域。
本发明的一个方面是分离的多聚核苷酸序列，如那些以上所描述的，其中其它的肿瘤坏死因子配体从CD154，CD70，Fas配体和TRAIL中选择。
本发明的一个方面是分离的多聚核苷酸序列，如那些以上所描述的，其中第二核苷酸序列编码天然的TNFα的结构域IV，或者结构域IV的亚结构域。
本发明的一个方面是分离的多聚核苷酸序列，如那些以上所描述的，其中第二核苷酸序列编码天然的TNFα的结构域IV的亚结构域，保留了天然TNFα的切割位点。
本发明的一个方面是分离的多聚核苷酸序列，如那些以上所描述的，其中第一核苷酸序列编码选自CD154、CD70、Fas配体和TRAIL的肿瘤坏死因子配体的结构域I、II和III，或者结构域I、II和III中的一个或多个的亚结构域，以及第二核苷酸序列编码天然TNFα的结构域IV，或者结构域IV的亚结构域。
本发明的一个方面是分离的多聚核苷酸序列，如那些以上所描述的，其中第一核苷酸序列编码CD154的结构域I、II和III，或者结构域I、II和III中的一个或多个的亚结构域，以及第二核苷酸序列编码天然TNFα的结构域IV，或结构域IV的亚结构域。
本发明的一个方面是分离的多聚核苷酸序列，如那些以上所描述的，进一步包括编码至少一个氨基酸的肽的接头结构域，接头结构域连接第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。
本发明的一个方面是分离的多聚核苷酸序列，如那些以上所描述的，其中序列从SEQ.ID.NO.1，SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4中选择。
本发明的一个方面是分离的多聚核苷酸序列，如那些以上所描述的，其中嵌合的TNFα包括从SEQ.ID.NO.5，SEQ.ID.NO.6，SEQ.ID.NO.7和SEQ.ID.NO.8中选择的氨基酸序列。
本发明的一个方面是嵌合TNFα，包括非TNFα的肿瘤坏死因子配体的第一结构域或者亚结构域，其中该结构域或者亚结构域替换了天然TNFα的切割位点，和结合于TNFα受体的天然TNFα的第二结构域或者亚结构域。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，它对于切割离开细胞表面较天然的TNFα不敏感。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，其具有的切割率大约比天然的TNFα配体小90％。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，如那些以上所描述的，其中结构域或者亚结构域包括其它肿瘤坏死因子配体的结构域III，或者结构域III的亚结构域。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，如那些以上所描述的，其中结构域或者亚结构域进一步包括其它肿瘤坏死因子配体的结构域II，或者结构域II的亚结构域。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，如那些以上所描述的，其中结构域或者亚结构域进一步包括其它肿瘤坏死因子配体的结构域I，或者结构域I的亚结构域。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，如那些以上所描述的，其中结构域或者亚结构域进一步包括其它肿瘤坏死因子配体的结构域IV的亚结构域。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，如那些以上所描述的，其中其它的肿瘤坏死因子从CD154，CD70，Fas配体和TRAIL中选择。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，如那些以上所描述的，进一步包括天然TNFα的结构域IV，或者结构域IV的亚结构域。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，如那些以上所描述的，进一步包括缺乏天然TNFα的切割位点的天然TNFα的结构域IV的亚结构域。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，如那些以上所描述的，包括选自CD154、CD70、Fas配体和TRAIL的肿瘤坏死因子配体的结构域I、II和III，或者结构域I、II或III中的一个或者多个的亚结构域，以及天然TNFα的结构域IV，或者结构域IV的亚结构域。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，如那些以上所描述的，包括CD154的结构域I、结构域II和结构域III，或者结构域I、II和III中的一个或者多个的亚结构域，以及天然的TNFα的结构域IV，或者结构域IV的亚结构域。
本发明的一个方面是嵌合的TNFα，如那些以上所描述的，进一步包括连接第一结构域或者亚结构域和第二结构域或者亚结构域的接头结构域。
本发明的一个方面是含有以上分离的多聚核苷酸序列的表达载体。
本发明的一个方面是以上的表达载体，其中该多聚核苷酸序列编码嵌合的TNFα，该嵌合的TNFα包括选自CD154、CD70、Fas配体和TRAIL的肿瘤坏死因子配体的结构域III或者结构域III的亚结构域，和天然TNFα的结构域IV或者结构域IV的亚结构域。
本发明的一个方面是一种表达载体，如那些以上所描述的，进一步包括编码选自CD154、CD70、Fas配体和TRAIL的肿瘤坏死因子配体的结构域II或者结构域II的亚结构域的多聚核苷酸序列。
本发明的一个方面是一种表达载体，如那些以上所描述的，进一步包括编码选自CD154、CD70、Fas配体和TRAIL的肿瘤坏死因子配体的结构域I或者结构域I的亚结构域的多聚核苷酸序列。。
本发明的一个方面是一种表达载体，如那些以上所描述的，进一步包括编码选自CD154、CD70、Fas配体和TRAIL的肿瘤坏死因子配体的结构域IV的亚结构域的多聚核苷酸序列。
本发明的一个方面是一种表达载体，如那些以上所描述的，进一步包括编码选自CD154、CD70、Fas配体和TRAIL的肿瘤坏死因子配体的结构域IV的亚结构域的多聚核苷酸序列。
本发明的一个方面是一种表达载体，如那些以上所描述的，进一步包括病毒DNA或者细菌DNA。
本发明的一个方面是一种表达载体，如那些以上所描述的，进一步包括腺病毒DNA，反转录病毒DNA或者其它病毒基因转移系统。
本发明的一个方面是一种表达载体，如那些以上所描述的，进一步包括启动子区域。
本发明的一个方面是一种表达载体，如那些以上所描述的，进一步包括多腺苷酸化的信号区域。
本发明的一个方面是一种的基因构建物，包括一种以上所描述的多聚核苷酸序列，该多聚核苷酸序列与启动子序列和多腺苷酸化信号序列有效地连接。
本发明的一个方面是包括以上描述的表达载体或者基因构建物中的一种的宿主细胞。
本发明的一个方面是以上的宿主细胞是一种哺乳动物细胞。
本发明的一个方面是该宿主细胞是一种抗原呈递细胞。
本发明的一个方面是该宿主细胞是一种肿瘤细胞。
本发明的一个方面是生产嵌合TNFα的方法，包括在适合于影响该蛋白的表达的条件下培养上述的宿主细胞中的一种。
本发明的一个方面是一种用于增加可以结合于细胞表面的TNFα受体的配体的浓度的方法，包括把分离的编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列导入细胞，其中嵌合的TNFα对来自细胞表面的切割较天然的TNFα不敏感。
本发明的一个方面是以上的方法，其中分离的多聚核苷酸序列包括以上所述的表达载体或者基因构建物中的一种。
本发明的一个方面是以上的方法，其中该细胞是一种哺乳细胞。
本发明的一个方面是以上的方法，其中该细胞在其表面表达TNFα受体。
本发明的一个方面是一种诱导表达TNFα受体的细胞凋亡的方法，包括把分离的编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列导入细胞，嵌合TNFα表达于细胞的表面。
本发明的一个方面是一种诱导免疫系统细胞活化的方法，包括把分离的编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列导入细胞，嵌合TNFα表达于细胞的表面。
本发明的一个方面是一种治疗在病人中瘤形成的方法，包括把编码嵌合TNFα的分离的多聚核苷酸序列导入赘生细胞，嵌合TNFα表达于细胞的表面。
本发明的一个方面是以上的方法，进一步包括从人类患者中得到赘生细胞，把编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列导入细胞后，重新把赘生细胞注入回患者体内。
本发明的一个方面是一种治疗瘤形成的方法，包括把编码嵌合TNFα的分离的多聚核苷酸序列注入患者的瘤床，嵌合TNFα随后表达于细胞的表面。
