WO1995013293A1

WO1995013293A1 - Ligand fas, partie de ce dernier, et adn codant pour ce dernier

Info

Publication number: WO1995013293A1
Application number: PCT/JP1994/001899
Authority: WO
Inventors: Shigekazu Nagata; Takashi Suda; Tomohiro Takahashi; Norio Nakamura
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.; Osaka Bioscience Institute
Priority date: 1993-11-10
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 1995-05-18
Also published as: JP3716936B2; KR100384821B1; CA2153507C; AU8115894A; CA2153507A1; JPH08127594A; DE69434738T2; ATE326535T1; EP0675200B1; EP0675200A1; AU689157B2; US6348334B1; DE69434738D1

Description

明細書

FAJSリ^ン ' の一一 S DN A

技術分野

本発明は、 Fas リガンドおよびその一部、およびそれをコードする新規な DNA を医薬の分野に提供する。本発明は、また、当該新規ポリペプチドを検出するために使用できる抗体を試薬の分野に提供する。さらに、本発明は、当該 DNA を含む組換え DNA分子、形質転換体、当該新規ポリペプチドの精製方法、および当該新規ポリペプチドの製造方法、当該 DNA に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、 Fas リガンドに関連する物質のスクリーニング法をも提供する。

背景技術

多数の細胞で構成される生体の恒常性は、細胞の増殖と分化およびその死によって巧妙に制御されている。細胞の死は、死につつある細胞の形態から、ネクロ一シス（壊死）とアポトーシス（自死）に大別される。このうち、ネクロ一シスとは、一つ以上の細胞あるいは組織や器官の一部分のァクシデン夕ルな死のことである。ネクローシスを起こした細胞では、細胞膜の破壊、および細胞内容物の細胞外への放出が観察される。一方、アポトーシスとは、生体の恒常性を維持するための細胞死のことである。アポトーシスを起こした細胞では、染色体 DNA の断片化、核の濃縮が観察されるが、ネクローシスの場合とは異なり、細胞膜の破壊や細胞内容物の放出は認められない。アポトーシスはプログラム細胞死（programed cel l death) の 1つの形態であるとも考えられており、例えば、個体発生において不必要な細胞や器官が欠落していく現象は細胞のアポトーシスによるものと考えられている。また、細胞障害性 T細胞（CTし)、ナチュラルキラ一細胞（NK細胞）、 TNF—ひや TNF—/Sなどによってウィルス感染細胞や腫瘍細胞が攻撃除去され際の細胞死もアポトーシスであると考えられており、アポトーシスの機能を解明し、生理現象との関係を明らかにするための研究が、多くの研究者によって進められている。

ところで、細胞にアポトーシスを生じさせる物質としては Fas抗体が知られている。 Fas抗体は、ヒト線維芽細胞でマウスを免疫して得られたモノクローナル抗体である（ヨネハラ S. (Yonehara S. )等、 J. Exp. Med. , 169巻、 1747-1756 頁、 1989年）。 Fas 抗体によって認識され、アポトーシスのシグナルを細胞に伝達する細胞表面抗原（Fas 抗原）がいかなるものであるかは長年不明であつたが、最近、ィトウ N. d toh N. )等によって、 Fas抗原遺伝子がクローニングされ、 Fas 抗原が約 45kDの細胞膜上の蛋白質であり、そのアミノ酸配列から TNFレセプターファミリーに属する事が判明した（Cel l、 66巻、 233-243頁、 1991年）。また、マウス Fas抗原遺伝子もクローニングされ（ワタナベ一フクナガ (Watanabe- Fukunaga R. )等、 J. I画 imoL , 148巻、 1274-1279頁、 1992年) 、 Fas抗原 mRNAが、マウスの胸腺、肝、肺、心臓、卵巣で発現していることが確認された。

Fas抗原遺伝子のクローニング以後、 Fas抗原を介したアポトーシスと疾患との関係についての研究が進み、種々の報告がされるようになった。

コバヤシ N. (Kobayashi N. ) 等は、エイズウイルス感染により T細胞膜上に Fa s 抗原の発現が誘導されることを報告し、エイズで見られる T細胞のアポトーシスカ \ Fas抗原を介した現象である可能性を示唆している（日経サイエンス、 6 Jr 巻、 34-41 頁、 1993年) 。

ォガサワラ（Ogasawara J. )等は、 Fas 抗体をマウスに投与することによって、劇症肝炎に似た現象が起きることを観察し、劇症肝炎などの炎症部位では、 F a s抗原を介したアポトーシスが生じている可能性を示唆した (Nature、 364巻、 806-809頁、 1993年）。ヒラマツ（Hiramatsu Y. )等は、慢性 C型肝炎の患者で、白血球の浸潤が認められる、肝臓の炎症部位に Fas抗原の発現が高いことを報告した (Hepatology, 19巻、 1354-1359頁、 1994年) 。

ワタナベ一フクナガ (Watanabe-Fukunaga R. )等は、自己免疫疾患のモデル動物の 1つである lprマウスでは Fas抗原遺伝子に変異が生じていること、このような変異の生じた Fas抗原遺伝子を発現している細胞ではアポトーシスが起きないことを証明している。そして、自己免疫疾患では、 Fas 抗原もしくは Fas 抗原に作用してアポトーシスを起こさせる生体内物質に異常があり、そのため、本来アポトーシスを起こして生体内から除去されるべき自己反応性の T細胞が残存し、自己免疫疾患様の症状が生じるのであろうと予想している（Nature, 356巻、 314-317頁、 1993年) 。

このように、 Fas抗原が単離され、生体内で Fas抗原が発現し、アポトーシスが惹起されることが確認されたことから、 Fas抗原に結合して細胞にアポトーシスを起こすような物質（以下、 Fas リガンドという）が生体内に存在し、 Fas抗原特異的なアポトーシスが起きていることが予想された。

上述の Watanabe- Fukimaga等は、 lprマウスと同様に自己免疫疾患様症状を呈する gldマウスでは、 Fas 抗原に結合する生体内分子の方に異常があるのであろうと予想した。

最近、ルービエ E. (Rouvier E. ) らは、免疫系において Fas 抗原特異的なアポトーシスが生じていることをより具体的に示した（J. Exp. Med. , 177巻、 195- 200 頁、 1993年）。すなわち、彼らは、マウス末梢血リンパ球（ PBL) 、および、マウス CTLとラット Tリンパ種細胞のハイブリドーマである PC60- dlOS細胞を使用し、これらの細胞による Ca^{2 +}非依存的な細胞障害作用が、 Fas抗原を発現する細胞に対してのみ認められる事を示した。そして、彼等は、これらのリンパ球細胞、とりわけ T細胞が Fas抗原もしくは Fas 抗原に関連する何らかの分子を認識しているであろうこと、およびこれらの細胞が Fas リガンドを発現してレ、るかもしれないことを指摘している。

Fas 抗原を介したアポトーシスの機構を解明するには、 Fas リガンドを単離することが重要である。

上記ルービエ (Rouvier E. )等により、 Fas リガンドの存在の可能性が指摘されたが、その実体は何ら明らかにされていない。

前述のように、 Fas 抗原と様々な疾患、生理現象との関連が示唆されていることから、 Fas リガンドの存在を明らかにし、その実体を把握することは、医療をはじめ、多くの分野で渴望されている。

発明の開示

本発明の目的は、 Fas抗原に結合する新規な蛋白質およびそれをコードする遺伝子を単離し、提供することにある。

Fas抗原に結合する物質が単離されれば、それを使用して、人為的に生体内で生じるアポトーシスを調節し、疾患の治療や、診断に使用する事ができる。 Fas 抗原に結合して細胞にアポトーシスを誘導するような物質（Fas リガンド）は、生体にとって不必要な細胞を除去するために使用することが可能である。たとえば、先述したように、エイズウイルス感染細胞では Fas抗原が発現されているので、エイズウイルス感染初期においては、 Fas リガンドを使用してアポトーシスを人工的に誘導し、感染細胞を早期に除去する事により、エイズを治療する事が可能であろう。また、ある種の自己免疫疾患では、人為的に Fas抗原を介したァポト一シスを生じさせる事により、自己抗原反応性の T細胞の除去が可能になるであろう。また、モリモト H, (Morimoto H. )等は、癌細胞に Fas抗原を介したァポトーシスを誘導する事によって、ァドリアマイシンやシスブラチンによる制癌効果が相乗的に増強されることを報告している（Cancer Res.， 53 巻、 2591 - 2596頁、 1993年）ので、 Fas リガンドは癌治療にも使用することができるであろう。

一方、エイズウイルス感染後期の免疫能の低下や、劇症肝炎における肝機能低下は、免疫担当細胞あるいは肝細胞のアポトーシスにより組織の機能が著しく低下した結果と考えられる。このような状態においては、 Fas リガンドの作用を抑制し、細胞のアポトーシスを防ぐことが必要になる。したがって、このような病態には、 Fas リガンドの発現を抑制する物質や Fas リガンドと拮抗的に作用する物質を使用した治療が必要である。

このように、生体内で生じているアポトーシスを人為的に調節するという原理に基づいた治療方法は、 Fas リガンドが同定されて初めて可能になる方法でめな o

Fas抗原と結合する蛋白質を、治療や研究に使用するためには、当該蛋白質を高純度で、大量に生産することが必要になる。当該蛋白質をコードする遺伝子をクローニングすれば、当該蛋白質を遺伝子工学的に生産することが可能になり、当該蛋白質を治療薬の主成分として使用したり、抗体の作製に使用することが可能になる。また、遺伝子そのものは、遺伝子治療やアンチセンス医薬の開発に使用したり、トランスジエニックマウス等、アポトーシスが関与する疾患のモデル動物の作製に使用することができる。

本発明者らは、 Fas リガンドを単離すべく鋭意研究を重ねてきた。そして、上述した PC60- dlOS細胞に着目した。 PC60- dlOS はマウス CTL とラット Tリンパ腫とのハイプリドーマで、 PMA (ホルボールミリステートアセテート）とィオノマィシンで刺激すると Fas 抗原発現細胞に対してのみ了ポトーシスを誘導する細胞である。本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、無刺激でも、より高い細胞障害作用を示す、 Fas リガンド遺伝子をクローニングするのに適した細胞集団、 PC60 -dlOS-2を得る事に成功した。そして、この細胞集団より、ラット Fas リガンド遺伝子をクローニングした。また、本発明者らは医薬品等に使用するのに適したヒト由来の Fas リガンドを単離することを目的として研究を重ね、ついにヒト Fa s リガンドをコードする遺伝子を得ることにも成功した。さらに、マウス Fas リガンドをコ一ドする遺伝子を得る事にも成功し、これらの配列が互いに類似すること、部分的に共通の配列を有することを確認した。さらに、 Fas リガンドの活性に必要と思われる部分を特定し、本発明を完成させたものである。

すなわち、本発明第 1の態様は、 Fas リガンドのアポト一シスを誘導する活性を有するポリべプチドを提供する。

本発明第 2の態様は、 Fas リガンドであるポリペプチドの一部を提供する。本発明第 3の態様は、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徵とする新規 DNAである。

本発明第 4の態様は、本発明第 3の態様の DNA を含むことを特徴とする組み換え DNA分子である。

本発明第 5の態様は、本発明第 3の態様の新規 DNAで形質転換されたことを特徵とする形質転換体である。

本発明第 6の態様は、本発明第 4の態様の組み換え DNA分子で形質転換されたことを特徴とする形質転換体である。

本発明第 7の態様は、本発明第 5または第 6の態様の形質転換体を用いることを特徴とする本発明第 1または第 2の態様の新規ポリべプチドの製造方法であ

本発明第 8の態様は、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドの精製方法である。

本発明第 9の態様は、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドを認識することを特徴とする新規抗体である。

本発明第 10の態様は、 Fas リガンド遺伝子または Fas リガンドに対する mRNAの —部に相補的な塩基配列を含むことを特徴とするォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体である。

本発明第 11の態様は、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドもしくはそれを発現する形質転換体を使用することを特徴とする Fas 抗原もしくは Fas リガンドに関連する物質のスクリーニング方法である。

図面の簡単な説明

図 1は、それぞれ dlOS、 dlOS- 2、及び pTN24_15で形質転換させた COS- 7細胞のフローサイトメトリーの解析結果、 _a， b， cを示す図である。

図 2は、クローン pTN24 - 15中の塩基配列および推定されるァミノ酸配を示す図である。

図 3は、クローン pTN24- 15中の塩基配列および推定されるアミノ酸配を示す図である。

図 4は、 dlOS、 dlOS- 2、 dlOS-16のノーザンハイブリダィゼシヨンの結果を示す図である。

図 5は、ラット脾細胞と胸腺細胞とを用いたノーザンハイブリダィゼーシヨンの結果を示す図である。

図 6は、ラット各組織のノーザンハイプリダイゼ一シヨンの結果を示す図であな。

図 7は、 dlOS-12及び pTN24- 15で形質転換した COS- 7細胞の免疫沈降の結果を示す図である。

図 8は、 W4、 WR19L を標的細胞としたときの dlOS細胞の細胞障害活性を示す図である。

図 9は、 W4、 WR19L を標的細胞としたときの pTN24- 15で形質転換した COS- 7細胞、 pCEV4で形質転換した COS- 7細胞の細胞障害活性を示す図である。

図 10は、 W4、 WR19Lを標的細胞としたときの PTN24-15で形質転換した C0S-7細胞、 PCEV4で形質転換した COS- 7細胞の細胞障害活性を示す図である。

図 11は、 W4細胞に対する dlOS細胞及び PTN24-15で形質転換した COS- 7細胞の細胞障害作用の mFas-Fc による阻害を示す図である。

図 12は、 pTN24- 15で形質転換した COS- 7細胞をエフヱクタ一細胞とし、 W4細胞を標的細胞としたときの、標的細胞における染色体 DNA の変化を示すゲル電気泳動を示す図である。図 13は、精製した Fas リガンドの 10-20%グラジェント SDS-ポリアクリルァミドゲル電気泳動の結果を示す図である。

図 14は、 W4及び ¾9L細胞を標的細胞としたときの精製 Fas リガンドの細胞障害活性を示す図である。

図 15は、プラスミド pBL-hFし 4H中の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を示す図である。

図 16は、ヒト Fas リガンド染色体遺伝子の塩基配列を示す図である。

図 17は、ヒト Fas リガンド染色体遺伝子の塩基配列を示す図である。

図 18は、ヒト Fas リガンド染色体遺伝子の塩基配列を示す図である。

図 19は、クローン pBX- hFLl中の塩基配列を示す図である。

図 20は、クローン pBX-hFLl中の塩基配列を示す図である。

図 21は、 pEX-hFLlで形質転換させた COS細胞および pEF_MFLW4Fで形質転換させた COS細胞をエフェクター細胞とし、 WR19Lおよび "WC8Aを標的細胞とした時の特異的細胞溶解率を示す図である。

図 22は、 hFas-Fc および mFas-Fc による、 pEX- hFLlで形質転換させた COS細胞の WC8A細胞に対する細胞障害活性の阻害を示す図である。

図 23は、クローン pBL- MFLW4 中の塩基配列を示す図である。

図 24は、クローン pBL- MFLW4 中の塩基配列を示す図である。

図 25は、 PEF-MFLW4Fで形質転換させた COS 細胞をェフクタ一細胞とし、

WR19L および¹ W4を標的細胞とした時の細胞障害活性を示す図である。

図 26は、 gl dマウスより単離した Fas リガンド cDNAを含むプラスミドで形質転換させた COS細胞をエフェクター細胞とし、 WR19L および "W4を標的細胞とした時の細胞障害活性を示す図である。

図 27は、微生物の形態を表す図面代用写真であって、抗血清 19-3とヒト Fas リガンド発現細胞を用いたウエスタンプロッティングの結果を示す図面代用写真でめる。

図 28は、微生物の形態を表す図面代用写真であって、モノクローナル抗体 F864 -5-1とヒト Fas リガンド発現細胞を用いたウエスタンプロッティングの結果を示す図面代用写真である。

図 29は、モノクローナル抗体 F883- 1 -1のぺプチドとの反応性を示す図であ。

図 30は、モノクローナル抗体 F883- 1 -1のアポトーシス抑制活性を示す図であ o。

図 31は、モノクロ一ナル抗体 F897- 1 -2のべプチド③との反応性を示す図であ O o

図 32は、モノクローナル抗体 F897-1 -2のアポトーシス抑制活性を示す図である。

図 33は、 WC8 および "W4を標的細胞とした時の形質転換体 C0S-1/PM1070の培養上清の細胞障害活性を示す図である。

図 34は、 WC8 およひ 1V4を標的細胞とした時の、形質転換体 COS-1/pEX-hFLlの培養上清の細胞障害活性を示す図である。

図 35は、微生物の形態を示す図面代用写真であり、非還元条件下における、形質転換体 COS- l/pM1070の培養上清のウェス夕ンブロッティングの結果を示す。図 36は、微生物の形態を示す図面代用写真であり、非還元条件下における形質転換体 COS- 1/pEX-hFLlの培養上清のウェス夕ンブロッティングの結果を示す。図 37は、アンチセンスオリゴヌクレオチド A41のアポトーシス抑制活性を示す図である。

図 38は、アンチセンスオリゴヌクレオチド A69， A 184， A 355 , A 505 , A 733， A924 のアポトーシス抑制活性を示す図である。

図 39は、各培養上清中のポリペプチド ND38、 ND40、 ND4K ND42、 ND43および CD179 の細胞障害活性を示す図である。

図 40は、微生物の形態を示す図面代用写真であって、形質転換体 JE5505 (PM1068)の菌体および培養上清のゥヱスタンプロッティングの結果を示す。

図 41は、微生物の形態を示す図面代用写真であって、形質転換体 JE5505 (PM1069)の菌体および培養上清のゥヱスタンプロッテイングの結果を示す。

発明の概要

以下に詳細に本発明を説明する。

まず、本発明第 1の態様について説明する。

本明細書中の説明において、「式 X (もしくは配列番号 X ) に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド」とは、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、式 X もしくは配列番号 Xに記載されたァミノ酸配列であるか、式 Xもしくは配列番号 Xのアミノ酸配列の N末端、 C末端のいずれか一方、もしくはその両方に、任意の 1つ以上のァミノ酸が付加してなるァミノ酸配列であることを意味する。また、「式 X (もしくは配列番号 X ) に記載のァミノ酸配列を有するポリぺプチド」とは、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、実質的に、式 Xもしくは配列番号 Xに記載のァミノ酸配列であることを意味する。また、本明細書中の説明において、「Fas リガンド」とは、少なくともその活性として、 Fas抗原を発現する細胞に対してアポトーシスを誘導する活性を有する物質のことである。 Fas リガンドによるアポトーシスの誘導は、 Fas リガンドが細胞表面の Fas抗原に結合し、 Fas抗原を介して、アポトーシスのシグナルが細胞に伝達されるためと考えられている。ここでいう Fas 抗原はいかなる動物種由来の Fas抗原であってもよい。例えば、ヒト Fas 抗原であれば、ィトウ等によりアミノ酸配列が決定されており、マウス Fas抗原であればワタナベ—フクナガ等によりアミノ酸配列が決定されており、ラット Fas 抗原であれば、キムラ等により、アミノ酸配列が決定されている（ィトウ N. ( I toh N. )等、 Cel l , 66 巻、 233-243頁、 1991年、ワタナベ—フクナガ R. (Watanabe- Fukunaga R. ) 等、 J. Immunol. . 148巻、 1274-1279 頁、 1992年、キムラ K. (Kimura Κ· )等、 Biochem. Biop ys. Res. Co議 un. . 198巻、 666-674頁、 1994年) 。

本発明第 1の態様の Fas リガンドのアポト一シス誘導活性を有する新規ポリぺプチドは、式 1ないし 12 (配列表の配列番号 1ないし 12) いずれかに記載のァミノ酸配列を含むことを特徴とする。

このうち、前記式 1ないし 4は、ヒト細胞より得られた Fas リガンドのァミノ酸配列であり、前記式 5ないし 8はラット細胞より得られた Fas リガンドのアミノ酸配列である。また、前記式 9ないし 12はマウス細胞より得られた Fas リガンドのァミノ酸配列である。

前記式 4、 8、 12のアミノ酸配列は、いずれも、細胞内領域、膜貫通領域、細胞外領域を含んでいることから、これらのポリペプチドは、生体内においては細胞表面ポリペプチドとして存在していると考えられる。従って、これらのァミノ酸配列を有するポリべプチドを得るためには、これらを発現している細胞や組織から精製する必要がある。ところで、このような細胞表面上に存在するポリぺプチドの細胞外領域は、細胞膜から切断、遊離され、それを生産する細胞の培養上清中や、尿や血液等の体液中に存在することが多い。一般に、ポリペプチドの精製は、細胞や組織から精製する場合と、培養上清や尿から精製する場合とでは、後者の方が効率的であり収量も多い。従って、 Fas リガンドにおいても、細胞外領域の方が、その生産性の面で、都合がよい。

本発明では、このような Fas リガンドの細胞外領域も本発明の Fas リガンドのアポトーシス誘導活性を有するポリべプチドとして提供する。細胞外領域が細胞膜から切断される部位は、それを生産する細胞の培養条件や細胞内外のプロテアーゼの影響により、多様性が生じることもある。しかしながら、本発明において提供される Fas リガンドの細胞外領域の好ましい例は、前記式 3、 7、 11のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。これらはそれぞれヒト、ラット、マウスの Fas リガンドの細胞外領域のァミノ酸配列に相当する。前記式 3の配列は、前記式 4のアミノ酸配列の N末端より数えて第 103番目から 281 番目に相当し、前記式 7の配列は前記式 8のアミノ酸配列の N末端から数えて第 100番目から 278番目に相当する。また、前記式 11の配列は前記式 12のアミノ酸配列の N末端から数えて第 101 番目から 279番目に相当する。

本発明の Fas リガンドのアポト一シス誘導活性を有するポリぺプチドは、好ましくは、 Fas リガンドの細胞外領域である。

ところで、周知のとおり、ポリペプチドを組み換え DNA技術を使用して製造する場合には、低分子量のポリペプチドの方が発現量が高く、より高い生産効率が期待できる。また、活性に必要な部分のみを有しているポリペプチドは、余分な配列を有しているポリべプチドに比べ、生体に対する抗原性が低いことが期待される。加えて、低分子量のポリペプチドであれば、他の活性を有するポリべプチドと融合させて新たな活性を付加させたり、抗体と結合させて特定の細胞にのみ作用させる等の修飾が容易である。本発明は、このように、生産性、抗原性等の点で有用性が期待できるより低分子のポリぺプチドとして、前記式 1、 5、 9のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。また、本発明は、前記式 2、 6、 10のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。前記式 1、 2、 5、 6、 9および 10は、ヒト、ラットおよびマウスの紬胞外領域部分のァミノ酸配列の一部を表すものである。

すなわち、前記式 1、 5、 9のアミノ酸配列は、ぞれぞれ、前記式 3、 7、 11 の了ミノ酸配列の N末端から 42ァミノ酸が欠損した配列である。また前記式 2、 6、 10のアミノ酸配列は、それぞれ、前記式 3、 7、 11のアミノ酸配列の N末端力、ら 41アミノ酸が欠損した配列である。実施例からも明らかなように、細胞外領域のァミノ酸配列である前記式 3の N末端から 42ァミノ酸、 41ァミノ酸を欠損したアミノ酸配列（それぞれ、前記式 1、式 2 ) のアミノ酸配列を有するポリぺプチドであってもアポトーシス誘導活性を有している。また、前記式 3の N末端から 40ァミノ酸、 38ァミノ酸、 34ァミノ酸を欠損したァミノ酸配列を有するポリぺプチドであっても、アポトーシスを誘導する活性を有している。

このことは、細胞外領域の N末端から 43番目以降のァミノ酸配列がアポトーシス誘導活性には必要であり、このアミノ酸配列、すなわち前記式 1、 5、 9いずれかに記載のァミノ酸配列をその一部に含有するポリぺプチドは、アポトーシス誘導活性を有していること、および欠損するァミノ酸の数によってアポトーシスを誘導する活性に差があることを示唆している。従って、本発明の新規ポリぺプヂドは、前記式 1、 5、 9のいずれかのアミノ酸配列を含有するものとして特徴づけられる。

本発明第 1の態様のポリべプチドの中で、ヒト由来の Fas リガンドの細胞外領域である前記式 3のァミノ酸配列の N末端から 1ないし 42いずれかの数のァミノ酸が欠如したアミノ酸配列を有するポリペプチドは、いずれも、他の動物種から得られた Fas リガンドに比べてヒトに対する抗原性が低く、形質転換体において適当なシグナルべプチドをつけて発現させれば、形質転換体の培養上清から回収でき、低分子化されているので優れた生産性が期待される。なかでも、前記式 3 の N末端から 40ァミノ酸を欠損したァミノ酸配列を有するポリべプチド、および前記式 3の N末端から 34ァミノ酸を欠損したアミノ酸配列を有するポリぺプチドは、活性の面からも好ましいポリペプチドである。

一般にポリペプチドは、種の違い、個体の違いによって、その基本的な機能が保持れたまま、アミノ酸配列に変異が生じる場合がある。ここでいうアミノ酸の変異とは、アミノ酸配列中の 1つ以上のアミノ酸が、欠失したり、他のアミノ酸に置換されたりすること、および、アミノ酸配列中の任意の位置に 1つ以上のァミノ酸が挿入もしくは付加されたりすることである。このような変異は、遺伝子工学的な技術を使用し、人工的に生じさせることも可能である。従って、ポリべプチド力、前記式 1ないし 12に記載のいずれかのァミノ酸配列に上記のような変異が生じたアミノ酸配列を含有するものであっても、それが、前記式 1ないし 12 のァミノ酸配列を有するポリべプチドと同様の性質を有する限り、本発明のポリぺプチドに含まれる。

一般に、同一の機能を有するポリペプチドに対する DNA は、動物種や個体が異なっていても互いに相同性があり、互いにハイブリダィズすることが多い。アミノ酸の多様性も、それらをコードする DNAが互いにハイブリダィズする範囲で生じることが多い。例えば実施例で示したハイブリダィゼ一シヨン法による DNA のクロ一ニングは、前記式 3または 11のアミノ酸配列をコードする DNAカ前記式 7のアミノ酸配列をコードする DNA とハイブリダィズすることを示している。そして、前記式 3のアミノ酸配列を有するポリべプチドは、ヒト Fas抗原に加え、少なくとも、マウス Fas抗原に結合する。前記式 7のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ラット Fas抗原に加え、少なくともマウス Fas抗原にも結合する。前記式 1 1のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、マウス Fas 抗原に加え少なくともヒト Fas抗原にも結合する。このように、互いにハイブリダィズする DNA によってコードされるァミノ酸配列を有するポリべプチドは、実質的に同一の機能を有すると考えられる。

従って、本発明の新規ポリペプチドは、前記式 1ないし 12、より好ましくは前記式 1、 5、 9のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列にハイプリダイズする塩基配列によってコードされるァミノ酸配列を含有するものとしても特徴づけることができる。本発明の新規ポリペプチドは、好ましくは、この特徴に加え、少なくともヒト Fas抗原、ラット Fas抗原、マウス Fas 抗原のいずれかに結合するものであり、さらに好ましくはアポトーシス誘導活性を有するものである。

つぎに、本発明第 2の態様の新規ポリべプチドについて説明する。本発明第 2の態様の新規ポリペプチドは、 Fas リガンドの一部およびそれらの融合体である。本発明の第 2の態様のポリペプチドは、好ましくは、前記式 4、 8、 12いずれかに記載のァミノ酸配列の一部からなるポリべプチドおよびそれらポリべプチドを 2種以上融合させてなる融合体である。

前記式 4、 8、 12レ、ずれかに記載のァミノ酸配列の一部からなるポリぺプチドとは、いかなる長さのポリペプチドであってもよい。しかながら、当該ポリぺプチドが、前記式 4、 8、 12に特徴的な配列を有するためには、当該ポリペプチドは、好ましくは、 5アミノ酸以上、さらに好ましくは 10アミノ酸以上のアミノ酸からなるポリぺプチドである。

本発明第 2の態様のポリペプチドは、 Fas抗原に結合する物であっても、しない物であってもよい。本発明第 2の態様のポリペプチドが、 Fas 抗原に結合し、かつアポトーシスを誘導しない場合には、生体内の Fas リガンドに拮抗する物質として、アポトーシスを人為的に抑制するために使用することができる。また、本発明第 2の態様のポリペプチドは、実施例に示すように、それが、 Fas抗原に結合するかしないかに関わらず、また、アポトーシスを誘導するかしないかに関わらず、本発明第 1の態様の新規ポリべプチドに対する抗体作成するための抗原として使用することができる。

前記式 4、 8 . 121、ずれかに記載のァミノ酸配列の一部からなるポリぺプチドを 2種以上融合させてなるポリペプチドとは、前記式 4、 8、 12に記載のァミノ酸配列の一部からなるポリぺプチドょり選ばれる、任意の 2つ以上のポリぺプチドが任意の順番で融合したポリペプチドである。例えば、前記式 4に記載のアミノ酸配列の一部からなるポリべプチド同士を融合させたもの、前記式 4の一部からなるポリぺプチドと前記式 8の一部からなるポリぺプチドを融合させたもの等が本発明に含まれる。このような融合ポリペプチドの例としては、前記式 3のァミノ酸配列の N末端から数えて 50番目のァミノ酸から 179番目までのァミノ酸までの配列に加えて、その N末端に、前記式 7のアミノ酸配列の 1番目のアミノ酸力、ら 49番目のァミノ酸までの配列、もしくは前記式 11のァミノ酸配列の 1番目のァミノ酸から 49番目のァミノ酸までの配列を有するポリべプチドが挙げられる。これらのポリペプチドは、それぞれ、ヒト由来 Fas リガンドとラット由来 Fas リガンドのキメラ型ポリべプチド、ヒト由来 Fas リガンドとマウス由来 Fas リガンドのキメラ型ポリペプチドであり、 Fas抗原を誘導する細胞に対してアポトーシスを誘導することが期待されるものである。

上述の融合ポリぺプチドは、組み換え DNA技術を使用して作製することができる。すなわち、それぞれのポリペプチドをコードする DNA をライゲーシヨンさせて、目的のキメラ型 Fas リガンドをコードする DNA を作製する。これを適当な発現ベクター組み込んで宿主細胞を形質転換させ、形質転換体もしくはその培養上製から目的のキメラ型 Fas リガンドを回収する。

通常、同一の機能を有する蛋白質をコードする DNA の塩基配列は、動物種や個体が違っても、互いにホモロジ一を有していることが多い。従って、「配列番号 13ないし 24 (式 13ないし 24) いずれかの塩基配列中の任意の一- 3以上の塩基に変異が生じた塩基配列」とは、前記式 13ないし 24より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも一部とホモロジ一のある配列、すなわち、前記式 13ないし 24より選択されるいずれかの塩基配列に相補的な配列の少なくとも一部とハイプリダイズする塩基配列を有する DNAであることが好ましい。ここで「ハイブリダィズする」とは、前記式 13ないし 24のいずれかの塩基配列に相補的な配列の一部をプロ —ブとして、公知の方法（例えば、サムブルック J. (Sambrook J: )等、 Molecul ar Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed.， 1989年、 Cold Spring Harborし a boratory, ニューヨーク（New York)、参照）でハイブリダイゼーシヨンを行つた場合にハイプリダイズすることをいう。

本発明の第 1および第 2の態様の新規ポリべプチドには、糖鎖を有するもの、有さないものいずれもが含まれる。

前記式 4および 8で示したアミノ酸配列には、それぞれ 4 ケ所の糖鎖付加可能部位（N—グリコシレーションサイト）がある。すなわち、前記式 4においては、了ミノ酸番号 76〜78、 184 〜186 、 250 〜252 、 260 -262力、前記式 8 においてはアミノ酸番号 116 〜118 、 130 〜132 、 247 -249 、 257 〜259 が糖鎖付加可能部位に相当する。また、前記式 12のアミノ酸配列には 5 ケ所の N—グリコシレーシヨンサイトがある（ァミノ酸番号 117 〜119 、 131 〜133 、 182 〜 184 、 248 〜250 および 258 〜260 ) 。

従って、当該ポリペプチド力動物細胞によって生産されたものであったり、遺伝子工学的に酵母や動物細胞等の真核細胞を宿主として生産させたものであったりした場合には、糖鎖が付加される可能性がある。一方、大腸菌等の原核細胞を宿主として遺伝子工学的にポリぺプチドを生産させた場合には、当該新規ポリぺプチドは糖鎖を持たない。

本発明第 1および第 2の態様のポリべプチドは、糖鎖の有無にかかわらず有用である。例えば、当該ポリペプチドは、糖鎖の有無にかかわらず、本発明第 9の態様の抗体を作成する際の抗原として使用したり、当該ポリべプチドに結合する物質のスクリーニングに使用することができる。

本発明第 1および第 2の態様の新規ポリぺプチドはいかなる方法で生産されたものであってもよい。例えば、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサィザー 430A型、パーキンエルマ一ジャパン（株）製）を使用して化学合成したものでも、ヒトおよびヒト以外のいかなる生物の組織や細胞、体液から精製されたものであってもよい。ヒトゃ動物の体液としては、血液や尿があげられる。細胞としては、本発明の新規ポリべプチドを産生する細胞を適宜選択して用いることができる。例えば、脾細胞や胸腺細胞、リンパ球系細胞、および、それらの株化細胞などを、ノーザンプロットあるいはウエスタンプロット等で解析し、本発明の新規ポリべプチドの発現量の高いものを選択する。

必要があれば、細胞を PMA (ホルボールミリステートアセテート）ゃィオノマイシン、 PHA (フィトヘムァグルチニン）、 ConA (コンカナバリン A) 、 IL- 2 ( インターロイキン- 2) 等の刺激剤から選ばれる、 1種もしくは 2種以上の適切な刺激剤で刺激して産生誘導する。そして、細胞もしくは培養上清から、当該ポリペプチドを精製する。精製は、濃縮や、各種クロマトグラフィー、塩析など一般的に行われているポリペプチドの精製方法を適宜組み合わせ、 Fas 抗原への結合性、もしくは、 Fas抗原を発現している細胞への細胞障害活性等を指標として行うことができる。精製方法の好ましい例は、第 8の態様で説明する。

しかしながら、当該新規ポリペプチドは、その純度の面から、遺伝子工学的に生産されたもの、すなわち、組換え型ポリペプチドであることが好ましい。当該ポリべプチドを遺伝子工学的に生産するには、後述する本発明第 3の態様の新規 DNA、もしくは第 4の態様の組換え DNA分子を用いて、適当な宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して培養混合物を回収し、当該ポリペプチドを精製する。また、該 DNAや組換え DNA分子を利用して無細胞系の合成方法（サムブルツク J. (Sambrook, J. )et al.： Molecular Cloning 2nd ed. ( 1989年） ) で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の 1つである。

遺伝子工学的に本発明の新規ポリべプチドを製造する好ましい方法については本発明第 7の態様で説明している。

近年の技術により、ポリペプチドをポリエチレングリコールや、スチレン—マレイン酸コポリマー、デキストラン、ピランコポリマー、ポリリジン等の高分子に結合させたり、多糖類やポリペプチドなどの天然高分子、ホルモンなどの生理活性物質、マグネタイトなどの無機物質に結合させたりすることが可能になった (例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84巻， 1487 - 1491 頁 (1981年) 、 Bioc hemistry 28巻， 6619-6624頁（1989年））。

ポリぺプチドにポリエチレングリコ一ルを結合させる方法の一例を簡単に説明する。まず、ポリペプチドをそれが活性を失わないような範囲の塩基性 p Hを有する緩衝液に溶解する。その溶液に、メトキシポリエチレングリコールスクシンィミジルサクシネートのような活性化ポリエチレングリコールを混合し、室温で一定時間反応させる。その後、ゲルろ過等によって、活性を有するフラクションを分取する。本発明第 1および第 2の態様の新規ポリべプチドも公知方法の組み合わせにより、このような修飾が可能である。従って、本発明第 1および第 2の態様の新規ポリべプチドには、上述のような修飾を受けたものも包含される。一般に、ポリペプチドは生体や、培養液中で、共有結合によりもしくは共有結合によらずに複数の分子が結合した多量体を形成することがある。多量体の形成は、同じ分子同士が結合して多量体を形成することもあるし、ことなる分子同士が結合して多量体を形成することもある。例えば、 TNF は 3量体を形成することが知られている。また、ァクチビンは 2量体を形成することが知られている。本発明の第 1および第 2の態様のポリべプチは、単量体であってもよいし、多量体を形成していても良い。例えば、本発明のポリペプチドは、前記式 1ないし 12いずれかのァミノ酸配列を有するポリべプチドが互いに結合して、 3量体を形成していてもよい。

本発明第 1および第 2の態様の新規ポリべプチドは、生体内で生じるアポトーシスを調節するために使用することができる。

例えば、 Fas抗原に結合し、アポトーシスを誘導する、前記式 1ないし 12のいずれかのァミノ酸配列を有するポリべプチドに代表される本発明の新規ポリぺプチドは、薬剤耐性となった癌を治療するために使用することができる。また、これらは、 HIV ウィルスが感染した細胞に対し、アポトーシスを人為的に誘導し、 AIDSの感染初期の治療薬となり、新しい治療方法を医療の分野に提供する事がでさる。

—方、本発明第 2の態様の新規ポリペプチドのうち、 Fas抗原に結合するがァポト一シスを誘導しないポリべプチドは、肝炎等の重篤な感染症となった時に感染細胞がアポトーシスを起こすのを防ぎ、肝臓等の主要組織の細胞の急激な減少を防止することによって、組織機能の低下を予防することができる。

本発明の新規ポリべプチドを医薬品として使用する場合には、ポリべプチドを有効成分として含む通常の医薬組成物の製造方法に準じて、注射剤、錠剤、カブセル剤、座剤、噴霧剤、クリーム剤、パップ剤、点眼剤等、適当な剤型の医薬組成物を製造する。例えば、注射剤であれば当該新規ポリペプチドを含む溶液を無菌状態で調製し、必要があれば、安定化剤等の補助成分を加えてアンプルに充填し、凍結乾燥することにより、当該新規ポリペプチドを有効成分とする医薬組成物を製造することができる。このようにして得られた医薬組成物は、使用時に、注射用蒸留水等に溶解して静脈内や局所へ投与することができる。医薬組成物の有効成分としては、本発明の新規ポリペプチドの中でもヒトに対する抗原性が最も低い、前記式 1ないし 4のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、特に前記式 1ないし 4のアミノ酸配列を有するポリペプチド、もしくは、それらの一部を有するポリぺプチドを使用することが好ましい。

本発明のポリペプチドは、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、ァポトーシスを調節し、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。

本発明第 1および第 2の態様の新規ポリペプチドは、また、抗体を得るための材料として使用することもできる。すなわち、本発明の新規ポリペプチドをゥサギなどの動物に投与して、本発明のポリペプチドに対する抗体を作成する。抗体の作製法については、第 9の態様で説明する。得られた抗体は、組織や細胞の染色に使用したり、当該新規ポリぺプチドを精製するためァフィニティーカラムの作製に使用することができる。

次に本発明の第 3の態様の新規 DNA を説明する。本明細書の説明において「式 Y (もしくは配列番号 Y) の塩基配列を含有する DNA 」とは、 DNA力、式 Y (もしくは配列番号 Y) で表されるものであっても、式 Y (もしくは配列番号 Y) に記載された塩基配列の 5'末端、 3'末端のいずれか一方、もしくは両方に任意の 1つ以上の塩基が付加した配列で表されるものであってもよいことを意味する。ここで、付加される塩基は、コーディングフレームにずれを生じさせない限りいかなるものであってもよく、例えば、リンカー配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他の蛋白質をコードする塩基配列、もしくは DNA プローブ等を作製する際にその検出感度の増加を目的として付加される配列等が例として挙げられる。また、「式 Y (もしくは配列番号 Y) の塩基配列を有する DNA 」とは、その DNAが実質的に、式 Y (もしくは配列番号 Y) に記載の塩基配列で表されるものであることを意味する。

本発明第 3の態様の新規 DNA は、 Fas リガンドに対する DNA およびその一部を含有する。

すなわち、本発明第 3の態様の新規 DNA は、本発明第 1および第 2の態様の新規ポリペプチドをコードする塩基配列を含有する。本発明の新規 DNA は、好ましくは、前記式 1ないし 12 (配列表の配列番号 1ないし 12) のいずれかのアミノ酸配列もしくはその一部分をコードする塩基配列を含有する。

