ES2262195T3 - Proteinas rdgb. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO DE UN ORGANISMO QUE PRESENTA UNA ENFERMEDAD O ESTADO CARACTERIZADO POR UNA ANOMALIA EN EL MECANISMO DE TRANSDUCCION DE UNA SEÑAL, COMPRENDIENDO DICHO MECANISMO UNA PROTEINA RDGB. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A PROCEDIMIENTOS DE DIAGNOSTICO DE DICHAS ENFERMEDADES Y A PROCEDIMIENTOS DE SELECCION DE AGENTES QUE PUEDEN SER UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE DICHAS ENFERMEDADES. TAMBIEN SE DESCRIBEN ACIDOS NUCLEICOS AISLADOS Y/O PURIFICADOS QUE CODIFICAN PARA UNA PROTEINA RDGB.

Description

Proteínas rdgB.

La presente invención se refiere en general a proteínas rdgB identificadas recientemente y a productos afines y métodos.

Antecedentes de la invención

El siguiente debate de los antecedentes de la invención y las referencias que se citan no se admite que sean técnica anterior de la invención.

La transducción de señales celulares es un mecanismo fundamental por el que los estímulos externos que regulan diversos procesos celulares se transmiten al interior de las células. Uno de los mecanismos bioquímicos fundamentales de la transducción de señales implica la fosforilación reversible de los restos tirosina de las proteínas. El estado de fosforilación de una proteína se modifica por las acciones recíprocas de las tirosina-fosfatasas (TP) y tirosina-quinasas (TK), incluidas las tirosina-quinasas de receptor y las tirosina-quinasas de no receptor.

En la solicitud de patente EE.UU. que lleva el número de serie 08/460 626, depositada con fecha 2 de junio de 1995, que es la solicitud en parte continuación de la solicitud de patente de EE.UU. que lleva el número de serie 08/357 642, depositada con fecha 15 de diciembre de 1994, se describe una tirosina-proteína-quinasa llamada PYK2; ambas solicitudes se incorporan a la presente como referencia en su totalidad, incluidas las figuras. La PYK2 contiene un dominio de extremo N, un dominio catalítico, dos regiones ricas en prolina, regiones de fijación potenciales de homología Src 2 (SH2) y una región homóloga del dominio de diana de adhesión focal.

Vithelic y col. describen en J. of Cell Biology 122, 1013-1022, 1993, un tipo de proteína encontrado en la
Drosophila, llamada proteína B de degeneración retínica de la Drosophila (rdgB). Sin embargo, la secuencia descrita en esta referencia contiene un error de secuenciación con un codón de paro falso y por ello los autores no se dieron cuenta de que la rdgB de la Drosophila contiene un dominio de fijación PYK-2. Además, la secuencia se identificó de modo incorrecto como miembro de la familia de dominios transmembrana 6 de las proteínas. Estas proteínas rdgB funcionan en muchas células sensoriales y neuronales de la mosca y están directamente asociadas con la visión de la mosca.

La secuencia de un clon genómico de una porción de la C. elegans se ha introducido en un banco de datos computerizado y (aunque no se le ha prestado atención) esta secuencia contiene una secuencia rdgB con intrones. Por lo tanto, el banco de datos GENEBANK contiene datos no elaborados de la secuencia de nucleótidos de una serie de clones genómicos de la C. elegans. Utilizando porciones de la secuencia de la rdgB humana, la presente invención identifica un marco de lectura abierto que hasta el momento no se había reconocido. Por consiguiente, la rdgB se ha encontrado segregada en 14 exones de dos cósmidos separados, el C54C6 (assc. nº Z77131) y el MO1F1 (assc. nº Z46381).

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos rdgB, a ácidos nucleicos que codifican a estos polipéptidos, células, tejidos y animales que contienen tales polipéptidos, anticuerpos de tales polipéptidos, ensayos que utilizan dichos polipéptidos y métodos relacionados con todo lo recién mencionado. Estos polipéptidos rdgB intervienen en varios mecanismos de transducción de señales y por ello la presente invención proporciona diversos agentes y métodos útiles para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de varias enfermedades o estados patológicos asociados con las anomalías de estos mecanismos.

La presente invención se basa en parte en la identificación y el aislamiento de una serie de nuevas moléculas de fijación de tirosina-quinasas de no receptor, llamadas hrdgB1, hrdgB2 y hrdgB3. Las secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa que codifican estas proteínas se definen en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de longitud completa se definen en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente. En general, las RDGB constan de 3 dominios estructurales. Los dominios PIT del extremo N que se describe en esta solicitud tienen aproximadamente un 45% de identidad de aminoácidos con la PPI1 y la PPI2 humanas. Los dominios PIT de la RDGB2 y de la RDGB3 (la RDGB1 carece de dominio PIT) tienen aproximadamente un 72% de identidad centre sí y aproximadamente un 62-65% de identidad con las rdgB de la Drosophila y de la C. elegans. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de la C. elegans se define en la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa de la Drosophila se define en la SEQ ID NO: 8 y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la Drosophila se define en la SEQ ID NO: 9. Los dominios PIT de las rdgB tienen un motivo de fijación ATP putativo conservado, similar al que se encuentra en las proteína-quinasas.

El segundo dominio central está presente en todas las rdgB humanas descritas en esta solicitud y no tiene homología de secuencia con ningún otro dominio conocido. Las tres rdgB humanas comparten un 43-47% de identidad a lo largo del tramo de 600 a 675 aminoácidos y presentan un 25-35% de identidad con las rdgB de los invertebrados. Estos dominios grandes contienen tres subdominios con una identidad mucho mayor (66-88% en las rdgB humanas y 35-75% con las rdgB de los invertebrados). Este nivel elevado de conservación, en especial a través de un abanico tan amplio de especies, sugiere que estos tramos tienen un papel funcional importante. La porción del extremo N del dominio central es una región ácida conservada de 10 a 15 aminoácidos, que consta casi exclusivamente de restos glutamato y aspartato, que pueden actuar como un motivo de fijación del calcio.

El tercer dominio de la rdgB es particularmente único en estas proteínas y consta de un extremo C de 343 a 384 restos de las proteínas. Hay un 60-63% de identidad entre las rdgB humanas y un 40-60% con las rdgB de los invertebrados. La comparación con la rdgB de la Drosophila se basa en el conocimiento único de este dominio y su significado funcional, tal como se describe aquí. La secuencia publicada contenía una mutación de desplazamiento de marco, de modo que la proteína se pensaba anteriormente que terminaba a menos de la mitad de camino de este dominio. Por comparación con las secuencias humanas, la presente invención proporciona una secuencia que se extiende más allá del término de la secuencia de la Drosophila, para incluir los aminoácidos 1054-1249.

Dentro del dominio de fijación PYK2 hay un motivo distinto que tiene homología de secuencia primaria con la región de fijación de nucleótidos de las proteínas que fijan GTP relacionadas con el ras. Todos los miembros de esta familia (ras, rho, rac, rab, ran) contienen una secuencia caracterizada por la secuencia de aminoácidos conservada hidrófobo-hidrófobo-G-X-K-X-D-hidrófobo. El motivo G-X-K está en las rdgB en el aminoácido (aa) 614 (rdgB1), aa 898 (rdB2), aa 983 (rdgB3) y aa 987 (dm). Basándose en los análisis de la estructura tridimensional (por cristalografía de rayos X) de esta región desde el ras al ran, este motivo abraza el anillo nucleótido de GDP/GTP como parte de la conmutación molecular "marcha-paro" de estas proteínas. Sin embargo, las rdgB carecen del bucle p en sentido ascendente (upstream) o caja A (A-box), presente en estas G-proteínas pequeñas.

Las proteínas rdgB intervienen en los mecanismos clave de transducción de señales relacionados con la señalización de neurotransmisores. Esto se basa en parte en el reconocimiento de la existencia y de la importancia de los dominios hallados en las proteínas rdgB (ver figura 1). Por ejemplo, los ensayos descritos en la presente solicitud demuestran que las proteínas rdgB contienen un dominio de fijación PYK2. Se cree que el PYK es el causante de la regulación de la señalización de neurotransmisores. Las proteínas rdgB contienen además un dominio PIT, que en la Drosophila interviene en la transferencia de PI. La transferencia de PI en los humanos interviene en el reciclado de vesículas sinápticas. Por lo tanto, en vista de los roles del dominio de fijación PYK2 y del dominio PIT, las proteínas rdgB pueden ser útiles para el tratamiento de estados patológicos del sistema nervioso a través de la ampliación o de la inhibición de tal señalización.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención describe un ácido nucleico aislado, purificado, enriquecido o recombinante, que codifica a un polipéptido rdgB. Tal ácido nucleico codifica con preferencia un polipéptido rdgB de mamífero y codifica con mayor preferencia un polipéptido rdgB humano.