附图简述
图1  图1是TNF超家族中的一些人和鼠的配体的示意图，描绘了那些配体的结构域I-IV(Kipps等，WO98/26061，1998年6月18日出版)。
图2  图2是野生型TNFα(命名为wtTNFα)、TNFα的缺失突变体(命名为2TNFα)以及本发明的一些典型的TNFα嵌合体的示意图，描绘了那些配体的结构域I-IV以及结构域接头。
图3  图3是一系列荧光激活细胞分类(FACS)直方图，表示在HT1080细胞上wt TNFα，缺失突变体2TNFα和本发明的一些典型的TNFα嵌合体的可比较的表面表达。阴影区代表用同型对照抗体荧光染色的背景荧光。非阴影区代表用编码该DNA序列的腺病毒感染的HT1080细胞的表面上wt TNFα、以前描述的膜稳定的2TNFα以及一些典型的TNFα嵌合体的表达水平。
图4  图4是一系列FACS直方图，表示未被感染的CLL B细胞和用编码wt TNFα和本发明的一些典型的TNFα嵌合物的腺病毒感染的细胞的TNFα的可比较的表面表达。阴影区代表用同型对照染色的细胞的背景荧光。非阴影区代表用TNF特异性抗体染色的细胞上的人TNFα的表达。
图5  图5表示通过TNF特异性的ELISA分析测定，用wtTNFα腺病毒，2TNFα腺病毒和典型的嵌合TNFα腺病毒载体感染的HT1080细胞产生的可溶性TNFα的量。
图6  图6代表用编码wt TNFα，2TNFα和典型的嵌合TNFα腺病毒载体的腺病毒感染后，WEHI164细胞的细胞死亡。
图7  图7表示用编码CD154:TNFα嵌合体的腺病毒感染HeLa细胞与用wt TNFα感染细胞，然后HeLa细胞与WEHI 164细胞共培养，WEHI 164细胞凋亡的比较图。较深的条带代表通过细胞-细胞接触引起的凋亡，同时较浅的条带代表由TNFα的可溶形式的作用介导的凋亡。
图8  图8是一系列FACS直方图，表示CLL B细胞与表达wt TNFα和本发明的典型的嵌合TNFα构建物的HeLa细胞共培养后，CLLB细胞表型标记CD25，CD54，CD96，CD95和CD70的比较的表面表达。
图9  图9表示由Hela细胞产生的可溶性TNFα的量，Hela细胞用编码wt TNFα，CD154:TNFα嵌合体，在嵌合体连接位点含有一个推定的CD154mmp识别序列的CD154:TNFα，或者在嵌合体连接位点缺乏连接结构域的CD154:TNFα的腺病毒载体感染，。
图10  图10表示由Hela细胞产生的可溶性TNFα的量，Hela细胞用编码在其连接结构域处有不同改变的CD70:TNFα嵌合体的质粒转染。
图11  图11表示注射带有对照腺病毒(LacZ)，编码wtTNFα的腺病毒，或者编码CD154:TNFα嵌合体的腺病毒的预先制备的肿瘤后，带肿瘤的鼠的百分率随时间的变化。
发明详述
所有引用的文献一并整入作为参考，包括任何其附图，如同在此完整列出。
I.定义
正如在此使用的，术语“嵌合TNFα”是指包括至少一个TNFα的结构域或者亚结构域和至少一个非TNFα的别的TNF配体结构域或者亚结构域的配体。
正如在此使用的，术语“亚结构域”是指是TNF配体的结构域的一部分，它是至少两个氨基酸的一段序列。“亚结构域”也包含一个或者多个氨基酸已经从中去除的氨基酸序列，包括从序列末端缩短一个或者多个氨基酸。
正如在此使用的，术语“切割位点”以及“mmp识别位点”是指被蛋白酶识别的一段氨基酸序列，典型的是蛋白酶是间质金属蛋白酶(mmp)，如TNFα转换酶(TACE)，它从表达细胞的表面切割TNFα。已经发现TACE通过在氨基酸残基丙氨酸76和缬氨酸77间切割前TNF而释放sTNFα。此外，这种切割依赖于从缬氨酸77到脯氨酸88的大约12个氨基酸的mmp识别序列。发现TNFα的切割位点一般在TNFα的结构域III和IV的边界区域。
正如在此使用的，术语“接头结构域”是指不是天然TNFα配体的一部分，连接TNFα嵌合构建物的结构域或者亚结构域的至少一个氨基酸的序列。正如在我们的实施例中描述的，尽管该接头结构域一般是两个到四个氨基酸的长度，但是只要是不影响TNFα嵌合构建物结合于其同源受体，接头可以是任何数目的氨基酸(一个氨基酸或者大于一个)。此接头可以包括不带电荷的氨基酸(如，丙氨酸和甘氨酸)或者带电荷的氨基酸(如天冬氨酸)。此外，接头结构域在TNFα嵌合构建物中并不是必须的，因为去除了接头结构域不应当影响TNFα嵌合构建物的功能和代谢过程。接头结构域的使用在文献(Ladurner等，J Mol Biol，273：330-337.，1997和Wu等，Q J Nucl Med，44：268-283.，2000)中有介绍。
正如在此使用的，术语“对切割不敏感”是指嵌合TNFα对于蛋白酶裂解切割，与天然的TNFα相比有更高的抵抗性，这可以通过已知数量的细胞在一段时间内产生的可溶性TNF的量测定。而且，本发明的嵌合TNFα“对于切割不敏感”是因为其切割率优选地至少比天然的TNFα少90％。
正如在此使用的，术语“表达载体”是指表达一个重组核苷酸序列，而且可以感染细胞和在其中自身复制的一段核酸。典型的表达载体包括用于重组DNA技术的质粒，以及各种可以在细菌和动物细胞中复制的病毒。许多表达载体已经在文献中说明。Cantwell等，Blood，在(1996)题目为：“Adenovirus Vector Infection of Chronic LymphocyticLeukemia B Cells”；Woll，P.J.和I.R.Hart， Ann.Oncol.，6 Suppl 1：73(1995)；Smith，K.T.，A.J.Shepherd，J.E.Boyd，和G.M.Lees， GeneTher.3：190(1996)；CooDer，M.J.， Semin.Oncol.，23：172(1996)；Shaughnessy，E.，D.Lu，S.Chatterjee，和K.K.Wong， Semin.Oncol.，23：159 (1996)；Glorioso，J.C.，N.A.DeLuca，和D.J.Fink， Annu.Rev.Microbiol.，49：675(1995)；Flotte，T.R.和B.J.Carter， Gene Ther.，2：357(1995)；Randrianarison-Jewtoukoff，V.和M.Perricaudet， Biologicals，23：145(1995)；Kohn，D.B.， Curr.Opin.Pediatr.，7：56(1995)；Vile，R.G.和S.J.Russell， Br.Med.Bull.，51：12(1995)；Russell，S.J.， Semin.Cancer.Biol.，5：437(1994)；和Ali，M.，N.R.Lemoine，和C.J.Ring， GeneTher.1：367(1994)。
II.编码嵌合TNFα配体的嵌合DNA序列
正如以上所说明的，TNF超家族的配体(“TNF配体”)具有相似的二级结构，它由很多结构域组成(Kipps等，WO98/76061，1998年6月18日出版)。在表1中，列出了很多TNF超家族的配体的结构域的边界范围。在人的TNFα的X-射线晶体结构的基础上，已经推导出CD40配体的受体结合部分的二级结构(Peitsch等，Iht lmmunol，5：233-238，1993)。应用计算机分析，其它的TNF配体的受体结合部分的二级结构通过与人TNFα的比较推导出。
                             表1.
            来自TNF超家族的配体的结构域结构*
  结构域1(细胞质) 结构域II(跨膜) 结构域III(胞外近端)   结构域IV(胞外远端)
人CD154     1-42  42-135   135-330   330-786
鼠CD154     1-42  42-135   135-327   327-783
  牛CD154     1-42  42-135   135-330   330-786
  人TNFα     1-87  87-168   168-228   228-699
  鼠TNFα     1-87  87-168   168-237   237-705
  猪TNFα     1-87  87-168   168-228   228-696
  人Fas配体     1-237  237-315   315-390   390-843
  鼠Fas配体     1-237  237-309   309-384   384-837
  人CD70     1-45  45-117   117-132   132-579
  人
  CD30配体     1-117  117-186   186-240   240-702
  人TRAIL     1-42  42-111   111-345   345-843