一般に、アミノ酸をコードする DNAのトリプレットは、アミノ酸の種類ごとに 1〜 6種類迄存在することが知られているので、前記配列番号 1ないし 12いずれかに記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列は 1種類には限定されない。したがって、本発明の DNA は、それが前記 1ないし 12のいずれかに記載のアミノ酸配列もしくはその一部をコードする限り、いかなる配列からなる DNAであってもよしかしながら、好ましくは、本発明の新規 DNA は、前記式 13ないし 24のいずれかに記載の塩基配列もしくは前記式 13なレ、し 24 (配列表の配列番号 13ないし 24) のいずれかに記載の塩基配列の一部を含有する DNAである。前記式 16、 20、 24に記載の塩基配列はそれぞれヒト、ラット、マウス由来の Fas リガンドのァミノ酸配列である前記式 4、 8、 12に記載のアミノ酸配列をコードするものである。前記式 15、 19、 23に記載の塩基配列は、それぞれ、前記式 4、 8、 12に記載された Fas リガンドの細胞外領域部分である前記式 3、 7、 11に記載のアミノ酸配列をコードするものである。前記式 13、 14、 17、 18、 21、 22に記載の塩基配列はそれぞれ、上記ヒト、ラットまたはマウス Fas リガンドの細胞外領域のより短い領域である前記式 1、 2、 5、 6、 9、 10のアミノ酸配列をコードするものである。

本発明の DNA は、それが本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドをコードする塩基配列を含有する限り、 cDNAであっても染色体 DNAであってもよい。しかしながら、ベクタ ^の導入の容易さ等、遺伝子工学的手法における扱い易さから、本発明の新規 DNA は cDNAであることが好ましい。染色体 DNA の一例としては、前記式 13ないし 16の塩基配列を含有する染色体 DNA の塩基配列を図 16 〜18に示してある。

本発明の DNA は、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを、組み換え DNA技術を使用して製造するために有用である。すなわち、本発明の DNA を、プロモーター配列等の発現に必要な配列を有する適当な発現ベクターの適当な位置に挿入し、このベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、形質転換体に本発明第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドを発現させることができる。例えば、実施例にも示したように、前記式 16、 20、 24の塩基配列を含有する組換え DNA分子で形質転換させた形質転換体の培養上清中には、アポトーシスを誘導する活性を有するポリペプチド、すなわち Fas リガンドが遊離される場合がある。 Fas リガンドはこのような形質転換体もしくはその培養上清から、回収することができる。

特に、前記式 13、 14、 15、 17、 18、 19、 21、 22、 23のいずれかに記載の塩基配列を有する DNA は、アポトーシスを誘導する活性を有するより低分子のポリぺプチドを生産するために適している。これらの塩基配列は、ヒト、ラットおよびマウスの Fas リガンドの細胞外領域部分またはその一部のァミノ酸配列をコードする塩基配列を表すものである前記式 1、 2、 3、 5、 6、 7、 9、 10、 1 1のアミノ酸配列をコードしているので、適当なシグナルべプチドをコ一ドする塩基配列の下流に、これらのいずれかの塩基配列を有する DNA を接続して発現させると、その培養上清中に前記ポリべプチドが分泌されるからである。

既に説明したように、ポリペプチドの精製においては、細胞のライセートから精製するよりも、培養上清から精製する方が効率的である。前記式 13、 14、 15. 17、 18、 19、 21、 22、 23のいずれかに記載の塩基配列を有する DNA は、上記利点に加え、低分子であるために、遺伝子工学的手法において扱いやすいという点でも利用価値が高い。

先述したように、同一の機能を有するポリペプチドであっても、種差や個体差によってアミノ酸配列や、それをコードする DNA の塩基配列に多様性が生じる事がある。通常、同一の機能を有するポリペプチドをコードする DNA の塩基配列は、動物種や個体が違っても、互いにホモロジ一を有していることが多い。従って、前記式 13ないし 24レ、ずれかに記載の塩基配列中の少なくとも一部とホモロジ一のある塩基配列、すなわち、前記式 13ないし 24のいずれかのに記載の塩基配列に相補的な配列の少なくとも一部とハイブリダィズする DNA は、本発明の DNAがコードするポリべプチドと同一の機能を有するポリべプチドをコ一ドしていると考えられる。ここで「ハイブリダィズする」とは、前記式 13ないし 24のいずれかに記載の塩基配列に相補的な配列、もしくはその一部をプローブとして、公知の方法（例えば、サムブルック J. (Sambrook J. )等、 Mol ecu lar C l oni ng, a Laboratory Manual 2nd ed. , 1989 年、 Cold Spri ng Harbor Laboratory, ニューヨーク（New York), 参照）でハイブリダイゼーシヨンを行つた場合にハイブリダィズすることをいう。実施例でも、前記式 19の塩基配列に相補的な塩基配列の一部をプロ一ブとして、ハイブリダイゼーシヨンを行う方法を示してあこのように、前記式 13ないし 24のレ、ずれかに記載の塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダィズする DNA も本発明第 3の態様の DNA に含まれる。特に、前記式 13、 17、 21の塩基配列に相補的な塩基配列とハイブリダィズする DNA であって、 Fas リガンドをコードする DNA は、本発明第 3の態様の好ましい例の 1 つである。

本発明第 3の態様の DNA は、配列表の配列番号 27、 25、 28のいずれかに記載の塩基配列の一部分の塩基配列を有する DNAであってもよい。実施例に示すように配列表の配列番号 27、 25、 28の塩基配列はそれぞれ、 Fas リガンドをコードする塩基配列を含有する DNA として、それぞれヒト、ラット、マウス由来の cDNAライブラリーより得られた cDNAの塩基配列である。配列番号 27、 25、 28に記載の塩基配列は、その配列中に、それぞれ、前記式 16、 20、 24に記載の配列を含有す前記配列表の配列番号 27、 25、 28のいずれかに記載の塩基配列の一部分とは、いかなる一部分でもよい。例えば、前記式 16、 20、 24の一部分であってもよいし、 5'末端側、 3'末端側のノンコーディング領域の一部分であってもよい。また、その長さは特に限定されない。

当該 DNA は、アポトーシスを誘導するポリペプチドをコードする DNA をクローニングするためのプローブや、 PCR 用のプライマーとして使用することがでさる。

また、当該 DNAを、ホースラディッシュペルォキシダーゼ（HRP0) 等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識し、組織や細胞における本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを検出したり、その発現量を測定する診断用 DNA プローブとしても使用することができる。

本発明の第 3の態様の新規 DNA は、レ、かなる方法で得られた DNAであってもよい。すなわち、前記式 13ないし 24 (配列表の配列番号 13ないし 24) 、もしくは配列表の配列番号 25、 27および 28を参考にして化学合成されたものであってもよく、適当な DNA ライブラリ一からクローニングされたものであってもよい。本発明の新規 DNA を化学合成するには、たとえば、次のように行えばよい。すなわち、まず、前記式 13ないし 24、もしくは配列表の配列番号 25、 27および 28を参考にして、所望の塩基配列を有する DNA を約 20塩基程度からなる断片に分けて DNA化学合成機（例えば、 394型、パーキンエルマ一ジャパン（株）製）を用いて合成し、その後、必要に応じて 5'末端のリン酸化を行い、各断片をァニーリングし、ライゲ一シヨンして目的とする DNA を得る。

本発明の新規 DNA を DNA ライブラリ一から得る例としては、適当なゲノム DNA ライブラリ一や cDNAラィブラリーを、ハイブリダイゼーシヨンによるスクリ一二ング法や、抗体を用いたィムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的の DNAを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。

ハイブリダィゼーシヨン法によるスクリーニングは、前記式 13ないし 24、もしくは配列表の配列番号 25、 27および 28のいずれかの塩基配列もしくはその一部を有する DNA を^{3 2} P等でラベルしてプローブとし、任意の cDNAライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、マニアテイス T. (Maniat is T. )等， Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, ニューョーク（New York), 1982年）行うことができる。

ィムノスクリ一二ング法で用いる抗体は、後述する本発明第 9の態様の抗体を使用することができる。

本発明の新規 DNA はまた、ゲノム DNA ライブラリーもしくは cDNAライブラリ一を铸型とする PCR (Polymerase Chain Reaction)によっても得る事ができる。

PCR は、前記式 13ないし 24、もしくは配列表の配列番号 25、 27および 28いずれかの配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作成し、任意の DNA ライブラリーに対し、公知の方法（例えば、ミカエル I. (Michael A.

I. )等， PCR Protocols' a Guide to Methods and Appl ications, ァカデミック出版 (Academic Press). 1990年参照）等を行って、本発明の新規 DNA を得る事もできる。

上記各種方法で使用する DNA ライブラリ一は、本発明の DNA を有する DNA ライブラリーを選択して使用する。当該 DNA ライブラリ一は、本発明の DNA を有するライブラリ一であれば、いかなるものも使用可能であり、市販の DNA ライブラリーを使用したり、本発明の DNA を有する細胞から cDNAライブラリーを作成するのに適した細胞を選び公知の方法（サムブルック J. (Sambrook J. ) 等、 olecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed. , Cold Spring Harbor L aboratory, ニューヨーク（New York), 1989年参照）に従って、 cDNAライブラリーを作製し、利用することができる。

DNA の塩基配列が提供されれば、 RNA の配列や、相補的な DNA および RNA の配列が一義的に決定されるので、本発明の開示により、本発明の第 3の態様の DNA に対応する RNAや、本発明の第 3の態様の DNA と相補的な配列を有する DNA および RNA もまた提供される。

本発明の第 3の態様の DNA は、 1本鎖であっても、それに相補的な配列を有する DNAや RNA と結合して 2重鎖、 3重鎖を形成していても良い。

また、当該 DNA は、ホースラディッシュペルォキシダ一ゼ（HRP0) 等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。

本発明の新規 DNA は、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを大量に生産するために使用することができる。当該 DNA を使用して本発明の新規ポリペプチドを生産させる方法の例は、本発明第 7の態様で説明する。当該 DNA はまた、上述のように酵素等で標識して、組織における本発明第 1および第 2の態様の新規ポリべプチドの発現状況を検査するために使用することができる。すなわち、当該 DNA をプローブとして使用して細胞における本発明の第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドの発現量を、 mRNA発現量を指標として確認することにより、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドの製造に適した細胞や細胞の培養条件を決定することができるほか、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドが関連する疾患の診断を行うことも可能である。

また、本発明の新規 DNA を生体内の細胞に導入し、例えば、自己免疫疾患等の遺伝的にアポト一シスの機構が欠損している疾患の遺伝子治療にも使用する事ができる。

さらに、本発明の DNA が有する塩基配列をもとにアンチセンス医薬品を開発し、生体内における Fas リガンド発現を調節することもできる。すなわち、前記式 13ないし 24、もしくは配列表の配列番号 25、 27および 28に記載の塩基配列を有する本発明の DNAの一部や、その誘導体を公知の方法で合成し、それらを使用して Fas リガンドの発現を調節したり、本発明の DNA に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドやその誘導体を使用して、 Fas リガンドの発現を調節することが可能である。アンチセンス医薬品の技術については、本発明の第 10の態様の説明で詳述する。

次に、本発明の第 4の態様の組換え DNA分子について説明する。

本発明の第 4の態様の組換え DNA分子は、上述した本発明の第 3の態様の新規 DNAを含むことを特徴とする組換え DNA分子である。本発明の組み換え DNA分子は、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。また、本発明の組換え DNA分子は、いかなる用途に使用されるものであってもよい。例えば、本発明の第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドを産生させる際に用いるものであつてもよいし、本発明の第 3の態様の DNA を増幅させ大量に得るために用いるものでめつこもよレ、o

本発明の第 4の態様の組換え DNA分子は、本発明の第 3の態様の新規 DNA に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、ェンハンサ一の配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリ A付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。これらの塩基配列の必要性は、組換え DNA分子の使用目的によって決定されるが、本発明の組換え DNA分子は、本発明第 3の態様の DNA に加えて、少なくとも、複製開始点およびマーカー遺伝子を有していることが好ましい。マーカ一遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子等があげられる。

当該組換え DNA分子の好ましい例は、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを発現するように大腸菌を形質転換させうるものである。すなわち、当該組換え DNA分子の好適な例は、本発明第 3の態様の DNA に加え少なくとも、大腸菌複製開始点、マーカー遺伝子に加えて大腸菌内で機能するプロモー夕一配列を有していることが好ましい。また、これらに加え、少なくともシグナルべプチドをコ一ドする配列を有していることが好ましい。大腸菌で機能するプ口モーター配列の好適な例は trp プロモーター、 lac プロモーターであり、大腸菌で機能しうるシグナルべプチドの好適な例は、大腸菌アル力リフォスファタ一ゼのシグナルぺブチドである。

また、当該組換え DNA分子は、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリべプチドを発現するように酵母や昆虫細胞、動物細胞等の真核細胞を形質転換させうるものであってもよい。

すなわち、当該組換え DNA分子は、少なくとも、本発明第 3の態様の DNA、マ —カー遺伝子に加えて、ポリ A付加配列を有していることが好ましい。これらに加えて、少なくとも、酵母で機能するアルコールォキシダーゼ（A0X ) 1のプロモーター、もしくは昆虫細胞で機能するポリヘドリンプロモーター、もしくは動物細胞で機能する SV40のプロモーターや SRひのプロモーター、ヒトエロンゲ一シヨンファクター 1 ひ（ FE1ひ）のプロモーター、もしくは大腸菌での複製開始点を有するものも当該組換え DNA分子の好適な例として挙げられる。

本発明の第 4の態様の組換え DNA分子は、本発明の第 3の態様の新規 DNA を任意のベクターに導入して得ることができる。必要であれば、当該新規 DNA を他の塩基配列とともに任意のベクタ一に導入してもよい。また、当該組換え DNA分子は、本発明第 3の態様の新規 DNA を任意の配列を有する DNA断片とライゲーションさせることにより得ることができる。 DNA をベクターに導入する方法は公知である (サムフ、'ノレック J. (Sambrook J. )等、 Molecular Cloning, a Laboratory M anual 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク (New York), 19 89年、参照）。すなわち、 DNA とベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片を DNA リガーゼを用いてライゲ一シヨンさせればよい。ベクターは、プラスミドベクタ一、ファージベクタ一、ウィルスベクタ一等いかなるものでもよい。たとえば、 pUC118、 pBR322、 pSV2-dhfr、 pBluescript l I 、 PHIL-SI 、 A ZapI I 、 A gtlO. pAc700、 YRP17、 pEF-BOS、 pEFN-I I 等から適宜選択して使用することができる。

次に、本発明の第 5の態様の形質転換体について説明する。

本発明の第 5の態様の形質転換体は、本発明の第 3の態様の新規 DNAで形質転換されたことを特徴とする。すなわち、本発明第 5の態様の形質転換体は、宿主となる適当な細胞や微生物に、本発明第 3の態様の新規 DNAを直接導入する事によつて形質転換されたことを特徴とする。

本発明の第 3の態様の新規 DNA を宿主細胞に導入する方法としては、エレクト口ポレーシヨン法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、 DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウィルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック 1991年 3月 20曰発行、羊土社、参照）があるがいずれの方法を用いても構わない。

本発明の形質転換体は、本発明の第 3の態様の DNA分子を大量に製造する目的でも使用することができる。また、本発明の第 3の態様の DNA 、宿主細胞の適当なプロモーターの下流に組み込まれた場合には、当該形質転換体は、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを生産する。従って、このような形質転換体は、本発明の第 1または第 2の態様のポリペプチドを製造する目的等に使用できる。

次に、本発明の第 6の態様の形質転換体について説明する。

本発明第 6の態様の形質転換体は、本発明の第 4の態様の組換え DNA分子を宿主となる細胞や微生物に導入する事によって、形質転換されたことを特徴とする。ただし、該組換え DNA分子の作成に使用するベクターは、宿主細胞に適した種類のものである必要がある。同様に、組換え DNA分子内に含まれるプロモー夕一、シグナルペプチドをコードする塩基配列、マーカー遺伝子等は、宿主細胞に適したものである必要がある。例えば、組換え DNA分子の作製に使用したべク夕一と宿主の好ましい組み合わせの例としては、 PUC118と大腸菌、 pEF-BOS と COS細胞あるいは CH0細胞、 Yac と酵母、 AcNPV と Sf細胞等（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック 1991年 3月 20日発行、羊土社、参照）が挙げられる。

本発明の第 4の態様の組換え DNA分子を宿主細胞に導入する方法としては、上記第 5の態様の形質転換体の作成方法と同様に、エレクトロボレ一シヨン法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、 DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウィルス粒子を用いてインフエクシヨンさせる方法、その他の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック 1991年 3月 20日発行、羊土社、参照）が挙げられる。

本発明第 6の態様の形質転換体は、原核細胞、真核細胞のレ、ずれであつてもよレ、。原核細胞の代表的な例としては、大腸菌と枯草菌があげられる。真核細胞の代表的な例としては CH0細胞、 HeLa細胞、 COS細胞、 Namalwa細胞等の哺乳動物細胞の他、 Sf細胞等の昆虫細胞や酵母等があげられる。

しかしながら、本発明の形質転換体は、好ましくは、大腸菌もしくは哺乳動物細胞もしくは酵母を形質転換させたものである。動物細胞の中では、遺伝子のコピー数を増加させることが可能な、 CH0細胞の dhfr欠損株が好ましい。また、酵母については、外来蛋白質の分泌発現量が多いという点で、ピキア（Pichia)属の酵母が好ましい。本発明第 6の態様の形質転換体は、本発明第 3の態様の新規 DNA を大量に得る目的や、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを生産するために使用することができる。

当該形質転換体は、いかなる目的で使用されるものであってもよいが、好ましくは、当該形質転換体は、本発明の新規ポリペプチドを産生するものがよく、より好ましくは、本発明の新規ポリぺプチドを培地中に分泌するものがよい。

本発明の第 1または第 2の態様の新規ポリべプチドを產生する形質転換体を得るためには、宿主細胞に導入する本発明の第 4の態様の組換え DNA分子中には、少なくとも、その宿主細胞で機能しうるプロモーター配列が含まれていることが必要である。そして、宿主細胞が大腸菌等の原核細胞である場合には、組換え DN A分子にはプロモーター配列に加え、複製開始点が含まれている必要がある。また、宿主細胞が動物細胞等の真核細胞である場合には、組換え DNA分子中には、プロモーター配列に加え、ポリ A付加サイト、複製開始点が含まれていることが必要である。なお、いずれの場合にも使用する組換え DNA分子には上述したマ一力一遺伝子が含まれていることが好ましレ、。

また、当該形質転換体が本発明の第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドを発現し分泌するためには、形質転換に使用する組換え DNA分子中には、上記の産生に必要な配列に加えて、本発明の第 3の態様の DNA の 5'末端に、シグナルぺプチドをコ一ドする塩基配列を有していることが好ましい。

本発明の形質転換体のより好ましい例の一つは、少なくとも、複製開始点、大腸菌で機能するプロモーター、マーカー遺伝子、大腸菌アルカリフォスファタ一ゼ等のシグナルべプチドをコ一ドする塩基配列、及び本発明第 3の態様の新規 DNA を含む組換え DNA 分子で形質転換された大腸菌である。他の好ましい例は、少なくとも、マーカー遺伝子、ポリ A付加配列、哺乳動物細胞で機能するプロモータ—、および本発明第 3の態様の DNA を含む組換え DNA分子で形質転換された哺乳動物細胞である。また、少なくとも、 A0X1のプロモーター、マーカー遺伝子、及び本発明の第 3の態様の DNA を含む組換え DNA分子で形質転換されたピキア (Pichia)属の酵母も本発明の形質転換体の好ましい例である。

本発明第 7の態様の製造方法は、本発明第 5または第 6の態様の形質転換体を使用することを特徴とする本発明第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドの製造方法である。形質転換体の作製方法にっレ、ては既に説明した通りである。当該製造方法では、まず、本発明第 5または第 6の態様の形質転換体を培養し、必要に応じて、遺伝子の増幅や発現誘導を行う。次に、培養混合物を回収し、それらを材料として、必要に応じて濃縮、可溶化、透析、各種クロマトグラフィ一等の操作を行い、本発明の第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドを精製する。

当該製造方法で使用する形質転換体は、いかなる宿主を形質転換したものであってもよい。しかしながら、好ましくは、 CH0細胞等の哺乳動物細胞もしくは酵母、もしくは大腸菌のいずれかより選択される細胞を宿主とした形質転換体であることが好ましい。

形質転換体の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換体の培養については各種の成書（たとえば、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、 1992年、参照）があるので、それらを参考にして行うことができる。また、遺伝子の増幅や発現誘導の方法および必要性は、宿主となる細胞の種類や、使用するプロモーターによって異なる。例えば、プロモーターが trp プロモータ一である時には 3 S—インドールアクリル酸で、 MMTVプロモーターである場合にはデキサメサゾンで、 A0X1プロモーターであればメタノールで誘導することが可能である。

一方、遺伝子の増幅方法の例としては、宿主として dhfr欠損の CH0細胞、べクターとして dhfrを有するベクタ一を使用した際のメソトレキセ一トを使用した遺伝子の増幅方法がある。

以下に、形質転換体として大腸菌、 CH0細胞、ピキア（Pichia) 属酵母を使用した場合の培養および発現誘導の例を示す。

trp プロモーターを有する組換え DNA分子で形質転換された大腸菌では、 L一ブロース（L- Broth ) で菌体を前培養し、それを M9-CA の培地に対して 1 50量となるように植え込み、 37°Cで培養を行う。培養開始数時間後に培地の 0D_{5 5}。値力く1〜4 (すなわち対数増殖期）に達した時点で 3 /8—インドールアクリル酸を終濃度 10 g / lとなるように添加し発現誘導を行う。さらに約 1〜 2日の培養を行うことにより、目的ポリぺプチドを含む培養混合物を得ることができる。

A0X1プロモーターを有する組換え DNA分子で形質転換されたピキア (Pi chia)属の酵母を用いる場合には、 BMGY培地で約 2日間前培養し、培地交換後、メタノールを加えて発現誘導する。さらに、 30°Cで約 2日間の培養を行い、目的ポリぺプチドを含む培養混合物を得ることができる。

—方、ェロンゲ一シヨンファクターのプロモーターを有する発現プラスミドが導入された CH0細胞等の哺乳動物細胞の形質転換体では、 10%ゥシ胎児血清を含有する D- MEM (Dulbecco modi f ied eagle' s medi um) で培養する。細胞は、約 5 X 10⁴ 細胞 Zmlの濃度で植え込み、 37 C、 5 %炭酸ガス Z95%空気の条件で培養を行う。通常、 2〜3日後にコンフルェントな状態になるので、その時点で培地を、血清不含の D-MEM に交換する。さらに引き続き、 2〜3日間の培養を行うことにより目的ポリペプチドを含む培養混合物を得ることができる。なお、目的ポリベプチドの産生量が少ない場合には前述したように dhfr遺伝子欠損 CH0細胞を使用し、メソトレキセ一トにより遺伝子を増幅し、産生量を増加させることも可能である。

本発明第 7の態様において、培養混合物とは、培養上清もしくは細胞のことである。すなわち、形質転換体が、当該ポリペプチドを細胞外に分泌する場合にはその培養上清を材料として、本発明の第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを回収、精製する。

一方、当該新規蛋白質が宿主細胞内に蓄積される場合には、リゾチーム、界面活性剤、凍結融解、加圧等の手段を用いて細胞を破砕した後、遠心分離して上清を回収し、濾過等により不要な細胞断片等を取り除いた後に、それを材料として本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを精製する。使用する形質転換体が大腸菌であり、産生された当該新規ポリぺプチドがぺリブラズ厶に蓄積される場合は、ウィルスキー（Wi l lsky) 等の方法 (J. Bacteriol. . 127巻、 595-609 頁、 1976年）等が使用できる。

培養混合物から本発明第 1または第 2の態様の新規ポリべプチドを精製する方法としては、ポリべプチドの精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ一や抗体クロマトグラフィ一等の各種ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィ一等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要により HPLCシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。精製方法の好適な例を、本発明第 8の態様として提供する。

当該製造方法において、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドは、他のポリぺプチドとの融合ポリぺプチドとして形質転換体に生産させてもよし、。たとえば、大腸菌のS—ガラクトシダーゼをコードする DNA の下流に目的のポリペプチドをコードする DNA を接続し、目的のポリペプチドをーガラクトシダーゼとの融合ポリべプチドとして発現させる方法は、高い生産量が期待できることから一般に行われている方法である。

当該ポリべプチドを他のポリべプチドとの融合ポリべプチドとして発現させた場合には、精製工程のいずれかのステップにおいて、融合ポリペプチドをブロムシァン等の化学物質やプロテアーゼ等の酵素で処理して当該ポリぺプチドを切り出す操作が必要になる。

また、使用する形質転換体が大腸菌であった場合に、当該ポリペプチドを不溶化蛋白であるインクルージョンボディーとして産生させた場合には、精製の際に、インクルージョンボディ一を可溶化し、デネイチヤーし、リフォールディングするという操作を精製の適当なステップで行えばよい（トマス E. 及びクラィトン J. (Thomas E. and Creighton J. ), Molecular Bi ology, 87巻， 563-577 頁， 1974年等参照）。

具体的には、まず、菌体を破砕し、遠心分離してペレツトを回収する。次に、尿素もしくはグァニジン塩酸、界面活性剤、還元型グル夕チオン、酸化型グル夕チオンを適量含む可溶化バッファー（たとえば、 5Mグァニジン塩酸、 0. 005 % Tween80、 50m トリス塩酸 (pH8. 0)、 5mM EDTA、 2mM還元型グル夕チオン、 0. 02 mM酸化型グルタチオンを含む緩衝液）をペレットに加え、 2—メルカプトェ夕ノールを加えてデネイチヤーし、上記可溶化バッファーからグァニジン塩酸を取り除いた溶液に対して透析してリフォールディングする。目的のポリペプチドを融合蛋白質として発現させている場合には、これらの操作の後で、ブロムシァン等の化学物質もしくはプロテアーゼ等の酵素で不要な部分を切断し、その後、適当なクロマトグラフィ一を行う。

次に、本発明の第 8の態様の精製方法を説明する。

本発明の第 8の態様は、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを含有する試料中から本発明第 1または第 2の態様の新規ポリべプチドを精製する方法であって、少なくとも下記より選ばれるいずれか 1つ以上の工程を行う事を特徴とする。

( 1 ) Fas抗原を使用したァフィ二ティークロマトグラフィー

( 2 ) 本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを認識する抗体を使用したァフィ二ティーク口マトグラフィー

当該精製方法は、上記（1 ) もしくは（2 ) のいずれかのみを行うものであつてもよく、（1 ) および（2 ) の両方を行うものであってもよい。また、他の精製方法と上記（ 1 ) もしくは（2 ) の少なくとも 1つを組合わせて行うものであってもよい。しかしながら、好ましくは、蛋白質の精製方法として通常行われている方法の前もしくは後に、上記（1 ) もしくは（2 ) のいずれか一方、もしくは両方の工程を任意の順序で行うものである。

例えば、上記 ( 1 ) もしくは（2 ) の工程のいずれかに加え、レクチンを吸着させた担体を使用したクロマトグラフィーを行うことにより、本発明第 1または第 2の態様のポリぺプチドを高純度で得ることができる。

本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドを含有する試料とは、当該新規蛋白質を含有するものであれば、いかなるものであってもよい。例えば、細胞の培養上清であっても、細胞のライセートであってもよく、尿や血液等の体液でつ乙 cfcレ、o

上記（1 ) のァフィ二ティ一クロマトグラフィーを行うためには、 Fas 抗原蛋白質を適当な担体に吸着させる事が必要である。使用する Fas抗原は本発明第 1 または第 2の態様のポリべプチドと結合するものであればいかなる動物由来の物であってもよい。しかしながら、精製しょうとする目的のポリペプチド力前記式 1ないし 4のレ、ずれかのァミノ酸配列またはそれらの一部を有する場合にはヒト Fas抗原を、前記式 5ないし 8のいずれかのアミノ酸配列またはそれらの一部を有するものである場合にはラット Fas抗原もしくはマウス Fas 抗原を、前記式 9ないし 12のいずれかのアミノ酸配列またはそれらの一部を有するものである場合にはマウス Fas抗原を、それぞれ使用する事が好ましい。

Fas 抗原を吸着させる担体の種類は特に限定されない。 Fas抗原を担体に結合させる場合には、 Fas抗原を直接担体に結合させるか、スぺーサ一を介して結合させる。また、 Fas 抗原を他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして作製し、融合ポリペプチド中の Fas 抗原以外の部分をそれと結合可能な担体に結合させ、間接的に、 Fas 抗原を担体に結合させてもよい。例えば、 Fas抗原と免疫グロブリンの定常領域との融合ポリぺプチドであれば、免疫グロブリンとプロティン Aが吸着する性質を利用して、プロティン Aが吸着したカラムに該融合ポリペプチドを吸着させ、結果として Fas 抗原吸着担体を容易に得る事が可能になる。

また、上記（2 ) のァフィ二ティークロマトグラフィーを行うためには、本発明第 9の態様の新規抗体を使用することができる。すなわち当該新規抗体をァガロース等の適当な担体に直接、もしくはスぺーサ一を介して結合させ、これを、ァフィ二ティ一クロマトグラフィー用カラムとして使用する。なお、上述したレクチンを吸着させた担体の好ましいものとしては、 ConAを吸着させた担体があげられる。例えば、 ConAをァガロース担体に吸着させたものなどが市販されているのでそれらを適宜選択し使用することが簡便である。

上記（ 1 ) および（2 ) のァフィ二ティ一クロマトグラフィー及び、レクチンを吸着させた担体を使用するァフィニティ一クロマトグラフィーは、ポリべプチドの精製に使用される溶液を適宜選択して溶出液とし、溶出された各画分の活性もしくは各画分中の本発明の第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドの存在を確認しながら行えばよい。本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドの存在を確認するには、各画分の Fas抗原を発現する細胞に対する細胞障害活性を測定したり、本発明の第 1または第 2の態様のポリペプチドを認識する抗体を使用した EIA等で確認することができる。本発明の第 1または第 2の態様のポリぺプチドを認識する抗体については本発明第 9の態様で説明する。

次に、本発明の第 9の態様の新規抗体について説明する。

本発明の第 9の態様の新規抗体は、本発明の第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドに結合することを特徴とする。

本発明の第 9の態様の新規抗体は、本発明の第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドと結合する限り、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。

抗体、すなわち、免疫グロブリンの構造は H鎖と L鎖とからなり、物理化学的性質や免疫学的性質は、 5つのクラス（IgG， IgA, Ig . IgD, IgE) に分けられる。このうち、 IgG 、 IgA はさらに H鎖のタイプによって、サブクラスに分けられる。本発明の新規抗体は、これらのいずれのクラス、サブクラスに属するものであってもよい。

さらに、免疫グロブリンは例えばペプシンで分解すると、 F(ab' )₂ と Fc' に別れ、パパインで分解すると Fab と Fcの 2つのフラグメントに分かれる。本発明の抗体は、抗原と結合するものであれば、完全な抗体分子でもその一部のフラグメントでもよい。また、本発明の抗体はキメラ抗体であってもよい。

本発明の新規抗体は、それがポリクロ一ナル抗体であっても、モノクローナル抗体であっても、公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の第 1 または第 2の態様の新規ポリべプチドを必要に応じてフロイン卜の完全アジュバント（FCA ) や不完全アジュバント（FIA ) 等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば 2〜 4週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い抗血清を得る。抗原として用いる本発明の新規ポリペプチドは、それが抗体の作製に使用しうる精製度のものであればレ、かなる方法で得られたものであつてもよ免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約

10〜20ァミノ酸からなるポリべプチドである場合には、それをキーホールリンぺッ卜へモシァニン（KLH ) 等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよレ、。当該新規ポリぺプチドで免疫する動物はいかなるものであつても良レ、が、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ゥサギ、ヒッジ、ゥマ、ニヮトリ、ャギ、ブ夕、ゥシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。

ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィ一等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。

モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウィルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイプリドーマを作製する。その後、本発明の第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドに結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れば良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィ一等の公知方法を適宜組み合わせて用し、れば良レ、。

また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリぺプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、本発明第 1または第 2の態様の新規ポリペプチドに対するモノクロ一ナル抗体を産生するハイブリドーマから mRNAを採取し、これをもとに cDNAライブラリ一を作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリ一ニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製することができる。

本発明の新規抗体は、体液中や組織中に存在する本発明の新規ポリべプチドを検出するために使用することができる。また、本発明の新規ポリペプチドを精製するために使用する抗体力ラムの作製、精製時の各分画中の本発明の新規ポリぺプチドを検出するために使用することができる。

本発明の新規抗体は、細胞に対する Fas リガンドの作用を修飾するものであつてもよい。細胞に対する Fas リガンドの作用を修飾する抗体の中で、特に好ましくは、 Fas リガンドが誘導するアポトーシスを抑制する効果を有するものである。当該抗体は、 Fas リガンドが誘導するアポトーシスを完全に抑制するものであってもよく、また、部分的に抑制するものであっても良い。

Fas リガンドが誘導するアポトーシスを抑制する効果を有する抗体を得るには、前記ポリクロ一ナル抗体およびモノクローナル抗体を製造する過程で得られる血清や、ハイプリドーマの培養上清を、例えば、次のようなアツセィ系にかけてスクリーニングする。すなわち、 Fas リガンドもしくは Fas リガンドを発現する細胞と、 Fas抗原を発現する細胞とを使用した in vi troのアツセィ系等である。スクリーニングの結果、選別された血清や培養上清から公知方法を組み合わせて目的の抗体を精製する。なお、 Fas リガンドもしくは Fas リガンドを発現する細胞と Fas 抗原を発現する細胞を利用したスクリ一二ング方法の好ましい例は、本発明第 11の態様で説明する。 Fas リガンドが誘導するアポトーシスを、完全に、又は、部分的に抑制することができる抗体は、生体におけるアポトーシスを調節するために使用することができる。たとえば、当該抗体はリウマチにおける関節組織の破壊、全身性エリテマト一デス（SLE)における自己組織の破壊、あるいは糖尿病、インフルエンザ、エイズ、肝炎等の組織や細胞のアポトーシスが関与する疾患の治療薬として使用することができる。

次に本発明第 10の態様を説明する。

本発明第 10の態様は、 Fas リガンド遺伝子の一部もしくは Fas リガンドに対する mRNAの一部に相補的な塩基配列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体である。当該ォリゴヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチド誘導体には、その塩基配列として、前記相補的な塩基配列のみを有する物、前記相補的な塩基配列に加えて、リボザィ厶配列等、他の塩基や塩基配列を有する物のいずれもが含まれる。

ここで、「Fas リガンド遺伝子」とは、 Fas リガンドをコードする DNA を含む遺伝子のことであり、 Fas リガンドをコードする領域に加え、その制御領域を含むものである。制御領域は、 Fas リガンドをコードする領域の上流に存在するもの、下流に存在するものいずれをも意味する。「Fas リガンドに対する mRNA」とは、 Fas リガンドをコードする塩基配列を含む mRNAである。当該 mRNAには、 Fas リガンドをコ一ドする塩基配列に加え、その上流および下流のノンコ一ディング領域を含むものも含まれる。

Fas リガンドをコードする染色体 DNA は、図 16〜18に示したように、イントロン部位とェクソン部位とからなることがわかっている。イントロンとェクソンからなる DNAが mRNAに転写される際には、まず、イントロンとェクソンとがそのまま転写されて pre- mRNAとなり、その後スプライシングを受けて、イントロンに対応ずる部分が削除され、ェクソン部分のみが転写された成熟 mRNAとなる。ここでいう「Fas リガンドに対する mRNA」には、 pre-mRNA. 成熟 mRNAのいずれもが含まれる。

また、「Fas リガンド遺伝子の一部もしくは Fas リガンドに対する mRNAの —部」とは、それらがコーディング領域であるか否かに関わらず、また、イントロン部位、ェクソン部位に関わらず、 Fas リガンド遺伝子もしくは Fas リガンドに対する mRNAに含まれるいかなる部分をも意味する。

なお、本発明の第 10の態様において「Fas リガンド」はいかなる動物種由来の Fas リガンドであってもよいが、好ましくは、ヒト、ラット、マウスいずれかに由来する Fas リガンドである。診断薬や医薬品への応用を考えると、特に好ましくは、ヒト Fas リガンドである。ヒト Fas リガンド遺伝子のコーディング領域付近の塩基配列は図 16〜18に示してある。また、ヒト Fas リガンド、ラット Fas リガンド、マウス Fas リガンドをコードする DNA の塩基配列はそれぞれ配列番号 31、 25、 28に示してある。上記各 Fas リガンドに対する各成熟 mRNAを含む塩基配列は、配列番号 31、 25、 28に示された塩基配列中の Tを Uに読み変えることによって得ることができる。

「相補的な塩基配列」とは、 DNAや mRNAの塩基配列に対して塩基特異的に相補的塩基対を形成するような塩基配列をいう。一般的には、 C (シトシン）と G (グァニン）の間、 T (チミン）と A (アデニン）の間、および U (ゥラシル）と A (アデニン）との間で相補的塩基対が形成されることが知られている。したがって、ヒト Fas リガンド遺伝子に相補的な塩基配列、およびヒト Fas リガンド、ラット Fas リガンド、マウス Fas リガンドに対する各成熟 mRNA に相補的な塩基配列を含む配列は、それぞれ、図 16〜18、配列番号 31、 25、 28に示した塩基配列中の Aに対して T、 Cに対して G、 Gに対して (：、 Tに対して A を対応させた配列、もしくは Aに対して U、 Cに対して G、 Gに対して (：、丁に対して Aを対応させた配列である。配列表の配列番号 31の塩基配列に相補的な DNA および RNA の配列は、それぞれ配列番号 29、 30に 5 ' →3 ' 方向で示してある。なお、「相補的な塩基配列」には (：、 G、 A、 T、 Uからなる塩基配列のみならず、これら塩基の誘導体を含む配列であつてもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドには、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオチドが複数結合したもの全てが含まれる。その代表的な物は DNA と mRNAである。

本発明のォリゴヌクレオチド誘導体には、その立体構造や機能がォリゴヌクレォチドと類似するものすべてが含まれる。たとえば、オリゴヌクレオチドの 3'末端もしくは 5'末端に他の物質が結合した物や、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか 1つにおいて、置換や、修飾が生じた物質、天然には存在しないような、塩基、糖、リン酸を有する物や、糖一リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有するもの等である。

本発明第 10の態様のォリゴヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチド誘導体は、 Fas リガンド遺伝子の一部もしくは Fas リガンドに対する mRNAの一部に相補的な塩基配列を有し、これらの遺伝子や mRNAにハイプリダイズするものが好ましい。特に好ましくは、少なくともヒト Fas リガンド遺伝子もしくはヒト Fas リガンドに対する mRNAにハイブリダイズするものである。 Fas リガンド遺伝子もしくは Fas リガンドに対する mRNAにハイブリダイズするようなォリゴヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチド誘導体は、組織や細胞における Fas リガンド遺伝子の存在やその発現状況を調べるための診断用ォリゴヌクレオチドプローブとして使用することができる。さらに、これらのオリゴヌクレォチドぉよびその誘導体は、 Fas リガンド遺伝子もしくは mRNAにハイブリダイズして、 Fas リガンドの発現を促進もしくは抑制することが期待されるので、 Fas リガンドの発現を調節し、 Fas リガンドによって誘導されるアポトーシスが関与する疾患の治療薬として使用することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体は、 Fas リガンド遺伝子もしくは Fas リガンドに対する mRNAにハイブリダィズし、 Fas リガンドの発現を調節する活性を有するものが好ましく、特に好ましくは、 Fas リガンドの発現を抑制するものである。すでに述べたように、エイズや肝炎における細胞死は Fas抗原を介したアポトーシスであると考えられている。したがって、 Fas リガンドの発現を抑制するォリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体は、エイズ、肝炎をはじめ、リウマチにおける関節組織の破壊、全身性エリテマトーデス（SLE ) における自己組織の破壊、糖尿病、インフルエンザ等の Fas リガンドを介したアポトーシスが関与する疾患の治療薬として使用することができる。