Se entiende por "aislado" en referencia a un ácido nucleico aquel polímero de 2 nucleótidos (con preferencia 21, con mayor preferencia 39, con preferencia especial 75) o más nucleótidos conjugados entre sí, incluidos el DNA y el RNA, que se aísla a partir de una fuente natural o que se sintetiza. El ácido nucleico aislado de la presente invención es único en el sentido de que no se encuentra en la naturaleza en estado puro ni separado. El uso del término "aislado" indica que se ha quitado una secuencia de origen natural de su entorno celular normal. Por lo tanto, la secuencia puede estar en una solución sin células o colocada en un entorno celular diferente. El término no implica que la secuencia sea la única cadena de nucleótido presente, pero indica que es la secuencia predominante presente (por lo menos en un 10 - 20% más que cualquier otra secuencia de nucleótido) y está esencialmente exenta (pureza por lo menos del 90 - 95%) de material no nucleótido que pueda estar naturalmente asociado con ella. Por consiguiente, el término no abarca un cromosoma aislado que codifique a uno o a varios polipéptidos rdgB.

Con el uso del término "enriquecido" en relación con un ácido nucleico se indica que la secuencia concreta de DNA o RNA constituye una función significativamente mayor (de 2 a 5 veces) del DNA o RNA total presente en las células o en la solución de interés que en las células normales o enfermas o en las células de las que se ha tomado la secuencia. Esto puede lograrlo una persona mediante la reducción preferencial de la cantidad de otros DNA o RNA presentes o por un incremento preferencial de la cantidad de la secuencia del DNA o del RNA específicos o por combinación de las dos cosas. Sin embargo, cabe señalar que enriquecido no implica que no estén presentes otras secuencias de DNA o RNA, sino que precisamente la cantidad relativa de la secuencia de interés se ha aumentado significativamente en una manera útil y con preferencia separada de una biblioteca de secuencias. El término significativo que se emplea aquí indica que el nivel del incremento es útil para la persona que efectúa tal incremento y significa en general un incremento con respecto a otros ácidos nucleicos por lo menos de 2 veces, con mayor preferencia de 5 a 10 veces o incluso más. El término tampoco implica que no haya DNA o RNA de otras fuentes. Las otras fuentes de DNA pueden ser, por ejemplo, el DNA procedente de una levadura o de un genoma bacteriano, o un vector de clonación, por ejemplo el pUC19. Este término distingue entre acontecimientos de tipo natural, por ejemplo una infección vírica o crecimientos de tipo tumoral, en los que el nivel de un mRNA puede aumentar naturalmente con respecto a otras especies de mRNA. Es decir, se pretende que el término abarque únicamente aquellas situaciones en las que una persona ha intervenido para elevar la proporción del ácido nucleico deseado.

Para algunos fines es ventajoso además que una secuencia de nucleótidos esté en forma purificada. El término "purificado" en relación con un ácido nucleico no requiere una pureza absoluta (tal es el caso, por ejemplo, de una preparación homogénea); basta con que contenga una indicación de que la secuencia es relativamente más pura que en el entorno natural (comparado con el nivel natural, este nivel debería ser por lo menos 2-5 veces mayor, p.ej. en términos de mg/ml). Los clones individuales aislados de una biblioteca de cDNA pueden purificarse hasta una homogeneidad electroforética. Las moléculas de DNA reivindicadas obtenidas a partir de estos clones pueden obtenerse directamente a partir de DNA total o de RNA total. Los clones cDNA no son de origen natural, pero pueden obtenerse con preferencia por manipulación de una sustancia de origen natural parcialmente purificada (RNA mensajero). La construcción de una biblioteca de cDNA a partir de mRNA implica la creación de una sustancia sintética (cDNA) y clones cDNA individuales puros que pueden aislarse de la biblioteca sintética por selección clónica de las células que llevan la biblioteca de cDNA. Por lo tanto, el proceso que implica la construcción de una biblioteca de cDNA a partir del mRNA y el aislamiento de distintos clones de cDNA proporciona una purificación aproximadamente 10^{6} veces del mensaje nativo. Por ello, está expresamente contemplada la purificación por lo menos de un orden de magnitud, con preferencia de dos o de tres órdenes, y con mayor preferencia de cuatro o de cinco órdenes.

Se entiende por "polipéptido rdgB" 9 o más aminoácidos contiguos, definidos mediante la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. Los polipéptidos rdgB pueden codificarse con secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa o con cualquier porción de una secuencia de ácido nucleico de longitud completa, en una longitud suficiente para conservar la actividad funcional del polipéptido. Las actividades funcionales preferidas incluyen la capacidad de fijarse sobre la porción N-terminal de la PYK2. Por ejemplo, la presente invención abarca los dominios aislados de mutantes de deleción y las secuencias complementarias capaces de hibridarse con proteínas rdgB de longitud completa en condiciones restrictivas de hibridación.

En formas preferidas de ejecución, el ácido nucleico aislado comprende, consta esencialmente de o consta de una secuencia de ácido nucleico definida en las secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o por lo menos 27, 30, 45, 60 ó 90 nucleótidos contiguos de las mismas, o consta por lo menos de 9, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 200 ó 300 aminoácidos contiguos de un polipéptido rdgB.

Se entiende por "comprende" que incluye, pero no se limita a, sea cual sea lo que sigue después de la palabra "comprende". Por lo tanto, el uso del término "comprende" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligados, pero que hay otros elementos que son opcionales y pueden estar presentes o no. Se entiende por "consta de" que incluye y se limita a, sea cual sea la continuación de la frase "consta de". Por lo tanto, la frase "consta de" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligados y que no puede estar presente ningún otro elemento. Con "consta esencialmente de" se indica que se incluyen los elementos enumerados a continuación y se limita a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o a la acción especificada en la descripción para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase "consta esencialmente de" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligados, pero que hay otros elementos opcionales que pueden estar presentes o no, dependiendo de si afectan o no a la actividad o la acción de los elementos enumerados.

Las composiciones y sondas de la presente invención pueden contener ácidos nucleicos humanos que codifican un polipéptido rdgB, pero están sustancialmente libres de ácidos nucleicos que no codifican a los polipéptidos rdgB. El ácido nucleico humano que codifica a un polipéptido rdgB tiene por lo menos 18 bases contiguas de la secuencia de nucleótido descrita en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 y se hibridará selectivamente con un DNA genómico humano que codifica a un polipéptido rdgB o será complementario de tal secuencia. El ácido nucleico puede aislarse de una fuente natural por clonación con cDNA o por hibridación sustractiva; la fuente natural puede ser sangre, semen y tejido de varios organismos, incluidos eucariotas, mamíferos, aves, peces, plantas, gorilas, macacos de la India (rhesus monkey), chimpancés y humanos; y el ácido nucleico puede sintetizarse por el método del triéster o utilizando un sintetizador automatizado de DNA. En otras formas preferidas adicionales, el ácido nucleico es una región conservada o única, por ejemplo la que sea útil para el diseño de sondas de hibridación para facilitar la identificación y la clonación de polipéptidos adicionales, el diseño de sondas para la PCR para facilitar la clonación de polipéptidos adicionales y la obtención de anticuerpos contra regiones de polipéptidos.

Se entiende por "regiones conservadas de ácidos nucleicos" las regiones presentes en dos o más ácidos nucleicos, que codifican a un polipéptido rdgB, con las que puede hibridarse una secuencia concreta de ácido nucleico en condiciones de restricción baja. Los ejemplos de condiciones de restricción baja, idóneas para la exploración de ácidos nucleicos que codifican a polipéptidos rdgB se pueden encontrar en Abe y col., J. Biol. Chem. 19, 13361, 1992 (que se incorpora a la presente en su totalidad, incluidas las figuras, como referencia). Las regiones conservadas difieren con preferencia como máximo en 7 entre 20 nucleótidos.

Se entiende por "región única de ácido nucleico" una secuencia presente en un ácido nucleico de longitud completa, que codifica a un polipéptido rdgB, que no está presente en una secuencia que codifica a ningún otro polipéptido de origen natural. Tales regiones contienen con preferencia 12 ó 20 nucleótidos contiguos, presentes en ácidos nucleicos de longitud completa que codifican a un polipéptido rdgB.

La invención se refiere además a una sonda de ácido nucleico para la detección de un polipéptido rdgB o un ácido nucleico que codifica a un polipéptido rdgB de una muestra. La sonda de ácido nucleico contiene el ácido nucleico que se hibridará por lo menos con una secuencia definida en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

En las formas de ejecución preferidas, la sonda de ácido nucleico se hibrida con ácido nucleico que codifica por lo menos 12, 27, 30, 35, 40, 50, 100, 200 ó 300 aminoácidos contiguos de la secuencia de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. Pueden utilizarse diversas condiciones de restricción baja o alta, en función de la especificidad y de la selectividad deseadas.

Se entiende por "condiciones de hibridación de restricción alta" aquellas condiciones de hibridación que: (1) emplean fuerza iónica baja y temperatura elevada para el lavado, por ejemplo NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/SDS del 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizador, por ejemplo la formamida, por ejemplo formamida del 50% (vol/vol) con un 0,1% de albúmina de suero bovino/un 1% de Ficoll/un 0,1% de polivinilpirrolidona/tampón fosfato sódico 50 mM, a pH 6,5, con NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida del 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, pirofosfato sódico 0,075 M, 5 x solución de Denhardt, DNA de esperma de salmón tratado con ultrasonidos (50 g/ml), SDS del 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y SDS del 0,1%. En condiciones de hibridación restrictivas solamente se hibridan las secuencias complementarias de ácido nucleico. Tales condiciones impiden con preferencia la hibridación de ácidos nucleicos que tienen 1 ó 2 apareamientos incorrectos entre 20 nucleótidos contiguos.

