KR100384821B1 - Fas리간드및그의일부,및그것을코드화하는DNA - Google Patents

Abstract

본 발명은 의약 분야에 유용한 FaS 리간드 및 그의 일부; 이를 코드화하는 DNA; 항체; 상기 DNA 를 함유하는 재조합 DNA 분자; 형질전환체; 신규한 단백질을 정제하는 방법; 신규한 단백질을 제조하는 방법; 신규한 단백질 항체; FaS 리간드 유전자 리간드 유전자에 상보적인 올리고누클레오티드; 및 FaS 리간드와 결합한 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

FaS 리간드 및 그의 일부, 및 그것을 코드화하는 DNA

다수의 세포로 구성되는 생체의 항상성은 세포의 증식과 분화 및 죽음에 의해 교묘하게 제어되고 있다. 세포의 죽음은 죽고 있는 세포의 형태로 부터 네크로시스(괴사)와 아포토시스(자사)로 크게 구별된다. 이중에서 네크로시스란, 하나 이상의 세포 또는 조직이나 기관의 일부분의 우연한 죽음을 말한다. 네크로시스를 일으킨 세포에서는 세포막의 파괴 및 세포 내용물의 세포밖으로의 방출이 관찰된다. 한편, 아포토시스란 생체의 항상성을 유지하기 위한 세포사를 말한다. 아포토시스를 일으킨 세포에서는 염색체 DNA의 단편화, 핵의 농축이 관찰되지만, 네크로시스의 경우와는 다르고 세포막의 파괴나 세포 내용물의 방출은 인식되지 않는다. 아포토시스는 프로그램 세포사(programed cell death)의 하나의 형태라고도 생각되어지고 있고, 예를들면 개체 발생에 있어서 불필요한 세포나 기관이 결핍되어 가는 현상은 세포의 아포토시스에 의한 것으로 생각되어지고 있다. 또한, 세포장애성T세포(CTL), NK세포(내츄럴 킬러 세포), TNF-α나 TNF-β 등에 의해 바이러스 감염세포나 종양세포가 공격 제거될 때의 세포사도 아포토시스라고 생각되어지고 있고, 아포토시스의 기능을 해명하고 생리 현상과의 관계를 명확히 하기 위한 연구가 많은 연구자에 의해 진행되고 있다.

그런데, 세포에 아포토시스를 발생시키는 물질로서는 Fas 항체가 알려져 있다. Fas 항체는 인간선유아세포(人線雄芽細胞)로 마우스를 면역하여 얻어진 모노클로날 항체이다(요네하라 S.(Yonehara S.) 등, J. Exp. Med., 169권, 1747-1756 페이지, 1989년). Fas 항체에 의해 인식되고 아포토시스의 시그널을 세포에 전달하는 세포 표면항원(Fas 항원)이 어떠한 것인가는 오랜 세월 불명료하였으나, 최근 이토우 N.(Itoh N.)등에 의해 Fas 항원 유전자가 클로닝되어 Fas 항원이 약 45kD의 세포막상의 단백질이고, 그 아미노산 배열로 부터 TNF 리셉터 패밀리에 속하는 것으로 판명되었다(Cell, 66권, 233-243페이지, 1991년). 또, 마우스 Fas 항원 유전자도 클로닝되어(와타나베-후쿠나가(Watanabe-Fukunaga R.)등, J. Immunol., 148권, 1274-1279페이지, 1992년), Fas 항원 mRNA 가 마우스의 흉선, 간, 폐, 심장, 난소에서 발현되고 있음이 확인되었다.

Fas 항원 유전자의 클로닝 이후 Fas 항원을 통한 아포토시스와 질환과의 관계에 관한 연구가 진행되고, 여러가지 보고가 나오게 되었다.

코바야시 N.(Kobayashi N.) 등은 에이즈 바이러스 감염에 의해 T세포막상에Fas 항원의 발현이 유도됨을 보고하고, 에이즈로 보이는 T세포의 아포토시스가 Fas 항원을 통한 현상일 가능성을 시사하고 있다(일경사이엔스, 6권, 34-41페이지, 1993년).

오가사와라(Ogasawara J.)등은 Fas 항체를 마우스에 투여하므로써 극증 간염을 닮은 현상이 일어나는 것을 관찰하고, 극증간염 등의 염증부위에서는 Fas 항원을 통한 아포토시스가 발생하고 있을 가능성을 시사하였다(Nature, 364권, 806-809페이지, 1993년). 히라마쯔(Hiramatsu Y.) 등은 만성C형 간염 환자로 백혈구의 침윤이 보이는 간장의 염증부위에 Fas 항원의 발현이 높음을 보고하였다(Hepatolo-gy, 19권, 1354-1359페이지, 1994년).

와타나베-후쿠나가(Watanabe-Fukunaga R.) 등은 자기면역질환의 모델 동물의 하나인 1pr 마우스에서는 Fas 항원 유전자에 변이가 일어나고, 이와 같은 변이가 일어난 Fas 항원 유전자를 발현하고 있는 새포에서는 아포토시스가 일어나지 않음을 증명하고 있다. 그리고, 자기면역질환에서는 Fas 항원 또는 Fas 항원에 작용하여 아포토시스를 일으키게 하는 생체내 물질에 이상이 있고, 그로인해 본래 아포토시스를 일으켜 생체내로 부터 제거되어야 할 자기반응성의 T세포가 잔존하며, 자기면역질환형태의 중상이 일어나고 있는 것이라고 예상하고 있다(Nature, 356권, 314-317페이지, 1993년).

이와 같이 Fas 항원이 단리되어 생체내에서 Fas 항원이 발현하고 아포토시스가 야기됨이 확인된 것으로 부터, Fas 항원에 결합하여 세포에 아포토시스를 일으키는 물질(이하, Fas 리간드라고 한다)이 생체내에 존재하고, Fas 항원 특이적인아포토시스가 일어나고 있음이 예상되었다.

상술한 Watanabe-Fukunaga 등은 1pr 마우스와 같이 자기면역질환증상을 보이는 gld 마우스에서는, Fas 항원에 결합하는 생체내 분자쪽에 이상이 있는 것이라고 예상하였다.

최근, 루비에 E.(Rouvier E) 등은 면역계에 있어서 Fas 항원 특이적인 아포토시스가 일어나고 있음을 보다 구체적으로 시사하였다(J. Exp. Med., 177권, 195-200페이지, 1993년). 즉 그들은 마우스 말초혈임파구(PBL) 및 마우스 CTL과 래트 T임파종 세포의 하이브리드마인 PC60-d10S 세포를 사용하여, 이들의 세포에 의한 Ca²⁺비의존적인 세포장애작용이 Fas 항원을 발현하는 세포에 대해서만 인정되는 것을 나타내었다. 그리고 그들은 이들 임파구세포, 특히 T세포가 Fas 항원 또는 Fas 항원에 관련하는 얼마간의 분자를 인식하고 있는 것 및 이들의 세포가 Fas 리간드를 발현하고 있을지도 모른다는 것을 지적하고 있다.

Fas 항원을 통한 아포토시스의 기구를 해명하는데에는 Fas 리간드를 단리하는 일이 중요하다.

상기 루비에(Rouvier E.) 등에 의해 Fas 리간드의 존재의 가능성이 지적되었으나 그 실체는 조금도 명확히 되어 있지 않다.

상술한 바와 같이 Fas 항원과 여러가지 질환, 생리현상과의 관련이 시사되고 있는 것으로 부터, Fas 리간드의 존재를 명확히 하고 그 실체를 파악하는 것은 의료를 비롯한 많은 분야에서 갈망되고 있다.

발명의 전개

본 발명의 목적은 Fas 항원에 결합하는 신규한 단백질 및 그것을 코드화하는 유전자를 단리하고 제공하는데 있다.

Fas 항원에 결합하는 물질이 단리되면 그것을 사용하여 인위적으로 생체내에서 발생하는 아포토시스를 조절하고, 질환의 치료나 진단에 사용할 수 있다. Fas 항원에 결합하여 세포에 아포토시스를 유도하는 물질(Fas 리간드)은 생체에서 불필요한 세포를 제거하는데 사용할 수 있다. 예를들면, 상술했듯이 에이즈 바이러스 감염세포에서는 Fas 항원이 발현되고 있으므로, 에이즈 바이러스 감염 초기에 있어서는 Fas 리간드를 사용하여 아포토시스를 인공적으로 유도하고, 감염세포를 조기에 제거하므로써 에이즈를 치료하는 일이 가능하다. 또한, 어떤 종류의 자기 면역질환에서는 인위적으로 Fas 항원을 통한 아포토시스를 발생시키므로써 자기항원반응성의 T세포의 제거가 가능해진다. 또한, 모리모토 H.(Morimoto H.)등은 암세포에 Fas 항원을 통한 아포토시스를 유도하므로써 아드리아마이신이나 시스플라틴에 의한 제암효과가 상승적으로 증강됨을 보고하고 있으므로(Cancer Res., 53권, 2591-2596페이지, 1993년), Fas 리간드는 암치료에도 사용할 수 있다.

한편, 에이즈 바이러스 감염 후기의 면역능력의 저하나 극증간염에 있어서의 간기능 저하는, 면역담당세포 또는 간세포의 아포토시스에 의해 조직의 기능이 현저하게 저하한 결과로 생각되어진다. 이와 같은 상태에서는 Fas 리간드의 작용을 억제하고 세포의 아포토시스를 막는 일이 필요하게 된다. 따라서, 이와같은 병의 용태에는 Fas 리간드의 발현을 억제하는 물질이나 Fas 리간드와 길항적으로 작용하는 물질을 사용한 치료가 필요하다.

이와 같이 생체내에서 발생하고 있는 아포토시스를 인위적으로 조절한다고 하는 원리에 기초한 치료방법은, Fas 리간드가 동정되어 비로소 가능해지는 방법이다.

Fas 항원과 결합하는 단백질을 치료나 연구에 사용하기 위해서는 해당 단백질을 고순도로, 대량으로 생산하는 일이 필요하다. 해당 단백질을 코드화하는 유전자를 클로닝하면 해당 단백질을 유전공학적으로 생산하는 일이 가능해지고, 해당 단백질을 치료약의 주성분으로서 사용하거나 항체의 제작에 사용하는 일이 가능해진다. 또한, 유전자 자체는 유전자 치료나 안티센스 의약의 개발에 사용하거나 트랜스제닉 마우스 등, 아포토시스가 관여하는 질환의 모델동물의 제작에 사용할 수 있다.

본발명자들은 Fas 리간드를 단리하기 위해 예의 연구를 거듭하여 왔다. 그리고 상술한 PC60-d10S 세포에 주목하였다. PC60-d10S 는 마우스 CTL 과 래트 T 임파종과의 하이브리드마로 PMA(포르볼미리스테이트아세테이트)와 이오노마이신으로 자극하면 Fas 항원 발현세포에 대해서만 아포토시스를 유도하는 세포이다. 본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 무자극성이고 보다 높은 세포장애작용을 나타내는 Fas 리간드 유전자를 클로닝하는데 적합한 세포집단, PC60-d10S-2 를 얻는데 성공하였다. 그리고 이 세포집단으로부터 래트 Fas 리간드 유전자를 클로닝하였다. 또한, 본 발명자들은 의약품 등에 사용하는데 적합한 사람으로부터의 Fas 리간드를 단리함을 목적으로 하여 연구를 거듭한 결과 마침내 인간 Fas 리간드를 코드화하는유전자를 얻는데에도 성공하였다. 또한, 마우스 Fas 리간드를 코드화하는 유전자를 얻는데에도 성공하고, 이들의 배열이 서로 유사한 것, 부분적으로 공통의 배열을 갖는 것을 확인하였다. 또한, Fas 리간드의 활성에 필요하다고 생각되어지는 부분을 특정화하고, 본 발명을 완성시킨 것이다.

즉, 본 발명의 제 1 태양은 Fas 리간드의 아포토시스를 유도하는 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 제 2 태양은 Fas 리간드인 폴리펩타이드의 일부를 제공한다.

본 발명의 제 3 태양은 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 코드화하는 염기배열을 갖음을 특징으로 하는 신규 DNA이다.

본 발명의 제 4 태양은 본 발명의 제 3 태양의 DNA를 포함함을 특징으로 하는 재조합 DNA분자이다.

본 발명의 제 5 태양은 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA로 형질전환되었음을 특징으로 하는 형질전환체이다.

본 발명의 제 6 태양은 본 발명의 제 4 태양의 재조합 DNA분자로 형질전환되었음을 특징으로 하는 형질전환체이다.

본 발명의 제 7 태양은 본 발명의 제 5 또는 제 6 태양의 형질전환체를 이용함을 특징으로 하는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드의 제조방법이다.

본 발명의 제 8 태양은 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리팹타이드의 정제방법이다.

본 발명의 제 9 태양은 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 인식함을 특징으로 하는 신규항체이다.

본 발명의 제 10 태양은 Fas 리간드 유전자 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA의 일부에 상보적인 염기배열을 포함함을 특징으로 하는 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 유도체이다.

본 발명의 제 11 태양은 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드 또는 그것을 발현하는 형질전환체를 사용함을 특징으로 하는 Fas 항원 또는 Fas 리간드에 관련하는 물질의 스크리닝 방법이다.

본 발명은 Fas 리간드 및 그의 일부, 및 그것을 코드화하는 신규한 DNA를 의약분야에 제공한다. 본 발명은 또한 해당 신규 폴리펩타이드를 검출하기 위하여 사용할 수 있는 항체를 시약의 분야에 제공한다. 또한 본 발명은 해당 DNA를 포함하는 재조합 DNA분자, 형질전환체, 해당 신규 폴리펩타이드의 정제 방법 및 해당 신규 폴리펩타이드의 제조 방법, 해당 DNA에 대한 안티센스올리고누클레오티드, Fas 리간드에 관련하는 물질의 스크리닝법을 제공한다.

제 1 도는 각각 d10S, d10S-2 및 pTN24-15로 형질전환시킨 COS-7 세포의 플로사이트메트리의 해석 결과 a, b, c 를 나타내는 도면이다.

제 2 도는 클론 pTN24-15 중의 염기배열 및 추정되는 아미노산 배열을 나타내는 도면이다.

제 3 도는 클론 pTN24-15 중의 염기배열 및 추정되는 아미노산 배열을 나타내는 도면이다.

제 4 도는 d10S, d10S-2, d10S-16의 노던하이브리다이제션의 결과를 나타내는 도면이다.

제 5 도는 래트 비세포와 흉선세포를 이용한 노던하이브리다이제션의 결과를 나타내는 도면이다.

제 6 도는 래트 각 조직의 노던하이브리다이제션의 결과를 나타내는 도면이다.

제 7 도는 d10S-12 및 pTN24-15 로 형질전환한 COS-7 세포의 면역침강의 결과를 나타내는 도면이다.

제 8 도는 W4, WR19L을 표적세포로 했을때의 d10S 세포의 세포장애활성을 나타내는 도면이다.

제 9 도는 W4, WR19L을 표적세포로 했을때의 pTN24-15 로 형질전환한 COS-7세포, pCEV4 로 형질전환한 COS-7 세포의 세포장애활성을 나타내는 도면이다.

제 10 도는 W4, WR19L을 표적세포로 했을때의 pTN24-15로 형질전환한 COS-7세포, pCEV4로 형질전환한 COS-7 세포의 세포장애활성을 나타내는 도면이다.

제 11 도는 W4 세포에 대한 d10S 세포 및 pTN24-15 로 형질전환한 COS-7 세포의 세포장애작용의 mFas-Fc 에 의한 저해를 나타내는 도면이다.

제 12 도는 pTN24-15 로 형질전환한 COS-7 세포를 에펙터 세포로 하고 W4세포를 표적세포로 했을때, 표적세포에 있어서의 염색체 DNA의 변화를 나타내는 겔 전기영동을 나타내는 도면이다.

제 13 도는 정제한 Fas 리간드의 10-20% 구배 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동의 결과를 나타내는 도면이다.

제 14 도는 W4 및 WR19L 세포를 표적세포로 했을때의 정제 Fas 리간드의 세포장애활성을 나타내는 도면이다.

제 15 도는 플라스미드 pBL-hFL4H 중의 염기배열 및 추정되는 아미노산 배열을 나타내는 도면이다.

제 16 도는 인간 Fas 리간드 염색체 유전자의 염기배열을 나타내는 도면이다.

제 17 도는 인간 Fas 리간드 염색체 유전자의 염기배열을 나타내는 도면이다.

제 18 도는 인간 Fas 리간드 염색체 유전자의 염기배열을 나타내는 도면이다.

제 19 도는 클론 pBX-hFL1 중의 염기배열을 나타내는 도면이다.

제 20 도는 클론 pBX-hFL1 중의 염기배열을 나타내는 도면이다.

제 21 도는 pEX-hFL1 로 형질전환시킨 COS 세포 및 pEF-MFLW4F로 형질전환시킨 COS 세포를 에펙터 세포로 하고, WR19L 및 WC8A를 표적세포로 했을때의 특이적 세포 용해율을 나타내는 도면이다.

제 22 도는 hFas-Fc 및 mFas-Fc 에 의한 pEX-hFL1 로 형질전환시킨 COS 세포의 WC8A 세포에 대한 세포장애활성의 저해를 나타내는 도면이다.

제 23 도는 클론 pBL-MFLW4 중의 염기배열을 나타내는 도면이다.

제 24 도는 클론 pBL-MFLW4 중의 염기배열을 나타내는 도면이다.

제 25 도는 pEF-MFLW4F 로 형질전환시킨 COS 세포를 에펙터 세포로 하고, WR19L 및 W4를 표적세포로 했을때의 세포장애활성을 나타내는 도면이다.

제 26 도는 gld 마우스로 부터 단리한 Fas 리간드 cDNA 를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킨 COS 세포를 에펙터 세포로 하고, WR19L 및 W4를 표적세포로 했을때의 세포장애활성을 나타내는 도면이다.

제 27 도는 미생물의 형태를 나타내는 도면대용 사진으로서, 항혈청 19-3 인간 Fas 리간드 발현세포를 이용한 웨스턴블로팅의 결과를 나타내는 도면대용 사진이다.

제 28 도는 미생물의 형태를 나타내는 도면대용 사진으로서, 모노클로날항체 F864-5-1 과 인간 Fas 리간드 발현세포를 이용한 웨스턴블로팅의 결과를 나타내는 도면대용 사진이다.

제 29 도는 모노클로날 항체 F883-1-1 의 펩타이드와의 반응성을 나타내는 도면이다.

제 30 도는 모노클로날 항체 F883-l-1 의 아포토시스 억제활성을 나타내는 도면이다.

제 31 도는 모노클로날 항체 F897-1-2과 펩타이드 ③ 의 반응성을 나타내는 도면이다.

제 32 도는 모노클로날 항체 F897-1-2 의 아포토시스 억제활성을 나타내는 도면이다.

제 33 도는 WC8 및 W4 를 표적세포로 했을때의 형질전환체 COS-1/pM1070의 배양 상등액의 세포장애활성을 나타내는 도면이다.

제 34 도는 WC8 및 W4 를 표적세포로 했을때의 형질전환체 COS-1/pEX-hFL1 의 배양 상등액의 세포장애활성을 나타내는 도면이다.

제 35 도는 미생물의 형태를 나타내는 도면대용 사진이고, 비환원조건하에 있어서의 형질전환체 COS-1/pM1070의 배양 상등액의 웨스턴블로팅의 결과를 나타낸다.

제 36 도는 미생물의 형태를 나타내는 도면대용 사진이고, 비환원조건하에 있어서의 형질전환체 COS-1/pEX-hFL1 의 배양 상등액의 웨스턴블로팅의 결과를 나타낸다.

제 37 도는 안티센스올리고누클레오티드 A41 의 아포토시스 억제활성을 나타내는 도면이다.

제 38 도는 안티센스올리고누클레오티드 A69, A184, A355, A505, A733, A924의 아포토시스 억제활성을 나타내는 도면이다.

제 39 도는 각 배양 상등액중의 폴리펩타이드 ND38, ND40, ND41, ND42, ND43 및 CD179의 세포장애활성을 나타내는 도면이다.

제 40 도는 미생물의 형태를 나타내는 도면대용 사진으로서, 형질전환체 JE5505(pM1068)의 균체 및 배양 상등액의 웨스턴블로팅의 결과를 나타낸다.

제 41 도는 미생물의 형태를 나타내는 도면대용 사진으로서, 형질전환체 JE5505(pM1069)의 균체 및 배양 상등액의 웨스턴블로팅의 결과를 나타낸다.

발명의 개요

이하에 상세하게 본 발명을 설명한다.

우선, 본 발명의 제 1 태양에 관하여 설명한다.

본 명세서중의 설명에서 「식 X(또는 배열번호 X)에 기재한 아미노산 배열을 함유하는 폴리팹타이드」란, 그 폴리펩타이드의 아미노산 배열이 식 X 또는 배열번호 X 에 기재된 아미노산 배열이든지, 식 X 또는 배열번호 X 의 아미노산 배열의 N말단, C말단의 어느 한쪽, 또는 그 양쪽에 임의의 하나 이상의 아미노산이 부가하여 이루어진 아미노산 배열임을 의미한다. 또한, 「식 X(또는 배열번호 X)에 기재한 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드」란, 그 폴리펩타이드의 아미노산 배열이 실질적으로 식 X 또는 배열번호 X 에 기재한 아미노산 배열임을 의미한다.

또한, 본 명세서중의 설명에서 「Fas 리간드」란, 적어도 그 활성으로서 Fas 항원을 발현하는 세포에 대하여 아포토시스를 유도하는 활성을 갖는 물질을 말한다. Fas 리간드에 의한 아포토시스의 유도는 Fas 리간드가 세포표면의 Fas 항원에 결합하고, Fas 항원을 통하여 아포토시스의 시그널이 세포에 전달되기 때문이라고 생각되어지고 있다. 여기서에 말하는 Fas 항원은 어떠한 동물종의 Fas 항원이어도 좋다. 예를들면 인간 Fas 항원이면 이토우 등에 의해 아미노산 배열이 결정되어 있고, 마우스 Fas 항원이면 와타나베-후쿠나가 등에 의해 아미노산 배열이 결정되어 있으며, 래트 Fas 항원이면 키무라 등에 의해 아미노산 배열이 결정되어 있다(이토우 N. (Itoh N.)등, Cell, 66권, 233-243페이지, 1991년, 와타나베-후쿠나가 R. (Watanabe-Fukunaga R.) 등, J. Immunol., 148권, 1274-1279페이지, 1992년, 키무라 K.(Kimura K.)등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 198권, 666-674페이지, 1994년).

본 발명의 제 1 태양의 Fas 리간드의 아포토시스 유도활성을 갖는 신규 폴리펩타이드는, 식 1 내지 12(배열표의 배열번호 1 내지 12) 중 어느 아미노산 배열을 포함함을 특징으로 한다.

이중에서 상기식 1 내지 4는 인간세포로 부터 얻어진 Fas 리간드의 아미노산배열이고, 상기식 5 내지 8 은 래트세포로 부터 얻어진 Fas 리간드의 아미노산 배열이다. 또한, 상기식 9 내지 12 는 마우스세포로 부터 얻어진 Fas 리간드의 아미노산 배열이다.

상기식 4, 8, 12 의 아미노산 배열은 어느것이나 세포내영역, 막관통영역, 세포외 영역을 포함하고 있는 것으로 부터, 이들의 폴리펩타이드는 생체내에 있어서 세포표면 폴리펩타이드로서 존재하고 있다고 생각된다. 따라서, 이들 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드를 얻기 위해서는 이들을 발현하고 있는 세포나 조직으로 부터 정제할 필요가 있다. 그런데, 이와 같은 세포표면상에 존재하는 폴리펩타이드의 세포외 영역은 세포막으로 부터 절단, 유리되고, 그것을 생산하는 세포의 배양 상등액중이나 소변이나 혈액 등의 체액중에 존재하는 일이 많다. 일반적으로 폴리펩타이드의 정제는 세포나 조직으로 부터 정제하는 경우와, 배양 상등액이나 소변으로 부터 정제하는 경우에 있어서 후자가 효율적이고 수량도 많다. 따라서, Fas 리간드에 있어서도 세포외 영역의 경우가 그 생산성의 면에서 형편이 좋다.

본 발명에서는 이와 같은 Fas 리간드의 세포외 영역도 본 발명의 Fas 리간드의 아포토시스 유도활성을 갖는 폴리펩타이드로서 제공한다. 세포외 영역이 세포막으로 부터 절단되는 부위는 그것을 생산하는 세포의 배양조건이나 세포내외의 플로테아제의 영향에 의해 다양성이 일어나는 일도 있다. 그러나, 본 발명에서 제공되는 Fas 리간드의 세포외 영역의 바람직한 예는 상기식 3, 7, 11 중 어느 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드이다. 이들은 각각 인간, 래트, 마우스의 Fas 리간드의 세포외 영역의 아미노산 배열에 상당한다. 상기식 3의 배열은 상기식 4 의 아미노산 배열의 N말단으로 부터 세어 제 103 번째에서 281 번째에 상당하고, 상기식 7의 배열은 상기식 8 의 아미노산 배열의 N말단으로 부터 세어 제 100 번째에서 278 번째에 상당한다. 또한, 상기식 11 의 배열은 상기식 12 의 아미노산 배열의 N말단으로 부터 세어 제 101 번째에서 279 번째에 상당한다.

본 발명의 Fas 리간드의 아포토시스 유도활성을 갖는 폴리펩타이드는 바람직하게는 Fas 리간드의 세포외 영역이다.

그런데, 주지하는 바와 같이 폴리펩타이드를 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 경우에는 저분자량의 폴리펩타이드의 쪽이 발현량이 높고, 보다 높은 생산효율을 기대할 수 있다. 또한, 활성에 필요한 부분만을 갖고 있는 폴리펩타이드는 나머지 배열을 갖고 있는 폴리펩타이드에 비해 생체에 대한 항원성이 낮을 것으로 기대된다. 덧붙여서, 저분자량의 폴리펩타이드이면 다른 활성을 갖는 폴리펩타이드와 융합시켜서 새로운 활성을 부가시키거나, 항체와 결합시켜서 특정의 세포에만 작용시키는 등의 수식이 용이하다. 본 발명은 이와 같이 생산성, 항원성 등의 점에서 유용성을 기대할 수 있는 보다 저분자의 폴리펩타이드로서, 상기식 1, 5, 9 중 어느 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기식 2, 6, 10 중 어느 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다.

상기식 1, 2, 5, 6, 9 및 10 은 인간, 래트 및 마우스의 세포외 영역 부분의 아미노산 배열의 일부를 나타내는 것이다.

즉, 상기식 1, 5, 9의 아미노산 배열은 각각 상기식 3, 7, 11 의 아미노산 배열의 N말단으로 부터 42 아미노산이 결손된 배열이다. 또한, 상기식 2, 6, 10의아미노산 배열은 각각 상기식 3, 7, 11 의 아미노산 배열의 N말단으로 부터 41 아미노산이 결손된 배열이다. 실시예로 부터 명확하듯이 세포외 영역의 아미노산 배열인 상기식 3의 N말단으로 부터 42 아미노산, 41 아미노산이 결손된 아미노산 배열(각각 상기식 1, 식 2)의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드이어도 아포토시스 유도활성을 갖고 있다. 또한, 상기식 3의 N말단으로 부터 40 아미노산, 38 아미노산, 34 아미노산이 결손된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드이어도 아포토시스를 유도하는 활성을 갖고 있다.

이것은 세포외 영역의 N말단으로 부터 43 번쩨 이후의 아미노산 배열이 아포토시스 유도활성에 필요하고, 이 아미노산 배열, 즉 상기식 1, 5, 9 중 하나의 아미노산 배열을 그 일부에 함유하는 폴리펩타이드는 아포토시스 유도활성을 갖고 있는 것 및 결손하는 아미노산의 수에 의해 아포토시스를 유도하는 활성에 차이가 있음을 시사하고 있다. 따라서, 본 발명의 신규 폴리펩타이드는 상기식 1, 5, 9 중 어느 아미노산 배열을 함유하는 것으로서 특징지워진다.

본 발명의 제 1 태양의 폴리펩타이드중에서 인간의 Fas 리간드의 세포외 영역인 상기식 3 의 아미노산 배열의 N말단으로 부터 1 내지 42 어느것인가의 수의 아미노산이 결여된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드는, 어느것이나 다른 동물종으로 부터 얻어진 Fas 리간드에 비하여 인간에 대한 항원성이 낮고, 형질전환체에 있어서 적당한 시그널 펩타이드를 붙여 발현시키면 형질전환체의 배양 상등액으로 부터 회수되고, 저분자화되어 있기 때문에 뛰어난 생산성이 기대된다. 그중에서도 상기식 3의 N말단으로 부터 40 아미노산이 결손된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드 및, 상기식 3의 N말단으로 부터 34 아미노산이 결손된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드는 활성면에서도 바람직한 폴리펩타이드이다.

일반적으로 폴리펩타이드는 종의 차이, 개체의 차이에 의해 그 기본적인 기능이 유지된채 아미노산 배열에 변이가 일어날 경우가 있다. 여기에서 말하는 아미노산의 변이란, 아미노산 배열중의 하나 이상의 아미노산이 결손하거나, 다른 아미노산으로 치환되거나, 아미노산 배열중의 임의의 위치에 하나 이상의 아미노산이 삽입 또는 부가되거나 하는 것을 의미한다. 이와 같은 변이는 유전공학적인 기술을 사용하여 인공적으로 일으키는 일도 가능하다. 따라서, 폴리펩타이드가 상기식 1 내지 12 에 기재한 어느것인가의 아미노산 배열에 상기와 같은 변이가 일어난 아미노산 배열을 함유하는 것이어도, 그것이 상기식 1 내지 12 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드와 같은 성질을 갖는 한 본 발명의 폴리펩타이드에 포함된다.

일반적으로 동일한 기능을 갖는 폴리펩타이드에 대한 DNA는 동물종이나 개체가 달라도 서로 상동성이 있고, 서로 하이브리드화 하는 일이 많다. 아미노산의 다양성도 그들을 코드화하는 DNA 가 서로 하이브리드화 하는 범위에서 발생하는 일이 많다. 예를들면 실시예에서 나타낸 하이브리드화법에 의한 DNA 의 클로닝은 상기식 3 또는 11 의 아미노산 배열을 코드화하는 DNA 가, 상기식 7의 아미노산 배열을 코드화하는 DNA 와 하이브리드화 하는 것을 나타내고 있다. 그리고 상기식 3 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드는 인간 Fas 항원에 더하여 적어도 마우스 Fas 항원에 결합한다. 상기식 7의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드는 래트 Fas 항원에 더하여 적어도 마우스 Fas 항원에도 결합한다. 상기식 11 의 아미노산 배열을 갖는폴리펩타이드는 마우스 Fas 항원에 더하여 적어도 인간 Fas 항원에도 결합한다. 이와 같이 서로 하이브리드화 하는 DNA 에 의해 코드화되는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드는 실질적으로 동일한 기능을 갖는다고 생각되어진다.

따라서, 본 발명의 신규 폴리펩타이드는 상기식 1 내지 12, 보다 바람직하게는 상기식 1, 5, 9 중 어느 아미노산 배열을 코드화하는 염기배열에 상보적인 염기배열로 하이브리드화 하는 염기배열에 의해 코드화되는 아미노산 배열을 함유하는 것으로서도 특징지을 수 있다. 본 발명의 신규 폴리펩타이드는 바람직하게는 이러한 특징에 더하여 적어도 인간 Fas 항원, 래트 Fas 항원, 마우스 Fas 항원의 어느것인가에 결합하는 것이고, 더욱 바람직하게는 아포토시스 유도활성을 갖는 것이다.

다음으로 본 발명의 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드에 관하여 설명한다.

본 발명의 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드는 Fas 리간드의 일부 및 그들의 융합체이다. 본 발명의 제 2 태양의 폴리펩타이드는 바람직하게는 상기식 4, 8, 12 중 하나의 아미노산 배열의 일부로 부터 이루어지는 폴리펩타이드 및, 그들 폴리펩타이드를 2종 이상 융합시켜 이루어지는 융합체이다.

상기식 4, 8, 12 중 하나의 아미노산 배열의 일부로 부터 이루어지는 풀리펩타이드란 어떠한 길이의 폴리펩타이드이어도 좋다. 그러나, 해당 폴리펩타이드가 상기식 4, 8, 12 에 특징적인 배열을 갖기 위해서는 해당 폴리펩타이드는 바람직하게는 5 아미노산 이상, 더욱 바람직하게는 10 아미노산 이상의 아미노산으로 부터 이루어지는 폴리펩타이드이다.

본 발명의 제 2 태양의 폴리펩타이드는 Fas 항원에 결합하거나, 결합하지 않는 것이어도 좋다. 본 발명의 제 2 태양의 폴리펩타이드가 Fas 항원에 결합하고 또 아포토시스를 유도하지 않는 경우에는, 생체내의 Fas 리간드에 길항하는 물질로서 아포토시스를 인위적으로 억제하기 위하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 제 2 태양의 폴리펩타이드는 실시예에 나타내듯이 그것이 Fas 항원에 결합하는가 아닌가에 관계없이, 또한 아포토시스를 유도하는가 아닌가에 관계없이 본 발명의 제 1 태양의 신규 폴리펩타이드에 대한 항체를 작성하기 위한 항원으로서 사용할 수 있다.

