WO1997042319A1 - NOUVEAUX DERIVES DE L'ANTIGENE Fas - Google Patents

NOUVEAUX DERIVES DE L'ANTIGENE Fas Download PDF

Info

Publication number
WO1997042319A1
WO1997042319A1 PCT/JP1997/001502 JP9701502W WO9742319A1 WO 1997042319 A1 WO1997042319 A1 WO 1997042319A1 JP 9701502 W JP9701502 W JP 9701502W WO 9742319 A1 WO9742319 A1 WO 9742319A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fas antigen
antigen
novel
fas
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP1997/001502
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Norio Nakamura
Shigekazu Nagata
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Osaka Bioscience Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka Bioscience Institute filed Critical Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to US09/180,100 priority Critical patent/US6306395B1/en
Priority to EP97918354A priority patent/EP0965637B1/en
Priority to AT97918354T priority patent/ATE299936T1/de
Priority to AU26505/97A priority patent/AU2650597A/en
Priority to DE69733773T priority patent/DE69733773T2/de
Publication of WO1997042319A1 publication Critical patent/WO1997042319A1/ja
Priority to US09/949,713 priority patent/US6953847B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention provides a novel Fs antigen derivative with improved activity and the like and a novel DNA encoding the same in the field of medicine.
  • the present invention also provides a recombinant DNA molecule containing the DNA, a transformant, and a method for producing the novel Fs antigen derivative.
  • the human Fas antigen is a polypeptide present on the surface of various cells and is thought to be involved in the death of cells called apoptosis.
  • the homeostasis of living organisms is subtly controlled by the proliferation and differentiation of cells and their death, but apoptosis is the death of cells that are distinguished from necrosis (loan death) by the morphology of dying cells. It is one form of. Death of cells to maintain the homeostasis of the living body, that is, removal of cells unnecessary for the living body, virus-infected cells and tumor cells to become cytotoxic T cells (CTL) and natural killer cells (NK) ) It has been found that cell death when attacked and eliminated by cells is primarily due to apoptosis.
  • CTL cytotoxic T cells
  • NK natural killer cells
  • Fas antigen gene has been cloned.
  • Fas antigen is a type I transmembrane glycoprotein with a molecular weight of about 45 kD, and its amino acid sequence NGFR (NGF) constitutes a physiologically important group of cell surface membrane proteins.
  • Nerve growth factor receptor) ZTNF R (TNF receptor) It was found to belong to the family (Ito N. (I toh N.), etc. Ce) 1, 66, 233-243, 1 99 1 year).
  • the mouse Fas antigen gene has been cloned (Watanabe-Fukunaga R. Li temple, J.
  • Fas antigen which was originally presumed to be present on the cell surface, was also detected in blood and culture supernatant, and was found to exist as a soluble Fas antigen (sFas). There is also growing interest in the physiological functions and the like.
  • human Fas ligand is a polypeptide reported by Nagata et al. As an in vivo molecule that induces apoptosis in cells expressing the Fas antigen (Tomoh iro Tak ahashi et al., Internati on al Immunology, vol. 6, pp. 157-574, pp. 1994).
  • Human Fas ligand is a type II membrane protein belonging to the TNF family and having a molecular weight of about 40 kD, and is thought to form a trimer in vivo, similar to TNF (Masato Tanaka). Et al., EMB OJ ournal, Vol. 14, Vol. 11, pp. 119- pp. 1995).
  • Human Fas ligand is rat Fas ligand (Takashi Suda et al., Ce11, 75 vol., 1169-178, pp. 1993) and mouse Fas ligand. Gand (Tomohiro Takahashi et al., Cell, 76, 969-976, 1994) and a high homologous region in the extracellular region, and a human Fas ligand. Can recognize mouse Fas antigen as well as human Fas antigen and induce apoptosis. Conversely, rat and mouse Fas ligands can also recognize and recognize human Fas antigens and induce apoptosis.
  • Fas antigens and Fas ligands have homology between different species and have It is thought that apoptosis via Fas ligand-Fas antigen plays a very important role in maintaining homeostasis of the living body, as well as its ability to be conserved both operatively and operatively.
  • Fas ligand gene is mutated, and Fas ligand of g 1 d mice induces apoptosis.
  • This mutation is a point mutation in the gene, and as a result, the seventh amino acid counted from the C-terminus of the extracellular region of the Fas ligand is changed to another amino acid.
  • Such gld mouse Fas ligand is unable to bind to the Fas antigen (Fred Rams dell et al., Eur. J. Immunol, 24, 928-933, 1994).
  • Fas ligand apoptosis by Fas ligand is involved in viral fulminant hepatitis, etc. (Nagata S. et al., Immunol. To day, 16: 39-43, 1999). 5 years).
  • Fas antigen apoptosis mediated by the Fas antigen and the disease becomes evident, it has become important to treat diseases associated with apoptosis abnormalities, that is, the above-mentioned autoimmune diseases, rheumatism, AIDS, etc. It has been expected to apply a Fas ligand or a Fas antigen.
  • substances that suppress apoptosis via the Fas antigen include, for example, ⁇ -type Fas antigen, and the extracellular region of the Fas antigen and the Fc region of immunoglobulin G (IgG). Fusion proteins, and fragments of anti-Fas antibodies (Dhein J. et al., Nature, Vol. 373, pp. 438—441, pp. 1995) Years) and anti-Fas antagonist antibodies, etc. (A1 ders om MA, etc., Int. Immuno 1.6, 179-9-186, pp. 1994) ).
  • IgG immunoglobulin G
  • the Fas antigen is isolated, apoptosis is induced in the living body via the Fas antigen, and apoptosis via the Fas antigen is associated with various diseases. Therefore, substances that regulate apoptosis via the Fas antigen are considered to be useful in the prevention, treatment and diagnosis of diseases in which apoptosis is expected to be involved.
  • the usefulness of pharmaceuticals in vivo must be considered in terms of activity, pharmacokinetics, stability, side effects, etc., but particularly highly active substances can be effective in vivo at low doses. This is expected, and its industrial utility is high.
  • Fas antigen derivatives particularly more active Fas antigen derivatives
  • elucidation of their properties when considering in vivo applications such as human therapy, New Fas antigen derivatives that can regulate Fas antigen-mediated apoptosis at lower doses are desired in terms of efficacy and safety.
  • Fas antigen derivatives it is also important to obtain novel Fas antigen derivatives to elucidate the interaction between the Fas antigen and the Fas ligand, and the mechanism of apoptosis via the Fas antigen.
  • polypeptides have activity even if they are a part of the polypeptide, provided that the structure of the active site is preserved.
  • An object of the present invention is to provide a novel Fs antigen derivative with improved activity and the like and a novel DNA encoding the same in the field of medicine.
  • the present invention also provides a recombinant DNA molecule containing the DNA and a transformant, and a method for producing the novel Fs antigen derivative. Disclosure of the invention
  • the present inventors have found that a novel Fas antigen derivative in which a specific number of N-terminal amino acid residues of the Fas antigen has been deleted is a conventional Fas antigen or The present inventors have found that the activity or function is improved as compared with the Fas antigen derivative, and completed the present invention after diligent efforts.
  • the first aspect of the present invention provides a novel Fas antigen derivative, and at least an amino acid from the N-terminal amino acid residue to the most N-terminal cysteine residue of the Fas antigen polypeptide.
  • a novel Fs antigen comprising at least a part or all of a Fs antigen extracellular domain polypeptide in which at least one amino acid residue among the residues (excluding the cysteine residue) is deleted.
  • An antigen derivative is provided.
  • a part or all of the Fas antigen extracellular domain polypeptide in which at least one of the first to fourth amino acid residues counted from the N-terminal of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing has been deleted is deleted.
  • New Fas antigen derivative containing, the number of deleted amino acid residues
  • novel Fas antigen variant comprising one or two or more portions of a Fas antigen, and at least one of the novel Fas antigen variants and other (poly) peptides
  • novel Fas antigen derivative which is a fusion polypeptide containing at least one (poly) peptide selected from the group consisting of the following a and b on the C-terminal side of the antigen derivative.
  • the present invention provides a novel Fs antigen derivative which is a multimer of the novel Fs antigen derivative.
  • a second aspect of the present invention is a DNA comprising a DNA sequence encoding the novel Fas antigen derivative, in particular, a DNA sequence described in SEQ ID NOS: 12 to 14 in the sequence listing. DNA containing the same is provided.
  • a third aspect of the present invention provides a recombinant DNA molecule comprising the DNA base sequence.
  • a fourth aspect of the present invention provides a transformant characterized by being transformed with the novel recombinant DNA molecule.
  • a fifth aspect of the present invention is characterized in that the method for producing a novel Fas antigen derivative comprises a step of culturing the transformant, and recovering and purifying the novel Fas antigen derivative from the culture mixture. And a method for producing the novel Fas antigen derivative.
  • a sixth aspect of the present invention provides a medicament comprising the novel Fas antigen derivative of the first aspect or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • At least one of the amino acid residues (excluding the cysteine residues) from the N-terminal amino acid residue to the most cysteine residue from the N-terminus of the Fas antigen is deleted.
  • a method for improving the activity or function of a Fas antigen or a Fas antigen derivative is deleted.
  • a known human Fas antigen contains a cDNA sequence (SEQ ID NO: 16) as shown in FIGS. 1 and 2 and an amino acid sequence deduced therefrom. Then, a signal peptide consisting of 16 residues is cleaved from the amino acid sequence to be present as a type I transmembrane protein consisting of 319 amino acids, and an extracellular region of 157 amino acids ( (Residues 107-157), transmembrane region of 17 amino acids (residues 158-174) and intracellular region of amino acids 144 (residues 175-319) ).
  • the extracellular region of the human Fas antigen has the function of binding to the Fas ligand, but the polypeptide that expresses only the extracellular region exists in a soluble form and binds to the Fas ligand. It has more apoptosis inhibitory activity. According to a computer analysis by the present inventors and the like described in detail below, it is possible that the cysteine residue at the 43rd position counted from the N-terminus forms some kind of bond with another amino acid residue. Yes, it is thought to contribute to the maintenance of the domain structure of the extracellular region of the Fas antigen necessary for binding to the Fas ligand.
  • FIG. 1 is a diagram showing the nucleotide sequence of DNA encoding human Fas antigen and the amino acid sequence deduced therefrom.
  • the asterisks indicate possible N-glycosylation sites, and the underline indicates the expected transmembrane region.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the human Fs antigen and the amino acid sequence deduced therefrom.
  • the asterisks indicate possible N-glycosylation sites, and the underlined portions indicate the expected transmembrane regions.
  • FIG. 3 shows a portion in a vector containing the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 17) of cDNA encoding shFas (nd29), which is one of the novel Fas antigen derivatives according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence and an amino acid sequence deduced therefrom. * Indicates possible N-glycosylation sites.
  • FIG. 4 shows a vector containing the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 18) of cDNA encoding shFas (nd29) Fc, which is one of the novel Fas antigen derivatives of the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a partial base sequence and an amino acid sequence deduced therefrom. * Indicates possible N-glycosylation sites.
  • FIG. 5 shows a vector containing a cDNA base sequence (SEQ ID NO: 19) encoding sh Fas (nd 29) -hinge, which is one of the novel Fas antigen derivatives of the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a partial base sequence of No. and an amino acid sequence deduced therefrom. * Indicates possible N-glycosylation sites.
  • Figure 6 shows the gel electrophoresis of shFas (nd 29) -Fc and hFas-Fc. It is a drawing substitute photograph shown.
  • FIG. 7 is a drawing substitute photograph showing the gel electrophoresis of shFas (nd 29) -hinge before gel filtration chromatography.
  • FIG. 8 is a drawing-substituting photograph showing gel electrophoresis of shFas (nd29) -hinge after gel filtration chromatography.
  • Fig. 9 is a diagram showing hF a s-F c and sh F a s (n d 29) -F c for producing apoptosis.
  • FIG. 10 is a graph showing the inhibitory effects of hFas-Fc and shFas (nd29) -Fc on cell apoptosis.
  • FIG. 11 is a graph showing the inhibitory effects of hFas-Fc and shFas (nd29) -hinge on cellular apoptosis.
  • FIG. 12 is a graph showing the inhibitory effect of hFas-Fc and shFas (nd29) hinge on cellular apoptosis.
  • FIG. 13 are diagrams showing the GOT and GPT elevation inhibitory effects of hFas_Fc and shFas (nd29) -one Fc.
  • FIG. 14 are diagrams showing the GOT and GPT elevation inhibitory effects of hFas-Fc and shFas (nd29) -hinge.
  • FIG. 2 is a schematic diagram comparing the amino acid sequences of shF as (nd29) —hinge.
  • a novel polypeptide containing an amino acid sequence means the following.
  • the first means that the novel polypeptide may be one defined by the amino acid sequence, and the second is the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence in addition to the amino acid sequence. This means that any one or both of them may be obtained by adding one or more amino acids, and the novel polypeptide may be a fusion polypeptide or two or more functional regions.
  • a polypeptide containing it means that any one or more amino acids may be added (inserted) between the fusion points or functional regions.
  • a polypeptide containing at least a part of an amino acid sequence refers to a novel polypeptide containing the entire amino acid sequence and any length contained in the amino acid sequence. Means a polypeptide comprising the sequence of any of the following moieties.
  • Fas antigen derivative or “Fas antigen derivative polypeptide” refers to a polypeptide containing at least a part of the Fas antigen. , A Fas antigen variant, a fusion polypeptide of a Fas antigen or a Fas antigen variant and another (poly) peptide, and a multimer thereof, etc., other than a (poly) peptide And those containing the compound of formula (1).
  • Fas antigen variant or “Fas antigen variant polypeptide” A polypeptide consisting of a part of the original or two or more parts, which basically does not contain (poly) peptides derived from other than the Fas antigen, and has less activity or function possessed by the Fas antigen A truncated form of the Fas antigen and a mutant in which at least one amino acid of the Fas antigen has been deleted or substituted (deleted or substituted, respectively).
  • Fas antigen extracellular domain Fas antigen (FasATM) lacking transmembrane domain such as ⁇ -type Fas antigen, and Fas antigen lacking intracellular domain are included. Is done.
  • a “fusion polypeptide” is a polypeptide in which two or more (poly) peptides in a non-naturally occurring combination are directly or indirectly, preferably directly, chemically bonded, preferably peptide-bonded.
  • the “N-terminal region” of the Fas antigen is exemplified by the human Fas antigen (FIGS. 1 and 2).
  • a signal peptide from the 16th Met in FIG.
  • the amino acid residue derived from the first A1a is also included, in the novel Fas antigen derivative of the present invention, in particular, the N-terminal amino acid residue (Arg) of the Fas antigen from which the signal peptide has been removed Means the region starting from the N-terminal amino acid residue (Arg) to the amino acid residue (42nd Phe) immediately before the first cysteine residue (43rd).
  • “Activity or function” is derived from physicochemical properties such as Fas ligand binding activity, biological activity such as apoptosis inhibitory activity or apotones-inducing activity as described below, stability, pharmacokinetics, and solubility. Among them, the action on the Fas ligand binding activity and the apoptosis is preferable.
  • CT / JP97 / 01502 tumor suppressive activity is particularly preferred.
  • “having improved activity or function” means that at least one activity or the like is compared with a polypeptide not lacking the corresponding N-terminal region (non-deleted N-terminal region). Is at least large, for example, 1.4 times or more, preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, further preferably 5 times or more, and particularly preferably 10 times or more.
  • a general method is used for comparing the activity values and the like, but the comparison can be made based on the activity amount per unit amount, that is, the specific activity.
  • the specific activity is determined by conventional 50% inhibitory concentration (IC.,) Or 50% effective dose (ED 5.) And the like.
  • the novel Fas antigen derivative according to the first aspect of the present invention comprises at least an amino acid residue from the N-terminal amino acid residue to the most cysteine residue from the N-terminus of the Fas ⁇ original polypeptide.
  • a part or all of the polypeptide of the extracellular domain of the Fas antigen from which at least one amino acid residue has been deleted and the novel Fas antigen derivative of the present invention have the ability to bind at least the Fas ligand. .
  • the origin of the Fas antigen from which one or more amino acid residues are to be deleted is not particularly limited, but may be a mammalian Fas antigen, particularly a human Fas antigen, for example, as shown in FIGS. 1 and 2. Those containing the amino acid sequence of the known human Fas antigen shown are preferred.
  • the novel Fas antigen derivative of the present invention has SEQ ID NO: 15 (human A novel Fas antigen derivative in which at least one of the first to fourth amino acid residues counted from the N-terminus of the Fs antigen extracellular region) has been deleted, preferably the number of deleted amino acid residues is two A novel Fas antigen derivative having 9 or more, particularly preferably 29 amino acid residues deleted.
  • the amino acid to be deleted may be continuous or non-continuous on the amino acid sequence, but is preferably continuous, and in this case, it is more preferable to delete preferentially from the N-terminal side. preferable. That is, a new Fas starting from the 30th Thr residue, with the deletion of the 29th amino acid residues from the 1st to the 29th from the N-terminus of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing Antigen derivatives are particularly preferred.
  • the number and position of amino acid residues in the N-terminal region that are desirably deleted refer to the results of a three-dimensional structural analysis of the Fas antigen extracellular region and the like as described in detail in the Examples.
  • the N-terminal region structure of the Fas antigen is designed so as not to cause steric hindrance in binding to the Fas ligand, thereby optimizing or regulating the binding strength to the Fas ligand. It is possible.
  • the N-terminal region of the Fas antigen may be susceptible to degradation by protease or the like due to its structural characteristics.
  • the processing of the polypeptide varies qualitatively or quantitatively depending on the host, and when the N-terminal region is deleted, these points and solubility and stability can be taken into consideration.
  • the amino acid residues preferably deleted from the N-terminal region are preferably 13 or 18 or more, more preferably 23 or more, and It is preferably at least 29, in each case from the N-terminus. It is preferable that the 36th to 42nd amino acid residues are not deleted.
  • novel Fas antigen derivative of the present invention includes amino acid residues in the N-terminal region, particularly, in the case of a human Fas antigen, the first to fourth amino acids from the N-terminal of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.
  • a novel Fas antigen derivative which is a novel Fas antigen variant comprising one or more portions of a Fas antigen having 29 amino acid residues deleted.
  • the Fas antigen mutant of the present invention has, on its C-terminal side, a polypeptide of residues 158 to 174 of FIGS. 1 and 2, and a residue of residues 175 to 319 of FIGS. Or a polypeptide containing the polypeptide of residues 158 to 319, of any length obtained from the polypeptide of residues 158 to 319. Also included are those obtained by combining arbitrary fragments in any order at the C-terminal or N-terminal, preferably C-terminal side of the Fas antigen mutant.
  • a preferred novel Fas antigen variant in which the number of deleted amino acid residues is 29 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (shFas (nd29)) in the sequence listing. More preferably, it is composed of the amino acid sequence.
  • the novel Fas antigen derivatives include conjugates with other chemicals, such as (poly) peptides, sugar chains, lipids or other high or low molecular weight compounds, among which other (poly) Preference is given to fusion polypeptides with polypeptides.
  • the (poly) peptide is not limited at all, and may include two or more (poly) peptides. In this case, the binding order of the two or more (poly) peptides may be changed, It may contain other than amino acids.
  • the type of bond between the essential novel F a s antigen variant and another chemical substance is not particularly limited, and includes both covalent bond and non-covalent bond, but a covalent bond is preferred from the viewpoint of bond stability.
  • the other chemical substance is a (poly) peptide
  • the peptide binding power is preferable.
  • the binding site can also be appropriately selected, and any of the N-terminus, C-terminus, and side chain of the novel Fas antigen mutant can be used as the binding site. Both, more preferably via the C-terminus.
  • the (poly) peptide is preferably a (poly) peptide having an action of improving or modifying the activity or function of the new Fas antigen derivative.
  • examples include those that enhance stability or half-life in blood, or those that increase accumulation in specific tissues, cells, or other specific sites, such as Fc fragments to increase blood half-life. Is mentioned. (Poly) peptides and the like having a function such that the novel Fas antigen derivative becomes a multimer are particularly preferred.
  • Examples of (poly) peptides that can be multimerized include all or part of the constant region of the immunoglobulin heavy and light chains, all or part of the heavy chain constant region excluding the first region (CH 1), or F All or part of the c fragment (in the case of IgG, consisting of hinge, CH2, and CH3 regions) (for example, each region of hinge region, CH2 region, CH3 region, or CH4 region) Or a combination of at least one part of the P, c fragment and at least one part of the hinge region, and at least one cysteine residue in the hinge region.
  • a portion of the hinge region including the entirety of the hinge region, or an Fc fragment including the portion of the hinge region or the CH3 region (in the case of IgM and IgE, the CH4 region) and the portion of the hinge region.
  • an Fc fragment including the portion of the hinge region or the CH3 region (in the case of IgM and IgE, the CH4 region) and the portion of the hinge region.
  • the entire or partial Fc fragment including the entire region, and the hinge region itself.
  • the iminoglobulin in this case may be of any origin, but is preferably of human origin.
  • the class and subclass are not necessarily limited, and any of IgG KI gG2, IgG3, IgG4, IgAUI gA2, IgM, IgE and IgD can be used.
  • IgG is a preferred example.
  • a novel Fas antigen derivative containing an Fc fragment or the like usually forms a 10-mer when the class derived from the power ⁇ that can form a dimer is IgM, and a tetramer when the class derived from IgA is IgM. Things are also included.
  • the constant region of immunoglobulin is important for various functions of an antibody molecule which are not directly involved in the antigen specificity of the antibody. For example, there are complement binding and activation, binding to Fc receptor (FcR), induction of ADCC activity, placental passage, granule release reaction of mast cells, and protein A reactivity.
  • FcR Fc receptor
  • the binding of the novel Fas antigen variant to another (poly) peptide or the like in the novel Fas antigen derivative is preferably direct, but may be indirect. May be linked via a peptide linker or an appropriate chemical spacer that does not significantly impair the activity or function of the enzyme.
  • the activity or function of the novel F ss antigen derivative of the present invention is further improved by multimerization.
  • the multimer includes all dimers or more, but is preferably 2 to 10, more preferably 2 or 3, and particularly preferably dimer. Further, both homopolymers and heteropolymers are included, but homopolymers are more preferable.
  • the multimerizing property of the (poly) peptide which can itself multimerize it is preferable to use the multimerizing property of the (poly) peptide which can itself multimerize. It is a particularly preferable method to use the above-mentioned multimerizing properties of the immoglobulin constant region or a portion thereof (for example, Fc fragment and hinge region).
  • a peptide or a polypeptide containing the peptide may be used.
  • an intracellular region such as a Fs antigen or TNF-R can also be used.
  • the bond between the monomers in the multimer may be any bond, preferably a covalent bond (eg, a disulfide bond or a peptide bond), but a non-covalent bond (eg, between the two CH 3 regions of immunoglobulin, Alternatively, binding between the intercellular region of the Fas antigen or TNF-R) may be used.
  • a covalent bond eg, a disulfide bond or a peptide bond
  • a non-covalent bond eg, between the two CH 3 regions of immunoglobulin, Alternatively, binding between the intercellular region of the Fas antigen or TNF-R
  • cysteine After introducing cysteine to the C-terminal, cross-linking using two types of activated linkers I do.
  • the introduction of cysteine includes cysteine amide and carboxypeptidase
  • Y There is a method using Y. If the C-terminal amino acid is lysine, apply lysine endopeptidase. If free cysteine is present, protect it by alkylation before introducing the cysteine to the C-terminal. Thereafter, cross-linking is performed using an activated linker.
  • divalent cross-linking reagents include N, N'-10-phenylenedimaleimide (Glennie et al., J. Immuno 1.1.139, 2367-237375).
  • trivalent crosslinking reagents tris-malein imide compounds (Japanese Patent Laid-Open No. 6-22891) have been used to crosslink antibodies.
  • the present invention is also applicable to the novel Fas antigen derivative, and can form a dimer or a trimer, respectively.
  • biotin After introducing biotin to the C-terminal, crosslink with avidin or the like.
  • biotinamide to introduce C-terminal as well as cysteine.
  • Avidin cross-links form tetramers, but depending on the reaction conditions, high-level aggregates are formed. Also, other functional polypeptides and the like can be bound.
  • the binding between biotin and avidin is an example of a strong non-covalent bond.
  • Cross-linking is performed using a cross-linking reagent specific for the cysteine, thiol, or amino group present in the novel Fs antigen derivative sequence or in the (poly) peptide or the like bound thereto.
  • peptide or chemical linkers or spacers of appropriate length can be used.
  • novel Fas antigen derivative can be liposomalized according to a known method by including a lipid-soluble substance such as a lipid or a hydrophobic peptide.
  • a lipid-soluble substance such as a lipid or a hydrophobic peptide.
  • the novel Fas antigen derivative of the present invention containing the transmembrane region of the Fas antigen can itself be incorporated into ribosomes or the like. These liposomes are highly multimeric and can be applied to specific cells or tissues by appropriate modification.
  • novel Fas antigen derivatives of the present invention which have multimerization ability include SEQ ID NOs: 10 (sh Fas (nd 29) — hinge) and 11 (sh Fas) in the sequence listing. (nd29) -Fc), and more preferably an amino acid sequence comprising the amino acid sequence.
  • the dimer improved its activity by deleting 29 amino acid residues from the N-terminus of the extracellular region of human Fas antigen Very high Fas ligand binding activity and apoptosis inhibitory activity by dimerizing the Fas antigen derivative of the present invention without diminishing the improved activity even when dimerizing the Fas antigen derivative of the present invention. Having.
  • polypeptides have different amino acid sequences due to mutations that occur in the course of evolution, while having essentially the functions inherent in the polypeptide due to differences in species or individuals.
  • the mutation in the amino acid sequence means 1) deletion of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the polypeptide, 2) substitution with another amino acid residue, 3) the above Insertion or addition of one or more amino acid residues at any position in the amino acid sequence.
  • Such a mutation can also be artificially generated using genetic engineering techniques, and a polypeptide having such a mutation is also included in the novel Fas antigen derivative of the present application.
  • a novel Fas antigen derivative has a methionine residue or signal peptide at the N-terminus. It may be one to which one or more amino acid residues derived from or derived from propeptide have been added.
  • the novel F ss antigen derivative according to the first aspect of the present invention may have undergone some modification as long as its characteristics are not lost. Modifications include the translational or post-translational modifications and chemical modifications of polypeptides that would normally be experienced by a native protein. Natural modifications include, for example, addition of sugar chains, and N-glycosylation, 0-glycosylation, and non-enzymatic glycosylations are known as sugar additions to proteins.
  • the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the invention may or may not have any sugar chains.
  • the novel Fas antigen derivative of the present invention may have an N glycosylation site.For example, 29 N-terminal region amino acid residue-deleted Fas antigen extracellular region has two N It has a glycosylation site. Therefore, the novel Fs antigen derivative may have a sugar chain depending on the host that produces it. That is, the above-mentioned protein produced when eukaryotic cells such as animal cells and yeast are used as a host has a sugar chain in the above-mentioned N-glycosylation site, and is used when a prokaryotic cell such as Escherichia coli is used as a host. It is considered to have no sugar chain.
  • the number, length, or sugar composition and sequence of sugar chains are not particularly limited, because they vary depending on the composition of the medium used for culturing the host. Other natural modifications include lipid binding, etc.
  • Modifiable sites include N-terminal or C-terminal amino acid residues or side chain functional groups.
  • polyethylene glycol, styrene male Synthetic polymers such as formic acid copolymers, dextrans, pyrancopolymers, and polylysines; natural molecules such as lipids, polysaccharides and (poly) peptides; physiologically active molecules such as hormones; and inorganic substances such as magnetite, etc. Sci. USA, 84, 1487-11491 (1989); Biooch em istry, 28 Vol., 66 19-66, 624 (1 989)).
  • modified derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxyl groups, amides of carboxyl groups by reaction with ammonia or primary or secondary amines, and residues of acyl groups (eg, alkanoyl or carboxylaroyl groups).
  • acyl groups eg, alkanoyl or carboxylaroyl groups.
  • novel Fs antigen derivative of the present invention can also be modified as described above by a combination of known methods as described above. Therefore, the novel F ss antigen derivative of the present invention includes those modified as long as the characteristics of the polypeptide of the first aspect of the present invention are not lost. Further, by such modification, the activity or function of the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the present invention can be modified or improved, another activity or function can be imparted, or a combination thereof can be provided. For example, the activity or function may include stability, solubility, pharmacokinetics or directivity to a particular cell, tissue or organ. Novel F a s antigen derivatives having such modifications are also included in the scope of the present invention.
  • the novel Fas antigen derivatives of the present invention also include those present in the form of salts.
  • the “salt” means both a salt of a carboxyl group of a protein molecule and an acid addition salt to an amino group.
  • Salts of carboxyl groups are formed by methods well known in the art and include inorganic salts such as sodium, calcium, ammonium, trivalent iron or zinc salts, and organic salts such as triethanolamine, arginine. Alternatively, it includes salts formed by lysine, piperidine, proforcein and the like.
  • Acid addition salts include, for example, salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids, such as acetic acid or oxalic acid.
  • novel F ss antigen derivative of the present invention can be applied to medicines, in such a case, it is desirable that the above-mentioned modification and the like maintain pharmaceutically acceptable properties.
  • the method for producing the novel Fas antigen derivative according to the first embodiment is not particularly limited, and may be a product isolated and purified from a natural product, and a commonly used chemical synthesizer (peptide synthesizer 43 OA) (Perkin-Elma Japan), etc., or may be obtained by genetic recombination.
  • polypeptides separated and purified therefrom are obtained by deletion or fragmentation by appropriate chemical treatment, for example, treatment with an enzyme, and those obtained by chemically binding them. It may be multimerized. That is, monomers among the novel F ss antigen derivatives of the present invention are also useful as intermediates or intermediate materials for producing multimers.
  • Example 1 Plasmid pM1097 encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing and contains the DNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 and the DNA encoding the signal peptide of the Fas antigen .
  • COS-1 cells were transformed with an appropriate vector, for example, an expression vector prepared by recombination into a plasmid pM1103 in which the dhfr gene was recombined with pEF-BOS shown in the Examples.
  • the shFas (nd 29) was obtained from the culture supernatant of the obtained transformant.
  • apoptosis-suppressing activity can be examined by measuring the rate of inhibition of apoptosis of Fas antigen-expressing cells.
  • the target Fas antigen-expressing cells can be obtained by transforming a cultured cell line or transformed cells that express the Fas antigen, and transforming the effector cells to express the Fas ligand.
  • Cell or Fs ligand Using soluble Fs ligand such as extracellular region, 51 Cr release assay or MTT assay (Mosman T., J. Immunol. Methods, vol. 65) , 55-63, 1983). The specific method is shown in the examples.
  • the novel Fas antigen derivative has an apoptosis inhibitory activity on WC8 cells obtained by transforming mouse WR19L to express human Fas antigen, and has a corresponding N-terminal region-deficient F at least greater in activity than the as antigen (derivative), for example, 1.4 times or more, preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, more preferably 5 times or more, particularly preferably 1 time or more. 0 times or more.
  • novel Fas antigen derivative of the present invention can regulate apoptosis via a Fas antigen, it enhances or attenuates apoptosis via a Fas antigen occurring in vivo. It is useful for prevention and treatment of related diseases.
  • preferred novel Fas antigen derivative of the present invention can regulate apoptosis via a Fas antigen, it enhances or attenuates apoptosis via a Fas antigen occurring in vivo. It is useful for prevention and treatment of related diseases.
  • preferred novel Fas antigen derivative of the present invention can regulate apoptosis via a Fas antigen, it enhances or attenuates apoptosis via a Fas antigen occurring in vivo. It is useful for prevention and treatment of related diseases.
  • preferred novel Fas antigen derivative of the present invention can regulate apoptosis via a Fas antigen, it enhances or attenuates apoptosis via a Fas antigen occurring in vivo.
  • the Fas antigen derivative can inhibit the induction of apoptosis by antagonistically inhibiting the binding between the Fas ligand and the Fas antigen, it prevents apoptosis of hepatocytes etc. in severe infections such as hepatitis.
  • the Fas antigen derivative can inhibit the induction of apoptosis by antagonistically inhibiting the binding between the Fas ligand and the Fas antigen, it prevents apoptosis of hepatocytes etc. in severe infections such as hepatitis.
  • it can be used for the treatment of infectious diseases caused by viruses and their complications.
  • it can be used as a therapeutic agent for influenza, AIDS, hepatitis and the like.
  • autoimmune diseases such as cardiomyopathy, nephritis, multiple organ failure in ischemic heart diseases such as diabetes and regurgitation, organ preservation and graft-versus-host disease (GVHD) in organ transplantation, etc. It is also useful for the treatment of
  • the novel F ss antigen derivative of the present invention can be used for the detection of F s ligand since it binds to the F s ligand more specifically and with high affinity. Further, since it retains at least a part of the antigenicity possessed by the Fs antigen, it can also bind to an anti-Fas antibody, and is also effective in suppressing apoptosis by the anti-Fas antibody.
  • the novel Fas antigen derivative of the present invention is characterized by affinity chromatography. It can be used for preparing a chromatography column, and is also useful for purifying a substance that binds to a Fas antigen such as a Fas ligand.
  • a second aspect of the present invention is a DNA encoding the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the present invention.
  • DNA may mean that a certain DNA is a DNA consisting of its base sequence, and that one or more arbitrary bases are present at one or both of the 5 'end and the 3' end of the base sequence. It means that it may consist of the added sequence.
  • the novel DNA of the present invention contains the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the present invention, preferably, at least a part of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 9 to 11 in the sequence listing. Is what you do. In general, it is known that there are one to six types of triloblets (codons) of DNA encoding an amino acid depending on the type of the amino acid. Therefore, the novel Fas antigen of the first embodiment of the present invention is used.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the derivative amino acid sequence is not limited to one type.
  • the novel Fas antigen derivative according to the first aspect of the present invention preferably contains a nucleotide sequence encoding at least a part, more preferably all of the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 9 to 11 in the sequence listing.
  • any nucleotide sequence is included in the scope of the present invention.
  • the novel DNA of the present invention contains at least a part of SEQ ID NOS: 12 to 14 of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 9 to 1 in the sequence listing.
  • the DNA contains the entire base sequence of SEQ ID NOS: 12 to 14 in the sequence listing.
  • the DNA of the present invention may be cDNA, chromosomal DNA and combinations thereof, as well as cDNA containing appropriately spliced introns.
  • the DNA of the present invention is preferably cDNA because of its strength and ease of genetic engineering.
  • an RNA corresponding to the novel DNA of the present invention, or a novel DNA of the present invention DNA and RNA containing sequences complementary to DNA are also provided.
  • the novel DNA of the present invention and its complementary DNA and RNA may be complementarily bonded to each other to form a double or triple strand.
  • DNAs and RNAs containing a base sequence capable of hybridizing (hybridizing) with the novel DNA of the present invention may be bonded to each other to form a double-stranded or triple-stranded chain.
  • the nucleic acid base may have a universal base such as inosine.
  • the DNA of the second aspect of the present invention may be obtained by any method. For example, even if it is chemically synthesized or obtained from an appropriate DNA library, PCR (Polymerase) is performed using DNA containing DNA encoding the full-length or a part of the human Fas antigen as type III. (Chain Reaction) method. Alternatively, DNA or a fragment thereof obtained by these methods can be produced by annealing or ligation as necessary.
  • PCR Polymerase
  • DNA or a fragment thereof obtained by these methods can be produced by annealing or ligation as necessary.
  • the DNA of the present invention can be chemically synthesized as follows. Specifically, the DNA of the present invention is divided into fragments of about 20 to 30 bases and synthesized as a plurality of fragments using a DNA chemical synthesizer (for example, Model 394, manufactured by Applied Biosystems). Then, if necessary, the 5 'end of each fragment is phosphorylated to anneal each fragment and ligate to obtain the desired DNA.
  • a DNA chemical synthesizer for example, Model 394, manufactured by Applied Biosystems.
  • the DNA of the present invention can also be obtained by the PCR method using a genomic library or a cDNA library or the like as a type II.
