JPH06510665A - アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アデノウィルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送技術分野 本発明は、一般に、アデノウィルスか介在する胃腸管への遺伝子の輸送方法に関 する。特に、本発明は、全身および／または局所使用のための治療タンパク質を 生産することを目的とする、組換え、増殖欠損性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄ ｅｆｉｃｉｅｎｔ）アデノウィルスか介在する胃腸管への治療遺伝子の輸送方法 に関する。

背景技術 治療剤としてのタンパク質の使用は、特に胃腸管の生理学的障壁によって制限さ れる。タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、あるいはアミノ酸断片という用語 は、ここではペプチド結合を介して結合したアミノ酸の重合体を定義するのに互 換的に用いられる。治療タンパク質は、ここでは個体に対して有益なタンパク質 として定義される。タンパク質は治療目的のために経口または経直腸投与するこ とはできない。なぜならタンパク質は一般に治療に必要な濃度で、完全な形態で 血液循環に到達しないからである（タンパク質か変性され、および／または吸収 されない）。従って、治療タンパク質は全身的に、例えば、静脈内、皮下、陵内 または筋肉内経由によって投与される。

投与に関するこのような問題は、多くの異なった治療タンパク質（これらのタン パク質は全て全身系で投与されなければならないのだか）を生産することか可能 な組換えＤＮＡ技術の発達によって劇的に増した。これは短期間の使用には重大 な問題ではないかもしれないか、長期間の使用（組換えタンパク質の殆とにおい て典型的な使用法である）では、投与経路に付随するあらゆる問題（例えば、利 用可能な静脈、不快感およびコストの問題）を伴う長期間の全身投与か必要とな る。

組換えアデノウィルスは、ｉｎ　ｖｉｖｏでヒトタンパク質を生産するのに使用 できることか知られている（例えば、肝臓に通しる門静脈内、および肺に通じる 気管内への組換えアデノウィルスの投与が含まれる）。ここに記載する全ての刊 行物はその全体か参考のためここで包含される（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ　Ｍ　ｅｔ 　ａｈ　（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２　：　４３１−４３４　；　Ｊａ ｆｆｅ　ＨＡ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　Ｃ１１ｎ　Ｒｅｓ　３９　（２） 　R０２　Ａ　： Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ　ＭＡ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　Ｃ１１ｎ　Ｒｅｓ　 ３９　（２）　：　３１１　Ａ参照）。しかしなから、これらの方法はすべて、 組換え遺伝子の腸管外投与（すなわち、静脈内、門脈内、気管内投与）を要する から組換えタンパク質の全身的投与に実用的でない。

本発明は、治療タンパク質の遺伝子コード配列を含む、組換え、増殖欠損性アデ ノウィルスを用いて胃腸管の管壁細胞（ｌｉｎｉｎｇ　ｃｅｌｌ）へ遺伝子を挿 入し、その部位を用いて治療タンパク質を生産し、それを全身的使用に利用でき る血液循環内へ分泌することにより、経腸経路で治療タンパク質を投与する方法 を提供することによって上記の問題を解決する。あるいは、同様の方法は胃腸管 の管腔内の局所治療用として、あるいは胃腸管壁の細胞内または細胞外マトリッ クスにおける使用のために、胃腸管内へタンパク質を分泌するのに使用すること ができる。

１９６０年代の研究では、（胃内ての不活性化を避けるために）腸溶性被覆カプ セルに生きたアデノウィルスを入れ、ヒトに経口で投与するとアデノウィルスに 対する全身性免疫ができることか示されている（Ｃｈａｎｏｃｋ　ＲＭ　ｅｔ　 ａｌ、　（１９６６）ＪＡＭＡ　１９５　：　１５１−１５８）。これは今や米 国における陸軍新兵のためのアデノウィルスに対する標準的な免疫方法である。