—方、 Fas リガンドの発現を促進するものは、エイズ感染初期の治療や、リウマチにおける滑膜細胞の異常増殖や自己免疫疾患における自己抗原反応性 T細胞の増殖を抑制するため等、生体にとって不要な細胞を除去するために使用でさる。蛋白質をコ一ドする DNAや mRNAに相補的な塩基配列を含むォリゴヌクレオチドを使用して、その蛋白質の発現を調節する方法は、アンチセンス法と呼ばれており、現在多くの研究者によって研究が進められている技術である。相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは、 ①遺伝子から pre- mRNAへの転写段階、 ② pre - mR NAから成熟 mRNAへのプロセッシング段階、 ③核膜通過段階、 ④蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担う DNA もしくは mRNAに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節すると考えられている。

本発明のォリゴヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチド誘導体は、 Fas リガンド遺伝子もしくは Fas リガンドに対する. mRNAのいかなる部分にハイプリダイズするものであってもよい。ハイブリダィズのしやすさの点では、一般的には、ステム ·ループを形成している mRNAのループ部分にハイプリダイズするような塩基配列、すなわち、ステム ·ループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつォリゴヌクレオチドもしくはォリゴヌクレオチド誘導体を設計するとよいとされている（東海林洋子、臨床免疫、 25巻、 1200— 1206頁、 1993年）。

また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キヤッビング部位、スプライス部位に結合するようなオリゴヌクレオチド、すなわち、これらの部位の配列に相補的な配列を有するォリゴヌクレオチドは、一般に高い発現抑制効果が期待できるものと考えられているので（癌と化学療法、 20巻、 13号、 1899— 1907 頁）、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が、 Fas リガンド遺伝子もしくは Fas リガンドに対する mRNAの翻訳開始コドン付近、リポソ一ム結合部位、キヤッビング部位、スプライス部位に結合するもの、すなわち、これらの部位に相補的な配列を含むものであれば、高い発現抑制効果が期待される。

本発明のォリゴヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチド誘導体は、診断や医薬用途として使用することを考慮すると、 Fas リガンド遺伝子もしくは mRNAと、特異的にハイプリダイズするものが好ましい。

一般的には、 15塩基以上の塩基を含む塩基配列であれば、特異性のある配列であると考えられている（横山一成、蛋白質核酸酵素、 38巻、 754〜765 頁、 1994年）。したがって、当該オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体も、 Fas リガンド遺伝子もしくは Fas リガンドに対する mRNAに相補的な塩基配列であって 15塩基以上からなる塩基配列を含むものであれば、 Fas リガンド遺伝子もしくは Fas リガンドに対する mRNAに特異的に結合することが期待される。一方、オリゴヌクレオチドを細胞内に取り込ませるには、その長さはあまり長すぎても不適当である。本発明第 10の態様のォリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、いかなる長さのものであってもよいが、本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体を細胞内に取り込ませ、 Fas リガンドの発現を調節させることを考慮すると、当該ォリゴヌクレオチドおよびこれらォリゴヌクレオチドの誘導体は Fas リガンド遺伝子もしくは Fas リガンドに対する mRNAに相補的な 15塩基以上 30塩基以下、好ましくは 15塩基以上 25塩基以下、より好ましくは 18 塩基以上 22塩基以下の塩基数からなる塩基配列を有するものが好ましい。

アンチセンス技術の進歩とともに、オリゴヌクレオチドの医薬品としての効果を高めることを目的として様々な誘導体が見いだされてきた。現在、目的の DNA や mRNAとの結合力、組織選択性、細胞透過性、ヌクレアーゼ耐性、細胞内安定性の高い様々なォリゴヌクレオチド誘導体が得られている。前述のように、本発明の「オリゴヌクレオチド誘導体」には、天然には存在しないような、塩基、糖、リン酸、バックボーン構造からなるものも含めて、あらゆる種類の誘導体が含まれる。

現在一般に知られている誘導体の例としては、ノくックボーン構造として、その全部または一部にフォスフォジエステル（phosphodiester) 結合、フォスフォロチォエート（phosphorothioate) 結合、フォスフォトリエステル（phosphotries ter ) 結合、メチルフォスフォネート（methylphosphonate ) 結合、フォスフォ口アミデート（phosphoroamidate) 結合、フォスフォロジチォェ一ト（phosphoro di thioate)結合、モルホリノ基を有する物等（東海林洋子等、癌と化学療法、 20巻、 1899— 1907頁、 1993年）があげられる。また、ポリアミドー核酸（PNA )

(P. E.二一ルセン (P. E. Nielsen ) 等、 Science 、 254 巻、 1497— 1500頁、 1991 年）や、糖の 2 ' 位が、他の原子あるいは置換基に置換されたものやひ一リボース等、糖部分を修飾したものも誘導体の例として挙げられる（ミカエル J. ゲー卜 (Michael J. Gai t), 290 - 299頁： in Antisense Research and Appl ications, CRC 出版、フロリダ、 1993年）。

さらに、糖部分が他の物質に置換されたもの、一部の塩基がイノシン（A、 T、 C, Gのいずれにでも結合するユニバーサル塩基と呼ばれる）に置換された物、オリゴヌクレオチドの 5'末端もしくは 3'末端もしくは内部にコレステロールゃァクリジン、ポリ一 L一リジン、ソラレン（psoralen)、長鎖アルキル等が結合したもの等も、オリゴヌクレオチド誘導体の例として知られている（マコトマックラ（Makoto Matsukura)，506-519頁およびポール S. ミラ一（Paul S. Mi l ler) 等、 190-202頁； in Ant isense Research and Appl icat ions, CRC 出版、フロリダ、 1993年） o

本発明のォリゴヌクレオチド誘導体は、上に例示した誘導体をはじめとしていかなる誘導体であってもよい。しかしながら、当該誘導体は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも 1つが高められた誘導体であることが好ましい。

特に好ましくは、当該オリゴヌクレオチド誘導体は、フォスフォロチォエート結合をバックボーン構造として有する誘導体である。

以下に、本発明のォリゴヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチド誘導体の製造方法を説明する。

オリゴヌクレオチドやその誘導体は、公知方法で製造することができる（例えば、スタンレー T. クルーク（Stanley T. Crooke) およびべルナルドレブロー (Benrnld Lebleu)編、 in Ant i sense Research and Appl icat ions, CRC 出版、フロリダ、 1993年）。

天然の DNA や RNA であれば、化学合成機を使用して合成したり、 Fas リガンド遺伝子を铸型として PCR 法により本発明のォリゴヌクレオチドを得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチォエート型等、誘導体の中には、化学合成機（たとえばパーキンエルマ一ジャパン（株）製、 394型）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行レ、、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィ一等を用レ、た HPLC法により精製することによつても、目的のオリゴヌクレオチドもしくはォリゴヌクレオチド誘導体を得ることができる。

次に、本発明のォリゴヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチド誘導体の利用方法について説明する。

本発明のォリゴヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチド誘導体を診断用のプローブとして使用する場合には、それらを、公知の方法に従い、ラジオァイソトープゃ、酵素、蛍光物質、発光物質等で標識する。次に、 Fas リガンドの発現を調べたい患者の細胞から DNA もしくは mRNAを公知方法で調製し、これを被検物質として、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中に、 Fas リガンド遺伝子もしくは RNAが含まれていれば、当該オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体はそれらと結合する。結合形成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることができる。近年、 Fas リガンドの発現と自己免疫疾患の関係等が報告されているので、本発明のオリゴヌクレオチドを使用した診断プローブは、たとえば、リウマチや SLE等の自己免疫疾患等の診断に利用することができる。また、炎症時の T細胞による細胞障害にも Fas リガンドが関係していると考えられるので、炎症の程度や治療方法を決定するための診断にも使用することができる。

本発明のォリゴヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチド誘導体を医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。

本発明第 10の態様のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体は、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リボソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、 '必要に応じて、本発明のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体に薬理学的に許容され得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のことである。

本発明のォリゴヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチド誘導体は、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、アポトーシスを調節し、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。

以下に、本発明第 11の態様のスクリーニング方法について説明する。

本発明の第 11の態様のスクリーニング方法は、本発明第 1または第 2の態様のポリぺプチドまたはそれを発現するように形質転換した形質転換体を使用することを特徴とする。

本発明のスクリーニング方法では、好ましくは、本発明第 1または第 2の態様のポリぺプチド、もしくはそれを発現する形質転換体に加え、 Fas 抗原を発現す, る細胞を使用することが好ましい。この方法を使用すれば、 Fas リガンドに結合する物質、 Fas リガンドの発現を促進もしくは抑制する物質に加え、 Fas抗原の発現を促進もしくは抑制する物質、 Fas リガンドの細胞への作用を調節する物質をスクリ一二ングすることができる。 Fas リガンドの細胞に対する作用の代表的なものはアポトーシスの誘導であるが、当該スクリーニング方法は、アポト一シスを促進したり抑制したりする物質の他にも、 Fas リガンド存在下で Fas 抗原発現細胞に生じる何らかの変化を促進したり抑制したりする物質のスクリーニングにも適している。

当該スクリーニング方法は、いかなる工程を含むものであってもよいが、好ましくは、下記（ 1 ) ないし（3) より選ばれるいずれかの工程を含むものである。すなわち、

(1) a. Fas抗原を発現する細胞を、 Fas リガンドもしくはそれを発現する形質転換体、もしくはその培養上清からなる群より選ばれるいずれかとともに培養する。

b. aに被験物質もしくは被験物質を含む試料を添加する。

c Fas抗原を発現する細胞の生死、形態的変化もしくは生化学的変化のうち少なくともいずれか 1つを測定する。

(2) a. 被験物質もしくは被験物質を含む試料を、 Fas リガンドもしくはそれを発現する形質転換体、もしくはその培養上清からなる群より選ばれるいずれかとィンキュベートする。

b. aに Fas抗原を発現する細胞を加えて、培養する。

(3) a. 被験物質もしくは被験物質を含む試料を Fas抗原を発現する細胞とインキュベートする。

b. aに、 Fas リガンド、もしくはそれを発現する形質転換体、もしくはその培養上清からなる群より選ばれるいずれかを加えて培養す。 c . Fas抗原を発現する細胞の生死、形態的変化もしくは生化学的変化のうち少なくともレ、ずれか 1つを測定する。

Fas 抗原を発現する細胞の形態的変化もしくは生化学的変化を測定する方法は、その変化を検出できる方法であれば特に限定されない。 Fas抗原を発現する細胞のアポトーシスの有無やその程度を測定するのであれば、 Fas抗原を発現する細胞にあらかじめ取り込ませた^{5 1} Crの放出量から測定することができる。また、トリパンブル一を用いた染色や、ホルマザンの生成を指標としたアツセィ（MTTアツセィ、アルマールブルーアツセィ等）を行って、 .Fas抗原を発現する細胞のうち生き残つた細胞数を測定してもよレ、。

一般に、細胞表面上に存在する膜型蛋白質が他分子と結合する領域は、細胞外領域であると考えられる。したがって本発明のスクリーニング方法においても、前記式 1ないし 3、 5ないし 7、 9ないし 11のアミノ酸配列を有するポリべプチドもしくはそれらを発現する形質転換体が好適に使用できる。なかでも、前記式 1ないし 3のァミノ酸配列を有するポリべプチドもしくはそれらを発現する形質転換体を使用することが好ましい。当該スクリ一ニング方法で使用する Fas リガンドは、本発明第 7の態様の説明に示した方法で得ることができる。また、 Fas リガンドを発現する形質転換体は本発明第 5または第 6の態様で説明した方法で得ることができる。

本発明第 11の態様のスクリ一二ング方法を使用すれば、 Fas リガンドに結合する物質や Fas リガンドの発現を調節する物質をスクリ一二ングすることができる。ここでいう物質には、化合物、ペプチド、蛋白質、抗体、核酸などすベての物質が含まれる。また、これらのスクリーニング方法を使用して、 Fas リガンドが関与する疾患の診断を行うことも可能である。

例えば、自己免疫疾患の患者より血球細胞や組織由来の細胞を分離し、 Fas リガンドもしくは Fas リガンドを発現する形質転換体と反応させ、患者から分離した細胞に生じるアポトーシスの程度を観察することにより、その患者の Fas抗原の機能もしくは発現に異常があるかないかを診断することができる。そして、その診断結果を参考に、原因に応じた治療を選択することができる。

なお、 Fas抗原を発現する細胞はいかなる細胞であってもよい。たとえば、ェィズゥィルス感染細胞のようにウイルスや薬物によつて Fas 抗原の発現が誘導された細胞でもよいし、 Fas 抗原を発現する株化細胞やハイプリドーマ、形質転換体であってもよい。好ましくは、ヒト Fas抗原を発現する細胞であり、特に、ヒト Fas抗原を発現する形質転換体、たとえば、 WC8細胞（ィトウ N. (I toh N. ) 等、 J. Immunol. . 151巻、 621-627頁、 1993年) を使用するのが好ましい。産業上の利用分野

Fas抗原に結合する物質が単離されれば、それを使用して、人為的に生体内で生じるアポトーシスを調節し、疾患の治療や、診断に使用する事ができる。 Fas 抗原に結合して細胞にアポトーシスを誘導するような物質（Fas リガンド）は、生体にとって不必要な細胞を除去するために使用することが可能である。たとえば、先述したように、エイズウイルス感染細胞では Fas抗原が発現されているので、エイズウイルス感染初期においては、 Fas リガンドを使用してアポトーシスを人工的に誘導し、感染細胞を早期に除去する事により、エイズを治療する事が可能であろう。また、ある種の自己免疫疾患では、人為的に Fas 抗原を介したァポトーシスを生じさせる事により、自己抗原反応性の T細胞の除去が可能になるであろう。また、モリモト H. (Morimoto H. )等は、癌細胞に Fas抗原を介したァポト一シスを誘導する事によって、ァドリアマイシンやシスブラチンによる制癌効果が相乗的に増強されることを報告している（Cancer Res. , 53 巻、 2591 -2596頁、 1993年）ので、 Fas リガンドは癌治療にも使用することができるであろう。

このように、生体内で生じているアポトーシスを人為的に調節するという原理に基づいた治療方法は、 Fas抗原に結合する物質が同定されて初めて可能になる方法である。

Fas抗原と結合するポリペプチドを、治療や研究に使用するためには、当該ポリぺプチドを高純度で、大量に生産することが必要になる。当該ポリぺプチドをコ一ドする遺伝子をクロ一ニングすれば、当該ポリべプチドを遺伝子工学的に生産することが可能になり、当該蛋白質を治療薬の主成分として使用したり、抗体の作製に使用することが可能になる。また、遺伝子そのものは、遺伝子治療ゃァンチセンス医薬の開発に使用したり、トランスジエニックマウス等、アポト一シスが関与する疾患のモデル動物の作製に使用することができる。発明を実施するための最良の形態

以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではなレ、。

また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。

なお、以下に示す実施例中の諸操作は、主にサムブルック等編〔モレキュラークローニング，ァラボラトリーマニュアル第 2版〕コールドスプリングハーバーラボラトリ一， ₁₉₈₉年；今本文男等編〔組換え遺伝子の細胞への導入と発現〕蛋白質核酸酵素臨時増刊 28(14)1983年；岡田善雄監修〔細胞工学的技術総集編〕実験医学臨時増刊 7 (13)1989年等を参考として実施した。

(実施例 1 ) キメラ蛋白質の調製

( 1 ) 発現プラスミド pFas-FcI I の調製

実施例 2で使用する、マウス Fas(mFas) 抗原の細胞外領域とヒト IgGl(hlgGl) の Fc領域とを結合させたキメラ蛋白質（以下 mFas-Fc と称する）の発現プラスミドを以下の方法で作製した。

まず、配列表の配列番号 33〜34に示すマウス Fas抗原染色体遺伝子のイントロン 4のセンス配列 (GATTTTCAACCACTCAGTCG)を含むォリゴヌクレオチドプライマ一と、イントロン 5のアンチセンス配列（ATGCGGCCGCTGGATCCTTTGTATGAAATTGAG TAAT) を含むオリゴヌクレオチドプライマーを化学合成した。後者のオリゴヌクレオチドプライマーには BamHI サイトを付加してある。

これらのオリゴヌクレオチドプライマ一を用いて、マウス Fas抗原染色体遺伝子を含むプラスミド（PMF3ES, 1992年度、分子生物学会）を铸型にして PCR を行った。その結果、ェクソン 5の 5'末端および 3'末端にフランキングリージョンを有する、 383bp の DNA断片が増幅された。

得られた増幅産物を Pst lと BamHI で消化し、ェクソン 5の 3'末端とイントロン 5の一部を含む 128bp の DNA フラグメントを得た。得られた DNA フラグメントでプラスミド pMFl (ワタナベ一フクナガ（Watanabe- Fukunaga R. )等、 J. Immunol. 148巻、 1274-1279 頁、 1992年）の Pst l- BamHI DNAフラグメント部分を置き換え、プラスミド pMFXを作製した。

一方、ヒト IgGl重鎮定常領域に対するェクソンを有するプラスミド PMH4 (ニシムラ Y. (Nishimura Y. )等、 Cancer Res.， 47巻、 999- 1005頁、 1987年）を Hae I Iで消化し、得られた 1. 7kbpの DNA フラグメントを pBluescript KS(+) の Xbalサィ卜にサブクローニングした。

これを Hind iおよび Apalで消化し、ヒンジ、 CH2 および CH3 ドメインをコードするェクソンを含む 1. 4kbpの DNA フラグメントを得た。このフラグメントを前述のプラスミド pMFXの Xbalサイトに挿入し、プラスミド pFAS-Fc を作製した。ブラスミド pFAS- Fc を Kpnlで切断後、平滑化し Not lで消化し、得られた 2. 3kbpの DNA フラグメントを、哺乳動物発現ベクター pEF-BOS (ミズシマ S. (Mizushima S. ) およびナガタ S. (Nagata S丄 Nucleic Acids Res. , 18巻、 5332頁、 1990年) にライゲートして、目的とする発現プラスミド pFAS-FcI I を得た。

( 2 ) 発現プラスミド phTNFR /8-Fc の作製

実施例 2で使用する、 TNF レセプター^とヒト IgGlの Fc領域キメラ蛋白質（以下、 hTNFR S- Fc と称する）の発現プラスミド phTNFR /S-Fc を以下のように構築した。まず、プラスミド p55TNFr-HGl (レオスッシヤー H. (Leostscher H. )等、 J. Biol. Chem. , 266 巻、 18324-18329 頁、 1991年) を ΚρηΙと Hindi 1 1 で消化し、 650bp の DNA フラグメントを調製した。プラスミド p55TNFr -HG1は、人工的スプライスドナー配列 (arti f icial spl ice donor sequence) に続くヒト TNF レセプ夕一（p55) の細胞外領域をコードする cDNA配列を含むプラスミドである。

一方、プラスミド pFAS- Fel l を Hind Iおよび Hindi I I で消化した。マウス Fas 抗原の細胞外領域をコードする配列を含む約 700bp の DNA フラグメントを、前述の 650bp の ΚρηΙ-HindI I Iフラグメントと入れ換え、目的とするプラスミド phTNFR ^-Fc を得た。

( 3 ) 発現プラスミド pBF - Fclの調製

実施例 10で使用する、ヒト Fas抗原の細胞外領域とヒト IgGlの Fc領域キメラ蛋白質（以下、 hFas- Fc と称する）の発現プラスミド pBF-Fcl を以下のように構築した。

まず、ヒト Fas抗原をコードする DNA (ィトウ N. G toh N. )等、 Cel l, 66巻、 233-243 頁、 1991年) を含むプラスミド pBLF58_lを Xholと BamHI で消化し、 700b の断片を得た。次にキメラ蛋白質 mFas-Fc の発現ベクター構築に用いた pFas- Fc を Xho I、 BamHI で消化し、先述の 700bp の断片を挿入した（pBHF 一方、 PBLF58- 1を鐯型とし、配列表の配列番号 35に示すセンスプライマー 1 (ATGCCCAAGTGACTGACATCAACT)と配列表の配列番号 36に示すァンチセンスプライマー 1 (GCGCGGATCCAGGAAGTGGGAAAGGATTACCTTCCTCTTTGCACTTGGTG)を使用して PCR を行い、ヒト Fas抗原の細胞外領域に、マウス Fas抗原染色体遺伝子のイントロン 5の配列、 BamHI サイトを付加した断片を調製した。

この PCR 産物を Msdと BamHI で消化し、得られた 360bp の DNA 断片を Msc l と BamHI で消化した pBHF-Cl に挿入した。ついで、形成されたプラスミドを Kpnl で切断後、平滑化し、 Not lで消化し、ヒト Fas 抗原の細胞外領域、ヒト IgGl の Fc領域をコードする DNA断片を得た。この断片を、 BstXI で切断後平滑化し、かつ Not lで切断した pEF-BOSに挿入し、ヒト Fas-Fc 発現べクタ一 pBF- Fclを得た。

( 4 ) キメラ蛋白質の生産と精製

プラスミド pFas- Fel l および phTNFRyS-Fcでそれぞれ COS- 7細胞、 BTS- 1 細胞 (セディビー J. M. (Sedivy J. . ), Biol. Technology, 6巻、 1192-1196頁、 1993年）を形質転換させた。また、プラスミド pBF- Fclで COS- 7細胞を形質転換させた。

COS- 7細胞の形質転換は、フクナガ R. (Fukunaga R. ) らが報告した DEAE - デキストラン法で行った（フクナガ R. (Fukunaga R. )等、 Cel l, 61巻、 341-350頁、 1990年）。形質転換の後、この COS- 7細胞を、 10%の FCS を含む培地中で 24時間ィンキュベートし、さらに、血清不含の培地中で 48時間および 72時間インキュベートした。インキュベート後の培養上清液を集め、遠心分離操作を行った後、 0. 45〃mのフィルターを通して細胞の破砕物を除き、プロテイン A - セファロース 4Bカラム（フアルマシア社）クロマトグラフィーにより、キメラ蛋白質 mFas-Fc、 hTNFRyS-Fc、 hFas-Fc をそれぞれ精製した。

—方、 BTS- 1 の形質転換は、エレクト口ポレーシヨン（ポッター H. (Potter H. )等、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 81巻、 7161-7165頁、 1984年) によって行った。すなわち、プラスミド pFas-FcI I を ApaU で、プラスミド phTNFR /S-Fc を Saclで消化した後、各々のプラスミド DNA 50 g をそれぞれ、 Xho lで切断した pSTneoB 5 とともに、 1 x iO⁷ 個の細胞を形質転換した。 10%FCS と 300 / g/mlの G-418 とを含むダルベッコ変法イーグル MEM(Dulbecco' s

Modif ied Eagle Medium, 以下 D-MEM と略す）で 10日間選択を行った後、 G-418 耐性クローンを分離し、 39. 5°Cで増殖させた。

目的とするキメラ蛋白質を生産するクローンを同定するため、クローンの一部を 33°Cで 3日間培養し、培地中に分泌されたキメラ蛋白質を、酵素免疫法（ELIS A)で検定した。検定に使用した ELISAでは、捕獲抗体として抗ヒト IgG-Fc抗体

(カッペル 55071) を、検出抗体として西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗ヒト

IgG-Fc抗体（ジャクソン研究所、 109-035098) を用いた。

mFas-Fc および hTNFR yS— Fcを効率的に生産する形質転換体を一^ ^ずつ、 39. 5 °Cで増殖させた後、 15cmプレートに 50%コンフルェントとなるように植え込んだ。 33°Cで 1週間培養したのち、培養上清から mFas— Fcと hTNFR/S— Fcをプロティン A -セファロース 4Bカラム（フアルマシア社）クロマトグラフィーにより、精製した。

精製後の mFas- Fc を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS- PAGE)で分析したところ、還元下で分子量 55kDの位置にバンドが認められ、非還元下においては、分子量 110kD の位置にバンドが認められた。これは、得られたキメラ蛋白 mFas-Fc が、 S- S 結合によるホモダイマ一として存在していることを示している。 (実施例 2 ) フローサイトメトリ一による解析および dlOS- 2細胞株の選択

( 1 ) キメラ蛋白質のピオチン化および FITC標識

スルホサクシ二ミジル 6— （ピオチンアミド）へキサノエート（NHS— LC—ビォチン、ピアス社、 21335)を用い、その操作手順書に従って、 mFas- Fc および hTNFR /S - Fc をピオチン化した。

また、 l mgの hTNFR /S- Fc と 20〃g の FITCとを、 1 mlの 50mM炭酸ナトリウム緩衝液（PH9. 5) 中で混合し、室温で 4時間反応させた後、未結合の FI TCをセフアデックス G- 25M を用いたカラムクロマトグラフィ一で除去し、 FITC標識 hTNFR 8 -Fc を得た。

( 2 ) フローサイトメトリー

PC60- dlOS細胞（以下、 dlOSと略す。ルービエ E. (Rouvier E. ) 等、 J. Exp. Med. , 177巻、 195-200 頁、 1993年）を染色用溶液（ 2 %FCS と 0. 02%NaN₃とを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下、 PBS と略す））を用いて洗浄した。約 1 X 10⁶ 細胞を、 5 g/mlのラット抗マウス FC 7 RI I ブロッキング抗体（ファーミジェン社）を含む染色用溶液 50〃 1 に懸濁した。これを 96ゥエルプレートの各ゥエルに添加し、氷上で 10分間インキュベーションした。 50〃 1の 20〃g/mlビォチン化 mFas-Fc を各ゥヱルに加え、氷上でさらに 30分間インキュベーションした。染色用溶液で洗净の後、フィコエリスリン標識ストレプトアビジン（25倍希釈、べクトン- ディッキンソン社）を加え、さらに染色用溶液を加えて 100〃 1 とし、氷上で 30分間反応させた。

細胞を染色用溶液で洗浄した後、 FACScan (べクトン一ディッキンソン社）を用いたフローサイトメリーによって解析を行った。この結果を図 laに示す。対照は白抜部分として、また PMAとィオノマイシンで 4時間処理する前に染色したものを影付された部分として、さらに、 PMAとィオノマイシンで 4時間処理した後に染色したものを着色部分で表した。その結果、蛍光強度のわずかなシフトが認められ、当該細胞がピオチン化 mFas-Fc で染色された事が確認された。

—方、 dlOS細胞を、ピオチン化 hTNFR 5- Fcで同様に染色し、フローサイトメトリ一で分析したところ、染色は認められなかった。これらの結果、実施例 1で調製した mFas- Fc は、 dlOS細胞上の Fasリガンドに特異的に結合することが確認された。

( 3 ) dl OS- 2細胞株の選択

( 2 ) で、高い蛍光活性が認められた dlOS細胞、 1〜3 X 10⁷ 個に、前述の方法でピオチン化 mFas-Fc および FITC標識 hTNFR S-Fc を反応させ、次いで、フィコエリスリン標識ストレプトアビジンで染色し、 FACS r (べクトン—ディツキンソン社）でソーティングした。フィコエリスリン蛍光を高いレベル（上位 0. 3 〜0. 5 %) で発する細胞を集め、 10%FCS と 50nMの 2 —メルカプトエタノールを含む D-MEMで増殖させた。

得られた細胞に対し、上記操作を更に繰り返した結果、選択された細胞群を dl 0S-2と名づけた。 dlOS- 2について、 dlOSと同様にフローサイトメトリーを行った結果を図 lbに示す。この dlOS-2は、刺激剤存在下、非存在下両方において、高い

Fasリガンド発現量を示す細胞が極めて濃縮された細胞群である。

(実施例 3 ) cDNAラィブラリ一の構築

実施例 2で得られた dlOS- 2細胞を 10%FCS を含む D-MEM中で 2 X 10⁵ 細胞/ ml まで増殖させ、 20ng/ml の PMA と 1 x g/mlのィオノマイシンで 37で、 3'時間刺激した。グァニジンイッチオシァネート zァシッドフエノール法（コムシンスキー

P. (Chomczynski P.) およびサシー N. (Sacchi N.), Anal. Biochem. , 162巻、 156-159頁、 1987年）によって総 RNA を分離した後、オリゴ (dT)—セルロース力ラムクロマトグラフィーを 2回繰り返し poly(A)RNAを選択的に分離した。ランダ厶へキサマーあるいはオリゴ (dT)プライマーを用い、ィトウ N. (Itoh N.)等、（ Cell, 66巻、 233-243頁、 1991年) の方法で 2本鎖 cDNAを合成した。

得られた 2本鎖 cDNAに BstXI アダプターを付加し、 1 %ァガロースゲルを用いた電気泳動で分子量分画を行った。 1.5kbp以上の大きさの cDNAを回収し、 BstXI で切断した PCEV4 ベクタ一（ィトウ N. (Itoh N.) 等、 Cell, 66巻， 233- 243頁、 1991年）にライゲートした。

ライゲートプロダクトを使用し、エレクトロボレ一シヨン（ドヮ一 W. (Dower W.) 等、 Nucleic Acids Res.. 16巻、 6127-6145頁、 1988年）により大腸菌 DH10 B細胞（ギブコ BRし (Gibco BRL) 社）を形質転換した。オリゴ (dT)でプライ厶させた cDNAライブラリーから得た約 1.0 X10⁶ 個の独立したクローンと、ランダムへキサマーでプライムさせた cDNAライブラリーから得た約 1.3 X10⁶ 個のクローンとを混合し、プラスミド DNA を調製して、 COS- 7細胞の形質転換に使用した。

(実施例 4 ) パンニング操作による cDNAクローンの濃縮

実施例 3で得られたプラスミド DNAでエレクトロポレーシヨン法により、 COS -7細胞を形質転換した。すなわち、 5 X10⁶ 個の COS- 7細胞を K- PBS— ( 30.8m NaCl, 120.7mM KCL 8. lmM Na₂HP0₄および 1.46mM KH₂P0₄ を含む緩衝液）で洗浄し、 0.4ml の 5mM MgCl₂を添加した K-PBS (K - PBS+ ) に細胞を懸濁した。次に、 0. 4ml の K- PBS+ に 40 g のプラスミド DNA を溶解し、それを細胞懸濁液に加え、氷上で 10分間インキュベーションした。細胞に 960 Fのキャパシ夕ンスで 230Vの電圧をかけエレクトロポレーシヨンし、氷上で 10〜15分間インキュベーシヨンした後、細胞懸濁液を 5 mlの血清無添加の冷 D-MEMで希釈し、さらに室温で 30分間インキュベーションした。その後、この細胞を 2つの 10cmプレートに植え込み、 10%FCS を含む D- MEM中で 37°Cで 60時間培養した。

以上の方法で、総数 1. 2 X 10⁸ 個の COS- 7細胞を形質転換し、 10cmプレートで培養した。 1プレートあたり 5 mlの 0. 5mM EDTAおよび 0. 02%NaN₃を含む PBS (PB S/EDTA/NaNa ) を加え、 37°Cで 30分間インキュベーションし、プレートよりこれらの細胞を剝した。剝した細胞を、 3 mgZmlの BSA および 2. 5 g Zmlの抗マウス Fe y I Iレセプター抗体とを含む PBSZEDTA/NaN₃に 5〜7 X 10⁶ 個 Zmlの細胞濃度で再度懸濁した。氷上で 10分間インキュベーションした後、 mFas- Fc を終濃度が 4 g /mlになるように加え、氷上で 60分間インキュベーションした。この細胞を氷冷した PBSで洗浄し、 50mへぺス緩衝液（pH8. 3)および 0.2mM ビス（スルホサクシニミドイル）スべレート（BS³ 、ピアス社）とを含む PBS 中に 5〜7 X 10⁶ 個 Zmlの細胞濃度になるよう浮遊した。

氷上で 30分間インキュベーションしたのち、 1Mトリス—塩酸（以下、 Tris-HCl と略す、 pH8. 0)を終濃度が 50m となるよう添加し、さらに氷上で 10分間インキュベーシヨンした。 PBSで洗浄したのち、細胞を 3 mg/ml の BSA を添加した PBS /E DTA /NaN₃ 30mlに懸濁し、ナイロンメッシュ（ポアサイズ 100 u rn) で濾過を行い凝集物を取り除いた。

この細胞懸濁液を、抗ヒト IgG-Fc抗体（カッペル 55071) を固定化した 30個の 10cmパンニング用プレートに分配した。室温で 2時間ィンキュベーションしたのち、 PBS で穏やかに洗浄することにより非付着細胞を取り除き、ィトウ N. Cltoh N. )等の方法で染色体外 DNA を付着細胞から抽出した (Cel l, 66巻、 23 3-243 頁、 1990年）。以上の 1回目のパンニング操作で得られた DNA を用い、ェレクト口ポレーシヨンにより大腸菌を形質転換させ、 4. 1 X 10⁶ 個のコロニーを得た。これらよりプラスミド DNA を調製し、 9. 6 X 10⁷ 個の C0S-7細胞（60 プレート）を形質転換した。

これをパンニング用プレート 30枚に分配して 2回目のパンニングを行い、 1回目と同様に付着細胞から DNA を調製した。回収したプラスミド DNA を用い大腸菌を形質転換し、 8. 0 X 10⁶ 個のクローンを得た。これらよりプラスミド DNA を調製し、 4. 0 X 10⁷ 個の COS- 7細胞（10プレート）を形質転換した。

これをパンニング用プレート 30枚に分配して 3回目のパンニングを行った。 1 回目、 2回目と同様に付着細胞からプラスミド DNA を回収し、大腸菌を形質転換させ、 3. 8 X 10⁶ 個のクロ一ンを得た。これらより調製したプラスミド DNA で 1. 0 X 10⁷ 個の COS- 7細胞（25プレート）を形質転換し、 10枚のパンニング用プレー卜に分配して、 4回目のパンニング操作を行った。

以上の 4回目のパンニング操作を終了した後、 COS- 7細胞から染色体外 DNA を調製し、大腸菌を形質転換させた。各菌体クローンより、プラスミド DNA を調製して解折したところ、 48クローン中 16クローン力、 l. Okbp以上のインサートを有していた。これらのプラスミド DNA をそれぞれ COS- 7細胞に導入した後、 COS - 7 細胞をピオチン化 mFas-Fc で染色し、実施例 2の方法でフローサイトメトリーを行った。その結果、 5つのクローンが染色された。この 5クローンのうちの 1つで、 1. 6kbpのインサートをもつクローン、 PTN24-15で形質転換させた COS- 7細胞 (C0S/PTN24-15)の結果を図 lcに示した。この pTN24- 15で形質転換させた COS- 7細胞はピオチン化 hTNFR^- Fc では、染色されなかった。また、外来遺伝子を含まない PCEV4 で形質転換させた C0S-7細胞はピオチン化 mFas-Fc で染色されなかつた。

(実施例 5 ) DNA配列の決定およびその解折

実施例 4で得られた 5クローンについて制限酵素マツビングをしたところ、それらが互いにオーバーラップしていることがわかった。そこで、この 5クローンのうちの 1つ、 PTN24-15をさらに詳しく解析した。 DNA 配列の決定は DNA シ一ケンサ一（370A型、パーキンエルマ一ジャパン（株））と Taq ダイデォキジサイクノレシーケンシングキット (Taq Dye Deoxy cycle sequencing ki t, ノヽ⁰— キンエルマ一ジャパン（株））を使用して行った。

クローン PTN24-15の塩基配列と、それから推定したァミノ酸配列を図 2、 3と、配列表の配列番号 25に示した。この cDNAは、 1623塩基から成り、 1つのオープンリーディングフレームを有していた。

また、この配列中には、配列表の配列番号 37に示すコザック M. (Kozak M. , J. Cell Biol. , 115巻、 887-903 頁、 1991年) によって提唱された配列 (CCA/GCCAT GG) は認められなかつこが、翻訳開始部位は塩基番号 74〜76に位置する ATG と考えられた。このオープンリーディングフレームは、 908 〜910 の終止コドン TAA で終わっている。そして、この cDNAは、 278 アミノ酸をコードすることがわかつた。アミノ酸配列から推定されるペプチド部分の分子量は 31, 138であり、等電点は 9.53である。この cDNAがコ一ドする 278 ァミノ酸のうち N末端側の 77ァミノ酸は、極めてプロリンに富んだ配列であった。 N末端付近に典型的なシグナル配列は確認できなかったが、ヒドロパシー分析（Hydropathy Anal ys i s ) により、 Fasリガンドは、プロリンリッチな領域に続いて、おそらくトランスメンブランアンカーとして機能すると考えられる 22個の疎水性アミノ酸を有することがわかった。シグナル配列が欠如しており、内部に疎水性ドメインを有する構造から、 Fasリガンドは I I型のトランスメンブレン蛋白質であることが示唆された。

細胞外領域として推定される領域は C末端側に存在し、 179 アミノ酸から成り、 4つの N—グリコシレーシヨンサイト（Asn- X-Ser /Thr) を含むことが確認された。これらのグリコシレーションサイトは、図 2、図 3中に *で示した。

cDNAライブラリー作成に使用した dl OS-2細胞は、ラッ卜とマウスのハイブリドーマである。 Fasリガンド cDNAの由来を決定するために、 Fasリガンド cDNA の 3'末端ノンコーディング領域からプライマーを設計、合成し、ラットとマウスの脾臓細胞から得た染色体 DNA を铸型として PCR を行った。すなわち、配列表の配列番号 25の塩基番号 1006〜1025、 1305〜1324をセンスプライマー 2および 3 (配列表の配列番号 38および 39) とし、配列表の配列番号 25の 1327〜1346および 1543〜1562をァンチセンスプライマ一 2および 3 (配列表の配列番号 40および 41) として用いた。その結果、ラット染色体 DNA でのみ、サイズ 341bp と 258bp のバンドが得られた。これらの結果は、クローン PTN24-15より得られた cDNA が dlOSハイプリドーマ細胞のラット遺伝子に由来することを示している。

なお、ノヽナノヽンの; ¾ "法（Hanahan D. ¾\ Techni ques for Transformat ion ofE. col i, In DNA Cloning, vol. 1, グロ一バー D. . (Glover D. M. )編、 109-136 頁、 IRし出版（IRL Press), 1985年）に準じて、上記 _PTN24- 15で大腸菌を形質転換させ、得られた形質転換体 DH10B (PTN24-15) を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（FERM P- 13953) 。さらに、平成 6年 1 0月 2 7日付で原寄託から国際寄託に移管した（FERM BP- 4848)。

(実施例 6 ) ノーザンハイプリダイゼーシヨン

mRNA分離キット（フアルマシア）を用い、 dlOS、 dlOS- 2、ラット各組織（脳、肺、心臓、肝臓、小腸、腎臓、卵巣、精巣、骨格筋）および細胞（脾細胞、胸腺細胞）から poly(A)RNAを調製した。 50%ホルムアミド中で 65てで 5分間加熱し RN A を変性させ、 6. 6 %のホルムアルデヒドを含む 1. 5%ァガロースゲルで電気泳動を行い、ニトロセルロースあるいはナイロン膜（シュライヒヤーアンドシユエル（Schleicher and Schuel l)社）に転写させた。

プローブとして、実施例 4で得られた PTN24- 15の 43〜967 の DNA配列（配列表の配列番号 42) を含む 925bp の 2本鎖 DNA フラグメントを PCR により調製し、ランダ厶プライマーラベリングキット（ベ一リンガーマンハイム社）によつて^{3 2} P標識した。ヒト EF 1 ひの cDNA (ゥェツキ T. (Uetsuki T. ) 等、 J. Biol. Chem. , 264巻、 5791-5798 頁、 1989年) の 1. 8kbpの長さを有する BamHI フラグメントの^{3 2} P標識物を、コントロールプローブとして使用した。ハイブリダィゼーション操作は、ハイストリンジエンシー (high stringency ) の条件下でサ厶ブノレック J. (Sambrook J. )らの方法 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク（New York), 1989年) を用いた。図 4には、 dlOS、 dlOS-2. dl OS— 16各細胞を PMA とィオノマイシンで刺激した場合と刺激しない場合の、ノーザンハイブリダィゼ一シヨンの結果を示した。図 4から明らかなように、 dlOSから得た poly(A)RNAは、約 2. 0kbpの弱いハイプリダィゼ一シヨンバンドを示した。このバンドのシグナルの強さは、 PMAゃィオノマイシンで dlOS細胞を刺激すると増加する。 dlOS- 2細胞は、 PMAとィオノマイシンで刺激した dlOSよりも約 4倍強いシグナルを示し、 dlOS- 2細胞では Fasリガンド mRNAの発現量が PMA とィオノマイシンで刺激した dlOS細胞よりも、約 4倍高いことが示唆された。

また、実施例 2の操作を 16回繰り返して得た dlOS— 16細胞では、 mRNA発現量は dlOS細胞よりも約 100 倍多かった。 dlOS - 16の細胞障害活性は、 dlOS細胞より 100倍高く、 Fasリガンド mRNA発現量の増加は、細胞障害活性、 mFas - Fcで染色される強さと正の相関関係にある事が分かった。