*结构域的确定是通过把cDNA的起始甲硫氨酸的第一个核苷酸作为核苷酸数目1来确定每个结构域的核苷酸边界。根据本发明，显示的核苷酸边界可能与那些本发明中用到的和已确定的结构域边界有相当的变化。
已知TNF超家族成员间的结构相似性和编码它们的核苷酸序列，编码TNFα的结构域或者亚结构域的核苷酸序列就应当可以和相对应的另外的TNF配体的核苷酸序列互换，由此得到编码嵌合TNFα的杂合的多聚核苷酸序列。
选择在不同的TNF配体基因中相对应的序列交换核苷酸序列是由于功能性的原因，即，因为新序列编码的结构域或者亚结构域提供或改变所需的功能，或者消除目标配体基因所不需要的功能。例如，人们熟知至少部分TNFα是从母体分子切割得到，而且变成可溶形式。如以上说明的，可溶形式一般是不理想的。因此，从TNF配体中交换并不含有可导致TNFα可溶形式的TNFα切割位点的序列，会至少部分地改善这一问题。
根据本发明，TNFα的结构域III包括被蛋白酶切割的氨基酸序列。例如，对于TNFα切割位点已经确定是在氨基酸丙氨酸76和缬氨酸77之间。在这一位点的切割产生了可溶性的TNFα分子。正如以上所说明的，天然TNFα在结构域I到IV具有另外的切割位点(Mueller等，JBiol Chem，274：38112-38118，1999)。
此外，根据本发明，TNFα的结构域IV包括对于结合TNFα受体是必须的一个或者多个氨基酸，它必须保留以保持TNFα受体的结合。
所以，目前本发明优选的实施方案是嵌合的TNFα多聚核苷酸序列，包括编码非天然TNFα的TNF配体的结构域或者亚结构域的第一核苷酸序列，其中被编码的结构域或者亚结构域替代了含有切割位点的天然TNFα的结构域或者亚结构域。因此，该第一序列可以不受限制地编码以下的结构域，亚结构域或者它们的组合：替代天然TNFα的切割位点的结构域III的亚结构域；整个结构域III；替代天然TNFα切割位点的结构域III和结构域II或者其亚结构域；替代天然TNFα切割位点的结构域III和结构域I或者其亚结构域；替代天然TNFα切割位点的结构域III和结构域IV的亚结构域；结构域III，结构域II和结构域I或者它们的亚结构域。优选地，第一核苷酸序列编码以下TNF配体：CD154，CD70，FasL和TRAIL的至少一个结构域或者亚结构域。根据本发明，用这四种其他的TNF配体中的一种的结构域或者亚结构域替换含有TNFα切割位点的结构域和亚结构域，得到与天然TNFα相比对切割显著不敏感的嵌合TNFα。
第一核苷酸序列可有效地与第二核苷酸序列连接，该第二核苷酸序列编码天然TNFα的涉及TNFα受体结合的胞外结构域或者亚结构域。该结构域或亚结构域包括能够结合于TNF-R1，TNF-R2或者其它TNFα受体的天然TNFα的整个结构域IV或者其亚结构域。这样，由本发明提供的嵌合多聚核苷酸序列编码可以结合于表达TNFα受体的细胞的嵌合TNFα。
本发明优选的多聚核苷酸序列编码天然TNFα的亚结构域IV，该亚结构域IV有效地与选自CD154、CD70、FasL和TRAIL的配体的结构域I、II和III连接。例如，在本发明的一个优选实施方案中，编码人TNFα的结构域IV或者结构域IV的亚结构域的核苷酸与编码人CD154的结构域I、结构域II和亚结构域III且缺少CD154切割位点的核苷酸序列连接(CD154:TNFα)。在此提供的这样的多聚核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1。可选择的，编码人CD154的亚结构域III的核苷酸可以包括CD154的切割位点(命名为CD154+mmp:TNFα)。本发明优选的另一实施方案是编码人TNFα的结构域IV或结构域IV的亚结构域的核苷酸序列，该核苷酸序列有效地与编码人CD70的结构域I、II和III的核苷酸序列连接(SEQ.ID.NO.2)。SEQ.ID.NO.3也提供了本发明优选的多聚核苷酸序列的另一个例子，其中编码人TNFα的结构域IV或者结构域IV的亚结构域的核苷酸序列有效地与编码人FasL的结构域I、II和III的核苷酸序列连接。最后，SEQ.ID.NO.4，本发明另一个优选的实施方案，提供了编码人TNFα的结构域IV或者结构域IV的亚结构域的核苷酸序列，其有效地与编码人TRAIL的结构域I、II和III的核苷酸序列连接。在所有这些实施方案中，核苷酸优选地编码人TNFα的结构域IV的亚结构域，其缺失了TNFα的切割位点。此外，在SEQ.ID.NO.1-4中描述的TNF家族成员的结构域I、II和III通过一个编码2到4个氨基酸的肽的接头结构域与TNFα的结构域IV连接。目前本发明最优选的多聚核苷酸序列是SEQ.ID.NO.1。图2说明了嵌合TNFα的上述实施方案的结构域I-IV。此外，以下的
表II说明了这些嵌合TNFα序列的核苷酸边界。
                          表II
    构建物     结构域I-III     TNF的结构域IV
    CD154:TNFα     1-321     265-699
    CD70:TNFα     1-132     265-699
    FasL:TNFα     1-390     265-699
    TRAIL:TNFα     1-345     265-699
    CD154+mmp:TNFα     1-351     265-699
以上的多聚核苷酸序列均包括人TNF配体序列，本发明也考虑使用来自其它物种的多聚核苷酸序列，如鼠的多聚核苷酸序列，但不限于此。
因此，被编码的嵌合TNFα包括一段非TNFα的TNF配体的多肽结构域或者亚结构域，其替换了天然TNFα的一个切割位点。结果，嵌合的TNFα相对于天然TNFα，对细胞表面的切割不敏感。优选地，交换的结构域是选自CD154，CD70，FasL或者TRAIL。优选的构建物是：人CD154的结构域I、II和亚结构域III以及人TNFα的结构域IV或者结构域IV的亚结构域(SEQ.ID.NO.5)；人CD70的结构域I、II和III以及人TNFα的结构域IV或者结构域IV的亚结构域(SEQ.ID.NO.6)；人FasL的结构域I、II和III以及人TNFα的结构域IV或者结构域IV的亚结构域(SEQ.ID.NO.7)；人TRAIL的结构域I、II和III以及人TNFα的结构域IV或者结构域IV的亚结构域(SEQ.ID.NO.8)。本发明最优选的嵌合TNFα的实施方案是SEQ.ID.NO.5。
III.基因构建物
本发明也涉及含有本发明的可以在靶细胞中表达嵌合TNFα的多聚核苷酸序列的表达载体或者任何其它的基因构建物。
本发明使用的表达载体包括编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列，其有效地与合适的转录或者翻译调控核苷酸序列连接，如来自哺乳动物，微生物，病毒或者昆虫基因的核苷酸序列。这样的调控序列包括在基因表达中具有调控作用的序列，例如，转录启动子或者增强子，控制转录的操纵子序列，编码在信使RNA内的核糖体结合位点的序列，以及控制转录、翻译起始或者转录终止的合适的序列。
特别有用的调控序列包括来自各种哺乳动物，病毒，微生物和昆虫基因的启动子区域。启动子区域引导包括编码本发明的嵌合TNFα的多聚核苷酸序列在内的整个序列的转录的起始。有用的启动子区域包括在劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)发现的启动子，人巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子区域，1ac启动子，从腺病毒中分离的启动子，和任何其它的本领域普通技术人员已知的用于真核生物、原核生物、病毒或者微生物细胞基因表达的启动子。对于在真核生物细胞中表达基因和蛋白特别有用的其它启动子包括哺乳动物细胞启动子序列和增强子序列，例如那些源于多瘤病毒，腺病毒，猿猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒的启动子序列和增强子序列。特别有用的是病毒早期和晚期启动子，其一般在病毒，例如SV40病毒，的复制起点的附近。本领域普通技术人员将了解，特别有用的启动子的选择是依赖于确定的细胞系和用于在特定的细胞系中表达多聚核苷酸序列的基因构建物的其它各种参数。
因此本发明特定的基因构建物包括多聚核苷酸序列，此多聚核苷酸序列有效地与启动子序列或者启动子和增强子序列连接，而且也有效地与引发终止和信使RNA多聚腺苷酸化的多聚腺苷酸化序列连接。优选地，该多聚核苷酸序列通过使用CMV启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化序列来构建。
IV.宿主细胞
本发明也考虑使用各种宿主细胞，该宿主细胞用含有本发明的多聚核苷酸序列的表达载体或者其它的基因构建物来转化或者转染。这些细胞可以是原核或者真核细胞。