  • the PCR method is used, the known nucleotide sequence and D encoding the novel Fas antigen derivative of the first embodiment of the present invention are used.
  • a sense primer and an antisense primer designed based on the base sequence of NA and the like and, if necessary, combined with a restriction enzyme recognition sequence and the like are prepared.
  • Michael A.I. Polymerase Chain React on, PCRP rotocols, aguidetomethodsandapp 1 ications (1990), Academic Publishing (Ac ad emicic Press)
  • See See
  • a typical example is described in Examples.
  • the above-mentioned DNA library is not particularly limited as long as it contains the DNA of the second embodiment of the present invention or a part thereof. Therefore, a commercially available DNA library may be used, and appropriate cells such as lymphocytes obtained from peripheral blood of humans, cell lines of humans, or hybridomas may be used if necessary. Activated with a suitable activator, cDNA may be prepared and used according to the method of Sambrook J. et al.
  • the transformant containing the DNA encoding the human Fas antigen was obtained by the applicant of the present invention from 1-3-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan. (Hereinafter referred to as the Institute of Biotechnology, Industrial Technology) under the accession number FERM BP-3826.
  • the novel DNA of the second aspect of the present invention can be used for producing the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention. By transforming a host with this recombinant DNA molecule, It can be used to produce the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the invention uniformly and in large quantities.
  • new Fas antigen derivatives will be introduced into the pharmaceutical field as the main component of therapeutic agents. Or use it as a diagnostic agent.
  • the method for producing the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the present invention using the novel DNA of the present invention will be described in the fifth aspect of the present invention.
  • the DNA of the second aspect of the present invention can be applied to gene therapy of patients who have a genetic or acquired abnormality in Fs ligand or Fs antigen-mediated apoptosis. That is, the novel DNA of the present invention is ligated to an appropriate vector and directly introduced into a living body or cells to treat and prevent the onset of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and SLE, AIDS, hepatitis, and nephritis. You can also.
  • the recombinant DNA molecule of the third embodiment is characterized by containing the novel DNA of the second embodiment of the present invention described above.
  • the novel recombinant DNA molecule of the present invention may be in any form, such as single-stranded or double-stranded, such as circular or linear, and a complex thereof, and may be appropriately selected according to the purpose. From the viewpoint of easiness of handling and incorporation into a host, it is preferably a ring, and from the viewpoint of stability and the like, it is preferably a double-stranded chain.
  • the novel recombinant DNA molecule of the present invention has the nucleotide sequence of the DNA of the second embodiment of the present invention.
  • Any one or more bases may be added to either the 5 'end or the 3' end, or both.
  • the base added here may be any base as long as it does not cause a shift in the coding frame in the novel DNA of the present invention.
  • Examples include a base sequence encoding another polypeptide, or a sequence added for the purpose of increasing the detection sensitivity when a DNA probe or the like is prepared.
  • the recombinant DNA molecule of the present invention preferably contains another nucleotide sequence as necessary, in addition to the novel DNA of the second aspect of the present invention.
  • the term "another base sequence” used herein refers to the sequence of the enhancer, the sequence of the promoter, the sequence of the ribosome binding site, the base sequence used for the purpose of amplifying the copy number of DNA, the translation initiation codon, and the signal peptide. It refers to a base sequence to be encoded, a base sequence to encode another polypeptide, a translation termination codon, a poly-A additional sequence, a splice sequence, a replication origin, a gene sequence serving as a selection marker, and the like.
  • the type of nucleotide sequence required depends on the intended use of the recombinant DNA molecule to be prepared.
  • the host cell is transformed to produce the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the present invention. Therefore, the recombinant DNA molecule is required to have at least the sequence of the translation initiation codon, termination codon, replication origin, and selection gene in addition to the novel DNA of the second embodiment of the present invention. It preferably contains a promoter sequence, and more preferably contains a promoter sequence that functions in the host. In particular, those containing a sequence encoding a signal peptide in addition to these sequences are preferable because they can transform host cells so as to secrete and express the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the present invention.
  • a recombinant DNA molecule in which a DNA containing the entire nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 12 to 14 in the sequence listing is connected downstream of a signal sequence encoding a signal peptide in an appropriate vector is prepared. And transforming it into a suitable host, the transformant obtained here During culturing, a polypeptide containing an amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 9 to 7 in the sequence listing can be secreted into the culture supernatant.
  • the signal sequence to be connected can be appropriately selected, but is preferably a signal sequence encoding a signal peptide of a Fas antigen, particularly a human Fas antigen, and the human Fs shown in FIG. 1 or FIG.
  • An example is a signal sequence encoding a signal peptide of an as antigen.
  • the signal peptide of TNF or G—CSF, the signal peptide of Escherichia coli lipophosphatase, the signal peptide of yeast PH 01 and the signal of ⁇ -factor 1 ( ⁇ —fact 0 r) in yeast Appropriate ones can be selected and used depending on the host used and conditions from sequences encoding the peptide.
  • selectable marker gene examples include an ampicillin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a neomycin resistance gene, a thymidine kinase gene, and the like.
  • a novel recombinant DNA molecule containing at least two selectable markers includes yeast and yeast.
  • yeast When a mammalian cell is used as a host, it is preferable because a clone transformed with the target gene can be easily selected.
  • a sequence used for the purpose of amplifying the copy number a sequence of a dehydrofolate reductase gene (dhfr) or the like can be used.
  • the promoter sequence that functions in the host is a trp promoter or 1 ac promoter when the host is Escherichia coli, and alcohol oxidase 1 (A ⁇ ) when the host is eukaryotic cells such as yeast or COS cells.
  • X 1), one promoter for SV, one promoter for SV, one promoter for SR, or Sequences such as the promoter of the tolonging factor 1 (EF1 ⁇ ) can be listed.
  • a preferred example of a recombinant DNA molecule of the present invention is one that can transform Escherichia coli to express the novel F ss antigen derivative of the first aspect of the present invention from the viewpoint of a host. Therefore, the recombinant DNA molecule of the present invention preferably has at least a promoter sequence that functions inside Escherichia coli, in addition to a replication origin and a marker sequence of Escherichia coli, and a sequence encoding a signal peptide. It is preferable to have
  • Suitable promoter sequences that function in Escherichia coli include the trp promoter and a) ac promoter.
  • signal peptides that function in Escherichia coli signal peptides of Escherichia coli phosphatase are suitable.
  • a more preferable example is one in which an eukaryotic cell such as an animal cell or yeast is transformed so as to express the novel Fs antigen derivative of the first aspect of the present invention.
  • the recombinant DNA molecule of the present invention comprises at least a translation initiation codon, a stop codon, a selectable marker gene and a polyaddition sequence, and a SV40 which functions in animal cells.
  • Promoter promoter of human elongation factor (E10 ngation Factor 1a (EF1a)), promoter of S Ra promoter or alcohol oxidase 1 (AOX1) functioning in yeast
  • those having an SV40 replication origin and the like are preferable examples of the recombinant DNA molecule of the present invention.
  • the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention comprises a method for ligating the novel DNA of the second aspect of the present invention with another DNA fragment having an arbitrary nucleotide sequence, or (Sambrook J., etc.): Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd., Old Spring Laboratories, New York (New York ), 1989, see).
  • the DNA and the vector may be digested with appropriate restriction enzymes, respectively, and the resulting fragments may be ligated using DNA ligase.
  • the vector may be any vector such as a plasmid vector, a phage vector, or a virus vector, and a commercially available product may be used. Typical vectors are pUC118, pBR322 pSV2-dhfr, pBluescript II, PHIL-SI, ⁇ ZapI ⁇ gt10, pAc700, YRP 17, pEF-BOS, pEFN-II and the like, and the use of pEF-BOS and the like are preferable because high expression can be expected.
  • the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention may be used for any purpose.
  • it may be used for industrially producing the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the present invention, or may be used for amplifying and mass-producing the novel DNA of the second aspect of the present invention. It may be something.
  • the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention can be used to produce the transformant of the fourth aspect of the present invention.
  • the transformant of the present invention is characterized by being transformed with the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention. That is, the transformant of the present invention is a recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention. Can be obtained by introduction into a host cell or microorganism.
  • the transformant of the present invention may be a transformant of a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.
  • Prokaryotic cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • Eukaryotic cells include mammalian cells such as C0S cells, CHO cells, HeLa cells, Nama1wa cells, insect cells such as Sf cells, and yeast. Of these, transformants obtained by transforming Escherichia coli, mammalian cells, and yeast are preferred because they are easy to handle and high expression levels can be expected.
  • the copy number of a gene can be increased in mammalian cells, it is preferable to use a dhfr-deficient strain of CHO cells as a host. Further, among yeasts, it is preferable to use a yeast belonging to the genus Pichia as a host because of a large secretory production amount of a foreign protein.
  • the vector used for producing the recombinant DNA molecule of the present invention must be of a type suitable for the host cell.
  • Examples of preferred combinations of vector and host used for the recombinant DNA molecule include pUC118 and Escherichia coli, pEF BOS and COS or CHO cells, Yac and yeast, Ac NPV and Sf Cell, etc. (see Experimental Medicine Extra Edition, Handbook of Genetic Engineering, published on March 20, 1999, Yodosha, etc.).
  • a promoter, a nucleotide sequence encoding a signal peptide, a marker gene, and the like included in the recombinant DNA molecule should be suitable for the host.
  • an appropriate promoter or the like necessary for expression of the recombinant DNA molecule is required in the recombinant DNA molecule. Must have an array.
  • the host cell may be transformed with a recombinant DNA molecule having a base sequence encoding a signal peptide upstream of the DNA of the embodiment.
  • the method for introducing the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention into a host cell includes an electoral poration method, a protoplast method, an alkali metal method, a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, and a microinjection method. From the Chillon method, the method of influencing using virus particles, and other publicly known methods (Experimental Medicine Extra Edition, Genetic Engineering Handbook, published March 20, 1991, Yodosha, etc.) One suitable for the host or recombinant DNA molecule may be selected. Phosphoric acid method The DEAE-dextran method allows efficient transformation of B-milk cells, so these methods may be used if the host cells are mammalian cells. preferable.
  • the transformant of the present invention is preferably a transformant that expresses the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the present invention, and particularly preferably expresses the polypeptide and is contained in the culture supernatant. It is better to secrete it. If such a transformant is used, it becomes easy to mass-produce the novel F ss antigen derivative of the present invention.
  • the transformant of the fourth aspect of the present invention may be used for any purpose, it produces a large amount of the DNA of the second aspect or the recombinant DNA molecule of the third aspect of the present invention.
  • the novel Fas antigen derivative according to the first aspect of the present invention is industrially produced. It can be used for manufacturing purposes.
  • the production method according to the fifth aspect of the present invention is a method for producing a novel Fas antigen derivative according to the first aspect of the present invention, which comprises using the transformant according to the fourth aspect of the present invention.
  • the method for producing the transformant is as described above.
  • the transformant of the fourth aspect of the present invention is cultured, and gene amplification and expression induction are performed as necessary. Next, the culture mixture is recovered, and if necessary, the operations such as concentration, solubilization, dialysis, and various types of chromatography are appropriately combined to purify the novel Fs antigen derivative of the present invention.
  • the “culture mixture” means a transformant, a medium containing the transformant, or a culture supernatant or a lysate of cells.
  • the polypeptide can be purified from the culture supernatant.
  • the new Fas antigen derivative accumulates in the transformant, select one suitable for the host cell from lysozyme treatment, detergent treatment, freeze-thaw, pressurization, ultrasonic treatment, and other methods as appropriate. After lysing or disrupting the cells, the polypeptide is recovered as a soluble fraction or an insoluble fraction by a method such as centrifugation or filtration and purified.
  • the cultivation of the transformant can be performed by a general method with reference to various books (for example, f-microbial experiment method) edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Chemical Company, Ltd. Published by People, 1992, see).
  • an appropriate drug is selected and used depending on the incorporated promoter.
  • a typical example of a method for amplifying a gene is a method using methotrexate when a dhfr-deficient CHO cell is used as a host and a vector having dhfr is used.
  • the transformant used in the production method is not limited as long as it is the transformant according to the fourth aspect of the present invention.
  • COS cells and mammalian cells such as CHO cells or yeast, or A transformant using a cell selected from any of Escherichia coli as a host is preferable.
  • Examples of culture and induction of expression when mammalian cells such as Escherichia coli and CHO cells and yeast of the genus Pichia are used as transformants are described below.
  • the cells are pre-cultured with L-broth (L-Broth), and the amount is 1-50 per M9-CA medium.
  • L-Broth L-broth
  • culture at 37 ° C. A few hours after the start of culture, when the OD550 value of the medium reaches 1 to 4 (that is, in the logarithmic growth phase), 3 / 3-indoleacrylic acid is added to a final concentration of 10 g / m1 to induce expression. I do.
  • a culture mixture containing the target protein By further culturing for about 1 to 2 days, a culture mixture containing the target protein can be obtained.
  • a culture mixture containing the target protein When using Pichia yeast transformed with a recombinant DNA molecule having the AOX1 promoter, pre-culture for about 2 days in BMGY medium, replace the medium, and induce expression by adding methanol. . Furthermore, culturing is performed at 30 ° C. for about 1 to 2 days to obtain a culture mixture containing the target protein.
  • a transformant obtained by transforming a mammalian cell such as a CH0 cell with a recombinant DNA molecule having a promoter of a fermentation factor is cultured in a DMEM medium containing 10% fetal serum. .
  • Cells are about! ⁇ ] 0 X 1 0 1 implantation at a concentration of cells Zm 1, the culture is performed under the condition of 3 7 ° C, 5% carbon dioxide Gasuno 95% air. Usually, the cells become confluent after 2-3 days. At that point, the medium is replaced with serum-free D-MEM. Subsequently, by culturing for 2 to 3 days, a culture mixture containing the target protein can be obtained.
  • the gene can be amplified by methotrexate to increase the production amount as described above.
  • an appropriate method is appropriately selected from the methods usually used for polypeptide purification.
  • various methods such as salting out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, antibody chromatography, etc.
  • Appropriate methods such as affinity chromatography, chromatofocusing, adsorption chromatography, and reversed-phase chromatography are appropriately selected and combined, and if necessary, purified using an HPLC system or the like. Just do it.
  • antibodies, Fas ligands or anti-Fas antibodies that recognize the novel Fas antigen derivative of the present invention.
  • Affinity chromatography using protein A or the like as a ligand is also useful in the purification of the novel polypeptide.
  • the novel Fas antigen derivative of the first aspect of the present invention may be expressed as a fusion protein with ⁇ -galactosidase of Escherichia coli or other polypeptides.
  • a chemical substance such as bromocyan or hydroxylamine or an enzyme such as protease.
  • the transformant used is Escherichia coli
  • the protein is produced as an insolubilized protein
  • the inclusion body, the ink body is solubilized during purification.
  • the operation of re-dening, de-netching and re-dening may be performed at appropriate steps of the refining (Thomas E. and Claiton).
  • a solubilization buffer containing appropriate amounts of urea or guanidine hydrochloride, a surfactant, reduced glutathione, and oxidized glutathione for example, 5 M guanidine hydrochloride, 0.005% Tween 800, 50 mM Hydrochloric acid (pH 8.0), a buffer solution containing 5 mM EDTA, 2 mM reduced glutathione, and 0.02 mM oxidized glutathione
  • 2-mercaptoethanol was added thereto, and the mixture was decanted.
  • the solution obtained by removing guanidine hydrochloride from the solubilization buffer is dialyzed and refolded. When expressed as a fusion protein, these After the above operation, unnecessary protein portions are cleaved with a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as protease, and then appropriate chromatography is performed.
  • the novel Fas antigen derivative of the present invention having a Fas antigen activity useful for pharmaceuticals and the like can be industrially mass-produced uniformly and with high efficiency.
  • the medicament of the sixth aspect of the present invention contains the novel Fs antigen derivative of the first aspect or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • pharmaceutically acceptable carriers excipients, stabilizers, lubricants, coloring agents, disintegrants, preservatives, isotonic agents, stabilizers, dispersants, antioxidants ,
  • parenteral administration is, for example, injection such as intravenous administration, intraarterial administration, subcutaneous administration, intramuscular administration and the like, and also includes rectal administration, transdermal absorption, transmucosal absorption and the like.
  • the dosage form is preferably a suppository, an inhalant, particularly an injection.
  • the medicament according to the sixth aspect of the present invention is characterized in that abnormalities of apoptosis mediated by Fas antigen, in particular, excessive apoptosis due to overproduction of endogenous Fas ligand or overdose of exogenous Fas ligand in a pathological condition are exhibited.
  • Novel F a as active ingredient
  • the effective content, dosage, and formulation of the S antigen derivative or a physiologically acceptable salt thereof are appropriately determined according to the disease state.
  • a seventh aspect of the present invention at least one of the amino acid residues (excluding the cysteine residues) from the N-terminal amino acid residue to the most cysteine residue from the N-terminus of the Fas antigen is deleted.
  • a method for improving the activity or function of a Fas antigen or a Fas antigen derivative a Fas antigen or a Fas antigen having an improved activity or function, characterized in that at least one of the first to fourth amino acid residues counted from the N-terminus of the Fas antigen is deleted.
  • a method for designing and producing a derivative is provided. The production method includes a step of producing the novel Fs antigen derivative of the first aspect of the present invention, and confirming the improvement by measuring the activity and the like.
  • the method for selecting an amino acid residue to be deleted from the N-terminal region, the method for producing the polypeptide having the deletion, the method for measuring the activity, and the like are as described above.
  • antisense primer 1 SEQ ID NOS: 1 and 2 in the GTC AAGCTTGGTAC table.
  • This sense primer 1 combines the SpeI site (ACT AGT) with the 3 'terminal region of the nucleotide sequence encoding the human Fas antigen signal peptide and the amino acids 30 to 34 of the human Fas antigen. Contains the base sequence to be loaded.
  • antisense primer 2 is the extracellular domain of human Fas antigen. It contains the nucleotide sequence encoding the C-terminal side of the region, the HindIII site (AAGCTT), and the Kpnl site (GGTACC).
  • the obtained sense primer 1 and antisense primer 1 are each used for e ⁇ ⁇ mo1 and DNA encoding human Fas antigen (Ito N., (Itoh N.), etc.). Volume 66, 233—243, 199 1), 0.5 Pg of PBLF 58—1 and 20 nmo of dATP. DCTP, dGTP, and dTTP, respectively. 2.5 units of Pfu A 100 DNA I solution containing 100 ⁇ 1 of DNA polymerase and the attached Pfu buffer (both manufactured by Stratagene) was prepared.
  • PCR System 9600 Using a DNA thermal cycler (PCR System 9600, manufactured by Parkin Elmer), perform PCR at 94 ° C, 30 seconds; 55 ° C, 30 seconds; 72 ° C, 1 minute for 1 cycle. Performed 0 cycles.
  • the obtained PCR product was double-digested with SpeH indill, and a DNA fragment of about 410 bp was converted into a human Fas antigen signal described in Example 21 of International Patent Application Publication WO 95/13293. ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the plasmid was incorporated into the SpeI and Hind111 sites of the plasmid pM1081, which contains the peptide and the DNA encoding the human Fas ligand extracellular region, and the resulting plasmid was named pMl097.
  • This plasmid is a plasmid containing the DNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 in the sequence listing.
  • Sense Primer 3 (TCACAAGC C CAG CAACAC CA AG), Antisense Primer 4 (GCTTGCCGGCCGTCGCACT C), Sense Primer 5 (GAAGGATCCAGATCTAACGAGCC CAAATCTTGT) and Antisense Primer 1 (GTCGGTACC CTATC ATTTAC C CGGAGAC AG) was chemically synthesized (SEQ ID NOS: 3, 4, 5, and 6 in the sequence listing).
  • This sense primer 3 contains the nucleotide sequence encoding the C-terminal side of the CH1 region of human immunoglobulin G1
  • antisense primer 14 contains the sequence of the 3 'untranslated region of human immunoglobulin G1.
  • Sense primer 5 contains a nucleotide sequence encoding amino acid located at the C-terminal side of the extracellular region of human Fas antigen and an amino acid sequence located at the N-terminal side of the hinge region of human immunoglobulin G1. Includes coding base sequence and Bam I site (GGATC C).
  • Antisense primer 16 contains a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence located at the C-terminal side of the CH3 region of human immunoglobulin G] and a KpnI site (GGTACC).
  • the obtained sense primer 3 and antisense primer 4 were each replaced with 100 pmol, Human Sleen 5'-Stretch cDNA Library (manufactured by Clonetech) with 1 ⁇ 1, dATP, dCTP, dGTP, d
  • the obtained PCR product of about 750 bp was converted into type I, and 100 pmo of sense primer 5 and antisense primer 16 were respectively subjected to 100 pmo to obtain 20 nmo of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, respectively.
  • the resulting PCR product was double-digested with BamHI and KpnI, and a DNA fragment of about 720 bp was prepared in (1).
  • Plasmid obtained by incorporating in between Was named pMl303. This plasmid is a plasmid containing the DNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
  • PM1303 prepared in (2) was double-digested with EcoRI and KpnI, and a DNA fragment of about 150 bp was digested with pEF-BOS (Mizushima S.) and Nagayu. S. (Nagata S.), ucleic Acids Res., Vol. 18, p. 5322, p. 1990, 1990).
  • the resulting plasmid was named pMl304.
  • This plasmid is an expression vector for a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 in the sequence listing (sometimes referred to as shFas (nd29) 1-Fc in this specification).
  • sense primer 7 TGCGAATTCACCATGCTGGGCA TCTGG
  • antisense primer 8 CGGGGTAC CTC ACTAT GGG C ACGGTGGG CA
  • This sense primer 17 contains the EcoRI site (GGATCC) and the 5 'end region of the sequence encoding the human Fas antigen signal peptide.
  • Antisense primer 8 contains a nucleotide sequence encoding an amino acid located on the C-terminal side of the hinge region of human immunoglobulin G1 and a KpnI site (GGTACC).
  • the obtained sense primer 17 and antisense primer 18 were each subjected to 100 pm and 0.3 g of the pMl304 prepared in (3), and 20 g each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. nmo 1, 2.5 units A solution of 100 ⁇ 1 containing 10 ul of Pfu DNA polymerase and the attached Pfu buffer was prepared, and a PCR reaction was carried out in the same manner as in (1). The obtained PCR product was double-digested with EcoRI and KpnI, and a DNA fragment of about 450 bp was used in (3). The EcoRI and KpnI sites of pM1103 were used. The resulting plasmid was designated as pM1317.
  • This plasmid is an expression vector for a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing (shF as (nd 29)-hinge), which may be referred to in this specification. .
  • the present inventors transformed Escherichia coli JMI09 with plasmids PM1304 and pM1317 by a known method, and obtained the resulting transformant Escherichia coli JM109 (pM13). No. 0 4) and JM109 (pMl 3 17) were deposited with the Institute of Biotechnology, Industrial Science and Technology, 1-chome, Tsukuba-Higashi-Chome, Ibaraki, Japan, effective March 14, 996. It was transferred on March 6, 1997 under the Budapest Treaty (accession numbers FERM BP-5854, FERM BP 58 55).
  • each plasmid DNA was added to 500/1 of 10 mM Tris—HC 1 (pH 7.4) / 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter abbreviated as TE buffer). Dissolved in the solution. Add 2 mg / 'm 1 DE AE to each -125 ml of D-MEM (Nissui Pharmaceutical) containing dextran and 5 OmM Tris-HCl (H7.4) was added to prepare a DNA-DEAE dextran mixture.
  • a DNA-DEAE dextran mixture was added to COS-1 cells, which were monolayer-cultured to a semiconfluent with 1 700 cm 2 roller bottle (manufactured by Corning), and cultured at 37 ° C. — 1 / pM 1 304, COS-1 XM 13 17 and COS-1 / pBF-F c 1 were obtained.
  • the DNA-DEAE dextran mixed solution was removed, and the medium was replaced with a D-MEM medium containing 10% fetal serum (manufactured by Lifetech Oriental), and the cells were further cultured for 24 hours. Thereafter, the medium was changed P hen 0 1 redfree D-MEM CFBS, the BSA no addition) After culturing an additional 72 hours, the culture supernatant was recovered c
  • Ammonium sulfate (ammonium sulfate; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the COS-1 / pMl 304 culture supernatant 11 so as to be 70% saturated, dissolved, and then allowed to stand at 4 ° C overnight. .
  • the resulting precipitate was collected by centrifugation at 8,000 rm, 4 ° C for 30 minutes, suspended in phosphate buffered saline (PBS), and dialyzed against PBS.
  • the obtained suspension (57 ml) was diluted by adding a 2-fold amount of afiprep protein A-binding cuffer (manufactured by Biorad).
  • the mixture was applied to a column of equilibrated protein A preparative cartridge (manufactured by BioRad; 7.3 ml) equilibrated according to the instruction manual. After washing the column with 90 ml of ⁇ -prepprep protein A binding buffer, use shFas (nd 29) with ⁇ -prep prep protein A elution buffer (BioRad). One Fc was eluted.
  • FIG. G shows the results of shFas (nd29) -Fc purification.
  • lanes 1 to 4 show the results under non-reducing conditions
  • lanes 5 to 8 show the results under reducing conditions.
  • the purified shFas (nd29) -Fc was not reduced (lanes 1 to 3) and had a molecular weight of about 85 kD corresponding to a dimer, and reduced (lane 5). ⁇ 7), it was detected as almost one band of about 43 kD corresponding to the monomer.
  • the purified shFas (nd29) Fc obtained in Example 3 was subjected to reverse-phase HPLC in the following manner. First, the purified sh Fas (nd 29) — F c was preliminarily equilibrated with 0.05% trifluoroacetic acid in a V YD AC C 4 column (4.6 mm 0 x 25 cm, manufactured by Cypress Corporation). ) And then the column is Washed with fluoroacetic acid. After washing, elution was carried out at a flow rate of 1 m 1 / min by a linear concentration gradient method using 0.05% trifluoroacetic acid Z0 to 100% acetonitrile.
  • the fraction of the eluted main peak was lyophilized, dissolved in 70% formic acid to prepare a sample, and the sample was analyzed using a Model 477 A Protein Sequencing System-1 20 APTH Analyzer (PerkinElmer).
  • the N-terminal amino acid sequence was determined. That is, PTH amino acid was detected by ultraviolet absorption at 270 nm, and the amino acid was identified based on the retention time of a standard PTH amino acid (Perkin Elmer Inc.) previously separated by the same method. As a result, it has an N-terminal amino acid sequence (ThrGlnAsnLeuGluGlyLeuHiSHisAsp) in which 29 residues of the N-terminal amino acid of the human Fas antigen have been deleted. It was confirmed that.
  • the activity of shFas (nd 29) -Fc and hFas-Fc in suppressing the cytotoxic activity of 1A12 cells and FLm14 cells on WC8 cells and W4 cells was measured as an index.
  • 1A12 cells are cells transformed with mouse WR19L cells to express human Fas ligand
  • FLml4 cells are mouse FDCs expressing mouse Fas ligand.
  • WC8 cells are cells obtained by transforming human Fas antigen
  • W4 cells are cells obtained by transforming mouse WR19L cells so as to express mouse Fas antigen. These WR19L cells express little mouse Fas antigen and are sensitive to the cytotoxic effects of TNF. Vesicles.
  • the cytotoxic activity was measured according to the method of Ruvier E. (J. Ex. Med., 177, 195, 195—200). ,
  • FIG. 9 shows the specific inhibitory activity of shFas (nd29) -Fc and hFas-Fc on FLml4 cells as effector cells and W4 cells as target cells. Is shown in FIG. As shown in FIG. 9 and FIG. 10, shF as (nd 29) — F c is 3 to 10 times higher than h F as — F c and has cytotoxicity inhibitory activity.
  • shF as (nd 29) — F c is 3 to 10 times higher than h F as — F c and has cytotoxicity inhibitory activity.
  • the culture supernatant 101 of COS-1 / pM 13 17 was ultrafiltered and concentrated using a Filtron Mini Set (fraction molecular weight: 10 kD; manufactured by Fuji Filter) to obtain 1.51. Then, 1 MT ris-HC1 (pH 9.0) was added to the concentrate to adjust the pH to 8.0, and then to 50 mM Tris-HC1 (pH 8.0) containing 1 M NaCl. A pre-equilibrated anti-Fas antigen monoclonal antibody immobilized affinity column was applied.
  • the column was washed with 50 mM Tris-HC1 (pH 8.0) 32 20 ml containing 1 M NaCl, and then 0.1 M glycine-HC1 (p The shFas (nd29) -hinge was eluted with H2.5).
  • Fractions containing shFas (nd29) -hinge determined by ELISA were pooled, and subjected to ultrafiltration using Filtron Omega Cell (fraction molecular weight: 10 kD; manufactured by Fuji Filter Co., Ltd.). Concentrated. This concentrate was dialyzed against 0.9% NaCl to obtain purified shFas (nd 29) — h i nge.
  • shFas (nd 29) N-terminal amino acid sequence analysis of hinge Using the purified shFas (nd 29)-hinge obtained in Example 6 (2), model 477 A protein sequence was used. The N-terminal amino acid sequence was determined using Sing System-1 20 1 Analyzer-1 (PerkinElmer). That is, the PTH amino acid was detected by ultraviolet absorption at 270 nm, and the amino acid was identified based on the retention time of a standard PTH amino acid (Perkin Elmer Inc.) that had been previously separated by the same method. As a result, it was confirmed that the human Fas antigen had an N-terminal amino acid sequence in which 29 N-terminal amino acids were deleted. (Example 8) Comparison of apoptosis inhibitory activities of shFas (nd29) one hinge and hFas-Fc
  • FIG. 11 shows the specific cytotoxic activity of shFas (nd 29) -hinge and hFas-Fc when 1A12 cells were used as effector cells and WC8 was used as target cells.
  • sh Fas (nd 29) hinge and h Fas-Fc was shown in Fig. 1. See Figure 2.
  • shFas (nd29) -hinge had a cytotoxic inhibitory activity 3 to 10 times higher than that of hFas-Fc.
  • Example 9 Structural analysis near the N-terminal region of the Fas antigen extracellular region was constructed, and deletion of amino acid residues in the N-terminal region The relationship with the binding between the Fas ligands was analyzed.
  • a protein with a high degree of homology to the amino acid sequence of the extracellular domain of the Fas antigen was obtained from the biomolecule three-dimensional database PROTE IN DATABA K (PDB) in BIOSYM's Homo 1 ogy module. Searched by F ⁇ STA program. As a result, it was found that the extracellular region of the TNF receptor p55 ⁇ or (PDB-ID1 TNR) has a high overall structural homology.
  • This structure formed a complex with TNF- / 3, and was also optimal as a reference protein in constructing a model structure of a Fas antigen-Fas ligand complex model.
  • the TNF-a (PDB-ID1 TNF) structure was also used as the reference protein.
  • the construction of the model structure was performed by the homology modeling method using the Homo 1 ogy module manufactured by BI OSYM.
  • the constructed initial structure of the model was subjected to energy optimization calculation (MM calculation) using DIS COVER, a molecular force field calculation software manufactured by BIOS YM, to obtain a model of the Fas antigen and Fas ligand complex model.
  • MM calculation energy optimization calculation
  • BIOS YM a molecular force field calculation software manufactured by BIOS YM
  • Example 11 Inhibitory effect of shF as (nd 29) -hinge on liver injury in mice
  • C57BL / 6CrSic mice male, 9 weeks old, manufactured by Nippon SLC Limited
  • Five and four groups were used as test animals.
  • a propionobacterium aknes heat-killed cell suspension manufactured by Libimno Chemical Corporation
  • physiological saline manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the shFas (nd 29) -hinge prepared in Example 6 was diluted with a diluent (a saline solution containing 0.1% human serum albumin (Chemical and Serological Research Institute)), 0.3 mgZ8m] Zkg, 1 mg / 8 ml / kg 3 mg 8 ml 1 kg was administered via the tail vein.
  • the control group received the diluent.
  • 0.2 ml of a lipopolysaccharide (Sigma) solution prepared with physiological saline was intraperitoneally administered to a concentration of 5 micrograms Zm1. Eight to twenty-four hours after administration of lipopolysaccharide, a 75-microliter mouth blood was collected from the fundus.
  • the collected blood was mixed with 8.3 microliters of 3.8% aqueous solution of sodium citrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then centrifuged at 300 rpm for 10 minutes. After centrifugation, the obtained plasma was frozen in liquid nitrogen and stored at minus 30 degrees until use.
  • GOT and GPT are measured by GOT—FA Test Co., Ltd. (Jun Wako The measurement was performed using a GPT-FA Test Co., Ltd. (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and an autoanalyzer (manufactured by Roche, Cobasfara) manufactured by Yakuhin Kogyo Co., Ltd.
  • the G0T and GPT values of the shFas (nd 29) -hinge administration group were lower than those of the control group, and a liver injury-suppressing effect was observed (FIG. 14).
  • novel polypeptide of the present invention can inhibit the induction of apoptosis by antagonistically inhibiting the binding between the Fas ligand and the Fas antigen, apoptosis via the Fas antigen can be suppressed.
  • it regulates apoptosis that occurs in vivo due to endogenous or exogenous Fas ligand, and is used for the prevention and treatment of various diseases for which the involvement of apoptosis via the Fas antigen has been suggested. I can do it.
  • apoptosis is suppressed artificially using a novel Fas antigen inducer, thereby suppressing rapid cell death due to autoantigen-reactive T cell attack, It will be possible to prevent destruction.
  • Specific examples include graft-versus-host disease (GVHD) or diabetes.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • the ability to remove cells by an immune reaction during virus infection It is known that not only infected cells but also non-infected cells are removed at the same time.
  • impaired immunity late in AIDS virus infection and decreased liver function in hepatitis, especially in fulminant hepatitis may be the result of markedly reduced tissue function due to apoptosis of immunocompetent cells or hepatocytes.
  • the novel Fas antigen derivative that suppresses apoptosis can be used for the treatment of a viral infection associated with apoptosis such as influenza, AIDS and hepatitis and its complications.
  • a viral infection associated with apoptosis such as influenza, AIDS and hepatitis and its complications.
  • the Fas antigen is considered to be involved in cell death in various organs due to its wide organ distribution, myocardial damage in ischemic heart disease such as myocardial infarction, for example, re-portal disorder, nephritis, It is also considered to be effective in organ preservation during multiple organ failure and organ transplantation.
  • novel Fas antigen derivative of the present invention strongly suppresses apoptosis at a low dose, it is expected that it is effective at a low dose even in vivo and can suppress side effects at a low rate. Therefore, its usefulness is high in terms of efficacy, safety and cost.
  • novel Fas antigen derivative of the present invention comprising a human-derived sequence is preferable for human application.
  • the novel Fas antigen derivative in a form capable of inducing apoptosis when properly taken up into cells can be obtained by appropriately taking up into cells by ribosome formation, or the second aspect of the present invention.
  • Apoptosis is promoted by appropriately expressing it on cells by gene therapy using DNA or the like. Therefore, it is effective in removing unnecessary cells, for example, virus-infected cells in the early stage of virus infection, and can also be used in the prevention and treatment of diseases considered to be caused by apoptosis failure, such as rheumatoid arthritis and SLE. .
  • the Fas antigen since it retains at least a part of the antigenicity possessed by the Fas antigen, it can also bind to anti-Fas antibodies, and is also effective in suppressing apoptosis by anti-Fas antibodies It is.
  • novel Fas antigen derivative of the present invention specifically and with high affinity binds to Fas ligand, and thus can be applied to detection of Fas ligand in human body fluids. Since it can be used to detect an increase or decrease or an abnormality in Fas ligand in various diseases in which the involvement of Fas ligand is suggested, It can be applied for prediction, detection and selection of diagnostic or therapeutic methods. It is also useful for monitoring patients treated with agents that affect the expression of Fas ligand and Fas ligand and agents that affect the expression of Fas ligand, and for determining the therapeutic effect and prognosis.
  • the DNA and the like according to the second aspect of the present invention are useful for industrially mass-producing high-purity novel Fas antigen derivatives.
  • This makes it possible to provide the novel Fas antigen derivative as a main component of a therapeutic drug to the pharmaceutical field or to use it as a diagnostic drug.
  • the nucleotide sequence encoding the novel Fas antigen derivative can also be applied to gene therapy and the like.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid Synthetic DNA (sense primer 1) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid Synthetic DNA (antisense primer 2) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid Synthetic DNA (Sense Primer 3) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid Synthetic DNA (antisense primer 4) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid Synthetic DNA (sense primer 7) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type Other nucleic acid Synthetic DNA (Antisense Primer 8) Sequence:
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • V3V1 1.
  • V3V51 30 Summary 3 01V11
  • Sequence type nucleic acid
  • TTTTCTTCCA TTTCAGGTGT CGTGAGGAAT TCACCATGCT GGGCATCTGG ACCCTCCTAC 60 CTCTGGTTCT GACTAGTGTC GCTACTCAGA ACTTGGAAGG CCTCCATCAT GATGGCCAAT 120 TCTGCCATAA GCCCTGTCCT CCAGGTGAAA GGAAACCTAG GGACTGCACA GTCAATGGGG 180
  • CTGTATGTGA ACACTGTGAC CCTTGCACCA AATGTGAACA TGGAATCATC AAGGAATGCA 420
  • Sequence type nucleic acid
  • TTTTCTTCCA TTTCAGGTGT CGTGAGGAAT TCACCATGCT GGGCATCTGG ACCCTCCTAC 60 CTCTGGTTCT GACTAGTGTC GCTACTCAGA ACTTGGAAGG CCTGCATCAT GATGGCCAAT 120 TCTGCCATAA GCCCTGTCCT CCAGGTGAAA GGAAAGCTAG GGACTGCACA GTCAATGGGG 180
  • ACTGCACCCG GACCCAGAAT ACCAAGTGCA GATGTAAACC AAACTTTTTT TGTAACTCTA 360 CTGTATGTGA ACACTGTGAC CCTTGCACCA AATGTGAACA TGGAATCATC AAGGAATGCA 420
  • Sequence type nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