図 5には、ラットの脾臓および胸腺より調製した脾細胞、胸腺細胞の調製直後 (培養前）、刺激剤なしで 37°Cで 8時間培養後（未処理）、各刺激剤を加えて 37 でで 8時間培養後のノーザンハイブリダイゼーションの結果を示した。ラットの脾細胞では、 Fasリガンド mRNAの弱い発現が認められた。ラット脾細胞を PMAとィオノマイシン、もしくは ConAと IL- 2で 8時間刺激した時、 Fasリガンド mRNAの量は著しく増加した。ラット胸腺細胞では、培養前及び未処理の場合 Fasリガンド mRNAは、ほとんど発現していなかった。しかしながら、ラット胸腺細胞を PMA とィオノマイシン、もしくは ConAと IL-2で刺激すると、 Fasリガンド mRNAの発現量は、脾細胞におけるそれと同等にまで増加した（図 5 )。

ラットの各組織における Fasリガンド mRNAの発現量を調べた結果を図 6に示す。図 6に示したように、精巣に於いて約 2. Okbpの強いシグナルを有するバンドが確認された。小腸、腎臓、肺では、普通もしくは弱いシグナルを有するバンドが確認されたが、その他の組織では Fasリガンド mRNAの発現は認められなかつた。

なお、すべての mRNAがインタクト（intact) であることは、ヒト EF 1 ひの cDNA プローブと再ハイブリダィゼ一シヨンした全ての細胞および組織において、 1. 8k bpのバンドが認められたことから明らかである（図 4、 5および 6の下段）。 (実施例 7 ) Fasリガンドの生化学的解析

dlOS— 12細胞で発現している Fasリガンド及び pTN24- 15で形質転換させた COS -7細胞で発現している Fasリガンドの生化学的性状を検討した。

dlOS— 12細胞は、実施例 2の操作を 12回繰り返して得られた細胞集団である。まず、 dlOS— 12あるいは PTN24-15で形質転換させた C0S-7細胞の細胞表面蛋白を D—ピオチニル一 ε —アミノカプロン酸 Ν—ヒドロキシサクシニミドエステル (biot in-CNHS-ester、ベ一リンガーマンハイム社）用いるマイヤー（Meier ) らの方法でピオチン化した（Anal. Biochem. , 204巻、 220-226頁、 1992年）。なお、 PTN24-15で形質転換させた C0S-7細胞の対照として、外来遺伝子を含まない PCEV4ベクターで形質転換させた C0S-7細胞を用いた。細胞（7. 5 X 10⁶ 個）を 1 mlのライシスバッファー（ 1 %NP— 40、 50m Tri s-HCl ( pH 8. 0) 、 150mM NaCK 1 mM ( p —ァミノフエ二ル）メチルスルホニルフロライド塩酸塩（APMSF)、 1 z g/mlぺプスタチンおよび l mMロイぺプチンを含む）中に加え氷上で 30分間ィンキュベーシヨンし、細胞を溶解させた。

14, OOOrpmで 15分間遠心操作を行った後、上清を 10〃g/mlの hTNFR /3— Fcと氷上で 60分間ィンキュベ一ションし、さらに 5 %液量のプロティン A—セファロース 4Bと、 4 °Cで 60分間インキュベーションした。プロテイン A—セファロース 4B を除去したのち、上清に 10〃g/mlの mFas— Fcを加え、氷上で 60分間インキュベーシヨンした。 1 %液量のプロテイン A—セファロース 4Bをこの混合物に加え、 4 °Cで一夜ィンキュベ一シヨンした。遠心操作の後、沈降物をライシスバッファーで洗浄し、 5 %の 2 —メルカプトエタノールを含む 20 1のラエ厶リ（Lae圃 l i) の試料用緩衝液（2 %SDS、 10%グリセリンおよび 0. 002 %ブ口モフヱノールブ b-(BPB, Bromophenol blue)を含む 62. 5mM Tris-HCl (pH6. 3)) .に再懸濁し、 95°C で 2分間加熱した。次いで、 0. 1 %SDS を含む 10—20%グラジェントポリアクリルアミドゲルを用いてグラジェントゲル電気泳動を行い、 PVDF膜へ転写し、 ECL システム（アマ一シャム社）で検出した。

図 7に、 mFas— Fcと dlOS— 12、 COS- 7/pCEV4 または COS- 7/pTN24- 15との免疫沈降の結果を示す。図 7に示したように、 mFas— Fcは、 dlOS— 12細胞ライセート中の分子量約 40, 000の蛋白質と免疫沈降し、一方、 PTN24-15で形質転換させた COS - 7細胞（COS- 7/pTN24-15) からのライセート中では分子量約 37， 000— 45, 000の蛋白質とともに免疫沈降した。外来遺伝子を含まない PCEV4ベクターで形質転換させた COS- 7細胞（C0S-7/pCEV4)では、免疫沈降物は認められなかった。

PTN24- 15で形質転換させた COS- 7細胞と d 10S— 12細胞で免疫沈降した蛋白質の分子量は、いずれも前述したアミノ酸配列より推定される分子量よりも大きかつた。これら 2つの細胞間での分子量の差、およびアミノ酸配列から推定される分子量との差は、 4つある N—グリコシレーシヨンサイ卜のいくつかにおいてグリコシレーシヨンに違いが生じているためと考えられた。 (実施例 8 ) Fasリガンドの細胞障害活性の測定

( 1 ) ェフエクタ一細胞による細胞障害活性の測定

dlOS細胞および PTN24-15で形質転換させた C0S-7細胞の、細胞障害活性を、 W4 細胞（ォガサワラ J. (Ogasawara J. ) 等、 Nature、 364巻、 806-809 頁、 1993年）をターゲット細胞として測定した。 W4細胞は、マウス Fas抗原を発現させるようにマウス WR19L細胞を形質転換させた細胞である。この WR19L細胞は、マウス Fas抗原を殆んど発現せず、 ΤΝ の細胞障害作用に感受性の細胞である。

細胞障害活性の検定は、ルービエ E. (Rouvi er E. ) 等の方法に準じて行つた（J. Exp. Med. , 177巻、 195-200頁、 1993年）。

まず、 dlOS細胞 (2.5〜5 X 10⁵ 細胞/ ml)を、 10ng/ml の PMA (シグマ社) およびカルシウムィオノフォアであるィオノマイシン（カルビオケム社） 500ng/ml が添加された 10%FCS 含有 D- MEM 中で、 37°Cで 3時間インキュベーションした後、 D-MEMで洗浄し、エフェクター細胞とした。また、 COS- 7細胞を PTN24-15 で DEAE—デキストラン法で形質転換し、エフヱクタ一細胞とした。一方、 100^ 1の 10 FCS を含む RPMI 1640中で、 20 Ciの [^{5 1} Cr] クロム酸ナトリウム (アマ一シャム社）と共に 1 X 10⁶ 個の WR19し細胞あるいは W4細胞を 37°Cで 2時間インキュベートした。培養液（RPMI 1640) で洗浄した後、これらの細胞を標的細胞として使用した。

dlOSをエフェクタ一細胞とし、 WR19Lまたは W4を標的細胞としたときの特異的細胞障害活性を図 8に示した。また、エフヱクタ一細胞を C0S/pTN24-15、 COS/ PCEV4 としたときの特異的細胞障害活性を図 9に示した。標的細胞 1 X 10⁴ 個とエフェクター細胞とを、さまざまな比で丸底のマイクロ夕イタ一プレー卜の各ゥエル中で混合した。このとき全液量が計 200 / 1になるようにした。 700rpmで 2分間、プレートの遠心操作を行ったのち、 37°Cで 4時間インキュベーションした。さらに、 l，200rpmで 5分間、プレートの遠心操作を行い、各ゥヱルより上清 100 1を分取して 7カウンターを用いて放射活性を測定し、特異的細胞溶解率を算出した。

^{5 1} Crの自然放出は、培地のみで標的細胞をィンキュベーシヨンすることにより決定し、一方、最大放出量は、標的細胞に 0. 1 %となるようにトライトン X100を加えることにより決定した。また、特異的細胞溶解率は次の式により計算した。実測の^{5 1} C rの放出量一⁵ ' C rの自然放出量

特異的細胞溶解率 =

5 1 C rの最大放出量一⁵ ' C rの自然放出量

図 9に示したように、 pTN24- 15で形質転換させた C0S-7 細胞（C0S/pTN24 -15)は、 W4細胞を溶解させた力外来遺伝子を含まない pCEV4ベクターで形質転換させた COS- 7細胞（C0S/pCEV4) では、 W4細胞の溶解は認められなかった。 PTN24-15で形質転換させた COS- 7細胞 (C0S/pTN24- 15)と、 dlOS細胞の細胞障害活性を、 W4細胞に対する E/T (エフェクター細胞/標的細胞）比で比較すると、前者は後者に比べ少なくとも 10倍高い活性を有していた。また、 dlOS細胞および pT Ν24- 15で形質転換させた COS- 7細胞（ C0S/pTN24- 15 ) は、ともに W 19L細胞に対しては細胞障害作用を示さなかった（図 8、 9 ) 。 ( 2 )細胞の培養上清の添加による細胞障害活性の検討

図 10に、 C0S/PTN24- 15 または C0S/pCEV4の培養上清を種々の濃度で添加したときの標的細胞（W4，WR19し）に対する細胞障害活性を示した。

PTN24-15で形質転換させた COS- 7細胞 (C0S/pTN24_15)の培養上清の細胞障害活性をみたところ、 W4細胞に対し顕著な細胞障害活性が認められたが、 WR19し細胞に対しては細胞障害活性は認められなかった（図 10) 。これは、 COS- 7細胞上で発現されたリコンビナント Fasリガンドが切断され、可溶型になっていることを示す結果である。

( 3 ) mFas— Fcおよび hTNFR /S— Fcによる細胞障害活性の阻害

さらに、 mFas— Fc、 hTNFR S— Fcをアツセィ系に加えて、エフェクター細胞による細胞障害活性の変化を検討した。この結果を図 1 1に示す。

図 11に示すように、 Fasリガンドを発現する COS- 7細胞 (C0S/PTN24- 15)の細胞 P章害活性は、 dlOS細胞と同様に、 10〃g/mlの mFas— Fcで阻害され、 10〃g/mlの hT NF yS—Fcでは阻害されなかった。

(実施例 9 ) 染色体 DNA のフラグメンテーションについての検定

24ゥヱルプレート内の 8 X 10⁴ 個の COS- 7細胞を、 10 z g の pTN24- 15で形質転換した。トランスフエクトの 72時間後、 2 X 10⁵ 個の WR19L細胞あるいは W4細胞 (ォガサワラ J. (Ogasawara J. ) 等、 Nature, 364巻、 806-809頁， 1993年) をゥエルに加え、 10%FCS を含む RPMI 1640中 37°Cで、 1〜 3時間インキュベーションした。 WR19Lまたは W4細胞のうち、ゥエル内壁に付着しない非付着細胞を集め、レイ一ド P. W. (Laird P. W. ) らに準じて染色体 DNA を調製し（Lai rd P. W. 等、 Nucleic Acids Res.， 19巻、 4293頁、 1991年) 、 0. 5 /z g/mlの臭化工チジゥム存在下でァガロースゲルを使用して電気泳動を行った。

上述の WR19Lまたは W4細胞の染色体 DNAの電気泳動の結果を図 12に示した。図 12から明らかなように、 pTN24- 15で形質転換させた C0S-7細胞（COS/pTN 24- ）とコカルチャーした W4細胞では、染色体 DNA力、アポトーシスの特徴であるステップラダー様式 (step-ladder fashion ) でフラグメント化していた。

DNAのラダーは、インキュベーション後 1. 0 時間で観察され、インキュベーション後 2時間で、ほとんどの DNAが断片化してしまつた。

このような DNAのフラグメント化は、外来遺伝子を含まない PCEV4で形質転換させた C0S-7細胞とコカルチャーした W4細胞では認められなかった。さらに、このような DNAの断片化はターゲット細胞に用いた W4細胞および WR19L細胞のうち W4細胞でのみ確認され、 WR19L細胞では確認されなかった。

(実施例 10) ァフィ二ティークロマトグラフィーを用いた Fasリガンドの精製

( 1 ) 細胞表面蛋白質のピオチン化

以下で、トレーサー蛋白質として使用するため、マイヤ一（Meier)等の方法（Anal. Biochem. , 204巻、 220頁、 1992年）に従って細胞表面のピオチン化を行った。すなわち、 dlOS- 12細胞を 50〃g/mlの NHS— LC—ピオチンを含む 10mM ホウ酸ナトリウム緩衝生理食塩水で、 1 X 10⁷ 細胞/ ml になるように懸濁し、室温で 15分間インキュベートした。最終濃度が 10m になるように塩化アンモニゥ厶を添加し、反応を停止後、 150mMの NaClを含む 50mM Tris-HCl (pH8. 0、以下 TBS と略す）で 3回洗浄し、細胞表面蛋白質をピオチン化した。

( 2 ) mFas— Fcァフィ二ティーカラムの調製

実施例 1で作製したキメラ蛋白質 mFas— Fcの精製標品 4 mgを 4 mlの PBS(pH7. 4) に溶解した後、 2 mlのプロテイン A—セファロ一ス 4Bと混合し、 4 °Cで 1時間結合させた。遊離の蛋白質を除去するため、樹脂を TBSで 3回、次に 200mのホウ酸ナトリウム溶液 (PH9. 0) で 1回洗浄した。さらに、ジメチルビメリミディト（D MP) を含む 200mM.ホウ酸溶液（pH9. 0) で室温 45分間インキュベートすることにより、樹脂に mFas— Fcを共有結合させた。

( 3 ) Fasリガンドの精製

実施例 2の操作を 12回繰り返して得られた dlOSのサブライン、 dlOS— 12を、 50 nMの 2 —メルカプトエタノールと 20mllfへぺス（pH7. 4) を添加した 10%FCS含有 D- MEMを培地を用いて、 37°Cにて、 10本のローラ一ボトルで培養した。細胞密度が 2 X 10⁵ 細胞/ ml に到した時点で 10ng/ml の PMAと 500ng /ml のィオノマイシンを添加し、さらに 4時間インキュベートした。

培養後の細胞浮遊液を 250 x g で 20分間遠心後ペレツトを回収し、 PBS で 3回、 TBSで 1回洗浄した。ペレツトの状態で、 — 80°Cで保存し、以下の細胞膜画分の調製に使用した。また、一部を（ 1 ) の細胞表面蛋白質のピオチン化に使用した。

凍結した細胞ペレツトは 4倍量の I mMの p—アミノフエ二ルメタンスルフォ二ノレフルォライトノヽィドロクロライド (p— aminophenyl methanesulfonyl f 1 uoride hydrochloride, APMSF ) 、 1 g/mlぺプス夕チン、 1 g/mlロイべプチンおよび 0. 02% NaN₃ を含む 0. 3 Mショ糖溶液中で、ウルトラートラックス T25 (Ul tra-Turrax T25, ヤンクゥントクンケル、スタウフェン（Janke & Kunkel, Staufen)社）を用い、ブルーポジションで、氷上で 2分間、破砕した。 1. 000 xgで 20分間、 4 °Cにて遠心し、核および破砕されていない細胞を除去した。次に上清を 100, 000 xgで 90分間、 4 °Cにて遠心し、膜分画を得た。この膜分画を 40mlのライシスバッファー（ 1 %NP— 40、 1 mill APMSF, 1 // g/mlぺプスタチンおよび 1 g/mlロイぺプチンを含む TBS ) に溶解し、 4 °Cでー晚振とうし可溶化した。可溶化した膜分画を 100, 000 x で 60分間、 4 °Cにて遠心し、上清を一 80°Cで保存した。細胞表面タンパクをピオチン化した細胞も同様に処理し、一 80°Cで保存した。

Fasリガンドのトレーサーとして可溶化した膜分画 100mlに、ピオチン化した細胞からの可溶化膜分画 10mlを添加した。その混合物を 1 %NP— 40を含む TBS で平衡化した mFas— Fcカラム（1. 4ml)にアプライした。

カラムを 1 %NP— 40を含む TBS 50mlおよび 0. 1 %NP— 40を含む TBS 50mlで洗浄後、 1 M NaCl および 0. 1 %NP— 40を含む 50mM Tris- HCKpH8. 0)で Fasリガンドを溶出した。

l mlづっフラクションを集め、各フラクションの 10〃 1を SDS-ポリアクリルァミド電気泳動 (SDS-PAGE)に供した後、 PVDF膜に転写した。ピオチン化した蛋白質は、 HRP0標識ストレプトアビジンと反応させて染色し、使用説明書通りに ECレンステ厶（アマ一シャム社）で検出した。

40kDのピオチン化 Fasリガンドを含む画分をプールし、 10〃 1の ConA—ァガロースビーズ（E Y ラボラトリーズ社）と 4でで 1晚インキュベートした。 0. 1 %^— 40を含む丁8 3で4回洗浄後、 0. 1 %NP— 40および 2 M ひ—メチルマンノシドを含む PBS 200 1で Fasリガンドを溶出し、精製 Fasリガンドを得た。 ( 4 ) SDS-PAGE

( 3 ) で得た精製 Fasリガンドを用いて 0. 1 %SDS を含む 10— 20%グラジェントポリアクリルァミド電気泳動を行レ、、シルバースティ二ングキット（和光純薬工業（株））で染色、あるいは PVDF膜に転写後、 ECLシステムでバンドを検出した。 Fasリガンド精製の結果を図 13に示す。図中、レーン 1は、銀染色の結果を、レーン 2は EC1システムでの検出結果である。

図 13に示したように、精製された Fasリガンドは銀染色および ECLシステムでともに非還元下、分子量約 40kDの 1本のバンドとして検出された。

( 5 ) 細胞障害活性

実施例 8の方法に従って、精製 Fasリガンドの細胞障害活性を測定した。ただし、これまでの細胞障害活性でェフエクタ一細胞として用いられた dlOS細胞および PTN24- 15で形質転換させた COS- 7細胞の代わりに、（3 ) で得られた精製 Fas リガンドを使用し、標的細胞である W4細胞および WR19し細胞に対する特異的細胞溶解率を指標として、細胞障害活性を測定した。精製された Fasリガンドの細胞障害活性の検討結果を図 14に示す。

図 14より明らかなように、 Fas抗原を発現していない WR19し細胞に対しては細胞障害活性は認められなかったが、 Fas抗原を発現している W4細胞に対しては濃度依存的な細胞障害活性が確認された。

(実施例 1 1) ラット Fasリガンド DNA の一部を使用したスクリーニング

( 1 ) ヒト染色体 DNA ライブラリーのスクリーニング

ヒト（胎盤）染色体 DNA ファージライブラリー（EMBL3 SP6 /T7 、クローンテック（Cl ontech)社）を指示菌（菌名 VCS257) に感染させ、軟寒天と混合し、寒天プレートに重層した。 37°Cにて一晚インキュベーションし、ファージブラークを形成させた。これを一旦、 4 °Cで約 4時間冷却し、その後、ファージをニトロセルロースフィルターに転写した。

—方、実施例 4で得たプラスミド pTN24- 15を铸型として、センスプライマ一 4 (AGAACTCCGTGAGTTCACCA)およびアンチセンスプライマ一 4 (CAATATTCCTGGCATCCAT G)配列（配列表の配列番号 43および 44) を用いて PCR を行い、ラット Fasリガンド cDNAの細胞外領域をコードする cDNA (配列表の配列番号 25の塩基番号 400 から 967番）を増幅させた。ランダムプライマーラベリングキット（ベーリンガーマンハイム社）を使用して実施例 6の方法で増幅産物を^{3 2} P標識して、プローブ 1

(配列表の配列番号 45) を作製した。配列表の配列番号 25の 5'末端側、すなわち配列表の配列番号 25の塩基番号 43から 233を PCR により増幅させ、得られた増巾 i 産物を上述のように^{3 2} P標識して、プローブ 2 (配列表の配列番号 46) を作製した。

ショウ (Shaw) 等の方法 (Nucleic Acids Res. , 11巻， 555-573頁、 1983年) を一部改変して、上記の各プローブとニトロセルロースフィルターとをハイプリダイゼ一シヨンさせた。すなわち、フィルターを、 65°Cでー晚、 0. 1 %SDS を含む 3 XSSCで洗浄し、次いで、 50%ホルムアミド、 5 Xデンハルト溶液、 0. 1 % SDS 、 250 zg/mlの変性サケ精子 DNA を含む 5 xSSCP中で、 42°C、 5時間プレハイブリダィゼ一シヨンした。次に、 50%ホルムアミド、 1 Xデンハルト溶液、 0. 1 %SDS 、 100 〃g/mlの変性サケ精子 DNA、 10%(w/v) デキストラン硫酸を含む 5 XSSCPに上述のプローブを 1. 1 x l0⁶cpm/ml となるように添加し、前記フィルターを 28。Cで 18時間ハイブリダイゼーションさせた。 0. 1 %SDS を含む 2 xSSCPを用い、室温で 2回フィルターを洗浄し、次いで、 0. 1 %SDS を含む 0. 3 XSSCPを用い、 37°Cで 3回洗浄した。オートラジオグラフィ一を行ったところ、複数のポジティブクローンが検出された。

( 2 ) ポジティブクローンの解析一 1

プローブ 1 とのハイブリダイゼ一ションで得られたポジティブクローンのうち 2つのクローン、 λ hFL4および λ hFL7から、公知方法（サムブルック (Sambro ok «I. )等、 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. , Cold Spring H arbor Laboratory, ニューヨーク（New York), 1989年参照）でファージ DNA を調製した。クローン； I hFUおよび； l hFL7中には、それぞれ 18kbp、 17kbp のヒト染色体 DNA を含んでおり、制限酵素マップを作成した結果、互いに重複した範囲を含んでいる事が分かった。

配列表の配列番号 25の塩基配列中の 524 番目から 967番目に相当する DNA断片 (配列表の配列番号 47) を実施例 4で得られたプラスミド PTN24- 15から調製し、実施例 6の方法で^{3 2} Pで標識してプローブ 3とした。クローン； I hFL4と λ hFL7を数種の制限酵素で切断した後、上記プローブ 3を使用してサザンハイプリダィゼ一シヨンを行った。その結果、クロ一ン；11^し4と；1 卩し7中の2. 81^ の 11(111 I フラグメント力、当該プローブ 3とハイブリダィズすることが確認された。クローン； l hFL4から DNA を調製し、 Hindi I I で消化した。得られた 2. 8kb のフラグメントを、 Hindl l l で切断した pBluescript KS(+) に組み込み、プラスミド pBL-hFL4H と命名した。 pBL- hFL4H 中の DNA配列を DNA シーケンサー（370A型、パーキンエルマ一ジャパン（株））を使用して解析したところ、当該プラスミドには、ヒト Fasリガンドの細胞外領域の C末端側の 130 アミノ酸をコードする DN Aを有する DNA配列が含まれていることが確認された。結果を、図 15と配列表の配列番号 26に示した。図 15中、 5'末端より数えて 12番目まではイントロンである。ェクソン部分は 13番目の Gから始まっており、 405番目から 407番目の配列 TAA は終止コドンである。

実施例 5で解析した pTN24- 15の塩基配列と比較し、図 15にはヒト Fasリガンドと異なるラット Fasリガンドのァミノ酸残基および塩基のみに下線をつけて示した。ここで配列を確認した部位は、配列番号 25の塩基番号 514番目から 910番目の塩基配列と高いホモロジ一を有しており、塩基配列で 86. 7%.、アミノ酸で 81. 5 %のホモロジ一を有していた。

なお、ハナハンの方法に準じてプラスミド pBL-hFL4Hで大腸菌 DH10B を形質転換させ、得られた形質転換体、大腸菌 DH10B(pBL-hFL4H)を、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（FERM P-14014) 。さらに、平成 6年 1 0月 2 7日付で、原寄託から国際寄託に移管した（FERM BP-4849) 。また、；\ hFL4由来の BamH I フラグメントを pBluescript KS(+) の BaraHI サイトに組換えて得たプラスミド pBい hFUBlには、ヒト Fas リガンド遺伝子のェクソン 3と上述した 130 アミノ酸をコードするェクソン 4が含まれていることが確認された。

( 3 ) ポジティブクローンの解析一 2

プローブ 2とのハイブリダイゼ一ションで得られたポジティブクローンのうち 1つのクローン； I hFし 5から、同様に、ファージ DNAを調製した。このクローン中には 18kbpのヒト染色体 DNAが含まれていることが確認された。クローン； l hFL5 から DNA を調製し、 BamHI で消化した。得られた 4. 4kbp のフラグメントを、 Ba mHI で切断した pBluescript KS(+) に組み込み、プラスミド pBL- hFL5Blと命名した。 pBL-hFL5Bl中の DNA 配列を DNA シーケンサ一を使用して解析したところ、当該プラスミドには、ヒト Fasリガンドの細胞内領域を含む 131 アミノ酸をコードする DNA を有する DNA配列が含まれていることが確認された。得られた塩基配列を、 pTN24- 15の塩基配列と比較し、プロモ一夕一領域、イントロン、ェクソンを決定した。また、プラスミド pBし- hFL5Blには、上述した 131 アミノ酸をコードするェクソン 1 とともに、ェクソン 2も含まれていることが確認された。

( 2 ) および（3 ) で得られた結果をまとめて、図 16〜18および配列表の配列番号 27に示した。図中で示した部位は、配列未確認の塩基配列である。ヒト Fasリガンドに対する染色体遺伝子は、 4つのェクソンよりなる。すべてのスプライシングドナーサイトとァクセプ夕ーサイトは、 GT—— AGルール（パジエツト（Padgette)等、 Annu. Rev. Biochei 55 巻、 1119 - 1150 頁、 1986年) に適合しており、スプライシングサイトに隣接する塩基配列は、他の遺伝子に見られるスプライシングサイトの塩基配列とよく一致している。

(実施例 12) ヒト Fasリガンドをコードする cDNAのクローニングおよび発現

( 1 ) ヒト Fasリガンド cDNAの PCR によるクローニング

ヒト末稍血より T細胞を採取し、 10%FCS、 50〃Mの S—メルカプトェタノ一ノレ、 20ng/ml の IL- 2を含む RPMI 1640培地（日水製薬 (株) ) に、 2 X 10⁶ 細胞/ m 1 となるように懸濁し、 37°Cでー晚培養した。次いで、 ConAを 5 となるように加え、 37°Cでさらに 4日間培養した。死細胞をヒストパック 1083 (シグマ社）を用いた密度勾配遠心で除き、 mRNA調製キット（フアルマシア社）を用いて poly (A)RNAを調製した。カワサキ E. S.等の方法（Kawasaki E. S. , Ampl if icat ion of 腿 in PCR Protocols. A Guide to Methods and Ampl if icat ions. , M. A.イニス（M. A. Innis)等編，アカデミック出版 (Academic Press), サンディエゴ (San Diego), 21- 27頁、 1990年）に従い、以下のように一本鎖 cDNAの合成および PCR を行った。

まず、センスプライマー 5 (GCTCTAGACTACAGGACTGAGAAGAAGT) およびアンチセンスプライマー 5 (GCTCTAGAACATTCTCGGTGCCTGTAAC) を作製した（配列表の配列番号 48および 49) 。このセンスプライマ一は、 ATG 開始コドンの上流域と 5'末端の Xbalサイト（GCTCTAGA) を含んでいる。一方、アンチセンスプライマーは TAA 終始コドンの下流領域と Xbalサイト（GCTCTAGA) を含んでいる。

先述の poly(A)RNA 1 fi g に、 50ngのランダムへキサマー、 200 ュニットの MM LV RNase H" リバーストランスクリプターゼ（ギブコ BRL社）を添加し、逆転写反応させた。この反応液 2. 0 1を、先述のセンスプライマー、アンチセンスプライマ一をそれぞれ 100 pmolと 4 xdNTPと Taq DNA ポリメラ一ゼを含む PCR バッファー 100 1で希釈した。 DNA サーマルサイクラ一（DNA thermal cycler. パ一キン一エルマ一（Perkin- Elmer) 社）を使用して、 PCR を行った。なお、 PC R は； 94°C、 1分； 55°C、 2分； 72 、 3分を 1サイクルとする反応を 20サイクル行った。

得られた PCR 産物を、制限酵素 Xbalで消化した後、 1 %ァガロースゲル（口一ゲルテンペレ一チヤ一（Low Gel Temperature), バイオラッド（BioRad)社）で分離した。約 970bp の DNA フラグメントをゲルより回収後、 pBluescript I Iの Xbalサイ卜に組み込み、プラスミド pBX- hFLlと命名した。 pBX-hFLl中の DNA 配列を DNA シーケンサ一を使用して確認した。当該プラスミドに含まれる 970bp の DN A フラグメントの塩基配列は、実施例 11で得られたヒト染色体遺伝子の配列と一致することが確認された。クローン pBX-hFい中の塩基配列の解析結果を配列表の配列番号 31および図 19〜20に示す。

ヒト Fasリガンドは、ラット Fasリガンドと同じく、 N末端にシグナル配列を持たないが、タンパク分子の中央部分に 22個の疎水性アミノ酸を有し、 I I型膜夕ンパクであることがわかった。細胞内領域は Met から始まる 80アミノ酸からなり、プロリンが 80残基中に 32含まれる。 C末端細胞外領域は 179 アミノ酸からなり、 3箇所の N—グリコシレ一シヨンサイト（Asn- X-Ser/Thr)が存在する。ハナハンの方法（既出）に準じて、プラスミド pBX- hFLlで大腸菌 DH10B を形質転換し、得られた形質転換体、大腸菌 DH10B (pBX- hFLl)を工業技術院生命工学ェ業技術研究所に寄託し（寄託番号 FERM P-14225 ) 、さらに、平成 6年 1 0月 2 7日付で原寄託から国際寄託に移管した（寄託番号 FERM BP-4850 ) 。

( 2 ) COS細胞への導入

( 1 ) で得られた 970bp の Xbal DNAフラグメントを動物細胞発現ベクター pEF - B0S (ミズシマおよびナガ夕（Mi zushima & Nagata) , Nucl ei c Aci ds Res. , 18巻、 5322頁、 1990年) の Xbal部位に挿入し、プラスミド pEX-hFLlと命名した。 10%FCS を含む D-MEM培地に、 COS- 7細胞を 10cmシャーレ当り 2 X 10⁶ 細胞となるように植え込み、 5〃g のプラスミド pEX- hFLlを DEAE—デキストラン法（フクナガ R. (Fukunaga R. )等、 Cel l, 61巻、 341- 350頁、 1990年) で導入し、形質転換体 COS/pEX-hFLl を得た。

( 3 ) 形質転換体の細胞障害活性

( 2 ) で形質転換させた COS細胞をエフェクター細胞とし、 10 ^e の WR19L または WC8A細胞をターゲット細胞として、実施例 8と同様に、組換え細胞の細胞障害活性を確認した。 WC8A細胞は、マウス WR19L細胞をヒト Fas抗原を発現するように形質転換した細胞である（I toh N. 等、 J. I隱 unoし 151巻、 621-627頁、 19 93年）。すなわち、 10⁶ の WR19L または WC8A細胞を、 20〃の [^{5 I} Cr] クロム酸ナトリウム（アマ一シャム (Amersham)社）を含む RPM I I 640培地で、 37°Cで 2時間培養し、 ⁵ ' Crで標識した。

この^{5 1} Crで標識した細胞（1 X 10⁴ ) を、 COS/pEX- hFLl と様々な割合で混合し、 37°Cで 4時間培養後、 ^{5 ]} Crの遊離を指標に細胞障害活性を測定した。この結果を図 21に示す。

図 21に示すように COS/pEX- hFLl は WC8A細胞に対しを濃度依存的に細胞障害活性を示した。 WR19しに対してはアポト一シスは誘導しなかった。さらに、 COS/p EX- FLl の細胞障害活性を調べた結果を図 22に示す。この細胞障害活性は、実施例 1で作製したヒト Fas抗原の細胞外領域を含むキメラ蛋白質（hFas— Fc) あるいはマウス Fas抗原の紬胞外領域を含むキメラ蛋白質（iriFas— Fc) を添加することにより阻害された力可溶型のヒト TNF レセプター（hTNFR yS— Fc) を添加しても阻害されなかった（図 22) 。

以上の結果より、（ 1 ) で単離した 970bp の cDNAによりコードされる蛋白質は、 Fas抗原と結合してアポトーシスを誘導する活性を有する Fasリガンドであることが確認された。

(実施例 13) マウス Fasリガンド染色体遺伝子の単離

129 /Sv マウス染色体 DNA を; I FIX Πベクターに導入して作成したマウス染色体 DNA ライブラリ一（ストラタジーン（Stratagene) 社、ラホヤ（La Jol la), CA ) ) を指示菌に感染させ、軟寒天と混合し、寒天プレートに重層し、 1. 3 X 10⁶ 個のプラークを得た。これを一旦 4 °Cで約 4時間冷却し、ファージをニトロセルロースフィルターに転写した。

実施例 11で得たプラスミド PTN24-15を铸型として、センスプライマ一 4 (AGAAC TCCGTGAGTTCACCA)およびアンチセンスプライマー 4 (CAATATTCCTGGCATCCATG)配列を用いて PCR を行い、細胞外ドメインをコードする cDNA (配列表の配列番号 25の塩基配列の塩基番号 400から 967番）を増幅させた。ランダムプライマーラベリングキット（ベーリンガーマンハイム社）を使用して実施例 6の方法で増幅産物を^{3 2} P標識して、プローブ 1を作製した。また、配列表の配列番号 25の 5'末端側、すなわち配列表の配列番号 25の塩基番号 43から 233 を PCR により増幅させ、上述のように^{3 2} P標識して、プローブ 2を作製した。

プローブ 1および 2をそれぞれ、ニトロセルロースフィルターとハイブリダイゼーシヨンさせた。ハイプリダイゼーシヨンの条件は後述する実施例 16と同様の穏やかな条件で行った。すなわち 33°Cで 18時間ハイプリダイゼーシヨンした後、フィルターを室温にて 0. 1 %SDS を含む 2 xSSCPで 2回洗浄した後、 37での 0. 1 %SDS を含む 0. 3 xSSCPで洗浄した。オートラジオグラフィーを行ったところ、 2つのポジティブクローンを得た（； MFL5, A FL18 ) 。ポジティブクローンのプラークを単離し、 pBluescript I I KS(+) (ストラタジーン（Stratagene)社) にサブクローニングした後、挿入されているマウス染色体 DNA の制限酵素地図の作成、 DNA シーケンサーを使用して塩基配列を決定した。

この 2クローンについて制限酵素地図を作成し、サザンハイブリダイゼーション解析したところ、 i MFL5, UIFL18 は、それぞれ Fasリガンド染色体遺伝子の 5'、 3'領域を有していた。また、ラット Fasリガンド cDNAと相応する領域、プロモーター領域の塩基配列を決定したところ、決定された塩基配列は、ラット Fas リガンド cDNAと高い相同性を示し、クローニングされた； FIX I Iベクターに組み込んだ DNAがマウス Fasリガンド遺伝子を含むことがわかった。

図 23〜24に、マウス Fasリガンド遺伝子のプロモータ一、ェクソン、 3'フランキング領域の塩基配列を示した。 TATA boxから 107bp 下流の ATG開始コドン力、ら 837bp のオープンリーディングフレームがあり、 279 アミノ酸（アミノ酸部分の分子量 31， 440) をコードしている。マウス Fasリガンドは、ラット Fasリガンドと同様 N末端にシグナル配列を持たないが、夕ンパク分子の中央部分に 22疎水性アミノ酸を有していた。これにより、マウス Fasリガンドは I I型膜タンパクであることが明らかになった。細胞内領域は 78ァミノ酸からなりプロリンが 78残基中 25含まれる。 C末端細胞外領域は 179 アミノ酸からなり、 5箇所の N—グリコシレーシヨンサイト（Asn-X-Ser /Thr) が存在する。

また、マウス Fasリガンド cDNAは、ラット Fasリガンド cDNAと塩基配列で 90. 6 %、ァミノ酸配列で 91. 4%の相同性を持ち、 3'ノンコーディング領域で 84. 5%の相同性を持つことが確認された。

(実施例 14) マウス Fasリガンドをコードする cDNAの PCR によるクローニングおよび発現

( 1 ) プラスミド pBL- MFLW4 の調製

野生型（C3H +/ +) マウスの脾臓細胞を、 10%FCS 、 50〃Mの ^一メルカプトエタノール、 1. 5 ； z g/mlの ConA、 20ng/ml の IL-2を含む RPMI 1640培地 (日水製薬（株））に、 2 X 10⁶ 細胞/ ml となるように懸濁し、 37°Cで 2日間培養した。 10ng/ml の PMA 、 500ng /ml のィオノマイシンで 4時間処理した後、死細胞をヒストパック 1083 (シグマ社）を用いた密度勾配遠心で除き、 mRNA調製キット（フアルマシア社）を用いて poly(A)RNAを調製した。

カワサキ（Kawasaki)等の方法（Kawasaki E. S. , Ampl if icat ion of RNA In PC R Protocols. A Guide to Methods and Ampl if ications. , . A.イニス (M. A. I nnis) 編、ァカデミック出版 (Academic Press), サンディエゴ (San Diego) 、 21 -27 頁、 1990年）に従い、以下のように一本鎖 cDNAの合成および PCR を行つた。

まず、センスプライマー 6 (GCTCTAGAGAGAAGGAAACCCTTTCCTG) およびアンチセンスプライマー 6 (GCTCTAGAATATTCCTGGTGCCCATGAT) を作製した（配列表の配列番号 50および 51) 。このセンスプライマー 6は、 ATG 開始コドンの上流域と 5'末端の Xbalのサイト（GCTCTAGA) を含んでいる。一方、アンチセンスプライマ一は TAA終始コドンの下流領域と Xbalサイト（GCTCTAGA) を含んでいる。

先述の poly(A)RNA 1 g に、 50ngのランダムへキサマー、 200 ュニッ卜の LV RNase H— リバーストランスクリブターゼ（ギブコ BRし (Gibco BRL)社）を添加し逆転写反応させた。この反応液 1. 0〃 1を、先述のセンスプライマ一、アンチセンスプライマーをそれぞれ lOOpmol 、 4 xdNTPと Taq DNA ポリメラーゼを含む PCR バッファー 100〃 1で希釈した。 DNA サーマルサイクラ一（DNA thermal cycler, パーキン一エルマ一（Perkin- Elmer) 社）を使用して、 PCR 産物を制限酵素 Xbalで処理した後、 1 %ァガロースゲル（ローゲルテンペレーチヤ一（L ow Gel Temperature), バイオラッド社）で分離した。

約 940bp の DNA フラグメントをゲルより回収後、 pBluescript I I KS (十）の Xbal サイトに組み込み、プラスミド pB MFLW4 と命名した。 pBl^- MFLW4 中の DNA配列を DNA シーケンサ一を使用して確認した。その結果、 pBし- MFLW4 は、配列表の配列番号 32の塩基配列を有しており、当該塩基配列は、実施例 13で得られた染色体遺伝子の配列と一致することが確認された。

ハナハンの方法（既出）に準じて、プラスミド pBL- MFLW4で大腸菌 DH10B を形質転換し、得られた形質転換体、大腸菌 DH10B (pBし- MFLW4) を工業技術院生命ェ学工業技術研究所に寄託した（寄託番号 FERM P-14226 ) 。さらに、平成 6年 1 0月 2 7日付で原寄託から国際寄託に移管した（FERM BP-4851 ) 。

( 2 ) COS細胞への導入

( 1 ) で得られた 940bp の Xbalフラグメントを動物細胞発現ベクター pEF- BOS (ミズシマ及びナガ夕（Mi zushima & Nagata) , 1990年）の Xba l部位に揷入し、プラスミド PEF-MFLW4Fと命名した。 COS- 7細胞を 10%FCS を含む D-MEM培地に、 10 cmシャーレ当り 2 X 10⁶ 細胞となるように植え込み、 5〃g のプラスミド pEF - MF LW4Fを DEAE—デキストラン法（フクナガ (Fukunaga) , 1990年）で導入した。

( 3 ) 形質転換体の細胞障害活性

( 2 ) で形質転換させた COS細胞（ C0S/pEF-MFLW4F ) をエフェクター細胞とし、 10^s の WR19L または W4細胞を夕一ゲット細胞として、実施例 8と同様に、組換え細胞の細胞障害活性を確認した。 W4細胞はマウス WR19L細胞をマウス Fas抗原を発現するように形質転換した細胞である（ォガサワラ J. (0gasawara J. ) 等， Nature, 364巻， 806-809頁， 1993年）。すなわち、 10⁶ の WR19L細胞または W4細胞を、 20〃Ciの [ ^{5 1} Cr] クロム酸ナトリウム（アマ一シャム（Amersha m)社）を含む RPMU 640培地を用いて 37°Cで 2時間培養し、 ^{5 )} Crで標識した。