在一些优选的实施方案中，该细胞是哺乳动物的正常抗原呈递细胞，例如单核细胞，巨噬细胞，B细胞等等。在另一些优选的实施方案中，该细胞可以是能够在本发明的多聚核苷酸序列导入到这些细胞中时刺激旁观抗原呈递细胞(bystander APC)的正常细胞。本发明也考虑使用那些天然并不可以呈递抗原于免疫系统的体细胞，但是这些体细胞可以用编码抗原呈递所需的分子的基因进行基因工程改造，这样就使得这些细胞成为人工的抗原呈递细胞。随后编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列可以导入到这些人工的抗原呈递细胞中。在文献中已知的各种测试可以被用来确定一种特定的细胞是否可以具有抗原呈递细胞的功能，例如细胞增殖或者淋巴因子的产生，因此本发明的这一方面可以很容易确定。
除了以上的正常的人细胞外，本发明也考虑将编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列导入到各种赘生细胞或者恶性细胞中，例如免疫系统细胞和实体瘤细胞。这些赘生细胞包括白血病细胞，例如急性单核细胞白血病(AML)，急性粒单核细胞白血病(AMML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性骨髓性白血病或者慢性粒单核细胞白血病(CMML)。也考虑来源于淋巴瘤，神经胶质瘤，乳房，子宫颈，卵巢，肺，膀胱或者前列腺癌的细胞。
最后，在本发明的一个优选实施方案中，编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列被导入到在其细胞表面表达同源TNFα受体，如TNF-R1和TNF-R2的细胞中。
V.利用含有辅助分子配体基因的基因载体和构建物的方法
为了识别在调控免疫应答中TNFα和它的同源受体的相互作用，本发明也考虑通过把编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列导入细胞中，增加可以结合于TNF-R1、TNF-R2或者一些其它的TNFα同源受体的膜稳定化的配体的浓度的方法，这样嵌合TNFα与天然TNFα相比对细胞表面的切割不敏感。由于嵌合TNFα对于蛋白酶解切割较不敏感，所以提高了其结合于它的同源受体和诱导细胞裂解反应或者免疫应答的能力。此外，用本发明的编码嵌合TNFα配体的多聚核苷酸序列感染细胞，该细胞诱导带有TNFα受体的细胞凋亡和清除的能力提高了。
本发明可以用于任何参与免疫反应的人细胞，这些细胞既可以作为免疫系统的目标，也可以作为免疫系统对外来目标的应答的一部分。方法包括体外方法和体内方法，以及其它的涉及注入多聚核苷酸或者载体进入宿主细胞的各种方法。方法也包括直接注入肿瘤或者瘤床。
所以本发明考虑使用体外方法，其包括从动物或者人类患者中分离细胞。本发明的编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列被导入分离的细胞。然后细胞再次导入到患者特定的部位或者直接进入患者的循环系统。在本发明的一个优选实施方案中，细胞表面标记物，包括例如肿瘤标记物或可鉴别细胞的抗原分子，可以用于从患者中特定地分离这些细胞。
本发明也考虑把编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列导入动物或者人患者体内所需的细胞中，而不需要首先从患者中取出这些细胞。已知把多聚核苷酸序列导入体内特定细胞或者患者体内的方法，包括表达载体的使用和对患者直接注射各种基因构建物。在一典型应用中，含有本发明的多聚核苷酸序列的表达载体引入到循环系统或者患者的局域部位，使载体特定地感染目标细胞。在其它优选的实施方案中，载体直接注射到患者的瘤床中，该瘤床中含有至少一些将被导入本发明的多聚核苷酸序列的细胞。
本发明也考虑直接把含有编码嵌合TNFα的多聚核苷酸序列的基因构建物注射于动物或者人患者，该基因构建物还可以额外含有启动子和多聚腺苷酸化的序列。这样的有用方法的例子已有描述(Vile等，Ann Oncol，5：59-65，1994)。基因构建物也可以直接注射到动物或人患者的肌肉或者其它部位，或者直接注射到患者的肿瘤或者瘤床中。
VI.治疗瘤形成的方法
本发明也关于编码本发明的嵌合TNFα的多聚核苷酸序列的基因转移，从而可以诱导肿瘤细胞的凋亡。除了通过TNFα和它的受体TNF-R1和TNF-R2的相互作用直接引起这些肿瘤的凋亡外，本发明也考虑用嵌合TNFα感染肿瘤细胞，这样配体以膜稳定化的方式表达，因此也可以参与免疫应答。
所以，本发明考虑治疗瘤形成的方法，包括把本发明的多聚核苷酸序列插入瘤形成细胞，这样编码的嵌合TNFα在瘤形成细胞的表面表达。本发明考虑在体内和体外治疗人的瘤形成。
在治疗瘤形成的一种优选方法中，该方法进一步包括首先从患者得到瘤形成细胞，往瘤形成细胞中插入本发明的多聚核苷酸序列，这样在瘤形成细胞的表面表达嵌合TNFα，再将这些细胞重新转移到患者中。本领域普通技术人员了解把转化过的瘤形成细胞再转移到患者中的各种方法。
                           实施例
I .含有嵌合辅助分子配体基因的基因构建物和基因治疗载体的构建SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4的嵌合辅助分子配体基因的构建和克隆如下：
i .使用来自两种不同的辅助分子配体基因的结构域制备嵌合辅助分子 配体基因
编码配体(CD154、CD70、FasL和TRAIL)的结构域I-III的DNA片段通过以全长cDNA为模板，使用对配体的结构域I-III两边的5’和3’区域特异的寡聚核苷酸为引物进行PCR。此外，编码TNFα的亚结构域IV的DNA片段被PCR扩增。BamHI限制性内切酶位点被设计加入到结构域III-IV连接处的PCR引物中，以保证结构域I-III的片段可以与结构域IV的片段连接。此外，限制性内切酶位点分别加入到结构域I和IV两边的5’和3’端引物中，使其可以连接到pcDNA3载体中。结构域I-III和结构域IV的片段经PCR扩增以后，DNA片段用BamHI和对应于结构域I和IV两侧的5’和3’的限制内切酶消化。消化后，结构域I-III片段和结构域IV的片段在BamHI位点连接，同时连接到真核表达质粒pcDNA3(lnvitrogen，san Diego，CA)的多克隆位点中。嵌合TNFα(在此后的实施例中，TNFα将被简称为“TNF”)的DNA插入物的两侧有强的异源CMV启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化序列。
ii. 腺病毒合成
嵌合的TNF-pcDNA3质粒用限制性内切酶Nru I和Sma I消化，释放出含有来自pCDNA3的CMV启动子、嵌合的TNF基因、来自pcDNA3的多聚腺苷酸化信号的DNA片段。通过1％的琼脂糖凝胶把消化的DNA片段分离纯化后，DNA片段连接到腺病毒穿梭载体MCS(SK)pXCX2的EcoR V位点。该质粒是质粒pXCX2的改进，pBluescript多接头(polylinker)序列已经克隆到E1区域，(J.R.Tozer，UCSD，数据未发表，1993年9月)。纯化了嵌合的TNF-MCS(SK)pXCX2质粒以后，按照制造商的说明，使用Promega的磷酸钙转染试剂盒将5μg的该穿梭质粒与5μg的JM17质粒共转染到293AC2细胞中。转染之后，细胞培养5天以进行同源重组和病毒合成。然后收集总细胞和上清液，并且通过冻融三次来释放与细胞关联的腺病毒。
起始病毒产生以后，通过空斑纯化技术，得到病毒的克隆分离株。简要地说，被冻融的病毒上清液在台式离心机上以1000rpm离心5分钟，由此除去碎片。293AC2细胞在6孔组织培养板中生长至会合后，用病毒上清的系列稀释物感染1-2小时。感染后，吸去培养基，细胞用含有4％胎小牛血清和0.65％琼脂糖的DMEM培养基覆盖，保持在56℃。培养4-6天后，把分离的空斑挑出，置于1毫升的培养基中，用于病毒扩增。
通过连续地感染更大数量的293AC2来大规模制备腺病毒。然后通过氯化铯密度梯度离心纯化腺病毒。该方法利用氯化铯密度梯度，通过密度为1.45g/cm3和1.20g/cm3的密度梯度浓缩病毒颗粒，其中由293AC2扩增的病毒样品在SW40转子(Beckman，Brea，CA)中以25,000rpm，4℃离心2小时。病毒条带用27规格的针头和注射器分离，并用Sephadex G-25 DNA级的柱子(Pharmacia，Piscataway，NJ)脱盐。病毒再用含有10％甘油的磷酸缓冲盐溶液脱盐并且储存于-70℃。病毒最终的滴度通过离子交换HPLC确定。
II. 往CLL细胞和HeLa细胞中导入和表达嵌合辅助分子配体基因
i. 表达