상기식 4, 8, 12 어느것이가에 기재의 아미노산 배열의 일부로 부터 이루어지는 폴리펩타이드를 2종 이상 융합시켜 이루어지는 폴리펩타이드란, 상기식 4, 8, 12 에 기재의 아미노산 배열의 일부로 부터 이루어지는 폴리펩타이드에서 선택되는 임의의 두개 이상의 폴리펩타이드가 임의의 순번으로 융합한 폴리펩타이드이다. 예를들면 상기식 4 에 기재된 아미노산 배열의 일부로 부터 이루어지는 폴리펩타이드끼리를 융합시킨 것, 상기식 4 의 일부로 부터 이루어지는 폴리펩타이드와 상기식 8 의 일부로 부터 이루어지는 폴리펩타이드를 융합시킨 것 등이 본 발명에 포함된다. 이와 같은 융합 폴리펩타이드의 예로서는 상기식 3의 아미노산 배열의 N말단으로 부터 세어 50 번째의 아미노산에서 179 번째까지의 아미노산에서의 배열에 더하여, 그 N말단에 상기식 7 의 아미노산 배열의 1 번째의 아미노산에서 49 번째의 아미노산까지의 배열, 또는 상기식 11 의 아미노산 배열의 1 번째의 아미노산에서 49 번째의 아미노산까지의 배열을 갖는 폴리펩타이드를 들 수 있다.

이들 폴리펩타이드는 각각 인간의 Fas 리간드와 래트의 Fas 리간드의 키메라형 폴리펩타이드, 사람의 Fas 리간드와 마우스의 Fas 리간드의 키메라형 폴리펩타이드이고, Fas 항원을 유도하는 세포에 대하여 아포토시스를 유도하는 일이 기대되는 것이다.

상술의 융합 폴리펩타이드는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제작할 수 있다. 즉, 각각의 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA를 결합시켜서 목적하는 키메라형 Fas 리간드를 코드화하는 DNA를 제작한다. 이것을 적당한 발현벡타에 넣어 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환 또는 그 배양상제로 부터 목적하는 키메라형 Fas 리간드를 회수한다.

통상, 동일한 기능을 갖는 단백질을 코드화하는 DNA의 염기배열은 동물종이나 개체가 달라도 서로 동족성을 갖고 있는 일이 많다. 따라서, 「배열번호 13 내지 24(식 13 내지 24) 중 어느 염기배열중의 임의의 하나 이상의 염기에 변이가 발생한 염기배열」이란 상기 식 13 내지 24로 부터 선택되는 어느 염기배열의 적어도 일부와 동족성이 있는 배열, 즉 상기식 13 내지 24로 부터 선택되는 어느 염기배열에 상보적인 배열의 적어도 일부와 하이브리드화 하는 염기배열을 갖는 DNA인 것이 바람직하다. 여기에서 「하이브리드화 한다」라는 것은, 상기식 13 내지 24 중 어느 염기배열에 상보적인 배열의 일부를 프로브로서 공지의 방법(예를들면 샘브룩 J.(Sambrook J.)등, Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., 1989년, Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕(New York), 참조)으로 하이브리드화를 행한 경우에 하이브리드화 하는 것을 말한다.

본 발명의 제 1 및 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드에는 당쇄를 갖는 것, 갖지 않는 것 모두 포함된다.

상기식 4 및 8 에서 나타낸 아미노산 배열에는 각가 4개소의 당쇄부가 가능부위(N-글리코실화 부위)가 있다. 즉, 상기식 4 에 있어서는 아미노산 번호 76 내지 78, 184 내지 186, 250 내지 252, 260 내지 262 가, 상기식 8 에 있어서는 아미노산 번호 116 내지 118, 130 내지 132, 247 내지 249, 257 내지 259 가 당쇄부가 가능부위에 해당한다. 또한, 상기식 12의 아미노산 배열에는 5개소의 N-글리코실화 부위가 있다(아미노산 번호 117 내지 119, 131 내지 133, 182 내지 184, 248 내지 250, 258 내지 260).

따라서, 해당 폴리펩타이드가 동물세포에 의해 생산된 것이거나, 유전공학적으로 효모나 동물세포 등의 진핵세포를 숙주로서 생산시킨 것이거나 한 경우에는 당쇄가 부가될 가능성이 있다. 한편, 대장균 등의 원핵세포를 숙주로서 유전공학적으로 폴리펩타이드를 생산시킨 경우에는, 해당 신규 폴리펩타이드는 당쇄를 갖지 않는다.

본 발명의 제 1 및 제 2 태양이 폴리펩타이드는 당쇄의 유무에 관계없이 유용하다. 예를들면, 해당 폴리펩타이드는 당쇄의 유무에 관계없이 본 발명의 제 9 태양의 항체를 작성할때의 항원으로서 사용하거나, 해당 폴리펩타이드에 결합하는 물질의 스크리닝에 사용할 수 있다.

본 발명의 제 1 및 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드는 어떠한 방법으로 생산된 것이어도 좋다. 예를들면, 펩타이드 합성기(예를들어 펩타이드신세사이저43OA형, 퍼킨엘머져팬(주)제)를 사용하여 화학합성한 것이거나, 인간 및 인간 이외의어떠한 생물의 조직이나 세포, 체액으로 부터 정제된 것이어도 좋다. 인간이나 동물의 체액으로서는 혈액이나 소변을 들 수 있다. 세포로서는 본 발명의 신규 폴리펩타이드를 생산하는 세포를 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 예를들면, 비세포나 흉선세포, 임파구계세포 및 그들의 주화세포 등을 노던블롯트 또는 웨스턴블롯트 등으로 해석하고, 본 발명의 신규 폴리펩타이드의 발현량이 높은 것을 선택한다.

필요하다면 세포를 PMA(포르볼미리스테이트아세테이트)나 이오노마이신, PHA(피트햄아글루티닌), ConA(콘카나발린A), IL-2(인터로이킨-2) 등의 자극제로 부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 적절한 자극제로 자극하여 생산유도한다. 그리고 세포 또는 배양 상등액으로 부터 해당 폴리펩타이드를 정제한다. 정제는 농축이나 각종 크로마토그래피, 염석 등 일반적으로 행해지고 있는 폴리펩타이드의 정제방법을 적절히 조합시켜 Fas 항원에의 결합성, 또는 Fas 항원을 발현하고 있는 세포에의 세포장애활성 등을 지표로서 행할 수 있다. 정제방법의 바람직한 예는 제 8 태양에서 설명한다.

그러나, 해당 신규 폴리펩타이드는 그 순도면으로 볼 때 유전공학적으로 생산된 것, 즉 재조합형 폴리펩타이드인 것이 바람직하다. 해당 폴리펩타이드를 유전공학적으로 생산하는데에는 후술하는 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA, 또는 제 4 태양의 재조합 DNA 분자를 이용하여 적당한 숙주세포를 형질전환하고, 얻어진 형질전환체를 배양하여 배양혼합물을 회수하여 해당 폴리펩타이드를 정제한다. 또한, 핵 DNA나 재조합 DNA 분자를 이용하여 무세포계의 합성방법(샘브룩 J.(Sambrook, J.)et al. : Molecular Cloning 2nd ed. (1989년))으로 얻는 방법도 유전공학적으로 생산하는 방법중의 하나이다.

유전공학적으로 본 발명의 신규 폴리펩타이드를 제조하는 바람직한 방법에 관해서는 본 발명 제 7 태양에서 설명하고 있다.

최근의 기술에 의해 폴리펩타이드를 폴리에틸렌글리콜이나 스티렌말레인산코폴리머, 덱스트란, 필란코폴리머, 폴리리신 등의 고분자에 결합시키거나, 다당류나 폴리펩타이드 등의 천연고분자, 호르몬 등의 생리활성물질, 마그네타이트 등의 무기물질에 결합시키거나 하는 일이 가능해졌다(예를들면 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84권, 1487-1491페이지 (1981년), Biochemistry 28권, 6619-6624 페이지(1989년)).

폴리펩타이드에 폴리에틸렌글리콜을 결합시키는 방법의 일례를 간단히 설명한다. 우선, 폴리펩타이드 자체가 활성을 잃지 않는 범위의 염기성 pH를 갖는 완충액에 용해시킨다. 그 용액에 메톡시폴리에틸렌글리콜 숙신이미딜석시네이트와 같은 활성화 폴리에틸렌글리콜을 혼합하고, 실온에서 일정시간 반응시킨다. 그후, 겔여과 등에 의해 활성을 갖는 획분을 분취한다. 본 발명의 제 1 및 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드도 공지 방법의 조합에 의해 이와 같은 수식이 가능하다. 따라서, 본 발명의 제 1 및 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드에는 상술과 같은 수식을 받은 것도 포함된다.

일반적으로 폴리펩타이드 생체나 배양액중에서 공유결합에 의해 또는 공유결합에 의하지 않고 복수의 분자가 결합한 다량체를 형성할 수 있다. 다량체의 형성은 같은 분자끼리 결합하여 다량체를 형성하는 일도 있고, 다른 분자끼리 결합하여다량체를 형성하는 일도 있다. 예를들면, TNF 는 3량체를 형성함이 알려져있다. 또한, 악티빈은 2량체를 형성함이 알려져 있다.

본 발명의 제 1 및 제 2 태양의 폴리펩타이드는 단량체이어도 좋고, 다량체를 형성하고 있어도 좋다. 예를들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 상기식 1 내지 12 중 어느 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드가 서로 결합하여 3량체를 형성하고 있어도 좋다.

본 발명의 제 1 및 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드는 생체내에서 발생하는 아포토시스를 조절하기 위하여 사용할 수 있다.

예를들어, Fas 항원에 결합하고 아포토시스를 유도하는 상기식 1 내지 12 중 어느 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드로 대표되는 본 발명의 신규 폴리펩타이드는 약제 내성이 있는 암을 치료하기 위하여 사용할 수 있다. 또한, 이들은 HIV 바이러스가 감염된 세포에 대하여 아포토시스를 인위적으로 유도하고, AIDS 의 감염초기의 치료약으로 되어 새로운 치료방법을 의약분야에 제공할 수 있다.

한편, 본 발명의 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드중 Fas 항원에 결합하지만 아포토시스를 유도하지 않는 폴리펩타이드는, 간염 등의 중독한 감염증이 되었을때에 감염세포가 아포토시스를 일으키는 것을 막고, 간장 등의 주요조직의 세포의 급격한 감소를 방지하므로써 조직기능의 저하를 예방할 수 있다.

본 발명의 신규 폴리펩타이드를 의약품으로서 사용할 경우에는 폴리펩타이드를 유효성분으로서 포함하는 통상의 의약조성물의 제조방법에 준하여 주사제, 정제, 캅셀제, 좌제, 분무제, 크림제, 파프제, 점안제 등, 적당한 제형의 의약조성물을 제조한다. 예를들어, 주사제이면 해당 신규 폴리펩타이드를 포함하는 용액을 무균상태에서 조제하고, 필요하면 안정화제 등의 보조성분을 가하여 앰플에 충진하여 동결건조시킴으로써 해당 신규 폴리펩타이드를 유효성분으로 하는 의약조성물을 제조할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 의약조성물은 사용시에 주사용 증류수 등에 용해하여 정맥내 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 의약조성물의 유효성분으로서는, 본 발명의 신규 폴리펩타이드중에서도 인간에 대한 항원성이 가장 낮고 상기식 1 내지 4 의 아미노산 배열을 함유하는 폴리펩타이드, 특히 상기식 1 내지 4 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드 또는 그들의 일부를 갖는 폴리펩타이드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 폴리펩타이드는 환자의 연령이나 성별, 질환의 종류, 정도에 따라서 그 투여방법, 투여량을 설정하여 사용할 수 있다. 즉, 아포토시스를 조절하고 병의 용태를 개선하는데 적당한 양을 경구투여 또는 흡입, 경피투여, 점안, 질내투여, 관절내투여, 직장투여, 정맥내투여, 국소투여, 근육내투여, 피하투여, 복강내투여 등 적당한 방법을 선택하여 투여하면 좋다.

본 발명의 제 1 및 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드는 또한 항체를 얻기 위한 재료로서 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 신규 폴리펩타이드를 토끼 등의 동물에 투여하여 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 항체를 작성한다. 항체의 제작법에 관해서는 제 9 태양에서 설명한다. 얻어진 항체는 조직이나 세포의 염색에 사용하거나 해당 신규 폴리펩타이드를 정제하기 위해 친화성 칼럼의 제작에 사용할 수 있다.

다음으로 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA를 설명한다.

본 명세서의 설명에서 「식 Y(또는 배열번호 Y)의 염기배열을 함유하는 DNA」란, DNA가 식 Y(또는 배열번호 Y)로 표시되거나, 식 Y(또는 배열번호 Y)에 기재된 염기배열의 5' 말단, 3' 말단의 어느 한쪽, 또는 양쪽에 임의의 하나 이상의 염기가 부가된 배열로 표시된 것이어도 좋음을 의미한다. 여기에서, 부가되는 염기는 코팅프레임에 어긋남을 발생시키지 않는 한, 어떠한 것이어도 좋고, 예를들면 린카배열, 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열, 다른 단백질을 코드화하는 염기배열, 또는 DNA 프로브 등을 제작할 때에 그 검출감도의 증가를 목적으로 하여 부가되는 배열 등을 예로서 들 수 있다. 또한 「식 Y(또는 배열번호 Y)의 염기 배열을 갖는 DNA」란 그 DNA가 실질적으로 식 Y(또는 배열번호 Y)로 표시된 염기배열로 나타난 것임을 의미한다.

본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA 는 Fas 리간드에 대한 DNA 및 그 일부를 함유한다.

즉, 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA는 본 발명의 제 1 및 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 코드화하는 염기배열을 함유한다. 본 발명의 신규 DNA는 바람직하게는 상기식 1 내지 12(배열표의 배열번호 1 내지 12)중 어느 아미노산 배열 또는 그 일부분을 코드화하는 염기배열을 함유한다.

일반적으로 아미노산을 코드화하는 DNA의 트리플래트는 아미노산의 종류마다 1 내지 6종류까지 존재함이 알려져 있기 때문에, 상기 배열번호 1 내지 12 중 어느 아미노산 배열을 코드화하는 염기배열은 1종류에 한정되지 않는다. 따라서 본 발명의 DNA는 그것이 상기 1 내지 12 중 어느 아미노산 배열 또는 그 일부를 코드화하는 한, 어떠한 배열로 이루어지는 DNA이어도 좋다.

그러나, 바람직하게는 본 발명의 신규 DNA는 상기식 13 내지 24 중 어느 염기배열 또는 상기식 13 내지 24(배열표의 배열번호 13 내지 24)중 어느 염기배열의 일부를 함유하는 DNA이다. 상기식 16, 20, 24에 기재한 배열은 각각 인간, 래트, 마우스의 Fas 리간드의 아미노산 배열인 상기식 4, 8, 12 에 기재한 아미노산 배열을 코드화하는 것이다. 상기식 15, 19, 23 에 기재한 염기배열은 각각 상기식 4, 8, 12 에 기재된 Fas 리간드의 세포외 영역부분인 상기식 3, 7, 11 에 기재한 아미노산 배열을 코드화하는 것이다. 상기식 13, 14, 17, 18, 21, 22 에 기재한 염기배열은 각각 상기 인간, 래트 또는 마우스 Fas 리간드의 세포외 영역의 보다 짧은 영역인 상기식 1, 2, 5, 6, 9, 10의 아미노산 배열을 코드화하는 것이다.

본 발명의 DNA는 그것이 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 코드화하는 염기배열을 함유하는 한, cDNA 이거나 염색체 DNA이어도 좋다. 그러나 벡타로의 도입의 용이함 등, 유전공학적수법에 있어서의 취급의 용이함으로 부터 본 발명의 신규 DNA는 cDNA인 것이 바람직하다. 염색체 DNA의 일례로서는 시험식 13 내지 16 의 염기배열을 함유하는 염색체 DNA의 염기배열을 제 16도 내지 18도에 나타낸다.

본 발명 DNA는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조하기 위해 유용하다. 즉, 본 발명의 DNA를 프로모터배열 등의 발현에 필요한 배열을 갖는 적당한 발현벡타의 적당한 위치에 삽입하고, 이 벡타에서 적당한 숙주세포를 형질전환시킴으로써 형질전환체에 본 발명의 제 1또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 예를들면, 실시예에도 나타냈듯이 상기식 16, 20, 24 의 염기배열을 함유하는 재조합 DNA 분자로 형질전환시킨 형질전환체의 배양 상등액중에는 아포토시스를 유도하는 활성을 갖는 폴리펩타이드, 즉 Pas 리간드가 유리되는 경우가 있다. Fas 리간드는 이와같은 형질전환체 또는 그 배양 상등액으로 부터 회수할 수 있다.

특히 상기식 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23 중 어느 염기배열을 갖는 DNA는, 아포토시스를 유도하는 활성을 갖는 보다 저분자의 폴리펩타이드를 생산하기 위하여 적당하다. 이들 염기배열은 인간, 래트 및 마우스의 Fas 리간드의 세포외 영역부분 또는 그 일부의 아미노산 배열을 코드화하는 염기배열을 나타내는 상기식 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11 의 아미노산 배열을 코드화하고 있기 때문에, 적당한 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열의 하류에 이들중 어느 염기배열을 갖는 DNA를 접속하여 발현시키면 그 배양 상등액중에 상기 폴리펩타이드가 분비되기 때문이다.

이미 설명했듯이, 폴리펩타이드의 정제에 있어서는 세포의 용해물로 부터 정제하기 보다는 배양 상등액으로 부터 정제하는 편이 효율적이다. 상기식 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23 중 어느 염기배열을 갖는 DNA는 상기 이점에 더하여 저분자이기 때문에 유전공학적 수법에 있어서 취급하기 쉽다고 하는 점에서도 이용가치가 높다.

상술했듯이 동일한 기능을 갖는 폴리펩타이드이어도 종의 차이나 개체차이에 의해 아미노산 배열이나 그것을 코드화하는 DNA의 염기배열에 다양성이 발생하는일이 있다.

통상, 동일한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA의 염기배열은 동물종이나 개체가 달라도 서로 동족성을 갖고 있는 일이 많다. 따라서, 상기식 13 내지 24 중 어느 염기배열중의 적어도 일부와 동족성이 있는 염기배열, 즉 상기식 13 내지 24 중 어느 염기배열에 상보적인 배열의 적어도 일부와 하이브리드화 하는 DNA는, 본 발명의 DNA가 코드화하는 폴리펩타이드와 동일한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 코드화하고 있다고 생각되어진다. 여기서 「하이브리드화 한다」란, 상기식 13 내지 24 중 어느 염기배열에 상보적인 배열, 또는 그 일부를 프로브로서 공지의 방법(예를들면 샘브룩 J.(Sambrook J.)등, Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., 1989년, Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕(New York), 참조)으로 하이브리드화를 행한 경우에 하이브리드화 함을 말한다. 실시예에서도 상기식 19의 염기배열에 상보적인 염기배열의 일부를 프로브로서 하이브리드화를 행하는 방법을 나타내고 있다.

이와 같이 상기식 13 내지 24 중 어느 염기배열에 상보적인 염기배열과 하이브리드화 하는 DNA도 본 발명의 제 3 태양의 DNA에 포함된다. 특히 상기식 13, 17, 21 의 염기배열에 상보적인 염기배열과 하이브리드화 하는 DNA로서 Fas 리간드를 코드화하는 DNA는 본 발명의 제 3 태양의 바람직한 예의 하나이다.

본 발명의 제 3 태양의 DNA는 배열표의 배열번호 27, 25, 28 중 어느 염기배열의 일부분의 염기배열을 갖는 DNA이어도 좋다. 실시예에 나타내듯이 배열표의 배열번호 27, 25, 28 의 염기배열은 각각 Fas 리간드를 코드화하는 염기배열을 함유하는 DNA로서, 각각 인간, 래트, 마우스의 cDNA 라이브러리로 부터 얻어진 cDNA의 염기배열이다. 배열번호 27, 25, 28 에 기재한 염기배열은 그 배열중에 각각 상기식 16, 20, 24 에 기재한 배열을 함유한다.

상기 배열표의 배열번호 27, 25, 28중 어느 염기배열의 일부분이란 어떠한 일부분이어도 좋음을 의미한다. 예를들면, 상기식 16, 20, 24 의 일부분이어도 좋고, 5' 말단측, 3' 말단측의 논코팅 영역의 일부여도 좋다. 또한 그 길이는 특히 한정되지 않는다.

해강 DNA는 아포토시스를 유도하는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA를 클로닝하기 위한 프로브나, PCR 용의 플라이마로서 사용할 수 있다.

또한 해당 DNA를 포슬라딧슈퍼옥시다제(HRPO)등의 효소나 방사성동위체, 형광물질, 화학발광물질 등으로 표식하고, 조직이나 세포에 있어서의 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 검출하거나, 그 발현량을 측정하는 진단용 DNA 프로브로서도 사용할 수 있다.

본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA는 어떠한 방법으로 얻어진 DNA이어도 좋다. 즉, 상기식 13 내지 24(배열표의 배열번호 13 내지 24) 또는 배열표의 배열번호 25, 27 및 28 을 참고로 하여 화학합성된 것이어도 좋고, 적당한 DNA 라이브러리로 부터 클로닝된 것이어도 좋다.

본 발명의 신규 DNA를 화학 합성하는데는 예를들어 다음과 같이 수행하면 좋다. 즉, 우선 상기식 13 내지 24, 또는 배열표의 배열번호 25, 27 및 28 을 참고로 하여 원하는 염기배열을 갖는 DNA를 약 20 염기정도로 부터 이루어지는 단편으로나누어 DNA 화학합성기(예를들면 394형, 퍼킨엘머져팬(주)제)를 이용하여 합성하고, 그후 필요에 따라서 5' 말단의 인산화를 행하여 각 단편을 아닐링하고 결합하여 목적하는 DNA를 얻는다.

본 발명의 신규 DNA를 DNA 라이브러리로 부터 얻는 예로서는, 적당한 게놈 DNA 라이브러리나 cDNA 라이브러리를 하이브리드화에 의한 스크리닝법이나 항체를 이용한 이뮤노스크리닝법 등으로 스크리닝하고, 목적하는DNA를 갖는 클론을 증식시켜 그로부터 제한효소 등을 이용하여 반출하는 방법이 있다. 하이브리드화법에 의한 스크리닝은 상기식 13 내지 24, 또는 배열표의 배열번호 25, 27 및 28 중 어느 염기배열 또는 그 일부를 갖는 DNA를³²P 등으로 라벨링하여 프로브로하고, 임의의 cDNA 라이브러리에 대하여 공지의 방법으로(예를들면 마니아티스 T.(Maniatis T.) 등, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕(New York), 1982년) 행할 수 있다.

이뮤노스크리닝법으로 이용하는 항체는 후술하는 본 발명의 제 9 태양의 항체를 사용할 수 있다.

본 발명의 신규 DNA는 또한 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하는 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의해서도 얻을 수 있다.

PCR은 상기식 13 내지 24 또는 배열표의 배열번호 25, 27 및 28 중 어느 배열을 기초로 센스프라이머, 안티센스프라이머를 작성하고, 임의의 DNA 라이브러리에 대하여 공지의 방법(예를들면 미카엘 A. I. (Michael A. I.) 등, PCRProtocols, a Guide to Methods and Applications, 아카데믹출판(Academic Press), 1990년 참조)등을 행하여 본 발명의 신규 DNA를 얻을 수도 있다.

상기 각종 방법으로 사용하는 DNA 라이브러리는 본 발명의 DNA를 갖는 DNA 라이브러리를 선택하여 사용한다. 해당 DNA 라이브러리는 본 발명의 DNA를 갖는 라이브러리이면 어떠한 것도 사용가능하고, 시판의 DNA 라이브러리를 사용하거나, 본 발명의 DNA를 갖는 세포로 부터 cDNA 라이브러리를 작성하는데 적당한 세포를 선택하여 공지의 방법(샘브룩 J.(Sambrook J.)등, Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕(New York), 1989년 참조)에 따라서 cDNA 라이브러리를 제작하고 이용할 수 있다.

DNA의 염기배열이 제공되면 RNA의 배열이나 상보적인 DNA 및 RNA의 배열이 일의적으로 결정되기 때문에, 본 발명의 개시에 의해 본 발명의 제 3 태양의 DNA에 대응하는 RNA나 본 발명의 제 3 태양의 DNA와 상보적인 배열을 갖는 DNA 및 RNA 가 또한 제공된다.

본 발명의 제 3 태양의 DNA는 1본쇄이어도, 그에 상보적인 배열을 갖는 DNA나 RNA와 결합하여 2중쇄, 3중쇄를 형성하고 있어도 좋다.

또한, 해당 DNA는 포슬라딧슈퍼옥시다제(HRPO)등의 효소나 방사성동위체, 형광물질, 화학발광물질 등으로 표식되어 있어도 좋다.

본 발명의 신규 DNA는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 대량으로 생산하기 위하여 사용할 수 있다. 해당 DNA를 사용하여 본 발명의 신규 폴리펩타이드를 생산시키는 방법의 예는 본 발명의 제 7 태양에서 설명한다. 해당 DNA는 또한 상술한 바와 같이 효소 등으로 표식하여 조직에 있어서의 본 발명의 제 1 및 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드의 발현상황을 검사하기 위하여 사용할 수 있다. 즉, 해당 DNA를 프로브로서 사용하여 세포에 있어서의 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드의 발현량을 mRNA 발현량을 지표로서 인식함으로써, 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드의 제조에 적당한 세포나 세포의 배양조건을 결정할 수 있는 외에, 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드가 관련하는 질환의 진단을 행하는 일도 가능하다.

또한, 본 발명의 신규 DNA를 생체내의 세포에 도입하고, 예를들면 자기면역질환 등의 유전적으로 아포토시스의 기구가 결손되어 있는 질환의 유전자치료에도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA가 갖는 염기배열을 기초로 안티센스 의약품을 개발하고, 생체내에 있어서의 Fas 리간드 발현을 조절할 수도 있다. 즉, 상기식 13 내지 24 또는 배열표의 배열번호 25, 27 및 28 에 기재한 염기배열을 갖는 본 발명의 DNA의 일부나 그 유도체를 공지의 방법으로 합성하고, 그들을 사용하여 Fas 리간드의 발현을 조절하거나, 본 발명의 DNA에 상보적인 배열을 포함하는 올리고누클레오티드나 그 유도체를 사용하여 Fas 리간드의 발현을 조절하는 일이 가능하다. 안티센스 의약품의 기술에 관해서는 본 발명의 제 10 태양의 설명에서 상세히 서술한다.

다음으로, 본 발명의 제 4 태양의 재조합 DNA 분자에 관하여 설명한다.

본 발명의 제 4 태양의 재조합 DNA 분자는 상술한 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA를 포함함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자이다. 본 발명의 재조합 DNA 분자는 환상, 직쇄상 등 어떠한 형태의 것이어도 좋다. 또한, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 어떠한 용도에 사용되는 것이어도 좋다. 예를들면, 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 생산시킬때에 이용하는 것이어도 좋고, 본 발명의 제 3 태양의 DNA를 증폭시켜 대량으로 얻기 위하여 이용하는 것이어도 좋다.

본 발명의 제 4 태양의 재조합 DNA 분자는 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA에 가하고, 필요하다면 다른 염기배열을 갖고 있어도 좋다. 다른 염기배열이란 에난서배열, 프로모터배열, 리보좀결합배열, 복제수의 증폭을 목적으로서 사용되는 염기배열, 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열, 다른 폴리펩타이드를 코드화하는 염기배열, 폴리A부가배열, 스플라이싱배열, 복제개시점, 선택마커로 이루어지는 유전자의 염기배열 등을 말한다. 이들 염기배열의 필요성은 재조합 DNA 분자의 사용목적에 의해 결정되지만, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 본 발명의 제 3 태양의 DNA에 더하여 적어도 복제개시점 및 마커 유전자를 갖고 있는 것이 바람직하다. 마커 유전자로서는 암피시린내성유전자, 카나마이신내성유전자, 네오마이신내성유전자, 티미딘키나제유전자 등을 들 수 있다.

해당 재조합 DNA 분자의 바람직한 예는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 발현하도록 대장균을 형질전환시킬 수 있는 것이다. 즉, 해당 재조합 DNA 분자의 알맞은 예는 본 발명의 제 3 태양의 DNA에 더하여 적어도 대장균복제개시점, 마커 유전자에 더하여 대장균내에서 기능하는 프로모터배열을 갖고 있는 것이 바람직하다. 또한, 이들에 더하여 적어도 시그널 펩타이드를 코드화하는배열을 갖고 있는 것이 바람직하다. 대장균에서 기능하는 프로모터배열의 알맞은 예는 trp 프로모터, lac 프로모터이고, 대장균에서 기능할 수 있는 시그널 펩타이드의 알맞은 예는 대장균 알칼리 포스파다제의 시그널 펩타이드이다.

또한, 해당 재조합 DNA 분자는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 발현하도록 효모나 곤충세포, 동물세포 등의 진핵세포를 형질전환시킬 수 있는 것이어도 좋다.

즉, 해당 재조합 DNA 분자는 적어도 본 발명의 제 3 태양의 DNA, 마커 유전자에 더하여 폴리A부가배열을 갖고 있는 것이 바람직하다. 이들에 더하여 적어도 효모에서 기능하는 알코올옥시다제(AOX) 1의 프로모터, 또는 곤충세포에서 기능하는 폴리헤드린프로모터, 또는 동물세포에서 기능하는 SV40 의 프로모터나 SRα의 프로모터, 히트에론게이션팩터 1α(FE1α)의 프로모터, 또는 대장균에서의 복제개시점을 갖는 것도 해당 재조합 DNA 분자의 알맞은 예로서 들 수 있다.

본 발명의 제 4 태양의 재조합 DNA 분자는 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA를 임의의 벡터에 도입하여 얻을 수 있다. 필요하면 해당 신규 DNA를 다른 염기배열과 함께 임의의 벡터에 도입하여도 좋다. 또한, 해당 재조합 DNA 분자는 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA를 임의의 배열을 갖는 DNA 단편과 결합시킴으로써 얻을 수 있다. DNA를 벡터에 도입하는 방법은 공지이다(샘브룩 J.(Sambrook J.) 등, Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕(New York), 1989년 참조). 즉, DNA와 벡터를 각각 적당한 제한효소로 소화하고, 얻어진 각각의 단편을 DNA 리가제를 이용하여 결합시키면 좋다. 벡터는 플라스미드벡터, 파지벡터, 바이러스벡터 등 어떠한 것이어도 좋다. 예를들면, pUC118, pBR322, pSV2-dhfr, pBluescriptII, PHIL-S1, λZapII, λgt10, pAc700, YRP17, pEF-BOS, pEFN-II 등으로 부터 적절히 선택하여 사용할수 있다.

다음으로, 본 발명의 제 5 태양의 형질전환체에 관하여 설명한다.

본 발명의 제 5 태양의 형질전환체는 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA로 형질전환되었음을 특징으로 한다. 즉, 본 발명의 제 5 태양의 형질전환체는 숙주가 되는 적당한 세포나 미생물에 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA를 직접 도입함으로써 형질전환되었음을 특징으로 한다.

본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA를 숙주세포로 도입하는 방법으로서는, 일렉트로폴레이션법, 프로토플라스트법, 알칼리금속법, 인산칼슘침전법, DEAE덱스트란법, 마이크로인젝션법, 바이러스입자를 이용하는 방법 등의 공지방법(실험의학 임시중간, 유전공학핸드북 1991년 3월 20일 발향, 양토(羊土)사, 참조)이 있으나 어떠한 방법을 이용하여도 상관없다.

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 제 3 태양의 DNA 분자를 대량으로 제조할 목적으로도 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 제 3 태양의 DNA가 숙주세포의 적당한 프로모터의 하류에 넣어진 경우에는, 해당 형질전환체는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 생산한다. 따라서, 이와 같은 형질전환체는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 폴리펩타이드를 제조할 목적 등으로 사용할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 제 6 태양의 형질전환체에 관하여 설명한다.

본 발명의 제 6 태양의 형질전환체는 본 발명의 제 4 태양의 재조합 DNA 분자를 숙주가 되는 세포나 미생물에 도입함으로써 형질전환되었음을 특징으로 한다. 단, 그 재조합 DNA 분자의 작성에 사용하는 벡터는 숙주세포에 적합한 종류의 것일 필요가 있다. 마찬가지로 재조합분자내에 포함되는 프로모터, 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열, 마커 유전자 등은 숙주세포에 적합한 것일 필요가 있다. 예를들어 재조합 DNA 분자의 제작에 사용한 벡터와 숙주의 바람직한 조합의 예로서는, pUC118 과 대장균, pEF-BOS 와 COS 세포 또는 CH0 세포, Yac 와 효모, AcNPV 와 Sf 세포 등(실험의학임시증간, 유전공학 핸드북 1991년 3월 20일 발행, 양토사, 참조)을 들 수 있다.

본 발명의 제 4 태양의 재조합 DNA 분자를 숙주세포에 도입하는 방법으로서는, 상기 제 5 태양의 형질전환체의 작성방법과 마찬가지로 일렉트로폴레이션법, 프로토플라스트법, 알칼리금속법, 인산칼슘침전법, DEAE덱스트란법, 마이크로인젝션법, 바이러스입자를 이용하는 방법 등의 공지방법(실험의학임시증간, 유전공학 핸드북 1991년 3월 20일 발행, 양토(羊土)사, 참고)을 들 수 있다.

본 발명의 제 6 태양의 형질전환체는 원핵세포, 진핵세포의 어느 것이어도 좋다. 원핵세포의 대표적인 예로서는 대장균과 고초균을 들 수 있다. 진핵세포의 대표적인 예로서는 CHO 세포, HeLa 세포, COS 세포, Namalwa 세포 등의 포유동물 외에 Sf 등의 곤충세포나 효모 등을 들 수 있다.

그러나, 본 발명의 형질전환체는 바람직하게는 대장균 또는 포유동물 세포 또는 효모를 형질전환시킨 것이다. 동물세포중에서는 유전자의 복제수를 증가시킬수 있는 CHO 세포의 dhfr 결손주가 바람직하다. 또한, 효모에 관해서는 외래 단백질의 분비 발현량이 많다고 하는 점에서 피키아(Pichia) 속의 효모가 바람직하다.

본 발명의 제 6 태양의 형질전환체는 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA를 대량으로 얻을 목적이나, 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용할 수 있다.