この^{5 1} Crで標識した細胞 ( 1 X 10⁴ ) を、 COS/pEF- MFLW4F細胞と様々な割合で混合し、 37°Cで 4時間培養後、 ⁵ ' Crの遊離を指標に細胞障害活性を測定し、結果を図 25に示した。

図 25に示すように C0S/PEF-MFLW4F細胞は W4細胞を濃度依存的に細胞障害活性を示したが、 WR19L細胞に対してはアポトーシスを誘導しなかった。また、図 21 に示したように、 WC8A細胞に対しても、濃度依存的に細胞障害活性を示した。さらに、 C0S/pEF-MFLW4F細胞の細胞障害活性は、実施例 1で作製したマウス Fas 抗原の細胞外領域を含むキメラ蛋白質（niFas— Fc) 20 z g/nilを添加することにより阻害されたが、ヒト TNF レセプターの可溶型（ hTNFR S— Fc) では阻害されな力、つた。

以上の結果より、（ 1 ) で単離した 940bp の cDNAによりコードされる蛋白質は、 Fas抗原と結合してアポトーシスを誘導する活性を有する Fasリガンドであることが確認された。

(実施例 15) モノクローナル抗体の作製

( 1 ) ぺプチドの合成及びキヤリア一結合投与抗原の調製

実施例 12で決定したァミノ酸配列に基づき 4種類のぺプチドを合成した。配列表の配列番号 52に示すペプチド① ( L VMM E G KMM S Y) は Fraoc法を用いたペプチド合成キット（国産化学（株））の使用説明書に従って合成し、樹脂から脱保護切断した後エーテルにより粗ペプチド 275. 7mg を得た。次に粗ペプチド 10 mgを 5 %アンモニア水溶液を用いて溶解し、セフアデクス G 10により脱塩した。

得られた溶液を逆相 HPLCカラムカプセルパック C 18 ( CAPCELLPAK C18 120A、 5 /z m、 4. 6睡 X 250瞧、資生堂（株））を用いて精製した。溶出液を凍結乾燥し、精製ペプチドを得た。

また、ペプチド② （KSNSRSMPLEWEDTYG I VLL)、ペプチド ③ (SKYPQDLVMMEGKMMS)およびペプチド④ (LSLVNFEE SQTFF) は（株）不二家バイオサイエンス研究所に合成を依頼した（配列表の配列番号 53〜55)。

得られたぺプチドを以下の方法でキーホールリンぺッ卜へモシァニン（KLH:ピァス（Pierce)社）およびカチオン化 BSA (ピアス社）に結合し投与抗原とした。

KLHおよびカチオン化 BSAは蒸留水に溶解し lOmg/ml に調製した。各々のぺプチドを蒸留水または 5 %アンモニア水に溶解し lmg/ml に調製した。 KLHではべプチドとキャリアーのモル比が 100対 1となるように、カチオン化 BSAでは 10対 1となるようにそれぞれ混合し、塩酸を用いて pH 5に調整した。次に水溶性カルジィミド (1 - Ethyト 3 - (3 - dimethylaminopropyl) - carbodiimide hydrochlo ride, 同仁化学研究所）をキャリアー 1 mg当たり等量添加し、室温にて 4時間撹拌した。反応液をセフアデックス G25 (フアルマシア社）により精製し、最初に溶出してくる画分を投与抗原とした。

(2)投与および抗血清の調製

(1)で調製した投与抗原 100 〃g と等量のフロインド完全アジュバントとを混合し、 BALB/cまたは ddyマウス（5〜6週令、芊）の腹腔内に投与した。 1週間後、同量をフロインド不完全アジュバントと混合し、腹腔内に投与した。さらに 1週間間隔で 2回追加投与を行い、さらに 1週間後に投与抗原 20 / gを生理食塩水で希釈し、静脈内投与し、 2日後に細胞融合を行った。 2回投与後、抗血清を眼底静脈より採血し、血清を分離して得た。

( 3 ) 抗血清のぺプチドとの反応性の測定

ァミノプレート（住友ベークライト（株））の各ゥエルに 2. 5 %のグルタールアルデヒド溶液 70 1を分注し、室温で 1時間静置し、内容液を廃棄した。 0. 076 Mの PBS(pH6. 4 ) で 5 g/mlに希釈したぺプチド溶液 50 1を加え、 37°C で 1時間処理した。プレートを氷水で冷却後、ィォン交換水でプレートを 5回洗浄し、 0. 2 %のゼラチンを溶解した PBS 100 1を分注し、 30分静置しブロッキングを行った。

次に抗血清を PBSで 500倍に希釈し 50 1添加した。 37°Cで 1時間反応後、 0. 005 % Tween 20 を含む生理食塩水（以下、洗浄液と略す）で 2回洗浄し、ペルォキシダ一ゼ標識抗マウスィムノグロブリンズ抗体（ダコ（DAK0)社）を 0. 25%のゼラチンを溶解した PBSで 2， 000倍に希釈して添加した。 37°Cで 1時間反応させた後、洗浄液で 5回洗浄した。オルトフヱ二レンジアミンを 3 mg/ml 、過酸化水素を 0. 027 %を含むマツキルべイン緩衝液 PH5. 0 を 50 1を添加し室温で 10分間反応させた。

反応後、 2 N硫酸 50 1を添加し反応を停止し、 492nm の吸光度を測定した。各抗血清とも投与したぺプチドと反応性を示した。

( 4 ) モノクローナル抗体の作製

( 2 ) で免疫したマウスを屠殺し、脾臓を取り出した。これを断した後、ステンレス · メッシュを通し、 RPMI 1640培地に浮遊させ、脾細胞浮遊液を得た。この脾細胞とマウスミエローマ細胞（P3X63Ag8Ul) を 10： 1の割合で混合して遠心 (1. 400rpmで 8分間）した。得られた沈殿に 0. 5ml の 42. 5%のポコール 1540と 15%のジメチルスルフォキサイドを含む RPMI 1640をすばやく加え、さらに 1分間激しく細胞を振とうした後、 10mlの RPMI 1640をゆつくり加えた後、遠心（800rpmで 5分間）を行った。

この沈殿を HAT 培地（ヒポキサンチン 1 xiO— ⁴M、アミノプテリン 4 X 10一⁷ M、チミジン 1.6 X10—⁵M、讓 FCS を含む RPMI1640培地）に 2 X10⁵ 細胞 /ml になるように懸濁し、 96ゥヱルマイクロプレートのゥヱル当り 0.2ml を分注した。 2〜 3日毎に半量の培地を交換し、その後 HT培地（ヒポキサンチン 1 X10—⁴M、チミジン 1.6 X10— ⁵M、 10%FCS を含む RPMI1640培地）に交換した。

ハイプリドーマ細胞の生育が認められたところで、 ELISA法によりスクリ一二ングを行った。すなわち、実施例 15 ( 1 ) で作製したペプチドを不溶化させた 96 ゥエルプレートを洗浄液で 2回洗浄後、 0.25%ゼラチンを含む PBS で 10倍に希釈した培養上清 100 1を各ゥエルに添加し、室温で 2時間反応させた。反応終了後、洗浄液で 5回洗浄し、第 2抗体として 0.25%ゼラチンを含む PBSで 2, 000倍に希釈したペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗マウス Igs 抗体（ダコ（DAK0)社） 50〃 1を添加し、室温で 2時間反応させた。

反応終了後、洗浄液で 5回洗浄後、 3 mg/ml オルトフエ二レンジァミンおよび 0.027 %過酸化水素を含む 0.1 Mマツキルべイン緩衝液 pH5.0 を 100 1添加し、室温で 10分間酵素反応を行い、 100 1の 2N硫酸で反応を停止し、 492 nmの吸光度を測定した。

ELISA法で陽性であったゥエルのハイブリドーマを、 96ウェルマイク口プレートに 1ゥエルあたり 2個、 1個、あるいは 0.5個となるよう 10%FCS を含む RPMI •1640を用いて希釈した。

ウィスターラッ卜の胸腺細胞をフィーダ一細胞として加えて、プレートの各ゥエルに植え込み、クロ一ニングを行った。

顕微鏡下で観察して、確実にシングルセルコロニーであるゥヱルを選択し、それらの培養上清を（3 ) の EUSA 法によりスクリーニングし、モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを得た。

( 5 ) ウェス夕ンブロッティングによる反応性の確認

前記（ 2 ) で得られた抗血清（ペプチド②を使用して作成した抗原で免疫、 lot. 19-3 ) および前記（4 ) で得られたモノクローナル抗体（ペプチド② を使用して作成した抗原で免疫、 F864-5- 1) とヒト Fas リガンドとの反応性を、実施例 12で COS細胞に発現させたヒト Fasリガンド、実施例 14で発現させたマウス Fasリガンドおよび Fasリガンドの配列を含まないベクターをトランスフエク卜した COS細胞をコントロールとしてウエスタンプロッティングで確認した。まず、各組換え COS細胞約 1 X 10⁴ 個を 150mM の NaCl、 1 %の NP— 40、 0. 1 % デォキシコール酸ナトリウム（Sodium deoxycolate) 、 0. 1 %SDS および 0. 2U/m 1 のァプロチニン（Aprot inin) を含む 50m Tris-HCl (pH7. 5) 9 n 1 と混合し、さらに等量の 2 %SDS、 30%グリセロール、 10%の 2—メルカプトエタノールおよび 0. 01 %BPB を含む 0.25M Tris-HCl (pH6. 8)と混合した。

37°Cで 1時間処理した後、 SDS—ポリアクリルァミドゲル電気泳動 ( 4 -20% グラジェントゲル）を行い、泳動終了後 PVDF膜（ミリポア社）に 4 °Cにて 200mA 、 90分の条件で転写した。メンブレンをブロックエース（雪印乳業 (株））で、 37°Cで 2時間ブロッキングを行った。次にメンブレンを洗浄液で 2回、 37°Cで 4分撹拌して洗浄し、 PBS で 5倍に希釈したブロックエースで 500倍に希釈した抗血清 19- 3、または培養上清 F864- 5 - 1 と 37°Cで 1. 5 時間反応させた。反応終了後、洗浄液で 2回洗浄し、ペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗マウスィ厶ノグロブリンズ抗体（Cat. No. P260、ダコ社）を PBSで 5倍に希釈したブロックエースで 1. 000倍に希釈した溶液に浸し、 37°C で 1. 5 時間反応させた。メンブレンを洗浄液で 3回、蒸留水で 2回洗浄し、表面の水を切り TMB試薬（Cat. No. TM9125, シック（SCYTK)社）で発色させた。

図 27及び 28に、抗血清 19-3とモノクローナル抗体 F864 - 5-1を使用したウェス夕ンブロッテイングの結果をそれぞれ示した。図 27及び 28から明らかなように、ヒト Fasリガンド発現 COS細胞抽出液と反応するバンドが見られるのに対して、マウス Fasリガンドおよびコントロールではバンドは認められなかった。

( 6 ) 阻止反応によるべプチドとの反応性の確認一 1

前記（4 ) で得られたモノクローナル抗体（ペプチド②を使用して作製した抗原で免疫、 F883- 1-1) と、投与抗原ペプチド（ペプチド②） .との反応性を阻止反応により確認した。

アミノブレート（住友ベークライト（株））の各ゥエルに 2. 5 %のグルタールアルデヒド溶液 70 1を分注し、室温で 1時間静置後、内容液を廃棄した。 0. 07 6 Mの PBS(pH6. 4)で 5〃g/mlに希釈したぺプチド②溶液 50〃 1を加え、 37°Cで 1 時間処理した。プレートを氷水で冷却後、イオン交換水でプレートを 5回洗浄し、 0. 2 %のゼラチンおよび 0. 1 Mグリシンを含む PBS 100 1を分注し、 30 分間静置してプロッキングを行った。

次に、阻止ペプチドとして上記ペプチド②、 ③、 ④を PBSで 10 z g/mlに希釈して阻止抗原溶液とし、ネガティブコントロールとして阻止抗原を含まない溶液を調製した。これらの各溶液をそれぞれ 25〃 1添加後、 0. 2 ゼラチンを溶解した PBS を用いて 0. 4 〃g/mlに希釈した F883-1- 1を 25〃 1加えた。 37°Cで 1時間反応後、洗浄液で 2回洗浄した。

次に、ペルォキシダーゼ標識抗マウスィムノグロブリンズ抗体（ダコ社）を 0. 2 %のゼラチンを溶解した PBSで 2, 000倍に希釈して各ゥヱルに 50〃 1を添加した。 37°Cで 1時間反応させた後、洗浄液で 5回洗浄した。オルトフエ二レンジァミンを 3 mg/ml 、過酸化水素を 0. 027 %含むマツキルべイン緩衝液 pH5. 0 を上記各ゥヱルに 50 1添加して室温で 10分間反応させた。 2 N硫酸 50 1を添加して反応を停止し、 492nmの吸光度を測定した。結果を図 29に示した。

図 29では、 P且止抗原無添加のゥヱル（ネガティブコントロール）の吸光度を 10 0 とした場合の各ゥエルの吸光度を算出し、反応性として示した。

図 29から明らかなように、 F883-1-1抗体と抗原ペプチドとの反応性は、 P且止ぺプチドとしてべプチド②を使用した場合にのみ阻止されることが確認された。 ( 7 ) 阻止反応によるべプチドとの反応性の確認一 2

前記（4 ) で得られた IgM型モノクローナル抗体（ぺプチド③を使用して作製した抗原で免疫したマウスより得た脾細胞とミエローマから作成したハイブリド —マ F897- 1- 2の産生する抗体 F897-1-2) と、投与抗原べプチド（ぺプチド③）との反応性を阻止反応により確認した。

まず、中根ら ( Immunof luorescence and Related Staining Techniques, W. Kn app, K. Holubar and G. Wi ck eds. 1978 ) の方法に従い、ペプチド③をペルォキシダ一ゼで標識した。すなわち、ペルォキシダ一ゼ（RZ3. 11、東洋紡（株））を 6mg秤量し、 1.5ml の蒸留水で溶解した。次に蒸留水で溶解した 0.1 Mメタ過ョゥ素酸ナトリウムを 0.3ml 添加し室温で 15分間静置し、続いて蒸留水で溶解した 1.5 %エチレングリコール 0.3 mlを添加し室温で 20分間静置した。この溶液を 0.001 Mの酢酸緩衝液 (PH4.4) に対して 4 °Cで一夜透析した。

得られた活性化ペルォキシダーゼ 159 1 (ペルォキシダーゼ 500 US相当）に 1 M炭酸緩衝液 (pH9.5) を 9 ζ 1添加し、続けて蒸留水で溶解して 1 mg/ml に調製したペプチド③を 428/ 1 (ペルォキシダーゼに対して 20倍モル量）添加し 25°Cにて 2時間反応させた。次に、 0.01M炭酸緩衝液（pH9.5) で溶解した 4mg/m 1 の水素化ホウ素ナトリウムを 15〃 1添加し 4°Cで 2時間静置し、さらに蒸留水で 0.2 Mに希釈したグリシンを 25 1添加し室温で 1時間静置した。次に 0.076 Mの PBS(pH6.4)に対して 4でで一夜透析し、得られたペルォキシダーゼ標識ぺプチド③溶液に等量のグリセ口一ルを添加し一 20°Cにて保存した。

次に、ィ厶ノプレート（ヌンク（NUNC)社、マキシソープ（MaxiSorp^TM) ) の各ゥエルに 0.076 Mの PBS(pH6.4)で 20〃g/mlに希釈した抗マウスィムノグロブリン抗体（Z259、ダコ社）を 50 1加え、 45°Cで 30分処理した。プレートを氷水で冷却後、イオン交換水でプレートを 5回洗浄し、 0.2 %ゼラチンを含む PBS 100 1を分注し、 4 °Cで一夜静置してブロッキングを行った。ブロッキング後、 PBS で 100倍に希釈した塩析抗体 (F897- 1-2)を 50 / 1加え 37°Cで 1時間静置した後、 0.005 % Tween 20 を含む 0.9 %NaClの洗浄液で 2回洗浄し、さらにイオン交換水で 1回洗浄した。

一方、ペプチド③を PBSで 3〃g/ml、 10 g/mlに希釈して阻止抗原溶液とし、ネガティブコントロールとして阻止抗原を含まなレ、溶液を調製した。これらの溶液を 25 1添加後、 PBSで 200倍に希釈したペルォキシダ一ゼ標識ペプチド③を 25 1加え、 37°Cで 1時間反応させた。反応終了後洗浄液で 5回洗浄し、続いてイオン交換水で 2回洗浄した。オルトフエ二レンジアミンを 3 mg/ml 、過酸化水素 0. 027 %を含むマッキルべィン緩衝液（pH5. 0) を上記各ゥヱルに 50〃 1添加して室温で 5分間反応させた。 2 N硫酸 50 1を添加して反応を停止し、 492 の吸光度を測定した。阻止抗原無添加のゥル（ネガティブコントロール）の吸光度を 100 とした場合の各ゥエルの吸光度を算出し、反応性（％) とした。結果を図 31に示した。

図 31から明らかなように、 F897- 1-2抗体と抗原ペプチドとの反応性は、ぺプチド③により阻止されることが確認された。

(実施例 16) アポトーシス抑制活性の評価一 1

実施例 15で得られた抗体 F883-1- 1のアポト一シス抑制活性を、 Fasリガンドを発現する形質転換体および Fas抗原を発現する形質転換体を使用した以下の方法で確認した。

まず、ヒト Fasリガンドをコードする cDNAを含むプラスミド pEX- hFLl (実施例 12参照）で、マウス正常骨髄細胞由来細胞株 FDC-P1を形質転換した。その中の 1 クローン、 FLhl細胞を、 50U/ml のマウス【し- 3 (インタージェン社）および 10% の FCS を含有する RPM I I 640培地（ギブコ BRL社）中で、 5 %C0₂ 存在下、 37°Cにて 4日間培養した。培養後、 FLhl細胞を 10%FCS を含有する RPMI 1640培地に 5 x 10⁵ 細胞/ ml となるよう懸濁し、この懸濁液を 96穴平底プレートの各ゥエルに 50 H 1ずつ添加した。

一方、実施例 15で得られた抗体 F883- 1- 1を PBS - を使用して各種濃度に調製した。これを上述の各ゥヱルに 10〃 1ずつ添加し、 5 C0₂ 存在下、 37°Cにて 30分間インキュベートした。

次に、 10%FCS を含有する RPMI1640培地に、ヒト Fas抗原を発現する形質転換体 WC8 細胞（ィトウ N. (Itoh Ν·)等、 J. Imnumol., 151 巻、 62卜 627 頁、 1993年）を 6.3 X10⁵ 細胞/ ml となるよう懸濁し、これを各ゥヱルに 40 1ずつ添加した。 5 %C0₂ 存在下、 37°Cで 16時間インキュベートした後、トリパンブルーを各ゥエルに 100 1ずつ添加して、各ゥエルあたりの生細胞数をカウントした。

F883- 1-1抗体のアポトーシス抑制活性を図 30に示した。図 30から明らかなように、 FLhlによる WC8 のアポトーシスは F883- 1-1抗体により用量依存的に抑制された。なお、モノクローナル抗体 F883-1-1を産生するハイプリドーマ F883-1 - 1を、平成 6年 8月 9日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し（寄託番号 F ERM P- 14464)、さらに平成 6年 1 0月 27日付で原寄託から国際寄託に移管した (FER BP-4852)。

(実施例 17) アポトーシス抑制活性の評価一 2

実施例 15で得られた抗体 F897-1-2のアポトーシス抑制活性を、以下に述べる実施例 18 (3) の方法で作製した形質転換体 COS- 1 /pEX-hFLl の培養上清およびヒト Fas抗原を発現する形質転換体 WC8細胞を使用して、実施例 8および 12の方法に準じて確認した。

まず、 10^s 個の WC8細胞を 20〃Ciの [⁵'Cr] クロム酸ナトリウム（NEN社）および 10%の非働化ゥシ血清を含有する RPMI1640培地中で 37°Cで 2時間培養し、 ⁵ 'Crで標識した。次に、 96ゥヱル U底プレート（コ一ニング (CORNING) 社）の各ゥエルに、 COS - 1 /pEX-hFLl の培養上清を終濃度が 3 %になるように 6〃 1、 10%の FCS を含有する RPMI1640を 74 1ずつ添加した。さらに、実施例 15で得られた抗体 F897-1 - 2 を、 0. 1 %の BSAを含有する PBS ― で 300 zg/mlになるように調整し、終濃度が 30 ^ g/mlとなるように各ゥヱルに 20 / 1ずつ添加した。 37°Cで 30分間インキュペートした後、 ⁵ 'Crで標識した WC8細胞を 1 X 10⁴ 個/ 100 / 1 / ゥエルとなるよう各ゥエルに添加し、 37°Cで 4時間培養した。培養後、 ⁵ 'Crの遊離を指標に細胞障害活性を測定した。

結果を図 32に示した。図 32より明らかなように、 COS- 1 /pEX-hFLl の培養上清中に存在する Fasリガンドによる WC8細胞のアポトーシスは、 F897- 1-2抗体により抑制された。

なお、モノクローナル抗体である F897-1- 2抗体を産生するハイプリドーマ F897 -1-2を、工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成 6年 9月 1日付けで寄託し

(寄託番号 FERM P- 14497)、さらに平成 6年 1 0月 2 7日付で原寄託から国際寄託に移管した (FERM BP - 4853)。

(実施例 18) ヒト Fasリガンドの細胞外領域の発現

( 1 ) プラスミド P M1067の作製

まず、センスプライマ一 7 (CACCTGCAGAAGGAGCTGGCAGAA)およびアンチセンスプライマ一 7 (AATAAGCTTGGTACCCTATTAGAGCTTATATAA) を化学合成機にて合成した（配列表の配列番号 56および 57) 。このセンスプライマーはヒト Fasリガンド細胞外領域、すなわち前記式 3のァミノ酸配列の N末端側に位置するァミノ酸配列をコードする塩基配列と Pst lサイト（CTGCAG) を含んでいる。また、プライマーは、 TAA終止コドンを含む領域と Hindl U サイト（AAGCTT) 、 Kpn lサィト（GGTACC) を含んでいる。

得られたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーをそれぞれ lOOpmol 、実施例 12 ( 1 ) で得たプラスミド pBX- hFLlを 50ng、 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTPをそれぞれ 20mnol、 2. 5 ュニットの pfu ポリメラーゼおよび添付の pfu バッファー（共にストラタジーン社） 10 1を含む 100 1の溶液を調整した。 DNA サーマルサイクラ一（PCR システム 9600, パーキンエルマ一社）を使用して； 94°Cで 30秒； 55°Cで 30秒； 72°Cで 1分を 1サイクルとする PCR を 30サイクル行った。得られた PCR 産物を Pst l、 Hindi I I で二重消化し、 pUC118の Pst l、 Hindi I I サイ卜に組み込み、得られたプラスミドを pM1067と命名した。

( 2 ) プラスミド pM1070の作製

センスプライマー 8 (TGCGAATTCACCATGCTGGGCATCTGG) およびアンチセンスブライマ一 8 (AACCTGCAGGTGGAAGAGCTGAGCAACAGACGTAAG)を化学合成機にて合成した（配列表の配列番号 58および 59) 。このセンスプライマ一 8はヒト Fas抗原シグナルぺプチドをコ一ドする配列の 5'末端領域と EcoRI サイト（GAATTC)を含んでいる。一方、アンチセンスプライマー 8はヒト Fas抗原シグナルペプチドをコードする配列の 3'末端領域とヒト Fasリガンド細胞外領域の N末端側をコードする塩基配列および Pst lサイトを含んでいる。

得られたセンスプライマ一 8、アンチセンスプライマー 8をそれぞれ lOOpmol 、実施例 1 ( 3 ) で使用したプラスミド pBLF58- 1を 50ng、 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTPをそれぞれ 20nmol、 2. 5 ュニッ卜の pfu ポリメラ一ゼおよび添付の pf u バッファー（共にストラタジーン社） 10〃 1を含む 100〃 1の溶液を調整し、 ( 1 ) と同様に PCR を行った。

得られた PCR産物を EcoRI、 PsUで二重消化し、（1 ) で得たプラスミド ρΜΙΟ 67の EcoRI、 Pst lサイト間に組み込み、 pM1250を得た。さらに、これを EcoRI 、 Kpnlで二重消化し、ァガロースゲル電気泳動に供した。約 600bp の断片を回収し、キアエックス（QIAEX^TM) キット（キアジェン（QIAGEN) 社）を使用して、 DNA を精製した。実施例 14 ( 2 ) で使用した pEF-BOS に DHFR遺伝子を組換えたプラスミド PM1103を準備し、そのクローニングサイトの EcoRI 、 Kpnlサイト間に、上述の約 600bp の DNA 断片を組み込み、得られたプラスミドを pM1070と命名した。

( 3 ) COS細胞への導入

PM1070および実施例 12 ( 1 ) で作製した pEX- hFLlを各々 COS- 1 細胞へ導入し、形質転換体 C0S-1/PM1070および COS-1/ρΕΧ- hFLlを作製した。すわなち、 8. 1 n g の PM1070あるいは pEX-hFLlを 40 1の lOmM Tris-HCl (pH7.4)/ 1 エチレンジァミン四酢酸（以下、 TEバッファーと記す）溶液に溶解した。これらに、それぞれ、 0.2mg/ml DEAE—デキストランおよび 50mM Tris- HCl (pH7. 4)を含有する D- MEM (日水製薬（株） ) 11. 3mlを添加し、 DNA-DEAEデキストラン混合液を作製した。

150cm²のルーフラスコ内でセミコンフルェントまで単層培養した COS- 1 細胞に DNA- DEAEデキストラン混合液を滴下し、 5 %C0₂ 存在下で、 37°Cにて培養し、形質転換体 C0S-l/pM1070および COS- 1/pEX- hFし 1を得た。 4時間後、 DNA-DEAEデキストラン混合液を除去し、 10%FC (アーバンサイエンティフィック社）を含有する D-MEM に交換し、さらに 48〜96時間培養した。 C0S-l/pM1070および COS- 1/pEX - hF LIの培養上清を回収し、以下の（4) および（5) で使用した。

( 4 ) 細胞障害活性の確認

(3) で得た培養上清の細胞障害活性を、 WC8細胞あるいは W4細胞をターゲット細胞として、実施例 8および実施例 12と同様に測定した。すなわち、 10^e 個の

WC8細胞あるいは W4細胞を、 20〃Ciの [⁵'Cr] クロム酸ナトリウム（NEN社）を含む RPMI1640培地を用いて 37°Cで 2時間培養し、 ⁵ 'Crで標識した。

⁵'Crで標識した細胞を 1 X10⁴ 個含む反応液中に、（3) で得た細胞培養上清を終濃度 3%あるいは 10%となるように添加し、 37°Cで 4時間培養後、 ⁵¹Crの遊離を指標に細胞障害活性を測定した。結果を図 33および 34に示した。図から明らかなように、 C0S-l/pM1070および COS-1/ρΕΧ- hFLlの培養上清は、 WC8細胞あるいは W4細胞に対して濃度依存的に細胞障害活性を示した。図中、 Mockは、コント口 —ル（対照）を示す。

以上の結果より、これらの培養上清中には、 Fas抗原と結合してアポトーシスを誘導する活性を有する Fasリガンドが含まれていることが確認された。

( 5 )形質転換体 COS- 1/PM1070および COS- 1/pEX-hFLlの培養上清を使用したゥェス夕ンブロッティング

ヒト Fasリガンドのアミノ酸配列の一部 (PSPPPEKKELRKVAH, 配列表の配列番号 60) を認識するゥサギ抗血清を公知方法に従って作製し、以下の方法でウエスタンブロッテイングを行つた。

まず、（ 3 ) で得た形質転換体 COS- 1/PM1070および COS- 1/pEX-hFLlの培養上清 10〃 1をそれぞれ蒸留水 5〃 1 とを混合した。これらに、 4%SDS、 80%グリセロール、 0.04%BPB を含む蒸留水 5 1もしくは 4%SDS、 80%グリセロール、 8 %DTT、 0. 04%BPB を含む蒸留水 5 1を加え、それぞれ 37°Cで 1時間処理した後、 SDS- PAGE ( 5— 20%グラジェントゲル）を行った。泳動終了後、 PVDF膜（アト一社）に室温にて 200mA、 60分の条件で転写した。スキムミルク（雪印乳業 (株））を使用して 4 °C、一夜反応させ、ブロッキングを行ったのち、メンブレンを PBSで 1回（室温で 15分インキュベート）、 0. 1 %Tween 20/PBSで 2回（室温で 5分インキュベート）洗浄した。

上述のゥサギ抗血清を 0. 5% BSA/0. 1% Tween 20/PBSで 1. 000倍に希釈し、 37°C で 1時間反応させた。反応終了後、 0. 1% Tween 20/PBS で 2回洗浄した。洗浄後、さらに、 0. 5% BSA/0. 1% Tween 20/PBSで 1, 000倍に希釈したペルォキシダーゼ標識抗ゥサギィ厶ノグロブリンズ抗体（Cat. No. P448、ダコ社）溶液に浸し、室温で 1時間反応させた。メンブレンを 0. 1 %Tween 20/PBSで 5回洗浄し、表面の水を切り、 ECL システム（アマ一シャム社）で検出した。

その結果、 COS- 1/PM1070の培養上清では、還元条件下で 29kD付近に、非還元条件下で 26kD付近に、それぞれバンドが認められた。

一方、 COS- 1/pEX-hFLlの培養上清では、還元条件下で 26kD付近に、非還元条件下で 24W)付近にそれぞれバンドが検出された。

非還元条件下でのウエスタンプロットの結果をそれぞれ図 35および 36に示した。図中、 Mockは、図 33および 34と同じである。

(実施例 19) アンチセンスオリゴヌクレオチドによる Fasリガンドの発現抑制 ( 1 ) アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成

配列表の配列番号 31の 20番目から 41番目の塩基配列（TAAAACCGTTTGCTGGGGCTGG) をもつ 22塩基よりなるフォスフォロチォエート型センスオリゴヌクレオチド（以下、センスオリゴヌクレオチド S20と呼ぶ）およびそれに相補的な塩基配列（CC AGCCCCAGCAAACGGTTTTA) をもつフォスフォロチォエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチド A41と呼ぶ）を公知方法にて合成した（配列表の配列番号 61および 62) 。得られた合成オリゴヌクレオチドを 1 mMとなるように TEノくッファーに溶解した。

( 2 ) アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への導入

ヒト Fasリガンドを発現する形質転換体 FLhl細胞（実施例 16参照）を 10%の非働化 FCS を含む RPMI 1640培地に懸濁し、 2. 0 X 10⁴ 個/ 196 ζ 1 / ゥエルとなるように 96ゥヱルプレート（ヌンク社）の各ゥヱルに添加した。（ 1 ) で得た I raM のアンチセンスオリゴヌクレオチド A41を、終濃度 20〃Mとなるように 4 / 1ずっ各ゥエルに添加し、 5 %C0₂ 存在下で 3日間培養し、細胞にオリゴヌクレオチドを導入した。同様に、 I m のセンスオリゴヌクレオチド S 20あるいは TEバッファ一をそれぞれ 4 p. 1ずつ各ゥヱルに添加し、 5 %C0₂ 存在下で 3日間培養し、コントロールとした。

( 3 ) 細胞障害活性の測定

( 2 ) で 3日間培養した FLhl細胞をエフェクター細胞とし、ヒト Fas抗原を発現する形質転換体 WC8に対する細胞障害活性を測定した。

細胞障害活性の測定は、実施例 8および 12で用いた方法に従い行った。

すなわち、 10⁶ 個の WC8細胞を 20 /Ciの [^{5 i}Cr] クロム酸ナトリウム（NEN社製）を含む RPMI1640培地を用いて 37°Cで 2時間培養し、 ^{5 1}Crで標識した細胞（ 1 X 10⁴ ) を上記エフヱクタ一細胞と E/T比 3対 1の割合で混合した。 37°Cで 5時間培養後、 ⁵ ' Crの遊離を指標に細胞障害活性を測定した。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド A41を導入した FLhl細胞では WC8 細胞に対するアポトーシス誘導活性が抑制された（図 37) 。

(実施例 20) アンチセンスオリゴヌクレオチドによる Fasリガンドの発現抑制一 2

( 1 ) アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成

配列表の配列番号 31のヒト Fasリガンドをコ一ドする DNA配列を参考に、フォスフォロチォエート型のセンスオリゴヌクレオチド、 S50、 SI 63. S338、 S484、 S714、 S905、およびフォスフォロチォェ一ト型のアンチセンスオリゴヌクレオチド A69、 A184、 A355、 A505、 A733、 A924を公知方法にて合成した（配列表の配列番号 63〜74) 。

このうち、センスオリゴヌクレオチド S50およびアンチセンスオリゴヌクレオチド A69は、それぞれ、配列番号 31の 50番目から 69番目の塩基配列（ACCAGCTGCC ATGCAGCAGC) およびその相補的な配列（GCTGCTGCATGGCAGCTGGT) をもつ 20塩基よりなるオリゴヌクレオチドである。

センスォリゴヌクレオチド S163およびアンチセンスォリゴヌクレオチド A1 84は、それぞれ、配列番号 31の 163 番目から 184 番目の塩基配列（CTGTGCCCAGAA GGCCTGGTCA) およびそれに相補的な塩基配列（TGACCAGGCCTTCTGGGCACAG) をもつ 22塩基からなるオリゴヌクレオチドである。

センスオリゴヌクレオチド S 338 およびアンチセンスオリゴヌクレオチド A355 は、それぞれ、配列番号 31の 338 番目から 355 番目の塩基配列 (CTTGGTAGGATTGG GCCT) およびそれに相補的な塩基配列（AGGCCCAATCCTACCAAG) をもつ 18塩基からなるオリゴヌクレオチドである。センスォリゴヌクレオチド S484およびァンチセンスォリゴヌクレオチド A5 05は、配列番号 31の 484 番目から 505 番目の塩基配列 (AGCTGAGGAAAGTGGCCC ATTT) およびそれに相補的な塩基配列（AAATGGGCCACTTTCCTCAGCT) をもつ 22塩基からなるォリゴヌクレオチドである。

センスォリゴヌクレオチド S714およびァンチセンスォリゴヌクレオチド A7 33は、それぞれ配列番号 31の 714番目から 733番目の塩基配列（CCCCAGGATCTGGT GATGAT) およびそれに相補的な塩基配列（ATCATCACCAGATCCTGGGG) をもつ 20塩基からなるオリゴヌクレオチドである。

センスオリゴヌクレオチド S 905 およびアンチセンスオリゴヌクレオチド A924 はそれぞれ、配列番号 31の 905番目から 924番目の塩基配列（AGAGAAGCACTTTGGG ATTC) およびそれに相補的な塩基配列（GAATCCCAAAGTGCTTCTCT) をもつ 20塩基からなるオリゴヌクレオチドである。

得られた上記の合成ォリゴヌクレオチドを、それぞれ 1 mM濃度となるように TE バッファ一に溶解した。

( 2 ) アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への導入

まず、ヒト Fasリガンドをコードする cDNAを含むプラスミド pEX-hFLl (実施例 12 ( 2 ) 参照）でマウス線維芽細胞様細胞株 L929を形質転換した。そのうちの 1 クローン LFLh3細胞を 10%の FCS を含む D- MEM に懸濁し、 3.0 X 10⁵ 個 /2. 0ml/ ゥエルとなるように 6ゥエルプレート（ヌンク社）に植え込み、 5 %C0₂ 存在下、 37°Cにて一夜培養した。

翌日、（1 ) で合成したオリゴヌクレオチドを終濃度 1 / Mとなるようにリポフエクトァミン（ギブコ BRL社） 40〃g を含有するォプティ— MEMI (0PTI-ME™ I、ギブコ BRL社） 1.000 1に懸濁し、ォリゴヌクレオチドーリボフェクトァミン混合液を作製した。 5%C0₂ 存在下、 37°Cにて一夜培養し、培地を除去した LFL 3細胞に上述のォリゴヌクレオチドーリボフェクトアミン混合液を添加した。 5%C0₂ 存在下、 37°Cにて 4時間培養後、 20%非働化 FCS及び 1 Mオリゴヌクレオチドを含有する D- MEMを 1， 000 a 1添加し、さらに 16時間培養することにより、 LFLh3細胞に（ 1 ) で合成したォリゴヌクレオチドを導入した。 ( 3 ) 細胞障害活性の測定

(2) でオリゴヌクレオチドを導入した LFLh3細胞を回収し、トリプシン溶液で 3分間処理した後、細胞障害活性測定用のエフェクタ一細胞として用いた。細胞障害活性の測定は、実施例 8および 12で用いた方法に従い行った。

すなわち、 10⁶ 個の WC8細胞を 20 Ciの [^5ICr] クロム酸ナトリウム（NEN社 ) を含む RPMI1640培地を用いて 37°Cで 2時間培養し、 ⁵¹Crで標識した細胞（1 x 10⁴ ) を上記エフェクター細胞と EZT比 1対 1の割合で混合した。 37°Cで 4時間培養後、 ⁵ ' Crの遊離を指標に細胞障害活性を測定した。

その結果、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチド、 A69, A184, A355, A505, A733, A924を導入した LFLh3細胞では WC8細胞に対するアポトーシス誘導活性が抑制された。これらのアンチセンスォリゴヌクレオチドの特異的細胞溶解抑制率を以下の式より計算し、図 38に示した。

SCL I (%) = ( 1— (SCL AON-LFL h /SCL SON—し h ) ) x 1 0 0 SCL I ：特異的細胞溶解抑制率

SCLAON-LFL.,：アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した LFLh3細胞の特異的細胞溶解率 S C L soN- L F L _h：センスオリゴヌクレオチドを導入した LFLh3細胞の特異的細胞溶解率

(実施例 21) ヒト Fasリガンドの細胞外領域の欠失変異体の動物細胞を宿主とする発現

ヒト Fasリガンドの細胞外領域の欠失変異体であるポリべプチド ND38、 ND40、 ND4U ND42、 ND43および CD179 を以下の方法で発現させた。なお、 ND38、 ND40、 ND41、 ND42、 ND43は、前記式 3 (配列表の配列番号 3 ) に記載のアミノ酸配列の N末端から、それぞれ 38アミノ酸、 40アミノ酸、 41アミノ酸、 42アミノ酸、 43ァミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチドである（すなわち、 ND38は配列番号 3のァミノ酸番号 39から 179 までのァミノ酸配列を、 ND40は配列番号 3 のアミノ酸番号 41から 179 までのアミノ酸配列を、 ND41は配列番号 3のアミノ酸番号 42から 179 までのァミノ酸配列を、 ND42は配列番号 3のアミノ酸番号 43から 179 までのアミノ酸配列を、 ND43は配列番号 3のアミノ酸番号 44から 179 までのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列表の配列番号 76〜80)。

また、ポリペプチド CD179 は前記式 3 (配列表の配列番号 3 ) に記載のァミノ酸配列の C末端から 1アミノ酸が欠失したァミノ酸配列、すなわちァミノ酸番号

1から 178 までのアミノ酸配列を有するポリペプチドである（配列表の配列番号 81)。

( 1 ) プラスミド PM1081の作製

ヒト Fas抗原シグナルべプチドとヒト Fasリガンド細胞外領域をコ一ドする塩基配列であって、サイレントミューテ一シヨンにより、ヒト Fas抗原シグナルぺプチドをコードする塩基配列中に Speし PshAI 認識配列が導入され、ヒト Fasリガンドをコ一ドする塩基配列中に Pst l認識配列が導入された塩基配列を有するプラスミド PM1081を以下の方法で作製した。

まず、アンチセンスプライマー 9 (CTTCTGCAGGTGGAAGAGCTGAGCGACACTAGTCAGAAC CAGAGG) を合成した（配列表の配列番号 82) 。このアンチセンスプライマー 9は、ヒト Fasリガンド細胞外領域の N末端側とヒト Fas抗原シグナルべプチドの C末端側をコードする塩基配列および Pst lサイト（CTGCAG)、 Spelサイト（ACTAG T), PshAI サイト（GACTAGTGTC)を含んでいる。