Los métodos para utilizar las sondas incluyen la detección de la presencia o de una cantidad de RNA de rdgB en una muestra poniendo en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico en condiciones tales que tenga lugar una hibridación y detectando la presencia o la cantidad de la sonda que se ha fijado sobre el RNA de rdgB. El dúplex de ácido nucleico formado entre la sonda y la secuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido rdgB puede utilizarse para la identificación de la secuencia del ácido nucleico detectado (véase por ejemplo Nelson y col., en Nonisotopic DNA Probe Techniques, p. 275, Academic Press, San Diego (coordinador: Kricka), 1992, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad, incluidas las figuras). Pueden construirse kits para llevar a la práctica dichos métodos, estos kits incluyen un recipiente en el que se ha depositado una sonda de ácido nucleico.

La invención se refiere además a un ácido nucleico recombinante, con preferencia en una célula o en un organismo. El ácido nucleico recombinante puede contener una secuencia definida en la SEQ ID NO: 1 y un vector o un promotor eficaz para iniciar la transcripción en la célula hospedante. Como alternativa, el ácido nucleico recombinante puede contener una región de iniciación de transcripción funcional en una célula, una secuencia complementaria a la secuencia de RNA que codifica a un polipéptido rdgB y una región de terminación de transcripción funcional en una célula.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido rdgB aislado, enriquecido o purificado.

Se entiende por "aislado" referido a un polipéptido un polímero de 2 aminoácidos (con preferencia 7, con mayor preferencia 13, con preferencia especial 25) o más conjugados entre sí, incluidos los polipéptidos que se aíslan a partir de una fuente natural o que se han obtenido por síntesis. Los polipéptidos aislados de la presente invención son únicos en el sentido de que no se encuentran en la naturaleza en estado puro ni separado. El uso del término "aislado" indica que se ha quitado una secuencia de origen natural de su entorno celular normal. Por ello, la secuencia puede estar en una solución libre de células o estar colocada en un entorno celular diferente. El término no implica que la secuencia sea la única cadena de aminoácidos que está presente, pero sí que sea la secuencia predominante presente (por lo menos un 10 - 20% más que cualquier otra secuencia) y esté esencialmente libre (pureza del 90 - 95%, por lo menos) de material no aminoácido naturalmente asociado con ella.

Con el uso del término "enriquecido" referido a un polipéptido se indica que la secuencia concreta de aminoácidos constituye una fracción significativamente más alta (de 2 a 5 veces) del total de aminoácidos presentes en las células o la solución de interés que en células normales o enfermas o en células, de las que se tomado la secuencia. Esto podría realizarlo una persona por reducción preferente de la cantidad de otros aminoácidos presentes, o por aumento preferente de la cantidad de la secuencia concreta de aminoácidos de interés, o por combinación de ambas cosas. Sin embargo, cabe señalar que enriquecido no implica que no estén presentes otras secuencias de aminoácidos, sino que la cantidad relativa de la secuencia de interés ha sufrido un aumento significativo. El término significativo se emplea aquí para indicar que el nivel del aumento es útil para la persona que está realizando tal aumento y significa en general un aumento con respecto a otros aminoácidos del orden por lo menos 2 veces, con mayor preferencia por lo menos de 5 a 50 veces o incluso más. El término tampoco implica que no haya aminoácidos de otras fuentes. Las demás fuentes de aminoácidos pueden comprender, por ejemplo, los aminoácidos codificados por una levadura o un genoma bacteriano, o un vector de clonación, por ejemplo el pUC19. Con este término se pretende abarcar aquellas situaciones en las que se ha intervenido para elevar la proporción del aminoácido deseado.

Para algunos fines es también ventajoso que una secuencia de aminoácidos esté en forma purificada. El término "purificado" referido a un polipéptido no requiere que la pureza sea absoluta (caso de una preparación homogénea); sino que contiene la indicación de que la secuencia es relativamente más pura que en el entorno natural (comparado con el nivel natural, este nivel debería ser por lo menos 2-5 veces mayor, p.ej. en términos de mg/ml). Se contempla expresamente la purificación de por lo menos un orden magnitud, con preferencia de dos o tres órdenes, y con mayor preferencia de cuatro o cinco órdenes de magnitud. La sustancia está con preferencia libre de contaminación en un nivel funcionalmente significativo, p.ej. tiene una pureza del 90%, 95% o 99%.

En las formas preferidas de ejecución, los polipéptidos rdgB contienen por lo menos 9, 10, 15, 20 ó 30 aminoácidos contiguos de la secuencia de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un anticuerpo purificado (p.ej. un anticuerpo monoclonal o policlonal), que tiene afinidad de fijación específica sobre un polipéptido rdgB. El anticuerpo contiene una secuencia de aminoácidos que es capaz de fijarse específicamente sobre un polipéptido rdgB.

Se entiende por "afinidad de fijación específica" que el anticuerpo se fijará sobre un polipéptido hrdgB en una determinada cantidad detectable, pero que no se fijará sobre otros polipéptidos en la misma medida, en condiciones idénticas. La presente invención abarca también los anticuerpos que pueden distinguir el hrdgB1 del hdrgB2 o del hrdgB3 o que pueden distinguir entre varios rdgB.

Los anticuerpos que tienen afinidad de fijación específica sobre polipéptidos rdgB pueden utilizarse en métodos de detección de la presencia y/o de la cantidad de un polipéptido rdgB en una muestra poniendo en contacto la muestra con el anticuerpo en condiciones tales que se forme un complejo inmune y detectando la presencia y/o la cantidad del anticuerpo conjugado con el polipéptido rdgB. Los kits de diagnóstico para aplicar tales métodos pueden construirse de modo que incluyan un primer recipiente que contiene el anticuerpo y un segundo recipiente que contiene un conjugado de un reactivo de fijación del anticuerpo y un marcador.

En otro aspecto, la invención se refiere a un hibridoma que produce un anticuerpo que tiene afinidad de fijación específica a un polipéptido rdgB.

Se entiende por "hibridoma" una línea celular inmortalizada que es capaz de segregar un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo rdgB.

En las formas de ejecución preferidas, el anticuerpo rdgB consta de una secuencia de aminoácidos que es capaz de fijarse específicamente a un polipéptido rdgB.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para detectar la presencia o la cantidad de un compuesto capaz de fijarse a un polipéptido rdgB. El método consiste en incubar el compuesto con un polipéptido rdgB y detectar la presencia o la cantidad de compuesto que se fijado al polipéptido rdgB.

En las formas preferidas de ejecución, el compuesto inhibe la actividad del rdgB. La presente invención se refiere además a compuestos capaces de fijar y de inhibir el polipéptido rdgB, que se identifican mediante los métodos descritos anteriormente.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de exploración de agentes potenciales, útiles para el tratamiento de una enfermedad o estado patológico caracterizados por una anomalía en el mecanismo de transducción de señales, que contiene una interacción entre un polipéptido rdgB y un reactivo de fijación natural (NBP). El método consiste en ensayar los agentes potenciales para comprobar los que son capaces de promover o interrumpir la interacción, como indicación de un agente útil.

Se entiende por "exploración" la investigación de un organismo para esclarecer si posee o carece de una propiedad. El proceso puede consistir en medir o detectar varias propiedades, incluido el nivel de transducción de señales y el nivel de interacción entre un polipéptido rdgB y un NBP.

Se entiende por "enfermedad o estado patológico" un estado de un organismo, p.ej. humano, que los miembros de la comunidad reconocen como anormal. La enfermedad o estado patológico puede caracterizarse por una anomalía en uno o en varios mecanismos de transducción de señales en una célula, con preferencia una célula que figure en el listado de la tabla 1, en el que uno de los componentes del mecanismo de transducción de señales es un polipéptido rdgB o un NBP.

Las enfermedades o trastornos específicos que pueden tratarse o prevenirse, en base a las células afectadas, incluyen: la miastenia grave; el neuroblastoma; los trastornos causados por toxinas neuronales, por ejemplo la toxina del cólera, la toxina de la tos ferina (pertusis) o el veneno de serpientes; la mielosis megacariocítica aguda; la trombocitopenia; las del sistema nervioso central, por ejemplo las crisis convulsivas, la apoplejía, el traumatismo craneal, las lesiones de médula espinal, las lesiones de células nerviosas inducidas por hipoxia, por ejemplo el paro cardíaco o el agotamiento neonatal, la epilepsia, las enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson, la demencia, la tensión muscular, la depresión, la ansiedad, el trastorno de pánico, el trastorno compulsivo-obsesivo, el trastorno de estrés post-traumático, la esquizofrenia, el síndrome neuroléptico maligno y el síndrome de Tourette. Los estados patológicos que pueden tratarse con los inhibidores de rdgB incluyen la epilepsia, la esquizofrenia, la hiperactividad extrema de los niños, el dolor crónico y el dolor agudo. Son ejemplos de estados patológicos que pueden tratarse con amplificadores del mecanismo PYK2-rdgB (por ejemplo, un inhibidor de fosfatasa) incluyen la apoplejía, la enfermedad de Alzheimer, de Parkinson, otras enfermedades neurodegenerativas y la migraña.