해당 형질전환체는 어떠한 목적으로 사용되는 것이어도 좋으나, 바람직하게는 해당 형질전환체는 본 발명의 신규 폴리펩타이드를 생산하는 것이 좋고, 보다 바람직하게는 본 발명의 신규 폴리펩타이드를 배지중에 분비하는 것이 좋다.

본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 생산하는 형질전환체를 얻기 위해서는, 숙주세포에 도입하는 본 발명의 제 4 태양의 재조합 DNA 분자중에는, 적어도 그 숙주세포에서 기능할 수 있는 프로모터 배열이 포함되어 있는 것이 필요하다. 그리고, 숙주세포가 대장균 등의 원핵세포인 경우에는 재조합 DNA 분자에는 프로모터 배열에 더하여 복제 개시점이 포함되어 있을 필요가 있다. 또한, 숙주세포가 동물세포 등의 진핵세포인 경우에는, 재조합 DNA 분자중에는 프로모터 배열에 더하여 폴리 A 부가 사이트, 복제 개시점이 포함되어 있는 것이 필요하다. 또한, 어느 경우에도 사용하는 재조합 DNA 분자에는 상술한 마커 유전자가 포함되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 해당 형질전환체가 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 발현하고 분비하기 위해서는, 형질전환에 사용하는 재조합 DNA 분자중에 상기의 생산에 필요한 배열에 더하여 본 발명의 제 3 태양의 DNA의 5' 말단에 시그널펩타이드를 코드화하는 염기배열을 갖고 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 형질전환체의 보다 바람직한 예의 하나는, 적어도 복제 개시점, 대장균에서 기능하는 프로모터, 마커 유전자, 대장균 알칼리 포스파다제 등의 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열 및 본 발명의 제 3 태양의 신규 DNA를 포함하는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 대장균이다. 다른 바람직한 예는 적어도 마커 유전자, 폴리A부가배열, 포유동물세포에서 기능하는 프로모터 및 본 발명의 제 3 태양의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 포유동물세포이다.

또한, 적어도 AOX1의 프로모터, 마커 유전자 및 본 발명의 제 3 태양의 DNA를 포함하는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 피키아(Pichia)속의 효모도 본 발명의 형질전환체의 바람직한 예다.

본 발명의 제 7 태양의 제조방법은, 본 발명의 제 5 또는 제 6 태양의 형질전환체를 사용함을 특징으로 하는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드의 제조방법이다. 형질전환체의 제작방법에 관해서는 이미 설명한 바와 같다.

해당 제조방법에서는 우선, 본 발명의 제 5 또는 제 6 태양의 형짙전환체를 배양하고, 필요에 따라서 유전자의 증폭이나 발현유도를 행한다. 다음으로, 배양혼합물을 회수하여 그들을 재료로서 필요에 따라 농축, 가용화, 투석, 각종 크로마토그래피 등의 조작을 행하고, 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 정제한다.

해당 제조방법에서 사용하는 형질전환체는 어떠한 숙주를 형질전환한 것이어도 좋다. 그러나, 바람직하게는 CHO 세포 등의 포유동물세포 또는 효모, 또는 대장균의 어느것인가로 부터 선택되는 세포를 숙주로 한 형질전환체인 것이 바람직하다.

형질전환체의 배양은 일반적인 방법으로 행할 수 있다. 형질전환체의 배양에 관해서는 각종의 성서(예를들면 「미생물실험법」사단법인 일본생화학회편, 주식회사 동경화학 동인, 1992년,참조)가 있으므로 그것들을 참고로 하여 행할 수 있다. 또한, 유전자의 증폭이나 발현유도의 방법 및 필요성은 숙주가 되는 세포의 종류나, 사용하는 프로모터에 의해 다르다. 예를들면, 프로모터가 trp 프로모터일때에는 3β-인돌아크릴산으로, MMTV 프로모터일 경우에는 덱사메사존으로, AOX1 프로모터이면 메탄올로 유도할 수 있다.

한편, 유전자의 증폭방법의 예로서는 숙주로서 dhfr 결손의 CHO 세포, 벡터로서 dhfr 을 갖는 벡터를 사용했을 때의 메소톨레키세트를 사용한 유전자의 증폭방법이 있다.

이하에 형질전환체로서 대장균, CHO 세포, 피키아(Pichia)속 효모를 사용했을 경우의 배양 및 발현유도의 예를 나타낸다.

trp 프로모터를 갖는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 대장균에서는 L-브로스(L-Broth)로 항체를 전배양하고, 그것을 M9-CA 의 배지에 대하여 1/50 량이 되도록 심어 37℃ 에서 배양을 행한다. 배양개시 수시간 후에 배지의 OD₅₅₀치가 1내지 4(즉 대수증식기)에 도달한 시점에서 3β-인돌아크릴산을 종농도 10㎍/㎖가 되도록 첨가하고 발현유도를 행한다. 또한, 약 1 내지 2 일의 배양을 행함으로써목적 폴리펩타이드를 포함하는 배양혼합물을 얻을 수 있다.

AOX1 프로모터를 갖는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 피키아(Pichia)속의 효모를 이용할 경우에는, BMGY 배지에서 약 2 일간 전배양하고, 배지교환후 메탄올을 가하여 발현유도한다. 또한, 30℃에서 약 2 일간의 배양을 행하여, 목적 폴리펩타이드를 포함하는 배양혼합물을 얻을 수 있다.

한편, 에론게이션팩터의 프로모터를 갖는 발현 플라스미드가 도입된 CHO 세포 등의 포유동물세포의 형질전환체에서는, 10% 소태아혈청을 함유하는 D-MEM(Dulbecco modified eagle's medium)으로 배양한다. 세포는 약 5×10⁴세포/㎖ 의 농도로 심고, 37℃, 5% 탄산가스/95% 공기의 조건에서 배양을 행한다. 통상, 2 내지 3 일후에 융합한 상태로 되므로 그 시점에서 배지를 혈청불함유의 D-MEM 으로 교환한다. 더욱 계속하여, 2 내지 3 일간의 배양을 행함으로써 목적 폴리펩타이드를 포함하는 배양혼합물을 얻을 수 있다. 또한, 목적 폴리펩타이드의 생산량이 적을 경우에는 상술했듯이 dnfr 유전자 결손 CHO 세포를 사용하여, 메소톨레키세트에 의해 유전자를 증폭하고, 생산량을 증가시키는 일도 가능하다.

본 발명의 제 7 태양에 있어서, 배양혼합물이란 배양 상등액 또는 세포를 말한다. 즉, 형질전환체가 해당 폴리펩타이드를 세포외로 분비할 경우에는 그 배양 상등액을 재료로서 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 회수, 정제한다.

한편, 해당 신규 단백질이 숙주세포내에 축적될 경우에는 리조팀, 계면활성제, 동결융해, 가압 등의 수단을 이용하여 세포를 파쇄한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하고, 여과 등에 의해 불필요한 세포단편 등을 제거한 후에, 그것을 재료로서 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 정제한다. 사용하는 형질전환체가 대장균이고, 생산된 해당 신규 폴리펩타이드가 페리플라즘에 축적되는 경우는, 윌스키(Willsky) 등의 방법(J. Bacteriol., 127권, 595-609 페이지, 1976년)등을 사용할 수 있다.

배양혼합물로 부터 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 정제하는 방법으로서는, 폴리펩타이드의 정제에 통상 사용되고 있는 방법중에서 적절한 방법을 적당히 선택하여 행할 수 있다. 즉, 염석법, 한외여과법, 등전점침전법, 겔여과법, 전기영동법, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피나 항체크로마토그래피 등의 각종 친화성 크로마토그래피, 크로마토 포카싱법, 흡착 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피 등, 통상 사용될 수 있는 방법중에서 적절한 방법을 적당히 선택하고, 필요에 따라 HPLC 시스템 등을 사용하여 적절한 순서로 정제를 행하면 좋다. 정제방법의 알맞은 예를 본 발명의 제 8 태양으로서 제공한다.

해당 제조방법에서 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드는, 다른 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 형질전환체로 생산시켜도 좋다. 예를들면, 대장균의 β-갈락토시다제를 코드화하는 DNA의 하류에 목적하는 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA를 접속하고, 목적하는 폴리펩타이드를 β-갈락토시다제와의 융합 폴리펩타이드로서 발현시키는 방법은 높은 생산량을 기대할 수 있어서 일반적으로 행해지고 있는 방법이다.

해당 폴리펩타이드를 다른 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 발현시킨 경우에는, 정제공정중 어느 스텝에서 융합 폴리펩타이드를 브롬시안 등의 화학물질이나 프로테아제 등의 효소로 처리하여 해당 폴리펩타이드를 잘라내는 조작이 필요하게 된다.

또한, 사용하는 형질전환체가 대장균이었을 경우에, 해당 폴리펩타이드를 불용화 단백인 봉입체로서 생산시킨 경우에는, 정제할 때에 봉입체를 가용화하여 변성하고, 리홀딩한다고 하는 조작을 정제의 적당한 스템에서 행하면 좋다(토마스 E. 및 클라이톤 J.(Thomas E. and Creighton J.), Molecular Biology, 87권, 563-577페이지, 1974년 등 참조).

구체적으로는 우선, 항체를 파쇄하고 원심분리하여 펠렛을 회수한다. 다음으로, 요소 또는 구아니딘염산, 계면활성제, 환원형 글루타티온, 산화형 글루타티온을 적당량 포함하는 가용화 완충액(예를들어 5M 구아니딘염산, 0.005% Tween 80, 50mM 트리스염산(pH8.0), 5mm EDTA, 2mM 환원형 글루타티온, 0.02mM 산화형글루타티온을 포함하는 완충액)을 펠렛에 가하고, 2-머캅토에탄올을 가하여 변성하고, 상기 가용화 완충액로 부터 구아니딘염산을 뺀 용액에 대하여 투석하여 리홀딩한다. 목적하는 폴리펩타이드를 융합단백질로서 발현시키고 있을 경우에는 이들 조작후에 브롬시안 등의 화학물질 또는 프로테아제 등의 효소로 불필요한 부분을 절단하고, 그후 적당한 크로마토그래피를 행한다.

다음으로, 본 발명의 제 8 태양의 정제방법을 설명한다.

본 발명의 제 8 태양은 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 함유하는 시료중으로 부터 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 정제하는 방법으로서, 적어도 하기로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 공정을 행함을 특징으로 한다.

(1) Fas 항원을 사용한 친화성 크로마토그래피

(2) 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 인식하는 항체를 사용한 친화성 크로마토그래피

해당 정제방법은 상기 (1) 또는 (2) 의 어느것만을 행하는 것이어도 좋고, (1) 및 (2) 의 양쪽을 행하는 것이어도 좋다. 또한, 다른 정제방법과 상기 (1) 또는 (2) 의 적어도 하나를 조합시켜 행하는 것이어도 좋다. 그러나, 바람직하게는 단백질의 정제방법으로서 통상 행해지고 있는 방법의 전 또는 후에, 상기 (1) 또는 (2) 의 어느 한쪽, 또는 양쪽의 공정을 임의의 순서로 행하는 것이다.

예를들어 상기 (1) 또는 (2) 의 공정의 어느 것인가에 가하여 렉틴을 흡착시킨 담체를 사용한 크로마토그래피를 행함으로써, 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 폴리펩타이드를 고순도로 얻을 수 있다.

본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 함유하는 시료란, 해당 신규 단백질을 함유하는 것이면 어떠한 것이어도 좋다. 예를들어, 세포의 배양 상등액이어도 좋고, 세포의 용해물이어도 좋고, 소변이나 혈액 등의 체액이어도 좋다.

상기 (1)의 친화성 크로마토그래피를 행하기 위해서는 Fas 항원 단백질을 적당한 담체에 흡착시키는 일이 필요하다. 사용하는 Fas 항원은 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 폴리펩타이드와 결합하는 것이면 어떠한 동물유래의 것이어도 좋다. 그러나, 정제하고자 하는 목적하는 폴리펩타이드가 상기식 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 배열 또는 그들의 일부를 갖는 경우에는 인간 Fas 항원을, 상기식 5 내지 8중 어느 하나의 아미노산 배열 또는 그들의 일부를 갖는 것일 경우에는 래트 Fas 항원 또는 마우스 Fas 항원을, 상기식 9 내지 12 중 어느 하나의 아미노산 배열 또는 그들의 일부를 갖는 것일 경우에는 마우스 Fas 항원을, 각각 사용하는 것이 바람직하다.

Fas 항원을 흡착시키는 담체의 종류는 특별히 한정되지 않는다. Fas 항원을 담체에 결합시킬 경우에는 Fas 항원을 직접 담체에 결합시키든가, 스페이서를 통하여 결합시킨다. 또한, Fas 항원을 다른 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 제작하고, 융합 폴리펩타이드중의 Fas 항원 이외의 부분을 그것과 결합 가능한 담체에 결합시켜, 간접적으로 Fas 항원을 담체에 결합시켜도 좋다. 예를들어, Fas 항원과 면역 글로블린의 정상영역과의 융합 폴리펩타이드이면 면역 글로블린과 프로테인 A 가 흡착하는 성질을 이용하여 프로테인 A 가 흡착한 칼럼에 그 융합 폴리펩타이드를 흡착시켜, 결과로서 Fas 항원 흡착 담체를 용이하게 얻을 수 있다.

또한, 상기 (2) 의 친화성 크로마토그래피를 행하기 위해서는, 본 발명의 제 9 태양의 신규 항체를 사용할 수 있다. 즉 해당 신규 항체를 아가로스 등의 적당한 항체에 직접 또는 스페이서를 통하여 결합시켜 이것을 친화성 크로마토그래피용 칼럼으로서 사용한다. 또, 상술한 렉틴을 흡착시킨 담체의 바람직한 것으로서는 ConA를 흡착시킨 담체를 들 수 있다. 예를들면, ConA 를 아가로스 담체에 흡착시킨 것 등이 시판되고 있으므로 그것들을 적절히 선택하여 사용하는 것이 간편하다.

상기 (1) 및 (2) 의 친화성 크로마토그래피 및 렉틴을 흡착시킨 담체를 사용하는 친화성 크로마토그래피는, 폴리펩타이드의 정제에 사용되는 용액을 적절히 선택하여 용출액으로 하고, 용출된 각 획분의 활성 또는 각 획분중의 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드의 존재를 확인하면서 행하면 좋다. 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드의 존재를 확인하는데는, 각 획분의 Fas 항원을 발현하는 세포에 대한 세포장애활성을 측정하거나, 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 폴리펩타이드를 확인하는 항체를 사용한 EIA 등으로 확인할 수 있다. 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 폴리펩타이드를 확인하는 항체에 관해서는 본 발명의 제 9 태양에서 설명한다.

다음으로, 본 발명의 제 9 태양의 신규 항체에 관하여 설명한다.

본 발명의 제 9 태양의 신규 항체는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드에 결합함을 특징으로 한다.

본 발명의 제 9 태양의 신규 항체는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드와 결합하는 한, 모노클로날 항체이어도 좋고, 폴리클로날 항체이어도 좋다.

항체, 즉 면역 글로블린의 구조는 H쇄와 L쇄로 부터 이루어지고, 물리화학적 성질이나 면역학적 성질은 다섯개의 클라스(IgG, IgA, IgM, IgB, IgE)로 나뉘어진다. 이중에서 IgG, IgA 는 더욱 H쇄의 타입에 의해 서브클라스로 나뉘어진다. 본발명의 신규 항체는 이들의 어느 클라스, 서브클라스에 속하는 것이어도 좋다.

또한, 면역 글로블린은 예를들어 펩틴으로 분해하면 F(ab')₂와 Fc' 로 나뉘고, 파파인으로 분해하면 Fab 와 Fc 의 두개의 플라그멘트로 나뉘어진다. 본 발명의 항체는 항원과 결합하는 것이면 완전한 항체 분자이어도 좋고, 그 일부의 플라그멘트이어도 좋다. 또한, 본 발명의 항체는 키메라 항체이어도 좋다.

본 발명의 신규 항체는 그것이 폴리글로날 항체이거나, 모노클로날 항체이어도 공지방법을 참고로 하여 얻을 수 있다(예를들면 면역실험조작법, 일본면역학회편, 일본면역학회발행, 참조). 이하에 간단히 설명한다.

해당 신규 항체를 얻는데는, 우선 동물에 면역 항원으로서 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드를 필요에 따라서 프로인트 완전 보조제(FCA)나 불완전 보조제(FIA) 등의 적절한 보조제와 함께 접종하고, 필요하면 2 내지 4 주간의 간격으로 추가면역한다. 추가면역 후, 채혈을 행하여 항혈청을 얻는다. 항원으로서 이용하는 본 발명의 신규 폴리펩타이드는 그것이 항체의 제작에 사용할 수 있는 정제도의 것이면 어떠한 방법으로 얻어진 것이어도 좋다.

면역항원으로서 사용하는 폴리펩타이드가 저분자의 폴리펩타이드, 즉 약 10 내지 20 아미노산으로 부터 이루어지는 폴리펩타이드일 경우에는, 그것을 키홀린페트헤모시아닌(KLH) 등의 캐리어와 결합시켜 항원으로서 사용하면 좋다. 해당 신규 폴리펩타이드로 면역시키는 동물은 어떠한 것이어도 좋으나 바람직하게는 통상 당업자에 있어서 면역학적인 실험에 사용되는 래트, 마우스, 토끼, 양, 말, 닭, 염소, 돼지, 소 등에서 목적하는 항체를 생산할 수 있는 동물종을 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.

폴리글로날 항체는 얻어진 항혈청을 정제함으로써 얻을 수 있다. 정제는 염석, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 공지방법을 적절히 조합시켜 행하면 좋다.

모노클로날 항체를 얻기 위해서는 아래와 같이 행한다. 즉, 면역시킨 동물로 부터 비세포 또는 임파구 등의 항체생산세포를 채취하고, 폴리에틸렌글리콜, 센다이바이러스, 전기펄스 등을 이용하는 공지방법에 의해 미에로마 세포주 등과 융합하여 하이브리드마를 제작한다. 그후, 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 생산하고 있는 클론을 선택하여 배양하고, 그 선택된 클론의 배양 상등액을 정제함으로써 얻으면 좋다. 정제는, 염석, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 공지방법을 적절히 조합시켜 이용하면 좋다.

또한, 유전공학적인 방법을 이용하여도 해당 신규 항체가 얻어진다. 예를들어, 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드로 면역시킨 동물의 비세포, 임파구 또는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 신규 폴리펩타이드에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이크리드마로 부터 mRNA 를 채취하고, 이것을 기초로 cDNA 라이브러리를 작성한다. 항원과 반응하는 항체를 생산하고 있는 클론을 스크리닝하고, 얻어진 클론을 배양하여, 배양혼합물로 부터 목적하는 항체를 공지의 방법을 조합시켜 정제할 수 있다.

본 발명의 신규 항체는 체액중이나 조직중에 존재하는 본 발명의 신규 폴리펩타이드를 검출하기 위하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 신규 폴리펩타이드를 정제하기 위하여 사용하는 항체 칼럼의 제작, 정제시의 각 분화중의 본 발명의 신규 폴리펩타이드를 검출하기 위하여 사용할 수 있다.

본 발명의 신규 항체는, 세포에 대한 Fas 리간드의 작용을 수식하는 것이어도 좋다. 세포에 대한 Fas 리간드의 작용을 수식하는 항체중에서 특히 바람직하게는, Fas 리간드가 유도하는 아포토시스를 억제하는 효과를 갖는 것이다. 해당 항체는 Fas 리간드가 유도하는 아포토시스를 완전히 억제하는 것이어도 좋고, 또한 부분적으로 억제하는 것이어도 좋다.

Fas 리간드가 유도하는 아포토시스를 억제하는 효과를 갖는 항체를 얻는데는 상기 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 제조하는 과정에서 얻어지는 혈청이나, 하이브리드마의 배양 상등액을 예를들면, 다음과 같은 엇세이계에 걸쳐서 스크리닝한다. 즉, Fas 리간드 또는 Fas 리간드를 발현하는 세포와, Fas 항원을 발현하는 세포를 사용한 시험관내의 엇세이계 등이다. 스크리닝의 결과, 선별된 혈청이나 배양 상등액으로 부터 공지방법을 조합시켜 목적하는 항체를 정제한다. 또, Fas 리간드 또는 Fas 리간드를 발현하는 세포와 Fas 항원을 발현하는 세포를 이용한 스크리닝 방법의 바람직한 예는 본 발명의 제 11 태양에서 설명한다.

Fas 리간드가 유도하는 아포토시스를 완전히 또는 부분적으로 억제할 수 있는 항체는, 생체에 있어서의 아포토시스를 조절하기 위하여 사용할 수 있다. 예를들어, 해당 항체는 류마티즘에 있어서의 관절조직의 파괴, 전신성 홍반성낭창(SLE)에 있어서의 자기조직의 파괴, 또는 당뇨병, 인플루엔자, 에이즈, 간염 등의 조직이나 세포의 아포토시스가 관여하는 질환의 치료약으로서 사용할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 제 10 태양을 설명한다.

본 발명의 제 10 태양은 Fas 리간드 유전자의 일부 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA의 일부에 상보적인 염기배열을 포함함을 특징으로 하는 올리고누클레오티드, 또는 올리고누클레오티드 유도체이다. 해당 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체에는 그 염기배열로서 상기 상보적인 염기배열만을 갖는 것, 상기 상보적인 염기배열에 더하여 리보자임배열 등, 다른 염기나 염기배열을 갖는 것 모두가 포함된다.

여기에서 「Fas 리간드 유전자」란 Fas 리간드를 코드화하는 DNA를 포함하는 유전자를 말하고, Fas 리간드를 코드화하는 영역에 더하여 그 제어영역을 포함하는 것이다. 제어영역은 Fas 리간드를 코드화하는 영역의 상류에 존재하는 것, 하류에 존재하는 것 모두를 의미한다. 「Fas 리간드에 대한 mRNA」란 Fas 리간드를 코드화하는 염기배열을 포함하는 mRNA이다. 해당 mRNA에는 Fas 리간드를 코드화하는 염기배열에 더하여 그 상류 및 하류의 비코딩 영역을 포함하는 것도 포함된다.

Fas 리간드를 코드화하는 염색체 DNA는 제 16 내지 18 도에 나타냈듯이 이소트론 부위와 엑손 부위로 부터 이루어짐을 알았다. 이소트론과 엑손으로 부터 이루어지는 DNA가 mRNA로 전사될 때에는, 우선 이소트론과 엑손이 그대로 전사되어 pre-mRNA로 되고, 그후 스플라이싱을 받아 이소트론에 대응하는 부분이 삭제되어 엑소부분만이 전사된 성숙mRNA로 된다. 여기에서 말하는 「Fas 리간드에 대한 mRNA」에는 pre-mRNA, 성숙mRNA의 모두가 포함된다.

또한, 「Fas 리간드 유전자의 일부 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA의 일부」란 그들이 코딩 영역인가 아니가에 관계없이, 또한 이소트론 부위, 엑손 부위에 관계없이 Fas 리간드 유전자 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA에 포함되는 모든 부분을 의미한다.

또, 본 발명의 제 10 태양에 있어서 「Fas 리간드」는 어떠한 동물종의 Fas 리간드이어도 좋으나, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스중 어느 Fas 리간드이다. 진단약이나 의약품에의 응용을 생각하면 특히 바람직하게는 인간 Fas 리간드이다. 인간 Fas 리간드 유전자의 코딩 영역 부근의 염기배열은 제 16 내지 18 도에 나타내고 있다. 또한, 인간 Fas 리간드, 래트 Fas 리간드, 마우스 Fas 리간드를 코드화하는 DNA의 염기배열은 각각 배열번호 31, 25, 28 로 나타내고 있다. 상기 각 Fas 리간드에 대한 각 성숙mRNA를 포함하는 염기배열은 배열번호 31, 25, 28 에 나타난 염기배열중의 T를 U로 읽음으로써 얻을 수 있다.

「상보적인 염기배열」이란 DNA나 mRNA의 염기배열에 대하여 염기 특이적으로 상보적염기대를 형성하는 염가배열을 말한다. 일반적으로는 C(시토신)과 G(구아닌)의 사이, T(티민)과 A(아데닌)의 사이 및 U(우라실)과 A(아데닌)과의 사이에서 상보적염기대가 형성됨이 알려져 있다. 따라서, 인간 Fas 리간드 유전자에 상보적인 염기배열 및 인간 Fas 리간드, 래트 Fas 리간드, 마우스 Fas 리간드에 대한 각 성숙mRNA에 상보적인 염기배열을 포함하는 배열은, 각각 제 16 내지 18도, 배열번호 31, 25, 28 에 나타낸 염기배열중의 A에 대하여 T, C에 대하여 G, G에 대하여C, T에 대하여 A를 대응시킨 배열, 또는 A에 대하여 U, C에 대하여 G, G에 대하여 C, T에 대하여 A를 대응시킨 배열이다. 배열표의 배열번호 31의 염기배열에 상보적인 DNA 및 RNA의 배열은, 각각 배열번호 29, 30 에 5'→3' 방향에서 나타내고 있다. 또, 「상보적인 염기배열」에는 C, G, A, T, U로 부터 이루어지는 염기배열뿐만 아니라 이들 염기의 유도체를 포함하는 배열이어도 좋다.

본 발명의 올리고누클레오티드에는 염기, 인산, 당으로 부터 이루어지는 누클레오티드가 복수결합한 것 모두가 포함된다. 그 대표적인 것은 DNA와 mRNA이다.

본 발명의 올리고누클레오티드 유도체에는 그 입체구조나 기능이 올리고누클레오티드와 유사한 것 모두가 포함된다. 예를들어, 올리고누클레오티드의 3' 말단 또는 5 ' 말단에 다른 물질이 결합한 것이나, 올리고누클레오티드의 염기, 당, 인산의 적어도 어느 하나에 있어서 치환이나 수식이 발생한 물질, 천연에는 존재하지 않는 염기, 당, 인산을 갖는 물질이나, 당-인산골격 이외의 골격을 갖는 것 등이다.

본 발명의 제 10 태양의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체는 Fas 리간드 유전자의 일부 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA의 일부에 상보적인 염기배열을 갖고, 이들의 유전자나 mRNA로 하이브리드화 하는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는 적어도 인간 Fas 리간드 유전자 또는 인간 Fas 리간드에 대한 mRNA로 하이브리드화 하는 것이다.

Fas 리간드 유전자 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA로 하이브리드화 하는 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체는, 조직이나 세포에 있어서의 Fas리간드 유전자의 존재나 그 발현상황을 조사하기 위한 진단용 올리고누클레오티드 프로브로서 사용할 수 있다. 또한, 이들의 올리고누클레오티드 및 그 유도체는 Fas 리간드 유전자 또는 mRNA로 하이브리드화 하여 Fas 리간드의 발현을 촉진 또는 억제하는 일이 기대되므로, Fas 리간드의 발현을 조절하고 Fas 리간드에 의해 유도되는 아포토시스가 관여하는 질환의 치료약으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체는 Fas 리간드 유전자 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA로 하이브리드화 하여, Fas 리간드의 발현을 조절하는 활성을 갖는 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 Fas 리간드의 발현을 억제하는 것이다. 이미 서술했듯이 에이즈나 간염에 있어서의 세포사는 Fas 항원을 통한 아포토시스라고 생각되어지고 있다. 따라서, Fas 리간드의 발현을 억제하는 올리고누클레오티드 또는 을리고누클레오티드 유도체는 에이즈, 간염을 비롯하여 류마티즘에 있어서의 관절조직의 파괴, 전신성 홍반성낭창(SLE)에 있어서의 자기조직의 파괴, 당뇨병, 인플루엔자 등의 Fas 리간드를 통한 아포토시스가 관여하는 질환의 치료약으로서 사용할 수 있다.

한편, Fas 리간드의 발현을 촉진하는 것은 에이즈 감염 초기의 치료나, 류마티즘애 있어서의 활막세포의 이상증식이나, 자기면역질환에 있어서의 자기항원 반응성 T세포의 증식을 억제하기 위해서 등, 생체에 있어 불필요한 세포를 제거하기 위하여 사용할 수 있다.

단백질을 코드화하는 DNA 나 mDNA에 상보적인 염기배열을 포함하는 올리고누클레오티드를 사용하여 그 단백질의 발현을 조절하는 방법은 안티센스법으로 불리고 있고, 현재 많은 연구자에 의해 연구가 진행되고 있는 기술이다. 상보적인 배열을 갖는 올리고누클레오티드는, ① 유전자로부터 pre-mRnA로의 전사단계, ② pre-mRAN로부터 성숙 mRAN로의 프로세싱 단계, ③ 핵막 통과 단계, ④ 단백으로의 번역 단계의 어느 하나로 유전자 정보를 담당하는 DNA 또는 mRAN에 결합하고, 유전정보의 전달의 정상적인 흐름에 영향을 주어 단백질의 발현을 조절한다고 생각되어지고 있다.

본 발명의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체는 Fas 리간드 유전자 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA의 어떠한 부분에 하이브리브화 하는 것이어도 좋다. 하이브리드화 하기 쉽다는 점에서는 일반적으로는 스템 · 루프를 형성하고 있는 mRNA의 루프 부분에 하이브리드화 하는 염기배열, 즉 스템 ·루프를 형성하고 있는 영역의 염기배열에 상보적인 염기배열을 갖는 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 유도체를 설계하면 좋다고 되어 있다(동해임양자(東海林洋子, 임상면역, 25권, 1200-1206페이지, 1993년).

또한, 번역 개시 코돈 부근, 리보솜 결합부위, 캐핑 부위, 스플라이스 부위에 결합하는 올리고누클레오티드, 즉 이들 부위의 배열에 상보적인 배열을 갖는 올리고누클레오티드는, 일반적으로 높은 발현 억제효과가 기대되는 것으로 생각되어지고 있기 때문에(암과 화학요법, 20권, 13호, 1899-1907페이지), 본 발명의 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 유도체가 Fas 리간드 유전자 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA의 번역개시코돈부근, 리보솜결합부위, 캐핑부위, 스플라이스 부위에 결합하는 것, 즉 이들의 부위에 상보적인 배열을 포함하는 것이면 높은 발현억제효과가 기대된다.

본 발명의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체는 진단이나 의약용도로서 사용함을 고려하면, Fas 리간드 유전자 또는 mRNA와 특이적으로 하이브리드화 하는 것이 바람직하다.

일반적으로 15염기 이상의 염기를 포함하는 염기배열이면 특이성이 있는 배열이라고 생각되어지고 있다(, 단백질 핵산 효소, 38권, 754-765페이지, 1994년). 따라서, 해당 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체도 Fas 리간드 유전자 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA에 상보적인 염기배열로서 15염기 이상으로부터 이루어지는 염기배열을 포함하는 것이면, Fas 리간드 유전자 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA에 특이적으로 결합하는 것이 기대된다.

한편, 올리고누클레오티드를 세포내로 넣기 위해서는 그 길이가 너무 길어도 부적당하다. 본 발명의 제 10 태양의 올리고누클레오티드 및 그 유도체는 어떠한 길이의 것이어도 좋으나, 본 발명의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체를 세포내로 넣어 Fas 리간드의 발현을 조절시킴을 고려하면, 해당 올리고누클레오티드 및 이들 올리고누클레오티드의 유도체는 Fas 리간드 유전자 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA 에 상보적인 15 염기 이상 30 염기 이하, 바람직하게는 15 염기 이상 25 염기 이하, 보다 바람직하게는 18 염기 이상 22 염기 이하의 염기수로 이루어지는 염기배열을 갖는 것이 바람직하다.

안티센스 기술의 진보와 함께 올리고누클레오티드의 의약품으로서의 효과를 높힘을 목적으로 하여 여러가지 유도체가 발견되어 왔다. 현재, 목적하는 DNA나mRNA와의 결합력, 조직 선택성, 세포 투과성, 누클레아제 내성, 세포내 안정성이 높은 여러가지 올리고누클레오티드 유도체가 얻어지고 있다.

상술과 같이 본 발명의 「올리고누클레오티드 유도체」에는, 천연에는 존재하지 않는 염기, 당, 인산, 골격 구조로 부터 이루어지는 것도 포함시켜 온갖 종류의 유도체가 포함된다.

현재 일반적으로 알려져 있는 유도체의 예로서는 골격구조로서 그 전부 또는 일부에 포스포디에스테르(phosphodiester)결합, 포스포로티오에이트(phosphoro thioate)결합, 포스포트리에스테르(phosphotriester)결합, 메틸포스포네이트(methylphosphonate)결합, 포스포로아미데이트(phosphoroamidate)결합, 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate)결합, 모르폴린기를 갖는 것 등(東海林 洋子등, 암과 화학요법, 20권, 1899-1907페이지, 1993년)을 들 수 있다. 또한, 폴리아미드-핵산(PNA)(P. E. 닐센(P.E. Nielsen) 등, Science, 254권, 1497-1500페이지, 1991년)이나, 당의 2' 위치가 다른 원자 또는 치환기로 치환된 것이나 α-리보스 등, 당부분을 수식한 것도 유도체의 예로서 들 수 있다(미카엘 J. 게이트(Michael J. Gait), 290-299페이지; in Antisense Research and Applications, CRC 출판, 플로리다, 1993년).

또한, 당부분이 다른 물질로 치환된 것, 일부의 염기가 이노신(A, T, C, G 어느것에나 결합하는 유니버설 염기로 불린다)으로 치환된 것, 올리고누클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 또는 내부에 콜레스테롤이나 아클리딘, 폴리-L-리딘, 솔라렌(psoralen), 장쇄 알킬 등이 결합한 것 등도 올리고누클레오티드 유도체의 예로서 알려져 있다(마꼬토 마쯔쿠라(Makoto Matsukura), 506-519페이지 및 폴 S.밀러(Paul S. Miller) 등, 190-202페이지; in Antisense Reserch and Appications, CRC 출판, 플로리다, 1993년).