TNFα的表面表达通过流式细胞术来检测。简要的说，吸出培养基，加入去粘附溶液(含有10mM EDTA的PBS，pH8)，将粘附的细胞从孔中分离出来。一旦细胞从板上脱离，各种样品的一半通过流式细胞仪进行配体表达的分析。简要的说，细胞用FACS染色缓冲液(由含有3％FCS和0.05％叠氮化钠的PBS构成)洗涤一次，用FACS缓冲液重悬细胞至大约为107个细胞/毫升，将5×105个(50微升)细胞放置于96孔u-底的塑料微孔板中。对于人TNFα特异性染色，加入对TNFα特异的PE连接的抗体(Pharmingen)，在4℃下保持30分钟。然后细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于FACS缓冲液中，再转移至FACS管中用于数据采集。为了控制非特异性抗体的结合，所有的样品用适当的同型对照抗体染色。而且，通过在所有的染色反应中加入10纳克/毫升的碘化丙啶，把死细胞和细胞碎片从分析中去除。细胞通过使用FACSCaliber流式细胞仪(Becton Dickinson)进行流式细胞术，以分析TNFα的表达。
(图3)表示用腺病毒感染HT1080细胞后，各种嵌合TNF构建物相对于野生型TNF和以前所描述的膜稳定化的TNF(命名为□TNF)的表达。简要的说，HT1080细胞用滴度逐渐增加的腺病毒感染，如上面的直方图所示。感染后两天，用流式细胞术分析细胞TNF的表面表达。此数据表明编码嵌合TNF构建物的腺病毒载体在细胞表面表达，正如用对TNF特异的荧光染料连接抗体检测到的。此外，此数据表明各种TNF构建物的表面表达水平有所不同。具体地，Ad-CD154:TNF感染得到最高水平的TNF表面表达。在其它的细胞系，包括293、HeLa、COLO205、A549、HCT15、PC3、RPM18226和BT20中也得到相似的表达型式，这表明，TNF构建物之间表达的差异并不受细胞类型所限。
(图4)表示用腺病毒感染慢性淋巴细胞白血病(CLL)B细胞后，各种嵌合TNF构建物的表达。如上面的直方图所示，CLL细胞用腺病毒感染，复合感染(M.O.I)率为1000。感染后两天，通过流式细胞术检测CD19+B细胞的TNF表面表达。此外，该图显示了在TNF构建物之间的表达差别型式，与我们对上面描述的细胞系的观察相同。即，TNF嵌合体的表达强于野生型TNF。而且，最强的TNF表面表达由hCD154:TNF嵌合体获得。
ii. 可溶性分子的产生
可溶性TNF的产生：ELISA定量
(图5)显示了由嵌合TNFα腺病毒载体感染的HT1080细胞产生的可溶性TNF的量。细胞以大小为10的M.O.I.比率被感染。感染后两天，收集上清液并且通过离心去除死细胞和细胞碎片。使用Pharmingen，Inc.(La Jolla，CA)的TNF特异性ELISA分析，按照制造商的说明，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定可溶的TNF。TNF的具体量的计算以已知量的重组TNF(Biosource International)的滴度为基础。这些数据表明，与野生型TNF(wt TNF)或者前面描述的缺乏推定的mmp蛋白酶切位点的膜稳定化的□TNF相比，嵌合TNF构建物产生的可溶性TNF要显著少得多。此外，尽管CD154:TNF与其它的构建物相比具有最高的表面表达水平，但是CD154:TNF产生最少的可溶性TNF。可溶性TNF的这种释放型式在其它的细胞系中也可以观察到，包括HeLa、293、A549、COLO205、HCT-15和BT-20。
iii. 嵌合辅助分子配体的功能分析
1.TNF嵌合物杀死WEHI 164纤维肉瘤细胞：共培养分析
(图6)使用以前描述的生物凋亡分析(Espevik等，J lmmunolMethods，95：99-105，1986)证明TNF嵌合物是功能性的。腺病毒以大小为10的M.O.I率感染HeLa细胞两天后，将WEHI164细胞，一种对TNF敏感的细胞系，铺于感染的HeLa细胞上，再温育18个小时。WEHI164细胞用PKH26(Sigma，Inc.)预先标记，PKH26是一种红色荧光化学物，它使WEHI164细胞可以从HeLa细胞中选择出来。WEHI细胞用碘化丙啶染色，用流式细胞仪分析细胞的死亡。数据表明，WEHI细胞在与表达TNF的HeLa细胞共培养后被杀死。
2.TNF嵌合物引起WEHI164发生细胞接触依赖性凋亡
(图7)表明通过TNF嵌合物使WEHI164细胞发生的接触依赖性死亡。这也表明了TNF嵌合物的膜稳定化表达。简要地说，HeLa细胞用M.O.I.比率为10的腺病毒感染一天。然后WEHI164细胞与感染的HeLa细胞直接混合或者用0.2微米的transwell插入物将其与HeLa细胞分离。此插入物可以阻止直接的细胞-细胞接触，但允许可溶性分子(如可溶性的TNF)在细胞间的扩散。混合后18小时，进行WEHI164细胞的凋亡分析，如图6所示的方法。野生型的TNF可释放出可溶性TNF，杀死用transwell插入物分离的WEHI164细胞，而与之相反，TNF嵌合物并不释放可以类似地诱导凋亡的可溶性TNF。
3.TNF嵌合物活化CLLB细胞
(图8)显示与表达嵌合TNF的HeLa细胞共培养的CLLB细胞的活化。HeLa细胞用M.O.I.比率为10的腺病毒感染。感染两天后，CLLB细胞铺于HeLa细胞上面，共培养一天。然后分析CD19+CLL细胞在表达表型标记物(CD25，CD54，CD86，CD95和CD70)方面的变化。如每一行左侧标记的，粗体线直方图代表与Ad-TNF载体共培养的CLL细胞。细线直方图代表与Ad-LacZ病毒共培养。阴影直方图代表用无相关特异性的同型对照单克隆抗体染色。此数据表明嵌合TNF构建物具有功能性，因为它们调控作为淋巴细胞激活的特征的CLL细胞上表型标记物的表达。
4.改变mmp位点的TNF嵌合的可溶性TNF的产生
(图9)显示由含有推定的CD154mmp识别位点的嵌合CD154:TNF腺病毒载体感染的HeLa细胞产生的可溶性TNF的量，该mmp识别位点在图3-8描述的CD154:TNF嵌合物中不存在。这一构建物命名为CD154+mmp:TNF(SEQUENCE ID#9)。细胞用M.O.I.比率为10的腺病毒进行感染。感染后两天，收集上清，并离心去除死细胞和细胞碎片。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，使用Pharmingen，Inc.(La Jolla，CA)的TNF特异性酶联免疫吸附试验试剂盒，按照制造商的说明测定可溶性TNF。TNF的具体量的计算以已知量的重组TNF(Biosource International)的滴度为基础。此数据说明了以上描述的对原CD154:TNF嵌合物的改变并不影响它们对被蛋白酶切割成为可溶性分子的敏感性。
5.接头结构域的改变对可溶性TNF的产生的影响
(图10)显示用编码在接头结构域中有各种改变的CD70:TNF嵌合物的质粒转染HeLa细胞，由该HeLa细胞产生的可溶性TNF的量。除了如图3-4说明的CD70:TNF构建物外，还显示了具有缩短的接头结构域的构建物(□接头CD70:TNF，Sequence ID#10)和具有含改变的氨基酸序列的接头结构域的构建物(接头DP-＞GACD70:TNF，SequenceID#11)。使用Lipofectamine2000(Gibco-BRL)，按照制造商的说明用质粒转染HeLa细胞。转染后两天，收集上清，按照以上描述的ELISA测定可溶的TNF。此数据表明TNF嵌合物的接头结构域的改变并不影响这些构建物的稳定性。
6.用嵌合TNF治疗预先建立的鼠WEHI164肿瘤
(图11)表明在具有预先建立的WEHI164肿瘤的鼠中，肿瘤内注射编码β-半乳糖苷酶(LacZ)、野生型TNF或者嵌合CD154:TNF的腺病毒后，具有肿瘤的鼠的百分数。简要的说，Balb/c鼠用3×106个WEHI164细胞进行皮下接种，用10天的时间形成肿瘤节。肿瘤接种后的第10、12和14天，将5×108噬斑形成单位(pfu)的病毒通过肿瘤内注射转入。然后每周监视肿瘤情况。当肿瘤直径大于2cm时无痛处死动物。此数据表明，用嵌合CD154:TNF处理的鼠中有75％完全消退了肿瘤，与之相比，用野生型TNF处理的鼠中只有50％消退了肿瘤，而用对照的腺病毒(Ad-Laz)处理的鼠中没有出现肿瘤的消退。此数据表明嵌合TNF具有针对肿瘤的治疗活性，而且活性高于wtTNF。
虽然优选的实施方案已经被描述和说明，但是对于本领域普通技术人员来说很明显的是，可以进行许多改变而不脱离本发明的精神或范围。除了受所附的权利要求和权利要求的法定等效物限制外，本发明并不受其它限制。
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<400>1
atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc      60
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cgcatcgccg tctcctacca gaccaaggtc aacctcctct ctgccatcaa gagcccctgc     600