明細書
発明の名称
新規 Fa s抗原誘導体 技術分野
本発明は、 活性等が改良された新規 F a s抗原誘導体およびそれをコ―ドする 新規な DNAを医薬の分野に提供する。 本発明は、 また、 当該 DNAを含む組換 え DNA分子、 形質転換体、 および当該新規 F a s抗原誘導体の製造方法をも提 供する。 背景技術
ヒト F a s抗原は、 様々な細胞の表面に存在するポリべプチドであって、 アポ ト一シスと呼ばれる細胞の死と関連していると考えられている。 生体の恒常性は 細胞の増殖と分化およびその死によつて巧妙に制御されているが、 アポ卜一シス は、 死につつある細胞の形態からネクロ一シス （壌死） と区別される細胞の死の 1形態である。 生体の恒常性を維持するための細胞の死、 すなわち、 生体にとつ て不必要な細胞を除去したり、 ウィルス感染細胞や腫瘍細胞が細胞障害性 T細胞 (CTL) やナチュラルキラ一 （NK) 細胞によって攻撃され、 除去される場合 の細胞の死は、 主としてアポトーシスによることがわかっている。
元々、 ヒ ト線維芽細胞でマウスを免疫して得られたモノクローナル抗体 であり、 ある種の細胞にアポ卜一シスを誘導する抗 F a s抗体 （ヨネハラ S. (Yon e h a r a S. ) 等、 J. Exp. Me d. 、 1 69卷、 1 747— 1 756頁、 1 98 9年） によって認識され、 アポ卜一シスのシグナルを細胞に 伝達する細胞表面抗原としてヨネハラ S. (Yo n e ha r a S. ) 等が見 出した F a s抗原が、 いかなるものであるかは長年不明であった。
近年、 F a s抗原遺伝子がクローニングされ、 F a s抗原は分子量約 4 5 kD の I型細胞膜貫通型糖蛋白質であり、 そのアミノ酸配列から生理学的に重要な細 胞表面膜タンパク質群を構成する NGFR (神経成長因子レセプター） ZTNF R (TNFレセプ夕一） ファミ リ一に属することが判明した （ィ トウ N. ( I t o h N. ) 等 C e 】 1、 66巻、 233 - 2 4 3頁、 1 99 1年） 。 ま た、 マウス F a s抗原遺伝子もクローニングされ （ワタナベ一フクナガ R. (Wa t an ab e-Fuk un a ga R. リ 寺、 J. I mmu n o l. ， 1 48卷、 1 274— 1 279頁、 1 992年） 、 F a s抗原 mRNA力 \ マウ スの胸腺、 肝、 肺、 心臓、 卵巣で発現していることが確認された。 ヒ卜において も、 リ ンパ球、 肝細胞、 小腸上皮細胞、 皮廣ケラチノサイ ト及び骨芽細胞等 の様々な組織や細胞で発現することが報告されている （L e i t h a u s e r, F. 等、 L a b. I n v e s t . 、 6 9卷、 4 1 5 - 4 2 9頁、 1 9 9 3 年） 。
本来細胞表面上に存在すると推定されていた F a s抗原が血中や培養上清中に も検出され、 可溶型 F a s抗原 （s F a s) としても存在することが判明し、 そ れらの生理的機能等についても関心が高まりつつある。
C h e n J. 等 （S c i e n c e、 2 6 3卷、 1 7 5 9— 1 7 6 2 頁、 1 994年） は、 アルタネイティブスプライシングにより第 IVェクソン （細 胞外領域 1 4塩基対及び細胞膜貫通領域 49塩基対に対応） を欠き、 分泌型分子 をコードすると考えられる可溶型の ATM型 F a s抗原をコードする mRNAが 存在すること、 全身性エラテマトーデス （S LE) 患者血清中において可溶 型 F a s抗原が高濃度であったこと、 マウス F a s抗原の細胞外領域とヒ ト
1 gGF c部分とからなるキメラ分子をマウスに投与した結果、 脾細胞数の増加 とともに自己リ ンパ球混合反応の上昇が認められたことを報告した。 また、
C a s c i n o I . 等 （J. I mm u n o 1. 、 1 5 4卷、 2 7 0 6—
27 1 3頁、 1 995年） も同様な F a s抗原 m R N Aを含めて少なくとも 3種 の F a s抗原をコ一ドする mRNAが存在することを報告した。 それらの生理的 機能や発現部位等については不明であるが、 組み換え ΔΤΜ型 F a s抗原は F a sリガンドの細胞障害活性を濃度依存的に抑制すること、 健常人及び S L E 患者血清中に存在する可溶型 F a s抗原の大部分はスプライシングバリアン卜が コードする ΔΤΜ型 F a s抗原であることが示されている （力ャガキ N. (K a y a g a k i N. ) 等、 医学のあゆみ、 1 7 4卷， 1 1 3 6 - 1 1 40、 1 995年） 。
さらに、 最近キムラ K. (K i m u r a K. ) 等は、 ラッ 卜 F a s抗 原遺伝子をクローニングするとともに、 ラッ 卜肝 mRNA中にアルタネィ ティブスプライシングの相違により 2種類の F a s抗原 mRNAが検出されるこ と、 及び膜結合型 F a s抗原の mRNA以外に分子量の小さなぺプチ ドを コードする mRNAがあることを報告し （B i o c h em i c a l a n d B i ophy s i c a l Re s e a r c h Co mm u n i c a t i on s, 1 98卷 （ 2 ) , 666— 674頁、 1 994年） 、 また、 対応するヒト F a s 抗原の変異体 （バリアント） も単離、 同定した （特開平 7— 2 8 9 2 6 6号 公報） 。
—方、 ヒト F a sリガンドは、 F a s抗原を発現する細胞に対してアポトーシ スを誘導する生体内分子として、 長田等により報告されたポリべプチドであ る (Tomoh i r o Tak a h a s h i等、 I n t e r n a t i on a l I mmu n o l o g y、 6巻、 1 5 6 7— 1 5 7 4頁、 1 9 9 4年） 。 ヒ ト F a sリガンドは、 TNFファ ミ リ一に属する分子量約 4 0 k Dの I I型 膜蛋白質で、 TNFと同様に、 生体内で 3量体を形成すると考えられている (Ma s a t o T a n a k a等、 EMB O J o u r n a l , 1 4巻、 1 1 2 9— 1 1 3 5頁、 1 9 9 5年） 。 また、 ヒ ト F a s リガンドはラッ ト F a sリガンド （T a k a s h i S u d a等、 C e 1 1、 75卷、 1 1 6 9 - 1 1 7 8頁、 1 9 9 3年） やマウス F a s リ ガン ド （T o mo h i r o Ta k ah a s h i等、 Ce l l、 7 6巻、 969— 976頁、 1 994年） と 細胞外領域において高いホモ口ジ一を有しており、 ヒ ト F a s リガンドはヒ ト F a s抗原のみでなくマウス F a s抗原をも認識し、 アポトーシスを誘導する ことができる。 逆に、 ラッ ト F a sリガンドおよびマウス Fa sリガンドも、 ヒ ト F a s抗原を認、識してアポトーシスを誘導することができる。
もともと細胞のアポトーシスという現象は、 生体の恒常性の維持に深い関わり をもつものとして注目されていたが、 上記のように F a s抗原および F a sリガ ンドが異なる種間でホモロジ一を有し構造的および作用的にも保存されているこ と力、ら、 F a sリガンドー F a s抗原を介したアポト一シスは生体の恒常性の維 持に極めて重要な役割を担っているものと考えられる。
特に最近、 F a sリガンド、 F a s抗原の異常と自己免疫疾患との関係につい て興味ある報告がなされた。 すなわち、 自己免疫疾患のモデルマウスの 1系統で ある MRL— 1 p r/ 1 rでは F a s抗原遺伝子に変異が生じており、 このよ うな変異の生じた F a s抗原遺伝子を発現している細胞ではアポトーシスが起き ない （R i e Wa t an a b e— Fuk u n a ga等、 Na t u r e、 356 巻、 3 1 4— 3 1 7頁、 1 993年および Ad a c h i M. 等、 P r o c. Na t l. Ac a d. S c i . USA, 90卷、 1 993年） 。 一方、 自己免疫 疾患のモデルマウスの他の系統である C 3 H— g 1 d/g 1 dでは、 F a sリガ ンド遺伝子に変異が生じており、 g 1 dマウスの Fa sリガンドはアポトーシス 誘導活性を持たない。 この変異とは、 遺伝子のポイントミューテーシヨンで あり、 その結果、 F a sリガンドの細胞外領域の C末端より数えて 7番目のアミ ノ酸が他のアミノ酸に変化している。 （Tomoh i r o Tak a h a s h i 等、 C e l l、 76巻、 969— 976頁、 1 994年） 。 このような g l dマ ウスの F a sリガンドは、 F a s抗原に結合することができない （F r e d Rams d e l l等、 Eu r. J. I mmun o l、 24巻、 928— 933 頁、 1 994年） 。
また、 S L E患者では血中の可溶型 F a s抗原の上昇 （C h e n g J. 等、 S c i e n c e, 2 6 3巻、 1 7 5 9— 1 7 6 2頁、 1 9 9 4年） ゃリ ンパ球表面の F a s抗原の発現の上昇が報告されている （ァマサキ Y. (Ama s a k i Y. ) 等、 C l i n. E x p. I mmu n o l . 9 9 巻、 24 5— 250頁、 1 995年） 他、 リンパ球増殖症候群においても、 F a s抗原の発現および機能異常を伴う F a s抗原遺伝子の異常が関与している可能 性が示唆されている （R i e ux L a u c a t F. 等、 S c i e n c e、 2 6 8巻、 1 3 4 7— 1 3 4 9頁、 1 9 9 5年および F i s h e r G. H. 等、 C e 1 8 1巻、 935— 9 4 6頁、 1 9 9 5年） 。
これらの事実から、 ヒ 卜における自己免疫疾患のある種のものは、 F a s抗原 もしくは Fa sリガンドの異常によって、 本来アポトーシスを起こして生体内か ら除去されるべき自己反応性の T細胞が残存するために生じるのであろうと考え られるようになった。
最近では、 関節リウマチにおける滑膜細胞の異常増殖や関節破壌も、 これらの 細胞で正常にァポト一シスが生じないために起こるのではないかと考えられてい る。 また、 コバヤシ N. 等は、 エイズウイルス感染により T細胞膜上に F a s 抗原の発現が誘導されるので （日経サイエンス、 6巻、 3 4— 4 1頁、 1 9 9 3 年） 、 エイズウイルス感染時における T細胞の減少も F a sリガンドを介したも のであると予想している。
また、 ウィルス性の劇症肝炎等においても F a s リガンドによるアポトーシス の関与が示唆されている （ナガタ S. 等、 I mmu n o l. To d a y, 1 6 巻、 3 9— 4 3頁、 1 99 5年） 。 このように F a s抗原を介したアポ卜一シス と疾患との関わりが明らかになるにつれて、 アポト一シスの異常を伴う疾患、 す なわち、 上記自己免疫疾患やリウマチ、 エイズ等の治療に、 F a sリガンドもし くは F a s抗原を応用することが期待されてきている。
現在のところ、 F a s抗原を介したアポトーシスを抑制する物質としては、 例 えば、 ΔΤΜ型 F a s抗原、 および F a s抗原の細胞外領域と免疫グロプリ ン G ( I g G) の F c領域との融合蛋白質、 ならびに抗 F a s抗体の断片 (Dh e i n J . 等、 N a t u r e、 3 7 3卷、 4 3 8— 4 4 1頁、 1 9 9 5 年） 及び抗 F a sアンタゴニスト抗体等が報告されている （A 1 d e r s om M. A. 等、 I n t. I mm u n o 1. 6巻、 1 7 9 9— 1 8 0 6頁、 1 9 9 4 年） 。
また、 長田らは、 Fa sリガンドに対する抗体を取得し、 該抗体がアポ卜一シ スを抑制しうることを報告してきた （Ma s a t 0 Ta n a k a等、 EMBO J o u r n a l , 1 4巻、 1 1 2 9— 1 1 3 5頁、 1 9 9 5年および国際特許 出願公開公報 WO 9 571 32 9 3 ) 。
上記したように、 F a s抗原が単離され、 生体内で F a s抗原を介してァ ポトーシスが惹起されること、 および F a s抗原を介したアポト一シスが種々の 疾患と関連していることが明らかにされつつあることから、 F a s抗原を介した アポトーシスを調節する物質は、 アポトーシスが関与すると予想される疾患の予 防及び治療ならびに診断において有用であると考えられている。 医薬品の生体内 での有用性は、 活性、 体内動態、 安定性、 副作用等を総合的に考慮しなければな らないが、 特に活性の高い物質は生体内においても低用量で有効性を発揮すると 期待され、 産業上の有用性が高い。 その意味からも、 改良された新規 F a s抗原 誘導体、 特により活性の高い F a s抗原誘導体およびその特性の解明が望まれて おり、 特にヒ トの治療等の生体内における適用を考慮した場合、 より低用量 で F a s抗原を介したアポトーシスを調節しうる新規 F a s抗原誘導体が有効性 および安全性の面から望まれている。
また、 F a s抗原と F a s リガンドとの相互作用、 F a s抗原を介したァ ポ卜一シスのメカニズム等の解明のためにも新規 F a s抗原誘導体の取得は重要 である。 ポリぺプチドはその活性部位の構造が保存されていれば、 そのポリぺプチドの 一部であっても活性を有しているものが知られている。 し力、し、 一方では、 ポリ ぺプチド中のアミノ酸 1個の変異または欠失であってもそのポリべプチドの活性 を変化させ極端な場合には失わせる場合も多く知られている。
本発明の目的は、 活性等が改良された新規 F a s抗原誘導体およびそれをコ一 ドする新規な D N Aを医薬の分野に提供することにある。 本発明は、 また、 当該 D N Aを含む組換え D N A分子および形質転換体、 ならびに当該新規 F a s抗原 誘導体の製造方法をも提供する。 発明の開示
上記したような状況の中で、 本発明者等は、 F a s抗原の特定の数の N末端領 域のァミノ酸残基を欠失させた新規 F a s抗原誘導体が、 従来の F a s抗原また は F a s抗原誘導体に比して活性または機能が向上していることを見い出し、 鋭 意努力の末、 本発明を完成させたものである。
すなわち、 本発明の第 1の態様は新規な F a s抗原誘導体を提供し、 少なくと も、 F a s抗原ポリペプチドの N末端アミノ酸残基から最も N末端よりのシステ ィン残基までのァミノ酸残基 （該システィン残基は除く） のうち少なくとも 1つ のアミノ酸残基が欠失した F a s抗原細胞外領域ポリべプチドの一部または全部 を、 少なくとも含有することを特徴とする新規 F a s抗原誘導体を提供する。 こ のうち、 配列表の配列番号 1 5の N末端から数えて 1 ~ 4 2番目のアミノ酸残基 のうち少なくとも 1つが欠失した F a s抗原細胞外領域ポリぺプチドの 1部また は全部を含有する新規 F a s抗原誘導体、 このうち、 欠失したアミノ酸残基数が 2 9以上である新規 F a s抗原誘導体、 特に欠失したアミノ酸残基数が 2 9であ る新規 F a s抗原誘導体を提供する。
また、 F a s抗原の 1または 2以上の部分からなる上記新規 F a s抗原変異体 ならびに少なくとも新規 F a s抗原変異体のいずれかおよび他の （ポリ） ぺプチ ドを含有する、 特に、 新規 F a s抗原誘導体の C末端側に下記 aおよび bからな る群から選択される少なくとも 1つの （ポリ） ペプチドを含有する融合ポリぺプ チドである新規 F a s抗原誘導体を提供する。
a . ィムノグロブリンのヒンジ領域の 1部または全部。
b . ィムノグロブリンの F c断片の 1部または全部。
また、 前記新規 F a s抗原誘導体の多量体である新規 F a s抗原誘導体を提供 する。
また、 本発明の第 2の態様は前記新規 F a s抗原誘導体をコ―ドする D N A配 列を含有することを特徴とする D N A、 とりわけ配列表の配列番号 1 2〜1 4に 記載の D N A配列を含有する D N Aを提供する。
さらに、 本発明の第 3の態様は、 該 D N Aの塩基配列を含有することを特徴と する組み換え D N A分子を提供する。
次いで、 本発明の第 4の態様は、 前記新規組み換え D N A分子で形質転換され たことを特徴とする形質転換体を提供する。
本発明の第 5の態様は、 前記の新規 F a s抗原誘導体の製造方法のうち、 前記 形質転換体を培養し、 該培養混合物から新規 F a s抗原誘導体を回収、 精製する 工程を含むことを特徴とする前記新規 F a s抗原誘導体の製造方法を提供す る。 本発明の第 6の態様は、 第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体またはその生理的 に許容されうる塩を有効成分として含有する医薬を提供する。
本発明の第 7の態様は、 F a s抗原の N末端ァミノ酸残基から最も N末端より のシスティン残基までのアミノ酸残基 （該システィン残基は除く） のうち少なく とも 1つを欠失させることを特徴とする、 F a s抗原または F a s抗原誘導体の 活性または機能を改良する方法を提供する。
ところで、 公知のヒ ト F a s抗原は、 図 1、 2に示したような c D N A配 列 （配列番号 1 6 ) およびそれより推定されるアミノ酸配列を含有する。 そ して、 そのアミノ酸配列より、 1 6残基からなるシグナルペプチドが切断され、 3 1 9アミノ酸からなる I型の細胞膜貫通型蛋白質として存在すること、 ならび に 1 5 7アミノ酸の細胞外領域 （ 1一〗 5 7残基目） 、 1 7アミノ酸の膜貫通領 域 （ 1 5 8— 1 7 4残基目） および 1 4 5アミノ酸の細胞内領域 （ 1 7 5— 3 1 9残基目） を有するものと推定されている。 ヒ ト F a s抗原の細胞外領 域は、 F a s リガンドと結合する機能を有するが、 細胞外領域のみを発現させた ポリペプチドは、 可溶型として存在し、 F a s リガンドと結合することによ りアポトーシス抑制活性を有する。 また、 後に詳述する本発明者などのコン ピュータ一解析によれば N末端から数えて 4 3番目のシスティン残基は他のァミ ノ酸残基と何らかの結合を形成している可能性があり、 F a s リガンドとの結合 に必要な、 F a s抗原細胞外領域のドメィン構造の保持に寄与していると考えら れる。 一方 F a s抗原細胞外領域の最も C末端よりのシスティン残基も構造保持 に必要と考えられる力く、 前述の Δ ΤΜ型 F a s抗原が F a sリガンドと結合する ことより、 C末端の 5残基すなわち 1 5 3番目のグリシン残基から 1 5 7番目の ァスパラギン残基までは活性に必要ないと予測される。 図面の簡単な説明
図 1はヒ ト F a s抗原をコ一ドする DNAの塩基配列およびそれから推定され るァミノ酸配列を示す図である。 *印は可能な N—グリコシレ一ションサイ トを、 また、 下線部は予想される細胞膜貫通領域を示す。
図 2はヒト F a s抗原をコードする DNAの塩基配列およびそれから推定され るァミノ酸配列を示す図である。 *印は可能な N—グリコシレーンヨンサイ 卜を、 また、 下線部は予想される細胞膜貫通領域を示す。
図 3は本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体の一つである s h F a s (n d 2 9) をコードする c DNAの塩基配列 （配列番号 1 7 ) を含 むベクター中の部分塩基配列およびそれから推定されるァミノ酸配列を示す図で ある。 *印は可能な N—グリコシレーシヨンサイ トを示す。
図 4は本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体の一つである s h F a s (n d 29) 一 F cをコードする c DNAの塩基配列 （配列番号 1 8 ) を含む ベクター中の部分塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す図であ る。 *印は可能な N—グリコシレ一シヨンサイ 卜を示す。
図 5は本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体の一つである s h F a s (n d 29) -h i n g eをコ一ドする c DNAの塩基配列 （配列番号 1 9) を含むベクター中の部分塩基配列およびそれから推定されるァミノ酸配列を示す 図である。 *印は可能な N—グリコシレーシヨンサイ トを示す。
図 6は s h F a s (n d 29) 一 F cおよび h F a s— F cのゲル電気泳動を 示す図面代用写真である。
図 7はゲル濾過クロマ卜グラフィ一前の s h F a s (nd 29) -h i n g e のゲル電気泳動を示す図面代用写真である。
図 8はゲル濾過クロマトグラフィ一後の s hF a s (n d 29 ) 一 h i n g e のゲル電気泳動を示す図面代用写真である。
図 9は hF a s— F cおよび s h F a s (n d 29) 一 F cのアポト一シス抑 制作用を示す図である。
図 1 0は hFa s— Fcおよび s hFa s (n d 29) 一 F cの細胞アポト一 シス抑制作用を示す図である。
図 1 1は hFa s— Fcおよび s hFa s (n d 29 ) —h i ngeの細胞ァ ポトーシス抑制作用を示す図である。
図 1 2は hFa s— F cおよび s hFa s (n d 29) h i n g eの細胞ァ ポトーシス抑制作用を示す図である。
図 1 3の （a) 〜 （d) は h F a s _ F cおよび s h F a s (n d 2 9 ) 一 F cの GOTおよび GPT上昇抑制作用を示す図である。
図 1 4の （a) 〜 （d) は h F a s— F cおよび s h F a s (n d 2 9 ) -h i n g eの GOTおよび GPT上昇抑制作用を示す図である。
図 1 5の （a) ~ ( c ) はヒ 卜 F a s抗原、 ヒ ト F a s抗原細胞外領域 ( s h F a s) 、 h F a s - F c、 s h F a s (n d 2 9 ) - F cおよび s hF a s ( n d 2 9 ) — h i n g eのアミノ酸配列を比較した模式図であ る。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
ここで、 本発明の新規 F a s抗原誘導体の説明において、 「ァミノ酸配列 （ま たは （ポリ） ペプチド等） を含有する新規ポリペプチド」 とは、 以下のことを意 味する。 第 1は、 その新規ポリぺプチドがそのァミノ酸配列で規定されるもので あってもよいという意味であり、 第 2は、 そのアミノ酸配列に加えてそのアミノ 酸配列の N末端あるいは C末端のいずれか一方、 もしくは両方に任意の 1つ以上 のァミノ酸が付加してなるものであってもよいという意味であり、 さらに新規ポ リぺプチドが融合ポリぺプチドまたは 2つ以上の機能的領域を含むポリぺプチド である場合には、 その融合点または機能的領域間に任意の 1つ以上のァミノ酸が 付加 （挿入） してなるものであってもよいという意味である。
また 「アミノ酸配列 （または （ポリ） ペプチド等） の少なくとも一部分を含有 するポリぺプチド」 とは、 そのアミノ酸配列全体を含有する新規ポリぺプチド、 およびそのァミノ酸配列に含まれる任意の長さからなる任意の- 部分の配列を含 有するポリベプチドを意味する。
また、 本発明の新規 F a s抗原誘導体の説明においては、 「F a s抗原誘 導体」 または 「F a s抗原誘導体ポリペプチド」 とは、 少なくとも F a s抗原の 一部を含有するポリべプチドであって、 F a s抗原変異体および、 F a s抗原ま たは F a s抗原変異体と他の （ポリ） ぺプチドとの融合ポリぺプチドならびにそ れらの多量体等が含まれ、 （ポリ） ペプチド以外の化合物を含有するものも含ま れる。
「 F a s抗原変異体」 または 「 F a s抗原変異体ポリぺプチド」 とは F a s抗 原の一部分または 2つ以上の部分からなるポリぺプチドであって、 基本的に F a s抗原以外に由来する （ポリ） ぺプチ ドを含まず、 F a s抗原が有す る活性または機能の少なく とも一つを有するポリべプチ ドであり、 切断型 (Tr un c a t e d) F a s抗原および F a s抗原の 1ァミノ酸以上を欠失も しくは置換した変異体 （それぞれ欠失体もしくは置換体と呼ぶことがある） 等、 例えば F a s抗原細胞外領域、 ΔΤΜ型 F a s抗原等の膜貫通領域を欠失し た F a s抗原 （F a sATM) および細胞内領域欠失 F a s抗原等が包含さ れる。
「融合ポリペプチド」 とは、 天然には存在しない組合せの 2以上の （ポリ） ぺ プチドが、 直接または間接的に、 好ましくは直接的に、 化学結合した、 好ましく はぺプチド結合したポリぺプチドを意味する。
ここで F a s抗原の 「N末端領域」 とは、 ヒト F a s抗原 （図 1、 2) を例に 挙げ説明すると、 広義にはシグナルペプチド （図 1において一 1 6番目の Me t から— 1番目の A 1 a) 由来のァミノ酸残基も含まれるが、 本発明の新規 F a s 抗原誘導体においては、 特にシグナルべプチドが除去された F a s抗原の N末端 ァミノ酸残基 （A r g) を N末端とし、 この N末端ァミノ酸残基 （A r g) より 始まり最初のシスティン残基 （4 3番目） の直前のァミノ酸残基 （4 2番目 の P h e ) までの領域を意味する。
「活性または機能」 とは、 F a sリガンド結合活性、 後述するようなアポト一 シス抑制活性もしくはアポトーンス誘導活性等の生物活性、 安定性、 体内動態、 または溶解性等の物理化学的性質等からもたらされる機能を含むが、 その中で F a sリガンド結合活性およびァポトーシスに対する作用が好ましく、 アポト一シ CT/JP97/01502 ス抑制活性が特に好ましい。
また、 「改良された活性または機能を有する」 とは、 対応する N末端領域を欠 失していないポリペプチド （N末端領域非欠失体） と比較して、 少なくとも一つ の活性等の値が、 少なくとも大であること、 例えば 1 . 4倍以上、 好ましくは 2 倍以上、 より好ましくは 3倍以上、 さらに好ましくは 5倍以上、 特に好ましくは 1 0倍以上であることを意味する。 活性値等の比較は、 一般的な方法が用いられ るが、 単位量あたりの活性量、 すなわち比活性で比較することができる。 比活性 は、 通常 5 0 %阻害濃度 （ I C . ,) または 5 0 %有効用量 （E D 5。） 等によって 求められる。
本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体は、 少なくとも、 F a s钪原ポリ ぺプチドの N末端ァミノ酸残基から最も N末端よりのシスティン残基までのァミ ノ酸残基 （該システィン残基は除く） のうち少なくとも 1つのアミノ酸残基が欠 失した F a s抗原細胞外領域ポリべプチドの一部または全部を、 少なくとも含有 する新規 F a s抗原誘導体である。 ここで上記少なくとも 1つのァミノ酸残基が 欠失した F a s抗原細胞外領域ポリぺプチドの一部または全部および本発明の新 規 F a s抗原誘導体は、 少なくとも F a sリガンドと結合する能力を有する。 上記の 1個以上のァミノ酸残基を欠失させる対象となる F a s抗原としては、 特に由来は限定されないが、 哺乳動物の F a s抗原、 特にヒト F a s抗原、 例え ば図 1、 2に示した公知のヒ 卜 F a s抗原のァミノ酸配列を含有するものが よい。
ァミノ酸残基を欠失させる対象となる F a s抗原が図 1、 2に示したヒト F a s抗原の場合は、 本発明の新規 F a s抗原誘導体は配列表の配列番号 1 5 (ヒト F a s抗原の細胞外領域） の N末端から数えて 1〜4 2番目のアミノ酸残基のう ち少なくとも 1つが欠失した新規 F a s抗原誘導体、 好ましくは欠失したァミノ 酸残基数が 2 9以上であり、 特に好ましくは欠失したアミノ酸残基数が 2 9であ る新規 F a s抗原誘導体である。