본 발명의 올리고누클레오티드 유도체는 위에 예시한 유도체를 비롯하여 어떠한 유도체이어도 좋다. 그러나, 해당 유도체는 누클레아제 내성, 조직 선택성, 세포 투과성, 결합력의 적어도 하나가 높아진 유도체인 것이 바람직하다.

특히 바람직하게는 해당 올리고누클레오티드 유도체는 포스포로티오에이트 결합을 골격구조로서 갖는 유도체이다.

이하에, 본 발명의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체의 제조방법을 설명한다.

올리고누클레오티드나 그 유도체는 공지방법으로 제조할 수 있다(예를들면 스탠리 T. 크룩(Stanley T. Crooke) 및 베르나르도 레블로(Bernald Lebleu)편, in Antisense Reserch and Applications, CRC 출판, 플로리다, 1993년).

천연의 DNA나 RNA이면 화학합성기를 사용하여 합성하거나, Fas 리간드 유전자를 주형으로 하여 PCR법에 의해 본 발명의 올리고누클레오티드를 얻을 수 있다. 또한, 메틸포스포네이트형이나 포스포로티오네이트형 등, 유도체중에는 화학합성기(예를들면 퍼킨엘머져팬(주)제, 394형)을 사용하여 합성할 수 있는 것도있다. 이 경우에는 화학 합성기예 첨부된 매뉴얼에 따라서 조작을 행하고, 얻어진 합성산물을 역상 크로마토그래피 등을 이용한 HPLC법에 따라 정제함에 의해서도 목적하는 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 유도체를 얻을 수 있다.

다음으로, 본 발명의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체의 작용방법에 관하여 설명한다.

본 발명의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체를 진단용의 프로브로서 사용하는 경우에는, 그것들을 공지의 방법에 따라 방사성동위원소나, 효소, 형광물질, 발광물질 등으로 표식한다. 다음으로, Fas 리간드의 발현을 조사하고 싶은 환자의 세포로부터 DNA 또는 mRNA를 공지방법으로 조제하고, 이것을 피검물질로서 상기 표식 프로브를 가하여 반응시킨 후, 세척하여 미반웅의 상기 표식 프로브를 제거한다. 피검물질중에 Fas 리간드 유전자 또는 RNA가 포함되어 있으면, 해당 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 유도체는 그들과 결합한다. 결합형성의 유무는 표식한 효소, 형광물질, 발광물질, 또는 방사성동위원소에 의한 발광, 형광, 방사능 등을 지표로 하여 알 수 있다.

근래, Fas 리간드의 발현과 자기면역질환의 관계 등이 보고된 바 있으므로, 본 발명의 올리고누클레오티드를 사용한 진단 프로브는 예를들어, 류마티즘이나 SLE 등의 자기면역질환 등의 진단에 이용할 수 있다. 또한, 염증시의 T세포에 의한 세포장애에도 Fas 리간드가 관계하고 있다고 생각되어지므로, 염증의 정도나 치료방법을 결정하기 위한 진단에도 사용할 수 있다.

본 발명의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체를 의약용도로 사용할 경우에는, 의약품으로서 사용하는데 적당한 순도의 것을, 학리학적으로 허용될 수 있는 사용방법으로 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제 10 태양의 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 유도체는 그들을 직접 적당한 용매에 용해, 또는 현탁하여 사용해도 좋고, 리포솜중에 봉입하거나 적당한 벡터에 넣은 형태로 하여 사용해도 좋다. 또한, 필요에 따라서 본 발명의 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 유도체에 약리학적으로 허용될 수 있는 보조성분을 첨가하여 주사제, 정제, 캅셀제, 점안제, 크림제, 좌제, 분무제, 파프제 등 적당한 제형으로 하여 사용해도 좋다. 약리학적으로 허용될 수 있는 보조성분이란 용매, 기제, 안정화제, 방부제, 용해제, 부형제, 완충제 등을 말한다.

본 발명의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유도체는 상술한 바와 같은 제형으로 한 경우, 환자의 연령이나, 성별, 환자의 종류, 정도에 따라서 그 투여방법, 그 투여량을 설정하여 사용할 수 있다. 즉, 아포토시스를 조절하고 병의 용태를 개선하는데 적당한 양을 경구투여, 또는 흡입, 경피투여, 점안, 질내투여, 관절내투여, 직장투여, 정맥내투여, 국소투여, 근육내투여, 피하투여, 복강내투여 등으로 부터 적당한 방법을 선택하여 투여하면 좋다.

이하에, 본 발명의 제 11 태양의 스크리닝 방법에 관하여 설명한다.

본 발명의 제 11 태양의 스크리닝 방법은 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 폴리펩타이드 또는 그것을 발현하도록 형질전환한 형질전환체를 사용함을 특징으로 한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서는 바람직하게는 본 발명의 제 1 또는 제 2 태양의 폴리펩타이드, 또는 그것을 발현하는 형질전환체에 가하여 Fas 항원을 발현하는 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 이 방법을 사용하면 Fas 리간드에 결합하는물질, Fas 리간드의 발현을 촉진 또는 억제하는 물질에 가하여 Fas 항원의 발현을 촉진 또는 억제하는 물질, Fas 리간드의 세포에의 작용을 조절하는 물질을 스크리닝할 수 있다. Fas 리간드의 세포에 대한 작용의 대표적인 것은 아포토시스의 유도이지만, 해당 스크리닝 방법은 아포토시스를 촉진하거나 억제하거나 하는 물질외에도 Fas 리간드 존재하에서 Fas 항원 발현세포에 발생하는 얼마간의 변화를 촉진하거나 억제하거나 하는 물질의 스크리닝에도 적당하다.

해당 스크리닝 방법은 어떠한 공정을 포함하는 것이어도 좋으나, 바람직하게는 하기 (1) 내지 (3) 에서 선택되는 어느것인가의 공정을 포함하는 것이다. 즉,

(1) a. Fas 항원을 발현하는 세포를 Fas 리간드 또는 그것을 발현하는 형질전환체, 또는 그 배양 상등액으로 이루어지는 군으로 부터 선택되는 어느것인가와 함께 배양한다.

b. a 에 피험물질 또는 피험물질을 포함하는 시표를 첨가한다.

c. Fas 항원을 발현하는 세포의 생사, 형태적 변화 또는 생화학적 변화중 적어도 어느것인가 하나를 측정한다.

(2) a. 피험물질 또는 피험물질을 포함하는 시료를 Fas 리간드 또는 그것을 발현하는 형질전환체, 또는 그 배양 상등액으로 이루어지는 군으로 부터 선택되는 어느것인가와 인큐베이트 한다.

b. a 에 Fas 항원을 발현하는 세포를 가하여 배양한다.

c. Fas 항원을 발현하는 세포의 생사, 형태적 변화 또는 생화학적 변화중 적어도 어느것인가 하나를 측정한다.

(3) a. 피험물질 또는 피험물질을 포함하는 시료를 Fas 항원을 발현하는 세포와 인큐베이트 한다.

b. a 에 Fas 리간드 또는 그것을 발현하는 형질전환체, 또는 그 배양상등액으로 이루어지는 군으로 부터 선택되는 어느것인가를 가하여 배양한다.

c. Fas 항원을 발현하는 세포의 생사, 형태적 변화 또는 생화학적 변화중 적어도 어느것인가 하나를 측정한다.

Fas 항원을 발현하는 세포의 형태적 변화 또는 생화학적 변화를 측정하는 방법은 그 변화를 검출할 수 있는 방법이면 특히 한정되지 않는다. Fas 항원을 발현하는 세포의 아포토시스의 유무나 그 정도를 측정하는 것이면 Fas 항원을 발현하는 세포에 미리 포함시킨⁵¹Cr 의 방출량으로부터 측정할 수 있다. 또한, 트립판 블루를 이용한 염색이나 포르마잔의 생성을 지표로 한 엇세이(MTT 엇세이, 아르말 블루 엇세이 등)를 행하여 Fas 항원을 발현하는 세포중 살아 남은 세포수를 측정하여도 좋다.

일반적으로 세포 표면상에 존재하는 막형 단백질이 타분자와 결합하는 영역은 세포외 영역이라고 생각되어진다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서도 상기식 1 내지 3, 5 내지 7, 9 내지 11 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드 또는 그들을 발현하는 형질전환체를 알맞게 사용할 수 있다. 그 중에서도, 상기식 1 내지 3 의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드 또는 그들을 발현하는 형질전환체를 사용하는 것이 바람직하다. 해당 스크리닝 방법에서 사용하는 Fas 리간드는 본 발명의 제 7 태양의 설명에 나타낸 방법으로 얻을 수 있다. 또한, Fas 리간드를 발현하는 형질전환체는 본 발명의 제 5 또는 제 6 태양에서 설명한 방법으로 얻을 수 있다.

본 발명의 제 11 태양의 스크리닝 방법을 사용하면 Fas 리간드에 결합하는 물질이나 Fas 리간드의 발현을 조절하는 물질을 스크리닝 할 수 있다. 여기에서 말하는 물질에는 화합물, 펩타이드, 단백질, 항체, 핵산 등 모든 물질이 포함된다. 또한, 이들의 스크리닝 방법을 사용하여 Fas 리간드가 관여하는 질환의 진단을 행하는 일도 가능하다.

예를들면, 자기면역질환의 환자로 부터 혈구세포나 조직의 세포를 분리하고, Fas 리간드 또는 Fas 리간드를 발현하는 형질전환체와 반응시켜, 환자로 부터 분리한 세포에 발생하는 아포토시스의 정도를 관찰함으로써, 그 환자의 Fas 항원의 기능 또는 발현에 이상이 있는가 없는가를 진단할 수 있다. 그리고, 그 진단결과를 참고로 원인에 따른 치료를 선택할 수 있다.

또, Fas 항원을 발현하는 세포는 어떠한 세포이어도 좋다. 예를들면, 에이즈 바이러스 감염세포와 같이 바이러스나 약물에 의해 Fas 항원의 발현이 유도된 세포이어도 좋고, Fas 항원을 발현하는 주화세포나 하이브리드마, 형질전환체이어도 좋다. 바람직하게는 인간 Fas 항원을 발현하는 세포이고, 특히 인간 Fas 발현하는 형질전환체, 예를들면 WC8 세포(이토우 N.(Itoh N.)등, J. Immunol., 151 권, 621-627 페이지, 1993년)를 사용하는 것이 바람직하다.

산업상의 이용분야

Fas 항원에 결합하는 물질이 단리되면 그것을 사용하여 인위적으로 생체내에 발생하는 아포토시스를 조절하고, 질환의 치료나 진단에 사용할 수 있다. Fas 항원에 결합하여 세포에 아포토시스를 유도하는 물질(Fas 리간드)은 생체에 있어 불필요한 세포를 제거하기 위하여 사용할 수 있다. 예를들면, 상술한 바와같이 에이즈 바이러스 감염세포에서는 Fas 항원이 발현되어 있으므로, 에이즈 바이러스 감염 초기에 있어서는 Fas 리간드를 사용하여 아포토시스를 인공적으로 유도하고 감염세포를 조기에 제거함으로써 에이즈를 치료할 수 있을 것이다. 또한, 어떤 종의 자기면역질환에서는 인위적으로 Fas 항원을 통한 아포토시스를 발생시킴으로써 자기항원반응성의 T세포의 제거가 가능해질 것이다. 또한, 모리모토 H. (Morimoto H.) 등은 암세포에 Fas 항원을 통한 아포토시스를 유도함으로써 아드리아마이신이나 스플라틴에 의한 제암효과가 상승적으로 증가됨을 보고하고 있으므로 (Cancer Res., 53권, 2591-2596페이지, 1993년), Fas 리간드는 암치료에도 사용할 수 있을 것이다.

한편, 에이즈 바이러스 감염 후기의 면역능력의 저하나 극증간염에 있어서의 간기능 저하는 면역담당세포 또는 간세포의 아포토시스에 의해 조직의 기능이 현저하게 저하한 결과로 생각되어진다. 이와 같은 상태에 있어서는 Fas 리간드의 작용을 억제하고, 세포의 아포토시스를 막는 일이 필요해진다. 따라서, 이와 같은 병의 용태에서는 Fas 리간드의 발현을 억제하는 물질이나 Fas 리간드와 길항적으로 작용하는 물질을 사용한 치료가 필요하다.

이와 같이 생체내에서 발생하고 있는 아포토시스를 인위적으로 조절한다고 하는 원리에 근거한 치료방법은, Fas 항원에 결합하는 물질이 동일해야 비로소 가능해지는 방법이다.

Fas 항원과 결합하는 폴리펩타이드를 치료나 연구에 사용하기 위해서는, 해당 폴리펩타이드를 고순도로, 대량으로 생산하는 일이 필요해진다. 해당 폴리펩타이드를 코드화하는 유전자를 클로닝하면 해당 폴리펩타이드를 유전공학적으로 생산하는 일이 가능해지고, 해당 단백질을 치료약의 주성분으로서 사용하거나, 항체의 제작에 사용하는 일이 가능해진다. 또한, 유전자 그 자체는 유전자 치료나 안티센스 의약의 개발에 사용하거나, 트랜스제닉 마우스 등, 아포토시스가 관여하는 질환의 모델 동물의 제작에 사용할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하에 실시예를 들어 본 발명을 한층 더 구체적으로 설명하지만, 이들은 일례로서 나타내는 것이고 본 발명은 이들에 의해 조금도 한정되는 것은 아니다.

또한, 이하의 기재에서 이용하는 약호는 해당 분야에 있어서의 실용약호에 근거한 것이다.

또, 이하에 나타내는 실시예중의 모든 조작은 주로 샘브룩 등 편찬 [몰레큘라 클로닝 어 래보래토리 매뉴얼 제 2 판] 콜드 스프링 하버 래보래토리, 1989년;今本文男 등 편찬 [재조합유전자의 세포로의 도입과 발현] 단백질핵산효소임시증간 28(14) 1983년 ; 岡田善雄 감수 [세포공학적기술총집편] 실험의학임시증간 7(13)1989년 등을 참고로서 실시하였다.

(실시예 1) 키메라 단백질의 조제

(1) 발현 플라스미드 pFas-FcII 의 조제

실시예 2 에서 사용하는 마우스 Fas(mFas) 항원의 세포외 영역과 인간 IgG1(hIgG1) 의 Fc 영역을 결합시킨 키메라 단백질(이하 mFas-Fc 라고 칭한다)의 발현 플라스미드를 이하의 방법으로 제작하였다.

우선, 배열표의 배열번호 33 내지 34 에 나타내는 마우스 Fas 항원 염색

화학합성하였다. 후자의 올리고누클레오티드 프라이머에는 BamHI 사이트를 부가하고 있다.

이들의 올리고누클레오티드 프라이머를 이용하여 마우스 Fas 항원 염색체 유전자를 포함하는 플라스미드(pMF3ES, 1992년도, 분자생물학회)를 주형으로 하여 PCR을 행하였다. 그 결과, 엑손 5의 5' 말단 및 3' 말단에 프랑킨글리죤을 갖는 383bP 의 DNA 단편이 증폭되었다.

얻어진 증폭산물을 PstI 와 BamHI 로 소화하고, 엑손 5 의 3' 의 말단과 이소트론 5 의 일부를 포함하는 128bp의 DNA 플라스미드를 얻었다. 얻어진 DNA 플라그멘트로 플라스미드 pMF1(와타나베-후쿠나가(Watanabe-Fukunaga R.)등, J. Immunol. 148권, 1274-1279페이지, 1992년)의 PstI-BamHI DNA 플라그멘트 부분을 치환하고 플라스미드 pMFX 를 제작하였다.

한편, 인간 IgG1 중쇄정상영역에 대한 엑손을 갖는 플라스미드 pMH4(니시무라 Y. (Nishimura Y.) 등, Cancer Res., 47권, 999-1005페이지, 1987년)을 HaeII로 소화하고, 얻어진 1.7kbp의 DNA 플라스미드를 pBluescript KS(+) 의 XbaI 사이트에 서브클로닝 하였다.

이것을 HincII 및 ApaI 로 소화하고, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 코드화하는 엑손을 포함하는 1.4kbp의 DNA 플라그멘트를 얻었다. 이 플라그멘트를 상술한 플라스미드 pMFX의 Xbal 사이트에 삽입하고, 플라스미드 pFAS-Fc 를 제작하였다. 플라스미드 pFAS-Fc 를 KpnI 로 절단후, 평활화하여 NotI 로 소화하고, 얻어진 2.3kbp의 DNA 플라그멘트를 포유동물 발현벡터 pEF-BOS(미즈시마 S.(Mizushima S.) 및 나가타 S.(Nagata S.), Nucleic Acids Res., 18권, 5332페이지, 1990년)에 결합시켜 목적으로 하는 발현 플라스미드 pFAS-FcII 를 얻었다.

(2) 발현 플라스미드 phTNFR β-Fc 의 제작

실시예 2 에서 사용하는 TNF 리셉터β 와 인간 IgG1 의 Fc 영역 키메라 단백질(이하, hTNFRβ-Fc라 칭한다)의 발현 플라스미드 phTNFRβ-Fc 를 아래와 같이 구축하였다.

우선, 플라스미드 p55TNFr-HG1(레오스쳐 H.(Leostscher H.) 등, J. Biol. Chem., 266권, 18324-l8329페이지, 1991년)을 KpnI과 HindIII로 소화하고, 650bp의 DNA 플라그멘트를 조제하였다. 플라스미드 p55TNFr-HG1 은 인공적 스플라이그 도너 배열(artificial splice donor sequence)에 계속되는 인간 TNF 리셉터 (p55)의 세포외 영역을 코드화하는 cDNA 배열을 포함하는 플라스미드이다.

한편, 플라스미드 pFAS-FcII 를 HincII 및 HindII 로 소화하였다. 마우스Fas 항원의 세포외 영역을 코드화하는 배열을 포함하는 약 700bp의 DNA 플라그멘트를 상술한 650bp 의 KpnI-HindII 플라그멘트와 교체하고, 목적으로 하는 플라스미드 phTNFRβ-Fc 를 얻었다.

(3) 발현 플라스미드 pBF-Fc1 의 조제

실시예 10 에서 사용하는 인간 Fas 항원의 세포외 영역과 인간 IgG1 의 Fc 영역 키메라 단백질(이하, hFas-Fc 라 칭한다)의 발현 플라스미드 pBF-Fc1 을 아래와 같이 구축하였다.

우선, 인간 Fas 항원을 코드화하는 DNA(이토우 N.(Itoh N.) 등, Cell, 66권, 233-243페이지, 1991년)를 포함하는 플라스미드 pBLF58-1 을 XhoI와 BamHI로 소화하고 700bp의 단편을 얻었다. 다음으로 키메라 단백질 mFas-Fc의 발현 벡터 구축에 이용한 pFas-Fc를 XhoI와 BamHI로 소화하고 상술의 700bp 의 단편을 삽입하였다(pBHF-C1).

한편, pBLF58-1을 주형으로 하고, 배열표의 배열번호 35에 나타내는 센

외 영역에 마우스 Fas 항원 염색체 유전자의 인트론 5의 배열, BamHI 사이트를 부가한 단편을 조제하였다.

이 PCR 산물을 MscI 와 BamHI 로 소화하고, 얻어진 360bp 의 DNA 단편을MscI 와 BamHI 로 소화한 pBHF-C1 에 삽입하였다. 계속하여 형성된 플라스미드를 KpnI 로 절단후 평활화하여 NotI 로 소화하고, 인간 Fas 항원의 세포외 영역, 인간 IgG1 의 Fc 영역을 코드화하는 DNA 단편을 얻었다. 이 단편을 BstXI 로 절단후 평활화하고, 또 NotI 로 절단한 pEF-BOS 에 삽입하여 인간 Fas-Fc 발현 벡터 pBF-Fc1을 얻었다.

(4) 키메라 단백질의 생산과 정제

플라스미드 pFas-FcII 및 phTNFRβ-Fc 로 각각 COS-7 세포, BTS-1 세포(세디비 J. M.(Sedivy J. M.), Biol. Technology, 6권, 1192-1196페이지, 1993년)를 형질전환 시켰다. 또한, 플라스미드 pBF-Fc1 로 COS-7 세포를 형질전환 시켰다.

COS-7 세포의 형질전환은 후쿠나가 R.(Fukunaga R.) 등이 보고한 DEAE-덱스트란법으로 행하였다(후쿠나가 R.(Fukunaga R.) 등, Cell, 61권, 341-350 페이지, 1990년). 형질전환후, 이 COS-7 세포를 10% 의 FCS 를 포함하는 배지중에서 24시간 인큐베이트 하고, 또한 혈청 불함유의 배지중에서 48시간 및 72시간 인큐베이트 하였다. 인큐베이트후의 배양 상등액을 모아 원심분리조작을 행한 후, 0.45㎛ 의 필터를 통하여 세포의 파쇄물을 제거하고, 프로테인A-세파로스4B칼럼(팔마시아사)크로마토그래피에 의해 키메라 단백질mFas-Fc, hTNFRβ-Fc, hTNFRβ-Fc 를 각각 정제하였다.

한편, BTS-1 의 형질전환은 일렉트로폴레이션(포터 H.(Potter H.) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81권, 7161-7165페이지, 1984년)에 의해 행하였다. 즉, 플라스미드 pFas-FcII 를 ApaLI 로, 플라스미드 phTNFRβ-Fc 를 Sacl 로 소화한 후,각각의 플라스미드 DNA 50㎍ 을 각각 XhoI 로 절단한 pSTneoB 5㎍ 과 함께 1×10⁷개의 세포를 형질전환하였다. 10% FCS 와 300㎍/㎖ 의 G-418 을 포함하는 덜벡코 변성 이글 MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 이하 D-MEM으로 약칭한다)으로 10일간 선택을 행한 후, G-418 내성 클론을 분리하고 39.5℃에서 증식시켰다.

목적으로 하는 키메라 단백질을 생산하는 클론을 동정하기 위해, 클론의 일부를 33℃에서 3일간 배양하고, 배지중에 분비된 키메라 단백질을 효소면역법(ELISA)으로 검정하였다. 검정에 사용한 ELISA 에서는 포획 항체로서 항 인간 IgG-Fc 항체(카펠 55071)를 검출항체로서 서양고추냉이 퍼옥시다제 표식 항 인간 IgG-Fc 항체(잭슨연구소, 109-035098)를 이용하였다.

mFas-Fc 및 hTNFRβ-Fc를 효율적으로 생산하는 형질전환체를 하나씩 39.5℃에서 증식시킨 후, 15cm 플레이트에 50% 융합되도록 심었다. 33℃에서 1주간 배양한 후 배양 상등액으로부터 mFas-Fc와 hTNFRβ-Fc를 프로테인 A-세파로스4B칼럼(파마샤사) 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

정제후의 mFas-Fc 를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석한 바, 환원하에서 분자량 55kD 의 위치에 밴드가 확인되고, 비환원하에 있어서는 분자량 110kD 의 위치에 밴드가 확인되었다. 이것은 얻어진 키메라 단백 mFas-Fc가 S-S 결합에 의한 호모다이머로서 존재하고 있음을 나타내고 있다.

(실시예 2) 프로사이트메트리에 의한 해석 및 d10S-2 세포주의 선택

(1) 키메라 단백질의 비오틴화 및 FITC 표식

설포석신이미딜 6-(비오틴아미드)헥사노에이트(NHS-LC-비오틴, 피아스사, 21335)를 이용하여 그 조작순번에 따라 mFas-Fc 및 hTNFRβ-Fc 를 비오틴화하였다.

또한, 1mg 의 hTNFRβ-Fc 와 20㎍ 의 FITC를 1㎖ 의 50mM 탄산나트륨 완충액(pH9.5)중에서 혼합하고, 실온에서 4시간 반응시킨 후, 미결합의 FITC를 세파딕스 G-25M 을 이용한 칼럼 크로마토그래피로 제거하여 FITC 표식 hTNFRβ-Fc 를 얻었다.

(2) 프로사이트메트리

PC60-d10S 세포(이하, d10S 로 약칭한다. 루비에 E.(Rouvier E.)등, J. Exp. Med., 177권, 195-200페이지, 1993년)를 염색용 용액(2% FCS 와 0.02% NaN₃를 포함하는 인산 완충 생리 식염수(이하, PBS 로 약칭한다)를 이용하여 세척하였다. 약 1×10⁶세포를 5㎍/㎖ 의 래트 항 마우스 FCγRII 브로킹 항체(파미젠사)를 포함하는 염색용 용액 50㎕ 에 현탁하였다. 이것을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 빙상에서 10분간 인큐베이트하였다. 50㎕ 의 20㎍/㎖ 비오틴화 mFas-Fc를 각 웰에 첨가하여 빙상에서 30분간 더 인큐베이트하였다. 염색용 용액으로 세척한 후, 피코엘리스린 표식 스트레프트아비딘(25배 희석, 벡톤-디킨슨사)을 가하고, 추가로 염색용 용액을 가하여 10㎕로 하여 빙상에서 30분간 반응시켰다.

세포를 염색용 용액으로 세척한 후, FACCcan(벡톤-디킨슨사)을 이용한 프로사이트메리에 의해 해석을 행하였다. 이 결과를 제 1a 도에 나타내었다. 대조는 백색을 뺀 부분으로 하고, 또한 PMA 와 이오노마이신으로 4시간 처리하기 전에 염색한 것을 영부(影付) 부분으로 하고, 또한 PMA 와 이오노마이신으로 4시간 처리한 후에 염색한 것을 착색부분으로 나타내었다. 그 결파, 형광강도의 약간의 위치이동이 확인되고, 해당세포가 비오틴화 mFas-Fc 로 염색된 것이 확인되었다.

한편, 같은 식으로 d10S 세포를 비오틴화 hTNFRβ-Fc로 염색하고, 프로사이트메트리로 분석한 바, 염색은 확인되지 않았다. 이들의 결과, 실시예 1 에서 조제한 mFas-Fc 는 d10S 세포상의 Fas 리간드에 특이적으로 결합함이 확인되었다.

(3) d10S-2 세포주의 선택

(2)에서 높은 형광활성이 확인된 d10S 세포, 1∼3×10⁷개에 상술한 방법으로 비오틴화 mFas-Fc 및 FITC 표식 hTNFRβ-Fc 를 반응시켜, 계속하여 피코엘리스린 표식 스트레프트아비딘으로 염색하고 FACCtar(벡톤-딕슨사)로 소트하였다. 피코엘리스린 형광을 높은 레벨(상위 0.3 ∼ 0.5%)에서 발하는 세포를 모으고, 10%FCS 와 50nM 의 2-머캅토에탄올을 포함하는 D-MEM 으로 증식시켰다.

얻어진 세포에 대하여 상기 조작을 더욱 반복한 결과, 선택된 세포군을 d10S-2 로 명명하였다. d10S-2 에 관하여 d10S 와 같은 식으로 프로사이트메트리를 행한 결과를 제 1b 도에 나타낸다. 이 d10S-2 는 자극제의 존재하 및 비존재하의 양쪽에서 높은 Fas 리간드 발현량을 나타내는 세포가 극히 농축된 세포군이다.

(실시예 3) cDNA 라이브러리의 구축

실시예 2 에서 얻어진 d10S-2 세포를 10% FCS 를 포함하는 D-MEM 중에서 2×10⁵세포/㎖ 까지 증식시켜, 20ng/㎖ 의 PMA 와 1㎍/㎖ 의 이오노마이신으로 37℃ 에서 3시간 자극하였다. 구아니딘이소티오시아네이트/산 페놀법(콤신스키 P.(Chomczynski P.) 및 사시 N.(Sacchi N.), Anal. Biochem., 162권, 156-159 페이지, 1987년)에 의해 총 RNA 를 분리한 후, 올리고(dT)-셀룰로오즈 칼럼 크로마토그래피를 2회 반복하여 poly(A)RNA 를 선택적으로 분리하였다. 랜덤헥사머 또는 올리고(d7)프라이머를 이용하여 이토우 N.(Itoh N.)등 (Cell, 66권, 233-243페이지, 1991년)의 방법으로 2본쇄 cDNA 를 합성하였다.

얻어진 2본쇄 cDNA 에 BstXI 아답터를 부가하고, 1% 아가로스겔을 이용한 전기영동으로 분자량 분획을 행하였다. 1.5kbp 이상의 크기의 cDNA 를 회수하고 BstXI 로 절단한 pCEV4 벡터(이토우 N.(Itoh N.)등, Cell, 66권, 233-243페이지, 1991년)에 결합시켰다.

결합 생성물을 사용하여 일렉트로폴레이션(도워 W.(Dower W.)등, Nucleic Acids Res., 16권, 6127-6145페이지, 1988년)에 의해 대장균 DH10B 세포(기브코 BRL(Gibco BRL)사)를 형질전환하였다. 올리고(dT)로 프라임시킨 cDNA 라이브러리로 부터 얻은 약 1.0×10⁶개의 독립된 클론과, 랜덤헥사머로 프라임시킨 cDNA 라이브러리로 부터 얻은 약 1.3×10⁶개의 클론을 혼합하고, 플라스미드 DNA를 조제하여 COS-7 세포의 형질전환에 사용하였다.

(실시예 4) 펀닝조작에 의한 cDNA 클론의 농축

실시예 3 에서 얻어진 플라스미드 DNA 로 일렉트로폴레이션법에 의해 COS-7 세포를 형질전환하였다. 즉, 5×10⁶개의 COS-7 세포를 K-PBS^-(30.8 mNacl,120.7mM KCl, 8.1mM Na₂HPO₄및 1.46mM KH₂PO₄를 포함하는 완충액)로 세척하고, 0.4㎖ 의 5mM MgCl₂를 첨가한 K-PBS(K-PBS⁺)에 세포를 현탁하였다.

다음으로, 0.4㎖ 의 K-PBS⁺에 40㎍ 의 플라스미드 DNA를 용해하고 그것을 세포 현탁액에 가하여 빙상에서 10분간 인큐베이트 하였다. 세포에 960μF의 전기용량으로 230V 의 전압을 걸어 일렉트로폴레이션 하고, 빙상에서 10 내지 15분간 인큐베이트한 후, 세포 현탁액을 5㎖ 의 혈청 무첨가의 냉D-MEM 으로 희석하고, 더욱 실온에서 30분간 인큐베이트 하였다. 그후, 이 세포를 두개의 10cm 플레이트에 심어 10% FCS 를 포함하는 D-MEM 속에서 37℃ 에서 60시간 배양하였다.

이상의 방법으로 총 1.2×10⁸개의 COS-7 세포를 형질전환 하고, 10cm 플레이트에서 배양하였다. 1플래이트 당 5㎖ 의 0.5mM EDTA 및 0.02% NaN₃를 포함하는 PBS(PBS/EDTA/NaN₃)를 가하여 37℃ 에서 30분간 인큐베이트 하고, 플레이트로 부터 이들의 세포를 벗기었다. 벗겨낸 세포를 3mg/㎖ 의 BSA 및 2.5㎍/㎖ 의 항 마우스 FcγII 리셉터 항체를 포함하는 PBS/EDTA/NaN₃에 5∼7 ×10⁶개/㎖ 의 세포농축으로 재차 현탁하였다. 빙상에서 10분간 인큐베이트한 후 mFas-Fc 를 최종 농도가 4㎍/㎖ 가 되도록 가하고, 빙상에서 60분간 인큐베이트하였다. 이 세포를 빙냉한 PBS 로 세척하고, 50mM 허피스 완충액(pH8.3) 및 0.2mM 비스(설포석신이미도일)스벨레이트(BS³, 피아스사)를 포함하는 PBS중에 5∼7 ×10⁶개/㎖ 의 세포 농도가 되도록 부유하였다.

빙상에서 30분간 인큐베이트한 후 1M 트리스-염산(이하, Tris-HCl 이라고 약칭한다. pH8.0)을 최종 농도가 50mM 이 되도록 첨가하고, 더욱 빙상에서 10분간 인큐베이트 하였다. PBS 로 세척한 후,세포를 3mg/㎖ 의 BSA를 첨가한 PBS/EDTA/NaN₃30㎖ 에 현탁하고, 나일론 메스(기공 크기 100㎛)로 여과를 행하여 응집물을 제거하였다.

이 세포 현탁액을 항 인간 IgG-Fc 항체(카펠 55071)를 고정화한 30개의 10cm 펀닝용 플레이트에 분배하였다. 실온에서 2시간 인큐베이트한 후, PBS 로 온화하게 세척하므로써 비부착 세포를 제거하고, 이토우 N.(Itoh N.)등의 방법으로 염색체외 DNA 를 부착 세포로 부터 배출하였다(Cell, 66권, 233-243페이지, 1990년). 이상의 1회째의 펀닝 조작으로 얻어진 DNA를 이용하여 일렉트로폴레이션에 의해 대장균을 형질전환시켜 4.1×10⁶개의 콜로니를 얻었다. 이들로 부터 플라스미드 DNA 를 조제하고, 9.6×10⁷개의 COS-7 세포(60 플레이트)를 형질전환 하였다.

이것을 펀닝용 플레이트 30 매로 분배하여 2 회째의 펀닝을 행하고, 1 회째와 마찬가지로 부착 세포로부터 DNA 를 조제하였다. 회수한 플라스미드 DNA 를 이용하여 대장균을 형질전환시키고, 8.0×10⁶개의 클론을 얻었다. 이들로부터 플라스미드 DNA 를 조제하고 4.0×10⁷개의 COS-7 세포(10 플레이트)를 형질전환시켰다.

이것을 펀닝용 플레이트 30 매로 분배하여 3 회째의 펀닝을 행하였다. 1회째, 2회째와 마찬가지로 부착 세포로부터 플라스미드 DNA 를 회수하고, 대장균을 형질전환시켜 3.8×10⁶개의 클론을 얻었다. 이들로부터 조제한 플라스미드 DNA로 1.0×10⁷개의 COS-7 세포(25 플레이트)를 형질전환시키고, 10매의 펀닝용 플레이트에 분배하여 4회째 펀닝조작을 행하였다.