cagagggaga ccccagaggg ggctgaggcc aagccctggt atgagcccat ctatctggga     660
ggggtcttcc agctggagaa gggtgaccga ctcagcgctg agatcaatcg gcccgactat     720
ctcgactttg cggagtctgg gcaggtctac tttggaatca ttgctctgtg a              771
<210>2
<211>580
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物，包括与hCD70的结构域I、II和III连接的hTNFα结构域IV
<400>2
atgccggagg agggttcggg ctgctcggtg cggcgcaggc cctatgggtg cgtcctgcgg    60
gctgctttgg tcccattggt cgcgggcttg gtgatctgcc tcgtggtgtg catccagcgc   120
ttcgcacagg ctgcggatcc tgtagcccat gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag   180
ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat   240
aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg tacctcatct actcccaggt cctcttcaag   300
ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc   360
tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc   420
ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat gagcccatct atctgggagg ggtcttccag   480
ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag atcaatcggc ccgactatct cgactttgcg   540
gagtctgggc aggtctactt tggaatcatc gctctgtgaa                         580
<210>3
<211>837
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物，包括与hFasL的结构域I、II和III连接的hTNFα结构域IV
<400>3
atgcagcagc ccttcaatta cccatatccc cagatctact gggtggacag cagtgccagc    60
tctccctggg cccctccagg cacagttctt ccctgtccaa cctctgtgcc cagaaggcct   120
ggtcaaagga ggccaccacc accaccgcca ccgccaccac taccacctcc gccgccgccg   180
ccaccactgc ctccactacc gctgccaccc ctgaagaaga gagggaacca cagcacaggc   240
ctgtgtctcc ttgtgatgtt tttcatggtt ctggttgcct tggtaggatt gggcctgggg   300
atgtttcagc tcttccacct acagaaggag ctggcagaac tccgagagtc taccagccag   360
atgcacacag catcatcttt ggagaagcaa gcggatcctg tagcccatgt tgtagcaaac   420
cctcaagctg aggggcagct ccagtggctg aaccgccggg ccaatgccct cctggccaat   480
ggcgtggagc tgagagataa ccagctggtg gtgccatcag agggcctgta cctcatctac   540
tcccaggtcc tcttcaaggg ccaaggctgc ccctccaccc atgtgctcct cacccacacc   600
atcagccgca tcgccgtctc ctaccagacc aaggtcaacc tcctctctgc catcaagagc   660
ccctgccaga gggagacccc agagggggct gaggccaagc cctggtatga gcccatctat   720
ctgggagggg tcttccagct ggagaagggt gaccgactca gcgctgagat caatcggccc   780
gactatctcg actttgcgga gtctgggcag gtctactttg gaatcattgc tctgtga      837
<210>4
<211>813
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合DNA构建物，包括与hTRAIL的结构域I、II和III连接的hTNFα结构域IV
<400>4
atggctatga tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg    60
atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac   120
gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa   180
gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc   240
aagtggcaac tccgtcagct cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt   300
tctacagttc aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtcctcag   360
agagtagcgg atcctgtagc ccatgtgtta gcaaaccctc aagctgaggg gcagctccag   420
tggctgaacc gccgggccaa tgccctcctg gccaatggcg tggagctgag agataaccag   480
ctggtggtgc catcagaggg cctgtacctc atctactccc aggtcctctt caagggccaa   540
ggctgcccct ccacccatgt gctcctcacc cacaccatca gccgcatcgc cgtctcctac   600
cagaccaagg tcaacctcct ctctgccatc aagagcccct gccagaggga gaccccagag   660
ggggctgagg ccaagccctg gtatgagccc atctatctgg gaggggtctt ccagctggag   720
aagggtgacc gactcagcgc tgagatcaat cggcccgact atctcgactt tgcggagtct   780
gggcaggtct actttggaat cattgctctg tga                                813
<210>5
<211>256
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO：1的DNA序列编码的嵌合TNFα多肽
<400>5
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
            20                  25                  30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
        35                  40                  45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
    50                  55                  60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