欠失させるァミノ酸はァミノ酸配列上連続していても連続していなくてもよい が、 連続している方がより好ましく、 この場合、 N末端側から優先的に欠失させ ることがより好ましい。 すなわち、 配列表の配列番号 1 5の N末端から数えて第 1番目から 2 9番目までの 2 9個のァミノ酸残基を欠失した、 3 0番目の T h r 残基から始まる新規 F a s抗原誘導体が特に好ましい。
また、 欠失させることが望ましい N末端領域のアミノ酸残基の数および位置に 関しては、 実施例で詳述するような、 F a s抗原細胞外領域等のコンピューター による立体構造解析の結果を参考にすることができる。 すなわち、 立体構造解析 において F a s抗原の N末端領域構造が F a s リガンドとの結合において立体障 害とならないように設計することで、 F a s リガンドとの結合力等を至適化また は調節することが可能である。
また、 F a s抗原の N末端領域はその構造上の特性からプロテアーゼ等による 分解を受けやすい可能性がある。 また、 宿主によってポリペプチドのプロセッシ ングが質的または量的に異なる可能性もあり、 N末端領域を欠失させる場合には これらの点ならびに溶解性および安定性等をも考慮に入れることができる。 以上のような点を考慮すると、 ヒト F a s抗原の場合、 N末端領域から欠失さ せることが好ましいアミノ酸残基は、 好ましくは 1 3または 1 8以上、 より好ま しくは 2 3以上、 さらに好ましくは 2 9以上であり、 いずれの場合も N末端から 数えて 3 6番目から 4 2番目のァミノ酸残基は欠失させない方が好ましい。 また本発明の新規 F a s抗原誘導体には、 N末端領域のアミノ酸残基、 特にヒ ト F a s抗原の場合、 配列表の配列番号 1 5の N末端から数えて 1〜 4 2番目の ァミノ酸残基のうち少なくとも 1つが欠失した F a s抗原細胞外領域の一部また は全部を含有する新規 F a s抗原変異体、 好ましくは欠失したアミノ酸残基数が 2 9以上であり、 特に好ましくは欠失したァミノ酸残基数が 2 9である F a s抗 原の 1または 2以上の部分からなる新規 F a s抗原変異体である新規 F a s抗原 誘導体が含まれる。
具体的には本発明の F a s抗原変異体には、 その C末端側に図 1、 2の第 1 5 8〜 1 7 4残基のポリぺプチド、 第 1 7 5〜 3 1 9残基のポリぺプチド、 ま たは第 1 5 8〜3 1 9残基のポリペプチドを含有するものが含まれ、 第 1 5 8〜 3 1 9残基のポリペプチドから得られる任意の長さの任意の断片を任意の順番に 組み合わせたものを F a s抗原変異体の C末端または N末端、 好ましくは C末端 側に含有するものも含まれる。
ここで、 欠失したァミノ酸残基数が 2 9である好ましい新規 F a s抗原変異体 は配列表の配列番号 9 ( s h F a s ( n d 2 9 ) ) のァミノ酸配列を含有するも のであり、 より好ましくは該アミノ酸配列からなるものである。
新規 F a s抗原誘導体には他の化学物質等、 例えば （ポリ） ペプチド、 糖鎖、 脂質またはその他の高分子もしくは低分子の化合物等との結合物が包含され、 こ のうち他の （ポリ） ぺプチドとの融合ポリぺプチドが好ましい。 該 （ポリ） ぺプ チドは、 全く限定されず、 また、 2種以上の （ポリ） ペプチドを含んでもよく、 その場合当該 2種以上の （ポリ） ペプチドの結合順番を入れ換えることもでき、 アミノ酸以外のものを含んでも構わない。
他の化学物質等と必須の新規 F a s抗原変異体の結合の種類は特に限定さ れず、 共有結合および非共有結合の何れもが含まれるが、 結合の安定性から共有 結合によるものが好ましい。 特に他の化学物質が （ポリ） ペプチドの場合、 ぺプ チド結合力 <好ましい。
また、 結合の部位も適宜選択可能であり、 当該新規 F a s抗原変異体の N 末端、 C末端および側鎖の何れも結合部位として用いることができるが、 好まし くは両末端のいずれかもしくは両方、 より好ましくは C末端を介して結合す る。
他の化学物質が （ポリ） ペプチドである場合、 該 （ポリ） ペプチドは、 当該新 規 F a s抗原誘導体の活性または機能を向上または修飾するような作用を有する (ポリ） ぺプチド等が好ましい。 例えば、 安定性もしくは血中半減期を向上させ るもの、 または特定の組織、 細胞もしくはその他の特定部位への集積性を高める ものが含まれ、 血中半減期を延長させる例としては F c断片が挙げられる。 当該 新規 F a s抗原誘導体が多量体になるような機能を有する （ポリ） ペプチド等が 特に好ましい。 多量体化するような （ポリ） ペプチドとしてはィムノグロブリン 重鎖および軽鎖の定常領域の全体もしくは部分、 重鎖定常領域の第 1領域 ( C H 1 ) を除く領域の全体もしくは部分、 または F c断片 （I g Gの場合、 ヒ ンジ領域、 C H 2領域および C H 3領域からなるものとする） の全体もしくは部 分 （例えばヒンジ領域、 C H 2領域、 C H 3領域もしくは C H 4領域の各領域の 単独または任意の組合せ） 等があげられ、 P， c断片およびヒンジ領域の少なくと も 1部からなるものが好ましい力く、 ヒンジ領域のシスティン残基の少なくとも 1 つ、 好ましくは全部を含むヒンジ領域の部分、 または該ヒンジ領域の部分もしく は CH3領域 （I gMおよび I gEの場合、 CH4領域） を含む F c断片および ヒンジ領域の部分がより好ましく、 ヒンジ領域全体を含む F c断片の全体もしく は部分およびヒンジ領域そのものが特に好ましい。
この場合のィムノグロブリ ンは、 由来する種は何れでもよいが、 ヒ ト由 来のものが好ましい。 また、 クラス及びサブクラスに関しても必ずしも限定され ず、 I gG K I gG 2、 I gG3、 I gG 4、 I g A U I gA2、 I gM, I gEおよび I gD等の何れもが使用可能であるが、 例えば、 I gGが好ましい 例である。 F c断片等を含む新規 Fa s抗原誘導体は、 通常 2量体を形成し得る 力 \ 由来するクラスが I gMの場合、 1 0量体に、 また I gAの場合、 4量体を 形成するものも含まれる。
ところで、 ィムノグロブリンの定常領域、 特に F c領域は、 その抗体の抗原特 異性とは直接関与しない抗体分子の種々のェフエクタ一機能等に重要であること が知られている。 例えば、 補体の結合および活性化、 F c受容体 （FcR) との 結合、 ADCC活性の誘導、 胎盤通過性、 マス卜細胞の顆粒放出反応等ならびに プロテイン A反応性がある。
これらの機能は、 本発明の新規 Fa s抗原誘導体に取り込まれた場合、 有効に 利用しうるものであるが、 ある場合、 例えば特定の疾患においては、 医薬として 生体に投与した場合には副作用を惹起する原因となる可能性も有している。 そこ で、 そのような場合には、 それらのエフヱクタ一機能等の全部または一部を除去 した F c断片等が好ましく、 例えば I gGの CH 2領域の糖付加部位に変異を導 入して該部位の糖鎖を欠失させた F c変異体、 CH2領域を欠失した I gGの定 常領域もしくは F c断片、 またはヒンジ領域等が好ましい例である。
また、 新規 F a s抗原誘導体における、 新規 F a s抗原変異体と他の （ポリ） ペプチド等との結合は、 直接的であることが好ましいが、 間接的なものでも よく、 例えば新規 F a s抗原誘導体の活性や機能を大きく損なわないようなぺプ チドリンカーまたは適当な化学的スぺ一サーを介して結合してもよい。
本発明の新規 F a s抗原誘導体は、 多量体化することによりその活性または機 能がさらに改良される。
多量体は、 2量体以上のものを全て含むが、 好ましくは 2〜1 0、 より好まし くは 2または 3、 特に好ましくは 2量体である。 またホモおよびへテロポリマー のいずれも含まれるが、 ホモポリマーがより好ましい。
多量体化の方法は、 それ自体多量体化しうる様な （ポリ） ペプチドの多量体化 する性質を利用することが好ましい方法である。 前記の、 ィムノグロブリ ンの定 常領域またはその部分 （例えば F c断片およびヒンジ領域） の多量体化する性質 を利用することが特に好ましい方法である力く、 その他にヒンジ様構造をとりうる システィン含有べプチドまたは該ぺプチドを含有するポリべプチドを使用しても よい。 また、 それ以外に F a s抗原または T N F— Rの細胞内領域等も使用する ことができる。 多量体における各単量体間の結合は、 いかなる結合でもよく、 共 有結合 （例えばジスルフィ ド結合やペプチド結合） が好ましいが、 非共有結 合 （例えばィムノグロブリンの 2つの C H 3領域間、 または F a s抗原もしくは T N F— Rの細胞間領域間の結合） でもよい。
その他に、 化学的架橋による方法がある。 例えば、
1 ) C末端にシスティンを導入後、 2種類の活性化リ ンカ一を用いて架橋 する。 システィンの導入には、 システィンアミ ドおよびカルボキシぺプチダーゼ
Yを用いる方法がある。 C末端アミノ酸がリジンである場合には、 リジンエンド ぺプチダ一ゼを適用する。 また、 遊離システィンが存在する場合は、 C末端にシ スティンを導入する前に予めアルキル化によって保護しておく。 その後、 活性化 リンカ一を用いて架橋する。 例えば、 2価の架橋試薬としては、 N， N' 一 0— フエ二レンジマレインイミ ド （G l e n n i e等、 J . I mm u n o 1 . 1 3 9 巻、 2 3 6 7— 2 3 7 5頁、 1 9 8 7年） 等力 また、 3価の架橋試薬とし ては、 トリスーマレインイミ ド化合物 （特開平 6— 2 2 8 0 9 1 ) 等が抗体の架 橋に使用されており、 本発明の新規 F a s抗原誘導体にも応用可能であり、 それ ぞれ 2量体または 3量体を形成することができる。
2 ) C末端にピオチンを導入後、 アビジン等を用いて架橋する。 ビォチンアミ ドを用いてシスティンと同様に C末端に導入する。 アビジン架橋により 4量体が 形成されるが、 反応条件によっては高度な凝集体が形成する。 また、 他の機能性 ポリペプチド等を結合することもできる。 ピオチン一アビジン間の結合は、 強力 な非共有結合の例である。
3 ) 新規 F a s抗原誘導体配列内またはこれと結合させた （ポリ） ペプチド等 に存在するシスティン、 チオールまたはァミノ基に特異的な架橋試薬を用いて架 橋" 5る。
以上の場合において、 適当な長さのぺプチド性もしくは化学的リンカーまたは スぺーサ一が使用できる。
また、 新規 F a s抗原誘導体が、 例えば脂質または疎水性ペプチド等の脂溶性 物質を包含することにより公知の方法に従ってリポソ一ム化することも可能であ る。 例えば、 F a s抗原の細胞膜貫通領域を含有する本発明の新規 F a s抗原誘 導体は、 それ自体リボソーム等に取り込ませることが可能である。 これらのリポ ソ一ムは、 高度な多量体であるとともに、 さらに適当に修飾することにより特定 の細胞や組織に取り込ませる等の応用も可能である。
本発明の新規 F a s抗原誘導体のうち多量化能を有するものの好適な具体 例は、 配列表の配列番号 1 0 (s h F a s (n d 2 9) — h i n g e) およ び 1 1 ( s h F a s (n d 2 9 ) - F c ) のアミノ酸配列を含有するものが挙げ られ、 より好ましくは該配列からなるものである。
配列番号 1 0、 1 1のポリぺプチドの多量体のうち 2量体は、 ヒト F a s抗原 細胞外領域の N末端から 2 9個のアミノ酸残基を欠失させることにより活性が向 上した本発明の F a s抗原誘導体を 2量体化したもので 2量体化しても向上した 活性を損なうことなく結果として 2量体化することにより非常に高い F a sリガ ンド結合活性およびアポトーシス抑制活性を有する。
一般に、 ポリペプチドは、 種の相違あるいは個体の相違によって、 そのポリべ プチドが本来有する機能を基本的に有したまま、 進化の過程において生じた変異 によりアミノ酸配列が異なっている。 ここでいぅァミノ酸配列の変異とは、 1 ) ポリぺプチドのァミノ酸配列中の 1つ以上のァミノ酸残基の欠失、 2 ) 他の ァミノ酸残基への置換、 3 ) 上記のァミノ酸配列中の任意の位置に 1つ以上のァ ミノ酸残基の挿入あるいは付加をいう。 このような変異は、 遺伝子工学的な技術 を用いて人工的に生じさせることも可能であり、 このような変異を有するポリべ プチドも本願の新規 Fa s抗原誘導体に含まれる。
また新規 F a s抗原誘導体は N末端にメチォニン残基またはシグナルぺプチド 由来もしくはプロべプチド由来の 1以上のァミノ酸残基が付加されているもので もよい。
本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体は、 その特徴を失わない限り、 い 力、なる修飾を受けていてもよい。 修飾としては、 天然の蛋白質が通常受けるであ ろう、 ポリぺプチドの翻訳過程または翻訳後の修飾および化学的修飾等がある。 天然の修飾としては、 例えば糖鎖の付加等があげられ、 蛋白質に対する糖付加と しては、 N グリコシレーシヨン、 0—グリコシレ一シヨンおよび非酵素的な糖 付加などが知られており、 本発明第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体は、 何れの 糖鎖を有していても有していなくてもよい。
本発明の新規 F a s抗原誘導体は、 N グリコシレーシヨンサイ トを有する場 合があり、 例えば、 2 9個の N末端領域ァミノ酸残基欠失 F a s抗原細胞外領域 は、 2個の N グリコシレーシヨンサイ トを有している。 したがって、 当該新規 F a s抗原誘導体は、 これを産生する宿主によって糖鎖を有する場合がある。 す なわち、 動物細胞および酵母などの真核細胞を宿主とすると産生された上記夕ン パク質は上記 N グリコシレーシヨンサイ 卜に糖鎖を有し、 大腸菌などの原核細 胞を宿主とすると糖鎖を有しないと考えられる。 また、 糖鎖の数、 長さ、 または 糖鎖の糖組成および配列はこれら宿主の培養時の培地組成などによっても異なる ため、 特に限定されない。 その他の天然の修飾としては、 脂質の結合等があ o
近年の技術開発により、 ポリペプチドをさらに様々に修飾することが可能 となった。 修飾可能な部位としては、 N末端もしくは C末端のアミノ酸残基また は側鎖の官能基が含まれる。 例えば、 ポリエチレングリコール、 スチレン マレ イン酸コポリマー、 デキストラン、 ピランコポリマ一、 ポリリジン等の合成高分 子、 脂質、 多糖類や （ポリ） ペプチドなどの天然分子、 ホルモン等の生理活性分 子、 マグネタイ ト等の無機物質等をポリペプチドに結合させることができるよう になった （P r o Na t l. Ac a d. S c i. USA, 84卷， 1 4 87 一 1 49 1頁 （1 98 1年） ； B i o c h em i s t r y, 28卷， 66 1 9 - 6 624頁 （1 989年） ） 。
その他の修飾を受けた誘導体には、 例えば、 カルボキシル基の脂肪族エス テル、 アンモニアまたは一級若しくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基 のアミ ド、 ァシル残基 （例えばアルカノィルまたはカルボキシルァロイル基） に よって形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基の N—ァシル誘導体、 あるいはァ シル残基によって形成された遊離ヒドロキシル基 （例えばセリンまたはスレオニ ン残基のヒドロキシル基） の 0- ァシル誘導体が包含される。
本発明の新規 F a s抗原誘導体も上述のような公知の方法の組み合わせによつ て上述のような修飾が可能である。 従って、 本発明の新規 F a s抗原誘導体 には、 本発明第 1の態様のポリペプチドの特徴を失わない限り、 このような修飾 を受けたものも含まれる。 また、 それらの修飾によって、 本発明の第 1の態様の 新規 Fa s抗原誘導体の活性または機能を修飾または向上させたり、 別の活性ま たは機能を付与したり、 組み合わせることも可能である。 例えば、 活性または機 能としては、 安定性、 溶解性、 体内動態または特定の細胞、 組織もしくは臓器へ の指向性等が含まれる。 そのような修飾を受けた新規 F a s抗原誘導体も本発明 の範囲に含まれる。
また、 本発明の新規 F a s抗原誘導体は、 塩の形で存在するものも包含する。 ここで、 「塩」 とは、 蛋白質分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基への酸付 加塩の両者を意味するものである。 カルボキシル基の塩は本技術分野でよく知ら れている方法によって形成され、 無機塩、 たとえばナトリウム、 カルシウム、 ァ ンモニゥ厶、 三価の鉄または亜鉛の塩等、 および有機塩たとえばトリエタノール ァミン、 アルギニンもしくはリジン、 ピぺリジン、 プロ力イン等によって形成さ れる塩を包含する。 酸付加塩には、 たとえば塩酸もしくは硫酸のような鉱酸との 塩、 および有機酸たとえば酢酸もしくはシユウ酸との塩が包含される。
本発明の新規 F a s抗原誘導体は医薬への応用が可能であるが、 その場合には 上記の修飾等は医薬的許容性を維持するものであることが望ましい。
また、 上記第一の態様の新規 F a s抗原誘導体の生産方法は特に限定されず、 天然物から分離精製されたものでもよく、 一般的に使用される化学合成機 （ぺプ チドシンセサイザー 4 3 O A型、 パーキン一エルマ一ジャパン） などを用いて人 工合成してもよく、 遺伝子組換え法により得たものであってもよい。 またそれ等 から分離精製されたポリべプチドを適切な化学的処理、 例えば酵素を用いて処理 することによって、 欠失または断片化させて得られるもの、 およびそれらを化学 的に結合させたものおよび多量体化させたものでもよい。 すなわち、 本発明の新 規 F a s抗原誘導体のうち単量体は、 多量体を製造するための中間体または中間 材料としても有用である。
上記のうち、 生産量、 生産されたタンパク質の均一性または純度の面、 例 えば、 ヒト由来の他の夾雑タンパク質を含まないこと等から本発明第 5の態様で 詳述する遺伝子工学的に生産されたものであることが好ましい。
遺伝子工学的に生産する 1例を以下に簡単に説明する。 実施例 1 ( 1 ) で述べ るプラスミ ド p M 1 097は、 配列表の配列番号 9のァミノ酸配列をコ一ドする 配列番号 1 2の塩基配列で表される DNAおよび F a s抗原のシグナルペプチド をコードする DNAを含有する。 これを適当なベクタ一、 例えば実施例で示され る pEF— BOSに dh f r遺伝子を組み換えたブラスミ ド p M 1 1 03へ組み 換えることによって作製した発現ベクターを用いて COS— 1細胞を形質転 換し、 得られた形質転換体の培養上清から、 s h F a s (n d 29) を得た。 本発明の新規 F a s抗原誘導体の活性または機能のうちアポトーシス抑制活性 は、 Fa s抗原発現細胞のアポ卜一シスに対する抑制率を測定することによって 調べることができる。 例えば、 標的である F a s抗原発現細胞としては、 F a s抗原を発現する培養細胞株または形蜇転換細胞を、 エフ クタ一とし ては、 F a sリガンドを発現するように形質転換して得られた細胞または F a s リガンド細胞外領域などの可溶型 F a sリガンドを用いて、 51 C rリ リースアツ セィまたは MTTアツセィ （Mo sma n n T. 、 J . I mmu n o l . Me t h od s, 65巻、 55 - 63頁、 1 983年） 等により求める。 具体的 な方法は、 実施例に示してある。 当該新規 F a s抗原誘導体は、 マウス細胞 WR 1 9 Lをヒト F a s抗原を発現するように形質転換させて得られた WC 8細 胞に対するアポトーシス抑制活性が、 対応する N末端領域非欠失 F a s抗原 （誘 導体） と比較して活性において少なくとも大であること、 例えば 1. 4倍以上、 好ましくは 2倍以上、 より好ましくは 3倍以上、 さらに好ましくは 5倍以上、 特 に好ましくは 1 0倍以上である。
本発明の新規 F a s抗原誘導体は、 F a s抗原を介するアポト一シスを調節し 得るので、 生体内で生じる F a s抗原を介するアポト一シスの亢進または不全の 関与する疾患の予防、 および治療に有用である。 例えば、 好ましい本発明の新規
F a s抗原誘導体は、 F a sリガンドと F a s抗原との結合を拮抗的に阻害して アポトーシスの誘導を阻害し得るので、 肝炎等の重篤な感染症の際に肝細胞等の アポトーシスを妨げ、 主要臓器 ·組織における細胞の急激な減少を防ぐこと によってこれらの組織および臓器の機能の低下を防止することが可能であり、 ゥ ィルス等による感染症およびその合併症の治療に使用することができ、 例えば、 インフルエンザ、 エイズ、 肝炎等の治療薬として使用することができる。 また、 ある種の自己免疫疾患、 例えば糖尿病、 再港流障害等の虚血性心疾患における心 筋障害、 腎炎、 多臓器不全ならびに臓器移植の際の臓器保全および移植片対宿主 病 （G V H D) 等の処置にも有用である。
本発明の新規 F a s抗原誘導体は、 F a sリガンドとより特異的でかつ高い親 和力で結合するので、 F a sリガンドの検出にも使用可能である。 また、 F a s 抗原が保有する抗原性の少なくとも一部を保持しているので、 抗 F a s抗体とも 結合する事が可能であり、 抗 F a s抗体によるアポトーシスの抑制にも効果的で ある。
また、 F a sリガンド自体を、 治療や研究に使用するためには、 当該蛋白質を 高純度で、 大量に生産することが必要になるが、 本発明の新規 F a s抗原誘導体 は、 ァフィ二ティークロマトグラフィー用カラムの作製に使用することができ、 F a s リガンド等の F a s抗原に結合する物質の精製にも有用である。
本発明の第 2の態様は、 本発明の第一の態様の新規 F a s抗原誘導体をコード する D N Aである。
本明細書の D N A及び組換え D N A分子の説明において 「塩基配列を含有する DNA」 とは、 ある DNAがその塩基配列からなる DNAであってもよく、 また、 その塩基配列の 5' 末端あるいは 3' 末端のいずれか一方、 もしくはその 両方に 1つ以上の任意の塩基が付加された配列からなるものであってもよいこと を意味する。
本発明の新規 DNAは、 本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体、 好まし くは、 配列表の配列番号 9〜 1 1のアミノ酸配列をコードする塩基配列の少なく とも一部を含有するものである。 一般に、 アミノ酸をコードする DNAの卜リブ レッ ト （コドン） は、 アミノ酸の種類によって 1種類から 6種類まで存在するこ とが知られているので、 本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体のァミノ酸 配列をコードする DNAの塩基配列は 1種類には限定されない。 従って、 本発明 の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体、 好ましくは、 配列表の配列番号 9〜 1 1 のァミノ酸配列の少なくとも一部、 より好ましくは全部をコ一ドする塩基配列を 含有する DN Aである限り、 いかなる塩基配列からなるものであっても、 本発明 の範囲内に含まれる。 本発明の新規 DNAは、 さらに好ましくは、 配列表の配列 番号 9〜 1 】に記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列のうち配列表の配列番 号 1 2〜 1 4の少なくとも一部を含有する DNAであり、 特に好ましくは、 配列 表の配列番号 1 2〜1 4の塩基配列の全体を含有するものである。
本発明の DNAは c DNA、 染色体 DNAおよびそれらの組合せならびに適当 にスプライシングされうるイントロンを含む c DNAであってもよい。 し力、し、 遺伝子工学的な取扱いの容易さから、 本発明の DNAは cDNAであることが好 ましい。
本発明によれば、 本発明の新規 DNAに対応する RNA、 または本発明の新規 DNAと相補的な配列を含有する D N A及び R N Aも提供される。 本発明の新規 DN Aとそれに相補的な DNA及び RNAとカ^ 互いに相補的に結合して 2 本鎖、 あるいは 3本鎖を形成していても良い。 また本発明の新規 DN Aと雑種形 成 （ハイブリダィズ） しうる塩基配列を含有する DNA及び RNAも提供さ れる。 この場合においてもそれらが互いに結合して 2本鎖、 あるいは 3本鎖を形 成していても良い。 以上の場合、 核酸塩基として、 イノシンのようなュニバーサ ルベースを有していてもよい。
本発明の第 2の態様の DN Aは、 いかなる方法で得られたものであっても よい。 例えば、 化学合成されたものであってもよく、 適当な DNAライブラリー から得たものであっても、 ヒト F a s抗原の全長または部分をコードする DNA を含む D N Aを铸型として P C R (P o l y m e r a s e C h a i n Re a c t i on) 法で得たものであってもよい。 また、 これらの方法で得た D N Aまたはその断片を必要に応じてァニーリング、 ライゲーシヨンして作製する こともできる。
本発明の DN Aは、 以下のようにして化学合成をすることができる。 具体的に は、 本発明の DNAを約 20 - 30塩基からなる断片に分けて、 DNA化学合成 機 （例えば、 394型、 アプライドバイオシステムズ社製） を用いて、 複数の断 片として合成し、 その後、 必要に応じて各断片の 5' 末端をリン酸化して各断片 をァニーリングし、 ライゲーションして目的の DN Aを得る。
また本発明の DNAは、 ゲノムライブラリーもしくは cDNAライブラリ一等 を铸型とする PC R法によっても得ることができる。 PCR法を用いる場合、 公 知の塩基配列および本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体をコードする D N A等の塩基配列をもとに、 また必要に応じて制限酵素認識配列等組み合わせて 設計した、 センスプライマ一及びアンチセンスプライマーを作製し、 任意の DN Aライブラリ一等に対して公知の方法 （ミカエル A. I (M i c h a e l A. I . リ 綸、 Po l yme r a s e Ch a i n Re a c t i on, P C R P r o t o c o l s, a g u i d e t o m e t h o d s a n d a p p 1 i c a t i o n s ( 1 9 9 0年） 、 アカデミ ッ ク出版 (Ac a d em i c P r e s s) 、 参照） に準拠して行うことによって得るこ とができる。 典型的な例は、 実施例において述べる。
上述した DN Aライブラリ一は、 本発明の第二の態様の DN Aまたはその一部 を含むものであればよく、 特に限定されない。 したがって、 市販の DNAライブ ラ リーを使用してもよく、 ヒ 卜の末梢血などから得たリ ンパ球、 ヒ 卜の株化 細胞、 またはハイプリ ドーマなどといった適当な細胞を、 必要があれば適当な活 性化剤で活性化し、 サムブルック J . らの方法に準拠して c D N Aを作製して 使用してもよい。 なお、 ヒ ト F a s抗原をコー ドする DNAを含む形質転換 体は、 本発明の出願人により日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の通商産業 省工業技術院生命工学工業技術研究所 （以下、 生命工学工業技術研究所という） に受託番号 FERM B P— 3826として寄託されている。
本発明の第 2の態様の新規 D N Aは、 本発明の第 3の態様の組換え D N A分子 の作製に使用することができ、 この組換え DN A分子によって宿主を形質転換さ せることにより、 本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体を均一にかつ大量 に生産するために使用することができる。
これによつて、 新規 Fa s抗原誘導体を治療薬の主成分として医薬の分野に提 供したり、 診断薬として利用することが可能になる。 本発明の新規 D N Aを用い て本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体を産生する方法は、 本発明第 5の 態様で説明する。