이상의 4 회째의 펀닝조작을 종료한 후, COS-7 세포로부터 염색체외 DNA 를 조제하고 대장균을 형질전환시켰다. 각 균체 클론으로부터 플라스미드 DNA 를 조제하여 해석한 바, 48 클론 중 16 클론이 1.0 kbp 이상의 인서트를 갖고 있었다. 이들의 플라스미드 DNA를 각각 COS-7 세포에 도입한 후, COS-7 세포를 비오틴화 mFas-Fc 로 염색하고, 실시예 2의 방법으로 프로사이트메트리를 행하였다. 그 결과, 다섯 개의 클론이 염색되었다. 이 5 클론 중 하나로 1.6 kbp의 인서트를 갖는 클론, pTN24-15 로 형질전환시킨 COS-7 세포(COS/pTN24-15)의 결과를 제 1c 도에 나타내었다. 이 pTN24-15 로 형질전환시킨 COS-7 세포는 비오틴화 hTNFRβ-Fc 로는 염색되지 않았다. 또한, 외래유전자를 포함하지 않는 pCEV4 로 형질전환시킨 COS-7세포는 비오틴화 mFas-Fc 로 염색되지 않았다.

(실시예 5) DNA 배열의 결정 및 그 해석

실시예 4 에서 얻어진 5 클론에 관하여 제한 효소 맵핑을 한 바, 그들이 서로 오버랩하고 있다는 것을 알 수 있었다. 그래서, 이 5 클론 중 하나인 pTN24-15 를 더욱 상세하게 해석하였다. DNA 배열의 결정은 DNA 서열(370A 형,퍼킨엘머져팬(주))와 Taq 다이 디옥시 사이클 시퀀싱 키트(Taq Dye Deoxy cycle sequencing Kit, 퍼킨엘머져팬(주))를 사용하여 행하였다.

클론 pTN24-15의 염기배열과 그것으로 부터 추정한 아미노산 배열을 제 2 도, 3 도와 배열표의 배열번호 25 에 나타내었다. 이 cDNA는 1623 염기로부터 이루어지고, 하나의 오픈 리딩 프레임을 갖고 있다.

또한, 이 배열중에는 배열표의 배열번호 37 에 나타내는 코작 M.(Kozak M., J. Cell Biol., 115권, 887-903페이지, 1991년)에 의해 제창된 배열(CCA/GCCATGG)은 확인되지 않았지만, 번역 개시 부위는 염기번호 74 내지 76에 위치하는 ATG 로 생각되어졌다. 이 오픈 리딩 프레임은 908 내지 910 의 종지 코돈 TAA에서 끝나고 있다. 그리고, 이 cDNA는 278 아미노산을 코드화함을 알았다. 아미노산 배열로 부터 추정되는 펩타이드 부분의 분자량은 31,138 이고, 전등점은 9.53이다.

이 cDNA가 코드화하는 278 아미노산중 N말단측의 77 아미노산은 극히 프롤린이 풍부한 배열이었다. N말단 부근에 전형적인 시그널 배열은 확인되지 않았지만, 히드로퍼시 분석(Hydropathy Analysis)에 의해 Fas 리간드는 프롤린이 풍부한 영역에 계속하여 아마 트랜스맨브란앤커로서 기능한다고 생각되어지는 22개의 소수성 아미노산을 갖고 있음을 알았다. 시그널 배열이 결여되어 있고 내부에 소수성 도메인을 갖는 구조로 부터 Fas 리간드는 II형의 트랜스맨브랜 단백질임이 시사되었다.

세포외 영역으로서 추정되는 영역은 C말단측에 존재하고, 179 아미노산으로 부터 이루어지며, 4개의 N-글리코실화 부위(Asn-X-Ser/Thr)를 포함하는 것이 확인되었다. 이들 글리코실화 부위는 제 2 도, 3 도중에 * 로 나타내었다.

cDNA 라이브러리 작성에 사용한 d10S-2 세포는 래트와 마우스의 하이브리드마 이다. Fas 리간드 cDNA 의 유래를 결정하기 위하여 Fas 리간드 cDNA의 3' 말단 비코딩 영역으로 부터 프라이머를 설계, 합성하고, 래트와 마우스의 비장세포로 부터 얻은 염색체 DNA를 주형으로서 PCR을 행하였다. 즉, 배열표의 배열번호 25 의 염기번호 1006 내지 1025, 1305 내지 1324 를 센스 프라이머 2 및 3(배열표의 배열번호 38 및 39)으로 하고, 배열표의 배열번호 25 의 1327 내지 1346 및 1543 내지 1562 를 안티센스 프라이머 2 및 3 (배열표의 배열번호 40 및 41)으로 하여 이용하였다. 그 결과, 래트 염색체 DNA에서만 사이즈 341bp 와 258bp의 밴드가 얻어졌다. 이들의 결과는 클론 pTN24-15로부터 얻어진 cDNA가 d10S 하이브리드마 세포의 래트 유전자에서 유래함을 나타내고 있다.

또, 하나한의 방법(Hanahan D. 저, Techniques for Transformation of E.coli, In DNA Cloning, vol. 1, 글로버 D. M.(Glover D. M.)편, 109-136페이지, IRL 출판(IRL Press), 1985년)에 준하여 상기 pTN24-15로 대장균을 형질전환시켜 얻어진 형질전환체 DH10B(pTN24-15)를 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁하였다(FERM P-13953). 또한, 평성 6년 10월 27일부로 원기탁으로부터 국제 기탁으로 이관하였다(FERM BP-4848).

(실시예 6) 노던하이브리드화

mRNA 분리 키트(파마샤)를 이용하여 d10S, d10S-2, 래트 각 조직(뇌, 폐, 심장, 간장, 소장, 신장, 난소, 정소, 골격근) 및 세포(비세포, 흉선세포)로부터 poly(A)RNA 를 조제하였다. 50% 포름아미드중에서 65℃에서 5분간 가열하고 RNA 를변성시켜 6.6%의 포름알데히드를 포함하는 1.5% 아가로스겔로 전기영동을 행하고, 니트로셀룰로오스 또는 나일론막(슐라이햐 앤드 슈엘(Schleicher and Schuell)사)에 전사시켰다.

프로브로서 실시예 4 에서 얻어진 pTN24-15 의 43 내지 967 의 DNA 배열(배열표의 배열번호 42)을 포함하는 925bp 의 2본쇄 DNA 플라그멘트를 PCR 에 의해 제조하고, 랜덤 프라이머 라벨링 키트(베링거 멘하임사)에 의해³²P 표식하였다. 인간 EF1α의 cDNA(우에쯔키 T.(Uetsuki T.) 등, J. Biol. Chem., 264권, 5791-5798 페이지, 1989년)의 1.8kbp 의 길이를 갖는 BamHI 플라그멘트의³²P 표식물을 콘트롤 프로브로서 사용하였다. 하이브리드화 조작은 하이 스트링젠시(high stringency)의 조건하에서 샘브룩 J.(Sambrook J.) 등의 방법(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕(New York), 1989년)을 이용하였다.

제 4 도에는 d10S, d10S-2, d10S-16 각 세포를 PMA 와 이오노마이신으로 자극한 경우와 자극하지 않은 경우의 노던하이브리드화의 결과를 나타내었다. 제 4 도로 부터 명확하듯이 d10S로 부터 얻은 poly(A)PNA 는 약 2.0kbp 의 약한 하이브리드화를 나타내었다. 이 밴드의 시그널의 세기는 PMA나 이오노마이신으로 d10S세포를 자극하면 증가한다. d10S-2 세포는 PMA 와 이오노마이신으로 자극한 d10S 보다도 약 4배 강한 시그널을 나타내고, d10S-2 세포에서는 Fas 리간드 mRNA 의 발현량이 PMA 와 이오노마이신으로 자극한 d10S 세포보다도 약 4배가 높음이 시사되었다.

또한, 실시예 2 의 조작을 16회 반복하여 얻은 d10S-16 세포에서는 mRNA 발현량이 d10S 세포보다도 약 100배 많았다. d10S-16 의 세포장애활성은 d10S 세포보다 100배 높고, Fas 리간드 mRNA 발현량의 증가는 세포장애활성, mFas-Fc 로 염색되는 세기와 정 상관관계에 있음을 알 수 있었다.

제 5 도에는 래트의 비장 및 흉선으로부터 조제한 비세포, 흉선세포의 조제직후(배양전), 자극제 없이 37℃에서 8시간 배양후(미처리), 각 자극제를 가하여 37℃에서 8시간 배양 후의 노던하이브리드화의 결과를 나타내었다. 래트의 비세포에서는 Fas 리간드 mRNA의 약한 발현이 확인되었다. 래트 비세포를 PMA와 이오노마이신, 또는 ConA 와 IL-2로 8시간 자극했을 때 Fas 리간드 mRNA의 양은 현저하게 증가하였다. 래트 흉선세포에서는 배양전 및 미처리의 경우 Fas 리간드 mRNA는 거의 발현하지 않았다. 그러나, 래트 흉선세포를 PMA와 이오노마이신, 또는 ConA와 IL-2로 자극하면 Fas리간드 mRNA의 발현량은 비세포에 있어서의 발현량과 동등하게 될 때까지 증가하였다(제 5도).

래트의 각 조직에 있어서의 Fas 리간드 mRNA의 발현량을 조사한 결과를 제 6 도에 나타내었다. 제 6 도에 나타냈듯이 정소에서 약 2.0 kbp의 강한 시그널을 갖는 밴드가 확인되었다. 소장, 신장, 폐에서는 보통 또는 약한 시그널을 갖는 밴드가 확인되었으나, 그 외의 조직에서는 Fas 리간드 mRNA의 발현은 확인되지 않았다.

또, 모든 mRNA가 인택트(intact)인 것은 인간 EF1α의 cDNA 프로브와 재하이브리드화한 모든 세포 및 조직에 있어서 1.8kbp의 밴드가 확인된 것으로부터 명확하다(제 4 도, 5 도 및 6 도의 하단).

(실시예 7) Fas 리간드의 생화학적 해석

d10S-12 세포에서 발현하고 있는 Fas 리간드 및 pTN24-15 로 형질전환시킨 COS-7 세포로 발현하고 있는 Fas 리간드의 생화학적 성상을 검토하였다.

d10S-12 세포는 실시예 2의 조작을 12회 반복하여 얻어진 세포집단이다. 우선, d10S-12 또는 pTN24-15 로 형질전환시킨 COS-7 세포의 세포 표면 단백을 D-비오티닐-ε-아미노카프론산 N-히드록시석신이미드 에스테르 (biotin-CNHS-ester, 베링거 맨하임사)를 이용하는 마이어(Meier) 등의 방법으로 비오틴화하였다(Anal. Biochem., 204권, 220-226페이지, 1992년).

또, pTN24-15 로 형질전환시킨 COS-7 세포의 대조로서 외래유전자를 포함하지 않는 pCEV4벡터로 형질전환시킨 COS-7 세포를 이용하였다. 세포(7.5 ×10⁶개)를 1ml 의 라인스 완충액(1% NP-40, 50mM Tris-HCL (pH8.0), 150mM Nacl, 1mM(p-아미노페닐)메틸설포닐플로라이드 염산염(APMSF), 1㎍/㎖ 펩스타틴 및 1mM 로이펩틴을 포함한다)중에 가하여 빙상에서 30분간 인큐베이트하고 세포를 용해시켰다.

14,000rpm 으로 15분간 원심조작을 행한 후, 상등액을 10㎍/㎖ 의 hTNFRβ-Fc 와 빙상에서 60분간 인큐베이트하고, 더욱 5% 액량의 프로테인A-세파로스 4B 와, 4℃ 에서 60분간 인큐베이트 하였다. 프로테인A-세파로스4B 를 제거한 후, 상등액에 10㎍/㎖ 의 mFas-Fc 를 가하여 빙상에서 60분간 인큐베이트하였다. 1% 액량의 프로테인A-세파로스4B 를 이 혼합물에 가하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이트 하였다. 원심조작 후, 침강물을 라인스 완충액로 세척하고 5% 의 2-머캅토 에탄올을 포함하는 20㎕ 의 라에물리(Laemmli)의 시료용 완충액(2% SDS, 10% 글리세린 및 0.002% 브로모페놀 블루(BPB, Bromophenol blue)를 포함하는 62.5mM Tris-HCL(pH6.3)에 재현탁하여 95℃ 에서 2분간 가열하였다. 계속하여, 0.1% SDS 를 포함하는 10-20% 구배 폴리아크릴 아미드겔을 이용하여 구배 겔 전기영동을 행하고, PVDF 막으로 전사하여, ECL 시스템(아마샴사)으로 검출하였다.

제 7 도에 mFas-Fc 와 d10S-12, COS-7/pCEV4 또는 COS-7/pTN24-15와의 면역침강의 결과를 나타낸다. 제 7 도에 나타냈듯이 mFas-Fc는 d10S-12 세포 용해물중의 분자량 약 40,000 의 단백질과 면역침강하고, 한편, pTN24-15 로 형질전환시킨 COS-7 세포(COS-7/pTN24-15)로 부터의 용해물중에서는 분자량 약 37,000-45,000 의 단백질과 함께 면역침강하였다. 외래 유전자를 포함하지 않는 pCEV4 벡터로 형질전환시킨 COS-7 세포(COS-7/pCEV4)에서는 면역 침강물이 확인되지 않았다.

pTN24-15로 형질전환시킨 COS-7 세포와 d10S-12 세포로 면역침강한 단백질의 분자량은 모두 상술한 아미노산 배열로 부터 추정되는 분자량보다도 컸다. 이들 두개의 세포 사이에서의 분자량의 차이 및 아미노산 배열로 부터 추정되는 분자량과의 차이는, 네개 있는 N-글리코실화 부위의 몇개 인가에서 글리코실화에 차이가 발생하고 있기 때문이라고 생각되어졌다.

(실시예 8) Fas 리간드의 세포장애활성의 측정

(1) 에펙터 세포에 의한 세포장애활성의 측정

d10S 세포 및 pTN24-15로 형질전환시킨 COS-7 세포의 세포장애활성을 W4 세포(오가사와라 J.(Ogasawara J.) 등, Nature, 364권, 806-809페이지, 1993년)를 표적 세포로서 측정하였다. W4 세포는 마우스 Fas 항원을 발현시키도록 마우스 WR19L 세포를 형질전환시킨 세포이다. 이 WR19L 세포는 마우스 Fas 항원을 거의 발현하지 않고, TNF 의 세포장애작용에 감수성 세포이다.

세포장애활성의 검정은 루비에 E.(Rouvier E.) 등의 방법에 준하여 행하였다(J. Exp. Med., 177권, 195-200페이지, 1993년).

우선, d10S 세포(2.5∼5×10⁵세포/㎖)를 10ng/㎖의 PMA(시그마사) 및 칼슘 이오노포아인 이오노마이신(칼비오겜사) 500ng/㎖ 가 첨가된 10% FCS 함유 D-MEM 중에서, 37℃ 에서 3시간 인큐베이트한 후 D-MEM 으로 세척하고, 에펙터 세포로 하였다. 또한, COS-7 세포를 pTN24-15 로 DEAE-덱스트란법으로 형질전환시키고, 에펙터 세포로 하였다. 한편, 100㎕의 10% FCS 를 포함하는 RPMI1640 중에서 20μCi 의 [⁵¹Cr] 크롬산 나트륨(아마샴사)과 함께 1×10⁶개의 WR19L 세포 또는 W4 세포를 37℃에서 2시간 인큐베이트하였다. 배양액(RPMI1640)으로 세척한 후, 이들의 세포를 표적세포로서 사용하였다.

d10S 를 에펙터 세포로 하고 WR19L 또는 W4 를 표적세포로 하였을 때의 특이적 세포장애활성을 제 8 도에 나타내었다. 또한, 에펙터 세포를 COS/pTN 24-15, COS/pCEV4 로 하였을 때의 특이적 세포장애활성을 제 9 도에 나타내었다.

표적세포 1×10⁴개와 에펙터 세포를 여러가지 비로 환저의 마이크로타이터(micro titer) 플레이트의 각 웰중에서 혼합하였다. 이때 전액량이총 200㎕ 가 되도록 하였다. 700rpm 으로 2분간 플레이트의 원심조작을 행한 후, 37℃ 에서 4시간 인큐베이트 하였다. 또한, 1,200rpm 으로 5분간 플레이트의 원심조작을 행하고, 각 웰로 부터 상등액 100㎕ 을 분취하여 γ카운터를 이용하여 방사활성을 측정하고, 특이적 세포 용해율을 산출하였다.

⁵¹Cr 의 자연방출은 배지만으로 표적세포를 인큐베이트하므로써 결정하고, 한편, 최대방출량은 표적세포에 0.1% 가 되도록 트라이톤X100 을 가함으로써 결정하였다. 또한, 특이적 세포 용해율은 다음 식에 의하여 계산하였다.

제 9 도에 나타냈듯이 pTN24-15로 형질전환시킨 COS-7 세포(COS/pTN24-15)는 W4 세포를 용해시켰지만, 외래유전자를 포함하지 않는 pCEV4 벡터로 형질전환시킨 COS-7 세포(COS/pCEV4)에서는 W4 세포의 용해는 확인되지 않았다. pTN24-15로 형질전환시킨 COS-7 세포(COS/pTN24-15)와 d10S 세포의 세포장애활성을 W4 세포에 대한 E/T(에펙터 세포/표적세포)비로 비교하면, 전자는 후자에 비해 적어도 10배 높은 활성을 갖고 있다. 또한, d10S 세포 및 pTN24-15로 형질전환시킨 COS-7 세포(COS/pTN24-15)는 함께 WR19L 세포에 대해서는 세포장애작용을 나타내지 않았다(제 8 도, 9 도).

(2) 세포의 배양 상등액의 첨가에 의한 세포장애활성의 검토

제 10 도에 COS/pTN24-15 또는 COS/pCEV4 의 배양 상등액을 여러가지 농도로첨가했을 때의 표적세포(W4, WR19L)에 대한 세포장애활성을 나타내었다.

pTN24-15로 형질전환시킨 COS-7 세포(COS/pTN24-15)의 배양 상등액의 세포장애활성을 본 바, W4 세포에 대하여 현저한 세포장애활성이 확인되었으나, WR19L 세포에 대해서는 세포장애활성은 확인되지 않았다(제 10 도). 이것은 COS-7 세포상에서 발현된 재조합 Fas 리간드가 절단되어 가용형으로 되어 있음을 나타내는 결과이다.

(3) mFas-Fc 및 hTNERβ-Fc 에 의한 세포장애활성의 저해

또한, mFas-Fc, hTNFRβ-Fc 를 엇세이계에 가하여 에펙터 세포에 의한 세포장애활성의 변화를 검토하였다. 이 결과를 표 1 에 나타낸다.

표 11 에 나타냈듯이 Fas 리간드를 발현하는 COS-7 세포(COS/pTN24-15)의 세포장애활성은 d10S 세포와 마찬가지로 10㎍/㎖ 의 mFas-Fc 에서 저해되고, 10㎍/㎖ 의 hTNFβ-Fc 에서는 저해되지 않았다.

(실시예 9) 염색체 DNA 의 플라그멘테이션에 관한 검정

24웰 플레이트내의 8×10⁴개의 COS-7 세포를 10㎍ 의 pTN24-15 로 형질전환 하였다. 트랜스펙트의 72시간 후, 2×10⁵개의 WR19L 세포 또는 W4 세포(오가사와라 J.(Ogasawara J.) 등, Nature, 364권, 806-809페이지, 1993년)를 웰에 가하여 10% FCS 를 포함하는 RPMI1640 중 37℃ 에서 1 내지 3시간 인큐베이트하였다. WR19L 또는 W4 세포중 웰 내벽에 부착하지 않은 비부착 세포를 모아레이드 P. W.(Laird P. W.)등에 준하여 염색체 DNA를 조제하고(Laird P. W. 등, Nucleic Acids Res., 19권, 4293페이지, 1991년), 0.5㎍/㎖ 의 에티듐 브로마이드 존재하에서 아가로스겔을 사용하여 전기영동을 행하였다.

상술의 WR19L 또는 W4 세포의 염색체 DNA의 전기영동의 결과를 제 12 도에 나타내었다.

제 12 도로 부터 명확하듯이 pTN24-15로 형질전환시킨 COS-7 세포(COS/pTN24-15)와 함께 배양한 W4세포에서는 염색체 DNA가 아포토시스의 특징인 스텝 래더 양식(step-ladder fashion)으로 플라그멘트화 하고 있다.

DNA의 래더는 인큐베이트후 약 1.0시간에서 관찰되고, 인큐베이트후 약 2시간에서 거의 DNA가 단편화하고 말았다.

이와 같은 DNA의 플라그멘트화는 외래유전자를 포함하지 않는 pCEV4로 형질전환시킨 COS-7 세포와 함께 배양한 W4 세포에서는 확인되지 않았다. 또한, 이와 같은 DNA의 단편화는 표적 세포로 이용한 W4세포 및 WR19L 세포중 W4 세포에서만 확인되고, WR19L 세포에서는 확인되지 않았다.

(실시예 10) 친화성 크로마토그래피를 이용한 Fas 리간드의 정제

(1) 세포표면 단백질의 비오틴화

이하에서 트레이서 단백질로서 사용하기 위해 마이어(Meier) 등의 방법(Anal. Biochem., 204권, 220페이지, 1992년)에 따라 세포표면의 비오틴화를 행하였다. 즉, d10S-12 세포를 50㎍/㎖ 의 NHS-LC-비오틴을 포함하는 10mM 붕산나트륨 완충 생리식염수로 1×10⁷세포/㎖ 이 되도록 현탁하고, 실온에서 15분간 인큐베이트 하였다. 최종 농도가 10mM 이 되도록 염화암모늄을 첨가하고 반응을 정지한 후, 150mM의 Nacl 을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH8.0, 이하 TBS 라고 칭함)로 3회 세척하고 세포표면 단백질을 비오틴화 하였다.

(2) mFas-Fc 친화성 칼럼의 조제

실시예 1 에서 제작한 키메라 단백질 mFas-Fc 의 정제표품 4mg 을 4ml의 PBS(pH7.4)에 용해한 후, 2ml의 프로테인 A - 세파로스 4B와 혼합하고 4℃에서 1시간 결합시켰다. 유리의 단백질을 제거하기 위해 수지를 TBS 로 3회, 이어서 200mM 의 붕산나트륨 용액(pH9.0)으로 1회 세척하였다. 또한, 디메틸피멜리미데이트(DMP)를 포함하는 200mM 붕산 용액(pH9.0)에서 실온에서 45분간 인큐베이트함으로써 수지에 mFas-Fc 를 공유결합시켰다.

(3) Fas 리간드의 정제

실시예 2 의 조작을 12회 반복하여 얻어진 d10S 의 서브라인, d10S-12 를 50nM 의 2-머캅토에탄올과 20mM 허피스(pH7.4)를 첨가한 10% FCS 함유 D-MEM 을 배지를 이용하여 37℃ 에서 10 개의 롤러 병에서 배양하였다. 세포밀도가 2×10⁵세포/㎖ 에 도달한 시점에서 10ng/㎖의 PMA 와 500ng/㎖의 이오노마이신을 첨가하고 4시간 더 인큐베이트하였다.

배양후의 세포 부유액을 250×g 으로 20분간 원심후 펠렛을 회수하고, PBS 로 3회, TBS 로 1회 세척하였다. 펠렛의 상태로 -80 ℃ 에서 보존하고, 이하의 세포막 획분의 제조에 사용하였다. 또한, 일부를 (1) 의 세포표면 단백질의 비오틴화에 사용하였다.

동결한 세포 펠렛은 4배량의 1mM p-아미노페닐 메탄설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드(p-aminophenyl methanesulfonyl fluoride hydrochloride, APMSF), 1㎍/㎖ 펩스타딘, 1㎍/㎖ 로이펩틴 및 0.02% NaN₃를 포함하는 0.3M 서당 용액중에서 울트라-트락스 T25(Ultra-Turrax T25, 얀크 앤드 쿤켈, 스타펜(Janke & Kunkel, Staufen)사)를 이용하여 블루 포지션에서 빙상에서 2분간 파쇄하였다.

1,000×g 으로 20분간 4℃에서 원심하고, 핵 및 파쇄되지 않은 세포를 제거하였다. 다음에 상등액을 100,000×g 으로 90분간 4℃에서 원심분리하고 막 분획을 얻었다. 이 막 분획을 40㎖의 라인스 완충액(1% NP-40, 1mM APMSF, 1㎍/㎖ 펩스타딘 및 1㎍/㎖ 로이펩틴을 포함하는 TBS)로 용해하고, 4℃에서 하룻밤 흔들어 가용화 하였다. 가용화한 막 분획을 100,000×g으로 60분간 4℃에서 원심하고, 상등액을 -80℃에서 보존하였다. 세포표면 단백을 비오틴화한 세포도 동일하게 처리하고 -80℃에서 보존하였다.

Fas 리간드의 트레이서로서 가용화한 막 분획 100㎖에 비오틴화한 세포로부터의 가용화 막 분획 10㎖를 첨가하였다. 그 혼합물을 1% NP-40 을 포함하는 TBS 로 평형화한 mFas-Fc 칼럼(1.4ml)에 적용하였다.

칼럼을 1% NP-40 을 포함하는 TBS 50ml 및 0.1% NP-40 을 포함하는 TBS 50ml 로 세척후, 1M NaCl 및 0.1% NP-40 을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 8.0)로 Fas 리간드를 용출하였다.

1ml 씩 획분을 모아 각 획분의 10㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PAGE)에 제공한 후, PVDF 막으로 전사하였다. 비오틴화한 단백질은 HRPO 표식 스트렙토 아비딘과 반응시켜 염색하고, 사용 설명서대로 ECL 시스템(아마샴사)으로 검출하였다.

40kD 의 비오틴화 Fas 리간드를 포함하는 획분을 풀링하고, 10㎕ 의 ConA-아가로스 비스(EY 라보라트리스사)와 4℃에서 하룻밤 인큐베이트 하였다. 0.1% NP-40 을 포함하는 TBS 로 4회 세척 후, 0.1% NP-40 및 2M α-메틸만노시드를 포함하는 PBS 200㎕ 로 Fas 리간드를 용출하고 정제 Fas 리간드를 얻었다.

(4) SDS-PAGE

(3) 에서 얻은 정제 Fas 리간드를 이용하여 0.1% SDS 를 포함하는 10 - 20% 구배 폴리아크릴 아미드 전기영동을 행하고, 실버스테이닝키트(和光純藥工業(주))로 염색 또는 PVDF 막으로 전사후 ECL 시스템으로 밴드를 검출하였다. Fas 리간드 정제의 결과를 제 13 도에 나타낸다. 도면중 레인 1 은 은 염색의 결과를, 레인 2 는 ECL 시스템에서의 검출 결과이다.

제 13 도에 나타냈듯이 정제된 Fas 리간드는 은 염색 및 ECL 시스템에서 함께 비환원하 분자량 약 40kD 의 1 개의 밴드로서 검출되었다.

(5) 세포 장애 활성

실시예 8 의 방법에 따라서 정제 Fas 리간드의 세포 장애 활성을 측정하였다. 단, 지금까지의 세포 장애 활성에서 에펙터 세포로서 이용된 d10S 세포 및 pTN24-15 로 형질전환시킨 COS-7 세포 대신에 (3) 에서 얻어진 정제 Fas 리간드를사용하고, 표적세포인 W4 세포 및 WR19L 세포에 대한 특이적 세포 용해율을 지표로서 세포 장애 활성을 측정하였다. 정제된 Fas 리간드의 세포 장애 활성의 검토결과를 제 14 도에 나타낸다.

제 14 도로 부터 명확하듯이 Fas 항원을 발현하고 있지 않는 WR19L 세포에 대해서는 세포 장애 활성은 나타나지 않았으나, Fas 항원을 발현하고 있는 W4 세포에 대해서는 농도 의존적인 세포 장애 활성이 확인되었다.

(실시예 11) 레트 Fas 리간드 DNA의 일부를 사용한 스크리닝

(1) 인간 염색체 DNA 라이브러리의 스크리닝

인간(태반) 염색체 DNA 퍼지 라이브러리 (EMBL3 SP6/T7, 클론텍(Clontech)사)를 지시균(균명 VCS257)에 감염시켜 연한 한천과 혼합하고 한천 플레이트에 중층하였다. 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하고 퍼지 플라크를 형성시켰다. 이것을 일단 4℃에서 약 4시간 냉각하고 그후 퍼지를 니트로 셀룰로오스 필터에 전사하였다.

한편, 실시예 4 에서 얻은 플라스미드 pTN24-15 를 주형으로서 센스 프

래트 Fas 리간드 cDNA 의 세포외 영역을 코드화하는 cDNA(배열표의 배열번호 25의 염기번호 400 에서부터 967번)를 증폭시졌다. 랜덤 프라이머 라벨링키트(베링거 맨하임사)를 사용하여 실시예 6의 방법으로 증폭산물을³²P 표식하여 프로브 1(배열표의 배열번호 45)을 제작하였다. 배열표의 배열번호 25의 5' 말단측, 즉 배열표의배열번호 25의 염기번호 43 에서부터 233 을 PCR에 의해 증폭시켜 얻어진 증폭산물을 상술한 바와 같이³²P 표식하여 프로브 2(배열표의 배열번호 46)를 제작하였다.

쇼우(Shaw) 등의 방법(Nucleic Acids Res., 11권, 555-573페이지, 1983년)을 일부 개변하여, 상기의 각 프로브와 니트로 셀룰로오스 필터를 하이브리드화 시켰다. 즉, 필터를 65℃에서 하룻밤 0.1% SDS 를 포함하는 3×SSC 로 세척하고, 이어서 50% 포름아미드, 5×덴펄트 용액, 0.1% SDS, 250㎍/㎖ 의 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 5×SSCP 중에서 42℃에서 5시간 프리하이브리드화 하였다. 다음으로 50% 포름아미드, 1×덴팔트 용액, 0.1% SDS, 100㎍/㎖ 의 변성 연어 정자 DNA, 10%(w/v) 덱스트란 황산을 포함하는 5×SSCP 에 상술한 프로브를 1.1×10⁶cpm/ml 가 되도록 첨가하고, 상기 필터를 28℃에서 18시간 하이브리드화 시켰다. 0.1% SDS 를 포함하는 2×SSCP를 이용하여 실온에서 2회 필터를 세척하고, 이어서 0.1% SDS 를 포함하는 0.3×SSCP 를 이용하여 37℃에서 3회 세척하였다. 오토 래디오그래피를 행한 바, 복수의 포지터브 클론이 검출되었다.

(2) 포지티브 클론의 해석 - 1

프로브 1 과의 하이브리드화로 얻어진 포지티브 클론중 두개의 클론, λ hFL4 및 λhFL7 로 부터 공지의 방법(샘브룩 J. (Sambrook J.) 등, Molecular Cloning : a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕(New York), 1989년 참조)으로 퍼지 DNA를 조제하였다. 클론 λhFL4 및 λhFL7 중에는 각각 18kbp, 17kbp 의 인간 염색체 DNA를 포함하고 있고, 제한효소 맵을 작성한 결과 서로 중복된 범위를 포함하고 있음을 알았다.

배열표의 배열번호 25의 염기배열중의 524번째 부터 967번째에 상당하는 DNA 단편(배열표의 배열번호 47)을 실시예 4에서 얻어진 플라스미드 pTN24-15로 부터 조제하고, 실시예 6 의 방법으로³²P 로 표식하여 프로브 3으로 하였다. 클론 λhFL4 와 λhFL7 을 여러 종류의 제한효소로 절단한 후, 상기 프로브 3 을 사용하여 서던하이브리드화를 행하였다. 그 결과, 클론 λhFL4 와 λhFL7 중의 2.8kbp 의 HindIII 플라그멘트가 해당 프로브 3 과 하이브리드화 함이 확인되었다.

클론 λhFL4 로 부터 DNA를 조제하고 HindIII 으로 소화하였다. 얻어진 2.8kb 의 플라그멘트를 HindIII 으로 절단한 pBluescript KS(+)에 넣어 플라스미드 pBL-hFL4H 로 명명하였다. pBL-hFL4H 중의 DNA 배열을 DNA 서열(370A형, 퍼킨엘머져팬(주))를 사용하여 해석한 바, 해당 플라스미드에는 인간 Fas 리간드의 세포외 영역의 C 말단측의 130 아미노산을 코드화하는 DNA를 갖는 DNA 배열이 포함되어 있음이 확인되었다. 결과를 제 15 도와 배열표의 배열번호 26에 나타내었다. 제 15 도중, 5' 말단에서 세어 12번째까지는 인트론이다. 엑손 부분은 13번째의 G 로 부터 시작하고 있고, 405번째 부터 407번째의 배열 TAA 는 종지 코돈이다.

실시예 5 에서 해석한 pTN24-15 의 염기배열과 비교하여 제 15 도에는 인간 Fas 리간드와 다른 래트 Fas 리간드의 아미노산 잔기 및 염기만에 하선을 그어 나타냈다. 여기에서 배열을 확인한 부위는 배열번호 25의 염기번호 514번째에서부터 910번째의 염기배열과 높은 호몰로지를 갖고 있고, 염기배열에서 86.7%, 아미노산에서 81.5%의 호몰로지를 갖고 있었다.

또한, 하나한의 방법에 준하여 플라스미드 pBL-hFL4H로 대장균 DH10B 를 형질전환시켜 얻어진 형질전환체 대장균 DH10B(pBL-hFL4H)를 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁하였다(FERM P-14014). 그리고, 평성 6년 10월 27일부로 원기탁으로부터 국제기탁으로 이관하였다(FERM BP-4849). 또한, λhFL4 유래의 BamHI 플라그멘트를 pBluescript KS(+)의 BamHI 사이트로 재조합하여 얻은 플라스미드 pBL-hFL4B1 에는 인간 Fas 리간드 유전자의 엑손 3과 상술한 130 아미노산을 코드화하는 엑손 4가 포함되어 있음이 확인되었다.