この免疫ストラテジーの基礎となる概念は、カプセルか腸管の管腔内で溶解する ときアデノウィルスかカプセルから離れ、腸上皮細胞を感染させ、上皮細胞内で 増殖し、新しく増殖したウィルスが免疫系に現れ、その結果アデノウィルスに対 する全身性免疫ができるというものである。

既に、アデノウィルスを増殖欠損性となるように（すなわち、標的細胞に感染し た後、新しいウィルスの生産を指示しない）、また新しい遺伝子（例えば、治療 に存益な遺伝子のコード配列）を含むように変性し得ることが実際に行われ示さ れている。アデノウィルスゲノムのＥｔａ領域の初期プロモーター（ＥＰ）の直 接制御下に組換えＤＮＡ挿入物を使用することは、パスツール研究所のＭ、　Ｐ ｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、　ｅｔ　ａｌ、によって欧州特許出願Ｎｏ、０１８５５ ７３　（１９８６年６月２５日公開）に記載されている。このような変性ウィル スは組換え遺伝子を標的細胞にｉｎ　ｖｉｖｏで輸送するのに使用することがで きる［例えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　５ｃｉ ｅｎｃｅ２５２　：　４３１−４３４　：　Ｂｅｒｋｎｅｒ　ＫＬ　（１９８８ ）　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６　：　６１６−６２９参照１゜発明の要約 低音の胃腸管の細胞内でタンパク質を生産させる方法を提供することか、本発明 の全般的な目的である。

患者の胃腸管の細胞内でタンパク質を生産させる方法を提供することが、本発明 の特定の目的である。本方法は、タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む増殖 欠損性アデノウィルスを、該タンパク質か生産される条件下で患者の胃腸管に投 与することからなる。組換えアデノウィルスに入れられる特定の配列に基づいて 、ダンバク質か好ましくは全身治療のために血液循環へ、局所治療のために胃腸 管の管腔へ、あるいはその両方に分泌される。さらに、組換えアデノウィルスの 設計は好ましくは、使用するタンパク質が胃腸管の細胞内または胃腸管の壁内に 送達されるようにする。

本発明のさらなる目的および利慨は以下の記載から明確となるだろう。

図面の簡単な説明 図１　組換えアデノウィルス（Ａｄ）ベクター。上段−Ｅｔａ、Ｅｌｂ［ｖツブ ユニット（ｍｕ）　１．３−１１．２　：　１００　ｍｕ　・３６ｋｂｌおよび Ｅ　３　（ｍｕ　７６、６−８６．０）領域を示す野性壓Ａｄ５ゲノム。

図２：結腸壁の解剖図および組換えアデノウィルスＡｄ−αｌＡＴ　（ＡＴＣＣ ＣＣＬ　２４８）で変性したＴ８４ヒト結腸癌腫上皮細胞によって生産されたα −１アンチトリプシンの分泌の極性を評価するために使用した培養上皮細胞モデ ル。

Ａ、上皮細胞（１４）　、結腸の管腔（１３）、管腔に隣接する上皮の先端面（ １２）、粘膜下組織に隣接する上皮の基底外側面（１１）を示す結腸の断面図、 および毛細管（１９）、筋肉層（２０）。

Ｂ、　ｍ細孔膜（１７）、培養細胞（１６）、分離された先端（１５）および基 底外側（１８）のコンパートメントを示す上皮細胞培養物のチャンバー。

図３　組換えアデノウィルスＡｄ−αＩＡＴにｅｘ　ｖｉｖｏて接触させたラッ ト結腸によるヒトα−ｌアンチトリプシン（α１ＡＴ）のｄｅ　ｎｏｖｏ合成と 分泌のデモンストレーション。