得られたアンチセンスプライマ一 9と、実施例 18 ( 2 ) で使用したセンスブライマ一 8 (TGCGAATTCACCATGCTGGGCATCTGG、このセンスプライマー 8は EcoRI サィト（GAATTC) およびヒト Fas抗原シグナルべプチドの N末端をコ一ドする配列を含んでいる。）とを、それぞれ lOOpmol 、実施例 1 ( 3 ) で使用したプラスミド PBLF58-1を 50ng、 pfu DNA ポリメラーゼを 2.5 U、添付の pfu ノくッファーを 10 II 1含む 100 a 1の溶液を調製した。

実施例 18 ( 1 ) と同様に PCR を行い、 PCR産物を EcoRI および Pst lで二重消化し、ァガロースゲル電気泳動に供した。約 70bpの DNA断片を回収し、キアエックスキットを用いて DNA を精製した。実施例 18 ( 1 ) で作製したプラスミド pM1067 の EcoRI サイトおよび Pst lサイト間に、上述の約 70bpの DNA断片を挿入した。得られたプラスミドの塩基配列を確認したところ、 EcoRI サイトと Spelサイトとの間に 16塩基の欠損があった。そこで、目的とする EcoRI サイトから Spelサイトまでの配列を構築するためにセンスプライマー 9 (AATTCACCATGCTGGGCATCTGGAC CCTCCTACCTCTGGTTCTGA) 、アンチセンスプライマ一 10(CTAGTCAGAACCAGAGGTAGGAG GGTCCAGATGCCCAGCATGGTG) を合成し、それぞれを 1 nmolずつ含む 1の TE溶液を調整した（配列表の配列番号 83および 84) 。この TE溶液を 95°Cで 5分加熱後、 16°Cまで徐冷することにより、これらのォリゴヌクレオチドをァニーリングし、二本鎖 DNA の両端にそれぞれ EcoRI 切断配列と Spel切断配列を持つ DNA断片を得た。これを上述の 16塩基欠損したプラスミドの EcoRI サイ卜と Spelサイト間に挿入し、 pM1081を得た。

( 2 ) ポリペプチド ND38をコードする塩基配列を有するプラスミド pM1253の作製

まず、センスプライマ一 ll (CTGACTAGTGTCGCTAAGGAGCTGAGGAAA)を合成した。これは、ヒト Fas抗原シグナルペプチドをコードする塩基配列に加えて、配列表の配列番号 3の 39番目のリジンから 4 3番目のリジンまでのァミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、配列中に Spelサイト（ACTAGT)を含んでいる（配列表の配列番号 85) 。一方、アンチセンスプライマー 11として、配列番号 15の Apalサイト（G GGCCC)より下流 3'側に位置する塩基配列をもとに (TAAGCCGAAAAACGTCTGAG)を化学合成した（配列表の配列番号 86) 。

得られたセンスプライマ一 11とアンチセンスプライマー 11をそれぞれ ΙΟΟρ mol 、実施例 12 ( 1 ) で作製したプラスミド pEX- hFLlを 50ng、 pfu DNA ボリメラーゼを 2. 5 U、添付の pfuバッファーを 10 1含む 100 p. 1の溶液を調製し、実施例 18 ( 1 ) と同様に PCR を行った。この PCR産物を Spelおよび Apalで二重消化し、ァガロースゲル電気泳動に供した。約 400bp の DNA断片を回収し、キアエツクスキットを用いて DNA を精製した。（1 ) で作製したプラスミド pM1081の Spel サイ卜と Apalサイ卜との間に上述の約 400bp の DNA断片を挿入しプラスミド pM12 53を得た。 ( 3 ) ポリペプチド ND40をコードする塩基配列を有するプラスミド PM1254の作製

まず、センスプライマー 12CCTGACTAGTGTCGCTCTGAGGAAAGTGGCC)を合成した。これは、上ト Fas抗原シグナルべプチドをコ一ドする塩基配列に加えて、配列表の配列番号 3の 41番目のロイシンから 45番目のァラニンまでのァミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、配列中に Spelサイト（ACTAGT)を含んでいる（配列表の配列番号 87) 。

このセンスプライマー 12およびアンチセンスプライマ一 11を用いて（2 ) と同様に PCR を行い、得られた PCR産物をプラスミド PM1081に挿入して、プラスミド PM1254を得た。

( 4 ) ポリペプチド ND41をコードする塩基配列を有するプラスミド PM1255の作製

まず、センスプライマ一 13CCTGACTAGTGTCGCTAGGAAAGTGGCCCAT)を合成した。これは、ヒト Fas抗原シグナルペプチドをコードする塩基配列に加えて、配列表の配列番号 3の 42番目のアルギニンから 46番目のヒスチジンまでのァミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、配列中に Spelサイト（ACTAGT)を含んでいる（配列表の配列番号 88) 。

このセンスプライマー 13およびアンチセンスプライマー 11を用いて（2 ) と同様に PCR を行い、得られた PCR産物をプラスミド PM1081に挿入して、プラスミド PM1255を得た。 ( 5 ) ポリペプチド ND42をコードする塩基配列を有するプラスミド PM1256の作製

まず、センスプライマー 14(CTGACTAGTGTCGCTAAAGTGGCCCATTTA)を合成した。これは、ヒト Fas抗原シグナルペプチドをコードする塩基配列に加えて、配列表の配列番号 3の 43番目のリジンから 47番目のロイシンまでのァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を有し、配列中に Spelサイト（ACTAGT)を含んでいる（配列表の配列番号 89) 。

このセンスプライマ一 14およびアンチセンスプライマ一 11を用いて（2 ) と同様に PCR を行い、得られた PCR産物をプラスミド PM1081に挿入して、プラスミド PM1256を得た。

( 6 ) ポリペプチド ND43をコードする塩基配列を有するプラスミド pM1257の作製

まず、センスプライマー 15CCTGACTAGTGTCGCTGTGGCCCATTTAACA)を合成した。これは、ヒト Fas抗原シグナルペプチドをコードする塩基配列に加えて、配列番号 3の 44番目のバリンから 48番目のスレオニンまでのァミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、配列中に Spelサイト（ACTAGT)を含んでいる（配列表の配列番号 90) 。

このセンスプライマ一 15およびアンチセンスプライマー 11を用いて（2 ) と同様に PCR を行い、得られた PCR産物をプラスミド PM1081に揷入して、プラスミド PM1257を得た。

( 7 ) ポリペプチド CD179 をコードする塩基配列を有するプラスミド pM1259の作 -16CCTTGGTACCCTATTACTTATATAAGCC) およびセンスブライマ一 16(GAGCTACTGCACTACTGGGC)を合成した。アンチセンスプライマ一 16は、配列表の配列番号 3の 175番目のグリシンから 178番目のリジンまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列と終止コドン（TAA、 TAG). Kpnlサイト（GGTACC)を含む。センスプライマー 16は、配列番号 15のヒト Fasリガンド細胞外領域 DNA配列中の Apalサイト（GGGCCC)より上流 5'側に位置する配列である（配列表の配列番号 91および 92) 。

得られたセンスプライマー 16とアンチセンスプライマー 16それぞれ lOOpmol 、実施例 12 ( 1 ) で作製したプラスミド pEX-hFLlを 50ng、 pfu DNA ポリメラーゼを 2. 5 U、添付の pfuバッファーを 10 /〗含む 100 u】の溶液を調製し、実施例 18

( 1 ) と同様に PCR を行った。

この PCR 産物を Apalと Kpnlとで二重消化し、ァガロースゲル電気泳動に供した。約 170bp の DNA断片を回収し、キアエックスキットを用いて DNA を精製した。実施例 18 ( 2 ) で作製した PM1250の Apalサイトと Kpnlサイトとの間に上述の約 170bp の DNA断片を挿入した。得られたプラスミドを PM1259と命名した。

( 8 ) 動物細胞用発現プラスミド PM1083, pM1084, pM1085, pM1086, pM1087, pM 1089の作製

上記（2 ) ないし（7 ) で得た、プラスミド pM1253， pM1254, pM1255, pM 1256, p 1257, および pM1259をそれぞれ EcoRI と Κρηίで二重消化し、ァガロースゲル電気泳動に供した。

約 450bp (ただし、 PM1259の消化物の場合は約 600bp)の DNA断片を回収し、キァエックスキットを用いて DNA を精製した。実施例 18 ( 2 ) で使用した動物細胞を宿主に用いた発現用のプラスミド PM1103の EcoRI サイトと Kpnlサイトとの間に、上述の約 450 あるいは約 600bp の DNA断片を挿入した。

得られたプラスミドをそれぞれ pM1083(ND38), pM1084(ND40), p 1085(ND41), PM1086CND42), pM1087(ND43), および pM1089(CD179) と命名した。

( 9 ) COS細胞への導入

実施例 18 ( 2 ) で作製した pM1070並びに（8 ) で作製した pM1083, p 1084, p 1085, pM1086, p 1087, および pM1089を実施例 18 ( 3 ) と同様に COS- 1 細胞へ導入し、形質転換体 COS- l/pM1070, C0S-l/p 1083, COS- 1/ρΜ1084, C0S-l/pM1085, C0S-l/pM1086, C0S-l/pM1087, および COS- 1/ρΜ1089を作製した。

すなわち、 0.5 a の pM1070、 p 1083, p 1084, p 1085, pM1086, pM1087, および PM1089を、各々別個に 2.5/ 1の 10mM Tris-HCl(pH7. 4)/lmM EDTA溶液に溶解した。これらに、それぞれ、 0.2mg/mlの DEAE—デキストランおよび 50mM Tris - HCl(pH 8 ) を含有する D-MEM (日水製薬（株）） 0.7ml を添加し、 DNA- DEAEデキストラン混合液を作製した。 6ゥエルプレート（9. 4cm²/ ゥエル、ヌンク社）でセミコンフルェントまで単層培養した C0S-1 細胞に上述の DNA- DEAEデキストラン混合液を滴下し、 5 %C0₂ 存在下、 37°Cにて培養し、形質転換体 COS- 1/PM1070, COS- 1/ρΜ1083, C0S-l/pM1084, COS- 1/ρΜ1085, C0S-l/pM1086, C0S-l/p 1087, および COS- 1/ρΜ1089を得た。

DNA- DEAEデキストラン混合液を滴下してから 4時間後に、 DNA — DEAEデキストラン混合液を除去し、 10%FCS (アーバンサイエンティフィック社）を含有する D- EM に交換し、さらに 96時間培養した。 C0S-l/pM1070, C0S-l/p 1083, COS - 1/ PM1084, C0S-l/pM1085, C0S-l/pM1086, C0S-l/pM1087, および COS- 1/ρΜ1089の培養上清を回収し、以下の実験に供した。

(10) ブラスミド導入 COS細胞の培養上清の細胞障害活性の確認

( 9 ) で得た各プラスミド導入 COS細胞の培養上清の細胞障害活性を、 WC8細胞を標的細胞として、実施例 8および実施例 12と同様に測定した。すなわち、 10^s 個の WC8細胞を、 20 Ciの [^{5 1}Cr] クロム酸ナトリウム（NEN社）を含む RPMI 1640培地を用レ、て 37°Cで 2時間培養し、 ⁵ ' Crで標識した。

^{5 1} Crで標識した細胞を 1 X 10⁴ 個含む反応液中に、（9 ) で得た細胞培養上清を終濃度 1 %、 3 %、 10%、 30%となるように添加し、 37°Cで 4時間培養後、 ^{5 1} Crの遊離を指標に細胞障害活性を測定した。

結果を図 39に示した。図 39から明らかなように、 COS- l/pM1070と同様に、 COS - 1/PM1083, C0S-l/pM1084および COS- 1/ρΜ1085，および C0S-l/pM1086の培養上清は、 WC8細胞に対して濃度依存的に細胞障害活性を示した。したがって、これらの培養上清中に含まれるヒト Fasリガンドの欠失変異体は、ヒト Fas抗原と結合してアポトーシスを誘導する活性を有すると考えられた。一方、 C0S-l/pM1087 および C0S-1/PM1089の培養上清では、 COS- 1/PM1070の培養上清に比べ、 WC8細胞に対する顕著な細胞障害活性が認められなかった。したがって、これらの培養上清中に含まれるヒト Fasリガンドの欠失変異体は、アポトーシスを誘導する活性を持たないかもしくは極めて弱レ、活性しか有していなレ、と考えられた。

このようなアポトーシスを誘導活性の失活の原因は、 Fasリガンドの N末端あるいは C末端のァミノ酸を欠失したことで、 Fasリガンドの立体構造が維持できなくなつたためと考えられた。逆に、アポトーシス誘導活性を失うほど N末端もしくは C末端のァミノ酸が欠失したァミノ酸配列を有するポリべプチドの N末端もしくは C末端に、立体構造を維持できるようなァミノ酸配列を付加した場合には、それが本来の欠失したアミノ酸配列と異なる場合であっても、アポトーシス誘導活性が再び現れると推測される。また同様に、このような欠失変異体に立体構造を維持できるように、アミノ酸置換を施すことによつても、アポトーシス誘導活性を付与することが可能であることが推測される。

(実施例 22) ヒト Fasリガンドの細胞外領域およびその N末端欠失変異体の大腸菌を宿主とする発現

( 1 ) プラスミド pM468 の作製

プラスミド PM468 は、プラスミド pBR322の誘導体であり、大腸菌内にて複製する機能、アンピシリン耐性遺伝子、トリブトファンプロモーター、アルカリフォスファ夕ーゼ（phoA) のシグナルぺプチドおよびヒト脖分泌性トリプシンインヒビ夕ーをコードする DNA を有するプラスミドとして構築されたプラスミドであり、 pM469 (モリシタ H. (Morishi ta H. ) 等、 Thrombosis Research. 73巻、 193-204 頁、 1994年）のカナマイシン耐性遺伝子をアンピシリン耐性遺伝子に置換して得た。

( 2 ) プラスミド PM1059の作製

( 1 ) で得られたプラスミド PM468 を Hindl l l 、 BamHI で二重消化し、 0. 8 % ァガロースゲル（シーケ厶 GTG(SeakeM GTG) 、宝酒造社）で分離し、目的とする DNA断片を含むゲルを切り出した。キアエックスキットを用いて、約 3. 3 kbpの DNA 断片を精製した。

また、 BstEI I、 KpnU BamHI サイトを有するように設計したアンチセンスブライマ一 17CCGCGGATCCGGTACCTTTTTTGGTAACCGGGGTAAACAG) とトリプロファンプロモ一夕一の Hindl l l サイト上流 5'側に位置するセンスプライマ一 17 CGCAAGTTCACGT AAAAAGC)を化学合成した（配列表の配列番号 93および 94) 。アンチセンスプライマ— 17は BamHI サイト（GGATCC)、 Kpnlサイト（GGTACC)、 BstEI Iサイト（GGTTA CC) 、およびアル力リフォスファターゼのシグナルぺプチドの C末端側を含んでいる。これらのプライマーを用いてプラスミド PM468 を铸型にして PCR を行なつた。

すなわち、上述の PCR用の铸型 DNA を含む溶液 100〃 1中に上記のプライマーを添加し、ジーンアンプキット（Gene Amp™ DNA Ampl ification Reagent Kit w i t Ampl iTaq™, 宝酒造社）を用いて、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3 分間を 1サイクルとして、 30サイクルの PCR を行なつた。

得られた PCR産物を HindI I〖と BamHI で二重消化し 4 %ァガロースゲル電気泳動で分離して約 120bp の DNA断片を回収し、 DNAを精製した。この DNA断片を上述したプラスミド pM468 由来の約 3. 3kbpの DNA断片と T4 DNAリガーゼ（宝酒造社）を用いてライゲ一シヨンし、大腸菌 JM109 を形質転換することにより、プラスミド PM1059を得た。

( 3 ) ヒト Fasリガンドの細胞外領域の大腸菌を宿主とする発現プラスミド ρΜΙΟ 68の作製

センスプライマー 18 (TTGAAGCTTAAAAAAGGGTATAAAATAAAATGCAGCTCTTCCACCT)、ァンチセンスプライマー 18 (AAGGTCGACTATTAGAGCTTATATAAGCC) を化学合成機にて合成した（配列表の配列番号 95および 96) 。センスプライマー 18は、大腸菌トリプトフアンプロモーター/オペレーターの一部をコードする塩基配列、開始コドン (ATG)、配列表の配列番号 3のヒト Fasリガンド細胞外領域のうちの N末端部分をコードする塩基配列、 Hindl l l サイト（AAGCTT)を含む。アンチセンスプライマ一 18は配列表の配列番号 3のヒト Fasリガンド細胞外領域の C末端部分をコードする塩基配列、終止コドン（TAA, TAG)および Sai lサイト（GTCGAC)を含む。

得られたプライマーをそれぞれ lOOpmol 、実施例 12 ( 1 ) で得たプラスミド pB X - hFLlを 50ng、 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTPをそれぞれ 20nmol、 2. 5 ュニットの pfu DNA ポリメラーゼと添付の pfuバッファー 10/z 1とを含む 100 u 1の溶液を調製し、実施例 18 ( 1 ) と同様に PCR を行った。得られた PCR産物を Hindl l l と Sai l で二重消化し、ァガロースゲル電気泳動に供した。

約 600bp の DNA断片を回収し、キアエックスキットを用いて DNA を精製した。 ( 1 ) で得たプラスミド pM468 の Hindl l l サイト、 Sai lサイト間に上述の約 600 bpの DNA断片を挿入し、 PM1068を得た。

( 4 ) ヒト Fasリガンドの細胞外領域の大腸菌を宿主とする分泌発現プラスミド PM1069の作製

センスプライマー 19(GGGGGTTACCAAAGCCCAGCTCTTCCACCT)を合成した（配列表の配列番号 97) このセンスプライマーはアルカリフォスファターゼシグナルぺプチドの一部をコードする塩基配列、配列表の配列番号 3のヒト Fasリガンド紬胞外領域の N末端部分をコードする塩基配列、 BstEHサイト（GGTTACC) を含む。得られたセンスプライマー 19と（3 ) で用いたアンチセンスプライマー 18(AAG GTCGACTATTAGAGCTTATATAAGCC) をそれぞれ lOOpmol 、実施例 12 ( 1 ) で得たブラスミド pBX- hFLlを 50ng、 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTPをそれぞれ 20nmol、 2. 5ュニッ卜の pfu DNA ポリメラーゼと添付の pfu ノくッファー 10 1とを含む 100 1の溶液を調製し、実施例 18 ( 1 ) と同様に PCR を行った。得られた PCR産物を BstEI Iと Sal Iで二重消化し、ァガロースゲル電気泳動に供した。約 600 bpの DNA断片を回収し、キアエックスキットを用いて DNA を精製した。（2 ) で得たプラスミド pM1059の BstEI Iサイトと Sai lサイ卜との間に挿入し、 PM1069を得た。

( 5 ) ヒト Fasリガンドの細胞外領域の N末端 38アミノ酸残基を欠損するべプチドの大腸菌を宿主とする分泌発現プラスミド PM1073の作製

センスプライマー 20(CCCGGTTACCAAAGCCAAGGAGCTG) 、アンチセンスプライマ一 20(TAAGCCGAAAAACGTCTGAG)を化学合成した（配列表の配列番号 98および 99) 。センスプライマー 20はアル力リフォスファターゼシグナルぺプチドの一部をコ一ドする塩基配列、配列表の配列番号 3のヒト Fasリガンド細胞外領域のうち、 N末端ァミノ酸 38残基を欠損するべプチド（ND38) の N末端をコードする塩基配列、 BstEI Iサイト（GGTTACC) を含む。アンチセンスプライマー 20は、配列表の配列番号 15のヒト Fasリガンド細胞外領域 DNA配列中の Apalサイト（GGGCCC) より下流 3'側に位置する塩基配列である。

得られたプライマーをそれぞれ lOOpmol 、実施例 12 ( 1 ) で得たプラスミド pB X-hFLlを 50ng、 dATP、 dCTPヽ dGTP、 dTTPをそれぞれ 20nmol、 2. 5 ュニットの pfu DNA ポリメラーゼと添付の pfu ノ<ッファー 10〃 1とを含む 100 1の溶液を調製し、実施例 18 ( 1 ) と同様に PCR を行った。得られた PCR産物を BstEI Iと Apalで二重消化し、ァガロースゲル電気泳動に供した。約 300 bpの DNA断片を回収し、キアェックスキットを用いて DNA を精製した。（ 4 ) で得たブラスミド PM1069の BstEI Iサイト、 Apalサイト間に上述の約 300 bpの DNA断片を挿入し、 pM1073を得た。 ( 6 ) 形質転換体の作製およびヒト Fasリガンドの発現

(3) 、（4) 、 (5) で得たプラスミド PM1068, pM1069, pM1073を用い、ハナノヽンの方法（Hanahan, D.著、 Techniques for Transformation of E. Coli, In ： DNA cloning, Vol, 1, Glover. DJi.(ed), 109— 136 頁、 IRL 出版（IRL

Press), 1985年）により大腸菌 JE5505株を形質転換し、組換え大腸菌 JE5505(p M1068), JE5505(pM1069), JE5505(pM1073)を作製した。

得られた形質転換体それぞれを、 50ug/mlのアンピシリン含有 L—ブロース 5 mlにて一夜培養した。次レ、で 50 g/mlアンピシリン含有 M9CA培地 25mlにこの埼養液 0.5ml を植菌し、 37°Cにて 3ないし 4時間培養した後、培養液の 0D₅₅。がおおよそ 1になった時点で培地に終濃度 10〃 g/mlの 3 —インドールァクリル酸（和光純薬工業社）を添加し、さらに約 24時間培養した。得られた培養混合物を遠心分離し、上清と菌体をそれぞれ回収した。

(7) 形質転換体の菌体および培養上清を使用したウエスタンプロッティング実施例 18 (5) と同様にヒト Fasリガンドのアミノ酸配列の一部（PSPPP EKKELRKVAH) を認識するゥサギ抗血清を用いてウエスタンプロッティングを行った。

まず、（6) で得た形質転換体 JE5505(pM1068), JE5505(pM1069)および JE5505 (PM1073)の菌体（ 1mlの培養液相当）に RIPAバッファー（150mM NaCl, 1%NP 一 40、 0.1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.2U/ml Aprotinin を含む 50mM T ris-HCl(pH7.5)) 1 nilを加え、 30分間撹拌した後、遠心し、その上清を回収した。得られた形質転換体由来の上清および（6) で得た形質転換体の培養上清 10 1を、それぞれ蒸留水 5 / 1 と混合した。これらに； 4%SDS、 80%グリセロール、 0. 04%BPBを含む溶液 5 1 ；もしくは 4 %SDS、 80%グリセロール、 8 %DTT、 0.04%BPB を含む溶液 5 1を加え、それぞれ 37°Cで 1時間処理した後、 SDS- PAGEを行った。泳動終了後、 PVDF膜（アト一社）に室温にて 200mA、 60 分の条件で転写した。スキムミルク（雪印乳業（株））を使用して 4 °Cで一夜反応させ、ブロッキングを行ったのち、メンブレンを PBSで 1回、 0. 1% Tween 20/ PBSで 2回洗浄した。

上述のゥサギ抗血清を 0. 5% BSA/0. 1% Tween 20/PBSで 1, 000倍に希釈し、 37°C で 1時間反応させた。反応終了後、 0. 1% Tween 20/PBSで 2回洗浄した。洗浄後さらに 0.5% BSA/0. 1% Tween 20/PBSで 500 倍に希釈したペルォキシダーゼ標識抗ゥサギィ厶ノグロブリンズ抗体（Cat.番号 P448、ダコ（DAKO)社）溶液に浸し、室温で 1時間反応させた。メンブレンを 0. 1% Tween 20/PBSで 5回洗浄し、表面の水を切り、 ECL システム（アマ一シャム社）で検出した。

図 40に示したように JE5505(pM1068)の形質転換体および培養上清中にヒト Fas リガンド細胞外領域に相当するバンドが、非還元条件下では約 21kD付近と 23kD付近に 2本、還元条件下では約 23kD付近に 1本認められた。

また、図 41に示したように、 JE5505(pM1069)の形質転換体および培養上清中に、ヒト Fasリガンド細胞外領域に相当する明瞭なバンドが、非還元条件下、還元条件下の両者におし、て 23kD付近に認められた。

(参考例 1 ) gld(C3H gld/gld ) マウスからの Fasリガンドに対する cDNAのクロ一ニング

gld(C3H gld/gld ) マウスの脾臓細胞を実施例 14の方法で培養し、実施例 1 4 の方法で 1本鎖 cDNAの合成および PCR を行った。得られた PCR産物を、 Xbalで制限酵素処理後、 1 %ァガロースゲルで分離し、約 940bpDNAフラグメントを回収した。これを、 pBluescript I I KS(+)の Xbalサイトにサブクローニングし、その塩基配列を決定した。得られた塩基配列を、実施例 14 ( 1 ) で確認した配列と比較したところ、得られた PCR産物の配列は、実施例 14 ( 1 ) で得られた配列の 3'末端近くの T (配列番号 32の塩基番号 849 ) が Cに変異していることが明らかになった（配列表の配列番号 100 ) 。この 1塩基の変異により、アミノ酸配列にも変異が生じていた。すなわち、 gldマウスにおいては、マウス Fasリガンドの細胞外領域に位置する 273番目のァミノ酸がフヱニルァラニンからロイシンに変異していた。

(参考例 2 ) gld マウス由来の Fasリガンドの細胞障害活性

参考例 1で得られた約 940 bpの Xbalフラグメントを、動物細胞発現ベクター pE F-BOS の Xbal部位に挿入した。実施例（2 ) と同様の方法で、 COS細胞を形質転換した。形質転換した COS細胞をエフェクター細胞とし、実施例 14 ( 3 ) の方法で細胞障害活性を測定した。その結果、 gldマウスより得られた Fasリガンド cD NAで形質転換させた COS細胞は細胞障害活性を示さなかった（図 26) 。以上の結果より、自己免疫疾患のモデルである gldマウスでは、 Fasリガンドによるアポトーシスの誘導が正常に起こらないことが確認された。

今回の結果と、ォガサワラ（Ogasawara ）等の報告から、自己免疫疾患の原因として、 Fas抗原の異常および Fasリガンドの異常の少なくとも 2つがあることが示唆された。いずれの場合も、自己反応性の T細胞にアポトーシスを誘導することができず、自己反応性の T細胞が生体内より除去されなかったため、自己免疫疾患が生じることが予想された。産業上の有用性

本発明により、 Fasリガンドおよびその一部である新規ポリべプチドが提供される。当該新規ポリペプチドは、 Fas抗原を介したアポトーシスが関与する疾患、たとえば自己免疫疾患や、ウィルス感染の治療薬として開発する事ができる。また、当該新規ポリペプチドは抗体を作製する際の抗原として使用できるほか、試料中の当該ポリペプチドを、抗体を使用して競合反応にて測定する際に使用することができる。

本発明によればまた、 Fasリガンドもしくはその一部をコードする DNAが提供される。

当該 DNA は、前記新規ポリペプチドを遺伝子工学的手法を使用して、工業的に大量生産するために使用できる。また、 DNA プローブを作製するためにも使用できる。さらに、自己免疫疾患では、遺伝的にアポトーシスの機構が欠損しているケースが考えられるが、当該新規 DNA は、このような疾患の遺伝子治療にも使用する事ができる。

さらに、 DNA配列が明らかになったことにより、 Fasリガンド遺伝子もしくは Fasリガンドに対する mRNAの一部に相補的な塩基配列を含むォリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が提供される。当該オリゴヌクレオチドは、 F asリガンドの発現を調節するために使用できる他、診断用プローブとしても利用できる。 ο ε τ

0Ζ\ 9ΐΐ Οΐϊ

Π31 ηΐθ J8S ΙΒΛ usv 〖ΒΛ JAX naq SIR dsv ^I ^Ml naq usy

901 ΟΟΐ 96

3Md Λ BIV Aio naq αΑχ J9S J3S 3JV dJl m ^ΐθ J¾

06 98 08

J SAQ jAi J9S s i io W。 ^ 八 naq dsy uio

9Z 0 99

OJJ JA sA J9S usv SJV ιΑ Ι¾Λ sAq STH S naq OJJ naq

09 99 09

usv usv SAO s uio 13 V 3Md s J9S Ι^Λ 9 d

0 98

J人丄 naq J¾ nio usy 9Π 八 Π9 A sXq s q 丄 s

OS 92 OS

八 Aio J9S naq naq 八 9Π 丄 J 1 dsv n d¾ naq 9ΐ Οΐ 9 ϊ

0Jd W J8S SJV usv J3S δλη λΐθ JMi ngq SIH ¾ ί^Λ sAq

：葛ゝ,ベ -

難, ： ows

IO/t^df/I3d €6Z£I/S6 OM. Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu Tyr

125 130 135 lys Leu

137 配列番号： 2

配列の長さ： 1 3 8

配列の型：アミノ酸

配列の種類：タンパク質

配列：

Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met 1 5 10 15

Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly He Val Leu Leu Ser Gly

20 25 30

Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn

50 55 60

Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr

65 70 75

Pro Gin Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys

80 85 90 l 3 1 ζ ε ΐ

09 59 09

dJl nio naq OJJ }d\ J3S V s usy s sAq AIQ JIU n9つ SIH

0 9S

BIV ΙΒΛ sAq 3jy naq ι ο sAq sAq nig OJ,J oij OJJ JDS OJJ SIH

OS 92 OS

^ΐθ 911 uiO sAq nio naq jas J9S ¾IV J¾ STH uio as J 9ΐ Οΐ 9 ΐ 9S nig 3JV naq n^g BIV na n^g s ui ^N91 ^siH ^9lW ⁿ⁹l ^UI3

··麵葛べ ^: nou

翊ミ丄： mw

8SI

SSI 02Ϊ ZI

naq Aio gqj 9i]d J¾ UJQ S nio nig 9i usy ηοη J9S ngq

0Z\ 9Π 0Π

nio -I3S usv ΐ^Λ J'U "91 STH dsy ¾IV s J nsq usy 3Md

GOT 00 ΐ 96

ΐ¾Λ Biv Αΐθ η9η JXi J3S Jas 3-iy ¾IV 1 \ uiO ^ΐθ J¾ I0/f"6dr/XDd €6Z£X/S6 ΟΛ Glu Asp Thr Tyr Gly l ie Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys

65 70 75

Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr

80 85 90

Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu

95 100 105

Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gin Asp Leu

110 115 120

Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gin

125 130 135

Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr

140 145 150

Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val

155 160 165

Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

170 175 179 配列番号： 4

配列の長さ： 2 8 1

配列の型：アミノ酸

配列の種類：タンパク質

配列： ε τ

99 ΐ 09 ΐ 99ΐ

dsv nio d l nig つ。· ^ S V S usv S sA 13

091 m 0Π

naq S TH ¾IV Λ sAq SJV nio sAq sAq nio OJd OJJ OJd

9SI OS! ΐ

J9S OJd sin Aio 911 «Ϊ0 s nio naq s S ^IV J¾ SIR

OZl 911 0Π

uio ^J J3S ni 3JV na ¾iv naq nio sAq uio "31 S IR

90Ϊ 001 96

slid naq ui ne naq 八 naq ¾iv Λ na

06 98 08

\ 13W 9Md 3Md 八 Π9 η3 s na ¾ J9S S IH usy

9Z 0丄 99

IO §^JV sAq sAq naq OJJ OJJ na OJJ ngq ojj OJJ naq OJJ OJJ

09 99 09

OJd OJd OJd OJd OJd OJd naq OJJ OJJ OJJ OJJ OJJ OJJ OJJ OJJ

0 9S

o d 3-iV v UIO ^IO OJd 3JV 3JV o^d ^J OJJ s OJd

08 93 02

naq ΙΒΛ Aio OJd OJd BIV 丄 OJd J9S J9S ¾IV s J9S dsy

9ΐ Οΐ 9 ΐ

d-ΐχ JAi 9ii «10 OJd 丄 OJd JAi usy 3 d OJd uio UI9 lO/f6dT/I3J €6Z£I/S6 OAV Tyr Gly He Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly

170 175 180

Leu Val l ie Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val

185 190 195

Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys

200 205 210

Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gin Asp Leu Val Met Met

215 220 225

Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gin Met Trp Ala

230 235 240

Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp

245 250 255

His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu

260 265 270

Glu Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

275 280 281 配列番号： 5

配列の長さ： 1 3 7

配列の型：アミノ酸

配列の種類：タンパク質

配列： Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro Arg .Ser Arg Ser l ie Pro

1 5 10 15

Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu l ie Ser Gly Val

20 25 30

Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val lie Asn Glu Ala Gly Leu Tyr

35 40 45

Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Ser

50 55 60

Gin Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Phe Lys Tyr Pro

65 70 75

Gly Asp Leu Val Leu Met Glu Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys Thr

80 85 90

Thr Gly Gin l ie Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe

95 100 105

Asn Leu Thr Val Ala Asp His Leu Tyr Val Asn l ie Ser Gin Leu

110 115 120

Ser Leu l ie Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr

125 130 135 lys Leu

137 配列番号： 6 配列の長さ： 1 3 8

配列の型：アミノ酸

配列の種類：タンパク質

配列：

Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro Arg Ser Arg Ser l ie

1 5 10 15

Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu l ie Ser Gly

20 25 30

Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Ala Gly Leu

35 40 45

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn

50 55 60

Ser Gin Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Phe Lys Tyr

65 70 75

Pro Gly Asp し eu Val Leu Met Glu Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys

80 85 90

Thr Thr Gly Gin lie Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val

95 100 105

Phe Asn Leu Thr Val Ala Asp His Leu Tyr Val Asn l ie Ser Gin

110 115 120

Leu Ser Leu lie Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu

125 130 135 8 ε τ

90 ΐ 00 ΐ 96

ΠΘ 0Jd υιο S usv SAQ s uio 3JV 9Md 1 Ι¾Λ sAq s

06 38 08

丄 ΐ^Λ 9qd JAx na Aio ¾IV nio usv 3ΐΙ ΐ^Λ 13 ^ΐθ sAq

9 01 39

sAq J^i sAq ΐ¾Λ ^ΐθ s 9Π naq ¾ιν Jqi ^10 丄 J¾ dsy

09 S9 09

dj丄 n naq ojd 9Π J9S 3JV S Sjy 0Jd usv ^IO SIH

9^ 0 9S

BIV J9S 3^JV ojj

USV

OS 93 02

BIV θΐΐ UIO sA nio ^ d ^J9S ΐ^Λ ^ naq Jd$ SIH US

91 01 9 ΐ

nio 3JV neq nig Έ\/ na sAq uio n^l s?H 3Md uig

^: 翊： fiSOfi^3l 6 Z ΐ ^: ^ω ^Ι L： ¼蓥園

88 ΐ

naq sAq i SlOIP6d£llDd £6 I/S6 OAV Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu

110 115 120

Val Leu Met Glu Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gin

125 130 135 l ie Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr

140 145 145

Val Ala Asp His Leu Tyr Val Asn l ie Ser Gin Leu Ser Leu l ie

150 155 .160

Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

165 170 179 配列番号： 8

配列の長さ： 2 7 8

配列の型：アミノ酸

配列の種類：タンパク質

配列：

Met Gin Gin Pro Val Asn Tyr Pro Cys Pro Gin l ie Tyr Trp Val

5 10 15

Asp Ser Ser Ala Thr Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe

20 25 30

Ser Cys Pro Ser Ser Gly Pro Arg Gly Pro Gly Gin Arg Arg Pro

35 40 45 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gin

50 55 60

Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Ser Pro Leu Lys Lys Lys Asp Asn

65 70 75

He Glu Leu Trp Leu Pro Val l ie Phe Phe Met Val Leu Val Ala

80 85 90

Leu Val Gly Met Gly Leu Gly Met Tyr Gin Leu Phe His Leu Gin

95 100 105

Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn His Ser Leu Arg

110 115 120

Val Ser Ser Phe Glu Lys Gin l ie Ala Asn Pro Ser Thr Pro Ser

125 130 135

Glu Thr Lys Lys Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro

140 145 150

Arg Ser Arg Ser l ie Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Thr

155 160 165

Ala Leu l ie Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie

170 175 180

Asn Glu Ala Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg

185 190 195

Gly Gin Ser Cys Asn Ser Gin Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met

200 205 210 Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu Val Leu Met Glu Glu Lys

215 220 225

Lys Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gin l ie Trp Ala His Ser Ser

230 235 240

Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Val Ala Asp His Leu Tyr

245 250 255

Val Asn He Ser Gin Leu Ser Leu l ie Asn Phe Glu Glu Ser Lys

260 265 270 Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

275 278 配列番号： 9

配列の長さ： 1 3 7

配列の型：アミノ酸

配列の種類：タンパク質

配列：

Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro His Ser Arg Ser l ie Pro 1 5 10 15

Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu He Ser Gly Val

20 25 30

Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Thr Gly Leu Tyr

35 40 45 Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Asn

50 55 60

Gin Pro Leu Asn His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro

65 70 75

Glu Asp Leu Val Leu Met Glu Glu Lys Arg Leu Asn Tyr Cys Thr

80 85 90

Thr Gly Gin He Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe

95 100 105

Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn He Ser Gin Leu

110 115 120

Ser Leu l ie Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr

125 130 135 lys Leu

137 配列番号： 1 0

配列の長さ： 1 3 8

配列の型：アミノ酸

配列の種類：タンパク質

配列：

Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro His Ser Arg Ser l ie 1 5 10 15 Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu l ie Ser Gly

20 25 30

Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn

50 55 60

Asn Gin Pro Leu Asn His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr

65 70 75

Pro Glu Asp Leu Val Leu Met Glu Glu Lys Arg Leu Asn Tyr Cys

80 85 90

Thr Thr Gly Gin l ie Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val

95 100 105

Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn lie Ser Gin

110 115 120

Leu Ser Leu lie Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu

125 130 135

Tyr Lys Leu

138 配列番号： 1 1

配列の長さ： 1 7 9

配列の型：アミノ酸配列の種類：タンパク質

配列：

Gin Leu Phe His Leu Gin Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Phe

1 5 10 15

Thr Asn Gin Ser Leu Lys Val Ser Ser Phe Glu Lys Gin l ie Ala

20 25 30

Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Lys Lys Glu Pro Arg Ser Val Ala

35 40 45

His Leu Thr Gly Asn Pro His Ser Arg Ser He Pro Leu Glu Trp

50 55 60

Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu l ie Ser Gly Val Lys Tyr Lys

65 70 75

Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr

80 85 90

Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Asn Gin Pro Leu

95 100 105

Asn His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glu Asp Leu

110 115 120

Val Leu Met Glu Glu Lys Arg Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gin

125 130 135

He Trp Ala His Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr

140 145 150 Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn l ie Ser Gin Leu Ser Leu He

155 160 165

Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

170 175 179 配列番号： 1 2

配列の長さ： 2 7 9

配列の型：アミノ酸

配列の種類：タンパク質

配列：

Met Gin Gin Pro Met Asn Tyr Pro Cys Pro Gin He Phe Trp Val

5 10 15

Asp Ser Ser Ala Thr Ser Ser Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe

20 25 30

Pro Cys Pro Ser Cys Gly Pro Arg Gly Pro Asp Gin Arg Arg Pro

35 40 45

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gin

50 55 60

Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Thr Pro Leu Lys Lys Lys Asp His

65 70 75

Asn Thr Asn Leu Trp Leu Pro Val Val Phe Phe Met Val Leu Val

80 85 90 9 I

992 092

Π91 SIH dsy BIV ^J "91 usy sqd Ι¾Λ ¾IV ^10 ^N J s

9S2 082

S stH ^IV dJl 911 UI9 3 ^JM1 sAQ J usy na 3jy sA

922 OZZ 9Ϊ2

nio nio naq na dsy OJJ J sXq J3S usy 8Jy

01 90S 002

•U丄 Ι¾Λ s q SIH usv "31。Jd ^ΐθ usv usv S "Ϊ0 13 V

96 ΐ 061 981

3Md 丄 sAq J3S JA Ι¾Λ 9qd JAi na XIQ J¾ n usv 9Π

08ΐ 9ZI Oil

ΙΒΛ naq A19 AJO sX sAq ·ΐλ丄 sAq Ι¾Λ i) s \\ naq ¾iv J¾

991 091 991

ΑΐΟ 丄 jqx dsy nio 丄 nsq OJd J3S 8JV s SIR OJJ

091 0Π

usy ^IO J¾ Π31 SIH ¾IV ΐ¾Λ s 3Jy OJd n sAq s nio ^J3S

SSI OST I

o d J I J9S OJd usv ¾IV 3ΪΙ uio sAq nio ^Md S ^J9S ΐ^Λ δλη Z\ 9ΐΐ ΟΠ

naq J9S usy J ^ d "10 V naq n|9 ^iv naq nio sXq uio

90ΐ 001 96

naq SIH 9Md naq uio J i I9jy λιο naq

3 ΐ¾Λ naq ¾IV Tyr Val Asn lie Ser Gin Leu Ser Leu He Asn Phe Glu Glu Ser

260 265 270

Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

275 279 配列番号： 1 3

配列の長さ： 4 1 1

配列の型：核酸

配列の種類： c DNA t o mRNA

配列：

AAA GTG GCC CAT TTA ACA GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT 45