Los trastornos preferidos incluyen la epilepsia, la apoplejía, la esquizofrenia y la enfermedad de Parkinson, porque existe una relación establecida entre estos trastornos y el funcionamiento de los canales de potasio, véase McLean y col., Epilepsia 35, S5-S9, 1994; Ricard-Mousnier y col., Neurophysiologie Clinique 23, 395-421, 1993; Crit. Rev. Neurobiol. 7, 187-203, 1994; Simon y Lin, Biophys. J. 64, A100, 1993; Birnstiel y col., Synapse (NY) 11, 191-196, 1992; Coleman y col., Brain Res. 575, 138-142, 1992; Popolip y col., Br. J. Pharmacol. 104, 907-913, 1991; Murphy y col., Exp. Brain Res. 84, 355-358, 1991; Rutecki y col., Epilepsia 32, 1-2, 1991; Fisher y Coyle (coord.), Frontiers of Clinical Neuroscience, vol. 11 "Neurotransmitters and Epilepsy", congreso, Woods Hole MA, EE.UU. IX+260P, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY; Treherne y Ashford, Neuroscience 40, 523-532, 1991; Gehlert, Prog. Neuro-Psychopharmacol. Biol. Psychiatry 18, 1093-1102, 1994; Baudy, Expert Opin. Ther. Pat. 4/4, 343-378, 1994; Porter y Rogawski, Epilepsia 33, S1-S6, 1992; Murphy, J. Physiol. 453, 167-183, 1992; Cromakalim, Drugs Future 17/3, 237-239, 1992; Carmeliet, Eur. Heart J. 12, 30-37, 1991; Olpe y col., Experientia 47/3, 254-257, 1991; Andrade y col., Science 234/4781, 1261-1265, 1986; Forster, J. Neurosci. Methods 13/3-4, 199-212, 1984.

En las formas preferidas de ejecución, los métodos descritos aquí incluyen la identificación de un paciente que necesite tratamiento. Los expertos en la materia reconocerán que pueden utilizarse varias técnicas para identificar tales pacientes. Por ejemplo, pueden medirse los niveles celulares de potasio o puede examinarse si existe un defecto en los genes individuales.

Se entiende por "anomalía" un nivel que es estadísticamente diferente del nivel observado en organismos que no sufren tal enfermedad o estado patológico y puede caracterizarse ya sea por un exceso de la cantidad, de la intensidad o de la duración de una señal o por un defecto de la cantidad, intensidad o duración de una señal. La anomalía en la transducción de señales puede detectarse por una anomalía en el funcionamiento de las células, en la viabilidad o en estado de diferenciación. La presente invención se basa en parte en la determinación de tal anomalía en un mecanismo que puede aliviarse por acción en el sitio de interacción PYK2-rdgB de dicho mecanismo. Un nivel de interacción anormal puede ser mayor o menor que el nivel normal y puede desequilibrar el normal desarrollo o funcionamiento del organismo. Por lo tanto, es posible además explorar los agentes que puedan ser útiles para tratar una enfermedad o estado patológico, caracterizados por una anomalía en el mecanismo de transducción de señales, explorar la capacidad de los compuestos para afectar la interacción entre un polipéptido rdgB y la PYK2, dado que el complejo formado por tal interacción es parte integrante del mecanismo de transducción de señales. Sin embargo, la enfermedad o estado patológico puede caracterizarse mediante una anomalía en el mecanismo de transducción de señales incluso si el nivel de interacción entre el polipéptido rdgB y el NBP es normal.

Se entiende por "interacción" cualquier asociación física entre polipéptidos, tanto si es covalente como no covalente. Esta unión puede incluir cualquier mecanismo químico, por ejemplo un enlace covalente, enlace de afinidad, intercalado, enlace coordinado y formación de complejos. Los ejemplos de enlaces no covalente incluyen las uniones electrostáticas, los enlaces de hidrógeno y los enlaces por fuerzas de Van der Waals. Además, las interacciones entre polipéptidos pueden ser directas o indirectas. Por lo tanto, la asociación entre dos polipéptidos concretos puede logarse mediante un agente intermedio o varios agentes de este tipo, que conecte las dos proteínas de interés (p.ej. un polipéptido rdgB y la PYK2). Otro ejemplo de interacción indirecta es la producción, estimulación o inhibición independientes tanto del polipéptido rdgB como de la PYK2 por parte de un agente regulador. En función del tipo de interacción presente podrán utilizarse varios métodos para medir el nivel de interacción. Por ejemplo, las fuerzas de los enlaces covalentes se mide a menudo en términos de la energía que se necesita para romper un cierto número de enlaces (es decir, en kcal/mol). Las interacciones no covalentes se describe a menudo del modo recién descrito y también en términos de la distancia que separa las moléculas interaccionantes. Las interacciones indirectas pueden describirse de muchas maneras, incluido el número de agentes intermedios que intervienen, o el grado de control ejercido sobre el polipéptido rdgB en relación con el control ejercido sobre la PYK2 u otro NBP.

El término "romper" significa que se reduce la interacción entre el polipéptido rdgB y la PYK2 o un NBP, ya sea impidiendo la expresión del polipéptido rdgB, ya sea impidiendo la expresión de la PYK2 o del NBP, ya sea impidiendo específicamente la interacción de las proteínas de síntesis natural, ya sea interfiriendo en la interacción de las proteínas.

El término "promover" significa que la interacción de un polipéptido rdgB y la PYK2 o el NBP se incrementa ya sea aumentando la expresión de un polipéptido rdgB, ya sea aumentado la expresión de la PYK2 o de un NBP, ya sea disminuyendo la actividad desfosforilante de la correspondiente PTP reguladora (u otra fosfatasa que actúe en otros componentes de señalización fosforilados) facilitando la interacción del polipéptido rdgB y la PYK2 o el NBP, ya sea prolongando la duración de la interacción. El enlace covalente puede promoverse ya sea por condensación directa de las cadenas laterales existentes, ya sea por incorporación de moléculas eslabón externas. Muchos agentes bivalentes o polivalentes de enlace pueden ser útiles para la unión de polipéptidos, por ejemplo un anticuerpo, con otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de unión representativos pueden incluir compuestos orgánicos, tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehídos, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta enumeración no pretende ser exhaustiva de los diversos grupos de agentes de unión conocidos en la técnica, sino que se presenta como ilustrativa de los agentes de unión más frecuentes (véase Killen y Lindstrom, J. Immunol. 133, 1335-2549, 1984; Jansen, F.K. y col., Immunological Rev. 62, 185-216, 1982; y Vitetta y col., lugar
citado).

El término "NBP" indica un reactivo natural de fijación de un polipéptido rdgB, que se asocia de forma natural con un polipéptido rdgB. La estructura (primaria, secundaria o terciaria) del reactivo natural de fijación concreto influirá en el tipo concreto de interacción entre el polipéptido rdgB y el reactivo natural de fijación. Por ejemplo, si el reactivo natural de fijación contiene una secuencia de aminoácidos complementaria del polipéptido rdgB, una interacción posible será un enlace covalente. De manera similar, otras características estructurales permitirán otras interacciones correspondientes. La interacción no se limita a restos concretos y puede implicar específicamente restos fosfotirosina, fosfoserina y fosfotreonina. Un amplio abanico de secuencias pueden ser capaces de interaccionar con los polipéptidos rdgB. Un ejemplo de reactivo natural de fijación puede ser la pyk2, que se ha descrito antes. Utilizando métodos bien conocidos de la técnica se pueden identificar diversos reactivos naturales de fijación sobre los polipéptidos rdgB, por ejemplo el uso de una exploración de dos híbridos.

El término "mecanismo de transducción de señales" indica la secuencia de acontecimientos que implica la transmisión de un mensaje desde una proteína extracelular hasta el citoplasma atravesando la membrana celular. La señal provocará en último término la ejecución de una función concreta, por ejemplo la proliferación incontrolada y, por ello, puede provocar el cáncer. Varios mecanismos de la transducción de señales (Fry y col., Protein Science 2, 1785-1797, 1993) proporcionan métodos posibles de medición de la cantidad o de la intensidad de una señal determinada. En función de la enfermedad concreta asociada con la anomalía en el mecanismo de transducción de señales, podrán detectarse diversos síntomas. Las personas expertas en la materia reconocerán tales síntomas, asociados con enfermedades diversas descritas aquí. Además, por el hecho de que algunas moléculas adaptadoras reclutan proteínas secundarias transductoras de señales hacia la membrana, una medida de la transducción de señales consiste en la concentración y la localización de varias proteínas y complejos. Además, los cambios conformacionales que intervienen en la transmisión de una señal pueden observarse utilizando estudios de dicroísmo circular y de fluores-
cencia.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de diagnóstico de una enfermedad o estado patológico en un organismo, caracterizado por una anomalía en el mecanismo de transducción de señales, que contiene una interacción entre el polipéptido rdgB y la PYK2 o un NBP. El método consiste en detectar el nivel de interacción como indicación de dicha enfermedad o estado patológico.