さらに、 本発明の第 2の態様の D N Aは、 遺伝的にまたは後天的に F a sリガ ンドまたは F a s抗原を介したアポトーシスに異常を有する患者の遺伝子治療に 応用することができる。 すなわち、 本発明の新規 D N Aを適当なベクターに連結 し、 生体または細胞に直接導入して、 関節リュウマチおよび S L E等の自己免疫 疾患、 エイズ、 肝炎ならびに腎炎等の患者の治療および発症予防を行うこともで きる。
次に、 本発明の第 3の態様の組換え D N A分子について説明する。 本発明の第
3の態様の組換え D N A分子は、 上述した本発明の第 2の態様の新規 D N Aを含 むことを特徴とする。
本発明の新規組換え D N A分子は、 環状または直鎖状等、 1本鎖または 2本鎖 ならびにその複合した鎖等、 いかなる形態のものであってもよく、 目的に応じて 適宜選択しうるが、 取り扱いの容易さや宿主中への組み込みの容易さからは、 環 状であることが好ましく、 安定性等からは 2本鎖であることが好ましい。
本発明の新規組換え D N A分子は、 本発明の第 2の態様の D N Aの塩基配列の
5 ' 末端、 あるいは 3 ' 末端のいずれか一方、 もしくはその両方に任意の 1っ以 上の塩基が付加されたものであつてもよい。
ここで付加される塩基は、 本発明の新規 D N Aに、 コーディングフレームのず れを生じさせない限りいかなるものであってもよく、 例えば、 アダプタ一配列、 リンカ一配列、 シグナル配列をコードする塩基配列、 —ガラク トシダ一ゼ等の 他のポリぺプチドをコ一ドする塩基配列、 もしくは D N Aプローブ等を作製する 際にその検出感度の増加を目的として付加される配列等を挙げることができ る。
本発明の組換え D N A分子は、 本発明の第 2の態様の新規 D N Aに加えて、 必 要により他の塩基配列を含有していることが好ましい。 ここでいう 「他の塩基配 列」 とは、 ェンハンサ一の配列、 プロモーターの配列、 リボゾーム結合部位 配列、 D N Aのコピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、 翻訳開始コド ン、 シグナルペプチドをコードする塩基配列、 他のポリペプチドをコードする塩 基配列、 翻訳終止コドン、 ポリ A付加配列、 スプライス配列、 複製開始点、 選択 マーカ一となる遺伝子配列等をいう。
どのような塩基配列が必要となるかは、 作製する組換え D N A分子の使用目的 によって定まるが、 好ましくは本発明の第一の態様の新規 F a s抗原誘導体を産 生するように宿主細胞を形質転換できるものであり、 したがって、 当該組換え D N A分子は少なく とも、 本発明第二の態様の新規 D N Aに加えて翻訳開始コ ドン、 終止コドン、 複製開始点および選択マ一力一遺伝子の配列を含有している ことが好ましく、 さらに宿主内で機能するプロモーター配列を含有しているもの がより好ましい。 特に、 これらの配列に加えて、 シグナルペプチドをコードする 配列を含有するものは、 本発明の第一の態様の新規 F a s抗原誘導体を分泌発現 するように、 宿主細胞を形質転換できるので好ましい。 例えば、 配列表の配列番 号 1 2〜1 4の塩基配列の全体を含有する D N Aを適当なベクタ一中でシグナル ぺプチドをコ一ドするシグナル配列の下流に接続した組換え D N A分子を作 製し、 これを用いて適当な宿主を形質転換させると、 ここで得られた形質転換体 の培養時にはその培養上清中に配列表の配列番号 9〜 〗に記載のァミノ酸配列 を含有するポリべプチドを分泌させることができる。 接続するシグナル配列は、 適宜選択することが可能であるが、 F a s抗原、 特にヒト F a s抗原のシグナル ぺプチドをコ一ドするシグナル配列が好ましく、 図 1 または図 3に示したヒ 卜 F a s抗原のシグナルべプチドをコ一ドするシグナル配列等がその例であ る。
その他に、 T N Fまたは G— C S Fのシグナルペプチド、 大腸菌のアル力 リフォスファタ一ゼのシグナルぺプチド、 酵母の P H 0 1のシグナルぺプチドぉ よび酵母の α —ファクタ一 （α— f a c t 0 r ) のシグナルぺプチドをコ一ドす る配列等から使用する宿主および条件に応じて適したものを選択して利用するこ とができる。
選択マーカー遺伝子としては、 アンピシリ ン耐性遺伝子、 カナマイシン耐性遺 伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子、 チミジンキナーゼ遺伝子等を挙げることが でき、 少なくとも 2つの選択マーカーが含まれている新規組換え D N A分子が、 酵母や哺乳動物細胞を宿主にする場合に、 目的遺伝子で形質転換されたクローン を容易に選択できるという理由から好ましい。 コピー数の増幅を目的として使用 される配列としては、 デヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子 （d h f r ) の配列等を 使用することができる。
宿主内で機能するプロモーター配列としては、 宿主が大腸菌の場合は t r pプ 口モータ一または 1 a cプロモータ一であり、 宿主が酵母や C O S細胞などの真 核細胞の場合はアルコールォキシダーゼ 1 ( A〇X 1 ) のプロモータ一、 ボリへ ドリンプロモータ一、 S V 4 0プロモータ一、 S R のプロモータ一、 またはヒ トエロンゲ一シヨンファクター 1 ひ (E F 1 α) のプロモータ一などの配列を挙 げることができる。
本発明の組換え DNA分子の好ましい例は、 宿主の観点からすると、 本発明の 第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体を発現するように大腸菌を形質転換させ得る ものである。 従って、 本発明の組換え DNA分子は、 少なくとも、 大腸菌の複製 開始点、 マーカー配列に加えて大腸菌内部で機能するプロモーター配列を有して いることが好ましく、 さらにシグナルぺプチドをコ一ドする配列を有してレ、るこ とが好ましい。
大腸菌で機能する好適なプロモーター配列としては、 t r pプロモーター、 】 a cプロモータ一等であり、 大腸菌で機能するシグナルペプチドとしては、 大腸 菌のアル力リフォスファタ一ゼのシグナルぺプチドが好適である。
また、 より好ましい例は、 本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体を 発現するように動物細胞または酵母等の真核細胞を形質転換させるものである。 この場合には、 本発明の組換え DN A分子は、 少なくとも、 翻訳開始コドン、 終 止コ ドン、 選択マーカ一遺伝子に加えてポリ Λ付加配列を、 さらに動物細 胞で機能する SV 4 0のプロモーター、 ヒト伸長因子 （E 1 0 n g a t i o n F a c t o r 1 a (E F 1 a) ) のプロモータ一、 S Raプロモ一夕一ま たは、 酵母で機能するアルコールォキシダ一ゼ 1 (AOX 1 ) のプロモーターな らびに、 S V 4 0の複製開始点等を有するものが本発明の組換え D N A分子の好 適な例として挙げられる。
本発明の第 3の態様の組換え D N A分子は、 本発明の第 2の態様の新規 D N A を任意の塩基配列を有する他の DNA断片とライゲーションする方法、 または任 意のベクターに導入する方法 （サムブルック J. (S amb r o o k J. ) 等 ： Mo l e c u l a r C l o n i n g, a L a b o r a t o r y M a n u a l 2 n d e d . , C o l d S p r i n H a r b o r L a b o r a t o r y, ニューヨーク （N ew Yo r k) , 1 9 8 9年， 参照） 等で得ることができる。
具体的には、 DNAとベクターとをそれぞれ適当な制限酵素で消化して、 得ら れた各断片を D N Aリガーゼを用いてライゲ一シヨンさせればよい。 ベクターと しては、 プラスミ ドベクター、 ファージベクタ一、 ウィルスベクタ一等いかなる ものでもよく、 市販品を利用してもよい。 ベクタ一の代表的なものとしては、 pUC 1 1 8、 p BR 322 p SV 2— d h f r、 pB l u e s c r i p t I I、 PH I L— S I、 λ Z a p I λ g t 1 0 , pA c 7 0 0、 YR P 1 7、 pEF— BOS、 p E FN— I I等が挙げられる力く、 pEF— BOS等を 用いることが高発現を期待できることから好ましい。
また、 本発明の第 3の態様の組換え DNA分子は、 いかなる用途に使用される ものであってもよい。 例えば、 本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体をェ 業的に産生させる際に用いるものであってもよいし、 本発明第 2の態様の新規 D N Aを増幅させ量産するために用いるものであってもよい。 また、 本発明の第 3 の態様の組換え DN A分子は、 本発明の第 4の態様の形質転換体を作製するため に使用できる。
次に、 本発明の第 4の態様の形質転換体について説明する。 本発明の形質転換 体は、 本発明の第 3の態様の組換え D N A分子で形質転換されたことを特徴とす る。 すなわち、 本発明の形質転換体は、 本発明の第 3の態様の組換え DN A分子 を、 宿主となる細胞や微生物に導入する事によって得ることができる。
本発明の形質転換体は、 原核細胞、 真核細胞のいずれを形質転換したも のであってもよい。 原核細胞としては、 大腸菌、 枯草菌などを挙げること ができる。 真核細胞としては C 0 S細胞、 C HO細胞、 H e L a細胞、 N ama 1 w a細胞等の哺乳動物細胞の他、 S f細胞等の昆虫細胞や酵母を挙げ ることができる。 このうち、 大腸菌、 哺乳動物細胞、 酵母を形質転換して得られ た形質転換体は扱いやすく、 高発現量が期待できるので好ましい。
哺乳動物細胞の中では、 遺伝子のコピー数を增加させることができるため、 C HO細胞の dh f r欠損株を宿主とすることが好ましい。 また、 酵母の中では、 外来タンパク質の分泌生産量が多いために、 ピキア （P i c h i a) 属の酵母を 宿主とすることが好ましい。
また、 本発明の組換え DNA分子の機能を充分に発揮させるためには、 本発明 の組換え D N A分子の作製に使用するベクタ一は、 宿主細胞に適した種類のもの でなければならない。 組換え D N A分子に使用したベクターと宿主との好ましい 組合わせの例としては、 pUC l 1 8と大腸菌、 p EF BOSと COS細胞あ るいは CHO細胞、 Y a cと酵母、 A c NPVと S f 細胞等 （実験医学臨時 増刊、 遺伝子工学ハンドブック、 1 99 1年 3月 20日発行、 羊土社、 参照） を 挙げることができる。 同様に、 組換え DNA分子に含まれるプロモーター、 シグ ナルぺプチドをコ一ドする塩基配列、 マーカー遺伝子等も宿主に適したものを使 用する。
また、 本発明第 1の態様の新規 Fa s抗原誘導体を発現する形質転換体を得る ためには、 当該組み換え DNA分子中には、 適当なプロモーター等発現に必要な 配列を有している必要がある。
本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体を分泌生産する形質転換体を得る には、 本発明の第 3の態様の上記生産に適した組み換え D N A分子であって、 本 発明の第二の態様の D N Aの上流にシグナルべプチドをコ一ドする塩基配列を含 有する組み換え D N A分子で、 宿主細胞を形質転換させればよい。
宿主細胞に、 本発明第三の態様の組み換え D N A分子を導入する方法とし ては、 エレク ト口ポレーシヨン法、 プロトプラスト法、 アルカリ金厲法、 リン酸 カルシウム法、 D E A E—デキストラン法、 マイクロインジヱクシヨン法、 ウイ ルス粒子を用いてィンフ クションさせる方法、 その他の公知方法 （実験医学臨 時増刊、 遺伝子工学ハンドブック、 〗 9 9 1年 3月 2 0日発行、 羊土社、 参照） 等から、 宿主または組換え D N A分子に適したものを選択すればよい。 リン酸力 ルシゥム法ゃ D E A E—デキストラン法を使用すると、 B甫乳動物細胞の形質転換 が効率よく行われるので、 宿主細胞が哺乳動物細胞である場合には、 これらの方 法を使用することが好ましい。
本発明の形質転換体は、 好ましくは、 本発明の第一の態様の新規 F a s抗原誘 導体を発現する形質転換体がよく、 とくに好ましくは、 該ポリぺプチドを発 現し、 培養上清中に分泌するものがよい。 このような形質転換体を使用すれば、 本発明の新規 F a s抗原誘導体を大量に生産することが容易になるからであ る o
本発明の第 4の態様の形質転換体は、 いかなる目的で使用するものであっても よいが、 本発明の第 2の態様の D N Aまたは第 3の態様の組換え D N A分子を大 量に製造する目的や、 本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体を工業的に製 造する目的等に使用できる。
本発明の第 5の態様の製造方法は、 本発明の第 4の態様の形質転換体を使用す ることを特徴とする本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体の製造方法であ る。 形質転換体の作製方法については上述した通りである。 本発明の製造方法に おいては、 本発明の第 4の態様の形質転換体を培養し、 必要に応じて遺伝子の增 幅や発現誘導を行う。 次いで培養混合物を回収し、 必要に応じて濃縮、 可溶化、 透析、 各種のクロマトグラフィー等の操作を適宜組み合わせて、 本発明の新 規 F a s抗原誘導体の精製を行う。
本発明の第 5の態様において、 「培養混合物」 とは、 形質転換体、 形質転換体 を含む培地、 もしくは培養上清または細胞のライセートを意味する。 産生された 前記の新規 F a s抗原誘導体が細胞培養上清中に分泌される場合は、 培養上清か ら該ポリペプチドを精製できる。 一方、 新規 F a s抗原誘導体が形質転換体内に 蓄積される場合には、 リゾチーム処理、 界面活性剤処理、 凍結融解、 加圧、 超音 波処理その他の方法から宿主細胞に適したものを適宜選択して細胞を溶解または 破砕した後、 遠心分離、 濾過等の方法により可溶性画分または不溶性画分として 該ポリペプチドを回収し、 精製する。
宿主細胞が大腸菌であって、 前記新規ポリぺプチ ドがぺリブラズムに 蓄積される場合には、 ウィ ルスキー （W i 1 1 s k y ) 等の方法 （ J . B a c t e r i o 1 . , 1 2 7巻， 5 9 5— 6 0 9頁、 1 9 7 6年） を採用して 該ポリペプチドを回収することができる。
形質転換体の培養は、 各種の成書を参考にして、 一般的な手法で行うことがで きる （例えば、 f微生物実験法」 社団法人日本生化学会編、 株式会社東京化学同 人発行、 1 992年、 参照） 。
遺伝子の発現誘導を行う場合には、 組み込まれたプロモータ一によつて適当な 薬剤を選択して使用する。 例えば、 t r pプロモーターが組み込まれている場合 には 3 β—イ ンドールァクリル酸を用い、 MMTVプロモーターの場合にはデキ サメタゾンを、 また Α〇Χ 1プロモーターの場合にはメタノールをそれぞれ使用 するとよい。
遺伝子の増幅方法の代表的な例としては、 d h f r欠損 CHO細胞を宿主 とし、 dh f rを有するベクターを使用した際にメ トトレキセートを用いる方法 等が挙げられる。
当該製造方法で使用する形質転換体は、 本発明の第 4の態様の形質転換体であ れば、 限定されないが、 好ましくは、 COS細胞および、 CHO細胞等の哺乳動 物細胞もしくは酵母、 もしくは大腸菌のいずれかより選択される細胞を宿主とし た形質転換体であることが好ましい。
以下に、 形質転換体として大腸菌、 CHO細胞等の哺乳動物細胞、 ピキア (F i c h i a) 属酵母を使用した場合の培養および発現誘導の例を示す。 t r pプロモータ一を有する組換え DNA分子で形質転換された大腸菌では、 L—ブロース （L一 B r o t h) で菌体を前培養し、 それを M9 - C Aの培地に 対して 1ノ 50量となるように植え込み、 37°Cで培養を行う。 培養開始数時間 後に培地の OD 550値が 1〜4 (すなわち対数増殖期） に達した時点で 3 /3— イ ン ドールァクリル酸を終濃度 1 0 g /m 1となるように添加し発現誘導を行 う。 さらに約 1〜2日の培養を行うことにより、 目的蛋白質を含む培養混合物を 得ることができる。 A O X 1 プロモーターを有する組換え D N A分子で形質転換されたピキア ( P i c h i a ) 属の酵母を用いる場合には、 B M G Y培地で約 2 日間前培 養し、 培地交換後、 メタノールを加えて発現誘導する。 さらに、 3 0 °Cで約 1〜 2日間の培養を行い、 目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。
ェロンゲ一シヨンファクタ一のプロモータ一を有する組み換え D N A分子 で C H 0細胞等の哺乳動物細胞を形質転換して得られた形質転換体は、 1 0 %ゥ シ胎児血清を含有する D M E M培地で培養する。 細胞は、 約！〜】 0 X 1 0 1 細 胞 Zm 1の濃度で植え込み、 3 7 °C、 5 %炭酸ガスノ 9 5 %空気の条件で培養を 行う。 通常、 2〜 3日後にコンフルェン卜な状態になるので、 その時点で培 地を、 血清不含の D— M E Mに交換する。 さらに引き続き、 2〜3日間の培養を 行うことにより目的蛋白質を含む培養混合物を得ることができる。 なお、 目的蛋 白質の産生量が少ない場合には前述したようにメ 卜 トレキセ一トにより遺伝子を 増幅し、 産生量を増加させることも可能である。
上述の培養混合物から本発明の第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体を精製する 方法としては、 通常ポリペプチドの精製に使用されている方法のなかから適当な 方法を適宜選択して行う。 具体的には、 塩析法、 限外濾過法、 等電点沈澱法、 ゲ ル濾過法、 電気泳動法、 イオン交換クロマ トグラフィ ー、 疎水性クロマト グラフィ一や抗体クロマ卜グラフィ一等の各種ァフィニティークロマ トグラ フィ一、 クロマトフォーカシング法、 吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマ トグラフィ一等、 通常使用される方法の中から適切な方法を適宜選択し組み合わ せ、 必要により H P L Cシステム等を用いて精製を行えば良い。 特に、 抗 F a s 抗体のうち本発明の新規 F a s抗原誘導体を認識する抗体、 F a s リガンドまた はプロティン A等をリガンドとしたァフィ二ティークロマトグラフィーは、 当該 新規ポリべプチドの精製においても有用である。
当該製造方法において、 本発明第一の態様の新規 F a s抗原誘導体は、 大腸菌 の ^一ガラク トシダ一ゼや、 他のポリペプチドとの融合蛋白質として発現させて もよいが、 この場合には、 精製工程のいずれかのステップにおいて、 融合蛋白質 をブロムシアンまたはヒドロキシルアミン等の化学物質やプロテア一ゼ等の酵素 で処理して当該蛋白質を切り出す操作が必要になる。
また、 使用する形質転換体が大腸菌であった場合に、 当該蛋白質を不溶化蛋白 質であるインクル一ジョ ンボディ一として産生させた場合には、 精製の際に、 ィ ンクル一ジョンボディーを可溶化し、 デネィチヤ一し、 リフォールデイングする という操作を精製の適当なステップで行えばよい （トマス E. 及びクライ トン
J . (Th oma s E . a n d C r e i g h t o n J. ) ， J. Mo l e c u l a r B i o l o g y, 8 7卷， 5 6 3— 5 7 7頁， 】 9 7 4年） 。
具体的には、 まず、 菌体を破砕し、 遠心分離してペレツ トを回収する。 次に、 尿素もしくはグァニジン塩酸、 界面活性剤、 還元型グルタチオン、 酸化型グ ルタチオンを適量含む可溶化バッファ一 （たとえば、 5 Mグァニジン塩酸、 0. 00 5 %Twe e n 8 0、 5 0 mM卜リス塩酸 （ p H 8. 0) 、 5 mM EDTA、 2 mM還元型グルタチオン、 0. 02 mM酸化型グルタチオンを含 む緩衝液） をべレッ トに加え、 2—メルカプトエタノールを加えてデネィチヤ一 し、 上記可溶化バッファ一からグァニジン塩酸を取り除いた溶液に対して透析し てリフォールデイングする。 融合蛋白質として発現させている場合には、 これら の操作の後で、 ブロムシアン等の化学物質もしくはプロテア一ゼ等の酵素で不要 な蛋白質部分を切断し、 その後、 適当なクロマトグラフィーを行う。
当該製造方法によれば、 医薬品などに有用な F a s抗原活性を有する本発明の 新規 F a s抗原誘導体を均一にかつ高効率で工業的に大量生産することがで きる。
次に、 本発明の第 6の態様の医薬について説明する。 本発明の第 6の態様の医 薬は、 第 1の態様の新規 F a s抗原誘導体またはその生理的に許容されうる塩を 有効成分として含有する。
また、 必要に応じて医薬的に許容されうる担体、 陚形剤、 安定剤、 滑沢剤、 着 色剤、 崩壊剤、 防腐剤、 等張化剤、 安定化剤、 分散剤、 酸化防止剤、 干渉剤、 保 存剤、 懸濁化剤、 乳化剤、 一般的に用いられる適当な溶媒の類 （滅菌水や植物油 等） 、 さらには生理的に許容しえる溶解補助剤などを適宜添加した医薬組成物と することができる。
本発明の医薬には種々の投与経路が可能であるが、 非経口投与が好ましい。 非 経口投与としては例えば、 静脈内投与、 動脈内投与、 皮下投与、 筋肉内投与等の 注射が一般的であり、 その他に直腸内投与、 経皮吸収、 経粘膜吸収等が挙げられ る。 この場合、 剤形としては、 坐剤、 吸入剤、 特に注射剤などが好適である。 本発明の第 6の態様の医薬は、 F a s抗原を介するアポトーシスの異常、 特に 病的状態における内因性の F a s リガンドの過剰生産または外因性の F a s リガ ンドの過量投与による過剰なアポトーシスを来したヒ 卜または動物に投与するこ とにより、 過剰なアポトーシスを制御し、 アポ卜一シスの異常に起因する種々の 病態ならびに疾患を予防および治療することができる。 有効成分である新規 F a S抗原誘導体またはその生理的に許容されうる塩の有効な含有量、 または投与量 および処方は病態に応じて適宜決定される。
本発明の第 7の態様は、 F a s抗原の N末端ァミノ酸残基から最も N末端より のシスティン残基までのアミノ酸残基 （該システィン残基は除く） のうち少なく とも 1つを欠失させることを特徴とする、 Fa s抗原または Fa s抗原誘導体の 活性または機能を改良する方法である。 また、 F a s抗原の N末端から数え て 1〜4 2番目のァミノ酸残基のうち少なくとも 1つを欠失させることを特徴と する、 活性または機能を改良された F a s抗原または F a s抗原誘導体の設計方 法および作製方法を提供する。 該作製方法は、 本発明の第 1の態様の新規 F a s 抗原誘導体を製造し、 活性等を測定することにより改良を確認する工程を含む。 N末端領域から欠失させるアミノ酸残基の選択方法、 該欠失を有するポリべプチ ドの製造方法および活性の測定方法等については前述したとおりである。 実施例
以下に、 実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、 これらは一例とし て示すものであり、 本発明はこれらにより何等限定されるものではない。 また、 以下の記載において用いる略号は、 当該分野における慣用略号に基づくものであ る。 なお、 以下に示す実施例中の諸操作は、 主に下記の雑誌、 成書を参考として 実施した。
1. ミ力エル A. I . ( i c h a e l A. I . ) 等編、 Po l yme r a s e Ch a i n Re a c t i on, P C R P r o t o c o l s, a u i d e t o me t h o d s a n d a p p l i c a t i o n s (1 990年） 、 アカデミック出版 （A c a d em i c P r e s s)
2. サムブルック J. (S amb r o o k J. ) 等： Mo l e c u l a r C l o n i n 2 n d e d. , Co 】 d S r i ng Ha r b o r La b o r a t o r y, ニューヨーク （New Yo r k) , 1 989年
3. 実験医学臨時増刊、 遺伝子工学ハンドブック 1 99 1年 3月 20日発行、 羊土社
4. 「微生物実験法」 社団法人日本生化学会編、 株式会社東京化学同人発行、 1 992年
5. 免疫実験操作法、 日本免疫学会編、 日本免疫学会発行
6. 今本文男等編 〔組換え遺伝子の細胞への導入と発現〕 蛋白質核酸酵素臨時 増刊 28 ( 1 4 ) 1 983年
7. 岡田善雄監修 〔細胞工学的技術総集編〕 実験医学臨時増刊 7 ( 1 3) 1 989年
(実施例 1 ) 新規ポリぺプチドの発現ベクターの作製
(1) プラスミ ド pMl 097の作製
TGGAA) およびアンチセンスプライマ一 2 (GTC AAGCTTGGTAC 表の配列番号 1および 2) 。 このセンスプライマー 1は S p e Iサイ 卜 （ACT AGT) とヒト F a s抗原シグナルペプチドをコードする塩基配列の 3' 末端領 域およびヒ ト F a s抗原の 30番目から 34番目のァミノ酸をコ一ドする塩基配 列を含んでいる。 一方、 アンチセンスプライマー 2はヒ ト Fa s抗原の細胞外領 域の C末端側をコードする塩基配列と H i n d ΙΠ サイ ト （AAGCTT) 、 K p n lサイ ト （GGTACC) を含んでいる。
得られたセンスプライマー 1、 アンチセンスプライマ一 2をそれぞれ Ι Ο Ο ρ m o 1、 ヒ ト F a s抗原をコ一 ドする DNA (ィ トウ N. 、 （ I t o h N. ) 等、 C e 1 し 66巻、 233— 243頁、 1 99 1年） を含むブラスミ ド PBLF 58— 1を 0. 5〃 g、 d ATP. dCTP、 dGTP、 dTTPを それぞれ 2 0 nmo し 2. 5ユニッ トの P f u D N Aポリメラ一ゼと添付 の P f uバッファー （共にス 卜ラタジーン社製） を 1 0〃 1含む 1 0 0〃 I の溶液を調製した。 DNAサーマルサイクラ一 （PCRシステム 9600、 パ一 キンエルマ一社製） を使用して、 94°C、 3 0秒； 55°C, 30秒； 72 °C、 1 分を 1サイクルとする PCRを 3 0サイクル行った。 得られた P C R産物を S p e H i n dill で二重消化し、 約 4 1 0 b pの D N A断片を国際特許出 願公開 WO 95 / 1 3293の実施例 2 1に記載したヒ ト F a s抗原シグナルぺ プチドとヒ ト F a sリガンド細胞外領域をコードする D N Aを含むブラスミ ド pM 1 08 1の S p e I、 H i n d 111 サイ トに組み込み、 得られたプラスミ ドを pMl 097と命名した。 本プラスミ ドは配列表の配列番号 1 2の塩基配列 で表される DNAを含有するプラスミ ドである。
(2) プラスミ ド pMI 303の作製