(3) 포지티브 클론의 해석 - 2

프로브 2 와의 하이브리드화로 얻어진 포지티브 클론중 하나의 클론 λhFL5로부터 동일하게 퍼지 DNA를 조제하였다. 이 클론중에는 18kbp의 인간염색체 DNA가 포함되어 있음이 확인되었다. 클론 λhFL5로부터 DNA를 조제하고 BamHI 로 소화하였다. 얻어진 4.4 kbp의 플라그멘트를 BamHI로 절단한 pBluescript KS(+)에 넣고, 플라스미드 pBL-hFL5B1 로 명명하였다. pBL-hFL5B1 중의 DNA 배열을 DNA 서열를 사용하여 해석한 바, 해당 플라스미드에는 인간 Fas 리간드의 세포내영역을 포함하는 131 아미노산능 코드화하는 DNA를 갖는 DNA 배열이 포함되어 있음이 확인되었다. 얻어진 염기배열을 pTN24-15 의 염기배열과 비교하여 프로모터 영역, 인트론, 엑손을 결정하였다. 또한, 플라스미드 pBL-hFL5B1 에는 상술한 131 아미노산을 코드화하는 엑손 1 과 함께 엑손 2 도 포함되어 있음이 확인되었다.

(2) 및 (3) 에서 얻어진 결과를 종합하여 제 16 도 내지 18 도 및 배열표의배열번호 27 에 나타냈다. 도면 중 -------- 로 나타낸 부위는 배열 미확인의 염기배열이다. 인간 Fas 리간드에 대한 염색체 유전자는 네개의 엑손으로 이루어진다. 모든 스플라이싱 도너 사이트와 억셉터 사이트는 GT----AG 룰(파젯트(Padgette) 등, Annu. Rev. Biochem., 55권, 1119-1150페이지, 1986년)에 적합하고, 스플라이싱 사이트에 인접하는 염기배열은 다른 유전자로 보이는 스플라이싱 사이트의 염기배열과 잘 일치하고 있다.

(실시예 12) 인간 Fas 리간드를 코드화하는 cDNA 의 클로닝 및 발현

(1) 인간 Fas 리간드 cDNA 의 PCR 에 의한 클로닝

인간 말초혈로 부터 T세포를 채취하여 10% FCS, 50μM 의 β-머캅토 에탄올, 20ng/ml 의 IL-2 를 포함하는 RPMI1640 배지(日水제약(주)에 2×10⁶세포/ml 로 되도록 현탁하고, 37℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 이어서, ConA를 5㎍/㎖로 되도록 가하여 37℃에서 4일간 더 배양하였다. 죽은 세포를 히스토팩 1083(시그마사)을 이용한 밀도구배원심으로 빼고, mRNA 조제 키트(파마샤사)를 이용하여 poly(A)RNA 를 조제하였다. 가와사키 E. S. 등의 방법(Kwasaki E. S., Amplification of RNA in PCR Protocols. A Guide to Methods and Amplifications., M. A. 이니스(M. A. Innis)등 편, 아카데믹 출판(Academic Press), 산디에고(San Diego), 21-27페이지, 1990년)에 따라 이하와 같이 1본쇄 cDNA 의 합성 및 PCR 을 행하였다.

였다(배열표의 배열번호 48 및 49). 이 센스 프라이머는 ATG 개시 코돈의 상류역과 5' 말단의 XbaI 사이트(GCTCTAGA)를 포함하고 있다. 한편, 안티센스 프라이머는 TAA 종시 코돈의 하류영역과 XbaI 사이트(GCTCTAGA)를 포함하고 있다.

상술의 poly(A)RNA 1㎍에 50ng 의 랜덤 핵서머, 200유니트의 MMLV RNase H^-리버스 트랜스 클리프다제(기브코 BRL사)를 첨가하고, 역 전사반응시켰다. 이 반응액 2.0㎕를 상술의 센스 프라이머, 안티센스 프라이머를 각각 100pmol과 4×dNTP 와 Taq DNA 폴리머라제를 포함하는 PCR 완충액 100㎕ 로 회석하였다. DNA 서머 사이클러(DNA thermal cycler, 퍼킨엘머(Perkin-Elmer)사)를 사용하여 PCR 을 행하였다. PCR 은 ; 94℃에서 1분 ; 55℃에서 2분 ; 72℃ 에서 3분을 1 사이클로 한 반응을 20 사이클 행하였다.

얻어진 PCR 산물을 제한효소 XbaI 로 소화한 후, 1% 아가로스겔(로우 겔 탬퍼레이쳐(Low Gel Temperature), 바이오래드(BioRad)사)로 분리하였다. 약 970bp 의 DNA 플라그멘트를 겔로 부터 회수후, pBluescript II 의 XbaI 사이트에 넣고 플라스미드 pBX-hFL1 로 명명하였다. pBX-hFL1 중의 DNA 배열을 DNA 서열를 사용하여 확인하였다. 해당 플라스미드에 포함되는 970bp 의 DNA 플라그멘트의 염기배열은 실시예 11 에서 얻어진 인간 염색체 유전자의 배열과 일치함이 확인되었다. 클론 pBX-hFL1 중의 염기배열의 해석결과를 배열표의 배열번호 31 및 제 19 도 내지 20 도에 나타낸다.

인간 Fas 리간드는 래트 Fas 리간드와 같이 N 말단에 시그널 배열을 갖지 않지만, 단백 분자의 중앙부분에 22개의 소수성 아미노산을 갖고, II형 막 단백임을 알았다. 세포내영역은 Met 로 부터 시작하는 80 아미노산으로 이루어지고, 프롤린이 80 잔기중에 32 포함된다. C 말단 세포외 영역은 179 아미노산으로 이루어지고 3개소의 N-글리코실화 부위(Asn-X-Ser/Thr)가 존재한다.

하나한의 방법(기출)에 준하여 플라스미드 pBX-hFL1 으로 대장균 DH10B 를 형질전환하여 얻어진 형질전환체 대장균 DH10B(pBX-hFL1)를 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁하고(기탁번호 FERM P-14225), 더우기 평성 6년 10월 27일부로 원기탁으로 부터 국제기탁으로 이관하였다(기탁번호 FERM BP-4850).

(2) COS 세포로의 도입

(1) 에서 얻어진 970bp 의 XbaI DNA 플라그멘트를 동물세포 발현 벡터 pEF-BOS(미즈시마 및 나가타(Mizushima & Nagata), Nucleic Acids Res., 18권, 5322페이지, 1990년)의 XbaI 부위에 삽입하고, 플라스미드 pEX-hFL1 이라 명명하였다. 10% FCS 를 포함하는 D-MEM 배지에 COS-7 세포를 10cm 샬레당 2 ×10⁶세포로 되도록 심고, 5㎍ 의 플라스미드 pEX-hFL1 을 DEAE-덱스트란법(후쿠나가 R.(Fukunaga R.) 등, Cell, 62권, 341-350페이지, 1990년)으로 삽입하여 형질전환체 COS/pEX-hFL1 을 얻었다.

(3) 형질전환체의 세포장애활성

(2) 에서 형질전환시킨 COS 세포를 에펙터 세포로 하고, 10⁶의 WR19L 또는 WC8A 세포를 타켓 세포로서 실시예 8과 동일하게 재조합 세포의 세포장애 활성을확인하였다. WC8 세포는 마우스 WR19L 세포를 인간 Fas 항원을 발현하도록 형질전환한 세포이다(Itoh N. 등, J. Immunol., 151권, 621-627페이지, 1993년). 즉, 10⁶의 WR19L 또는 WC8A 세포를 20μCi의 [⁵¹Cr] 크롬산 나트륨(아마샴(Amersham)사)을 포함하는 SPMI1640 배지에서 37℃에서 2시간 배양하고⁵¹Cr로 표식하였다.

이⁵¹Cr 로 표식한 세포(1×10⁴)를 COS/pEX-hFL1 과 여러가지 비율로 혼합하고 37℃에서 4시간 배양 후,⁵¹Cr 의 유리를 지표로 세포장애활성을 측정하였다. 이 결과를 제 21 도에 나타낸다.

제 21 도에 나타내듯이 COS/pEX-hFL1 은 WC8A 세포에 대하여 농도의존적으로 세포장애활성을 나타냈다. WR19L 에 대해서는 아포토시스는 유도하지 않았다. 또한, COS/pEX-hFL1 의 세포장애활성을 조사한 결과를 제 22 도에 나타낸다. 이 세포장애활성은 실시예 1 에서 제작한 인간 Fas 항원의 세포외 영역을 포함하는 키메라 단백질(hFas-Fc) 또는 마우스 Fas 항원의 세포외 영역을 포함하는 키메라 단백질(mFas-Fc)을 첨가하므로써 저해되었지만, 가용형의 인간 TNF 리셉터(hTNFRβ-Fc)를 첨가하여도 저해되지 않았다(제 22 도).

이상의 결과로 부터 (1) 에서 단리한 970bp의 cDNA 에 의해 코드화되는 단백질은 Fas 항원과 결합하여 아포토시스를 유도하는 활성을 갖는 Fas 리간드임이 확인되었다.

(실시예 13) 마우스 Fas 리간드 염색체 유전자의 단리

129/Sv 마우스 염색체 DNA를 λFIX II 벡터에 도입하여 작성한 마우스 염색체 DNA 라이브러리(스트라타진(Stratagene)사, 라호야(La Jolla), CA))를 지시균에 감염시켜 연한 한천과 혼합하고, 한천 플레이트에 중층하여 1.3×10⁶개의 플라크를 얻었다. 이것을 일단 4℃ 에서 약 4시간 냉각하고 퍼지를 니트로 셀룰로오스 필터에 전사하였다.

실시예 11 에서 얻은 플라스미드 pTN24-15 를 주형으로서 센스 프라이

을 코드화하는 cDNA(배열표의 배열번호 25의 염기배열의 염기번호 400 에서 967번)을 증폭시켰다. 랜덤 프라이머 라벨링키트(베링더 맨하임사)를 사용하여 실시예 6 의 방법으로 증폭산물을³²P 표식하여 프로브 1 을 제작하였다. 또한, 배열표의 배열번호 25의 5' 말단측, 즉 배열표의 배열번호 25의 염기번호 43 에서 233을 PCR에 의해 중폭시켜 상술과 같이³²P 표식하여 프로브 2 를 제작하였다.

프로브 1 및 2 를 각각 니트로 셀룰로오스 필터와 하이브리드화 시켰다. 하이브리드화의 조건은 후술하는 실시예 16 과 동일한 온화한 조건으로 행하였다. 즉 33℃에서 18시간 하이브리드화한 후, 필터를 실온에서 0.1% SDS를 포함하는 2×SSCP 로 2회 세척한 후, 37℃의 0.1% SDS 를 포함하는 0.3×SSCP 로 세척하였다. 오토 래디오 플라피를 행한 바, 두개의 포지티브 클론을 얻었다(λMFL5,λMFL18). 포지티브 클론의 플라크를 단리하여 pBluescript II KS(+) (스트라타진(Stratagene)사)에 서브 클로닝한 후, 삽입되어 있는 마우스 염색체 DNA의 제한효소 지도의 작성, DNA 서열를 사용하여 염기배열을 결정하였다.

이 2 클론에 관하여 제한효소 지도를 작성하고 서던 하이브리드화 해석한 바, λMFL5, λMFL18은 각각 Fas 리간드 염색체 유전자의 5', 3' 영역을 갖고 있다. 또한, 래트 Fas 리간드 cDNA 와 상응하는 영역, 프로모터 영역의 염기 배열을 결정한 바, 결정된 염기배열은 래트 Fas 리간드 cDNA 와 높은 상동성을 나타내고, 클로닝된 λFIX II 벡터에 넣은 DNA가 마우스 Fas 리간드 유전자를 포함함을 알았다.

제 23 도 내지 24 도에 마우스 Fas 리간드 유전자의 프로모터, 엑손, 3' 플랭킹 영역의 염기배열을 나타냈다. TATA box 에서 107bp 하류의 ATG 개시코돈으로 부터 837bp 의 오픈 리딩 플레임이 있고, 279 아미노산(아미노산 부분의 분자량 31,440)을 코드화하고 있다. 마우스 Fas 리간드는 래트 Fas 리간드와 같은 N 말단에 시그널 배열을 갖지 않지만, 단백 분자의 중앙부분에 22 소수성 아미노산을 갖고 있다. 이로써 마우스 Fas 리간드는 II형 막 단백임이 명확해졌다. 세포내영역은 78 아미노산으로 이루어지고 프롤린이 78 잔기중 25 포함된다. C 말단 세포외 영역은 179 아미노산으로 이루어지고 5개소의 N-글리코실화 부위(Asn-X-Ser/Thr)가 존재한다.

또한, 마우스 Fas 리간드 cDNA는 래트 Fas 리간드 cDNA와 염기배열에서 90.6%, 아미노산 배열에서 91.4% 의 상동성을 갖고, 3' 비코딩 영역에서 84.5%의상동성을 갖음이 확인되었다.

(실시예 14) 마우스 Fas 리간드를 코드화하는 cDNA 의 PCR 에 의한 클로닝 및 발현

(1) 플라스미드 pBL-MFLW4 의 조제

야생형(C3H +/ +) 마우스의 비장 세포를 10% FCS, 50μM 의 β-머캅토 에탄올, 1.5㎍/㎖ 의 ConA, 20ng/㎖ 의 IL-2 를 포함하는 RPMI1640 배지(日水제약(주))에 2×10⁶세포/㎖ 로 되도록 현탁하고, 37℃ 에서 2일간 배양하였다. 10 ng/㎖ 의 PMA, 500ng/㎖ 의 이오노마이신으로 4시간 처리한 후, 죽은 세포를 피스토백 1083(시그마사)을 이용한 밀도구배원심으로 빼고, mRNA 조제 키트(파마샤사)를 이용하여 poly(A)RNA 를 조제하였다.

카와사키(Kawasaki) 등의 방법(Kawasaki E. S., Amplification of RNA In PCR Protocols. A Guide to Methods and Amplifications., M. A. 이니스(M. A. Innis)편, 아카데믹 출판(Academic Press), 산디에고(San Diego), 21-27페이지, 1990년)에 따라 이하와 같이 1본쇄 cDNA의 합성 및 PCS을 행하였다.

(배열표의 배열번호 50 및 51). 이 센스 프라이머 6은 ATG 개시 코돈의 상류역과 5' 말단의 XbaI 의 사이트(GCTCTAGA)를 포함하고 있다. 한편, 안티센스 프라이머는 TAA 종시 코돈의 하류영역과 XbaI 사이트(GCTCTAGA)를 포함하고 있다.

상술의 poly(A)RNA 1㎍ 에 50ng 의 랜덤 헥서머, 200 유니트의 MMLV RNaseH^-리버스 트랜스 클리프다제(기브코 BRL(Gibco BRL)사)를 첨가하여 역전사 반응시켰다. 이 반응액 1.0㎕ 를 상술의 센스 프라이며, 안티센스 프라이머를 각각 100pmol, 4×dNTP 와 Taq DNA 폴리머라제를 포함하는 PCR 완충액 100㎕로 희석하였다. DNA 서머 사이클러(DNA thermal cycler, 퍼킨스 엘머(Perkin-Elmer)사)를 사용하여 PCR 산물을 제한효소 XbaI 로 처리한 후, 1% 아가로스겔(로우 겔 템퍼레이쳐(Low Gel Temperature), 바이올랫드사)로 분리하였다.

약 940bp 의 DNA 플라그멘트를 겔로 부터 회수 후, pBluescript II KS(+)의 XbaI 사이트에 넣어 플라스미드 pBL-MFLW4 로 명명하였다. pBL-MFLW4 중의 DNA 배열을 DNA 서열를 사용하여 확인하였다. 그 결과, pBL-MFLW4 는 배열표의 배열번호 32의 염기배열을 갖고 있고, 해당 염기배열은 실시예 13 에서 얻어진 염색체 유전자의 배열과 일치함이 확인되었다.

하나한의 방법(기출)에 준하여 플라스미드 pBL-MFLW4 로 대장균 DH10B 를 형질전환하고, 얻어진 형질전환체 대장균 DH10B(pBL-MFLW4)를 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁하였다(기탁번호 FERM P-14226). 더우기, 평성 6년 10월 27일부로 원기탁자로 부터 국제기탁으로 이관하였다(FERM BP-4851).

(2) COS 세포로의 도입

(1) 에서 얻어진 940bp 의 XbaI 플라그멘트를 동물세포 발현 벡터 pEF-BOS(미즈시마 및 나가타(Mizushima & Nagata), 1990년)의 XbaI 부위에 삽입하고, 플라스미드 pEF-MFLW4F 로 명명하였다. COS-7 세포를 10% FCS 를 포함하는 D-MEM 배지에 10cm 샬레당 2×10⁶세포로 되도록 심고, 5㎍ 의 플라스미드 pEF-MFLW4F 를 DEAE-덱스트란법(후쿠나가(Fukunaga), 1990년)으로 도입하였다.

(3) 형질전환체의 세포장애활성

(2) 에서 형질전환시킨 COS 세포(COS/pEF-MFLW4F)를 에펙터 세포로 하고, 10⁶의 WR19L 또는 W4 세포를 표적 세포로서 실시예 8 과 동일하게 재조합 세포의 세포장애활성을 확인하였다. W4 세포는 마우스 WR19L 세포를 마우스 Fas 항원을 발현하도록 형질전환한 세포이다 (오가사와라 J. (Ogasawara J.)등, Nature, 364권, 806-809페이지, 1993년). 즉, 10⁶의 WR19L 세포 또는 W4 세포를 20μCi 의 [⁵¹Cr] 크롬산 나트륨(아마샴(Amersham)사)을 포함하는 RPMI1640 배지를 이용하여 37℃에서 2시간 배양하고⁵¹Cr 로 표식하였다.

이⁵¹Cr 로 표식한 세포(1×10⁴)를 COS/pEF-MFLW4F 세포와 여러가지 비율로 혼합하고 37℃에서 4시간 배양 후,⁵¹Cr 의 유리를 지표로 세포장애활성을 측정하고 결과를 제 25 도에 나타냈다.

제 25도에 나타내듯이 COS/pEF-MFLW4F 세포는 W4 세포를 농도 의존적으로 세포장애활성을 나타냈으나, WR19L 세포에 대해서는 아포토시스를 유도하지 않았다. 또한, 제 21 도에 나타냈듯이 WC8A 세포에 대해서도 농도 의존적으로 세포장애활성을 나타냈다. 또한, COS/pEF-MFLW4F 세포의 세포장애활성은 실시예 1 에서 제작한마우스 Fas 항원의 세포외 영역을 포함하는 키메라 단백질(mFas-Fc) 20㎍/㎖ 를 첨가하므로써 저해되었으나, 인간 TNF 리셉터의 가용형(hTNFRβ-Fc)으로는 저해되지 않았다.

이상의 결과로 부터 (1) 에서 단리한 940bp 의 cDNA 에 의해 코드화되는 단백질은 Fas 항원과 결합하여 아포토시스를 유도하는 활성을 갖는 Fas 리간드 임이 확인되었다.

(실시예 15) 모노클로날 항체의 제작

(1) 펩타이드의 합성 및 캐리어 결합 투여 항원의 조제

실시예 12 에서 결정한 아미노산 배열에 기초하여 4종류의 펩타이드를 합성하였다. 배열표의 배열번호 52에 나타내는 펩타이드 ① (LVMMEGKMMSY)은 Fmoc 법을 이용한 펩타이드 합성 키트(國産화학(주))의 사용설명서에 따라 합성하고, 수지로 부터 탈보호 절단한 후 에테르에 의해 조펩타이드 275.7mg 을 얻었다. 이어서 조펩타이드 10mg 을 5% 암모니아 수용액을 이용하여 용해하고 세파딕스 G10 에 의해 탈염하였다.

얻어진 용액을 역상 HPLC 칼럼 캅셀팩 C18(CAPCELLPAK C18 120Å, 5㎛, 4.6mm×250mm, 資生堂(주))을 이용하여 정제하였다. 용출액을 동결 건조하고 정제 펩타이드를 얻었다.

또한, 펩타이드 ② (KSNSRSMPLEWEDTYGIVLL), 펩타이드 ③ (SKYPQDLVMMEGKMMS) 및 펩타이드 ④ (LSLVNFEESQTFF)는 (주)不二家바이오사이엔스 연구소에 합성을 의뢰하였다(배열표의 배열번호 53 내지 55).

얻어진 펩타이드를 이하의 방법으로 키홀링페트헤모시아닌(KLH : 피어스(Pierce)사) 및 카티온화 BSA(피어스사)에 결합하여 투여 항원으로 하였다.

KLH 및 카오틴화 BSA 는 증류수에 용해하여 10mg/ml 로 조제하였다. 각각의 펩타이드를 증류수 또는 5% 암모니아수에 용해하고 1mg/ml 로 조제하였다. KLH 에서는 펩타이드와 캐리어의 몰비가 100 대 1 이 되도록, 카오틴화 BSA에서는 10 대 1 이 되도록 각각 혼합하고, 염산을 이용하여 pH5 로 조정하였다. 다음에 수용성 카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, 同仁화학 연구소)를 캐리어 1mg 당 동량 첨가하고 실온에서 4시간 교반하였다. 반응액을 세파딕스 G25(파마샤사)에 의해 정제하고 최초로 용출해 오는 획분을 투여 항원으로 하였다.

(2) 투여 및 항혈청의 조제

(1) 에서 제조한 투여 항원 100㎍과 동량의 플로인트 완전 보조제를 혼합하여 BALB/c 또는 ddy 마우스(5 내지 6주령, 암컷)의 복강내에 투여하였다. 1주일 후 동량을 플로인드 불완전 아쥬밴드와 혼합하여 복강내에 투여하였다. 또한, 1주일 간격으로 2회 추가 투여를 행하고, 더우기 1주일 후에 투여 항원 20㎍을 생리식염수로 희석하여 정맥내 투여하고, 2일후에 세포 융합을 행하였다. 2회 투여후, 항혈청을 안저정맥으로 부터 채혈하고 혈청을 분리하여 얻었다.

(3) 항혈청의 펩타이드와의 반응성의 측정

아미노 플레이트(住友베크라이트(주))의 각 웰에 2.5% 의 글루타르 알데히드 용액 70㎕를 분주하고, 실온에서 1시간 정치하여 내용액을 폐기하였다. 0.076M 의PBS(pH6.4)로 5㎍/㎖ 로 희석한 펩타이드 용액 50㎍를 가하고 37℃에서 1시간 처리하였다. 플레이트를 빙수로 냉각 후 이온교환수로 플레이트를 5회 세척하고, 0.2% 의 젤라틴을 용해한 PBS 100㎕를 분주하여 30분 정치하고 블로킹을 행하였다.

다음에 항혈청을 PBS로 500배로 희석하여 50㎕ 첨가하였다. 37℃에서 1시간 반응후 0.005% Tween 20 을 포함하는 생리식염수(이하, 세척액이라고 약칭한다)로 2회 세척하고, 퍼옥시다제 표식 항 마우스 이뮤노 글로블린즈 항체(다코(DAKO)사)를 0.25% 의 젤라틴을 용해한 PBS로 2,000배로 희석하여 첨가하였다. 37℃에서 1시간 반응시킨 후 세척액으로 5회 세척하였다. 오르토 페닐렌 디아민을 3mg/ml, 과산화수소를 0.027% 포함하는 맥킬베인 완충액 pH5.0 을 50㎕를 첨가하여 실온에서 10분간 반응시켰다.

반응후, 2N 황산 50㎕를 첨가하여 반응을 정지하고, 492nm 의 흡광도를 측정하였다. 각 항혈청 모두 투여한 펩타이드와 반응성을 나타냈다.

(4) 모노클로날 항체의 제작

(2) 에서 면역시킨 마우스를 도살하고 비장을 꺼냈다. 이것을 절단한후 스테인레스 · 메시를 통하여 RPMI1640 배지에 부유시켜 비세포 부유액을 얻었다. 이 비세포와 마우스미에로마 세포(P3X63Ag8U1)를 10 : 1 의 비율로 혼합하여 원심(1,400rpm으로 8분간)하였다. 얻어진 침전에 0.5ml 의 42.5% 의 폴리에틸렌 글리콜 1540 과 15% 의 디메틸 설폭사이드를 포함하는 RPMI1640 을 재빠르게 가하여 더욱 1분간 격하게 세포를 흔든 후, 10ml 의 RPMI1640을 천천히 가한후에 원심(800rpm으로 5분간)을 행하였다.

이 침전을 HAT 배지(히폭산틴 1×10^-4M, 아미노프텔린 4×10^-7M, 티미딘 1.6×10^-5M. 10% FCS를 포함하는 RPMI1640 배지)에 2×10⁵세포/ml 가 되도록 현탁하고, 96 웰 마이크로 플레이트의 웰당 0.2ml 를 분주하였다. 2 내지 3일마다 반량의 배지를 교환하고, 그후 HT 배지(히폭산틴 1×10^-4M, 티미딘 1.6×10^-5M, 10% FCS를 포함하는 RPMI1640 배지)로 교환하였다.

하이브리드마 세포의 생육이 확인된 곳에서 ELISA 법에 의해 스크리닝을 행하였다. 즉, 실시예 15(1) 에서 제작한 펩타이드를 불용화시킨 96 웰 플레이트를 세척액으로 2회 세척후, 0.25% 젤라틴을 포함하는 PBS로 10배로 희석한 배양 상등액 100㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시컸다. 반응종료 후, 세척액으로 5회 세척하고,제 2 항체로서 0.25% 젤라틴을 포함하는 PBS로 2,000배로 희석한 퍼옥시다제 표식 토기 항 마우스 Igs 항체(다코(DAKO)사) 50㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다.

반응종료 후, 세척액으로 5회 세척후 3mg/ml 오르토 페닐렌 디아민 및 0.027% 과산화수소를 포함하는 0.1M 맥킬베인 완충액 pH5.0을 100㎕ 첨가하고, 실온에서 10분간 효소반응을 행하여 100㎕ 의 2N 황산으로 반응을 정지하여 492nm 의 흡광도를 측정하였다.

ELISA 법에서 양성이었던 웰의 하이브리드마를 96 웰 마이크로 플레이트에 1 웰당 2개, 1개, 또는 0.5개가 되도록 10% FCS를 포함하는 RPMI1640을 이용하여 희석하였다.

위스터 래트의 흉선 세포를 피더 세포로서 가하여 플레이트의 각 웰에 심고 클로닝을 행하였다.

현미경하에서 관찰하여 확실하게 싱글 셀 콜로니인 웰을 선택하여 그들의 배양 상등액을 (3)의 ELISA 법에 의해 스크리닝하고, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리드마를 얻었다.

(5) 웨스턴 블로팅에 의한 반응성의 확인

상기 (2) 에서 얻어진 항혈청(펩타이드 ② 를 사용하여 작성한 항원으로 면역, lot. 19-3) 및 상기 (4) 에서 얻어진 모노클로날 항체(펩타이드 ② 를 사용하여 작성한 항원으로 면역, F864-5-1)와 인간 Fas 리간드와의 반응성을 실시예 12에서 COS 세포에 발현시킨 인간 Fas 리간드, 실시예 14 에서 발현시킨 마우스 Fas 리간드 및 Fas 리간드의 배열을 포함하지 않는 벡터를 트랜스펙터한 COS 세포를 콘트롤로서 웨스턴 블로팅으로 확인하였다.

우선, 각 재조합 COS 세포 약 1×10⁴개를 150mM 의 NaCl, 1% 의 NP-40, 0.1% 데옥시콜산 나트륨(Sodium deoxycolate), 0.1% SDS 및 0.2U/ml 의 아프로티닌(Aprotinin)을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH7.5) 9㎕와 혼합하고, 더욱 동량의 2% SDS, 30% 글리세롤, 10%의 2-머캅토 에탄올 및 0.01% BPB 를 포함하는 0.25M Tris-HCl(pH6.8)과 혼합하였다.

37℃ 에서 1시간 처리한 후, SDS-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(4-20% 구배겔)을 행하고, 영동 종료후 PVDF막(밀리포아사)에 4℃에서 200mA, 90분의 조건에서전사하였다. 멤브레인을 블럭에이스(雪印乳業(주))로 37℃에서 2시간 블로킹을 행하였다.

다음에 멤브레인을 세척액으로 2회, 37℃에서 4분 교반하여 세척하고, PBS로 5배로 희석한 블럭에이스로 500배로 희석한 항혈청 19-3, 또는 배양 상등액 F864-5-1 과 37℃에서 1.5시간 반응시켰다. 반응종료 후 세척액으로 2회 세척하고, 퍼옥시다제 표식 토끼 항 마우스 이뮤노 글로블린즈 항체(Cat. No. P260, 다코사)를 PBS로 5배로 희석한 블럭에이스로 1,000배로 희석한 용액에 담가 37℃에서 1.5시간 반응시켰다. 멤브레인을 세척액으로 3회, 증류수로 2회 세척하고, 표면의 물을 헤쳐 TMP 시약(Cat. No. TM9125, 시쯔크(SCYTK)사)으로 발색시켰다.

제 27 도 및 28 도에 항혈청 19-3 과 모노클로날 항체 F864-5-1 을 사용한 웨스턴 블로팅의 결과를 각각 나타냈다. 제 27 도 및 28 도로 부터 명확하듯이 인간 Fas 리간드 발현 COS 세포 유출액과 반응하는 밴드가 보이는 것에 대하여, 마우스 Fas 리간드 및 콘트롤에서는 밴드는 나타나지 않았다.

(6) 저지반응에 의한 펩타이드와의 반응성의 확인 - 1

상기 (4) 에서 얻어진 모노클로날 항체(펩타이드 ② 를 사용하여 제작한 항원으로 면역, F883-1-1)와, 투여 항원 펩타이드(펩타이드 ②)와의 반응성을 저지 반응에 의하여 확인하였다.

아미노 플레이트(住友베크라이트(주))의 각 웰에 2.5%의 글루타르 알데히드 용액 70㎕를 분주하여 실온에서 1시간 정치 후, 내용액을 폐기하였다. 0.076M의 PBS(pH6.4)로 5㎍/㎖ 로 희석한 펩타이드 ② 용액 50㎕를 가하여 37℃에서 1시간처리하였다. 플레이트를 빙수로 냉각후 이온교환수로 플레이트를 5회 세척하고, 0.2%의 젤라틴 및 0.1M 글리신을 포함하는 PBS 100㎕를 분주하여 30분간 정치하여 블로킹을 행하였다.

다음에 저지 펩타이드로서 상기 펩타이드 ②, ③, ④ 를 PBS로 10㎍/㎖로 희석하여 저지 항원 용액으로 하고, 네가티브 콘트롤로서 저지 항원을 포함하지 않는 용액을 제조하였다. 이들의 각 용액을 각각 25㎕ 첨가 후 0.2% 젤라틴을 용해시킨 PBS를 이용하여 0.4㎍/㎖ 로 희석한 F883-1-1을 25㎕ 가하였다. 37℃에서 1시간 반응시킨 후 세척액으로 2회 세척하였다.

다음에 퍼옥시다제 표식 항 마우스 이뮤노 글로블린즈 항체(다코사)를 0.2%의 젤라틴을 용해시킨 PBS로 2,000배 희석하여 각 웰에 50㎕ 씩 첨가하였다. 37℃ 에서 1시간 반응시킨 후 세척액으로 5회 세척하였다. 오르토 페닐렌 디아민을 3mg/㎖, 과산화수소를 0.027% 포함하는 맥킬베인 완충액 pH5.0을 상기 각 웰에 50㎕ 첨가하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 2N 황산 50㎕를 첨가하여 반응을 중지시키고 492nm의 흡광도를 측정하였다. 결과를 제 29도에 나타냈다.

제 29 도에서는 저지 항원 무첨가의 웰(네가티브 콘트롤)의 흡광도를 100 으로 한 경우의 각 웰의 흡광도를 산출하고 반응성으로서 나타냈다.

제 29 도로 부터 명확하듯이 F883-1-1 항체와 항원 펩타이드와의 반응성은 저지 펩타이드로서 펩타이드 ② 를 사용한 경우에만 저지됨이 확인되었다.

(7) 저지 반응에 의한 펩타이드와의 반응성의 확인 - 2

상기 (4) 에서 얻어진 IgM 형 모노클로날 항체(팹타이드 ③ 을 사용하여 제작한 항원으로 면역한 마우스로 부터 얻은 비세포와 미에로마로 부터 작성한 하이브리드마 F897-1-2가 생산하는 항체 F897-1-2)와,투여 항원 펩타이드(펩타이드③)와의 반응성을 저지 반응에 의해 확인하였다.

우선, 중근들(Immunofluorescence and Related Staining Techniques, W. Knapp, K. Holubar and G. Wick eds. 1978)의 방법에 따라서 팹타이드 ③ 을 퍼옥시다제로 표식하였다. 즉, 퍼옥시다제(R23. 11, 東洋紡(주))를 6mg 칭량하고 1.5ml 의 증류수로 용해하였다. 다음에 증류수로 용해한 0.1M 메타과요오드산나트륨을 0.3ml 첨가하여 실온에서 15분간 정치하고, 계속하여 증류수로 용해한 1.5% 에틸렌글리콜 0.3ml를 첨가하여 실온에서 20분간 정치하였다. 이 용액을 0.001M 의 초산완충액(pH 4.4)에 대하여 4℃에서 하룻밤 투석하였다.