Se entiende por "organismo" cualquier ser vivo. El término incluye a mamífero, en concreto los humanos. Los organismos preferidos incluyen a los ratones, ya que la aptitud para tratar o diagnosticar ratones es a menudo predictiva de la aptitud para funcionar en otros organismos, por ejemplo los humanos.

El término "diagnóstico" indica cualquier método para identificar un síntoma normalmente asociado con una enfermedad o estado patológico concretos. Por ello, un diagnóstico inicial puede establecerse de modo concluyente como correcto mediante el uso de indicios confirmantes adicionales, por ejemplo la presencia de otros síntomas. La clasificación actual de varias enfermedades y estados patológicos está cambiando de modo constante a medida que se conocen mejor los mecanismos que provocan las enfermedades o estados patológicos. Por lo tanto, la detección de un síntoma importante, por ejemplo la detección de un nivel anormal de interacción entre los polipéptidos rdgB y la PYK2 o los NBP puede constituir una base para definir y diagnosticar una enfermedad o estado patológico recién citados. Por ejemplo, los cánceres convencionales se clasifican con arreglo a la presencia de un conjunto concreto de síntomas. Sin embargo, un subconjunto de tales síntomas puede asociarse con una anomalía en un mecanismo concreto de señalización, por ejemplo el mecanismo del ras^{21} y en el futuro pueden reclasificarse estas enfermedades como enfermedades de mecanismo ras^{21} con independencia de los síntomas concretos que se observen.

Otro aspecto más de la invención se refiere a un método para el tratamiento de un organismo que tenga una enfermedad o estado patológico, caracterizado por una anomalía en el mecanismo de transducción de señales. El mecanismo de transducción de señales consta de una interacción entre un polipéptido rdgB y la PYK2 o un NBP y el método consiste en promover o interrumpir la interacción, incluidos los métodos que se dirigen directamente a la interacción rdgB:NBP, así como los métodos que se dirigen a otros puntos de lo largo del conducto o mecanismo.

Se entiende por "proteína mutante negativa dominante" una proteína mutante que interfiere con el mecanismo normal de transducción de señales. La proteína mutante negativa dominante contiene el dominio de interés (p.ej. un polipéptido rdgB o la PYK2 o un NBP), pero tiene una mutación que impide la señalización correcta, por ejemplo impide la unión de un segundo dominio de la misma proteína. Un ejemplo de proteína negativa dominante se describe en Millauer y col., Nature, 10 de febrero de 1994. El agente es con preferencia un péptido que bloquea o promueve la interacción del polipéptido rdgB y la PYK2 u otro NBP. El péptido puede ser recombinante, purificado o incorporado a un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Es preferible una EC_{50} o IC_{50} de menos que o igual a 100 \muM y es incluso más preferido de menos que o igual a 50 \muM y especialmente preferido de menos que o igual a 20 \muM. Estos valores bajos de EC_{50} o IC_{50} son ventajosos, ya que permiten usar concentraciones bajas de moléculas "in vivo" e "in vitro" para la terapia o para el diagnóstico. El descubrimiento de moléculas de EC_{50} y IC_{50} bajos permite el diseño y la síntesis de moléculas adicionales que tengan valores EC_{50} o IC_{50} de menos que o igual a 100 \muM para una o varias, pero no para todas las células elegidas entre el grupo formado por una célula paratiroidea, un osteoclasto óseo, una célula renal yuxtaglomerular, una célula renal de túbulo proximal, una célula renal de túbulo distal, una célula del limbo ascendente grueso del bucle de Henle y/o ducto colector, una célula del sistema nervioso central, un queratinocito de la epidermis, una célula parafolicular del tiroides (célula C), una célula intestinal, un trofoblasto de la placenta, una plaqueta, una célula de músculo liso vascular, una célula cardíaca atrial, una célula secretora de gastrina, una célula secretora de glucagón, una célula renal mesangial, una célula mamaria, una célula beta, una célula grasa/adiposa, una célula inmune y una célula del tracto
GI.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" indica una cantidad de una composición farmacéutica que tiene un efecto terapéuticamente relevante. Un efecto terapéuticamente relevante alivia en alguna medida uno o varios síntomas de la enfermedad o estado patológico del paciente; o devuelve uno o varios parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados o causantes de la enfermedad o del estado patológico a sus valores normales, parcial o completamente. Por lo general, una cantidad terapéuticamente eficaz se sitúa entre 1 nmol y 1 \mumol de la molécula, en función de su EC_{50} o IC_{50} y de la edad y tamaño del paciente así como de la enfermedad que sufre el paciente.

En otro aspecto, la invención describe un polipéptido que consta de un polipéptido rdgB recombinante o un fragmento único del mismo. Se entiende por "fragmento único" una secuencia de aminoácidos presente en un polipéptido rdgB de longitud completa que no está presente en los demás polipéptidos de origen natural. Tal secuencia contiene con preferencia 6 aminoácidos contiguos, presentes en la secuencia completa. Con mayor preferencia, tal secuencia consta de 12 aminoácidos contiguos, presentes en la secuencia completa. Con preferencia todavía mayor, tal secuencia contiene 18 aminoácidos presentes en la secuencia completa.

La expresión "polipéptido rdgB recombinante" significa un polipéptido producido por técnicas de DNA recombinantes, de tal manera que sea distinto de los polipéptidos de origen natural, ya sea por su ubicación (p.ej. presente en una célula o tejido del que se encuentra en la naturaleza), ya sea por su pureza o estructura. En general, un polipéptido recombinante de este tipo estará presente en una célula en una cantidad diferente de la que se observa normalmente en la naturaleza.

En otro aspecto, la invención describe una célula recombinante o un tejido que contiene un ácido nucleico purificado que codifica a un polipéptido rdgB. En tales células, el ácido nucleico puede estar bajo el control de sus elementos reguladores genómicos, o puede estar bajo el control de elementos reguladores exógenos, incluido un promotor exógeno. Se entiende por "exógeno" el promotor que normalmente no está unido "in vivo" transcripcionalmente a la secuencia que codifica al polipéptido rdgB.

En otro aspecto, la invención se refiere a un agente que se fija sobre un polipéptido rdgB, capaz de fijarse sobre un polipéptido rdgB. El agente de fijación es con preferencia un anticuerpo purificado, que reconoce un epítope presente en un polipéptido rdgB. Otros agentes de fijación son las moléculas que se fijan sobre el polipéptido rdgB y moléculas análogas que se fijan sobre un polipéptido rdgB.

Se entiende por "purificado" en relación a un anticuerpo el hecho de que el anticuerpo es distinto de los anticuerpos de origen natural, porque está en forma purificada. El anticuerpo se suministra con preferencia en forma de preparación homogénea por técnicas estándar. Los usos de los anticuerpos de polipéptidos clonados incluyen el uso terapéutico o como herramienta de diagnóstico.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótido que codifica: (a) a un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 4 de los restos aminoácido 1-616 o bien 616-974; (b) al complemento de la secuencia de aminoácidos de (a); (c) a un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 5, desde los restos aminoácido 1-250, 250-900 o 900-1243; (d) al complemento de la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 6 desde los restos aminoácido 1-251, 251-985 o 985-1349; o (f) al complemento de la secuencia del nucleótido de (e). Los expertos en la materia conocen perfectamente la utilidad de tales dominios aislados para el diseño de inhibidores de proteínas.

La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico aislada, que consta de una secuencia de nucleótido, que codifica a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, excepto en que carece por lo menos de un dominio, pero no más de dos, elegidos entre el grupo formado por un dominio PIT, el dominio central, el dominio de fijación PYK2, el dominio de fijación del calcio y el dominio de fijación de nucleótidos. Tales mutantes de deleción son útiles para diseñar ensayos de inhibidores de proteína. Las moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente pueden ser, por ejemplo, cDNA o DNA genómico y pueden estar colocados en un vector recombinante o en un vector de expresión. En tal vector, el ácido nucleico está asociado operativamente con la secuencia de nucleótido regulador que contiene información transcripcional y de regulación de la traducción, que controla la expresión de la secuencia de nucleótido a la célula hospedante.

Por lo tanto, la invención proporciona también una célula hospedante diseñada genéticamente que contiene cualquiera de las secuencias de nucleótido descritas aquí y el ácido nucleico está con preferencia operativamente asociado con la secuencia de nucleótido regulador que contiene información transcripcional y de regulación de la traducción, que controla la expresión de la secuencia del nucleótido en una célula hospedante. Tales células hospedantes pueden ser obviamente procariotas o eucariotas.

Otras características y ventajas de la invención resultarán obvias por la siguiente descripción de las formas preferidas de ejecución de la misma y por las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 presenta los dominios de algunas proteínas rdgB de longitud completa preferidas.