                85                  90                  95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Val
            100                 105                 110
Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu
        115                 120                 125
Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp
    130                 135                 140
Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
145                 150                 155                 160
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
                165                 170                 175
His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu
            180                 185                 190
Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala
        195                 200                 205
Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln
    210                 215                 220
Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
225                 230                 235                 240
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
                245                 250                 255
<210>6
<211>192
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO：2的DNA序列编码的嵌合TNFα多肽
<400>6
Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly
1               5                   10                  15
Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile
            20                  25                  30
Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Ala Asp Pro Val
        35                  40                  45
Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu
    50                  55                  60
Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp
65                  70                  75                  80
Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
            85                      90                  95
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
            100                 105                 110
His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu
        115                 120                 125
Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala
    130                 135                 140
Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln
145                 150                 155                 160
Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
                165                 170                 175
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
            180                 185                 190
<210>7
<211>278
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQIDNO：3的DNA序列编码的嵌合TNFα多肽
<400>7
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
1               5                   10                  15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
            20                  25                  30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
        35                  40                  45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
    50                  55                  60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
65                  70                  75                  80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
                85                  90                  95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
            100                 105                 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
        115                 120                 125
Lys Gln Ala Asp Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu
    130                 135                 140
Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu
                165                 170                 175
Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser
            180                 185                 190
Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr
        195                 200                 205
Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg
    210                 215                 220
Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu
                245                 250                 255
Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr
            260                 265                 270
Phe Gly Ile Ile Ala Leu
        275
<210>8
<211>270
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>由SEQ ID NO：4的DNA序列编码的嵌合TNFα多肽
<400>8
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
1               5                   10                  15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
            20                  25                  30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
        35                  40                  45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
    50                  55                  60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65                  70                  75                  80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
                85                  90                  95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
            100                 105                 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Asp Pro Val Ala His
        115                 120                 125
Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
    130                 135                 140
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln
145                 150                 155                 160
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu
                165                 170                 175
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
            180                 185                 190
Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
        195                 200                 205
Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
    210                 215                 220
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu
225                 230                 235                 240
Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
                245                 250                 255
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
            260                 265                 270

Claims (21)

1.编码嵌合TNFα配体多肽的核酸分子，包括第一多核苷酸和第二多核苷酸，第一多核苷酸编码CD154的结构域III片段，该片段缺乏存在于野生型CD154分子的结构域III上的间质金属蛋白酶识别位点，第二多核苷酸编码TNFα蛋白质的结构域IV片段，该片段结合TNFα受体但缺乏存在于野生型TNFα分子的结构域IV上的间质金属蛋白酶识别位点。
2.权利要求1所述的核酸分子，进一步包括第三多核苷酸，其编码CD154的结构域II。
3.权利要求1或权利要求2所述的核酸分子，进一步包括第四多核苷酸，其编码CD154的结构域I。
4.权利要求1、2或3所述的核酸分子，其中所述第一多核苷酸进一步编码间质金属蛋白酶识别位点，该位点从所述第二多核苷酸编码的结构域IV片段缺失。
5.权利要求1所述的核酸分子，进一步包括编码至少一个氨基酸的肽的接头结构域，该接头结构域连接所述第一多核苷酸和第二多核苷酸。
6.权利要求1所述的核酸分子，包括SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列。
7.权利要求4所述的核酸分子，包括SEQ.ID.NO.5的核苷酸序列。
8.嵌合TNFα配体多肽，包含CD154的结构域III片段和TNFα蛋白质的结构域IV片段，该CD154的结构域III片段缺乏存在于野生型CD154分子的结构域III上的间质金属蛋白酶识别位点，该TNFα蛋白质的结构域IV片段结合于TNFα受体但缺乏存在于野生型TNFα分子的结构域IV上的间质金属蛋白酶识别位点。
9.权利要求8所述的嵌合TNFα，进一步包括CD154的结构域II片段。
10.权利要求8或者9所述的嵌合TNFα，进一步包括另一种肿瘤坏死因子配体的结构域I片段。
11.权利要求8、9或者10所述的嵌合TNFα，其中结构域III片段进一步包括从结构域IV片段缺失的间质金属蛋白酶识别位点。
12.权利要求8、9、10或11所述的嵌合TNFα，进一步包含编码至少一个氨基酸的肽的接头结构域，该接头结构域连接结构域III片段和结构域IV片段。
13.表达载体，包括权利要求1所述的核酸分子。
14.权利要求13所述的表达载体，进一步包括病毒DNA或者细菌DNA。
15.权利要求14所述的表达载体，其中所述的病毒DNA选自腺病毒DNA或者反转录病毒DNA。
16.基因构建物，包含根据权利要求1的核酸分子，该核酸分子有效地与启动子序列和多聚腺苷酸化作用的信号序列连接。
17.宿主细胞，包括根据权利要求13所述的表达载体或者根据权利要求16所述的基因构建物。
18.权利要求17所述的宿主细胞，其中该细胞是哺乳动物细胞。
19.权利要求17所述的宿主细胞，其中该细胞是肿瘤细胞。
20.权利要求17所述的宿主细胞，其中该细胞是抗原呈递细胞。
21.产生根据权利要求8所述的嵌合TNFα多肽的方法，包括在适于实现蛋白表达的条件下培养权利要求17所述的宿主细胞。
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