本発明の詳細な説明 本発明は、胃腸管内における治療タンパク質の生産方法に関する。段階としては 、まず最初に、増殖欠損性アデノウィルス（以下、「変性アデノウィルス」とい う）を治療に有益なタンパク質のコード配列を用いて構築する。例えば、ヒトα ＩＡＴ遺伝子のコード配列を含むアデノウィルスＡｃｔ−αＩＡＴが使用される （図１ならびにＲｏｓｅｎｆｅｌｄ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ、　（＋９９１）　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２５２：４３１−４３４参照）。第二に、変性アデノウィルスを腸溶 性カプセルに入れる（あるいは代替として、胃を通過するチューブを介して、ウ ィルスか変化しないよう胃管壁液（ｓｔｏｍａｃｈ　ｌｉｎｉｎｇｆｌｕｉｄ） を変性した後、経口でまたはチューブによって胃内へ、または直腸経由で投与す る）。代替として、錠剤が十二指腸、空腸、回腸、または結腸の塩基性（ｐＨ） 環境に到達するまで変性アデノウィルスの遊離と吸収を妨げるために、特別なコ ーティングをアデノウィルスの施すことも出来る。経口投与にはカプセル錠剤あ るいは丸剤か簡便な送達担体であり、直腸投与には坐剤が好ましい。そして投与 が行なわれ、以下の筋書きか起こる。

（１）胃腸管の細胞（好ましくは上皮細胞）が変性アデノウィルスに感染する。

（２）変性アデノウィルス配列内の組換え遺伝子が組換えタンパク質の合成を指 示し、該タンパク質は（組換え遺伝子内の配列の設計のされ方に基づいて）血液 循環内、胃腸管の管腔内、あるいは血液循環内、胃腸管の管腔内両方、あるいは 胃腸管の上皮細胞内、あるいは胃腸管の壁内の局所周辺に分泌される。

（３）そして治療タンパク質は（血液循環内に分泌されたときは）全身で、ある いは（管腔内へ分泌されたときは）腸内で、胃腸管壁の細胞内および／または細 胞外マトリックス内で作用するように利用できる。

本発明は組換えタンパク質のヒトへの実用的で、簡便で、安全な投与方法を提供 する。増殖欠損性アデノウィルスを用いることにより、ウィルスか標的細胞内で 増殖することかできないのてこの方法は安全である。組換えアデノウィルスを使 用することにより、標的細胞はヒト治療タンパク質を生産するようになる。増殖 欠損性組換えアデノウィルスによる感染の標的として胃腸管の上皮細胞を選択す ることによって、本発明は反復的に使用し得る経路により（例えば、上皮細胞内 の組換えアデノウィルス感染の慢性度に応じて、毎日、あるいはより少ない頻度 で）、容易に投与することを可能にした（好ましくは、腸溶性皮膜カプセルで経 口投与する）。

胃腸管の上皮細胞は、組換えアデノウィルスの生産物の一部を感染した上皮細胞 の基底外側面を通して分泌するので、本方法は全身への効用を必要とする適用に 利用できる。またこれらの上皮細胞は、生産物の一部をその先端面を通して分泌 するので、本方法は管腔への効用を必要とする適用（例えば、管腔内胃腸疾患お よび胃腸癌）に利用できる。組換えアデノウィルスを適切に設計すれば、治療タ ンパク質は、胃腸管の上皮細胞内または胃腸管壁の局所周辺での治療用（例えば 、胃腸管の癌あるいは胃腸管の炎症疾患への適用）に利用できる。

全身的投与を必要とする疾患に対しては、本アプローチは組換えタンノくり質を 血液循環に投与する簡便で安全な方法を提供する。そのようなタンノくり質とし ては、以下のものか含まれるか、これらに限定されない。