Descripción de las formas preferidas de ejecución

La presente invención se refiere a polipéptidos rdgB, a ácidos nucleicos que codifican a estos polipéptidos, a células, tejidos y animales que contienen tales ácidos nucleicos, a anticuerpos contra tales polipéptidos, a ensayos que utilizan dichos polipéptidos y a métodos relacionados con todo lo anterior. Los expertos en la materia reconocerán que muchos de los métodos descritos a continuación en relación con los rdgB, la PYK-2, un NBP o un complejo de rdgB y PYK-2 o un NBP pueden utilizarse también con respecto a los demás miembros de este grupo.

Describimos el aislamiento y la caracterización de una nueva proteína de fijación de tirosina-quinasa de no receptor, llamada la rdgB. La hrdgB1 se expresa en el cerebro, el bazo y el ovario. La hrdgB2 se expresa en muchos tejidos humanos, incluidos el cerebro, el corazón, el timo y los leucocitos de sangre periférica. La hrdgB3 se expresa en gran manera en el timo, pero también se expresa en el cerebro, el corazón, los ovarios y los testículos.

Los ejemplos de la PYK2 presentados anteriormente revelan un nuevo mecanismo para la unión entre los receptores unidos a proteína G y el mecanismo de señalización de la MAP-quinasa. Estos ejemplos indican además que el influjo del calcio, inducido por la despolarización de la membrana a raíz de la activación del receptor de nicotinato de acetilcolina u otros estímulos que provocan el influjo del calcio o la liberación de las reservas internas, conduce a la activación de la PYK2, la fosforilación de tirosina de Shc, el reclutamiento de Grb2/Sos y la activación del mecanismo de señalización de la MAP-quinasa. La Pyk2 puede encauzar además las señales extracelulares en el conducto de señalización de la JNK/SAP-quinasa.

Las proteínas rdgB constituyen un nexo con las observaciones descritas anteriormente. Se ha constatado que las proteínas rdgB se fijan sobre la PYK2 con alta afinidad, tanto "in vitro" como "in vivo". La evidencia de esta interacción de alta afinidad se visualiza en los ensayos que extraen la PYK2 de un lisado celular con la glutationa-S-transferasa fusionada con proteínas rdgB. Estos ensayos se describen en la siguiente sección de los ejemplos. Además, los homólogos de Drosophila de las proteínas rdgB contienen un dominio fosfitidilinositol-transferasa así como un dominio de fijación del Ca2+. Aunque falta el dominio de la fosfitidil-inositol-transferasa en una variante empalmada alternativamente, todas las formas de proteínas rdgB contienen un dominio de fijación del Ca2+. Por lo tanto, el dominio de fijación del Ca+2 de las proteínas rdgB interviene potencialmente en la respuesta al Ca2+ observada en la señalización de la PYK2.

El modelo presentado en esta solicitud puede constituir el mecanismo que subyace en la regulación mediada por el calcio de la expresión genética en células neuronales inducida por el receptor de MMDA o por canales de calcio sensibles al voltaje. El modelo de expresión de la PYK2, los estímulos externos que activan la quinasa junto con su rol en el control de los mecanismos de señalización la MAP-quinasa y de la JNK sugieren un rol potencia de la PYK2 y de las proteínas rdgB en el control de un amplio abanico de procesos del sistema nervioso central, incluida la plasticidad neuronal, el control muy localizado de la función de canales iónicos, así como la activación localizada de los mecanismos de señalización de la MAP-quinasa y de la JNK, la excitabilidad celular y la eficacia sináptica.

Otras características y aspectos de la invención son: ácidos nucleicos que codifican a un polipéptido rdgB; una sonda de ácido nucleico para la detección de los rdgB; los métodos basados en una sonda y un kit para la detección de los rdgB; los constructos de DNA que contienen una molécula de ácido nucleico de rdgB y las células que contienen estos constructos; los polipéptidos rdgB purificados; los anticuerpos de rdgB y el hibridoma; un método basado en un anticuerpo y un kit para la detección de rdgB; el aislamiento de compuestos que interaccionan con rdgB; composiciones; rotura de los complejos proteicos; anticuerpos y complejos; formulaciones farmacéuticas y modos de administración; identificación de agentes; purificación y producción de complejos; derivados y complejos; y evaluación de trastornos. Todos los aspectos y características recién mencionados se explican con detalle con respecto a la PYK-2 en la publicación PCT WO 96/18738, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad, incluidas las figuras. Los expertos en la materia entenderán rápidamente que tal descripción puede adaptarse también fácilmente a las rdgB y que es igualmente aplicable a la presente invención.

Ejemplos

Los ejemplos que siguen no son limitantes y deben considerarse como meramente representativos de varios aspectos y características de los procedimientos empleados para identificar secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de longitud completa de una serie de proteínas rdgB. Se proporcionan igualmente ensayos para demostrar la expresión, la interacción y las actividades de señalización de las rdgB.

Materiales y métodos Exploración de dos híbridos

Se emplea como hospedante para la exploración de dos híbridos la cepa de levadura L40 que contiene los genes informante (reporte) HIS3 y \beta-gal bajo el control del sitio de fijación LexA situado en sentido ascendente. El dominio N-terminal de la PYK2 (aa 2-245), el PYKN-\DeltaI (aa 2-237), el PYK-NN (aa 2-285) y el Fak (aa 2-412) y el dominio N-terminal (2-412) se fusionan en el marco sobre el dominio de fijación de DNA de LexA. La cepa de levadura que expresa la proteína de fusión LexA-PYKN se transfecta con una biblioteca de cDNA de cerebro humano (Clontech, nº HL404AB) fusionada con el dominio de activación transcripcional GAL4. Se extienden en placas los transformante sobre un medio de selección de agar, que carece de uracilo (Ura-), triptófano (Trp-), leucina (Leu-) e histidina (his-). Se aíslan las colonias resultantes y se ensayan de nuevo para determinar el crecimiento en placas de Ura-Trp-Leu-His y la actividad de la \beta-galactosidasa. Se purifica el DNA plásmido de las colonias que son His+, \beta-gal+ y se utilizan para la retransformación de las cepas de levaduras que expresan cebos heterólogos para determinar la especificidad de la interacción.

Aislamiento de los cDNA de las rdgB

hrdgB1: se explora una biblioteca de cDNA de cerebro humano, sustancia negra (\lambdagt10, Clontech, nº HL1179a) con una sonda marcada con P32, derivada del plásmido de levadura prensada que codifica a la GAL10-rdgB1. Se aíslan cuatro clones independientes, se subclonan y se analizan sus secuencias. El análisis de las secuencias indica que el extremo 5' del gen carece de nuestros clones. Por lo tanto, se explora la biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano (\lambdagt11, Clontech, nº HL3003b) con una sonda derivada de la región 5' más extrema de nuestro nuevo contingente de cDNA. Los análisis de secuencias de los seis clones independientes que se aíslan indican que todos ellos pertenecen al mismo gen, el hrdgB1, pero que carecen del extremo 5' del gen. Se construye una biblioteca de cDNA con cebadores específicos en \lambdaZapII, utilizando como molde poly(A)+ RNA de cerebro fetal humano para nuestra síntesis (kit de Strategene). Se aíslan 15 clones independientes y permiten el aislamiento posterior de los cDNA de longitud completa de la hrdgB1.

hrdgB2 y hrdgB3: se amplifica un fragmento de DNA de un fragmento EST (T12574) por método PCR a partir de un cDNA de cerebro fetal humano. El producto de la PCR se subclona, se secuencia y se emplea como sonda para la exploración de una biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano (\lambdagt11, Clontech, nº HL15015b). De esta exploración se obtiene un clon positivo. Los análisis de secuencia indican que es un clon de cDNA parcial de un nuevo gen que pertenece a la familia de las rdgB humanas. El inserto cDNA de este clon (1,8 kb) se utiliza como sonda para la reexploración de la misma biblioteca de cDNA. Se obtiene siete clones independientes, que se subclonan y se secuencian. El análisis de las secuencias indica que todos ellos pertenecen al mismo gen, el hrdgB2, pero que son diferentes del clon original, que se aísla a partir de la misma biblioteca. El extremo 3' de nuestro primer clon (1,8 kb) se emplea como sonda para explorar una biblioteca de cDNA de corazón humano (Clontech, nº 7759-1, 7760-1) y permiten el posterior aislamiento de dos isoformas empalmadas alternativas de la hrdgB3.

Northern Blot (= transferencia northern)

Se hibridan "northern blots" de múltiples tejidos humanos (Clontech, nº HL11296) en condiciones de alta restricción empleando un fragmento de cDNA de hrdgB1 marcado con P32 (EcoRI-Eco47III nuc# 245-511), hrdgB2 (SacI-Eco47III nuc# 1540-2661) y hrdgB3 (Bst-X1 nuc # 912-1472) como sonda con arreglo a las instrucciones del fabricante.