얻어진 활성화 퍼옥시다제 159㎕(퍼옥시다제 500㎕ 상당)에 1M 탄산완충액(pH9.5)을 9㎕ 첨가하고, 계속하여 증류수로 용해하여 1mg/㎖로 조제한 펩타이드 ③을 428㎕(퍼옥시다제에 대하여 20배 몰량) 첨가하여 25℃에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 0.01M 탄산완충액(pH9.5)으로 용해한 4mg/㎖의 수소화 붕소나트륨을 15㎕ 첨가하여 4℃에서 2시간 정치하고, 더욱 증류수로 0.2M으로 희석한 글리신을 25㎕ 첨가하여 실온에서 1시간 정치하였다. 다음에, 0.076M의 PBS(pH6.4)에 대하여 4℃ 에서 하룻밤 투석하고, 얻어진 퍼옥시다제 표식 펩타이드 ③ 용액에 동량의 글리세롤을 첨가하여 -20℃에서 보존하였다.

다음으로 이뮤노 플레이트(눈크(NUNC)사, 맥시소프(MaxiSorp^TM))의 각 웰에0.076M의 PBS(pH6.4)로 20㎍/㎖로 희석한 항 마우스 이뮤노 글로블린 항체(Z259, 다코사)를 50㎕ 가하여 45℃에서 30분 처리하였다. 플레이트를 빙수로 냉각한 후 이온교환수로 플레이트를 5회 세척하고, 0.2% 젤라틴을 포함하는 PBS 100㎕를 분주하여 4℃에서 하룻밤 정치하여 블로킹을 행하였다. 블로킹 후 PBS로 100배로 희석한 염석항체(F897-1-2)를 50㎕ 가하여 37℃에서 1시간 정치한 후, 0.005% Tween 20을 포함하는 0.9% NaCl의 세척액으로 2회 세척하고, 더욱 이온교환수로 1회 세척하였다.

한편, 펩타이드 ③ 을 PBS로 3㎕/㎖, 10㎍/㎖ 로 희석하여 저지 항원 용액으로 하고, 네가티브 콘크롤로서 저지 항원을 포함하지 않는 용액을 조제하였다. 이들의 용액을 25㎕ 첨가후 PBS 로 200배로 희석한 퍼옥시다제 표식 펩타이드 ③을 25㎕ 가하여, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응종료 후 세척액으로 5회 세척하고, 계속하여 이온교환수로 2회 세척하였다. 오르토 페닐렌 디아민을 3mg/ml, 과산화수소 0.027%를 포함하는 맥킬베인 완충액(pH5.0)을 상기 각 웰에 50㎕ 첨가하여 실온에서 5분간 반응시켰다. 2N 황산 50㎕를 첨가하여 반응을 정지하고 492nm의 흡광도를 측정하였다. 저지 항원 무첨가의 웰(네가티브 콘트롤)의 흡광도를 100으로 했을 경우의 각 웰의 흡광도를 산출하여 반응성(%)으로 하였다. 결과를 제 31 도에 나타냈다.

제 31 도로 부터 명확하듯이 F897-1-2 항체와 항원 펩타이드와의 반응성은 펩타이드 ③ 에 의해 저지됨이 확인되었다.

(실시예 16) 아포토시스 억제 활성의 평가 -1

실시예 15 에서 얻어진 항체 F883-1-1의 아포토시스 억제 활성을, Fas 리간드를 발현하는 형질전환체 및 Fas 항원을 발현하는 형질전환체를 사용한 이하의 방법으로 확인하였다.

우선, 인간 Fas 리간드를 코드화하는 cDNA 를 포함하는 플라스미드 pEX-hFL1(실시예 12 참조)로 마우스 정상 골수 세포의 세포주 FDC-P1을 형질전환하였다. 그중의 1클론, FLh1 세포를 50U/ml 의 마우스 IL-3(인터젠사) 및 10%의 FCS 를 함유하는 RPMI1640 배지(기브코 BRL사)중에서 5% CO₂존재하, 37℃ 에서 4일간 배양하였다. 배양후 FLh1 세포를 10% FCS 를 함유하는 RPMI1640 배지에 5×10⁵세포/ml 가 되도록 현탁하고, 이 현탁액을 96개의 구멍을 가진 평평한 플레이트의 각 웰에 50㎕ 씩 첨가하였다.

한편, 실시예 15 에서 얻어진 항체 F883-1-1 을 PBS^-를 사용하여 각종 농도로 조제하였다. 이것을 상술의 각 웰에 10㎕ 씩 첨가하여 5% CO₂존재하, 37℃에서 30분간 인큐베이트 하였다.

다음으로, 10% FCS 를 함유하는 RPMI1640 배지에 인간 Fas 항원을 발현하는 형질전환체 WC8 세포(이토우 N.(Itoh N.)등, J. Immunol., 151권, 621-627 페이지, 1993년)를 6.3×10⁵세포/ml 가 되도록 현탁하고, 이것을 각 웰에 40㎕ 씩 첨가하였다. 5% CO₂존재하 37℃에서 16시간 인큐베이트한 후 트립판 블루를 각 웰에 100㎕씩 첨가하여 각 웰당의 생세포수를 카운트 하였다.

F883-1-1 항체의 아포토시스 억제 활성을 제 30 도에 나타낸다. 제 30 도로 부터 명확하듯이 FLh1 에 의한 WC8 의 아포토시스는 F883-1-1 항체에 의해 용량 의존적으로 억제되었다. 또, 모노클로날 항체 F883-1-1 을 생산하는 하이브리드마 F883-1-1 을 평성 6년 8월 9일부로 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁하고(기탁번호 FERM P-14464), 더우기 평성 6년 10월 27일부로 원기탁으로 부터 국제기탁으로 이관하였다(FERM BP-4852).

(실시예 17) 아포토시스 억제 활성의 평가 - 2

실시예 15 에서 얻어진 항체 F897-1-2 의 아포토시스 억제 활성을, 이하에 서술하는 실시예 18(3) 의 방법으로 제작한 형질전환체 COS-1/pEX-hFL1 의 배양 상등액 및 인간 Fas 항원을 발현하는 형질전환체 WC8 세포를 사용하여 실시예 8 및 12의 방법에 준하여 확인하였다.

우선, 10⁶개의 WC8 세포를 20μCi 의 [⁵¹Cr] 크롬산 나트륨(NEN사) 및 10%의 비동화 소 혈청을 함유하는 RPMI1640 배지중에서 37℃에서 2시간 배양하고⁵¹Cr 로 표식하였다.

다음으로, 96 웰 U 저플레이트(코닝(CORNING)사)의 각 웰에 COS-1/pEX-hFL1 의 배양 상등액을 최종 농도가 3%가 되도록 6㎕, 10%의 FCS를 함유하는 RPMI1640 을 74㎕ 씩 첨가하였다. 또한, 실시예 15 에서 얻어진 항체 F897-1-2 를 0.1%의 BSA를 함유하는 PBS^-로 300㎍/㎖ 가 되도록 조정하고, 최종농도가 30㎍/㎖ 가 되도록 각 웰에 20㎕ 씩 첨가하였다. 37℃에서 30분간 인큐베이트한 후,⁵¹Cr 로 표식한 WC8 세포를 1×10⁴개/100㎕/웰이 되도록 각 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간 배양하였다. 배양후,⁵¹Cr 의 유리를 지표로 세포장애활성을 측정하였다.

결과를 제 32 도에 나타냈다. 제 32 도로 부터 명확하듯이 COS-1/pEX-hFL1 의 배양 상등액중에 존재하는 Fas 리간드에 의한 WC8 세포의 아포토시스는 F897-1-2 항체에 의해 억제되었다.

또, 모노클로날 항체인 F897-1-2 항체를 생산하는 하이브리드마 F897-1-2 를 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 평성 6년 9월 1일부로 기탁하고(기탁번호 FERM P-14497), 더우기 평성 6년 10월 27일부로 원기탁으로 부터 국제기탁으로 이관하였다(FERM BP-4853).

(실시예 18) 인간 Fas 리간드의 세포외 영역의 발현

(1)플라스미드 pM1067의 제작

기로 합성하였다(배열표의 배열번호 56 및 57). 이 센스 프라이머는 인간 Fas 리간드 세포외 영역, 즉 상기식 3 의 아미노산 배열의 N 말단측에 위치하는 아미노산 배열을 코드화하는 염기배열과 PstI 사이트(CTGCAG)를 포함하고 있다. 또한, 안티센스 프라이머는 TAA 종지 코돈을 포함하는 영역과 HindIII 사이트(AAGCTT), KpnI사이트(GGTACC)를 포함하고 있다.

얻어진 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 각각 100pmol, 실시예 12(1) 에서 얻은 플라스미드 pBX-hFL1 을 50ng, dATP, dCTP, dGPT, dTTP 를 각각 20nmol, 2.5 유니트의 pfu 폴리머라제 및 첨부의 pfu 완충액(모두 스트라타진사) 10㎕를 포함하는 100㎕의 용액을 조정하였다. DNA 서머 사이클러(PCR 시스템 9600, 퍼킨엘머사)를 사용하여 ; 94℃에서 30초 ; 55℃에서 30초; 72℃에서 1분을 1 사이클로 하는 PCR을 30 사이클 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 PstI, HindIII 로 이중소화하고, pUC118 의 PstI, HindIII 사이트에 넣어 얻어진 플라스미드를 pM1067 이라 명명하였다.

(2) 플라스미드 pM1070 의 제작

합성기로 합성하였다(배열표의 배열번호 58 및 59). 이 센스 프라이머 8은 인간 Fas 항원 시그널 펩타이드를 코드화하는 배열의 5' 말단 영역과 EcoRI 사이트(GAATTC)를 포함하고 있다. 한편, 안티센스 프라이머 8 은 인간 Fas 항원 시그널 펩타이드를 코드화하는 배열의 3' 말단 영역과 인간 Fas 리간드 세포외 영역의 N 말단측을 코드화하는 염기배열 및 PstI 사이트를 포함하고 있다.

얻어진 센스 프라이머 8, 안티센스 프라이머 8을 각각 100pmol, 실시예 1 (3) 에서 사용한 플라스미드 pBLF58-1 을 50ng, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 를 각각20nmol, 2.5 유니트의 pfu 폴리머라제 및 첨부의 pfu 완충액(모두 스트라타진사) 10㎕를 포함하는 100㎕의 용액을 조정하고 (1)과 동일하게 PCR을 행하였다.

얻어진 PCR 산물을 EcoRI, PstI 으로 이중소화하고, (1) 에서 얻은 플라스미드 pM1067 의 EcoRI, PstI 사이트 사이에 넣어 pM1250 을 얻었다. 또한, 이것을 EcoRI, KpnI 로 이중소화하고, 아가로스겔 전기영동을 행하였다. 약 600bp의 단편을 회수하고 키아엑스(QIAEX^TM) 키트(카아젠(QIAGEN)사)를 사용하여 DNA를 정제하였다. 실시예 14 (2) 에서 사용한 pEF-BOS 에 DHFR 유전자를 재조합한 플라스미드 pM1103을 준비하고, 그 클로닝 사이트의 EcoRI, KpnI 사이트 사이에 상술한 약 600bp 의 DNA 단편을 넣어, 얻어진 플라스미드를 pM1070 이라 명명하였다.

(3) COS 세포로의 도입

pM1070 및 실시예 12 (1) 에서 제작한 pEX-hFL1 을 각각 COS-1 세포에 도입하고, 형질전환체 COS-1/PM1070 및 COS-1/pEX-hFL1 을 제작하였다. 즉, 8.1㎍의 pM1070 또는 pEX-hFL1 을 40㎕의 10mM Tris-HCl(pH7.4)/1mM 에틸렌디아민사초산(이하, TE 완충액라고 쓴다) 용액에 용해하였다. 이것들에 각각 0.2mg/ml DEAE-덱스트란 및 50mM Tris-HCl(pH7.4)을 함유하는 D-MEM(日水제약(주)) 11.3ml를 첨가하고, DNA-DEAE 덱스트란 혼합액을 제작하였다.

150cm²의 루프라스코내에 세미콘플루엔트까지 단층 배양한 COS-1 세포에 DNA-DEAE 텍스트란 혼합액을 적하하고, 5% CO₂의 존재하에 37℃에서 배양하여, 형질전환체 COS-1/pM1070 및 COS-1/pEX-hFL1 을 얻었다. 4시간후, DNA-DEAE 덱스트란혼합액을 제거하고 10% FC(아반사이엔티픽사)를 함유하는 D-MEM 으로 교환하여, 48 내지 96시간 더 배양하였다. COS-1/pM1070 및 COS-1/pEX-hFL1 의 배양 상등액을 회수하고 이하의 (4) 및 (5) 에서 사용하였다.

(5) 세포장애활성의 확인

(3) 에서 얻은 배양 상등액의 세포장애활성을 WC8 세포 또는 W4 세포를 표적 세포로서 실시예 8 및 실시예 12 와 동일하게 측정하였다. 즉, 10⁶개의 WC8 세포 또는 W4 세포를, 20μCi 의 [⁵¹Cr] 크롬산 나트륨(NEN사)을 포함하는 RPMI1640 배지를 이용하여 37℃ 에서 2시간 배양하고⁵¹Cr 로 표식하였다.

⁵¹Cr 로 표식한 세포를 1×10⁴개 포함하는 반응액중에 (3) 에서 얻은 세포배양 상등액을 최종 농도 3% 또는 10%가 되도록 첨가하고 37℃에서 4시간 배양후,⁵¹Cr 의 유리를 지표로 세포장애활성을 측정하였다. 결과를 제 33 도 및 34 도에 나타냈다. 도면으로 부터 명확하듯이 COS-1/pM1070 및 COS-1/pEX-hFL1의 배양 상등액은 WC8 세포 또는 W4 세포에 대하여 농도 의존적으로 세포장애활성을 나타냈다. 도면중 Mock 는 콘트롤(대조)을 나타낸다.

이상의 결과로 부터 이들의 배양 상등액중에는 Fas 항원과 결합하여 아포토시스를 유도하는 활성을 갖는 Fas 리간드가 포함되어 있음이 확인되었다.

(5) 형질전환체 COS-1/pM1070 및 COS-1/pEX-hFL1 의 배양 상등액을 사용한 웨스턴 블로팅

인간 Fas 리간드의 아미노산 배열의 일부(PSPPPEKKELRKVAH, 배열표의 배열번호 60)를 인식하는 토끼 항혈청을 공지방법에 따라 제작하고, 이하의 방법으로 웨스턴 블로팅을 행하였다.

우선, (3) 에서 얻은 형질전한체 COS-1/pM1070 및 COS-1/PEX-hFL1의 배양 상등액 10㎕를 각각 증류수 5㎕와 혼합하였다. 이것들에 4% SDS, 80% 글리세롤, 0.04% BPB 를 포함하는 증류수 5㎕ 또는 4% SDS, 80% 글리세롤, 8% DTT, 0.94% BPB 를 포함하는 증류수 5㎕를 가하여 각각 37℃에서 1시간 처리한후, SDS-PAGE(5-20%구배겔)를 행하였다. 영동종료후 PVDF막(아트사)에 실온에서 200mA, 60분의 조건에서 전사하였다. 스킴밀크(雪印유업(주))를 사용하여 4℃에서 하룻밤 반응시켜 블로킹을 행한후, 멤브레인을 PBS로 1회(실온에서 15분 인큐베이트), 0.1% Tween 20/PBS 로 2회(실온에서 5분 인큐베이트) 세척하였다.

상술의 토끼 항혈청을 0.5% BSA/0.1% Tween 20/PBS로 1,000배로 희석하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응종료후 0.1% Tween 20/PBS로 2회 세척하였다. 세척후, 더욱 0.5% BSA/0.1% Tween 20/PBS 로 1,000배로 희석한 퍼옥시다제 표식 항 토끼 이뮤노 글로블린즈 항체(Cat. No. P448, 다코사) 용액에 담가 실온에서 1시간 반응시켰다. 멤브레인을 0.1% Tween 20/PBS 로 5회 세척하고 표면의 물을 헤쳐 ECL 시스템(아마샴사)으로 검출하였다.

그 결과, COS-1/pM1070 의 배양 상등액에서는 환원조건하에서 29kD 부근에, 비환원조건하에서 26kD 부근에 각각 밴드가 나타났다.

한편, COS-1/pEX-hFL1 의 배양 상등액에서는 환원조건하에서 26kD 부근에,비환원조건하에서 24kD 부근에 각각 밴드가 검출되었다.

비환원조건하에서 웨스턴 블롯의 결과를 각각 제 35 도 및 36 도에 나타냈다. 도면중 Mock는 제 33 도 및 34 도와 같다.

(실시예 19) 안티센스 올리고 누클레오티드에 의한 Fas 리간드의 발현억제

(1) 안티센스 올리고 누클레오티드의 합성

리고 누클레오티드(이하 센스 올리고 누클레오티드 S20 이라고 부름) 및 그에 상보

안티센스 올리고 누클레오티드(이하, 안티센스 올리고 누클레오티드 A41 이라고 부름)를 공지방법으로 합성하였다(배열표의 배열번호 61 및 62). 얻어진 합성 올리고 누클레오티드를 1mM 이 되도록 TE 완충액로 용해하였다.

(2) 안티센스 올리고 누클레오티드의 세포로의 도입

인간 Fas 리간드를 발현하는 형질전환체 FLh1 세포(실시예 16 참조)를 10%의 비동화 FCS 를 포함하는 RPMI1640 배지에 현탁하고, 2.0×10⁴개/196㎕/웰이 되도록 96 웰 플레이트(눈크사)의 각 웰에 첨가하였다. (1) 에서 얻은 1mM 의 안티센스 올리고 누클레오티드 A41을 최종 농도가 20μM 이 되도록 4㎕ 씩 각 웰에 첨가하여 5% CO₂존재하에서 3일간 배양하고, 세포에 올리고 누클레오티드를 도입하였다. 동일하게, 1mM 의 센스 올리고 누클레오티드 S20 또는 TE 완충액를 각각 4㎕ 씩 각웰에 첨가하고, 5% CO₂존재하에서 3일간 배양하여 콘트롤로 하였다.

(3) 세포장애활성의 측정

(2) 에서 3일간 배양한 FLh1 세포를 에펙터 세포로 하고, 인간 Fas 항원을 발현하는 형질전환체 WC8 에 대한 세포장애활성을 측정하였다.

세포장애활성의 측정은 실시예 8 및 112 에서 이용한 방법에 따라 측정하였다.

즉, 10⁶개의 WC8 세포를 20μCi 의 [⁵¹Cr] 크롬산 나트륨(NEN사제)을 포함하는 RPMI1640 배지를 이용하여 37℃에서 2시간 배양하고,⁵¹Cr로 표식한 세포(1×10⁴)를 상기 에펙터 세포와 E/T비 3 대 1 의 비율로 혼합하였다. 37℃에서 5시간 배양후⁵¹Cr 의 유리를 지표로 세포장애활성을 측정하였다.

그 결과, 안티센스 올리고 누클레오티드 A41을 도입한 FLh1 세포에서는 WC8 세포에 대한 아포토시스 유도 활성이 억제되었다(제 37도).

(실시예 20) 안티센스 올리고 누클레오티드에 의한 Fas 리간드의 발현억제 - 2

(1) 안티센스 올리고 누클레오티드의 합성

배열표의 배열번호 31의 인간 Fas 리간드를 코드화하는 DNA 배열을 참고로 포스포로티오에이트형의 센스 올리고 누클레오티드, S50, S163, S338, S484, S714, S905, 및 포스포로티오에이트형의 안티센스 올리고 누클레오티드 A69, A184, A355, A505, A733, A924를 공지방법으로 합성하였다(배열표의 배열번호 63 내지 74).

이중에서 센스 올리고 누클레오티드 S50 및 안티센스 올리고 누클레오티

기로 이루어지는 올리고 누클레오티드이다.

센스 올리고 누클레오티드 S163 및 안티센스 올리고 누클레오티드 A184

는 22 염기로 이루어지는 올리고 누클레오티드이다.

센스 올리고 누클레오티드 S338 및 안티센스 올리고 누클레오티드 A355

이루어지는 올리고 누클레오티드이다.

센스 올리고 누클레오티드 S484 및 안티센스 올리고 누클레오티드 A50

22 염기로 이루어지는 올리고 누클레오티드이다.

센스 올리고 누클레오티드 S714 및 안티센스 올리고 누클레오티드 A73

기로 이루어지는 올리고누클레오티드이다.

센스 올리고누클레오티드 S905 및 안티센스 올리고누클레오티드 A924는,

이루어지는 올리고 누클레오티드이다.

얻어진 상기의 합성 올리고누클레오티드를 각각 1mM 농도가 되도록 TE 완충액으로 용해시켰다.

(2) 안티센스 올리고누클레오티드의 세포로의 도입

우선, 인간 Fas 리간드를 코드화하는 cDNA를 포함하는 플라스미드 pEX-hFL1(실시예 12 (2) 참조)로 마우스 선유아세포모양 세포주 L929를 형질전환시켰다. 그중의 1클론 LFLh3 세포를 10%의 FCS를 포함하는 D-MEM으로 현탁하고, 3.0×10⁵개/2.0㎖/웰이 되도록 6 웰 플레이트(눈크사)에 심어 5% CO₂존재하 37℃에서 하룻밤 배양하였다.

다음날, (1) 에서 합성한 올리고 누클레오티드를 최종 농도 1μM 이 되도록리포펙트아민(기브코 BRL사) 40㎍을 함유하는 옵티-MEMI(OPTI-MEM^TMI, 기브코 BRL사) 1,000㎕에 현탁하고, 올리고 누클레오티드-리포펙트아민 혼합액을 제작하였다. 5% CO₂존재하 37℃에서 하룻밤 배양하고, 배지를 제거한 LFLh3 세포에 상술의 올리고 누클레오티드-리포펙트아민 혼합액을 첨가하였다. 5% CO₂존재하 37℃에서 4시간 배양후 20% 비동화 FCS 및 1μM 올리고 누클레오티드를 함유하는 D-MEM 을 1,000㎕ 첨가하고, 16시간 더 배양하므로써 LFLh3 세포에 (1) 에서 합성한 올리고 누클레오티드를 도입하였다.

(3) 세포장애활성의 측정

(2) 에서 올리고 누클레오티드를 도입한 LFLh3 세포를 회수하고 트립신용액으로 3분간 처리한후, 세포장애활성 측정용의 에펙터 세포로서 이용하였다.

세포장애활성의 측정은 실시예 8 및 12에서 이용한 방법에 따라 행하였다.

즉, 10⁶개의 WC8 세포를 20μCi의 [⁵¹Cr] 크롬산 나트륨(NEN사)을 포함하는 RPMI1640 배지를 이용하여 37℃에서 2시간 배양하고,⁵¹Cr 로 표식한 세포(1×10⁴)를 상기 에펙터 세포와 E/T비 1 대 1 의 비율로 혼합하였다. 37℃에서 4시간 배양후⁵¹Cr 의 유리를 지표로 세포장애활성을 측정하였다.

그 결과, 상술의 안티센스 올리고 누클레오티드, A69, A184, A355, A505, A733, A924를 도입한 LFLh3 세포에서는 WC8 세포에 대한 아포토시스 유도 활성이 억제되었다. 이들의 안티센스 올리고 누클레오티드의 특이적 세포 용해 억제율을이하의 식으로 부터 계산하고 제 38도에 나타내었다.

SCLI : 특이적 세포 용해 억제율

SCL_AON-LFLh: 안티센스 올리고 누클레오티드를 도입한 LFLh3 세포의 특이적 세포 용해율

SCL_SON-LFLh: 센스 올리고 누클레오티드를 도입한 LFLh3 세포의 특이적 세포 용해율

(실시예 21) 인간 Fas 리간드의 세포외 영역의 결실 변이체의 동물세포를 숙주로 하는 발현

인간 Fas 리간드의 세포외 영역의 결실 변이체인 폴리펩타이드 ND38, ND40, ND41, ND42, ND43 및 CD179를 이하의 방법으로 발현시켰다. 또, ND38, ND40, ND41, ND42, ND43 은 상기식 3(배열표의 배열번호 3)에 기재한 아미노산 배열의 N 말단으로 부터 각각 38 아미노산, 40 아미노산, 41 아미노산, 42 아미노산, 43 아미노산이 결실된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드이다(즉, ND38은 배열번호 3의 아미노산 번호 39로 부터 179까지의 아미노산 배열을, ND40은 배열번호 3의 아미노산 번호 41로 부터 179까지의 아미노산 배열을, ND41은 배열번호 3의 아미노산 번호 42로 부터 179까지의 아미노산 배열을, ND42는 배열번호 3의 아미노산 번호 43으로 부터 179까지의 아미노산 배열을, ND43은 배열번호 3의 아미노산 번호 44로 부터179까지의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드이다. 배열표의 배열번호 76 내지 80).

또한, 폴리펩타이드 CD179는 상기식 3(배열표의 배열번호 3)에 기재의 아미노산 배열의 C 말단으로 부터 1아미노산이 결실된 아미노산 배열, 즉 아미노산 번호 1부터 178까지의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드이다(배열표의 배열번호 81).

(1) 플라스미드 pM1081 의 제작

인간 Fas 항원 시그널 펩타이드와 인간 Fas 리간드 세포외 영역을 코드화하는 염기배열로서, 사일렌트뮤테이션에 의해 인간 Fas 항원 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열중에 SpeI, PshAI 인식 배열이 도입되고, 인간 Fas 리간드를 코드화하는 염기배열중에 PstI 인식배열이 도입된 염기배열을 갖는 플라스미드 pM1081을 이하의 방법으로 제작하였다. 우선, 안티센스 프라이머

하였다(배열표의 배열번호 82). 이 안티센스 프라이머 9는 인간 Fas 리간드 세포외 영역의 N 말단측과 인간 Fas 항원 시그널 펩타이드의 C 말단측을 코드화하는 염기배열 및 PstI 사이트(CTGCAG), SpeI 사이트(ACTAGT), PshAI 사이트

얻어진 안티센스 프라이머 9와 실시예 18 (2) 에서 사용한 센스 프라이머

(GAATTC) 및 인간 Fas 항원 시그널 펩타이드의 N 말단을 코드화하는 배열을 포함하고 있다.)을 각각 100pmol, 실시예 1 (3) 에서 사용한 플라스미드 pBLF58-1 을 50ng, pfu DNA 폴리머라제를 2.5U, 첨부의 pfu 완충액를 10㎕ 포함하는 100㎕의 용액을 조제하였다.

실시예 18 (1)과 동일하게 PCR을 행하여 PCR 산물을 EcoRI 및 PstI 로 이중소화하고, 아가로스겔 전기영동을 행하였다. 약 70bp 의 DNA 단편을 회수하고 키아엑스키트를 이용하여 DNA를 정제하였다. 실시예 18 (1) 에서 제작한 플라스미드 pM1067의 EcoRI 사이트 및 PstI 사이트 사이에 상술의 약 70bp 의 DNA 단편을 삽입하였다.

얻어진 플라스미드의 염기배열을 확인한 바, EcoRI 사이트와 SpeI 사이트와의 사이에 16 염기의 결손이 있었다. 그래서, 목적으로 하는 EcoRI 사이트로 부터 SpeI 사이트까지의 배열을 구축하기 위하여 센스 프라이머 9(AATTCACCAT

하고, 각각을 1nmol 씩 포함하는 20㎕의 TE 용액을 조정하였다(배열표의 배열번호 83 및 84). 이 TE 용액을 95℃에서 5분 가열후 16℃까지 서서히 냉각하므로써, 이들의 올리고 누클레오티드를 아닐링하고 2본쇄 DNA의 양단에 각각 EcoRl 절단 배열과 SpeI 절단 배열을 갖는 DNA 단편을 얻었다. 이것을 상술의 16 염기 결손한 플라스미드의 EcdRI 사이트와 SpeI 사이트 사이에 삽입하고 pM1081을 얻었다.

(2) 폴리펩타이드 ND38을 코드화하는 염기배열을 갖는 플라스미드 pM1253의 제작

A)을 합성하였다. 이것은 인간 Fas 항원 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열에 가하여, 배열표의 배열번호 3의 39번째의 리신으로 부터 43번째의 리신까지의 아미노산 배열을 코드화하는 염기배열을 갖고, 배열중에 SpeI 사이트 (ACTAGT)를 포함하고 있다(배열표의 배열번호 85). 한편, 안티센스 프라이머 11 로서 배열번호 15의 ApaI 사이트 (GGGCCC)로 부터 하류 3' 측에 위치하는 염기배열을 기초

얻어진 센스 프라이머 11 과 안티센스 프라이머 11 을 각각 100pmol, 실시예 12 (1) 에서 제작한 플라스미드 pEX-hFL1 을 50ng, pfu DNA 폴리머라제를 2.5U, 첨부의 pfu 완충액를 10㎕ 포함하는 100㎕의 용액을 조제하고, 실시예 18 (1)과 동일하게 PCR을 행하였다. 이 PCR 산물을 SpeI 및 ApaI 로 이중소화하고, 아가로스겔 전기영동을 행하였다. 약 400bp의 DNA 단편을 회수하고 키아엑스키트를 이용하여 DNA를 정제하였다. (1) 에서 제작한 플라스미드 pM1081 의 SpeI 사이트와 ApaI 사이트와의 사이에 상술의 약 400bP의 DNA 단편을 삽입하여 플라스미드 pM1253 을 얻었다.

(3) 폴리펩타이드 ND40을 코드화하는 염기배열을 갖는 플라스미드 pM1254 의제작

C)를 합성하였다. 이것은 인간 Fas 항원 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열에 가하여, 배열표의 배열번호 3의 41번째의 로이신으로 부터 45번째의 알라닌까지의 아미노산 배열을 코드화하는 염기배열을 갖고, 배열중에 SpeI 사이트(ACTAGT)를 포함하고 있다(배열표의 배열번호 87).

이 센스 프라이며 12 및 안티센스 프라이머 11 을 이용하여 (2) 와 동일하게 PCR을 행하고, 얻어진 PCR 산물을 플라스미드 pM1081 에 삽입하여 플라스미드 pM1254 를 얻었다.

(4) 폴리펩타이드 ND41을 코드화하는 염기배열을 갖는 플라스미드 pM1255의 제작

T)을 합성하였다. 이것은 인간 Fas 항원 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열에 가하여, 배열표의 배열번호 3의 42번째의 아르기닌으로 부터 46번째의 히스티딘 까지의 아미노산 배열을 코드화하는 염기배열을 갖고, 배열중에 SpeI 사이트(ACT AGT)를 포함하고 있다(배열표의 배열번호 88).

이 센스 프라이며 13 및 안티센스 프라이머 11 을 이용하여 (2) 와 동일하게 PCR을 행하고, 얻어진 PCR 산물을 플라스미드 pM1081 에 삽입하여 플라스미드 pM1255 를 얻었다.

(5) 폴리펩타이드 ND42를 코드화하는 염기배열을 갖는 플라스미드 pM1256의 제작

A)를 합성하였다. 이것은 인간 Fas 항원 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열에 가하여, 배열표의 배열번호 3의 43번째의 리신으로 부터 47번째의 로이신까지의 아미노산 배열을 코드화하는 염기배열을 갖고, 배열중에 SpeI 사이트(ACTAGT)를 포함하고 있다(배열표의 배열번호 89).

이 센스 프라이며 14 및 안티센스 프라이머 11 을 이용하여 (2) 와 동일하게 PCR을 행하고, 얻어진 PCR 산물을 플라스미드 pM1081 에 삽입하여 플라스미드 pM1256 을 얻었다.

(6) 폴리펩타이드 ND43을 코드화하는 염기배열을 갖는 플라스미드 pM1257의 제작

A)를 합성하였다. 이것은 인간 Fas 항원 시그널 펩타이드를 코드화하는 염기배열에 가하여, 배열표의 배열번호 3의 44번째의 바린으로 부터 48번째의 스레오닌까지의 아미노산 배열을 코드화하는 염기배열을 갖고, 배열중에 SpeI 사이트(ACTAGT)를 포함하고 있다(배열표의 배열번호 90).

이 센스 프라이며 15 및 안티센스 프라이머 11 을 이용하여 (2) 와 동일하게 PCR을 행하고, 얻어진 PCR 산물을 플라스미드 pM1081 에 삽입하여 플라스미드pM1257 을 얻었다.

(7) 폴리펩타이드 CD179를 코드화하는 염기배열을 갖는 플라스미드 pM1259의 제작

이머 16은 배열표의 배열번호 3의 175번째의 글리신으로 부터 178번째의 리신까지 의 아미노산 배열을 코드화하는 염기배열과 종지 코돈(TAA, TAG), KpnI 사이트(GGTACC)를 포함한다. 센스 프라이머 16은 배열번호 15의 인간 Fas 리간드 세포외 영역 DNA 배열중의 ApaI 사이트(GGGCCC)로 부터 상류 5' 측에 위치하는 배열이다(배열표의 배열번호 91 및 92).

얻어진 센스 프라이머 16 과 안티센스 프라이머 16을 각각 100pmol, 실시예 12 (1) 에서 제작한 플라스미드 pEX-hFL1 을 50ng, pfu DNA 폴리머라제를 2.5U, 첨부의 pfu 완충액를 10㎕ 포함하는 100㎕의 용액을 조제하고 실시예 18 (1)과 동일하게 PCR을 행하였다.

이 PCR 산물을 ApaI 와 KpnI 로 이중소화하고 아가로스겔 전기영동을 행하였다. 약 170bp의 DNA 단편을 회수하고, 키아엑스키트를 이용하여 DNA를 정제하였다. 실시예 18 (2) 에서 제작한 pM1250 의 ApaI 사이트와 KpnI 사이트와의 사이에 상술의 약 170bp의 DNA 단편을 삽입하였다. 얻어진 플라스미드를 pM1259 로 명명하였다.

(8) 동물세포용 발현 플라스미드 pM1083, pM1084, pM1085, pM1086, pM1087, pM1089 의 제작

상기 (2) 내지 (7) 에서 얻은 플라스미드 pM1253, pM1254, pM1255, pM1256, pM1257및 PM1259를 각각 EcoRI 와 KpnI 로 이중소화하고, 아가로스겔 전기영동을 행하였다.