まず、 センスプライマ一 3 (TCACAAGC C CAG CAACAC CA AG) 、 アンチセンスプライマー 4 (GCTTGCCGGCCGTCGCACT C) 、 センスプライマー 5 (GAAGGATCCAGATCTAACGAGCC CAAATCTTGT) およびアンチセンスプライマ一 6 (GTCGGTACC CTATC ATTTAC C CGGAGAC AG) を化学合成した （配列表の配列 番号 3、 4、 5および 6 ) 。 このセンスプライマー 3はヒ 卜ィムノグロプリ ン G 1の CH 1領域の C末端側をコードする塩基配列を、 アンチセンスブラ イマ一 4はヒトイムノグロブリン G 1の 3 ' 非翻訳領域の配列を含む。 またセン スプライマー 5はヒ ト F a s抗原細胞外領域の C末端側に位置するァミノ酸 をコードする塩基配列とヒ トイムノグロプリン G 1のヒンジ領域の N末端側に位 置するァミノ酸配列をコードする塩基配列および B a mil Iサイト （GGATC C) を含んでいる。 アンチセンスプライマ一 6はヒ トイムノグロブリン G】の C H 3領域の C末端側に位置するァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列と K p n Iサ イ ト （GGTACC) を含んでいる。 得られたセンスプライマ一 3およびアンチ センスプライマ一 4をそれぞれ 1 0 0 pmo l、 Huma n S l e e n 5 ' -S t r e t c h cDNA L i b r a r y (クローンテツク社製） を 1〃 1、 dATP、 dCTP、 dGTP、 d T T Pをそれぞれ 20 n m o 1、 2. 5ュニッ 卜の P f u DNAポリメラーゼと添付の P f uノくッファーを 1 0 1含む 1 00 1の溶液を調製し、 （ 1 ) と同条件で PCR反応を行った。 さ らに、 得られた約 750 b pの PC R産物を铸型とし、 センスプライマ一 5およ びアンチセンスプライマ一 6をそれぞれ 1 00 pmoし dATP、 d CTP、 dGTP、 d TTPをそれぞれ 20 nmo 1、 . 5ユニッ トの P f uDNAポ リメラーゼと添付の P ί uバッファ一を 1 0 // 1含む 1 0 0〃 1の溶液を調 製し、 （ 1 ) と同様に P CR反応を行った。 得られた P CR産物を B amH I、 Kp n Iで二重消化し、 約 7 2 0 b pの DNA断片を ( 1 ) で作製した pM 1 0 9 7の B amH I、 Kp n Iサイ 卜間に組み込み、 得られたプラスミ ド を pMl 303と命名した。 本プラスミ ドは、 配列表の配列番号 1 4の塩基配列 で表される DNAを含有するプラスミ ドである。
(3) pM 1 304の作製
( 2 ) で作製した pM1 303を E c oR I、 Kp n Iで二重消化し、 約 1 1 50 b pの DNA断片を p EF— BOS (ミズシマ S. (M i z u s h i ma S. ) およびナガ夕 S. ( N a g a t a S . ) , u c l e i c A c i d s Re s. , 1 8卷、 5322頁、 1 9 90年） に d h f r遺伝子を 組換え修飾したブラスミ ド PM1 1 03の E c oR I、 Kpn lサイ 卜間に組み 込み、 得られたプラスミ ドを pMl 304と命名した。 本プラスミ ドは、 配列表 の配列番号 1 1のアミノ酸配列からなるポリぺプチド （s hFa s (n d 29) 一 F cと本明細書中で表記することがある） の発現ベクターである。
(4 ) pM 1 3 1 7の作製
まず、 センスプライマ一 7 (TGCGAATTCACCATGCTGGGCA TCTGG) 、 アンチセンスプライマ一 8 (CGGGGTAC CTC ACTAT GGG C ACGGTGGG CA) を化学合成した （配列表の配列番号 7お よび 8) 。 このセンスプライマ一 7は E c oR Iサイ ト （GGATCC) とヒト F a s抗原シグナルべプチドをコ一ドする配列の 5 ' 末端領域を含んでいる。 ァ ンチセンスプライマー 8はヒ トイムノグロプリン G 1のヒンジ領域の C末端側に 位置するアミノ酸をコードする塩基配列と Kp n Iサイ ト （GGTACC) を含 んでいる。 得られたセンスプライマ一 7およびアンチセンスプライマ一 8をそれ ぞれ 1 00 pm 0 し （3) で作製した pMl 304を 0. 3 g、 d ATP, d CTP、 d GTP、 dTTPをそれぞれ 2 0 nmo 1、 2. 5ユニッ トの P f uDNAポリメラーゼと添付の P f uノくッファーを 1 0 z l含む 1 00〃 1 の溶液を調製し、 （ 1 ) と同様に PC R反応を行った。 得られた PC R産物 を E c oR Iと Kpn Iで二重消化し、 約 4 50 bpのDNA断片を （3) で使 用した pM 1 1 03の E c oR I、 Kp n Iサイ 卜間に組み込み、 得られたブラ スミ ドを p M 1 3 1 7と命名した。 本プラスミ ドは、 配列表の配列番号 1 0のァ ミノ酸配列からなるポリべプチド （s hF a s (n d 29) — h i n geと本明 細書中で表記することがある） の発現ベクターである。 なお、 本発明者らは、 公 知方法にてプラスミ ド PM 1 304および pM 1 3 1 7で、 大腸菌 J M I 0 9を 形質転換させ、 得られた形質転換体大腸菌 J M 1 0 9 (pM 1 3 0 4 ) およ び JM1 09 (pMl 3 1 7) を、 日本国茨城県つくば巿東一丁目一番三号工業 技術院生命工学工業技術研究所へ、 1 996年 3月 1 4日付で寄託し、 1 9 97 年 3月 6日にブタぺスト条約に基づき移管した （受託番号 FERM B P— 5854、 FERM BP 58 55) 。
(実施例 2) 形質転換体の作製および培養
pM1 304、 pM 1 3 1 7、 および国際特許出願公開 WO 95 / 1 3293 の実施例 1に記載の pBF - F c l (ヒ 卜 Fa s抗原の細胞外領域とヒ 卜】 g G 1の F c領域とのキメラ蛋白質 （h F a s— F cと表記することがある） の発現 プラスミ ド） を使用して、 以下の方法で形質転換体 COS— lZpMl 30 4、 C 0 S - 1 /pM 1 3 1 7、 COS- l /p B F- F c 1を作製した。 すな わち、 それぞれのプラスミ ド DN A 1 00〃 gを 500 / 1の 1 0 mMT r i s — HC 1 (p H 7. 4 ) / 1 mMエチレンジァミ ン四酢酸 （以下、 T Eバッ ファーと略す） 溶液に溶解した。 これらに、 それぞれ 2mg/'m 1 DE AE —デキストランおよび 5 OmM T r i s—HC l ( H 7. 4) を含有する D 一 MEM (日水製薬） 1 25m lを添加し、 DNA— DEAEデキス卜ラン混合 液を作製した。 1 700 cm2 ローラ一ボトル （コ一ニング社製） でセミコンフ ルェン卜まで単層培養した COS— 1細胞に DNA— DEAEデキストラン混合 液を添加し、 37°Cにて培養し、 形質転換体 COS— 1 /pM 1 304、 COS - 1 X M 1 3 1 7、 COS- 1/pBF-F c 1を得た。 4時間後、 DNA- DEAEデキストラン混合液を除去し、 1 0%ゥシ胎児血清 （ライフテックオリ ェンタル社製） を含有する D— MEM培地に交換し、 さらに 24時間培養した。 その後、 培地を P h e n 0 1 r e d f r e e D-MEM CFBS, BSA 無添加） に交換し、 さらに 72時間培養した後、 培養上清を回収した c
(実施例 3) s hFa s (n d 29) 一 F cの精製
(1) ァフィ二ティークロマトグラフィー
COS- 1/pMl 304培養上清 1 1に、 硫安 （硫酸アンモニゥム；和光純 薬工業社製） を 70%飽和になるように添加し、 溶解した後、 一晩 4°Cで静置し た。 生じた沈殿を 8, 0 0 0 r m, 4 °Cで 3 0分間遠心分離をして回収し た後、 リン酸緩衝生理食塩液 （PBS) に懸濁し、 PBSに対して透析した。 得 られた懸濁液 57 m 1に、 2倍量のァフィプレッププロティン A結合ノくッファー (バイオラッ ド社製） を加えて稀釈した。 濾過によって不溶物を除いた後に、 使 用説明書通りに平衡化したァフイブレッププロテイン Aプレパラティヴカ一 トリ ッジ （バイオラッ ド社製； 7. 3 m 1 ) カラムにアプライした。 カラムをァ フィプレッププロティン A結合バッファー 90m lで洗浄後、 ァフイブレッププ ロティン A溶出バッファー （バイオラッ ド社製） で s h F a s (n d 2 9 ) 一 F cを溶出した。 ヒト F a s抗原に対するモノクロ一ナル抗体を用いた E L I S Aによって求めた s h F a s (n d 2 9) -F cを含む画分をプールし、 フィ ノレトロンオメガセル （フジフィルタ一社製；分画分子量 3 0 k D) を用いて限外 濾過を行い、 濃縮した。 この濃縮液を 0. 9 %N a C 1 に対して透析し、 精製 s h F a s (n d 2 9 ) — F cを得た。 また、 同様にして、 h F a s— F cを精製した。 各標品のタンパク質量はゥシ血清アルブミンを標準物質として L o w r y法で測定した。
(2) SDS- PAGE
(1 ) で得た精製 s hF a s (n d 2 9 ) — F cを用いて 0. 1 %SDSを含 む 5— 2 0 %グラジェントゲルを用いたポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を 行い、 2 D—銀染色試薬 · II 「第一」 （第一化学薬品社製） で染色し、 バンドを 検出した。 s hF a s (n d 2 9) - F c精製の結果を図 Gに示す。 図中、 レ一 ン 1~4は非還元下、 レーン 5~8は還元下の結果である。 図 6に示すように、 精製された s hF a s (n d 2 9 ) 一 F cは非還元下 （レーン 1〜3) で 2量体 に相当する分子量約 8 5 k D、 還元下 （レーン 5〜7 ) で単量体に相当する 約 4 3 k Dのほぼ 1本のバンドとして検出された。
(実施例 4) s hF a s (n d 2 9) — F cの N末端アミノ酸配列分析
( 1 ) 逆相 H PLCによる被験サンプルの脱塩
実施例 3で得られた精製 s hF a s (n d 2 9) F cを、 以下の要領で逆相 H P L Cに供した。 まず、 前記精製 s h F a s (n d 2 9 ) — F cを、 予 め 0. 0 5 %トリフルォロ酢酸にて平衡化した V YD AC C 4カラム （4. 6 mm0 x 2 5 cm, サイプレス社製） に供し、 次いでカラムを 0. 0 5 %トリフ ルォロ酢酸で洗浄した。 洗浄後、 0. 05 %トリフルォロ酢酸 Z0〜1 00%ァ セトニトリルを使用し、 直線濃度勾配法により流速 1 m 1 /分にて溶出を 行った。
(2) N末端アミノ酸配列分析
溶出されたメインピークの画分を凍結乾燥し、 70 %蟻酸に溶解してサンプル とし、 モデル 477 Aプロテインシークェンシングシステム一 1 20 APTHァ ナライザ一 （パーキンエルマ一社製） を使用し、 その N末端アミノ酸配列を決定 した。 即ち、 PTHアミノ酸の検出を 27 0 nmの紫外部吸収にて行い、 予め同 一の方法で分離した標準 PTHアミノ酸 （パーキンエルマ一社製） の保持時間を 基準にしてアミノ酸を同定した。 この結果、 ヒ ト F a s抗原の N末端アミノ 酸 29残基を欠失した N末端アミノ酸配列 （Th rG l nA s nL e uG l uG l yL e uH i sH i sAs p) を有していることが確認された。
(実施例 5) s hF a s (n d 29 ) — F c及び h F a s— F cのアポト一シス 抑制活性の比較
s hFa s (n d 29) - F c及び hFa s— F cが 1 A 1 2細胞及び FLm 1 4細胞の WC 8細胞及び W 4細胞に対する細胞障害活性を抑制する活性を指標 として測定した。 1 A 1 2細胞はヒ ト F a s リガンドを発現するようにマウ ス WR 1 9 L細胞を形質転換させた細胞であり、 また、 FLm l 4細胞はマウス F a sリガンドを発現するようにマウス FDC— P 1細胞を形質転換させた細胞 である。 WC 8細胞はヒ 卜 F a s抗原を、 W 4細胞はマウス F a s抗原を発現さ せるようにマウス WR 1 9 L細胞を形質転換させた細胞である。 この WR 1 9 L 細胞は、 マウス F a s抗原を殆ど発現せず、 TNFの細胞障害作用に感受性の細 胞である。 細胞障害活性の測定は、 ル一ビエ E. (Ro u V i e r E. ) 等 の方法に準じて行った （J. Ex . Me d. , 1 7 7巻、 1 9 5— 2 0 0頁、
1 9 9 3年） 。 先ず、 1 A 1 2細胞或は F Lm 1 細胞を 1 0 %非働化 F B S含 有 R P M I 1 6 4 0で洗浄し、 ェフエクタ一細胞とした。 一方、 1 0 0〃 】 の 1 0 %非働化 FB S含有 RPM I 1 6 4 0中で、 2 0 /C iの [5 1 C r] ク ロム酸ナトリウム （NEN社製） と共に 1 X 1 0 個の WC 8細胞または W 4細 胞を 3 7 °Cで 2時間ィンキュベ一 卜した。 1 0 %非働化 F B S含有 R PM
1 1 6 4 0で洗浄した後、 これらの細胞をターゲッ ト細胞として使用した。
1 X 1 01 個の 1 A 1 2細胞或は 1 X 1 0 '個の F Lm 1 4細胞とターゲッ 卜細 胞 1 X 1 0 ' 個とを、 様々な濃度の s h F a s (n d 2 9 ) 一 F c及び h F a s — F cと丸底のマイクロタイタープレー卜の各ゥヱル中で混合した。 このとき全 液量が計 1 0 0〃 1になるようにした。 8 0 0 r pmで 2分間、 プレー卜の遠心 操作を行った後、 3 7°Cで 4時間インキュベートした。 更に、 1， 2 0 0 r pm で 5分間プレートの遠心操作を行い、 各ゥエルより上清 5 0 1を分取してァカ ゥンターを用いて放射活性を測定し、 特異的細胞溶解率を算出した。 s l C rの自 然放出は、 培地のみでターゲッ ト細胞をインキュベートすることにより決定し、 一方、 最大放出量は、 ターゲッ ト細胞に 0. 1 %となるように T r i t o nX
1 0 0を加えることにより決定した。 また、 特異的細胞溶解率は次の式により算 出した。 特異的細胞溶解率 （％)
実測の51 C rの放出量一51 C rの自然放出量
X 1 0 0
51C rの最大放出量一 S'C rの自然放出量
1 A 1 2細胞をエフヱクタ一細胞とし、 WC 8細胞をターゲッ 卜細胞としたと きの s hF a s (n d 2 9) — F c及び h F a s— F cの特異的細胞障害抑制活 性を図 9に、 FLml 4細胞をエフヱクタ一細胞とし、 W 4細胞をターゲッ ト細 胞としたときの s h F a s (n d 2 9) 一 F c及び h F a s - F cの特異的細胞 障害抑制活性を図 1 0に示した。 図 9および図 1 0に示したように、 s hF a s (n d 2 9) — F cは h F a s— F cと比較して 3〜 1 0倍高 、細胞障害抑制活 性を有していた。
(実施例 6) s hFa s (n d 2 9) -h i n geの精製
(1 ) 抗 F a s抗原モノクローナル抗体固定化ァフィ二ティ一カラムの調製 ヒト F a s抗原で免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞を用いて公 知の方法 （Koh l e rと M i l s t e i n, Na t u r e, 2 5 6卷、 4 9 5 頁、 1 9 7 5年） で作製した、 抗 F a s抗原モノクロ一ナル抗体 （ 4 B 4— B 3 ) 3 5 0mgを、 1 2 0 m lのホルミルーセルロファイ ン （生化学工業 社製） と混合し、 4 °Cで 2時間撹拌した。 次いで、 6 5 Omgの卜リメチルアミ ンボラン （和光純薬工業社製） を添加し、 一晩撹拌して抗体を結合させた。 固定 化されなかった抗体を除くため、 樹脂を 2. 4 1の超純水で洗浄した。 更 に、 0. 2M T r i s -HC 1 ( H 8. 0) 中で 6 5 Omgのトリメチルァ ミンボランとともに 4でで 3時間撹拌させ、 未反応のホルミル基をプロックし、 抗体ァフィ二ティーカラムを得た。 (2) ァフィ二ティークロマトグラフィー
COS- 1 /pM 1 3 1 7培養上清 1 0 1を、 フィルトロンミニセッ ト （分画 分子量 1 0 k D； フジフィルター社製） で限外濾過濃縮し、 1. 5 1とした。 そ の後に、 濃縮液に 1 M T r i s— HC 1 (p H 9. 0) を添加して pH8. 0 に調製し、 1M NaC lを含む50mM T r i s— HC 1 (pH 8. 0) に て予め平衡化した抗 F a s抗原モノクローナル抗体固定化ァフィニティー力 ラムにアプライした。 カラムを 1 M Na C lを含む 5 0 mM T r i s— HC 1 (p H 8. 0 ) 3 2 0 m 1で洗浄後、 1 M N a C 1を含む 0. 1 M g l y c i n e - H C 1 ( p H 2. 5 ) で s h F a s ( n d 2 9 ) - h i n g eを溶出した。 EL I S Aによって求められた s h F a s (n d 29) -h i n g eを含む画分をプールし、 フィルトロンオメガセル （分画分子量 1 0 kD； フジフィルタ一社製） を用いて限外濾過を行い、 濃縮した。 この濃縮液を 0. 9 %N a C 1に対して透析し、 精製 s hF a s (n d 29) — h i n geを 得た。
(3) SDS PAGE
( 2 ) で得た精製 s h F a s (n d 2 9 ) - h i n g eを用いて 0. I % SDSを含む 5 - 20 %グラジェントゲルを用いたポリアクリルァミ ドゲル電気 泳動を行い、 2D -銀染色試薬 · II 「第一」 （第一化学薬品社製） で染色し、 バ ンドを検出した。 s h F a s (n d 2 9 ) 一 h i n g e精製の結果を図 7に 示す。 図中、 レーン 1は非還元下、 レーン 2は還元下の結果である。 図 7に示す ように、 精製された s hF a s (n d 29) — h i n g eは非還元下で分子量約 4 3 k D及び約 2 7 k Dの 2本のバンドとして、 還元下で約 2 3 k D及び 27 k Dの 2本のバンドとして検出された。
(4 ) ゲル濾過クロマトグラフィ一
実施例 6 (2) で得られた s h F a s (n d 2 9 ) 一 h i n g eを、 5 0 mM T r i s -HC l /0. 5 M N a C 1 ( p H 8. 0 ) で予め平衡 ィ匕した S e p h a d e x 75カラム （フアルマシア社製） に添加し、 50mM T r i s -HC 1 /0. 5 M N a C 1 (pH 8. 0 ) で溶出することによりゲ ル濾過を行い、 2 1 4 nmの吸光度を指標にして分画した。 実施例 6 (2) と同 様にして、 各画分を濃縮した後ポリアクリルァミ ドゲル電気泳動を実施した。 図 8に示したように、 高分子量側の画分 （フラクショ ン 1および 2) に含まれ、 お そらく 2量体に相当すると考えられるバンドと、 低分子量側の画分 （フラクショ ン 3および 4) に含まれ、 単量体に相当すると考えられるバンドに分離すること ができた。 両画分は共に、 実施例 8で述べるようなアツセィにおいて細胞障害抑 制活性を示したが、 高分子量側の画分がより強い活性 （約 5 0倍以上） を示 した。
(実施例 7) s hF a s (n d 29) — h i n g eの N末端ァミノ酸配列分析 実施例 6 (2) で得た精製 s hFa s (n d 29) - h i n g eを用い、 モデ ル 477 Aプロティンシークェンシングシステム- 1 20ΛΡΤΗアナライザ一 (パーキンエルマ一社製） を使用し、 その N末端アミ ノ酸配列を決定した。 即ち、 PTHアミノ酸の検出を 270 nmの紫外部吸収にて行い、 予め同一の方 法で分離した標準 PTHアミノ酸 （パーキンエルマ一社製） の保持時間を基準に してアミノ酸を同定した。 この結果、 ヒト F a s抗原の N末端アミノ酸 29残基 を欠失した N末端アミノ酸配列を有していることが確認された。 (実施例 8) s h F a s (n d 2 9 ) 一 h i n g e及び h F a s— F cのァ ポトーシス抑制活性の比較
s h F a s (n d 29) — h i n g e及び hF a s— F c力 \ 1 A 1 2細胞及 び F L m 1 細胞の WC 8細胞及び W 細胞に対する細胞障害活性を抑制する活 性を実施例 5と同様にして測定した。 1 A 1 2細胞をエフェクター細胞と し、 WC 8をターゲッ ト細胞としたときの s hF a s (n d 29) -h i n g e 及び h F a s - F cの特異的細胞障害抑制活性を図 1 1に、 F Lm 1 4細胞をェ フエクタ一細胞とし、 W 4細胞をターゲッ 卜細胞としたときの s h F a s (n d 2 9 ) 一 h i n g e及び h F a s - F cの特異的細胞障害抑制活性を 図 1 2に示した。 図 1 1および図 1 2に示したように、 s hFa s (n d 29 ) 一 h i n g eは hF a s— F cと比較して 3〜 I 0倍高い細胞障害抑制活性を有 していた。
(実施例 9) F a s抗原細胞外領域の N末端領域付近における構造の解析 F a s抗原細胞外領域の立体構造モデルを構築し、 N末端領域におけるァミノ 酸残基の欠失と F a s抗原一 F a sリガンド間の結合との関係を解析した。 F a s抗原細胞外領域のアミノ酸配列と相同性が高い立体構造既知の蛋白質を、 生体 高分子立体構造のデータベースである PROTE I N DATABA K (PDB) から、 B I OSYM社製、 Homo 1 o g yモジュール中の F Λ S T Aプログラムによって検索した。 その結果、 TNFレセプター p 55の細胞外領 ±或 （PDB— I D 1 TNR) が全体構造的に相同性が高いことが判明した。 こ の構造は、 TNF— /3との複合体を形成しており、 F a s抗原一 F a sリガンド 複合体モデル構造を構築する上でも参照蛋白質として最適であった。 また、 F a sリガンド構造においては、 TNF— a (PDB— I D 1 TNF) 構造も 参照蛋白質とした。 モデル構造の構築は、 B I OSYM社製、 Homo 1 o gy モジュールを用いてホモロジ一モデリング法によっておこなった。 構築したモデ ル初期構造を、 B I OS YM社製分子力場計算ソフ トウエアの D I S COVER を用いてエネルギー最適化計算 （MM計算） をかけ、 F a s抗原、 F a sリガン ド複合体モデル構造を得た。 次に、 得られた構造の N末端領域の一部が、 参照蛋 白質の座標から発生させることができなかつたため、 この部分の構造予測を行つ た。 複合体構造から Fa s抗原細胞外領域単量体モデル構造を抽出し、 N末端に 欠失している 3 1 アミノ酸残基を B 1 0 S丫1^1社製8 I O P O L YME R ジュールで自動的に付加し、 構造を極小化した。 次に、 真空中で 1 0 0 0 K、 1 00ピコ秒の分子動力学計算 （MD計算） を行い 1 0ピコ秒毎の構造をサンプ リングした。 サンプリングした構造は、 各々極小化し最終的な F a s抗原細胞外 領域単量体モデル構造とした。 これらの構造を F a s リガンドモデル構造と再度 複合体をつく らせたところ、 Fa s抗原細胞外領域の N末端構造が F a sリガン ドとの結合において立体障害となりえること力 <、 予測された。 一方、 n d 2 9モ デル構造を MD計算によるシミユレーション解析したところ、 F a s リガンドと の結合に障害となるような構造の大部分は欠失しており、 より迅速に F a s リガ ンドと結合することが予測された。 さらに、 サンプリングした構造の複数のコン フオメーシヨンと F a sリガンド構造との複合体モデルにおける立体障害の状態 について解析した。 その結果、 F a s抗原の N末端から数えて 1番目のアルギニ ン残基から 3 1番目のグルタミン残基までの範囲においては、 ァミノ酸残基を欠 失させる程立体障害が除かれ、 特に 1 3または 1 8以上のアミノ酸残基を欠失し た F a s抗原の細胞外領域のアポトーシス抑制活性が上昇することが予測さ れた。 また、 N末端から数えて 3 6番目のロイシン残基から 4 2番目のフエニル ァラニン残基までの範囲の欠失では活性の上昇は期待しにく く、 F a s抗原の N 末端から数えて 4 3番目のシスティン残基を欠失させると抗原が形成している 2 次構造の破壌のためにアポト一シス抑制活性が失われる可能性のあることが予測 された。 今回の立体構造モデルの解析により、 F a s抗原細胞外領域の N末端構 造を削ることによって F a s リガンドとの結合力を調整しうることが示され た。
(実施例 1 0) s hF a s (n d 2 9 ) — F cのマウス肝障害抑制作用
C 57 B L/6 C r S i cマウス （雄、 9週齢、 日本エスエルシ一株式会社 製） を用い、 1群 5匹、 3群を被験動物として用いた。 同マウスに 1. 5mg/ m 1の濃度になるように生理食塩水 （大塚製薬株式会社製） に溶解したプロピオ ンバクテリウムァクネス加熱死菌 （リビィムノケミカルコ一ポレーション社製） 液を尾静脈から 0. 2 m〗投与した。 8日後に、 実施例 3で調製した s h F a s (n d 2 9) -F cを希釈液 （ 0. 1 %ヒ ト血清アルブミン （ （財） 化学及血清 療法研究所） 含有生理食塩水） で希釈し、 0. 3mg/8m 1 /k g, 1 mg 8m の用量で尾静脈から投与した。 対照群には希釈液を投与した。 5分 後に 5マイクログラム /m 1の濃度になるように生理食塩水で調製したリポポリ サッカライ ド （シグマ社製） 液を 0. 2m l腹腔内に投与した。 リボポリサッカ ライ ド投与 8、 2 4時間後に眼底から 7 5マイクロリッ トルを採血した。 採血し た血液は 3. 8 %クェン酸ナトリウム （和光純薬工業株式会社製） 水溶液 8. 3 マイクロリツ トルと混合後、 3 00 0回転、 1 0分間遠心した。 遠心後、 得られ た血漿を液体窒素で凍結後、 使用時までマイナス 3 0度で保存した。 GOT、 G PTの測定は GOT— FAテストヮコ一 （和光純薬工業株式会社製） 、 GPT— FAテストヮコ一 （和光純薬工業株式会社製） とオートアナライザー （ロッシュ 社製、 コバスファラ） を用いて測定した。 その結果、 s hF a s (n d 2 9) - F c 1 mg/8m 1 /k g投与群において GOTおよび GPTの値は対照群の それよりも低値であり、 肝障害抑制効果が認められた （図 1 3) 。
(実施例 1 1 ) s hF a s (n d 29) -h i n g eのマウス肝障害抑制作用 C 57 B L/6 C r S i cマウス （雄、 9週齡、 日本エスエルシ一株式会社 製） を用い、 1群 5匹、 4群を被験動物として用いた。 同マウスに 1. 5mg/ m 1の濃度になるように生理食塩水 （大塚製薬株式会社製） に溶解したプロピオ ンバクテリウムァクネス加熱死菌 （リビィムノケミカルコーポレーション社製） 液を尾静脈から 0. 2m l投与した。 8日後に、 実施例 6で調製した s hFa s (n d 29) -h i n g eを希釈液 （ 0. 1 %ヒト血清アルブミン （ （財） 化学 及血清療法研究所） 含有生理食塩水） で希釈し、 0. 3mgZ8m】 Zk g、 1 mg/8 m 1 /k g 3 mg 8 m 1 k gの用量で尾静脈から投与した。 対照 群には希釈液を投与した。 5分後に 5マイクログラム Zm 1の濃度になるように 生理食塩水で調製したリポポリサッカライド （シグマ社製） 液を 0. 2 m 1腹腔 内に投与した。 リポポリサッカライ ド投与 8、 2 4時間後に眼底から 7 5マイク 口リッ トルを採血した。 採血した血液は 3. 8 %クェン酸ナトリウム （和光純薬 工業株式会社製） 水溶液 8. 3マイクロリッ トルと混合後、 3 0 0 0回転、 1 0 分間遠心した。 遠心後、 得られた血漿を液体窒素で凍結後、 使用時までマイナス 3 0度で保存した。 GOT、 GPTの測定は GOT— FAテストヮコ一 （和光純 薬工業株式会社製） 、 GPT— FAテストヮコー （和光純薬工業株式会社製） と オートアナライザー （ロッシュ社製、 コバスファラ） を用いて測定した。 その結 果、 s hF a s (n d 29) — h i n g e投与群の G 0 Tおよび G P Tの値は対 照群のそれよりも低値であり、 肝障害抑制効果が認められた （図 1 4) 。 産業上の利用の可能性