・αｌ−アンチトリプシン−αｌ−アンチトリプシン欠損症に対して・第■因子 −血友病に対して ・他の唾液凝固因子−出血疾患に対して・成長ホルモン−成長障害に対して ・インツユリン−糖尿病に対して ・他のペプチドホルモン ・他の脳下垂体ホルモン（副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）および甲状腺刺激 ホルモン（ＴＳＨ）の２例である。） ・全身療法に使用するリンホカインおよびサイトカイン・インターフェロンγ− 小児期の肉芽腫性疾患（および解明途中の他の疾患）に対して ・インターフェロンα−白血病および慢性活動性肝炎に対して・エリスロボエチ ンー慢性腎不全および他の骨髄抑制疾患に対して・他の血液学的成長因子−骨髄 抑制疾患に対して・例えば、再潅流療法に続いて、特にバルーンカテーテル（ｂ ａｌｌｏｏｎ　ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）後の肺冠状動脈内の血栓の予 防のための組織プラスミノーゲンアクチベーターの投与、あるいはヒト免疫不全 ウィルス（ＨＩＶ）感染に対するＣＤ４の投与、ならびに短期間または長期間い ずれかの全身的投与を必要とする他の組換えタンパク質の投与。

・セレブロシダーセ欠損症およびアデノシンデアミナーゼ欠損症のような他の遺 伝性疾患に使用する組換えタンパク質 ・レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト−例えば、全身性高血圧の制御の ため；敗血症性ショック、慢性関節リウマチおよび他の疾患に使用するインター ロイキン−ルセプターアンタゴニスト ・サイトカイン、リンホカイン、およびホルモンに対する結合性タンパク質−例 えば腫瘍壊死因子か介在するショックおよび消耗性疾患の治療に使用する腫瘍壊 死因子結合性タンパク質（腫瘍壊死因子レセプターの一部）胃腸管の遺伝性なら びに後天性疾患に対して、本方法は胃腸管壁の細胞表面、あるいは細胞内または 細胞外マトリックスに組換えタンパク質を投与する手段を提供する。可能な適用 例としては、以下のものが含まれる。

・嚢胞性線維症のような膵不全疾患に使用する膵臓酵素・乳糖不耐症に使用する ラクターゼおよび小腸ジサッカリダーゼ欠損症に使用する適当な酵素 ・サイトカイン、腫瘍抑制タンパク質（ｔｕｍｏｒ　５ｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｐ ｒｏｔｅｉｎ）　（例えば、ｐ５３および網膜芽細胞腫遺伝子）、および細胞毒 性タンパク質を用いた胃腸癌に対する局所治療 ・腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３および網膜芽細胞腫遺伝子）を用いた胃 腸管癌（例えば、家族性ポリープ症）になりやすい個体における癌の予防哨乳類 や鳥類（より詳しくは、家畜、例えば、。ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネ コおよびニワトリ）に対し、本方法は、成長を促進し、商業目的のだめの特徴を 生み出す目的で、および／または一般的な治療目的で、およびヒトか用いうる精 製画分からタンパク質を、またヒトタンパク質と反応性のある試薬用の抗体を生 産する目的で、組換えタンパク質（例えば、成長ホルモン）をこれらの動物に投 与する手段を提供する。

本発明に従って、生物学的に活性なタンパク質の有効量を受容個体に送達するた めの手段を提供することにより、治療剤としてのタンパク質およびポリペプチド の使用か大いに拡大する。本発明による調製物は、動物−哺乳類（ヒトを含む） 、魚類、および鳥類が含まれるがこれらに限られない−に好適に投与される。

本調製物は、好ましくは家畜類（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、家庭用 ベット（ネコ、イヌ、カナリア、イン：等）、魚類（特に水槽内や養殖場におけ る、例えば熱帯魚、金魚および他の鑑賞用コイ、ナマズ、マス、サケ等）および 鳥類、特にニワトリ、カモ、ガチョウ等のような家禽に好適に投与される。