CTG GAA TGG GAA GAC ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG 90 AAG TAT AAG AAG GGT GGC CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC 135 TTT GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC 180

CTG CCC CTG AGC CAC AAG GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC 225

CAG GAT CTG GTG ATG ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT 270

ACT GGG CAG ATG TGG GCC CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC 315

AAT CTT ACC AGT GCT GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC 360

TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT 405

AAG CTC 411 配列番号： 1 4 配列の長さ： 4 1 4

配列の型：核酸

配列の種類： c DNA t 0 mRNA

配列

AGG AAA GTG GCC CAT TTA ACA GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG 45

CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA 90

GTG AAG TAT AAG AAG GGT GGC CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG 135

TAC TTT GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC 180

AAC CTG CCC CTG AGC CAC AAG GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT 225

CCC CAG GAT CTG GTG ATG ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC 270

ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG 315

TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG 360

CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA 405

TAT AAG CTC 414 配列番号： 1 5

配列の長さ： 5 3 7

配列の型：核酸

配列の種類： c DNA t o mRNA

配列

CAG CTC TTC CAC CTA CAG AAG GAG CTG GCA GAA CTC CGA GAG TCT 45

ACC AGC CAG ATG CAC ACA GCA TCA TCT TTG GAG AAG CAA ATA GGC 90 CAC CCC AGT CCA CCC CCT GAA AAA AAG GAG CTG AGG AAA GTG GCC 135

CAT TTA ACA GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG 180

GAA GAC ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT AAG 225

AAG GGT GGC CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT 270

TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC CTG CCC CTG 315

AGC CAC AAG GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG 360

GTG ATG ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT ACT GGG CAG 405

ATG TGG GCC CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC 450

AGT GCT GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC 495

AAT TTT GAG GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC 537 配列番号： 1 6

配列の長さ： 8 4 3

配列の型：核酸

配列の種類： c DNA t 0 mRNA

配列：

ATG CAG CAG CCC TTC AAT TAC CCA TAT CCC CAG ATC TAC TGG GTG 45 GAC AGC AGT GCC AGC TCT CCC TGG GCC CCT CCA GGC ACA GTT CTT 90 CCC TGT CCA ACC TCT GTG CCC AGA AGG CCT GGT CAA AGG AGG CCA 135 CCA CCA CCA CCG CCA CCG CCA CCA CTA CCA CCT CCG CCG CCG CCG 180 CCA CCA CTG CCT CCA CTA CCG CTG CCA CCC CTG AAG AAG AGA GGG 225 AAC CAC AGC ACA GGC CTG TGT CTC CTT GTG ATG TTT TTC ATG GTT 270 CTG GTT GCC TTG GTA GGA TTG GGC CTG GGG ATG TTT CAG CTC TTC 315

CAC CTA CAG AAG GAG CTG GCA GAA CTC CGA GAG TCT ACC AGC CAG 360

ATG CAC ACA GCA TCA TCT TTG GAG AAG CAA ATA GGC CAC CCC AGT 405

CCA CCC CCT GAA AAA AAG GAG CTG AGG AAA GTG GCC CAT TTA ACA 450

GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACC 495

TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAG GGT GGC 540

CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT TCC AAA GTA 585

TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC CTG CCC CTG AGC CAC AAG 630

GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG GTG ATG ATG 675

GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC 720

CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAT 765

CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG 810

GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC 843 配列番号： 1 Ί

配列の長さ： 4 1 1

配列の型：核酸

配列の種類： c DNA t o mRNA

配列：

AGT GTG GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT 45

CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG 90 AAG TAT AAG AAA GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC 135 TTC GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC 180

CAG CCC CTA AGC CAC AAG GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT 225

GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT 270

ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT 315

AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC 360

TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC TTT TTT GGC TTA TAT 405

AAG CTT 411 配列番号： 1 8

配列の長さ： 4 1 4

配列の型：核酸

配列の種類： c DNA t o mRNA

配列：

AGG AGT GTG GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC 45 CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA 90 GTG AAG TAT AAG AAA GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG 135 TAC TTC GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC 180 AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT 225 CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC 270 ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC CTA GGG GCA GTA 315 TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA 360 CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC TTT TTT GGC TTA 405 TAT AAG CTT 414 配列番号： 1 9

配列の数： 5 3

配列の型：核酸

配列の種類： c DNA t 0 mRNA

配列

CAA CTC TTT CAT CTA CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC 45

ACC AAC CAC AGC CTT AGA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC 90 AAC CCC AGC ACA CCC TCT GAA ACC AAA AAG CCA AGG AGT GTG GCC 135 CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 180

GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG 225

AAA GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT 270

TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA 315

AGC CAC AAG GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG 360

GTG CTA ATG GAG GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG 405

ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC 450

GTT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC 495

AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT 537 配列番号： 2 0

配列の長さ： 8 3 4 配列の型：核酸

配列の種類： c DNA t o mRNA

配列：

ATG CAG CAG CCC GTG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TAC TGG GTA 45

GAC AGC AGT GCC ACT TCT CCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT 90 TCT TGT CCA TCC TCT GGG CCT AGA GGG CCA GGA CAA AGG AGA CCA 135 CCG CCT CCA CCA CCA CCT CCA TCA CCA CTA CCA CCG CCT TCC CAA 180

CCA CCC CCG CTG CCT CCA CTA AGC CCT CTA AAG AAG AAG GAC AAC 225

ATA GAG CTG TGG CTA CCG GTG ATA TTT TTC ATG GTG CTG GTG GCT 270

CTG GTT GGA ATG GGG TTA GGA ATG TAT CAA CTC TTT CAT CTA CAG 315

AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAC AGC CTT AGA 360

GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC AAC CCC AGC ACA CCC TCT 405

GAA ACC AAA AAG CCA AGG AGT GTG GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC 450

CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA ACT 495

GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA GGC GGC CTT GTG ATC 540

AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG 585

GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG GTC TAT ATG 630

AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG AAG 675

AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC 720

TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT 765

GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG 810

ACC TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT 834 配列番号： 2 1

配列の数： 4 1 1

配列の種類：核酸

配列の型： c DNA t o mRNA

配列：

AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC CCC CAC TCA AGG TCC ATC CCT 45

CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA ACC GCT CTG ATC TCT GGA GTG 90 AAG TAT AAG AAA GGT GGC CTT GTG ATC AAC GAA ACT GGG TTG TAC 135 TTC GTG TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AAC 180

CAG CCC CTA AAC CAC AAG GTC TAT ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCT 225

GAG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG AAG AGG TTG AAC TAC TGC ACT 270

ACT GGA CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC 315

AAT CTT ACC AGT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC 360

TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC TTT TTC GGC TTG TAT 405

AAG CTT 411 配列番号： 2 2

配列の数： 4 1 4

配列の種類：核酸

配列の型： c DNA t o mRNA

配列： AGG AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC CCC CAC TCA AGG TCC ATC 45

CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA ACC GCT CTG ATC TCT GGA 90 GTG AAG TAT AAG AAA GGT GGC CTT GTG ATC AAC GAA ACT GGG TTG 135 TAC TTC GTG TAT TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC 180

AAC CAG CCC CTA AAC CAC AAG GTC TAT ATG AGG AAC TCT AAG TAT 225

CCT GAG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG AAG AGG TTG AAC TAC TGC 270

ACT ACT GGA CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTA 315

TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA 360

CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC TTT TTC GGC TTG 405

TAT AAG CTT 414 配列番号： 2 3

配列の数： 5 3 7

配列の種類：核酸

配列の型： c DNA t o mRNA

配列：

CAG CTC TTC CAC CTG CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC 45

ACC AAC CAA AGC CTT AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC 90 AAC CCC AGT ACA CCC TCT GAA AAA AAA GAG CCG AGG AGT GTG GCC 135 CAT TTA ACA GGG AAC CCC CAC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 180

GAA GAC ACA TAT GGA ACC GCT CTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG 225

AAA GGT GGC CTT GTG ATC AAC GAA ACT GGG TTG TAC TTC GTG TAT 270 TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AAC CAG CCC CTA 315

AAC CAC AAG GTC TAT ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCT GAG GAT CTG 360

GTG CTA ATG GAG GAG AAG AGG TTG AAC TAC TGC ACT ACT GGA CAG 405

ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC 450

AGT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC 495

AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC TTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT 537 配列番号： 2 4

配列の長さ： 8 3 7

配列の種類：核酸

配列の型： c DNA t o mRNA

配列：

ATG CAG CAG CCC ATG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TTC TGG GTA 45

GAC AGC AGT GCC ACT TCA TCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT 90 CCC TGT CCA TCT TGT GGG CCT AGA GGG CCG GAC CAA AGG AGA CCG 135 CCA CCT CCA CCA CCA CCT GTG TCA CCA CTA CCA CCG CCA TCA CAA 180

CCA CTC CCA CTG CCG CCA CTG ACC CCT CTA AAG AAG AAG GAC CAC 225

AAC ACA AAT CTG TGG CTA CCG GTG GTA TTT TTC ATG GTT CTG GTG 270

GCT CTG GTT GGA ATG GGA TTA GGA ATG TAT CAG CTC TTC CAC CTG 315

CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAA AGC CTT 36,0

AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC AAC CCC AGT ACA CCC 405

TCT GAA AAA AAA GAG CCG AGG AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC 450 CCC CAC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA 495

ACC GCT CTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA GGT GGC CTT GTG 540

ATC AAC GAA ACT GGG TTG TAC TTC GTG TAT TCC AAA GTA TAC TTC 585

CGG GGT CAG TCT TGC AAC AAC CAG CCC CTA AAC CAC AAG GTC TAT 630

ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCT GAG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG 675

AAG AGG TTG AAC TAC TGC ACT ACT GGA CAG ATA TGG GCC CAC AGC 720

AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAC CAT TTA 765

TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT 810

AAG ACC TTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT 837 配列番号： 2 5

配列の長さ： 1 6 2 3

配列の種類：アミノ酸

配列の型： c DNA t o mRNA

配列

TCAGAGTCCT 10

GTCCTTGACA CTTCAGTCTC CACAAGACTG AGAGGAGGAA ACCCTTTCCT GGGGCTGGGT 70 GCC ATG CAG CAG CCC GTG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TAC TGG GTA 118 Met Gin Gin Pro Val Asn Tyr Pro Cys Pro Gin l ie Tyr Trp Val

10 15

GAC AGC AGT GCC ACT TCT CCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT TCT 166

Asp Ser Ser Ala Thr Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe Ser 8 S ΐ

O 98 ΐ Οδΐ

八 J9S V OJd sAq s q J¾ j OJ J¾ ^ OJd usy ^IV 9Π 209 010 10V 00V V33 OVV VVV 30V WO 131 333 V3V 30V 333 OVV 339 VIV

92ΐ 02ΐ gn uio sxq nio ^ d s J9S ΐ^Λ V naq J9S S IH usy J¾ 9Md ni V VV3 9VV WO 111 101 VOl VIO VOV 110 30V OVO 3VV 33V Oil OVO 103 OH 90 ΐ 00 ΐ

nsq nio BIV naq ni s uio SIH

naq 310 WO VOO 010 WO OVV OVO VIO m ILL 013 m m 01V VOO Vll 96 06 98 08

^ΐθ ^ΐθ ΐΒΛ Π9Ί ^IV ΐ^Λ 191 ΐ¾Λ 9Md 9Md Λ OJd na 89S 099 OIV VOO 110 013 139 010 013 010 01V 311 111 VIV 010 303 VIO

9 QL 99 dj naq nig d\ \ usy dsy sAq s sA naq OJd J8S naq OJ^ oij nsq

OIS 001 013 OVO VIV OVV OVO OVV OVV 3VV VIO 103 09V VIO VOO 133 013

09 99 09

OJd OJd OJd UIO S OJd OJd OJJ OJd J9S OJ(j OJd OJd OJd OJd

Z9Z 030 000 V33 VV3 301 133 ODD V33 V丄 3 V30 VOl VOO 130 VOO VOO VOO

9^ Of' 9S

OJd OJd OJJ 8JV SJV "TO '《13 OJd Λΐθ 3JV o』d A J3S s OJd s

ΠΖ 130 030 V33 VOV 90V VV。 VOO V33 000 VOV 130 000 131 001 VOO 191

OS 93 QZ

66SlOIP6d£llDd €6Z£I/S6 OAV GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 550 Ala His Leu Thr Gly Asn Pro Arg Ser Arg Ser l ie Pro Leu Glu Trp

145 150 155

GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA 598 Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu He Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys 160 165 170 175

GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA 646 Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Ala Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys

180 185 190

GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG 694 Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Ser Gin Pro Leu Ser His Lys

195 200 205

GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG 742 Val Tyr Met Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu Val Leu Met Glu

210 215 220

GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC 790 Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys Thr Thr Gly Gin lie Trp Ala His Ser

225 230 235

AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT 838 Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Val Ala Asp His Leu Tyr 240 245 250 255

GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC 886

¾44Λ- ΐ 9 I

S!H dsy BIV s jqi naq usy 9Md Ι¾Λ ^IV ^IO ⁿ⁸1 S S 62S IVO IVO 100 10V OOV 110 IVV 311 010 VOO 000 013 OVl OOV 30V 06 98 08

sjv ¾iv uio ^io ^J¾ J¾ s jAi J9s s 人 m 300 339 001 91V 9V3 030 13V 13V 301 OVl OOV OIV 91V OVV 000

5 OZ 99

niO m m 八 dsv u OJd s J9S usv SJy J Q Z OVO OIV 9IV 010 0X3 IVO OVO 333 IVl OVV 101 3VV OOV OIV 3VX

09 99 09

Ι¾Λ s STH S n^l ojj nai usy usy s J9S UI ^ΐθ 3JV 3Md

^61 319 OVV OVO 39V 010 333 010 OVV OVV 001 131 VV3 130 003 311

9^ 0 9S

丄 sAq s JAi Ϊ¾Λ 9 d J naq

6 OVl VXO VVV 331 IVl VIO 111 OVl 010 000 XOV WO IVV 31V 010

OS 92 02

nsi ^IO ^ΐθ sA sA i s \ S ⁿ⁹ ΐ^Λ 13 113 300 100 OVV OVV IVl OVV 010 V90 131 113 013 310 11V VOO

9ΐ Οΐ 9

j jqx dsy nio dj丄 nij) naq oj ^ 3J J9S usy J3S sAq

69 IVl 33V OVO WO 001 WO 013 133 OIV 331 OOV VOX 3VV 031 OVV ooov omvmvo

^: \ 95 100 105

TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA 374

Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu

110 115 120

TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC TAA GAGAAGCACT 417

Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

125 130

TTGGGATTC 426 配列番号： 2 7

配列の長さ： 2 4 3 3

配列の種類：核酸

配列の型：他の核酸

配列：

AATTATAATG TATAAAAAAG CATGCAATTA TAATTCATAA AATTATAGCC CCACTGACCA 60 TTCTCCTGTA GCTGGGAGCA GTTCACACTA ACAGGGCTAT ACCCCCATGC TGACCTGCTC 120 TGCAGGATCC CAGGAAGGTG AGCATAGCCT ACTAACCTGT TTGGGTAGCA CAGCGACAGC 180 AACTGAGGCC TTGAAGGCTG TTATCAGAAA ATTGTGGGCG GAAACTTCCA GGGGTTTGCT 240 CTGAGCTTCT TGAGGCTTCT CAGCTTCAGC TGCAAAGTGA GTGGGTGTTT CTTTGAGAAG 300 CAGAATCAGA GAGAGAGAGA TAGAGAAAGA GAAAGACAGA GGTGTTTCCC TTAGCTATGG 360 AAACTCTATA AGAGAGATCC AGCTTGCCTC CTCTTGAGCA GTCAGCAACA GGGTCCCGTC 420 CTTGACACCT CAGCCTCTAC AGGACTGAGA AGAAGTAAAA CCGTTTGCTG GGGCTGGCCT 480

8S fcvJDd £6US6 OAV

Josg31VslvolJ. ivv β VVv一v:

666dT/ £SUS6 OA8s/6:sV

C

in LTD oo

LO LO LO

<

250 255 260

GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA 2099 Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu

265 270 275

TAT AAG CTC TAA GAGAAGCACT TTGGGATTCT TTCCATTATG ATTCTTTGTT 2151 Tyr Lys Leu

281

ACAGGCACCG AGAATGTTGT ATTCAGTGAG GGTCTTCTTA CATGCATTTG AGGTCAAGTA 2211 AGAAGACATG AACCAAGTGG ACCTTGAGAC CACAGGGTTC AAAATGTCTG TAGCTCCTCA 2271 ACTCACCTAA TGTTTATGAG CCAGACAAAT GGAGGAATAT GACGGAAGAA CATAGAACTC 2231 TGGGCTGCCA TGTGAAGAGG GAGAAGCATG AAAAAGCAGC TACCAGGTGT TCTACACTCA 2391 TCTTAGTGCC TGAGAGTATT TAGGCAGATT GAAAAGGACA CC 2433 配列番号： 2 8

配列の長さ： 1 7 0 7

配列の種類：核酸

配列の型： G e n o m i c DNA

配列：

CTGCGGAAAC TTTATAAAGA AAACTTAGCT TCTCTGGAGC AGTCAGCGTC AGAGTTCTGT 60 CCTTGACACC TGAGTCTCCT CCACAAGGCT GTGAGAAGGA AACCCTTTCC TGGGGCTGGG 120 TGCC ATG CAG CAG CCC ATG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TTC TGG GTA 169 Met Gin Gin Pro Met Asn Tyr Pro Cys Pro Gin l ie Phe Trp Val 1 5 10 15

GAC AGC AGT GCC ACT TCA TCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT CCC 217 Asp Ser Ser Ala Thr Ser Ser Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe Pro

20 25 30

TGT CCA TCT TGT GGG CCT AGA GGG CCG GAC CAA AGG AGA CCG CCA CCT 265 Cys Pro Ser Cys Gly Pro Arg Gly Pro Asp Gin Arg Arg Pro Pro Pro

35 40 45

CCA CCA CCA CCT GTG TCA CCA CTA CCA CCG CCA TCA CAA CCA CTC CCA 313 Pro Pro Pro Pro Val Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gin Pro Leu Pro

50 55 60

CTG CCG CCA CTG ACC CCT CTA AAG AAG AAG GAC CAC AAC ACA AAT CTG 361 Leu Pro Pro Leu Thr Pro Leu Lys Lys Lys Asp His Asn Thr Asn Leu

65 70 75

TGG CTA CCG GTG GTA TTT TTC ATG GTT CTG GTG GCT CTG GTT GGA ATG 409 Trp Leu Pro Val Val Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Met 80 85 90 95

GGA TTA GGA ATG TAT CAG CTC TTC CAC CTG CAG AAG GAA CTG GCA GAA 457 Gly Leu Gly Met Tyr Gin Leu Phe His Leu Gin Lys Glu Leu Ala Glu

100 105 110

CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAA AGC CTT AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG 505 Leu Arg Glu Phe Thr Asn Gin Ser Leu Lys Val Ser Ser Phe Glu Lys

115 120 125 8 9 ΐ

688 Vll IVO OVO 13010V 33V 113丄 VV 311 VIO V300000133V130V OOV

9S2 082

BIV djj, d\] ui io Jiu -im s 丄 usy na 3JV s nio

1^8 3V3330001 VIV 9V0 V0913V 13V 3013VI 3VV Oil OOV OVV OVO OVO

OZZ 912 OIZ

naq 八 naq dsy n|g OJ^ αλ sA JSS usy 3JV 1⁹W J ΐ¾Λ sAq

S6A OIV V丄 3019013 IVO OVO 133 IVl OVV 131 OVV OOV OIV IVl 310 OVV

0S 002 961

SIH usv Π3Ί 0Jd uio usv usy s s A 8J\/ ^Md ΐ^Λ sAq

S 3V0 OVV VI3333 OVO OVV OVV 001131 OVO 130000311 OVX VIO VVV

061 08 ΐ

J9S i ΙΒΛ 3Md -ΐ χ Π9つ /ί]9 jqx njQ usy θΐΐ 八 naq A]Q AIO sAq

Z69 301 IVl 0103113V丄 Oil 00013V VV9 OVV 31V 910113309109 VVV S I OZI 991 091 sAq JAi sAq ΙΒΛ Aio S naq \ J¾ AIO 丄 J¾ dsv niO ^d

69 OVV IVl OVV 010 VOO 13131V 01310003V VOO IVl VOV OVO WO 001

99 ΐ 091

nio naq OJJ 9Π S 3JV S SIH OJJ usy ΧΐΟ J 1 naq SIH ¾IV 八

109 WO 01010031V 331 OOV VOl 0V3033 OVV 000 VOV VII 1V3030010

On 9SI 081

J9S 3JV 0Jd njo s q sAq J9g OJJ jqx J9S 0Jd usv ¾1V 3ΐΙ "ΐθ

S9 10V OOV 030 OVD VVV VVV WO 101333 VOV 10V 3333VV 330 VIV VV3

668I0/^6df/X3J €6Z£I/S6 OA\

6S/S6 OAV dT 668Ϊ0//3*l :

LO LO CO

CO CO ( J CO LO O- CD C I C 1 OO OO LO CO O

<C >

<C -=C

、

CD

3 VV1 JJ一

。M 30 V s11V 31 oi 8i3l 00V 91U11 33 i0a 31〕3001011013 slLVV,v一、 . δ IV 0idi3vjs mmvv: 99I l〕io3議 0131Vivvjl ii 。on VV VVvvv

13JL0 8s i/*6dr/d £6S/S6 OAV-

CO LO O CO CO

GGAGAGCTGG CACTGCTGTC CACCCAGTAG ATCTGGGGAT ATGGGTAATT 850

GAAGGGCTGC TGCATGGCAG CTGGTGAGTC AGGCCAGCCC CAGCAAACGG 900

TTTTACTTCT TCTCAGTCCT GTAG 924 配列番号： 3 0

配列の長さ： 9 2 4

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸、 RNA

アンチセンス： y e s

配列：

GAAUCCCAAA GUGCUUCUCU UAGAGCUUAU AUAAGCCGAA AAACGUCUGA 50 GAUUCCUCAA AAUUGACCAG AGAGAGCUCA GAUACGUUGA CAUAUAAAUG 100 AUCAGCACUG GUAAGAUUGA ACACUGCCCC CAGGUAGCUG CUGCGGGCCC 150

ACAUCUGCCC AGUAGUGCAG UAGCUCAUCA UCUUCCCCUC CAUCAUCACC 200

AGAUCCUGGG GAUACUUAGA GUUCCUCAUG UAGACCUUGU GGCUCAGGGG 250

CAGGUUGUUG CAAGAUUGAC CCCGGAAGUA UACUUUGGAA UAUACAAAGU 300

ACAGCCCAGU UUCAUUGAUC ACAAGGCCAC CCUUCUUAUA CUUCACUCCA 350

GAAAGCAGGA CAAUUCCAUA GGUGUCUUCC CAUUCCAGAG GCAUGGACCU 400

UGAGUUGGAC UUGCCUGUUA AAUGGGCCAC UUUCCUCAGC UCCUUUUUUU 450

CAGGGGGUGG ACUGGGGUGG CCUAUUUGCU UCUCCAAAGA UGAUGCUGUG 500

UGCAUCUGGC UGGUAGACUC UCGGAGUUCU GCCAGCUCCU UCUGUAGGUG 550

GAAGAGCUGA AACAUCCCCA GGCCCAAUCC UACCAAGGCA ACCAGAACCA 600 UGAAAAACAU CACAAGGAGA CACAGGCCUG UGCUGUGGUU CCCUCUCUUC 650

UUCAGGGGUG GCAGCGGUAG UGGAGGCAGU GGUGGCGGCG GCGGCGGAGG 700

UGGUAGUGGU GGCGGUGGCG GUGGUGGUGG UGGCCUCCUU UGACCAGGCC 750

UUCUGGGCAC AGAGGUUGGA CAGGGAAGAA CUGUGCCUGG AGGGGCCCAG 800

GGAGAGCUGG CACUGCUGUC CACCCAGUAG AUCUGGGGAU AUGGGUAAUU 850

GAAGGGCUGC UGCAUGGCAG CUGGUGAGUC AGGCCAGCCC CAGCAAACGG 900

UCUCAGUCCU GUAG 924 配列番号： 3 1

配列の長さ： 9 2 4

配列の種類：核酸

配列の型： c DNA t o mRNA

配列：

CTACAGGACT 10

GAGAAGAAGT AAAACCGTTT GCTGGGGCTG GCCTGACTCA CCAGCTGCC 59 ATG CAG CAG CCC TTC AAT TAC CCA TAT CCC CAG ATC TAC TGG GTG 104 GAC AGC AGT GCC AGC TCT CCC TGG GCC CCT CCA GGC ACA GTT CTT 149 CCC TGT CCA ACC TCT GTG CCC AGA AGG CCT GGT CAA AGG AGG CCA 194 CCA CCA CCA CCG CCA CCG CCA CCA CTA CCA CCT CCG CCG CCG CCG 239 CCA CCA CTG CCT CCA CTA CCG CTG CCA CCC CTG AAG AAG AGA GGG 284 AAC CAC AGC ACA GGC CTG TGT CTC CTT GTG ATG TTT TTC ATG GTT 329 CTG GTT GCC TTG GTA GGA TTG GGC CTG GGG ATG TTT CAG CTC TTC 374 CAC CTA CAG AAG GAG CTG GCA GAA CTC CGA GAG TCT ACC AGC CAG 419

ATG CAC ACA GCA TCA TCT TTG GAG AAG CAA ATA GGC CAC CCC AGT 464

CCA CCC CCT GAA AAA AAG GAG CTG AGG AAA GTG GCC CAT TTA ACA 509

GGC AAG TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACC 554

TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAG GGT GGC 599

CTT GTG ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT TCC AAA GTA 644

TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC CTG CCC CTG AGC CAC AAG 689

GTC TAC ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG GTG ATG ATG 734

GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC 779

CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAT 824

CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG 869

GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC TAA GAGAAGCACT 915

TTGGGATTC 924 配列番号 3 2

配列の長さ： 9 2 7

配列の型：核酸

配列の種類： c DNA t o mRNA

配列：

GAGAAGGA AACCCTTTCC TGGGGCTGG GTGCC 32 ATG CAG CAG CCC ATG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TTC TGG GTA 77 GAC AGC AGT GCC ACT TCA TCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT 122 CCC TGT CCA TCT TGT GGG CCT AGA GGG CCG GAC CAA AGG AGA CCG 167

CCA CCT CCA CCA CCA CCT GTG TCA CCA CTA CCA CCG CCA TCA CAA 212

CCA CTC CCA CTG CCG CCA CTG ACC CCT CTA AAG AAG AAG GAC CAC 257

AAC ACA AAT CTG TGG CTA CCG GTG GTA TTT TTC ATG GTT CTG GTG 302

GCT CTG GTT GGA ATG GGA TTA GGA ATG TAT CAG CTC TTC CAC CTG 347

CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAA AGC CTT 392

AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC AAC CCC AGT ACA CCC 437

TCT GAA AAA AAA GAG CCG AGG AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC 482

CCC CAC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA 527

ACC GCT CTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA GGT GGC CTT GTG 572

ATC AAC GAA ACT GGG TTG TAC TTC GTG TAT TCC AAA GTA TAC TTC 617

CGG GGT CAG TCT TGC AAC AAC CAG CCC CTA AAC CAC AAG GTC TAT 662

ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCT GAG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG 707

AAG AGG TTG AAC TAC TGC ACT ACT GGA CAG ATA TGG GCC CAC AGC 752

AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAC CAT TTA 797

TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT 842

AAG ACC TTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT TAA AAGAAAAAGC ATTTTAAAAT 892

GATCTACTAT TCTTTATCAT GGGCACCAGG AATAT 927 配列番号： 3 3

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸配列の種類：他の核酸合成 DNA (ヌクレオチドプライマー 1 ) 配列：

GATTTTCAACCACTCAGTCG 2 0 配列番号： 3 4

配列の長さ： 3 7

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (ヌクレオチドプライマー 2 ) 配列：

ATGCGGCCGCTGGATCCTTTGTATGAAATTGAGTAAT 37 配列番号： 3 5

配列の長さ： 2 4

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 1 ) 配列：

ATGCCCAAGTGACTGACATCAACT 24 配列番号： 3 6

配列の長さ： 5 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 1 ) 配列：

GCGCGGATCCAGGAAGTGGGAAAGGATTACCTTCCTCTTTGCACTTGGTG 50 配列番号： 3 7

配列の長さ： 1 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸コザックにより提唱された配列配列：

CCA/GCCATGG 10 配列番号： 3 8

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマ一 2 ) 配列：

AAGACCACAAGGTCCAACAG 20 配列番号： 3 9

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D NA (センスプライマー 3 ) 配列： GGTGAGAAAGGATGCTAGGT 20 配列番号： 40

配列の長さ： 20

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 2)

配列：

CATGGATAAGCTAGAGACTG 20 配列番号： 4 1

配列の長さ： 20

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 3)

配列：

GTACAACGCGTACATTACGG 20 配列番号： 42

配列の長さ： 925

配列の型：核酸

配列の種類： G e n om i c DNA

配列：

AGGAGGAA ACCCTTTCCT GGGGCTGGGT 28 GCC ATG CAG CAG CCC GTG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TAC TGG GTA 76 GAC AGC AGT GCC ACT TCT CCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT TCT 124 TGT CCA TCC TCT GGG CCT AGA GGG CCA GGA CAA AGG AGA CCA CCG CCT 172

CCA CCA CCA CCT CCA TCA CCA CTA CCA CCG CCT TCC CAA CCA CCC CCG 220

CTG CCT CCA CTA AGC CCT CTA AAG AAG AAG GAC AAC ATA GAG CTG TGG 268

CTA CCG GTG ATA TTT TTC ATG GTG CTG GTG GCT CTG GTT GGA ATG GGG 316

TTA GGA ATG TAT CAA CTC TTT CAT CTA CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC 364

CGT GAG TTC ACC AAC CAC AGC CTT AGA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA 412

ATA GCC AAC CCC AGC ACA CCC TCT GAA ACC AAA AAG CCA AGG AGT GTG 460

GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 508

GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA 556

GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA 604

GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG 652

GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG 700

GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC 748

AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT 796

GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC 844

TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT TAAAGGAAAA AGCATTTTAG AATGATCTAT 895

TATTCTTTAT CATGGATGCC AGGAATATTG 925 配列番号： 4 3

配列の長さ： 2 0 配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D NA (センスプライマ一 4 )

配列：

AGAACTCCGTGAGTTCACCA 20 配列番号： 4 4

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 D NA (アンチセンスプライマー 4 )

配列：

CAATATTCCTGGCATCCATG 20 配列番号： 4 5

配列の長さ： 5 6 8

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸（プローブ 1 )

配列：

A GAA CTC 7

CGT GAG TTC ACC AAC CAC AGC CTT AGA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA 55 ATA GCC AAC CCC AGC ACA CCC TCT GAA ACC AAA AAG CCA AGG AGT GTG 103 GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 151 GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA 199 GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA 247

GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG 295

GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG 343

GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC 391

AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT 439

GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC 487

TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT TAAAGGAAAA AGCATTTTAG AATGATCTAT 538

TATTCTTTAT CATGGATGCC AGGAATATTG 568 配列番号： 4 6

配列の長さ： 1 9 1

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸（プローブ 2 )

配列：

AGGAGGAA ACCCTTTCCT GGGGCTGGGT 28

GCC ATG CAG CAG CCC GTG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TAC TGG GTA 76 GAC AGC AGT GCC ACT TCT CCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT TCT 124 TGT CCA TCC TCT GGG CCT AGA GGG CCA GGA CAA AGG AGA CCA CCG CCT 172

CCA CCA CCA CCT CCA TCA C 191 配列番号： 4 7

配列の長さ： 4 4 4 配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸（プローブ 3 )

配列：

CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG 27

GAA GAC ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA 75

GGC GGC CTT GTG ATC AAT GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA 123

GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG 171

GTC TAT ATG AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA ATG GAG 219

GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC 267

AGC TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT GAC CAT TTA TAT 315

GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC 363

TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT TAAAGGAAAA AGCATTTTAG AATGATCTAT 414

TATTCTTTAT CATGGATGCC AGGAATATTG 444 配列番号： 4 8

配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 5 )

配列：

GCTCTAGACTACAGGACTGAGAAGAAGT 28 配列番号： 4 9 配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 5 ) 配列：

GCTCTAGAACATTCTCGGTGCCTGTAAC 28 配列番号： 5 0

配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 6 ) 配列：

GCTCTAGAGAGAAGGAAACCCTTTCCTG 28 配列番号： 5 1

配列の長さ： 2 8

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 6 ) 配列：

GCTCTAGAATATTCCTGGTGCCCATGAT 28 配列番号： 5 2

配列の長さ： 1 1 配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチドぺプチド①

配列：

Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr

1 5 11 配列番号： 5 3

配列の長さ： 2 0

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチドぺプチド②

配列：

Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr 1 5 10 15

Gly l ie Val Leu Leu

20 配列番号： 5 4

配列の長さ： 1 6

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチドぺプチド③

配列：

Ser Lys Tyr Pro Gin Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser 10 15 16 配列番号： 5 5

配列の長さ： 1 3

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチドぺプチド④

配列：

Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr Phe Phe

1 5 10 13 配列番号： 5 6

配列の長さ： 2 4

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマ一 7 )

配列：

CACCTGCAGAAGGAGCTGGCAGAA 24 配列番号： 5 7

配列の長さ： 3 3

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 7 ) 配列： AATAAGCTTGGTACCCTATTAGAGCTTATATAA 33 配列番号： 5 8

配列の長さ： 2 7

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 8 ) 配列：

TGCGAATTCACCATGCTGGGCATCTGG 27 配列番号： 5 9

配列の長さ： 3 6

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 8 ) 配列：

AACCTGCAGGTGGAAGAGCTGAGCAACAGACGTAAG 36 配列番号： 6 0

配列の長さ： 1 5

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド

配列：

Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His 1 5 10 15 配列番号： 61

配列の長さ： 22

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成ホスホロチォエート（PS)型

センスオリゴヌクレオチド S 20

配列：

TAAAACCGTTTGCTGGGGCTGG 22 配列番号： 62

配列の長さ： 22

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成ホスホロチォエート（PS)型

アンチセンスオリゴヌクレオチド A 4 1 配列：

CCAGCCCCAGCAAACGGTTTTA 22 配列番号： 63

配列の長さ： 20

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 PS型センスオリゴヌクレオチド S 50 配列：

ACCAGCTGCCATGCAGCAGC 20 配列番号： 6 4

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 P S型アンチセンスヌクレオチド A 6 9

配列：

GCTGCTGCATGGCAGCTGGT 20 配列番号： 6 5

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 P S型センスォリゴヌクレオチド S 1 6 3 配列：

CTGTGCCCAGAAGGCCTGGTCA 22 配列番号： 6 6

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 P S型アンチセンスオリゴヌクレオチド A 1 8 4 配列： TGACCAGGCCTTCTGGGCACAG 22 配列番号： 6 7

配列の長さ： 1 8

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 P S型センスオリゴヌクレオチド S 3 3 8 配列：

CTTGGTAGGATTGGGCCT 18 配列番号： 6 8

配列の長さ： 1 8

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 P S型アンチセンスオリゴヌクレオチド A 3 5 5 配列：

AGGCCCAATCCTACCAAG 18 配列番号： 6 9

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 P S型センスオリゴヌクレオチド S 4 8 4 配列：

AGCTGAGGAAAGTGGCCCATTT 22 配列番号： 7 0

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 P S型アンチセンスオリゴヌクレオチド A 5 0 5 配列：

AAATGGGCCACTTTCCTCAGCT 22 配列番号： 7 1

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 P S型センスオリゴヌクレオチド S 7 1 4 配列：

CCCCAGGATCTGGTGATGAT 20 配列番号： 7 2

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 P S型アンチセンスオリゴヌクレオチド A 7 3 3 配列：

ATCATCACCAGATCCTGGGG 20 配列番号： 73

配列の長さ： 20

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 P S型センスォリゴヌクレオチド S 905 配列：

AGAGAAGCACTTTGGGATTC 20 配列番号： 74

配列の長さ： 20

配列の種類：核酸

配列の種類：他の核酸合成 PS型アンチセンスオリゴヌクレオチド A 924 配列：

GAATCCCAAAGTGCTTCTCT 20 配列番号： 76

配列の長さ： 1 4 1

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ペプチド ND38

配列：

Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser

1 5 10 15

Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly lie Val Leu 20 25 30

Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu

35 40 45

Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin

50 55 60

Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn

65 70 75

Ser Lys Tyr Pro Gin Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met

80 85 90

Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gin Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu

95 100 105

Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn

110 115 120

Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr Phe

125 130 135 Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

140 141 配列番号： 7 7

配列の長さ： 1 3 9

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド ND 4 0 Z 6 ΐ

6ST

naq sAq αΑ ngq

9SI OS!