Constructos plásmidos - constructos de dos híbridos

Fusión con el dominio de fijación DNA LexA: se realiza una PCR para amplificar diferentes regiones de los cDNA de la PYK2 y de Fak del modo indicado, los fragmentos de DNA amplificado se subclonan en pBTM116 en marco para generar una proteína de fusión con el dominio de fijación de DNA LexA.

Fusión con el dominio de activación GAL4: se realiza una PCR para amplificar diferentes regiones de los cDNA de la hrdgB1, hrdgB2 o hrdgB3, los fragmentos de DNA amplificados se subclonan en pGAD10 (Clontech) en marco para generar una proteína de fusión con el dominio de activación GAL4.

Vectores de expresión

Se subclonan los cDNA de longitud completa de la hrdgB1, hrdgB2 y hrdgB3 en pCMP1 en sentido descendente al promotor CMV. Se fusiona un marcador de epítope HA (YPYDVPDYAS) SEQ ID NO: 10 en marco con sus extremos terminados en carboxi. Se subclona el dominio de fijación PYK2 de la hrdgB2 (restos 911-1243) en el pCMV-NEO que codifica a un codón iniciador de metionina con un marcador de epítope Myc (EQKLISEEDL) SEQ ID NO: 11, en sentido ascendente inmediatamente después del sitio de clonación.

Anticuerpos

Se preparan anticuerpos contra la rdgB1 en un conejo inmunizado con un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 965-974 de la hrdgB1 (anticuerpo C-Ter) o con una proteína de fusión FST que contiene los restos 231-374 (anticuerpo N-Ter). Se preparan los anticuerpos contra la hrdgB2 en conejo inmunizado con un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 152-163 de la hrdgB2. Se preparan anticuerpos contra la hrdgB3 en conejo contra la proteína de fusión MBP que contiene los restos 7-116 de la hrdgB3.

Ejemplo 1 Aislamiento de proteínas rdgB humanas

Se aplica el sistema de dos híbridos de levadura para identificar proteínas que interaccionan con el dominio terminal amino de la PYK2. El dominio N-terminal de la PYK2 se fusiona con el dominio de fijación de DNA LexA y se explora en una biblioteca de cDNA de cerebro humano. Empleando un gen de His-sintetasa (HIS3) bajo el control de operadores LexA como informante (reporte), se identifican 124 colonias de His+ a partir de una exploración inicial de un millón de transformantes. De estas, 24 son también positivas de b-galactosidasa (gal+). La retransformación de estos clones en cepas de levadura que expresan la proteína de fusión LexA-PYK2-N indica que solamente una interacciona con el dominio N-terminal de la PYK2 (PYK2-N). La especificidad de la interacción se determina además por transformación de este clon en una cepa de levadura que expresa cebos heterólogos. Se detecta una interacción en la cepa de levadura que expresa el dominio terminal PYK-N, o una versión más corta de la PYK-N que carece de 48 aminoácidos en su extremo C-terminal. Sin embargo, no se detecta interacción en la expresión de cepas de PYK-NN (aminoácidos 2-285) ni de dominio N-terminal de Fak, lo cual sugiere que esta interacción es muy específica.

El clon que tiene éxito en la interacción específica con la PYK2-N contiene un cDNA parcial, que permite el posterior aislamiento de cDNA de 3,1 kb con un marco abierto de lectura de 975 aminoácidos. La región codificadora está flanqueada por regiones 5' y 3' no traducidas de 93 y de 149 bp, respectivamente. La región 5' no traducida contiene tripletes repetidos (CGG), un motivo que se ha identificado en muchos trastornos neuropsiquiátricos. Esta región presenta una homología con la región no traducida del gel FMR-1 de retraso mental X frágil humano (coincidencia del 66,3%) empleando el algoritmo de Smith-Waterman.

Una investigación BLAST de la secuencia de cDNA de longitud completa pone de manifiesto que esta proteína está relacionada con la proteína B de degeneración de la retina de la Drosophila (rdgB) y por lo tanto se llama hrdgB1. La proteína rdgB de la Drosophila tiene un rol importante en el mecanismo de la fototransducción. El mutante rdgB se identifica inicialmente por defecto en el ojo compuesto, en el que el mutante rdgB de la mosca sufre una degeneración celular fotorreceptora ampliada por la luz. La proteína rdgB de la Drosophila contiene un dominio de transferencia de fosfatidilinositol (PI-TP) en su porción N-terminal y un sitio de fijación de calcio en un punto situado en sentido descendente (downstream). La proteína contiene seis regiones hidrófobas que se identifican como dominios transmembrana. Las mismas regiones hidrófobas se conservan en la proteína hrdgB1, sin embargo, los análisis de la secuencia de la rdgB1 así como del homólogo de Drosophila empleando diferentes algoritmos (PROSITE) indican que no son dominios transmembrana clásicos.

Una investigación en el banco de datos EST con la secuencia de la rdgB de la Drosophila permite la identificación de dos genes humanos adicionales que pertenecen a la misma familia genética. Se emplea un fragmento PCR derivado de un fragmento EST (T12574) como sonda para explorar una biblioteca de cDNA de cerebro humano y aislar posteriormente el gen hrdgB2. El cDNA de longitud completa del hrdgB2 (4186 bp) contiene un marco abierto de lectura de 1244 aminoácidos, que está flanqueado por una región 5' sin traducir de 174 bp y una región 3' sin traducir de 280 bp. Los 257 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína hrdgB2 tienen una similitud del 42% con la PtdInsTP humana entera (M73704).

El cDNA de longitud completa de la hrdgB3 se obtiene por exploración de bibliotecas de cDNA de corazón y de cerebro humanos. Se aísla un clon inicial de 1,8 kb a partir de una biblioteca de cerebro humano, empleando como sonda el producto de la PCR derivado de un fragmento EST (T12574). Se emplea un fragmento cDNA derivado de nuestro clon de 1,8 kb como sonda para la exploración de una biblioteca de cDNA de corazón humano y permite el aislamiento posterior del gen hrdgB3. Se han identificado dos isoformas resultantes del empalme alternativo mediante la clonación del cDNA, la más larga codifica una proteína de 1349 aminoácidos de un peso molecular previsto de 150 kDa y otra más corta que carece de los aminoácidos 50-378, de un peso molecular previsto de 120 kDa. La secuencia codificadora está flanqueada por una región 5' sin traducir de 79 bp y una región 3' sin traducir de 945 bp. La región N-terminal de la hrdgB3 contiene un dominio PI-TP que falta en la isoforma de empalme alternativo. Se identifica un tramo de glicinas y serinas dentro de los aminoácidos 612-634 (78% de glicina, 22% de serina).

Los análisis de alineamiento múltiple de las nuevas hrdgB1, hrdgB2 y hrdgB3 revela una gran similaridad en su estructura primaria: un dominio P1-TP en la región terminal amino, seis regiones hidrófobas conservadas y una región C-terminal muy conservada. A diferencia de otros miembros de la familia, la hrdgB1 no contiene el dominio PtdInsTP, lo cual sugiere que nuestros clones constituyen una forma empalmada alternativa.

Ejemplo 2 Distribución en tejido de las rgdB humanas

Los niveles de expresión de mRNA de la hrdgB1, hrdgB2 y hrdgB3 se determinan mediante un análisis "northern" de varios tejidos humanos. La hrdgB1 tiene un modelo de expresión muy restringido. Se expresa en el cerebro, en el bazo y en los ovarios en forma de mensaje de aproximadamente 7,5 kb. A diferencia de ello, la hrdgB2 tiene una expresión amplia en muchos tejidos humanos en forma de un mensaje de 4,5 kb. Los niveles máximos de expresión se detectan en el cerebro, el corazón, el timo y los leucocitos de la sangre periférica. La hrdgB3 se expresa en gran manera en el timo, pero también se expresa en el corazón, el cerebro, los ovarios y los testículos. Se detectan dos mensajes de la hrdgB3: uno de 7,5 kb y otro de 9,5 kb que pueden representar las dos isoformas empalmadas alternativas que se han aislado. Los resultados discutidos antes indican que los miembros de la familia genética de las rdgB tienen modelos de expresión muy diferentes, la expresión de la hrdgB1 es muy rara, la de la hrdgB2 es abundante y la hrdgB3 tiene un modelo de expresión único.

Ejemplo 3 Mapeo del dominio de interacción mínima de las proteínas rdgB

Para mapear el dominio de interacción de la PYK2 con la proteína hrdgB1 se construye una serie de mutantes de deleción de la hrdgB1 y se estudia su capacidad para interacción con la PYK2-N utilizando el sistema de dos híbridos. Como control positivo se emplean nuestros dos clones híbridos originales, que contienen los aminoácidos 627-975 de la hrdgB1. Se construyen mutantes de deleción y entre todos estos mutantes solamente el hrdgB1-\DeltaIV, que contiene los aminoácidos 627-936, interacciona con el dominio N-terminal de la PYK2. La interacción de este dominio con la PYK2 se confirma también con un ensayo de fijación "in vitro", en el que se constata la fijación de la PYK2 sobre una proteína de fusión GST inmovilizada que contiene la misma porción de la hrdgB1. Sin embargo no se detecta fijación sobre la proteína GST sola ni entre el mutante hrdgB1-\DeltaIV y la quinasa de adhesión focal.