本発明の新規ポリぺプチド （新規 F a s抗原誘導体） は、 F a s リガンド と F a s抗原との結合を拮抗的に阻害してアポトーシスの誘導を阻害し得る ので、 F a s抗原を介するアポト一シス、 特に内因性または外因性の F a sリガ ンドにより生体内で生じるアポトーシスを調節し、 F a s抗原を介したアポ卜一 シスの関与が示唆されている種々の疾患の予防および治療に使用する事がで きる。 例えば、 ある種の自己免疫疾患においては、 人為的に新規 F a s抗原誘導 体を用いてアポトーシスを抑制することにより、 自己抗原反応性の T細胞攻擊に よる急激な細胞死を抑制し、 臓器の破壊を防ぐことが可能になるであろう。 具体 例としては、 移植片対宿主病 （GVHD) あるいは糖尿病があげられる。 また、 ウィルス感染時には免疫反応により細胞が除去される力 この際には感染細胞ば かりでなく非感染細胞も同時に除去されてしまうことが知られている。 たと えば、 エイズウイルス感染後期の免疫能の低下や、 肝炎特に劇症肝炎における肝 機能低下は、 免疫担当細胞あるいは肝細胞のアポトーシスにより組織の機能が著 しく低下した結果と考えられる。 このような状態においては、 アポトーシスを抑 制する新規 F a s抗原誘導体をインフルエンザ、 エイズ、 肝炎等のアポトーシス が関与するウイルス感染症およびその合併症の治療に使用することができる。 そ の他、 F a s抗原はその広い臓器分布から種々の臓器における細胞の死に関与し ていると考えられることから、 心筋梗塞等の虚血性心疾患における心筋障害、 例 えば再港流障害、 腎炎、 多臓器不全および臓器移植の際の臓器保全にも有効であ ると考えられる。 特に、 本発明の新規 F a s抗原誘導体は、 低用量で強力にアポ ト一シスを抑制することから、 生体内においても低用量で有効でかつ副作用を低 率に押えうることが期待されるので、 有効性および安全性ならびにコス卜の面か らも有用性が高い。 特にヒ ト由来配列からなる本発明の新規 F a s抗原誘導 体は、 ヒ トへの適用上好ましいものである。
また、 適切に細胞に取り込まれた場合アポト一シスを誘導しうる形態の新 規 F a s抗原誘導体は、 リボソーム化等により適切に細胞に取り込ませることに より、 または、 本発明の第 2の態様の D N A等を用いて遺伝子治療的方法で適切 に細胞上で発現させることによりアポトーシスを促進する。 従って、 不要な 細胞、 例えばウィルス感染初期のウィルス感染細胞の除去等に有効であり、 また、 アポトーシスの不全が原因と考えられる疾患、 例えば関節リウマチおよび S L E等の予防および治療においても使用可能である。
また、 F a s抗原が保有する抗原性の少なくとも一部を保持しているので、 抗 F a s抗体とも結合する事が可能であり、 抗 F a s抗体によるアポ卜一シスの抑 制にも効果的である。
また、 本発明の新規 F a s抗原誘導体は、 特異的にかつ高い親和力で F a sリ ガンドと結合するので、 ヒ ト体液中の F a s リガンドの検出にも応用しう る。 F a sリガンドの関与が示唆されている種々の疾患における F a s リガンド の増加減少または異常を検出するために使用できるため、 特定の疾患及び病態の 予知、 検出および診断または治療方法の選択のために応用しうる。 また F a s リ ガンド及び F a sリガンド関連物質ならびに F a s リガンドの発現に影響を与え る薬剤による治療を受けている患者のモニタリング及び治療効果および予後の判 定にも有用である。
一方、 本発明の第 2の態様の D N A等は、 高純度の新規 F a s抗原誘導体をェ 業的に大量生産するために有用である。 これによつて、 新規 F a s抗原誘導体を 治療薬の主成分として医薬の分野に提供したり、 診断薬として利用することが可 能になる。 また、 新規 F a s抗原誘導体をコードする塩基配列は遺伝子治療等に も応用することもできる。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (センスプライマー 1 ) 配列：
CTGACTAGTG TCGCTACTCA GAACTTGGAA 30 配列番号： 2
配列の長さ ： 39
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (アンチセンスプライマー 2) 配列：
GTCAAGCTTG GTACCCTATT AGTTAGATCT GGATCCTTC 39 配列番号： 3
配列の長さ ： 22
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (センスプライマ一 3) 配列：
TCACAAGCCC AGCAACACCA AG 22 配列番号： 4
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (アンチセンスプライマー 4) 配列：
GCTTGCCGGC CGTCGCACTC 20 配列番号： 5
配列の長さ ： 33
配列の型：核酸
S己列の種類：他の核酸 合成 DNA (センスプライマー 5) 配列：
GAAGGATCCA GATCTAACGA GCCCAAATCT TGT 33 配列番号： 6
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (アンチセンスプライマー 6) 酉己歹 IJ：
GTCGGTACCC TATCATTTAC CCGGAGACAG 30 配列番号： 7
配列の長さ ： 2 7
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (センスプライマー 7) 配列：
TGCGAATTCA CCATGCTGGG CATCTGG 27 配列番号： 8
配列の長さ ： 3 0
配列の型：核酸
配列の種類：他の核酸 合成 DNA (アンチセンスプライマ一 8) 配列：
CGGGGTACCT CACTATGGGC ACGGTGGGCA 30 配列番号： 9
配列の長さ ： 1 28
配列の型：アミノ酸
配列：
Thr Gin Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gin Phe Cys His Lys
1 5 10 15
Pro Cys Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly
20 25 30 9 9
OS S3 02 02
^ΙΟ us Ι¾Λ Jill sAQ dsv 3JV ¾IV Siq 3JV "10 3 0Jd ojd s/iQ OJd
SI 01 S 1 s SIH s ana "ID ^IO dsv S!H S[H naq n[0 na usy uio JIJ
： 翊/ ： 3g 9ΐ s ι ：
ΖΙ QZI 9ίΐ
usv J3S 3JV J3S io nio ni sAq s JI usv J3S J l naq Jia
0Π SOI 00 ΐ 01
S 3 nto sAq 3[[ 9[[
Figure imgf000068_0001
S!H sA3 s J¾ S O OJd dsy S Q S!H
56 06 S8
nio sio I^A J MX jas usy SAQ aqj aqj usy OJd S/C sAg 3jy SAQ sAq
08 Si QL S9 usv uio JMl 3JV -iqi S Q us 9| I nio Ι¾Λ nio naq A19 S!H AIQ Q
09 9S OS
nig dsy s n9'| gjy SAQ gjy 3jy S Q s J9§ J9S 3i{d S!H ¾1V s
^ Οί- SS
dsv JMl JAi ig s Aig nio WJ) s OJd [¾Λ SXQ dsy OJJ nig dsy
ZOSIO/腿 JOd 6IC画 OW SI 01 ΐ 02 sAi S!H sAQ 3i|d uio 3 dsy S!H SIR ng 3 nio naq usy ujg J¾
翊 ： mo
09 ε : $¾α
1 ΐ ： 91
OH SET οει
OJd SAQ OJd ojj SAQ JM1 S!H Jqi sAq dsy SAQ J3S sA OJJ nio
SZI 021 9Π
usy 3JV J3S ^(9 nio "10 SAQ sAq JIJX usy J3S Ji]l nai jq丄
0Π SOI 001 01 sA3 nig s q 3[ [ on Α【3 S[H njg SAQ sA'i jqx SXQ OJJ dsy s SIH
S6 06 S8
nio sXo ΙΒΛ jqi J3S usy SAQ aqj
Figure imgf000069_0001
s S Q 3jy SAQ sA
08 9A OL S9 jiU usy "10 Jqi v JM1 SAQ usy 311 nio 1¾Λ nio naq Aio S!H 3 g
09 SS OS ni dsy SAQ na 3jy SAQ 3jy 3JV S sAq J9S J3S 3Md s!H ¾IV sAq
gt' Oi^ 38
dsv JM1 J^l nio sA Aio nio UJO SAQ OJJ Ι¾Λ dsv OJd nI0 dsv rosio/z.6dr/i3d 6ΐεひ/" O/A 8 9
061 S81 081 n J^l dJj, usv 3i|cl sii Λ nio OJd dsy njg S!H J9S Ι¾Λ dsv Ι^Λ
S丄 l ΟΑΐ S91 02
Ι¾Λ Λ s/ίθ J¾ [¾Λ nio OJd Ji|丄 3JV J3S 311 j dsy sA']
09ΐ ggi 09ΐ
OJd sAq OJd OJd 3MH ngq Ι¾Λ J3S OJd Aio Aio na ngq OJJ
0 ΐ SSI OCT
¾IV OJd sAQ OJd OJd sAo JMl sni JIU s dsy sAo jas sAq OJJ nio QT
S2T 021 SH
usv JOS v J3S ^IO njo n{Q s sA3 sAq J¾ usy J3S JMI naq jqx
Οΐΐ SOI 001
s n[o sAn 3[[ 9[i Af S!H njo s sAq JIU SAQ OJJ dsy SAQ S!H
56 06 98 01 nio SAQ ΙΌΛ ji|丄 jas usy SAQ oqj oqd usy OJJ sAq SAQ 3J / SAQ sAq
08 SI 01 99
JMl usv uio Jqi 3J J 1 SAQ usy an nyg 八 nio na Aio s!H 。
09 S9 09 njg dsy S/t3 na Sjy s ^ 3jy 3Jy sXg s J9¾ JOS 9 j SIH ¾IV sA g
98
dsv J41 JAl nio sA'| Ai "10 uio SAQ OJd Ϊ¾Λ SAO dsy OJJ nio dsy
08 S2 OZ
^10 usv ΙΒΛ Jill s dsy 3JV ¾1V s 3J nig AjQ OJd OJd S Q OJd rOSIO/i6df/X3«I 6ICWi60A\ 098
sAi Aj9 ojj J8S na J9S nai J9§ OSS 02 "10 J Mi J S !H usy s!H naq BJV nio S!H \ J3S SAQ J3S οεε οεε S2C
aqd Λ usv ^10 uiO "10 丄 Sjy S sA dsy Ι¾Λ -^1 na sAq J9§ 0Z 9l£ OIE SOS 丄 na'i 9¾ 9i|d J3S /510 dsy J3S dsy n3q OJd OJ^ J¾ jq丄 sA g
OOS 962 062 j/ί丄 usv usv nio OJd ujg A[Q usy J3S nio dJ丄 nio Ι¾Λ ¾IV 311 dsy
982 082 SAZ
J3S OJd i gqd /iio sAi na S Q J¾ na J3S Ι¾Λ uio usy s q
OLZ S92 092 01 jqi na'i nio dsy 3jy J3S OJd OJd ng jqi J/ (丄 m UIQ OJd njg 3jy
SSS 052 ^2
OJd uio ^io s BIV sAq J3S ail J¾ sAq nj ail OJd ¾i OJd na o ses oes s^s
BIV sA usy J8S [¾Λ sA'i SAQ sA JA丄 njo s /i{0 usy ng dj丄 dsy S
OZZ 512 012 uio sin naq Ϊ¾Λ J Ml naq Ι¾Λ J3S Ι¾Λ Ι¾Λ 3JV J J MI usy 丄
gOZ 002 S6I
uio "19 nio 3JV OJd sAq jqi sA ¾iv usy S!H [ΒΛ niO Ι¾Λ dsv iOSIO/Z.6df/X3d 6l£ZflL6 OW 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 384
配列の型：核酸
配列の種類： cDNA t o mRNA
酉己歹 ij：
ACTCACAACT TGGAAGGCCT GCATCATGAT GGCCAATTCT GCCATAAGCC CTGTCCTCCA 60 GGTGAAAGGA AAGCTAGGGA CTGCACAGTC AATGGGGATG AACCAGACTG CGTGCCCTGC 120 CAAGAAGGGA AGGAGTACAC AGACAAAGCC CATTTTTCTT CCAAATGCAG AAGATGTAGA 180 TTGTGTGATG AAGGACATGG CTTAGAAGTG GAAATAAACT GCACCCGGAC CCAGAATACC 240 AAGTGCAGAT GTAAACCAAA CTTTTTTTGT AACTCTACTG TATGTGAACA CTGTGACCCT 300 TGCACCAAAT GTGAACATGG AATCATCAAG GAATGCACAC TCACCAGCAA CACCAAGTGC 360
AAAGAGGAAG GATCCAGATC TAAC 384 配列番号： 1 3
配列の長さ ： 429
配列の型：核酸
配列の種類： cDNA t o mRNA
配列：
ACTCACAACT TGGAAGGCCT GCATCATGAT GGCCAATTCT GCCATAAGCC CTGTCCTCCA 60
GGTGAAAGGA AAGCTAGGGA CTGCACAGTC AATGGGGATG AACCAGACTG CGTGCCCTGC 120 CAAGAAGGGA AGGAGTACAC AGACAAAGCC CATTTTTCTT CCAAATGCAG AAGATGTAGA 180 TTGTGTGATG AAGGACATGG CTTAGAAGTG GAAATAAACT GCACCCGGAC CCAGAATACC 240 AAGTGCAGAT GTAAACCAAA CTTTTTTTGT AACTCTACTG TATGTGAACA CTGTGACCCT 300 TGCACCAAAT GTGAACATGG AATCATCAAG GAATGCACAC TCACCAGCAA CACCAAGTGC 360 AAAGAGGAAG GATCCAGATC TAACGAGCCC AAATCTTGTG ACAAAACTCA CACATGCCCA 420 CCGTGCCCA 429 配列番号： 1 4
配列の長さ ： 1 0 8 0
配列の型：核酸
配列の種類： c D N A t o m R N A
酉己歹リ：
ACTCAGAACT TGGAAGGCCT GCATCATGAT GGCCAATTCT GCCATAAGCC CTGTCCTCCA 60 GGTGAAAGGA AAGCTAGGGA CTGCACAGTC AATGGGGATG AACCAGACTG CGTGCCCTGC 120 CAAGAAGGGA AGGAGTACAC AGACAAAGCC CATTTTTCTT CCAAATGCAG AAGATGTAGA 180
TTGTGTGATG AAGGACATGG CTTAGAAGTG GAAATAAACT GCACCCGGAC CCAGAATACC 240 AAGTGCAGAT GTAAACCAAA CTTTTTTTGT AACTCTACTG TATGTGAACA CTGTGACCCT 300
TGCACCAAAT GTGAACATGG AATCATCAAG GAATGCACAC TCACCAGCAA CACCAAGTGC 360
AAAGAGGAAG GATCCAGATC TAACGAGCCC AAATCTTGTG ACAAAACTCA CACATGCCCA 420
CCGTGCCCAG CACCTGAACT CCTGGGGGGA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC CCCAAAACCC 480
AAGGACACCC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACAT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC 540 CACGAAGACC CTGAGGTCAA GTTCAACTGG TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC 600
AAGACAAAGC CGCGGGAGGA GCAGTACAAC AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC 660 08 9i 0L S9 siH BIV sAq dsy J MX 丄 ηΐθ sX'i Aio n{Q UIQ s OJJ Ι¾Λ SAD dsy Z
09 SS 09
OJd njg dsy Aid usv Ι¾Λ J Ml s dsy 8jy ¾iv sA 8jy nio JQ OJd
9? 017
OJd sAo OJd sA S!H SAQ 9i|d uio AJQ dsy S!H S!H na Λ19 n3q
OS 92 02 SI usv uio Jq丄 nio [¾Λ JM1 リ丄 八 JiU sAq 3jy naq nio "31 ^10 s
91 01 S I
J3S usy ail dsy JM1 n uio ¾1V usv Ι¾Λ s sA J9S naq 8J
：
§@ ； -· figG?½3S 01 2. 9 1 ：
g ϊ ： "蓥
080 [ VVVlOOODOi 3X01033191330V0VV9V3 OOVOVIOVOO VV3V3013X090V01V301V OSOI 0X033X391V lOllOiOOV VOOOOVOOVO 00100V30V0 VVOVOOIOOO V0130VV30V 096 3V10133U3 X13313000V OOOIOVOOXO 01033013003V30V0VV3V 13VV3VV0V9 S 006 9330V3009X VVOOVOV090 IOVOOXOOOO 31V0VO3OV3301V13I130 OVVVOIOOIO On 30100V0X030V3100V33V V0VV30V0130V0XV00033 OlVOOOOOOi 303V3V1010 02L OVOVOa VOV 003039V3000VVV030VVV 30X0IV33VV VV9V031V033030V333X3 OZL 030VVV3VV3310XOOVV30 0VV3O01VV913901DV90V 30V00I3310 rOSlO/Z.6Jf/lDd ひ "60AV ε L 9ε 0IV01V01V3 D10000VV90 iXDVVOVOXO V0V9IL0V3V I3VU0I0VO VV99V011VV08 OOIIVOOOVV OaiDVVDlVO VOIOVOIOVV D330IVV119 lOVVVVODXO 0XVILV9V10 02^2 0110I9100V 1131L0013133V1331030 V0013XVD0091301VDDVV OVVOXOOilV81 0OVDO0I13V D1I13100VV 0000119V90 DV19V3130000V0010011000300331321 1131330109 V09000V0330130013339 V33D0V01003V0V3VV000 V30013V3009 900000V31339VD013001 i im^N ILLOOOOVVO OOV910V0OO OiOIIOOOVO
： SI
VNH^ o \ V a 3 :
■■
Figure imgf000075_0001
9 ΐ ： ^ gsi osi S^T oi usy J3S 3JV J3S 3 "10 "ID sAi SAQ sA jqi usy J3S o i ssi οετ
JMl na J sAo nio sAq an an Aio S!H njo s/to sAq Jリ丄 s o OJd
S2I 021 SH
dsy s Q s!H n[0 s \Έ\ Jas usy sA^ 9Md a¾ usv o-id sίι S Q s
0Π 901 001
3JV s o jqi usy "10 JM13 Jill sAo usy an no Ι¾Λ "ίθ na
96 06 S8
siH i nig dsy SAQ naq 3JV S 3JV 3JV SAQ sA jas J9S rOSTO/.6dX/X3J 6ICひ/ 6 OAV AV ΰ O
2
to
Figure imgf000076_0001
V3V1 1。 V3V51 30纏3 01V11
V1VV3113311313Vし330, 1E AACTTTGTTT ATAACTCTGA GAAGATCATA TTTATGTAAA GTATATGTAT TTGAGTGCAG 〗740 AATTTAAATA AGGCTCTACC TCAAAGACCT TTGCACAGTT TATTGGTGTC ATATTATACA 1800 ATATTTCAAT TGTGAATTCA CATAGAAAAC ATTAAATTAT AATGTTTGAC TATTATATAT 1860 GTGTATGCAT TTTACTGGCT CAAAACTACC TACTTCTTTC TCAGGCATCA AAAGCATTTT 1920 GAGCAGGAGA GTATTACTAG AGCTTTGCCA CCTCTCCATT TTTGCCTTGG TGCTCATCTT 1980 AATGGCCTAA TGCACCCCCA AACATGGAAA TATCACCAAA AAATACTTAA TAGTCCACCA 2040 AAAGGCAAGA CTGCCCTTAG AAATTCTAGC CTGGTTTGGA GATACTAACT GCTCTCAGAG 2100 AAAGTAGCTT TGTGACATGT CATGAACCCA TGTTTGCAAT CAAAGATGAT AAAATAGATT 2160 CTTATTTTTC CCCCACCCCC GAAAATCTTC AATAATGTCC CATGTAAAAC CTGCTACAAA 2220 TGGCAGCTTA TACATAGCAA TGGTAAAATC ATCATCTGGA TTTACGAATT GCTCTTGTCA 2280 TACCCTCAAG TTTCTAAGAT TTAAGATTCT CCTTACTACT ATCCTACGTT TAAATATCTT 2340 TGAAAGTTTG TATTAAATGT GAATTTTAAG ΛΛΑΤΛΛΤΛΤΤ TATATTTCTG TAAATGTAAA 2400 CTGTGAAGAT AGTTATAAAC TGAAGCAGAT ACCTGGAACC ACCTAAAGAA CTTCCATTTA 2460 TGGAGGATTT TTTTGCCCCT TGTGTTTGGA ATTATAAAAT ATAGGTAAAA GTACGTAATT 2520 AAATAATGTT TTTG 2534 配列番号： 1 7
配列の長さ ： 4 8 6
配列の型：核酸
配列の種類： c D N A t o m R N A
配列：
TTTTCTTCCA TTTCAGGTGT CGTGAGGAAT TCACCATGCT GGGCATCTGG ACCCTCCTAC 60 CTCTGGTTCT GACTAGTGTC GCTACTCAGA ACTTGGAAGG CCTCCATCAT GATGGCCAAT 120 TCTGCCATAA GCCCTGTCCT CCAGGTGAAA GGAAACCTAG GGACTGCACA GTCAATGGGG 180
ATGAACCAGA CTGCGTGCCC TGCCAAGAAG GGAAGGAGTA CACAGACAAA GCCCATTTTT 240
CTTCCAAATG CAGAAGATGT AGATTGTGTG ATGAAGGACA TGGCTTAGAA GTGGAAATAA 300 ACTGCACCCG GACCCAGAAT ACCAAGTGCA GATGTAAACC AAACTTTTTT TGTAACTCTA 360
CTGTATGTGA ACACTGTGAC CCTTGCACCA AATGTGAACA TGGAATCATC AAGGAATGCA 420
CACTCACCAG CAACACCAAG TGCAAAGAGG AAGGATCCAG ATCTAACTAA TAGGGTACCT 480
TCTGAG 486 配列番号： 1 8
配列の長さ ： 1 1 8 2
配列の型：核酸
配列の種類： c D N A t o m R N A
酉己歹 'J：
TTTTCTTCCA TTTCAGGTGT CGTGAGGAAT TCACCATGCT GGGCATCTGG ACCCTCCTAC 60 CTCTGGTTCT GACTAGTGTC GCTACTCAGA ACTTGGAAGG CCTGCATCAT GATGGCCAAT 120 TCTGCCATAA GCCCTGTCCT CCAGGTGAAA GGAAAGCTAG GGACTGCACA GTCAATGGGG 180
ATGAACCAGA CTGCGTGCCC TGCCAAGAAG GGAAGGAGTA CACAGACAAA GCCCATTTTT 240
CTTCCAAATG CAGAAGATGT AGATTGTGTG ATGAAGGACA TGGCTTAGAA GTGGAAATAA 300
ACTGCACCCG GACCCAGAAT ACCAAGTGCA GATGTAAACC AAACTTTTTT TGTAACTCTA 360 CTGTATGTGA ACACTGTGAC CCTTGCACCA AATGTGAACA TGGAATCATC AAGGAATGCA 420
CACTCACCAG CAACACCAAG TGCAAAGAGG AAGGATCCAG ATCTAACGAG CCCAAATCTT 480 GTGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG 540 TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 600 CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG 660 ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC AACAGCACGT 720 ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA 780 AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA 840 AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA 900 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG 960 AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT 1020 CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG 1080 GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA 1140 GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT AAATGATAGG GTACCTTCTG AG 1182 配列番号： 1 9
配列の長さ ： 5 3 1
配列の型：核酸
配列の種類： c D N A t o m R N A
酉己歹 'J：
TTTTCTTCCA TTTCAGGTGT CGTGAGGAAT TCACCATGCT GGGCATCTGG ACCCTCCTAC 60 CTCTGGTTCT GACTAGTGTC GCTACTCAGA ACTTGGAAGG CCTGCATCAT GATGGCCAAT 120 TCTGCCATAA GCCCTGTCCT CCAGGTGAAA GGAAAGCTAG GGACTGCACA GTCAATGGGG 180 ATGAACCAGA CTGCGTGCCC TGCCAAGAAG GGAAGGAGTA CACAGACAAA GCCCATTTTT 240 > > CD oT> =- CT3
3 <T3
-3 >· T5
5>
T5 c"5 <r>
CD >
—3 >
—3
—3D
CAG TACCATT一
¾CTT CACTCCC CAACGA AAGAT CGG AT ；T ACTCA一 CCCGAAT A TGTATAC