^109 d Q d J¾ UTO S nio "10 ^ d usv ί^Λ "91 S ^{n n}I3

02ΐ 9ΐΙ 0Π

S 八 usy ΙΒΛ J naq SIH dsy B S Jqi naq usy 9 ΐ¾Λ

901 001 96

naq αΑχ jas S SJV ¾IV uiO ^10 ^{J J} SAQ

06 98 08

j Jas sAq iio nio ΐ¾Λ naq dsy u OJJュ

9Z 01 99

s jas usy 19J 丄八 sA SIH J8S naq OJJ na usy usy

09 gg og

s Jas uio ^IO 3^JV叫 d ΐ¾Λ sA J9S JAl Ϊ¾Λ 9Md ^J naq

0 98

ni usy 9ii ΙΒΛ naq sA sA sAq 八

OS 92 02

J9S naq na

J dsy ni3 dj丄 naq OJJ

9ΐ 0Ϊ 9 ΐ

J9S 3JV J9S usv J9S s 13 jq nsi SIH B】V Ι¾Λ sAq 3J\/ ^η^Ί

- lO/P6d£/10d £6Z€I/S6 OAV 配列番号： Ί 8

配列の長さ： 1 3 8

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ペプチド ND 4 1

配列：

Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met

1 5 10 15

Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly l ie Val Leu Leu Ser Gly

20 25 30

Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn

50 55 60

Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr

65 70 75

Pro Gin Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys

80 85 90

Thr Thr Gly Gin Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val

95 100 105

Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu

110 115 120

Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu 125 130 135

Tyr Lys Leu

138 配列番号： 7 9

配列の長さ： 1 3 7

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ペプチド ND 4 2

配列：

Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro 1 5 10 15

Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly He Val Leu Leu Ser Gly Val

20 25 30

Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Thr Gly Leu Tyr

35 40 45

Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Asn

50 55 60 し en Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro

65 70 75

Gin Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr

80 85 90

Thr Gly Gin Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe 95 100 105

Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu

110 115 120

Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu Tyr

125 130 135

Lys Leu

137 配列番号： 8 0

配列の長さ： 1 3 6

配列の型：アミノ酸

配列の種類：ぺプチド ND 4 3

配列：

Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu 1 5 10 15

Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly l ie Val Leu Leu Ser Gly Val Lys

20 25 30

Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe

35 40 45

Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Asn Leu

50 55 60

Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gin 9 6 ΐ

BIV ΐ^Λ sAq SJV naq n sAq sAq n os^ OJJ OJJ J9S OJJ S IH OS 93 03

ΐΟ 911 UI9 sAq nio ⁿ S S ^IV J¾ S IR 19}¾ UIO S 9Ϊ 01 9 I

J9S nig 3jy naq n|g EIV naq nig sAq ujg ngq S IH sqd ngq ui

6 z ΐ a o 、 ^ ： mncowm

ΐ 8 ： ^銎 M3I

98ΐ

9SI OS I 93ΐ

sA JA ns Aio 3Md 9Md J¾ UIO S nio 3Md usy ΐ¾Λ "91

0Z\ 9ΐϊ 0Π

J9S Π9ΐ nio ^J3S ΐ^Λ usv ΐ^Λ "31 s!H dsy ¾IV s J¾ naq

90ΐ 001 96

usv 3 d ΐ¾Λ BIV io naq J J9S s 3JV ¾IV 丄 "ΐθ ΐ3

06 98 08

J¾ s o J'U J3S sAq Ai nig 八 n9q dsy

9Z 01 39 35 40 45

His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp

50 55 60

Glu Asp Thr Tyr Gly l ie Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys

65 70 75

Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr

80 85 90

Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu

95 100 105

Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gin Asp Leu

110 115 120

Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gin

125 130 135

Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr

140 145 150

Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val

155 160 165

Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys

170 175 178 配列番号： 8 2

配列の長さ： 4 5

1 9 配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 9 ) 配列：

CTTCTGCAGGTGGAAGAGCTGAGCGACACTAGTCAGAACCAGAGG 45 配列番号： 8 3

配列の長さ： 4 5

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 9 ) 配列：

AATTCACCATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTACCTCTGGTTCTGA 45 配列番号： 8 4

配列の長さ： 4 5

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 10) 配列：

CTAGTCAGAACCAGAGGTAGGAGGGTCCAGATGCCCAGCATGGTG 45 配列番号： 8 5

配列の長さ： 3 0

配列の型：核酸配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 11) 配列：

CTGACTAGTGTCGCTAAGGAGCTGAGGAAA 30 配列番号： 8 6

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 11) 配列：

TAAGCCGAAAAACGTCTGAG 20 配列番号： 8 7

配列の長さ： 3 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 12) 配列：

CTGACTAGTGTCGCTCTGAGGAAAGTGGCC 30 配列番号： 8 8

配列の長さ： 3 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 13) 配列：

CTGACTAGTGTCGCTAGGAAAGTGGCCCAT 30 配列番号： 8 9

配列の長さ： 3 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 14) 配列：

CTGACTAGTGTCGCTAAAGTGGCCCATTTA 30 配列番号： 9 0

配列の長さ： 3 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 15) 配列：

CTGACTAGTGTCGCTGTGGCCCATTTAACA 30 配列番号： 9 1

配列の長さ： 2 7

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 16) 配列： CTTGGTACCCTATTACTTATATAAGCC 27 配列番号： 9 2

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 16) 配列：

GAGCTACTGCACTACTGGGC 20 配列番号： 9 3

配列の長さ： 3 9

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマ一 17) 配列：

CGCGGATCCGGTACCTTTTTTGGTAACCGGGGTAAACAG 39 配列番号： 9 4

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 17) 配列：

CGCAAGTTCACGTAAAAAGC 20 配列番号： 9 5

配列の長さ： 4 6

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 18) 配列：

TTGAAGCTTAAAAAAGGGTATAAAATAAAATGCAGCTCTTCCACCT 46 配列番号： 9 6

配列の長さ： 2 9

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 18) 配列：

AAGGTCGACTATTAGAGCTTATATAAGCC 29 配列番号： 9 7

配列の長さ： 3 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 19) 配列：

GGGGGTTACCAAAGCCCAGCTCTTCCACCT 30 配列番号： 9 8

配列の長さ： 2 5

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (センスプライマー 20)

配列：

CCCGGTTACCAAAGCCAAGGAGCTG 25 配列番号： 9 9

配列の長さ： 2 0

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸合成 DNA (アンチセンスプライマー 20) 配列：

TAAGCCGAAAAACGTCTGAG 20 配列番号： 1 0 0

配列の長さ： 9 2 7

配列の型：核酸

配列の種類：他の核酸 P C R産物

配列：

GA GAAGGAAACC CTTTCCTGGG GCTGGGTGCC 32 ATG CAG CAG CCC ATG AAT TAC CCA TGT CCC CAG ATC TTC TGG GTA 77 GAC AGC AGT GCC ACT TCA TCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT 122 CCC TGT CCA TCT TGT GGG CCT AGA GGG CCG GAC CAA AGG AGA CCG 167

CCA CCT CCA CCA CCA CCT GTG TCA CCA CTA CCA CCG CCA TCA CAA 212

CCA CTC CCA CTG CCG CCA CTG ACC CCT CTA AAG AAG AAG GAC CAC 257

AAC ACA AAT CTG TGG CTA CCG GTG GTA TTT TTC ATG GTT CTG GTG 302

GCT CTG GTT GGA ATG GGA TTA GGA ATG TAT CAG CTC TTC CAC CTG 347

CAG AAG GAA CTG GCA GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAA AGC CTT 392

AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC AAC CCC AGT ACA CCC 437

TCT GAA AAA AAA GAG CCG AGG AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC 482

CCC CAC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC ACA TAT GGA 527

ACC GCT CTG ATC TCT GGA GTG AAG TAT AAG AAA GGT GGC CTT GTG 572

ATC AAC GAA ACT GGG TTG TAC TTC GTG TAT TCC AAA GTA TAC TTC 617

CGG GGT CAG TCT TGC AAC AAC CAG CCC CTA AAC CAC AAG GTC TAT 662

ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCT GAG GAT CTG GTG CTA ATG GAG GAG 707

AAG AGG TTG AAC TAC TGC ACT ACT GGA CAG ATA TGG GCC CAC AGC 752

AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC AGT GCT GAC CAT TTA 797

TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT 842

AAG ACC CTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT TAA AAGAAAAAGC ATTTTAAAAT 892

GATCTACTAT TCTTTATCAT GGGCACCAGG AATAT 927

Claims

請求の範囲

1 . 下記式 1 (配列表の配列番号 1 ) のアミノ酸配列を含有することを特徴とする新規ポリペプチド。

式 1

し ys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn

1 5 10

Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp

15 20

Thr Tyr Gly l ie Val Leu Leu Ser Gly Val

25 30

Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn

35 40

Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys

45 50

Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Asn

55 60

Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg

65 70

Asn Ser Lys Tyr Pro Gin Asp Leu Val Met

75 80

Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr

85 90 Thr Gly Gin Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr

95 100

Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala

105 110

Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu

115 120

Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gin Thr

125 130

Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

135 137

2. 下記式 2 (配列表の配列番号 2 ) のアミノ酸配列を含有することを特徴とする新規ポリペプチド。

式 2

Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser

1 5 10

Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu

15 20

Asp Thr Tyr Gly He Val Leu Leu Ser Gly

25 30

Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie

35 40

Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser

2 o 6 45 50

Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn

55 60

Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met

65 70

Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gin Asp Leu Val

75 80

Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys

85 90

Thr Thr Gly Gin Met Trp Ala Arg Ser Ser

95 100

Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser

105 110

Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu

115 120

Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gin

125 130

Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

135 138

3 . 下記式 3 (配列表の配列番号 3 ) のアミノ酸配列を含有することを特徴とする新規ポリべプチド。

式 3 £6Z2/S6 OAV

o 3

> J

CD

CD D D

CD C C

G =3 ω

a-

3 LO to =3 LO LO LO LO LO

LO O O CD

o i

3= C5 a-

60

CD

CO O -J

=3

CD ^

-J

a

CD

CD CO

Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gin Asp Leu

115 120

Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr

125 130

Cys Thr Thr Gly Gin Met Trp Ala Arg Ser

135 140

Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr

145 150

Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser

155 160

Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser

165 170

Gin Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

175 179

4 . 下記式 4 (配列表の配列番号 4 ) のアミノ酸配列を有することを特徴とする新規ポリペプチド。

式 4

Met Gin Gin Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro

1 5 10

Gin l ie Tyr Trp Val Asp Ser Ser Ala Ser

15 20

Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu 686Ϊ0/ 6dr/lw £6:US6 OAV

cd CD »— < r— ( — 4 CO

Qu CD ^→ J o o O i

Qu CO CD o CD

ί-,

CU CD CD

o O o

i→ ?

Q CO

o σ α o

O

CD 3T O

i o LO O LO ~~ LO ~

CD CO LO 0d OO O

CO Q CD C

O GO

CD

Du Cu o O

ω

C DC

o 00 00

^

CD Du e CD o O o ZD CD

CD CD

ΐ I ζ usv 3Md ΐ¾Λ ¾IV ΛΙΟ naq i Jd^ J9S v

BIV djj, ui9 Aio J¾ jqi SAQ JAI jas

OSS ZZ

sA Aio nig J9}¾ j9|¾ Ι¾Λ ^ dsy

UIO OJJ J I s^i J8S usv 3JV 1 Ι¾Λ

012 gos

Siq s?H J9S naq oJcj na usy usy s JQ

002 961

uiO i V 9Md ^J Ι¾Λ sX J9S I 八

061 98 ΐ

9i JAi nan Aio J¾ ni usv Ι¾Λ ngq

081

io Si sA sAq Ι¾Λ ^IO jas na

Ο ΐ 99 ΐ

Π9Ί ΐ^Λ 911 i 丄 J¾ dsv nio dJX n

091 991

naq OJJ J3S V J3S usv sA Ai

09 Ϊ 9^1

•ill丄 na STH ¾iv ΐ¾Λ sAq Sjy na nio sAq

OH SSI 245 250

Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn

255 260

Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu

265 270

Glu Ser Gin Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys

275 280

Leu

281

5 . 下記式 5 (配列表の配列番号 5 ) に記載のアミノ酸配列を含有することを特徵とする新規ポリペプチド

式 5

Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro Arg

1 5 10

Ser Arg Ser l ie Pro Leu Glu Trp Glu Asp

15 20

Thr Tyr Gly Thr Ala Leu l ie Ser Gly Val

25 30

Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie Asn

35 40

Glu Ala Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys

45 50 Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn Ser

55 60

Gin Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg

65 70

Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu Val Leu

75 80

Met Glu Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys Thr

85 90

Thr Gly Gin l ie Trp Ala His Ser Ser Tyr

95 100

Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Val Ala

105 110

Asp His Leu Tyr Val Asn He Ser Gin Leu

115 120

Ser Leu l ie Asn Phe Glu Glu Ser Lys Thr

125 130

Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

135 137

6 . 下記式 6 (配列表の配列番号 6 ) に記載のアミノ酸配列を含有することを特徵とする新規ポリペプチド

式 6

Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro 66奪 6fcv81ld ε2/5 OA6V

o O D

CO o — o d cc3

C

CO <υ

CO

C CO

>

00

O CD

cd

L <U LO in 00 LO LO LO LO

CM CO LO >

< LT^ Cd O ^

CO

cd

CO Q

CD

o

CO

cd O

115 120

Leu Ser Leu l ie Asn Phe Glu Glu Ser Lys

125 130

Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

135 138

7 . 下記式 7 (配列表の配列番号 7 ) に記載のァミノ酸配列を含有することを徵とする新規ポリペプチド。

式 7

Gin Leu Phe His Leu Gin Lys Glu Leu Ala

1 5 10

Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn His Ser Leu

15 20

Arg Val Ser Ser Phe Glu Lys Gin He Ala

25 30

Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Thr Lys Lys

35 40

Pro Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn

45 50

Pro Arg Ser Arg Ser l ie Pro Leu Glu Trp

55 60

Glu Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu l ie Ser

65 70 9 I Z

Π9ΐ sAq J i naq Aig 91^ 9yd jqi s^

Oil 991

J3S niO "19 ^Md usv 911 "91 s n9q ui

091 991

J9S 311 usv Λ JAi naq SIH dsy ¾IV Ι¾Λ

09ΐ 9^ΐ

na usy 3Md ΐ¾Λ ^IV Aio naq αλ J9S

O SSI

J9S SIH dJl 311 ui ^10 J l s os I

J usy "91 Siq Siq nio ni ^ nsi 八

02ΐ 9ΐΐ

Π9ΐ dsy Αΐ9 OJJ JAX sAq 9qj usy 3Jy

Οΐΐ 901

• i Ι¾Λ sAi SIH J8S oj uio jas usy

001 96

S O s uio λιο 3JV 9Md J^l I¾ sAq s

06 98

08 9Z

ΐ¾Λ ngq AIQ io sAq sXq 丄 sAq 八人 ΐ3 I0/»-6dr/XDd ε6 1/S6 OAS.

8 . 下記式 8 (配列表の配列番号 8 ) に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする新規ポリペプチド。

式 8

Met Gin Gin Pro Val Asn Tyr Pro Cys Pro

1 5 10

Gin l ie Tyr Trp Val Asp Ser Ser Ala Thr

15 20

Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe

25 30

Ser Cys Pro Ser Ser Gly Pro Arg Gly Pro

35 40

Gly Gin Arg Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro

45 50

Pro Pro Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gin

55 60

Pro Pro Pro leu Pro Pro leu Ser Pro し eu

65 70

Lys し ys し ys Asp Asn l ie Glu Leu Trp Leu

75 80

Pro Val l ie Phe Phe Met Val Leu Val Ala

85 90

Leu Val Gly Met Gly Leu Gly Met Tyr Gin 8 I Z J'U ΐ¾Λ sAq siH J3S naq 0Jd utg J3S

002 961

usv SAQ J9S uio Aio SJV 3Md 1¾Λ sAq

06 ΐ

s JAl ΙΒΛ 3Mci J naq A19 ¾iv ni usy

081

9ii n9i Ai λ{ sAq JXI sAq 八

OZl 991

ΛΙΟ S 311 ¾i JMI Aio JAl J¾ dsy

09 ΐ 99 ΐ

nio dJl ni9 "31 OJJ an J9S SJV J9S SJV

09Ϊ I

0Jd usv ^io n9i STH J3S V

OH SSI

0Jd s q s jq J9S QJd J¾ J9S oJd

Οδ ΐ 92ΐ

usv BIV 311 "ID nio s s 1¾Λ

OZl gn

8JV ng J9S SIH USV ^ d ^ηΐ3 3jy na

Οΐΐ 901

n g ¾iv naq s^q uio na SIH 9Md nsi

001 96 SlO/P6dr/lDd £6 US6 OA\ 205 210

Arg Asn Phe Lys Tyr Pro Gly Asp Leu Val

215 220

Leu Met Glu Glu Lys Lys Leu Asn Tyr Cys

225 230

Thr Thr Gly Gin He Trp Ala His Ser Ser

235 240

Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Val

245 250

Ala Asp His Leu Tyr Val Asn l ie Ser Gin

255 260

Leu Ser Leu l ie Asn Phe Glu Glu Ser Lys

265 270

Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

275 278

9 . 下記式 9 (配列表の配列番号 9 ) に記載のアミノ酸配列を含有することを特徵とする新規ポリペプチド。

式 9

Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro His

1 5 10

Ser Arg Ser l ie Pro Leu Glu Trp Glu Asp

15 20 0 z z

OST 92 Ϊ

SAつ J9S nio nio usv 311 s

OZl 9Π

n3 u jag an usv Ι^Λ J'U Π3Ί siH dsy

Οΐ ΐ 901

BIV s JMl Π9 usv 9Md 〖ΒΛ ¾IV '(13 naq

00 ΐ 96

J^l s J9S S IR dJ 9Π "TO ^IO

06 58

J 1 s j usv naq 3jy sAq ni "10

08 9

naq naq dsy njg OJ^ αλ sAq jas usy

OL 39

3-iV 八 s siH usy naq o uio

09 99

usy usy SAQ J8S uio Aio 8JV ^Md ^J人丄八

09 ^

s J9S J^l ΐ¾Λ 9 d J^l na A{Q J¾ n usv 9ΐ Ι Ι¾Λ n^l 13 Aio s sxq JA s

08 S3

IO s an nan m i J¾ SlO/P6d£llD £6 I/S6 Ό/Α. Phe P e Gly Leu Tyr し ys Leu

135 137

1 0 . 下記式 1 0 (配列表の配列番号 1 0 ) に記載のアミノ酸配列を含有することを特徴とする新規ポリべプチド。

式 1 0

Arg Ser Val Ala His Leu Thr Gly Asn Pro

1 5 10

His Ser Arg Ser l ie Pro Leu Glu Trp Glu

15 20

Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Leu l ie Ser Gly

25 30

Val し ys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val l ie

35 40

Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser

45 50

Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys Asn

55 60

Asn Gin Pro Leu Asn His Lys Val Tyr Met

65 70

Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glu Asp Leu Val

75 80

Leu Met Glu Glu Lys Arg Leu Asn Tyr Cys 85 90

Thr Thr Gly Gin He Trp Ala His Ser Ser

95 100

Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser

105 110

Ala Asp His Leu Tyr Val Asn He Ser Gin

115 120

Leu Ser Leu l ie Asn Phe Glu Glu Ser Lys

125 130

Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

135 138

1 1 . 下記式 1 1 (配列表の配列番号 1 1 ) に記載のアミノ酸配列を含有することを特徴とする新規ポリべプチド。

式 1 1

bin Leu Phe His Leu Gin Lys Glu Leu Ala

10

Glu Leu Arg Glu Phe Thr Asn Gin Ser Leu

20

Lys Val Ser Ser Phe Glu Lys Gin l ie Ala

30

Asn Pro Ser Thr Pro Ser Glu Lys Lys Glu

40 ε ζ ζ

09 ΐ

•ill丄 Π31 usv 3Md Ι¾Λ ¾IV ^io naq J J3S (

J9S siH BIV dJl 3{i uio io JMl J¾ SAQ OST

J i usv naq Sjy s q nio nio Π9 八 OZl

naq dsy nig OJJ JA sAq J9S usy §jy

Οΐΐ

I¾ sAq sin usy na OJJ UIO usy usy 001

sAQ J9S uio Aio 3JV 3 d ΐ¾Λ s q J9S 06

J^l ΐ¾Λ 3 d J' na Aio J¾ nio usy 9Π 08

Ι^Λ naq Ai ^ΐθ s q J Λ AIO 0

J3S 9Π naq 2\ J¾ AIO 1 ·ΐ¾ dsy ni 09

dj丄 nio na 0Jd 9ii J^S 3jy s SIR 0Jd 09

usv i ^J 1 naq SIH ¾IV Ι¾Λ S SJy OJJ lO/t-6df/X3d: £6 I/S6 ΟΛ Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn l ie Ser

160

Gin Leu Ser Leu l ie Asn Phe Glu Glu Ser

170

Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

179

1 2. 下記式 1 2 (配列表の配列番号 1 2 ) に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする新規ポリぺプチド。

式 1 2

Met Gin Gin Pro Met Asn Tyr Pro Cys Pro

1 5 10

Gin He Phe Trp Val Asp Ser Ser Ala Thr

15 20

Ser Ser Trp Ala Pro Pro Gly Ser Val Phe

25 30

Pro Cys Pro Ser Cys Gly Pro Arg Gly Pro

35 40

Asp Gin Arg Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro

45 50

Pro Val Ser Pro Leu Pro Pro Pro Ser Gin

55 60

Pro し eu Pro Leu Pro Pro leu Thr Pro Leu o

cd CTj

JD <C E— Ϊ

CD

CO CD

i CD

CD

G =3 <U

CD E—

o cd

X CM CO LTD CO

Q→ — — cx

DO

<v CP

CO CO CO

o o

cd

cd a c o

-J CD

175 180

l ie Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr

185 190

Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gin Ser Cys

195 200

Asn Asn Gin Pro Leu Asn His Lys Val Tyr

205 210

Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Glu Asp Leu

215 220

Val Leu Met Glu Glu Lys Arg Leu Asn Tyr

225 230

Cys Thr Thr Gly Gin He Trp Ala His Ser

235 240

Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr

245 250

Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn He Ser

255 260

Gin Leu Ser Leu l ie Asn Phe Glu Glu Ser

265 270

Lys Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

275 279

1 3 . 前記式 1、 5および 9 (配列表の配列番号 1、 5および 9 ) 力、ら選ばれるいずれかのァミノ酸配列をコードする塩基配列の相補鎖とハイプリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有することを特徴とする新規ポリべプチド。

1 4. 配列表の配列番号 1 3、 1 7および 2 1から選ばれるいずれかの塩基配列の相補鎖とハイブリダィズする塩基配列によってコードされるァミノ酸配列を有することを特徴とする新規ポリぺプチド。

1 5. F a s抗原に結合する請求項 1ないし 1 4いずれかに記載のポリぺプチド。

1 6. F a s抗原を発現する細胞に対してアポトーシスを誘導する活性を有する請求項 1ないし 1 5いずれかに記載のポリべプチド。

1 7. 組換え型ポリペプチドである請求項 1ないし 1 6いずれかに記載の新規ポリぺプチド。

1 8. 前記式 4 (配列表の配列番号 4) に記載のアミノ酸配列の一部分からなるポリペプチド。

1 9. 前記式 8 (配列表の配列番号 8) に記載のアミノ酸配列の一部分からなるポリペプチド。

20. 前記式 1 2 (配列表の配列番号 1 2) に記載のアミノ酸配列の一部分からなるポリペプチド。

2 1. 前記式 4、 8および 1 2 (配列表の配列番号 4、 8、 1 2) から選ばれるいずれかのァミノ酸配列の一部または全部からなるポリべプチドが 2種以上融合してなるポリペプチド。

22. F a s抗原と結合する請求項 1 8ないし 2 1いずれかに記載のポリべプチ

2 3 . 請求項 1ないし 2 2いずれかに記載の新規ポリペプチドをコードする塩基配列を含有することを特徴とする新規 D N Α。

2 4 . 前記 D NAが、下記式 1 3 (配列表の配列番号 1 3 ) に記載の塩基配列を含有する請求項 2 3に記載の新規 D NA。

式 1 3

AAA GTG GCC CAT TTA ACA GGC AAG TCC AAC

30

TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG GAA GAC

60

ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA GTG

90

AAG TAT AAG AAG GGT GGC CTT GTG ATC AAT

120

GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT TCC AAA

150

GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC AAC

180

CTG CCC CTG AGC CAC AAG GTC TAC ATG AGG

210

AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG GTG ATG

240 ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC ACT

270

ACT GGG CAG ATG TGG GCC CGC AGC AGC TAC

300

CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC AGT GCT

330

GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG CTC

360

TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA TCT CAG ACG

390

TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC

411

2 5 . 前記 D N Aが、下記式 1 4 (配列表の配列番号 1 4 ) に記載の塩基配列を含有する請求項 2 3に記載の新規 D NA。

式 1 4

AGG AAA GTG GCC CAT TTA ACA GGC AAG TCC

30

AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG GAA

60

GAC ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT GGA

90

GTG AAG TAT AAG AAG GGT GGC CTT GTG ATC 120

AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT TCC

150

AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC AAC

180

AAC CTG CCC CTG AGC CAC AAG GTC TAC ATG

210

AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG GTG

240

ATG ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC TGC

270

ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC CGC AGC AGC

300

TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC AGT

330

GCT GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT GAG

360

CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA TCT CAG

390

ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC

414

2 6 . 前記 D NAが、下記式 1 5 (配列表の配列番号 1 5 ) に記載の塩基配列を有する請求項 2 3に記載の新規 D NA。

式 1 5

CAG CTC TTC CAC CTA CAG AAG GAG CTG GCA

30

GAA CTC CGA GAG TCT ACC AGC CAG ATG CAC

60

ACA GCA TCA TCT TTG GAG AAG CAA ATA GGC

90

CAC CCC AGT CCA CCC CCT GAA AAA AAG GAG

120

CTG AGG AAA GTG GCC CAT TTA ACA GGC AAG

150

TCC AAC TCA AGG TCC ATG CCT CTG GAA TGG

180

GAA GAC ACC TAT GGA ATT GTC CTG CTT TCT

210

GGA GTG AAG TAT AAG AAG GGT GGC CTT GTG

240

ATC AAT GAA ACT GGG CTG TAC TTT GTA TAT

270

TCC AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAA TCT TGC

300 AAC AAC CTG CCC CTG AGC CAC AAG GTC TAC

330

ATG AGG AAC TCT AAG TAT CCC CAG GAT CTG

360

GTG ATG ATG GAG GGG AAG ATG ATG AGC TAC

390

TGC ACT ACT GGG CAG ATG TGG GCC CGC AGC

420

AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT CTT ACC

450

AGT GCT GAT CAT TTA TAT GTC AAC GTA TCT

480

GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG GAA TCT

510

CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG CTC

537

2 7. 前記 DNAが、下記式 I 6 (配列表の配列番号 1 6 ) に記載の塩基配列を含有する請求項 2 3に記載の新規 D NA。

式 1 6

ATG CAG CAG CCC TTC AAT TAC CCA TAT CCC

1 30

CAG ATC TAC TGG GTG GAC AGC AGT GCC AGC 66/ JG一d £2/s6 OAV

o

CO CO CO

CD D

CD

CD CD

CD ^→ E—

C

CD CD

CD D CD

C

CD E—

CD J

CD

ί' 8 2

330 001 01V 0V3 000 13V 13V 301 3V1 30V 069

ΰ丄 V 01V OVV 090 OVO 01V 01V 010 010 1V0 099

0V3 330 m OVV 131 3VV OOV 01V 3V1 010 0S9

OVV 3V3 30V 910 300 010 OVV OVV 301 idl 009

m 100 003 Oil 3V1 VIO VVV 331 1V1 V10 0 9

111 0V1 013 000 13V WO 1VV 31V 910 113 o

030 100 OVV OVV 通 OVV 010 V09 131 110 0Ϊ9

913 310 11V VOO IV丄 33V 3V0 WO 001 WO

013 103 OIV 331 OOV VOX OVV 331 OVV 300 0

V3V Vll 1V0 000 010 VVV OOV 013 OVO 9VV

VVV WO 133 333 V33 10V 033 3V0 303 V1V 068 Sl0iP6dTilDd e6Z£I/S6 O L 720

CGC AGC AGC TAC CTG GGG GCA GTG TTC AAT

750

CTT ACC AGT GCT GAT CAT TTA TAT GTC AAC

780

GTA TCT GAG CTC TCT CTG GTC AAT TTT GAG

810

GAA TCT CAG ACG TTT TTC GGC TTA TAT AAG

840

CTC

843

2 8 . 前記 DNAが下記式 1 7 (配列表の配列番号 1 7 ) に記載の塩基配列を含有する請求項 2 3に記載の新規 DNA。

式 1 7

AGT. GTG GCC CAC TTA ACA GGG AAC CCC CGC

30

TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA GAC

60

ACA TAT GGA ACT GCT TTG ATC TCT GGA GTG

90

AAG TAT AAG AAA GGC GGC CTT GTG ATC AAT

120 GAG GCT GGG TTG TAC TTC GTA TAT TCC AAA

150

GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC AGC

180

CAG CCC CTA AGC CAC AAG GTC TAT ATG AGG

210

AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG CTA

240

ATG GAG GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC ACT

270

ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC TAC

300

CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT GCT

330

GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA CTC

360

TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC

390

TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT

411

2 9 . 前記 D N Aが下記式 1 8 (配列表の配列番号 1 8 ) に記載の塩基配列を含む請求項 2 3に記載の新規 D NA。

—3

CD T5 D T3 —3 -6 —3 D

CD CD C

CD —3

— ^

C

—3 CO D <T5 —3 —3

—3

—3 CD D

C"5

—3 —3 —5 —3

—3

- G~> -9

CO

o D ◦

8 330

GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA

360

CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG

390

ACC TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT

414

3 0 . 前記 D NAが下記式 1 9 (配列表の配列番号 1 9 ) に記載の塩基配列を含有する請求項 2 3に記載の新規 D NA。

式 1 9

CAA CTC TTT CAT CTA CAG AAG GAA CTG GCA

30

GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAC AGC CTT

60

AGA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC

90

AAC CCC AGC ACA CCC TCT GAA ACC AAA AAG

120

CCA AGG AGT GTG GCC CAC TTA ACA GGG AAC

150

CCC CGC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG

180 8蒙/1 dr¾ £6Z2/ ;S6 OAV

o

C CS1 CM c CO CO CO L

CD CD CD

CD CD

CD

E— D L5 C

CD CD

CD

C

CD CD CD

CD C

CD CD

AAG ACC TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT

537

3 1 . 前記 D NAが下記式 2 0 (配列表の配列番号 2 0 ) に記載の塩基配列を含有する請求項 2 3に記載の新規 D N A。

式 2 0

ATG CAG CAG CCC GTG AAT TAC CCA TGT CCC

30

CAG ATC TAC TGG GTA GAC AGC AGT GCC ACT

60

TCT CCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT

90

TCT TGT CCA TCC TCT GGG CCT AGA GGG CCA

120

GGA CAA AGG AGA CCA CCG CCT CCA CCA CCA

150

CCT CCA TCA CCA CTA CCA CCG CCT TCC CAA

180

CCA CCC CCG CTG CCT CCA CTA AGC CCT CTA

210

AAG AAG AAG GAC AAC ATA GAG CTG TGG CTA

240

CCG GTG ATA TTT TTC ATG GTG CTG GTG GCT ΐ / ζ

3VV 301 131 0V0 190 003 311 3V1 V10 VVV 0Z9

331 1V1 V10 311 3V1 Oil 900 130 OVO 丄 VV

01V 010 113 300 300 VVV OVV 1V1 OVV 010 019

VOO 131 01V Oil 100 10V VOO 1V1 VOV OVO 08

WO 001 WO 013 100 31V 301 90V VOL 303 OS

330 OVV 000 V3V Vll 3V3 339 010 IOV 90V 0

VOO OVV VVV 33V WO 131 333 VOV 30V 330 06S

OVV 330 V丄 V WO OVV WO ILL 131 VOX V10 098

VOV 110 30V 3V3 DVV 33V 311 OVO 103 313 OSS

WO VOO 013 WO OVV OVO V13 1V0 111 0X3 OOS

, WO 1V1 01V VOO Vll 900 01V VOO 110 913

OLZ lO/P6d£/J d £6Z£I/S6 OAX 600

AGC CAG CCC CTA AGC CAC AAG GTC TAT ATG

630

AGG AAC TTT AAG TAT CCT GGG GAT CTG GTG

660

CTA ATG GAG GAG AAG AAG TTG AAT TAC TGC

690

ACT ACT GGC CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC

720

TAC CTA GGG GCA GTA TTT AAT CTT ACC GTT

750

GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA

780

CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG

810

ACC TTT TTT GGC TTA TAT AAG CTT

834

3 2 . 前記 D N Aが下記式 2 1 (配列表の配列番号 2 1 ) に記載の塩基配列を含有する請求項 2 3に記載の新規 D N A。

式 2 1

AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC CCC CAC

30 ε ^ z

09S

0X3 WO 131 V丄 V 3VV 310 1V1 Vll 1V0 OVO OSS

130 10V 03V 113 1VV 311 V10 V30 090 013 OOS

3V1 30V 30V 3V3 330 001 V1V 9V3 VOO 10V m

13V 301 0V1 3VV Oil 00V OVV OVO 9V0 01V mz m 010 010 1V0 OVO 100 IVJ, OVV 101 OVV o\z

00V OIV 1V1 319 OVV OVO OVV V13 030 OVO 08Ϊ

OVV OVV 301 131 OVO 100 003 Oil 0V1 VXO OS I

VVV 001 1V1 010 311 0V1 Oil 000 13V wo 021

3VV 31V 010 110 300 100 VVV OVV 1V1 OVV 06

910 VOO 131 31V 010 130 03V VOO 1V1 VOV 09

OVO WO 001 WO 010 130 01V 031 09V V31

668I0/f6dr/X3J £6Z£I/S6 OAV TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG ACC

390

TTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT

411

3 3 . 前記 D N Aが下記式 2 2 (配列表の配列番号 2 2 ) に記載の塩基配列を含有する請求項 2 3に記載の新規 D NA。

式 2 2

AGG AGT GTG GCC CAT TTA ACA GGG AAC CCC

30

CAC TCA AGG TCC ATC CCT CTG GAA TGG GAA

60

GAC ACA TAT GGA ACC GCT CTG ATC TCT GGA

90

GTG AAG TAT AAG AAA GGT GGC CTT GTG ATC

120

AAC GAA ACT GGG TTG TAC TTC GTG TAT TCC

150

AAA GTA TAC TTC CGG GGT CAG TCT TGC AAC

180

AAC CAG CCC CTA AAC CAC AAG GTC TAT ATG

210

AGG AAC TCT AAG TAT CCT GAG GAT CTG GTG 240

CTA ATG GAG GAG AAG AGG TTG AAC TAC TGC

270

ACT ACT GGA CAG ATA TGG GCC CAC AGC AGC

300

TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC ACT

330

GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT CAA

360

CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT AAG

390

ACC TTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT

414

3 4 . 前記 D N Aが下記式 2 3 (配列表の配列番号 2 3 ) に記載の塩基配列を含有する請求項 2 3に記載の新規 D NA。

式 2 3

CAG CTC TTC CAC CTG CAG AAG GAA CTG GCA

30

GAA CTC CGT GAG TTC ACC AAC CAA AGC CTT

60

AAA GTA TCA TCT TTT GAA AAG CAA ATA GCC

90 0/6fcvd £2/s6 OAV

O CD

CD CM CO CO CO

CD

CD CD

C C

CD D

CD

CD CD C

C

CD

CD CD CD

AGC TAC CTG GGG GCA GTA TTC AAT CTT ACC

450

AGT GCT GAC CAT TTA TAT GTC AAC ATA TCT

480

CAA CTC TCT CTG ATC AAT TTT GAG GAA TCT

510

AAG ACC TTT TTC GGC TTG TAT AAG CTT

537

3 5 . 前記 D NAが下記式 2 4 (配列表の配列番号 2 4 ) に記載の塩基配列を含有する請求項 2 3に記載の新規 D NA。

式 2 4

ATG CAG CAG CCC ATG AAT TAC CCA TGT CCC

30

CAG ATC TTC TGG GTA GAC AGC AGT GCC ACT

60

TCA TCT TGG GCT CCT CCA GGG TCA GTT TTT

90

CCC TGT CCA TCT TGT GGG CCT AGA GGG CCG

120

GAC CAA AGG AGA CCG CCA CCT CCA CCA CCA

150

CCT GTG TCA CCA CTA CCA CCG CCA TCA CAA 8 I' Z

131 31V 013 130 33V V00 丄 VJL V3V 3V0 WO 08

001 WO 013 103 31V 331 OOV VOL 3V0 330 OS

3VV 000 V3V Vll 1V3 330 010 10V OOV 000 oz

OVO VVV VVV WO 131 033 V3V 10V 033 3VV 06S

009 V丄 V WO OVV WO 111 101 V31 V10 VVV 09S

110 30V WO OVV 30V 311 OVO 100 313 WO OSS

VOO 010 VV9 OVV 0V3 013 OVO Oil 313 OVO OOS

1V1 01V VOO Vll VOO 01V VOO 110 010 130 OLZ

0X0 013 110 OXV 311 111 V10 019 033 VIO

901 010 1VV V3V OVV OVO 3V9 OVV OVV OVV OIZ

Ud 100 33V 313 V33 030 010 V33 313 VOO 081 SlO/P6dr/10d £6Z£I/S6 OAV 6 t- Z

113 OVV m Oil 009 311 111 30V ovv

018

101 WO 0V0 111 XVV 31V 010 131 313 WD 08

131 V丄 V OVV 310 IV丄 Vll 1V3 OVO 100 10V 09

33V 110 1VV 311 19 V39 000 013 3V1 00V OZL

00V OVO 330 OOX V1V OVO VOO 10V 13V 301 069

OVX OVV Oil 90V OVV OVO OVO 01V VIO 010 099

010 1V0 OVO 133 1V1 OVV 131 OVV 00V 01V 089

m 310 ovv OVO ovv m ooo ovo ovv ovv

009

301 101 OVO 100 003 311 3VJ, VIO VVV 331 0 9

JLV1 010 311 3VI Oil 000 13V WO OVV OXV o

0X9 113 300 100 VVV 9VV 1V1 OVV 0X0 VOO 0Ϊ9 I0/f6df/XDd e6Z£i/S6 OAV 837

36. 前記 DNAが前記式 1 6 (配列表の配列番号 1 6) に記載の塩基配列の一部である請求項 23に記載の新規 DNA。

37. 前記 DNAが前記式 20 (配列表の配列番号 20) に記載の塩基配列の一部である請求項 23に記載の新規 DNA。

38. 前記 DNAが前記式 24 (配列表の配列番号 24) に記載の塩基配列の一部である請求項 23に記載の新規 DNA。

39. 前記式 1 3、 1 7、 2 1 (配列表の配列番号 1 3、 1 7、 2 1) のいずれかに記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有する DN Aとハイプリダイズし、 Fa sリガンドをコードすることを特徴とする新規 DNA。

40. 請求項 23ないし 39いずれかに記載の新規 DNAを含む事を特徴とする組み換え DN A分子。

4 1. 請求項 23ないし 39いずれかに記載の新規 DNAで形質転換されたことを特徴とする形質転換体。

42. 請求項 40に記載の組み換え DNA分子で形質転換されたことを特徴とする形質転換体。

43. 形質転換体が、下記 a) ないし c) より選ばれる少なくとも 1つの宿主を形質転換したものである請求項 4 1または 42いずれかに記載の形質転換体。

a) 大腸囷

b) 酵母

c ) 哺乳動物紬胞

44. 請求項 4 1ないし 43のいずれかに記載の形質転換体を培養し、その培養混合物から請求項 1ないし 22のいずれかに記載の新規ポリべプチドを回収、精製することを特徴とする、請求項 1ないし 22のいずれかに記載の新規ポリぺプチドの製造方法。

4 5. 請求項 1ないし 22のいずれかに記載の新規ポリべプチドを含有する試料中より該新規ポリペプチドを精製する方法であって、少なくとも、下記より選ばれるいずれか 1つ以上の精製工程を行う事を特徴とする、請求項 1ないし 22いずれかに記載の新規ポリぺプチドの精製方法。

( 1 ) F a s抗原を使用したァフィ二ティ一クロマトグラフィー

( 2 ) 請求項 1ないし 22のレ、ずれかに記載の新規ポリぺプチドを認識する抗体を使用したァフィ二ティークロマトグラフィー

4 6. 請求項 1ないし 22いずれかに記載の新規ポリペプチドを認識することを特徴とする新規抗体。

4 7. 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項 4 6に記載の新規抗体。

4 8. 前記抗体がポリクローナル抗体である請求項 4 6に記載の新規抗体。

4 9. Fa s抗原を発現する細胞のアポトーシスを抑制する効果を有する請求項

4 6ないし 4 8いずれかに記載の新規抗体。

5 0. F a sリガンド遺伝子の一部もしくは F a sリガンドに対する mRN Aの一部に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする、ォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体。

5 1. F a sリガンドの発現を調節する請求項 5 0に記載のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体。

5 2. F a sリガンドの発現を抑制する請求項 5 0または 5 1に記載のオリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体。

5 3 . オリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体が、配列表の配列番号 1 3ないし 2 8レ、ずれかに記載の塩基配列に相補的な塩基配列の一部を含むォリゴヌクレオチドまたはその誘導体である請求項 5 0ないし 5 2いずれかに記載のォリゴヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチド誘導体。

5 4 . 請求項 1ないし 2 2いずれかに記載の新規ポリべプチドもしくはそれを発現する形質転換体を使用することを特徴とする、 F a sリガンドに関連する物質もしくは F a s抗原に関連する物質のスクリ一ニング方法。

5 5 . 請求項 1ないし 2 2いずれかに記載の新規ポリペプチドもしくはそれを発現する形質転換体および F a s抗原もしくは F a s抗原を発現する細胞を使用することを特徴とする請求項 5 4に記載のスクリ一二ング方法。

5 6 . F a s リガンドに結合する物質、 F a s リガンドの発現を調節する物質、

F a s抗原の発現を調節する物質および F a sリガンドの標的細胞に対する作用を調節する物質からなる群より選ばれる少なくとも 1つの物質をスクリ一二ングする請求項 5 4または 5 5に記載のスクリーニング方法。

5 7 . 下記の（ 1 ) ないし（3 ) のいずれかより選択される工程を含む請求項 5 4ないし 5 6いずれかに記載のスクリーニング方法。

( 1 ) a . F a s抗原を発現する細胞を、請求項 1ないし 2 2いずれかに記載のポリべプチド、それを発現する形質転換体およびその培養上清からなる群より選ばれるいずれかとともに培養する。

b . aに被験物質もしくは被験物質を含む試料を添加する。

c F a s抗原を発現する細胞の生死、形態的変化もしくは生化学的変化のうち少なくともいずれか 1つを測定する。

(2) a. 被験物質もしくは被験物質を含む試料を、請求項 1ないし 22いずれかに記載の新規ポリべプチド、それを発現する形質転換体およびその培養上清からなる群より選ばれるいずれかとィンキュベートする。

b. aに Fa s抗原を発現する細胞を加えて、培養する。

c Fa s抗原を発現する細胞の生死、形態的変化もしくは生化学的変化のうち少なくともいずれか 1つを測定する。

(3) a. 被験物質もしくは被験物質を含む試料を Fa s抗原を発現する細胞とィンキュベートする。

b. aに、前記式 1ないし 22レ、ずれかに記載の新規ポリぺプチド、それを発現する形質転換体およびその培養上清からなる群より選ばれるいずれかを加えて培養する。