Dado que la hrdgB1 comparte una alta homología con la hrdgB2 y la hrdgB3 en sus dominios C-terminales, se examina si las regiones correspondientes de estas dos proteínas interaccionan con la PYK2. A tal fin se fusionan los aminoácidos 911-1244 y 996-1350 de la hrdgB2 y de la hrdgB3, respectivamente, en el marco con el dominio activador de la Gal-4 y se estudia su capacidad de interaccionar con la PYK-2 mediante el sistema de dos híbridos. Los resultados indican que la hrdgB2 puede fijarse fuertemente sobre el dominio N-terminal de la PYK2, mientras que la interacción entre la rdgB3 y la PYK2 es muy débil.

Para confirmar esta interacción "in vivo" se coexpresan la hrdgB2-HA o la hrdgB3-Ha con la PYK2 o bien con la Fak en células COS. Después de la lisis celular se inmunoprecipitan las proteínas hrdgB con anticuerpos anti-HA y se determina la presencia de la PYK2 o de la Fak en los inmunocomplejos por inmunotransferencia (immunoblotting) con anticuerpos contra la PYK2 y la Fak, respectivamente. Los resultados indican que tanto la hrdgB2 como la hrdgB3 interaccionan "in vivo" con la PYK2. Sin embargo no se detecta interacción entre la quinasa Fak afín, lo cual sugiere que las proteínas hrdgB interaccionan fuerte y específicamente con la PYK2.

Para explorar si el "dominio de fijación de la PYK2" de las hrdgB es suficiente para generar la asociación de estas dos proteínas "in vivo" se coexpresa una versión marcada con myc de la hrdgB2-"dominio de fijación de la PYK2" con la PYK2 o con la Fak en células COS y se analiza su interacción. Los resultados demuestran que este dominio puede interaccionar con la PYK2 "in vivo" y por lo tanto constituye un dominio separado en esta familia de proteínas.

Ejemplo 4 Asociación "in vivo" de rdgB1 y PYK2

Para confirmar la interacción de la hrdgB1 y la PYK2 "in vivo" se coexpresan una rdgB1 marcada con hemaglutinina y la PYK2 en células 293. Los resultados indican que la hrdgB1 se asocia fuertemente con la PYK2. La asociación de la hrdgB1 con la quinasa Fak afín no se pudo detectar en las mismas condiciones experimentales, lo cual sugiere que hay una interacción fuerte y específica entre la hrdgB1 y la PYK2.

Para mayor caracterización de la interacción entre las hrdgB y la PYK2 se utiliza cerebro de rata adulta como fuente de estas dos proteínas. Cuando se inmunoprecipita la hrdgB1 de un material homogeneizado de cerebro de rata utilizando anticuerpos específicos contra la hrdgB1, se pudo detectar la PYK2 en el inmunocomplejo. Sin embargo, la estequiometría de la interacción PYK2/rdgB1 no era tan elevada como la observada en células transfectadas. Estos resultados indican que la PYK2 y la rdgB1 interaccionan "in vivo" en condiciones fisiológicas y esta interacción puede tener una importante función reguladora en el cerebro.

Otras formas de ejecución se describen en las reivindicaciones siguientes.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Lev, Sima

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS RDGB Y PRODUCTOS Y MÉTODOS RELACIONADOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Lyon & Lyon

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 633 West Fifth Street Suite 4700

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Los Angeles

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

Código postal: 90071-2066

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEÍBLE CON ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete de 3,5'', capacidad 1,44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: IMB PC DOS 5.0

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: FastSeq

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE SOLICITUD

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: por asignar

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE DEPÓSITO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE DEPÓSITO:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Warburg, Richard J.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32,327

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/DOC. 222/105

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA LA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (213) 489 1600

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (213) 955 0440

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 67-3510

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3109 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4190 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5020 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1244 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1244 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 5

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 6

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 986 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 7

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4308 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 8

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1250 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 9

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu}

Claims (18)

1. Un polipéptido rdgB aislado o purificado que contiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

2. Un polipéptido rdgB aislado o purificado según la reivindicación 1,

(a) que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, excepto que carece de uno de los siguientes segmentos de restos aminoácido: 1-616 ó 616-974;

(b) que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 5, excepto que carece de uno de los siguientes segmentos de restos aminoácido: 1-250, 250-900 ó 900-1243; o

(c) que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 6, excepto que carece de uno de los siguientes segmentos de restos aminoácido: 1-251, 251-985 ó 985-1349.

3. Un polipéptido rdgB aislado o purificado según la reivindicación 1,

(a) que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, desde los restos aminoácido de 1 a 616 ó de 616 a 974;

(b) que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 5, desde los restos aminoácido de 1 a 250, de 250 a 900 ó de 900 a 1243; o

(c) que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 6, desde los restos aminoácido de 1 a 251, de 251 a 985 ó de 985 a 1349.

4. Un polipéptido rdgB aislado o purificado según la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, excepto que carece por lo menos de un dominio, pero como máximo de dos dominios elegidos entre el conjunto formado por el dominio PIT, el dominio central, el dominio de fijación de la PYK2, el dominio de fijación de calcio y el dominio de fijación de nucleó-
tido.

5. Un polipéptido rdgB aislado o purificado según la reivindicación 1, que consta de un polipéptido funcional que contiene por lo menos 20, con preferencia por lo menos 50, 100, 200 ó 300 aminoácidos contiguos definidos en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

6. Un anticuerpo purificado que tiene una afinidad de fijación específica con el polipéptido rdgB según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5.

7. Un hibridoma que produce un anticuerpo que tiene una afinidad específica de fijación con un polipéptido rdgB según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5.

8. Un método para detectar un compuesto capaz de fijarse sobre un polipéptido rdgB, que consiste en los pasos de incubar dicho compuesto con dicho polipéptido rdgB según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 y detectar la presencia de dicho compuesto fijado sobre dicho polipéptido rdgB.

9. Un método de exploración de agentes potenciales, útil para el tratamiento de una enfermedad o de un estado patológico caracterizado por una anomalía en el mecanismo de transducción de señales, caracterizado porque dicho mecanismo de transducción de señales incluye una interacción entre un polipéptido rdgB de las reivindicaciones 1-5 y un reactivo natural de fijación, que consiste en el paso de ensayar la capacidad de dichos agentes potenciales de promover o de romper dicha interacción como indicación de la utilidad de dicho agente.

10. Un método para el diagnóstico de una enfermedad o estado patológico caracterizado por una anomalía en el mecanismo de transducción de señales, dicho mecanismo de transducción de señales incluye una interacción entre un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 y un reactivo natural de fijación, que consiste en el paso de detectar el nivel de dicha interacción en una muestra como indicación de dicha enfermedad o estado patológico.

11. Una molécula de ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótido que:

(a) codifica a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6; o

(b) el complemento de la secuencia de nucleótido de (a).

\newpage

12. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11, que contiene una secuencia de nucleótido que codifica:

(a) una proteína rdgB que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, excepto que carece de uno de los siguientes segmentos de restos aminoácido: 1-616 ó 616-974;

(b) el complemento de la secuencia de nucleótido de (a);

(c) una proteína rdgB que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 5, excepto que carece de uno de los siguientes segmentos de restos aminoácido: 1-250, 250-900 ó 900-1243;

(d) el complemento de la secuencia de nucleótido de (c);

(e) una proteína rdgB que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 6, excepto que carece de uno de los siguientes segmentos de restos aminoácido: 1-251, 251-985 ó 985-1349; o

(f) el complemento de la secuencia de nucleótido de (e).

13. Una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11, que contiene una secuencia de nucleótido que codifica:

(a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, desde los restos aminoácido de 1 a 616 ó de 616 a 974;

(b) el complemento de la secuencia de nucleótido de (a);

(c) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 5, desde los restos aminoácido de 1 a 250, de 250 a 900 ó de 900 a 1243;

(d) el complemento de la secuencia de nucleótido de (c);

(e) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 6, desde los restos aminoácido de 1 a 251, de 251 a 985 ó de 985 a 1349; o

(f) el complemento de la secuencia de nucleótido de (e).

14. Una molécula de ácido nucleico aislado según la reivindicación 1 que contiene una secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, excepto que carece por lo menos de un dominio, pero como máximo de dos dominios elegidos entre el conjunto formado por el dominio PIT, el dominio central, el dominio de fijación de la PYK2, el dominio de fijación de calcio y el dominio de fijación de nucleótido.

15. Una sonda de ácido nucleico para la detección de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido rdgB según una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 14 en una muestra, dicha sonda hibridiza en condiciones restrictivas al ácido nucleico que codifica por lo menos 30, 50, 100, 200 ó 300 aminoácidos contiguos de la secuencia definida en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

16. Un vector recombinante que contiene una secuencia de nucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 14.

17. Un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido rdgB según una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 14 y un vector o un promotor eficaz para iniciar la transcripción en una célula hospedante.

18. Una célula hospedante diseñada genéticamente que contiene la secuencia de nucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 14.