Claims

請求の範囲
1 . F a s抗原ポリべプチドの N末端アミノ酸残基から最も N末端よりのシス ティン残基までのアミノ酸残基 （該システィン残基は除く） のうち少なくとも 1 つのァミノ酸残基が欠失した F a s抗原細胞外領域ポリべプチドの一部または全 部を、 少なくとも含有することを特徴とする新規 F a s抗原誘導体。
2 . 前記少なくとも 1つのアミノ酸残基が欠失した F a s抗原細胞外領域ポリ ぺプチドが、 配列表の配列番号 1 5の N末端から数えて 1〜 4 2番目のァミノ酸 残基のうち少なくとも 1つが欠失した F a s抗原細胞外領域ポリぺプチドである 請求項 1に記載の新規 F a s抗原誘導体。
3 . 前記ァミノ酸残基が欠失した F a s抗原細胞外領域ポリべプチドの欠失し たアミノ酸残基数が 2 9以上である請求項 1または 2に記載の新規 F a s抗原誘 導体。
4 . F a s抗原ポリべプチドの N末端ァミノ酸残基から最も N末端よりのシス ティン残基までのアミノ酸残基 （該システィン残基は除く） のうち少なくとも 1 つのァミノ酸残基が欠失した F a s抗原細胞外領域ポリべプチドの一部または全 部からなるポリべプチド
または、
該ポリべプチドを少なくとも含有し、 さらに F a s抗原膜貫通領域および Zま たは F a s抗原細胞内領域の 1部または全部を含有するポリべプチドからなる群 力、ら選択される、 F a s抗原の 1または 2以上の部分からなる新規 F a s抗原変 異体
である請求項 1〜 3のいずれかに記載の新規 F s抗原誘導体。
5. 請求項 4に記載の新規 F a s抗原変異体にさらに F a s抗原以外の (ポリ） ぺプチドを含有する融合ポリべプチドである請求項！〜 3のいずれかに 記載の新規 F a s抗原誘導体。
6. 請求項 5に記載の融合ポリべプチドの C末端側に下記 aおよび bからなる 群から選択される少なくとも 1つの （ポリ） ペプチドを含有する請求項 5に記載 の新規 F a s抗原誘導体。
a . ィムノグロブリンのヒンジ領域の 1部または全部。
b. ィムノグロプリンの F c断片の 1部または全部。
7. 請求項 1〜 6のいずれかに記載の新規 F a s抗原誘導体の多量体である新 規 F a s抗原誘導体。
8. 請求項 1〜 7のいずれかに記載のポリぺプチドをコ―ドする I〕 N A配列を 含有することを特徴とする DNA。
9. 配列表の配列番号 1 2〜1 4のいずれかに記載の DN A配列を含有する請 求項 8に記載の DNA。
1 0. 請求項 8または 9に記載の DNA配列を含有することを特徴とする組み 換え DNA分子。
1 1. 請求項 1 0に記載の組み換え D N A分子で形質転換されたことを特徴と する形質転換体。
1 2. 請求項 1 1に記載の形質転換体を培養し、 該培養混合物から請求項 1〜 7のいずれかに記載の新規 F a s抗原誘導体を回収、 精製する工程を含むことを 特徴とする、 請求項 1〜7のいずれかに記載の新規 F a s抗原誘導体の製造 方法。
1 3 . 請求項 1〜7のいずれかに記載の新規 F a s抗原誘導体またはその生理 的に許容されうる塩を有効成分として含有する医薬。
1 4 . F a s抗原ポリペプチドの N末端アミノ酸残基から最も N末端よりのシ スティン残基までのアミノ酸残基 （該システィン残基は除く） のうち少なくとも 1つを欠失させることを特徴とする、 F a s抗原または F a s抗原誘導体の活性 または機能を改良する方法。
PCT/JP1997/001502 1996-05-02 1997-05-01 NOUVEAUX DERIVES DE L'ANTIGENE Fas WO1997042319A1 (fr)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/180,100 US6306395B1 (en) 1996-05-02 1997-05-01 Fas antigen derivatives
EP97918354A EP0965637B1 (en) 1996-05-02 1997-05-01 Fas ANTIGEN DERIVATIVES
AT97918354T ATE299936T1 (de) 1996-05-02 1997-05-01 Fas antigen-derivate
AU26505/97A AU2650597A (en) 1996-05-02 1997-05-01 Novel fas antigen derivatives
DE69733773T DE69733773T2 (de) 1996-05-02 1997-05-01 Fas ANTIGEN-DERIVATE
US09/949,713 US6953847B2 (en) 1996-05-02 2001-09-12 Fas antigen derivative

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP8/135760 1996-05-02
JP13576096 1996-05-02

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US09180100 A-371-Of-International 1997-05-01
US09/180,100 A-371-Of-International US6306395B1 (en) 1996-05-02 1997-05-01 Fas antigen derivatives
US09/949,713 Division US6953847B2 (en) 1996-05-02 2001-09-12 Fas antigen derivative

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997042319A1 true WO1997042319A1 (fr) 1997-11-13

Family

ID=15159230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1997/001502 WO1997042319A1 (fr) 1996-05-02 1997-05-01 NOUVEAUX DERIVES DE L'ANTIGENE Fas

Country Status (7)

Country Link
US (2) US6306395B1 (ja)
EP (1) EP0965637B1 (ja)
AT (1) ATE299936T1 (ja)
AU (1) AU2650597A (ja)
CA (1) CA2253494A1 (ja)
DE (1) DE69733773T2 (ja)
WO (1) WO1997042319A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999058150A1 (fr) * 1998-05-14 1999-11-18 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Agents preventifs/remedes contre la cirrhose du foie
JP2003501090A (ja) * 1999-06-07 2003-01-14 イミュネックス・コーポレーション Ｔｅｋアンタゴニスト
US6759041B1 (en) 1998-05-29 2004-07-06 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Preventives/remedies for autoimmune demyelinating diseases
US6905684B1 (en) 1997-11-10 2005-06-14 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Preventives and remedies for diffuse lung diseases
JP2007528708A (ja) * 2003-06-30 2007-10-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆトラップおよびその治療的使用
JP2015524403A (ja) * 2012-07-18 2015-08-24 アポジェニックス ゲーエムベーハーＡｐｏｇｅｎｉｘ Ｇｍｂｈ 短縮されたＣＤ９５−Ｆｃ変異体

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6942981B1 (en) * 1999-05-14 2005-09-13 Arbor Vita Corporation Method of determining interactions with PDZ-domain polypeptides
US20050037969A1 (en) * 1999-05-14 2005-02-17 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in hematopoietic cells
US20070129291A1 (en) * 2001-08-01 2007-06-07 Genset S.A. Genobix agonists and antagonists for use in the treatment of metabolic disorders
GB2381122B (en) * 2001-10-16 2006-04-05 Zetex Plc Termination structure for a semiconductor device
AU2003278833A1 (en) * 2002-09-19 2004-04-08 Cornell Research Foundation, Inc. Homing peptides to receptors of heart vasculature
DE602004022390D1 (de) 2003-03-26 2009-09-17 Apogenix Gmbh Verbesserte fc-fusionsproteine
PT2101877E (pt) 2006-12-28 2013-07-22 Deutsches Krebsforsch Neutralização de atividade de blocos de invasão cd95 de células de glioblastoma in vivo
US20090196868A1 (en) * 2007-09-06 2009-08-06 Apogenix Gmbh Methods and compositions for preventing radiation-induced pneumonitis
SI2697257T1 (sl) 2011-04-13 2017-02-28 Bristol-Myers Squibb Company FC fuzijski proteini, ki vsebujejo nove linkerje ali razmestitve
JP6297552B2 (ja) 2012-07-18 2018-03-20 アポジェニックス アーゲー Ｍｄｓの治療のための、ｃｄ９５シグナル伝達経路阻害剤
EP3076179A1 (en) 2015-03-30 2016-10-05 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen Rechts Diagnosis and treatment of low grade gliomas
MX2021011608A (es) 2019-03-29 2021-12-10 Myst Therapeutics Llc Metodos ex vivo para producir celulas t terapeuticas y composiciones y metodos afines.
CN115023270A (zh) 2019-11-27 2022-09-06 迈斯特治疗公司 使用调节剂产生肿瘤反应性t细胞组合物的方法
CN115427438A (zh) 2020-02-27 2022-12-02 迈斯特治疗公司 肿瘤反应性t细胞的离体富集和扩增的方法及其相关组合物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05503009A (ja) * 1989-11-22 1993-05-27 ジェネンテク，インコーポレイテッド リガンド結合タンパク質および安定血漿タンパク質からなる融合タンパク質
JPH0769914A (ja) * 1993-01-22 1995-03-14 Bristol Myers Squibb Co 免疫応答調節組成物
WO1995013293A1 (fr) * 1993-11-10 1995-05-18 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Ligand fas, partie de ce dernier, et adn codant pour ce dernier
JPH07289266A (ja) * 1994-04-21 1995-11-07 Mochida Pharmaceut Co Ltd ヒトＦａｓ抗原バリアント及びそれをコードする新規ＤＮＡ

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2067031C (en) * 1991-04-26 2003-02-18 Shigekazu Nagata Dna coding for human cell surface antigen

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05503009A (ja) * 1989-11-22 1993-05-27 ジェネンテク，インコーポレイテッド リガンド結合タンパク質および安定血漿タンパク質からなる融合タンパク質
JPH0769914A (ja) * 1993-01-22 1995-03-14 Bristol Myers Squibb Co 免疫応答調節組成物
WO1995013293A1 (fr) * 1993-11-10 1995-05-18 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Ligand fas, partie de ce dernier, et adn codant pour ce dernier
JPH07289266A (ja) * 1994-04-21 1995-11-07 Mochida Pharmaceut Co Ltd ヒトＦａｓ抗原バリアント及びそれをコードする新規ＤＮＡ

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Nikkei Baio Saishin-Yogo Jiten '91, (In Japanese)", Edited by NIKKEI BAIOTEKU (NIKKEI BP SHA), 1991, p. 550. *
ITOH N., ET AL.: "THE POLYPEPTIDE ENCODED BY THE CDNA FOR HUMAN CELL SURFACE ANTIGEN FAS CAN MEDIATE APOPTOSIS.", CELL, CELL PRESS, US, vol. 66., 26 July 1991 (1991-07-26), US, pages 233 - 243., XP000579691, ISSN: 0092-8674, DOI: 10.1016/0092-8674(91)90614-5 *
RAMSDELL F, ET AL: "Gld/Gld Mice are Unable to Express a Functional Ligand for Fas", EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, WILEY - V C H VERLAG GMBH & CO. KGAA, DE, vol. 24, 1 January 1994 (1994-01-01), DE, pages 928 - 93, XP002962037, ISSN: 0014-2980, DOI: 10.1002/eji.1830240422 *
TANAKA M., ET AL.: "EXPRESSION OF THE FUNCTIONAL SOLUBLE FORM OF HUMAN FAS LIGAND IN ACTIVATED LYMPHOCYTES.", EMBO JOURNAL., OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY., GB, vol. 14., no. 06., 1 January 1995 (1995-01-01), GB, pages 1129 - 1135., XP002063725, ISSN: 0261-4189 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6905684B1 (en) 1997-11-10 2005-06-14 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Preventives and remedies for diffuse lung diseases
WO1999058150A1 (fr) * 1998-05-14 1999-11-18 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Agents preventifs/remedes contre la cirrhose du foie
US6759041B1 (en) 1998-05-29 2004-07-06 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Preventives/remedies for autoimmune demyelinating diseases
JP2003501090A (ja) * 1999-06-07 2003-01-14 イミュネックス・コーポレーション Ｔｅｋアンタゴニスト
JP2007528708A (ja) * 2003-06-30 2007-10-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆトラップおよびその治療的使用
JP2015524403A (ja) * 2012-07-18 2015-08-24 アポジェニックス ゲーエムベーハーＡｐｏｇｅｎｉｘ Ｇｍｂｈ 短縮されたＣＤ９５−Ｆｃ変異体
JP2015528006A (ja) * 2012-07-18 2015-09-24 アポジェニックス ゲーエムベーハーＡｐｏｇｅｎｉｘ Ｇｍｂｈ ＣＤ９５−Ｆｃアイソフォームの混合物を含む組成物

Also Published As

Publication number Publication date
CA2253494A1 (en) 1997-11-13
EP0965637A1 (en) 1999-12-22
ATE299936T1 (de) 2005-08-15
US20020044944A1 (en) 2002-04-18
US6306395B1 (en) 2001-10-23
AU2650597A (en) 1997-11-26
EP0965637B1 (en) 2005-07-20
US6953847B2 (en) 2005-10-11
EP0965637A4 (en) 2002-09-25
DE69733773D1 (de) 2005-08-25
DE69733773T2 (de) 2006-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1997042319A1 (fr) NOUVEAUX DERIVES DE L&#39;ANTIGENE Fas
CA2591297C (en) Il-7 variants with reduced immunogenicity
AU2018394189B2 (en) IL-2 variant
AU2012392760B2 (en) Immunomodulatory proteins
KR101507718B1 (ko) 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ｖｉｉｉ, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체
AU2019206030A1 (en) Methods for treating fatty liver disease
EP2507267B1 (en) Compositions and methods for increasing serum half-life of fc fusion proteins
US20050196402A1 (en) CTLA4-Cy4 fusion proteins
KR20060124656A (ko) 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
JP2008537680A (ja) 安定性の増大された改変型凝固第ｖｉｉｉ因子およびその誘導体
EP2411024A1 (en) Factor viii variants and methods of use
JP2008517605A (ja) メラノコルチン受容体結合性ミメティボディ、組成物、方法および用途
KR20010100980A (ko) Ｏｐｇ 융합 단백질 조성물 및 방법
EA037308B1 (ru) ВЫДЕЛЕННЫЙ ПЕПТИДНЫЙ АНТАГОНИСТ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМОГО КАЛИЕВОГО КАНАЛА Kv1.3
CN113105562B (zh) 突变型单链人凝血因子viii在制备融合蛋白中的应用
CZ290596B6 (cs) Modifikovaný lidský C3 protein, DNA sekvence kódující tento protein, DNA konstrukt obsahující tuto DNA sekvenci, konjugát obsahující uvedený protein, pouľití uvedeného proteinu a konjugátu a farmaceutický prostředek obsahující uvedený protein nebo konjugát
WO1998018487A1 (fr) Agent prophylactique/therapeutique
CA3161302A1 (en) Long-acting gdf15 fusion protein and pharmaceutical composition comprising same
KR20220044683A (ko) 관절염 치료를 위한 hla-dr/cii 펩티드 복합체
KR20200079197A (ko) 타입 1 인터페론 중화 Fc-융합 단백질 및 이의 용도
CN112673026B (zh) 突变型单链人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
KR20220160023A (ko) 조절성 t 세포를 활성화하는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 단백질
KR100502855B1 (ko) 인간 트롬보포이에틴 변이체 및 그의 제조방법
AU2004202633B2 (en) Antibodies and immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
JP2015514082A (ja) オステオプロテゲリン由来の組成物およびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CA CN JP KR NO NZ US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2253494

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2253494

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09180100

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1997918354

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1997918354

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1997918354

Country of ref document: EP