약 450bp(단, pM1259의 소화물의 경우는 약 600bp)의 DNA 단편을 회수하고, 키아엑스키트를 이용하여 DNA를 정제하였다. 실시예 18 (2) 에서 사용한 동물세포를 숙주로 이용한 발현용의 플라스미드 pM1103의 EcoRI 사이트와 KpnI 사이트와의 사이에 상술의 약 450 또는 약 600bp의 DNA 단편을 삽입하였다.

얻어진 플라스미드를 각각 pM1083(ND38), pM1084(ND40), PM1085(ND41), pM1086(ND42), pM1087(ND43), 및 PM1089(ND179)라고 명명하였다.

(9) COS 세포로의 도입

실시예 18 (2) 에서 제작한 pM1070 및 (8) 에서 제작한 pM1083, PM1084, pM1085, pM1086, pM1087 및 pM1089를 실시예 18 (3) 과 동일하게 COS-1 세포로 도입하고, 형질전환체 COS-1/pM1070, COS-1/pM1083, COS-1/pM1084, COS-1/pM1085, COS-1/pM1086, COS-1/pM1087 및 COS-1/pM1089 를 제작하였다.

즉, 0.5㎍의 pM1070, pM1083, pM1084, pM1085, pM1086, pM1087 및 pM1089 를 각각 개별로 2.5㎕의 10mM Tris-HCl(pH7.4)/1mM EDTA 용액에 용해하였다. 이것들에 각각 0.2mg/ml 의 DEAE-덱스트란 및 50mM Tris-HCl(pH8)을 함유하는 D-MEM(日水제약(주)) 0.7ml를 첨가하고, DNA-DEAE 덱스트란 혼합액을 제작하였다. 6 웰 플레이트(9.4cm²/웰 눈크사)로 세미콘플루엔트까지 단층 배양한 COS-1 세포에 상술의 DNA-DEAE 덱스트란 혼합액을 적하하고, 5% CO₂존재하 37℃에서 배양하여 형질전환체 COS-1/pM1070, COS-1/pM1083, COS-1/pM1084, COS-1/pM1085, COS-1/pM1086, COS-1/pM1087 및 COS-1/pM1089 를 얻었다.

DNA-DEAE 덱스트란 혼합액을 적하하고서 4시간후에 DNA-DEAE 텍스트란 혼합액을 제거하고, 10% FCS(아반사이엔티픽사)를 함유하는 D-MEM 으로 교환하여 96시간 더 배양하였다. COS-1/pM1070, COS-1/pM1083, COS-1/pM1084, COS-1/pM1085, COS-1/pM1086, COS-1/pM1087 및 COS-1/pM1089 의 배양 상등액을 회수하고 이하의 실험을 행하였다.

(10) 플라스미드 도입 COS 세포의 배양 상등액의 세포장애활성의 확인

(9) 에서 얻은 각 플라스미드 도입 COS 세포의 배양 상등액의 세포장애활성을, WC8 세포를 표적세포로서 실시예 8 및 실시예 12와 동일하게 측정하였다. 즉, 10⁶개의 WC8 세포를 20μCi 의 [⁵¹Cr] 크롬산 나트륨(NEN사)을 포함하는 RPMI1640 배지를 이용하여 37℃에서 2시간 배양하고⁵¹Cr로 표식하였다.

⁵¹Cr로 표식한 세포를 1×10⁴개 포함하는 반응액중에 (9) 에서 얻은 세포 배양 상등액을 최종 농도가 1%, 3%, 10%, 30% 로 되도록 첨가하고, 37℃에서 4시간 배양후,⁵¹Cr의 유리를 지표로 세포장애활성을 측정하였다.

결과를 제 39 도에 나타냈다. 제 39 도로 부터 명확하듯이 COS-1/pM1070 과동일하게 COS-1/pM1083, COS-1/pM1084 및 COS-1/pM1085 및 COS-1/pM1086 의 배양 상등액은 WC8 세포에 대하여 농도 의존적으로 세포장애활성을 나타내었다. 따라서, 이들의 배양 상등액중에 포함되는 인간 Fas 리간드의 결실 변이체는 인간 Fas 항원과 결합하여 아포토시스를 유도하는 활성을 갖는다고 생각되어졌다. 한편, COS-1/pM1087 및 COS-1/pM1089 의 배양 상등액에서는 COS-1/pM107O 의 배양 상등액에 비하여 WC8 세포에 대한 현저한 세포장애활성이 나타나지 않았다. 따라서, 이들의 배양 상등액중에 포함되는 인간 Fas 리간드의 결실 변이체는 아포토시스를 유도하는 활성을 갖지 않든가 또는 극히 약한 활성밖에 갖고 있지 않다고 생각되어졌다.

이와 같은 아포토시스의 유도활성을 잃는 원인은 Fas 리간드의 N 말단 또는 C 말단의 아미노산을 결실한 것으로, Fas 리간드의 입체구조가 유지될 수 없었기 때문이라고 생각되어졌다. 역으로, 아포토시스 유도활성을 잃는 만큼 N 말단 또는 C 말단의 아미노산이 결실된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 입체구조를 유지할 수 있는 아미노산 배열을 부가한 경우에는, 그것이 본래의 결실된 아미노산 배열과 다른 경우이어도 아포토시스 유도활성이 재차 나타난다고 추측된다. 또 마찬가지로, 이와 같은 결실 변이체에 입체구조를 유지할 수 있도록 아미노산 치환을 행함으로써도 아포토시스 유도활성을 부여함이 가능하다고 추측된다.

(실시예 22) 인간 Fas 리간드의 세포외 영역 및 그 N 말단 결실 변이체의 대장균을 숙주로 하는 발현

(1) 플라스미드 pM468 의 제작

플라스미드 pM468은 플라스미드 pBR322 의 유도체이고, 대장균에서 복제하는 기능, 안피실린 내성 유전자, 트립토판 프로모터, 알칼리 포스파다제(phoA)의 시그널 펩타이드 및 인간 췌분비성 트립신인히비터를 코드화하는 DNA를 갖는 플라스미드로서 구축된 플라스미드이고, pM469(모리시타 H.(Morishita H) 등, Thro-mbosis Research, 73권, 193-204페이지, 1994년)의 카나마이신 내성 유전자를 안피실린 내성 유전자로 치환하여 얻었다.

(2) 플라스미드 pM1059 의 제작

(1) 에서 얻은 플라스미드 pM468 을 HindIII, BamHI 로 이중소화하고, 0.8% 아가로스겔(시켐GTG(SeakeM GTG),寶酒造사)로 분리하여 목적으로 하는 DNA 단편을 포함하는 겔을 잘라냈다. 키아엑스키트를 이용하여 약 3.3kbp 의 DNA 단편을 정제하였다.

또한, BstEII, KpnI, BamHI 사이트를 갖도록 설계한 안티센스 프라이머

프로모터의 HindIII 사이트 상류 5' 측에 위치하는 센스 프라이머 17(CGCAAGTT CACGTAAAAAGC)를 화학 합성하였다(배열표의 배열번호 93 및 94). 안티센스 프라이머 17은 BamHI 사이트(GGATCC), KpnI 사이트(GGTACC), BstEII 사이트(GGTTACC) 및 알칼리 포스파다제의 시그널 펩타이드의 C 말단측을 포함하고 있다. 이들의 프라이머를 이용하여 플라스미드 pM468 을 주형으로 하여 PCR 을 행하였다.

즉, 상술의 PCR용의 주형 DNA를 포함하는 용액 100㎕ 중에 상기의 프라이머를 첨가하고, 진 앰프 키트(Gene Amp^TMDNA Amplification Reagent Kit with AmpliTaq^TM, 寶酒造사)를 이용하여 94℃에서 1분간, 55℃에서 2분간, 72℃에서 3분간을 1 사이클로서 30 사이클의 PCR을 행하였다.

얻어진 PCR 산물을 HindIII 와 BamHI 로 이중소화하고 4% 아가로스겔 전기영동으로 분리하여 약 120bp의 DNA 단편을 회수하여 DNA를 정제하였다. 이 DNA 단편을 상술한 플라스미드 pM468의 약 3.3kbp의 DNA 단편과 T4 DNA 리가제(寶酒造사)를 이용하여 결합하고, 대장균 JM109를 형질전환하므로써 플라스미드 pM1059 를 얻었다.

(3) 인간 Fas 리간드의 세포외 영역의 대장균을 숙주로 하는 발현 플라스미드 pM1068 의 제작

ATAAGCC)을 화학합성기로 합성하였다(배열표의 배열번호 95 및 96). 센스 프라이머 18은 대장균 트립토판 프로모터/오퍼레이터의 일부를 코드화 하는 염기배열, 개시코돈(ATG), 배열표의 배열번호 3의 인간 Fas 리간드 세포외 영역중의 N 말단 부분을 코드화하는 염기배열, HindIII 사이트(AAGCTT)를 포함한다. 안티센스 프라이머 18은 배열표의 배열번호 3의 인간 Fas 리간드 세포외 영역의 C 말단 부분을 코드화하는 염기배열, 종지코돈(TAA, TAG) 및 SalI 사이트(GTCGAC)를 포함한다.

얻어진 프라이머를 각각 100pmol, 실시예 12 (1) 에서 얻은 플라스미드 pBX-hFL1 을 50ng, dATP, dCPT, dGTP, dTTP 를 각각 20nmol, 2.5유니트의 pfu DNA 폴리머라제와 첨부의 pfu 완충액 10㎕를 포함하는 100㎕의 용액을 조제하고, 실시예 18 (1)과 동일하게 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 HindIII 와 SalI 로 이중소화하고, 아가로스겔 전기영동을 행하였다.

약 600bp의 DNA 단편을 회수하고 키아엑스키트를 이용하여 DNA를 정제하였다.

(1) 에서 얻은 플라스미드 pM468의 HindIII 사이트, SalI 사이트 사이에 상술의 약 600bp의 DNA 단편을 삽입하고 pM1068을 얻었다.

(4) 인간 Fas 리간드의 세포외 영역의 대장균을 숙주로 하는 분비 발현 플라스미드 pM1069의 제작

성하였다(배열표의 배열번호 97). 이 센스 프라이머는 알칼리 포스파다제 시그널 펩타이드의 일부를 코드화하는 염기배열, 배열표의 배열번호 3의 인간 Fas 리간드 세포외 영역의 N 말단 부분을 코드화하는 염기배열, BstEII 사이트(GGTTACC)를 포함한다.

얻어진 센스 프라이머 19 와 (3) 에서 이용한 안티센스 프라이머

에서 얻은 플라스미드 pBX-hFL1 을 50ng, dATP, dCTP, dGTP, dTTP 를 각각 20nmol,2.5유니트의 pfu DNA 폴리머라제와 첨부의 pfu 완충액 10㎕를 포함하는 100㎕의 용액을 조제하고, 실시예 18 (1) 과 동일하게 PCR을 행하였다.

얻어진 PCR 산물을 BstEII 와 SalI로 이중소화하고, 아가로스겔 전기영동을 행하였다. 약 600bp의 DNA 단편을 회수하고 키아엑스키트를 이용하여 DNA를 정제하였다. (2) 에서 얻은 플라스미드 pM1059 의 BstEII 사이트와 SalI 사이트와의 사이에 삽입하고, pM1069를 얻었다.

(5) 인간 Fas 리간드의 세포외 영역의 N 말단 38아미노산 잔기를 결손하는 펩타이드의 대장균을 숙주로 하는 분비 발현 플라스미드 pM1073의 제작

98 및 99). 센스 프라이머 20은 알칼리 포스파다제 시그널 펩타이드의 일부를 코드화하는 염기배열, 배열표의 배열번호 3의 인간 Fas 리간드 세포외 영역중 N 말단 아미노산 38잔기가 결손된 펩타이드(ND38)의 N 말단을 코드화하는 염기배열, BstEII 사이트(GGTTACC)를 포함한다. 안티센스 프라이머 20은 배열표의 베열번호 15의 인간 Fas 리간드 세포외 영역 DNA 배열중의 ApaI 사이트(GGGCCC)로 부터 하류 3' 측에 위치하는 염기배열이다.

얻어진 프라이머를 각각 100pmol, 실시예 12 (1) 에서 얻은 플라스미드 pBX-hFL1 을 50ng, dATP, dCPT, dGTP, dTTP 를 각각 20nmol, 2.5유니트의 pfu DNA 폴리머라제와 첨부의 pfu 완충액 10㎖를 포함하는 100㎕의 용액을 조제하고, 실시예 18(1)과 동일하게 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 BstEII 와 ApaI 로 이중소화하고, 아가로스겔 전기영동을 행하였다. 약 300bp의 DNA 단편을 회수하고 키아엑스키트를 이용하여 DNA를 정제하였다. (4) 에서 얻은 플라스미드 pM1069의 BstEII 사이트, ApaI 사이트 사이에 상술의 약 300bp의 DNA 단편을 삽입하고 pM1073을 얻었다.

(6) 형질전환체의 제작 및 인간 Fas 리간드의 발현

(3), (4), (5) 에서 얻은 플라스미드 pM1068, pM1069, pM1073을 이용하여 하나한의 방법(Hanahan, D. 저, Techniques for Transformation of E. Coli, In : DNA cloning, Vol, 1, Glover, D. M. (ed), 109-136 페이지, IRL 출판 (IRL Press), 1985년)에 의해 대장균 JE5505주를 형질전환하고, 재조합 대장균 JE5505(pM1068), JE5505(pM1069), JE5505(pM1073)을 제작하였다.

얻어진 형질전환체 각각을 50㎕/㎖의 안피실린 함유 L-브로스 5ml에서 하룻밤 배양하였다. 다음에 50㎕/㎖ 안피실린 함유 M9CA 배지 25ml에 이 배양액 0.5ml를 식균하고 37℃에서 3 내지 4시간 배양한후, 배양액의 OD₅₅₀가 대략 1이된 시점에서 배지에 최종 농도 10㎕/㎖의 3β-인돌아크릴산(和光純藥工業社)을 첨가하고, 약 24시간 더 배양하였다. 얻어진 배양 혼합물을 원심분리하고, 상등액과 균체를 각각 회수하였다.

(7) 형질전환체의 균체 및 배양 상등액을 사용한 웨스턴 블로팅

실시예 18(5)와 동일하게 인간 Fas 리간드의 아미노산 배열의 일부(PSPP PEKKELRKVAH)를 인식하는 토끼 항혈청을 이용하여 웨스턴 블로팅을 행하였다.

우선, (6) 에서 얻은 형질전환체 JE5505(pM1068), JE5505(pm1069) 및 JE5505(pM1073)의 균체(1ml의 배양액 상당)에 RIPA 완충액(150mM NaCl, 1%NP-40, 0.1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.2U/ml Aprotinin 을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH7.5) 1ml를 가하여 30분간 교반한후 원심하고, 그 상등액을 회수하였다. 얻어진 형질전환체의 상등액 및 (6) 에서 얻은 형질전환체의 배양 상등액 10㎕를 각각 증류수 5㎕와 혼합하였다. 이것들에 ; 4% SDS, 80% 글리세롤, 0.04% BPB 를 포함하는 용액 5㎕ ; 또는 4% SDS, 80% 글리세롤, 8% DTT, 0.04% BPB 를 포함하는 용액 5㎕를 가하여 각각 37℃에서 1시간 처리한후 SDS-PAGE 를 행하였다. 영동 종료후 PVDF막(아트사)에 실온에서 200mA, 60분의 조건에서 전사하였다. 스킴밀크(雪印乳業(주))를 사용하여 4℃에서 하룻밤 반응시켜 블로킹을 행한후, 멤브레인을 PBS로 1회, 0.1% Tween 20/PBS로 2회 세척하였다.

상술의 토끼 항혈청을 0.5% BSA/0.1% Tween 20/PBS 로 1,000배로 희석하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응종료후, 0.1% Tween 20/PBS로 2회 세척하였다. 세척후 더욱 더 0.5% BSA/0.1% Tween 20/PBS 로 500배로 희석한 퍼옥시다제 표식 항 토끼 이뮤노 글로블린즈 항체(Cat. 번호 P448, 다코(DAKO)사) 용액에 담가 실온에서 1시간 반응시켰다. 멤브레인을 0.1% Tween 20/PBS 로 5회 세척하고 표면의 물을 해쳐 ELC 시스템(아마샴사)으로 검출하였다.

제 40 도에 나타냈듯이 JE5505(pM1068)의 형질전환체 및 배양 상등액에 인간 Fas 리간드 세포외 영역에 상당하는 밴드가 비환원 조건하에서는 약 21kD 부근과 23kD 부근에 2개, 환원 조건하에서는 약 23kD 부근에 1개가 나타났다.

또한, 제 41 도에 나타냈듯이 JE5505(pM1069)의 형질전환체 및 배양 상등액중에 인간 Fas 리간드 세포외 영역에 상당하는 명료한 밴드가 비환원 조건하, 환원 조건하의 양자에서 23kD 부근에 나타났다.

(참고예 1) gld(C3H gld/gld) 마우스로 부터의 Fas 리간드에 대한 cCNA 의 클로닝

gld(C3H gld/gld) 마우스의 비장세포를 실시예 14의 방법으로 배양하고, 실시예 14의 방법으로 1본쇄 cDNA의 합성 및 PCR을 행하였다. 얻어진 PCR 산물을 XbaI 로 제한효소 처리후 1% 아가로스겔로 분리하고, 약 940bp DNA 플라그멘트를 회수하였다. 이것을 pBluescript II KS(+) 의 XbaI 사이트에 서브클로닝하고 그 염기배열을 결정하였다. 얻어진 염기배열을 실시예 14 (1) 에서 확인한 배열과 비교한바, 얻어진 PCR 산물의 배열은 실시예 14 (1) 에서 얻어진 배열의 3' 말단 가까이의 T(배열번호 32의 염기번호 849)가 C 로 변이해 있음이 명확해졌다(배열표의 배열번호 100). 이 1염기의 변이에 의해 아미노산 배열에도 변이가 발생하였다. 즉, gld 마우스에서는 마우스 Fas 리간드의 세포외 영역에 위치하는 273번째의 아미노산이 페닐 알라닌에서 로이신으로 변이해 있다.

(참고예 2) gld 마우스의 Fas 리간드의 세포장애활성

실시예 1 에서 얻어진 약 940bp의 XbaI 플라그멘트를 동물세포 발현 벡터 pEF-BOS 의 XbaI 부위에 삽입하였다. 실시예 (2) 와 같은 방법으로 COS 세포를 형질전환하였다. 형질전환한 COS 세포를 세포를 에펙터 세포로 하고, 실시예 14(3) 의 방법으로 세포장애활성을 측정하였다. 그 결과, gld 마우스로 부터 얻은 Fas 리간드 cDNA로 형질전환시킨 COS 세포는 세포장애활성을 나타내지 않았다(제 26 도).이상의 결과로 부터, 자기면역질환의 모델인 gld 마우스에서는 Fas 리간드에 의한 아포토시스의 유도가 정상으로 일어나지 않음이 확인되었다.

이번의 결과와 오가사와라(Ogasawara J.)등의 보고로 부터, 자기면역질환의 원인으로서 Fas 항원의 이상 및 Fas 리간드의 이상이라는 적어도 두가지가 있음이 시사되었다. 어느 경우에도 자기반응성의 T 세포에 아포토시스를 유도할 수 없고, 자기반응성의 T 세포가 생체내에서 제거되지 않았기 때문에 자기면역질환이 발생함이 예상되었다.

산업상의 유용성

본 발명에 의해 Fas 리간드 및 그 일부인 신규 폴리펩타이드가 제공된다. 해당 신규 폴리펩타이드는 Fas 항원을 통한 아포토시스가 관여하는 질환, 예를들어 자기면역질환이나 바이러스 감염의 치료약으로서 개발할 수 있다. 또한, 해당 신규 폴리펩타이드는 항체를 제작할 때의 항원으로서 사용할 수 있는 이외에, 시료중의 해당 폴리펩타이드를 항체를 사용하여 경합반응으로 측정할 때에 사용할수 있다.

본 발명에 의하면 또한 Fas 리간드 또는 그 일부를 코드화하는 DNA가 제공된다.

해당 DNA는 상기 신규 폴리펩타이드를 유전공학적 수법을 사용하여 공업적으로 대량 생산하기 위하여 사용할 수 있다. 또한, DNA 프로브를 제작하기 위해서도 사용할 수 있다. 더욱, 자기면역질환에서는 유전적으로 아포토시스의 기능이 결손되어 있는 경우를 생각할 수 있으나, 해당 신규 DNA는 이와 같은 질환의 유전자 치료에도 사용할 수 있다.

또한, DNA 배열이 명확히 되므로써 Fas 리간드 유전자 또는 Fas 리간드에 대한 mRNA 의 일부에 상보적인 염기배열을 포함하는 올리고 누클레오티드 또는 올리고 누클레오티드 유도체가 제공된다. 해당 올리고 누플레오티드는 Fas 리간드의 발현을 조절하기 위하여 사용할 수 있는 이외에, 진단용 프로브로서도 이용할 수 있다.

Claims (46)

1. 하기식 1(배열표의 배열번호 1)의 아미노산 배열을 함유함을 특징으로 하는 신규 폴리펩타이드.
2. 하기식 2(배열표의 배열번호 2)의 아미노산 배열을 함유함을 특징으로 하는신규 폴리펩타이드.
3. 하기식 3(배열표의 배열번호 3)의 아미노산 배열을 함유함을 특징으로 하는신규 폴리펩타이드.
4. 하기식 4(배열표의 배열번호 4)의 아미노산 배열을 가짐을 특징으로 하는 신규 폴리펩타이드.
5. 하기식 5(배열표의 배열번호 5)의 아미노산 배열을 함유함을 특징으로 하는 신규 폴리펩타이드.
6. 하기식 6(배열표의 배열번호 6)의 아미노산 배열을 함유함을 특징으로 하는신규 폴리펩타이드.
7. 하기식 7(배열표의 배열번호 7)의 아미노산 배열을 함유함을 특징으로 하는 신규 폴리펩타이트.
8. 하기식 8(배열표의 배열번호 8)의 아미노산 배열을 가짐을 특징으로 하는 신규 폴리펩타이드,
9. 28 ℃의 온도에서 18 시간동안 50% 포름아미드, 1×덴하르트 용액, 0.1% SDS, 100 mg/㎖의 변성 연어 정자 DNA 및 10%(w/v) 황산덱스트란을 함유하는 5×SSCP 용액에서 하이브리드화시킨 후, 실온에서 0.1% SDS를 함유하는 2×SSCP로 2 회 세척하고 37 ℃의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 0.3×SSCP로 3 회 세척하는 것을 포함하는 조건하에서, 배열번호 1, 5 및 26에 의해 표시되는 아미노산 배열의 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 배열을 코드화하는 누클레오티드배열의 상보쇄와 하이브리드화할 수 있는 누클레오티드 배열에 의해 코드화되는 아미노산 배열을 포함하고,

   a) Fas 항원에 결합할 수 있고,

   b) Fas 항원-발현 세포의 고사(apoptosis)를 유도하거나 억제하며,

   c) Fas 리간드에 대한 항체를 유도하는 것

   으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 활성을 갖는 폴리펩타이드.
10. 28 ℃의 온도에서 18 시간동안 50% 포름아미드, 1×덴하르트 용액, 0.1% SDS, 100 mg/㎖의 변성 연어 정자 DNA 및 10%(w/v) 황산덱스트란을 함유하는 5×SSCP 용액에서 하이브리드화시킨 후, 실온에서 0.1% SDS를 함유하는 2×SSCP로 2 회 세척하고 37 ℃의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 0.3×SSCP로 3 회 세척하는 것을 포함하는 조건하에서, 배열번호 13, 17 및 101에 의해 표시되는 누클레오티드 배열의 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 누클레오티드 배열의 상보쇄와 하이브리드화할 수 있는 누클레오티드 배열에 의해 코드화되는 아미노산 배열을 포함하고,

    a) Fas 항원에 결합할 수 있고,

    b) Fas 항원-발현 세포의 고사를 유도하거나 억제하며,

    c) Fas 리간드에 대한 항체를 유도하는 것

    으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 활성을 갖는 폴리펩타이드.
11. 제1항 내지 10항 중의 어느 하나에 있어서, Fas 항원에 결합하는 폴리펩타이드.
12. 제1항 내지 10항 중의 어느 하나에 있어서, Fas 항원을 발현하는 세포에 대해서 고사를 유도하는 활성을 갖는 폴리펩타이드.
13. 제1항 내지 10항 중의 어느 하나에 있어서, 재조합형 폴리펩타이드인 신규 폴리펩타이드.
14. 배열번호 4 또는 26에 의해 표시되는 아미노산 배열로부터 선택되는 적어도 10 개의 연속된 아미노산을 포함하고,

    a) Fas 항원에 결합할 수 있고,

    b) Fas 항원-발현 세포의 고사를 유도하거나 억제하며,

    c) Fas 리간드에 대한 항체를 유도하는 것

    으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 활성을 갖는 폴리펩타이드.
15. 배열번호 8에 의해 표시되는 아미노산 배열로부터 선택되는 적어도 10 개의연속된 아미노산을 포함하고,

    a) Fas 항원에 결합할 수 있고,

    b) Fas 항원-발현 세포의 고사를 유도하거나 억제하며,

    c) Fas 리간드에 대한 항체를 유도하는 것

    으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 활성을 갖는 폴리펩타이드.
16. 제14항 또는 15항에 따른 폴리펩타이드가 2 종류 이상 융합하여 이루어지는 융합 폴리펩타이드.
17. 제14항 또는 15항에 있어서, Fas 항원과 결합하는 폴리펩타이드.
18. 제1항 내지 10항, 14항, 15항 중 어느 하나의 신규 폴리펩타이드를 코드화하는 염기배열을 함유함을 특징으로 하는 신규 DNA.
19. 제18항에 있어서, 상기 DNA가 하기식 13(배열표의 배열번호 13)의 염기배열을 함유하는 신규 DNA.
20. 제18항에 있어서, 상기 DNA가 하기식 14(배열표의 배열번호 14)의 염기배열을 함유하는 신규 DNA.
21. 제18항에 있어서, 상기 DNA가 하기식 15(배열표의 배열번호 15)의 염기배열을 갖는 신규 DNA.
22. 제18항에 있어서, 상기 DNA가 하기식 16(배열표의 배열번호 16)의 염기 배열을 함유하는 신규 DNA.
23. 제18항에 있어서, 상기 DNA가 하기식 17(배열표의 배열번호 17)의 염기배열을 함유하는 신규 DNA.
24. 제18항에 있어서, 상기 DNA가 하기식 18(배열표의 배열번호 18)의 염기배열을 포함하는 신규 DNA.
25. 제18항에 있어서, 상기 DNA가 하기식 19(배열표의 배열번호 19)의 염기배열을 함유하는 신규 DNA.
26. 제18항에 있어서, 상기 DNA가 하기식 20(배열표의 배열번호 20)의 염기배열을 함유하는 신규 DNA.
27. 배열번호 16 또는 101에 의해 표시되는 누클레오티드 배열로부터 선택되는 적어도 15 개의 연속된 누클레오티드를 포함하고, Fas 리간드를 코드화하는 핵산을 검출하거나 증폭시키기 위한 프로브나 프라이머로 사용될 수 있는 DNA.
28. 배열번호 20에 의해 표시되는 누클레오티드 배열로부터 선택되는 적어도 15개의 연속된 누클레오티드를 포함하고, Fas 리간드를 코드화하는 핵산을 검출하거나 증폭시키기 위한 프로브나 프라이머로 사용될 수 있는 DNA.
29. 28 ℃의 온도에서 18 시간동안 50% 포름아미드, 1×덴하르트 용액, 0.1% SDS, 100mg/㎖의 변성 연어 정자 DNA 및 10%(w/v) 황산덱스트란을 함유하는 5×SSCP 용액에서 하이브리드화시킨 후, 실온에서 0.1% SDS를 함유하는 2×SSCP로 2 회 세척하고 37 ℃의 온도에서 0.1% SDS를 함유하는 0.3×SSCP로 3 회 세척하는 것을 포함하는 조건하에서, 배열번호 13, 17 및 101에 의해 표시되는 누클레오티드 배열의 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 누클레오티드 배열의 상보쇄와 하이브리드화할 수 있고, Fas 리간드를 코드화하는 DNA.
30. 제18항에 따르는 신규 DNA를 포함함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
31. 제18항에 따르는 DNA로 형질전환된 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 인간을 제외한 포유동물세포, 곤충세포 또는 효모세포.
32. 제30항에 따르는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 대장균, 바실러스 서브틸리스, 인간을 제외한 포유동물세포, 곤충세포 또는 효모세포.
33. 제30항 또는 32항에 따르는 세포를 배양하고, 그 배양혼합물로부터 제1항 내지 10항, 14항, 15항중 어느 하나에 따르는 폴리펩타이드를 회수, 정제함을 특징으로 하는 제1항 내지 10항, 14항, 15항 중 어느 하나에 따르는 폴리펩타이드의 제조방법.
34. 제1항 내지 10항, 14항, 15항 중 어느 하나에 따르는 신규 폴리펩타이드를 함유하는 시료중에서 그 신규 폴리펩타이드를 정제하는 방법에 있어서, 적어도 하기 공정중에서 선택되는 하나 이상의 정제공정을 행함을 특징으로 하는 제1항 내지 10항, 14항, 15항 중 어느 하나에 따르는 신규 폴리펩타이드의 정제방법.

    (1) Fas 항원을 사용한 친화성 크로마토그래피

    (2) 제1항 내지 10항, 14항, 15항 중 어느 하나의 신규 폴리펩타이드를 인식하는 항체를 사용한 친화성 크로마토그래피.
35. 제1항 내지 10항, 14항, 15항 중 어느 하나에 따르는 신규 폴리펩타이드를 인식함을 특징으로 하는 신규 항체.
36. 제35항에 있어서, 모노클로날 항체인 신규 항체.
37. 제35항에 있어서, 폴리클로날 항체인 신규 항체.
38. 제35항에 있어서, Fas 항원을 발현하는 세포의 고사를 억제하는 효과를 갖는 신규 항체.
39. 배열번호 13 내지 20, 25 내지 27 및 배열번호 31에 의해 표시되는 누클레오티드 배열중 어느 하나에 상보적인 적어도 15 개의 연속된 누클레오티드를 포함하고, Fas 리간드의 발현을 조절하거나 Fas 리간드의 발현을 억제할 수 있는 올리고누클레오티드; 또는 그의 골격구조에 포스포디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, 포스포트리에스테르 결합, 메틸포스포네이트 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합 또는 모르폴리노 그룹을 갖는 유도체; 또는, 당 부위가 변형되거나 다른 물질로 치환된 유도체; 또는, 어느 염기가 이노신으로 치환된 유도체; 또는, 콜레스테롤, 아크리딘, 폴리-L-라이신, 소랄렌, 또는 장쇄 알킬이 올리고누클레오티드의 5'- 또는 3'-말단이나 내부에 연결되어 있는 유도체.
40. 제1항 내지 10항, 14항, 15항중 어느 하나에 따르는 신규 폴리펩타이드 또는 그를 발현하는 형질전환체를 사용함을 특징으로 하는 Fas 리간드에 관련된 물질 또는 Fas 항원에 관련된 물질의 스크리닝 방법.
41. 제40항에 있어서, 제1항 내지 10항, 14항, 15항중 어느 하나에 따르는 신규 폴리펩타이드 또는 그를 발현하는 형질전환체 및 Fas 항원 또는 Fas 항원을 발현하는 세포를 사용함을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
42. 제40항에 있어서, Fas 리간드에 결합하는 물질, Fas 리간드의 발현을 조절하는 물질, Fas 항원의 발현을 조절하는 물질 및 Fas 리간드의 표적세포에 대한 작용을 조절하는 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 물질을 스크리닝하는 스크리닝 방법.
43. 제40항에 있어서, 하기의 (1) 내지 (3)중 어느 하나로부터 선택되는 공정을 포함하는 스크리닝 방법.

    (1) a. Fas 항원을 발현하는 세포를 제1항 내지 10항, 14항, 15항중 어느 하나에 따르는 폴리펩타이드, 그를 발현하는 형질전환체 및 그의 배양상등액으로 이루어지는 군에서 선택된 물질과 함께 배양하고,

    b. a에 피험물질 또는 피험물질을 포함하는 시료를 첨가하고,

    c. Fas 항원을 발현하는 세포의 생사, 형태적 변화 또는 생화학적 변화중 적어도 어느 하나를 측정한다.

    (2) a. 피험물질 또는 피험물질을 포함하는 시료를 제1항 내지 10항, 14항 및 15항중 어느 하나에 따르는 신규 폴리펩타이드, 그를 발현하는 형질전환체 및 그의 배양상등액으로 이루어지는 군에서 선택된 물질과 배양하고,

    b. a에 Fas 항원을 발현하는 세포를 가하여 배양하고,

    c. Fas 항원을 발현하는 세포의 생사, 형태적 변화 또는 생화학적 변화중 적어도 어느 하나를 측정한다.

    (3) a. 피험물질 또는 피험물질을 포함하는 시료를 Fas 항원을 발현하는 세포와 배양하고,

    b. a에 제1항 내지 10항, 14항, 15항중 어느 하나의 신규 폴리펩타이드, 그를 발현하는 형질전환체 및 그의 배양상등액으로 이루어지는 군에서 선택된 물질을 가하여 배양하고,

    c. Fas 항원을 발현하는 세포의 생사, 형태적 변화 또는 생화학적 변화중 적어도 어느 하나를 측정한다.
44. 배열번호 26에 나타내어진 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩타이드.
45. 배열번호 101에 나타내어진 누클레오티드 배열을 포함하는 DNA.
46. 아미노산 배열의 돌연변이가 하나 이상의 임의의 위치에서 일어나고, Fas 항원-발현 세포의 고사를 유도 또는 억제하거나 Fas 항원에 결합할 수 있는 배열번호 1 내지 8 및 26중 어느 하나에 의해 나타내어지는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩타이드.