本発明の一態様においては、増殖欠損性アデノウィルスは、動物、たとえば家畜 類、家庭用ペット、魚類、家禽等への投与用の無毒性の製薬上許容される担体と して作用する動物のエサと共に（あるいは、より少ない投与量にコントロールし て、動物用飲料水と共に）用いられる。ひとつには、本態様はヒト血清に対する 精製のためのタンパク質を生産するのに、および異なる種、例えばウシ、ウマ、 ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ブタ等においてヒトタンパク質に対する試薬用の抗体を 産生ずるのに有用である。別の面においては、本態様は、タンパク質またはポリ ペプチドか有用な治療剤である疾患の治療に、特に治療タンパク質をコードする 遺伝子かそれによって治療される種由来であるか、または免疫反応を抑制するた めに近い相同性を有する配列をもつ場合に有用である。

本発明の増殖欠損性アデノウィルスはさらに、慣用の賦形剤、すなわち、ウィル スを劣化させるような反応をおこさない、経腸（例えば経口）投与に適した製薬 上許容される有機あるいは無機担体物質との混合物で使用される。適切な製１上 許容される担体は当分野においてよく知られている。（適切なベヒクルとしては 酸耐性で塩基感受性のもの、すなわち、許容されない分解を受けることなく胃を 通過して輸送され得る程度に酸耐性で塩基感受性のものか含まれる。）例えば、 水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエ チレンゲルコール、ゼラチン、乳糖、アミロースあるいはデンプンのような炭水 化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠パラフィン、香油、脂 肪酸、モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステ ル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるか、こ れらに限定されない。増殖欠損性アデノウィルスを殺さないよう適切な注意を払 って、調製物を滅菌することができ、所望により活性ウィルスを劣化させるよう な反応をおこさない補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤 、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色剤、着香剤、および／または芳 香剤等か混合され得る。例えば、（緩衝剤や塩基によるのように）直接的に、あ るいは（薬物によるように）間接的かのいずれかで、胃のｐＨを高めるための薬 剤か、ウィルスか害されずにより容易に通過できるようにするために使用される 。

調製物はまた所望により他の生物学的活性物質、例えばアンチセンスＤＮＡまた はｍＲＮＡと併用される。

本発明のもうひとつの態様においては、増殖欠損性アデノウィルスは感染性物質 に対する免疫を生起させるワクチンとして使用され得る。そのストラテジーは以 下の通りである。免疫を生起させるタンパク質をコードする遺伝子を増殖欠損性 アデノウィルスにクローンする。次に目的の遺伝子を含む増殖欠損性アデノウィ ルスを、本明細書で述へたような動物（好ましくはヒト）に投与する。遺伝子配 列は、外来タンパク質に対する免疫ができるように、タンパク質か胃腸管の上皮 細胞によって全身循環へ分泌されるように設計されている。

この方法の例には肝炎ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、および動物の病気（特 にヒトの病気）の原因となる他の全てのウィルスに対する免疫の付与か含まれる 。このストラテジーはまた細菌、真菌（カビ）、および他の感染性物質に対する 免疫を付与するのに使用できる。

本発明の特に興味深い面は、増殖欠損性アデノウィルスを、化学療法剤（アンチ センス化合物を含む）を送達するためのシステムとして使用、特に癌化学療法に おいて使用することを包含することである。従来の化学療法剤との使用は上述し た。簡単に言えば、場内の腫瘍細胞に対するアンチセンス化合物との使用は、第 一の薬物標的としてｍＲＮＡを、もうひとつのｍＲＮＡ分子あるいはｍＲＮＡに 相補的な塩基配列を持つ合成オリゴデオキシヌクレオチド（水素結合された塩基 対によるハイブリッド二重鎖を形成する）と共に選択することを包含する。この ハイブリダイゼーションは標的とするｍＲＮＡのタンパク質生産物の発現を阻害 し、本工程は「翻訳停止」と呼ばれる。ｍＲＮＡの阻害は、単一のｍＲＮＡ分子 か多数のタンパク質コピーを生しさせるので、酵素活性部位の阻害より効果的で ある。よって、細胞機能に必要な遺伝子生産物の発現の選択的阻害は、定義はて きないか非常に所望される化学療法の到達点−選択的細胞死滅を生み出す。この ような方法は、例えば、Ｊ、Ｓ、　Ｃｏｈｅｎ、　”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｏｌ ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　ａｎＡｐｐｒｏａｃｈ　Ｔｏｗａｒｄ　 Ａｎｔｉ−、Ａｉｄｓ　Ｔｈｅｒａｐｙ”、　第＋　９５−２２４頁、　Ｄｅｓ ｉｇｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉ|Ａｉｄｓ Ｄｒｕｇｓ、　Ｅ、　ｄｅｃｌｅｒｇ　（編）　、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｕｂ ｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　（１９９０）：およびＳ、ｌ、。

Ｌｏｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　［ｎｕｎｕｎｏｌｏｇｙ　１４１汲Q８２−２８９ （１９８８）のような文献で知られている。

経腸投与には、錠剤、糖衣錠、液剤、ドロップ、坐剤か特に好適であり、あるい は加糖ベヒクルか用いられるカプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤なとも使用 し得る。持続性あるいは制御放出性組成物（例えばリポソーム）または活性ウィ ルスか、特異的に化学分解されるコーティング（例えば、マイクロカプセル化、 多重コーティング等による）で保護されたものに製剤化することかできる。また 組成物を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を使用することもてきる。

一般に、本発明による調製物は、製薬上許容される担体中に単位投与量あたり１ ０’−１０”ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは約１０’°−１０１２ｐｆｕ／ｍｌの組 換え増殖欠損性アデノウィルスを含有する単位投与形態に分配される。本発明に より投与される生物学的に活性な化合物の投与量は当分野において一般的に知ら れているか、本発明により改良されたデリバリ−システムか提供されるため、し ばしばその量か軽減される。

特定の症例において投与される増殖欠損性アデノウィルスの好ましい実際量は、 利用される特定のタンパク質またはポリペプチド、製剤化された特定の組成物、 投与様式、および治療される特定の部位や生物によって変わる。

使用される特定の調製物は、タンパク質またはポリペプチドの性質、および活性 成分の生物学的利用率（すなわち、薬剤かその作用部位に、または薬剤かそこか ら作用部位に接近する生物学的液に到達する程度）を確実にする所望の作用部位 に基づき、常套の知識に従って選択される。宿主への投与量は、通常に考慮して 、例えば対象製剤の異なる活性を通例に従って比較することにより、また適当な 慣用の薬理学的プロトコールにより決定することができる。

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定され るものではない。

実施例 本発明の実施可能性を示す目的で、ヒトα１−アンチトリプシンをコードする配 列を結腸の上皮細胞に輸送するために増殖欠損性組換えアデノウィルスＡｄ−α ＩＡＴ（図１）を用いた。次の３つのモデルを使用した。（１）Ｔ８４ヒト結腸 癌腫（カルシノーマ）細胞ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　：　（２）無傷ラット結腸ｅｘ　 ｖｉｖｏ　；および（３）コツｈンラット（ｃｏｔｔｏｎ　ｒａｔ）結腸ｉｎ　 ｖｉｖｏ。

以下のプロトコールおよび実験の詳細は続いて記載する実施例で参照する。

組換えベクター（Ａｄ−αＩＡＴ）は、Ｅ３領域の主要部およびＡｄ５の左末端 から２．６ｍｕを欠失させ、調節配列および組換えヒトαＩＡＴ遺伝子を含むプ ラスミドｐＭＬＰ−αＩＡＴからのαｌ−アンチトリプシン（αＩＡＴ）発現カ セットを左末端に付加することにより構築した（図１）。Ａｄ５はアメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクショ：／　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル、メリーランド州、アメリカ合 衆国から市販されている。α１ＡＴｃＤＮＡ、発現カセット、および最終のベク ターアデノウィルスは、Ｍ、　Ｒｏｓｅｎ−図１の下段にαＩＡＴ発現カ発現カ セット網を示す。ＩＴＲは逆向き末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｅｒｍｉｎａ ｌ　ｒｅｐｅａｔ）である。机換えウィルスベクターＡｄ−αｌＡＴを構築する ために、発現カセットを、Ａｄ−ｄ１３２７からＥｌａ領域の部分を除くために Ｃ１ａｌプＩノカツトしたＡｄ−ｄ　１３２７ＤＮＡと結合した。組換えアデノ ウィルスＤＮＡを増殖か行われる２９３細胞株にトランスフェクションし、感染 性ウィルス内に被包し、プラーク精製により単離した。個々のプラークを２９３ 細胞内の増殖により増幅させ、ウィルスＤＮＡを抽出した。使用する前に組換え ウィルスのＤＮＡか完全であることを制限断片分析およびサザンハイプリダイゼ イションにより確認した。Ａｄ−αＩＡＴのストックを２９３細胞中で増殖させ 力価を測定した。感染の３６時間後、凍結／解凍を５サイクル行なうことにより ウィルスを感染細胞から放出させた。Ｃｓ　Ｃ１勾配を用いてＡｄ−αＩＡＴを さらに精製した（詳細はＲｏｓｅｎｆｅｌｄ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ、　（＋９９１） 　５Ｃ１ｅｎＣｅ２５２：　４３１−４３４を参照）。

図３Ａは、組換えアデノウィルスＡｄ−αＩＡＴに接触させたラット結腸による ヒトα１−アンチトリプシン（αＩＡＴ）のｄｅ　ｎｏｖｏ合成および分泌のデ モンストレーションを示す。結腸を洗浄し、末端を結紮して長さ２〜５ｃｍの「 ソーセージ」をつくり、１０”　〜１０”　ｐｆｕ／ｍｌ　Ａｄ−ａ　ｌ　ＡＴ 　（ＬＨＣ−８培養液中）の５０〜１００マイクロリツトルを管腔に注入した。

「ソーセージ」を３７°Ｃで２４時間インキュベートし、洗浄後、１ｍ１Ｔ１２ の断片に切断し、３２Ｓ−メチオニン（５００ｎ＋Ｃｉ／ｍｌ）をメチオニン非 含有ＬＨＣ−８培養液に添加した。３７°Ｃで２４時間インキュベートした後、 断片を入れた液中のヒトαＩＡＴの存在を、免疫沈降、ドデシル硫酸ナトリウム ／アクリルアミドゲル、およびオートラジオグラフィーにより評価した。結果を 図３Ｂに示す。レーンｌ−非感染結腸、レーン２−Ａｄ−αＩＡＴに感染させた 結腸：レーン３−レーン２と同様であるか、ラベルしていないヒトαＩＡＴに接 触させた抗体を添加（抗体の特異性を調べるため）。５２ｋＤａのヒトαＩＡＴ を矢印で示す。

このモデルは、ヒト結腸上皮細胞にＡｄ−αＩＡＴを感染させることができ、感 染の結果、ヒトαｌΔＴか先端面（すなわち、上皮の管腔側）および基底外側面 （すなわち、」上皮の血液循環側）に分泌されることを示すために使用した。こ れを行うために、Ｔ８４８４細胞微細孔膜上でコンフルエントになり、堅固な接 合部（ｔｉｇｈｔ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を形成するまで培養した（上皮を隔てた 電気抵抗＞１５０ｏｈｍ／ｃｍ２）。上皮細胞のついた微細孔ポリカーボネート 膜（４，７ｃｍ”、孔サイズ３、Ｏｕｍ、　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ　Ｃｏ、、コス タ−、ケンブリッジ、　ＭＡ）が培養液を入れた２つのチャンバーを隔てている （すなわち、ｉｎ　ｙｉｖｏの上皮を模したｉｎ　ｖｉｔｒｏシステムである） 。上のチャンバーは先端面に面し、下のチャンバーは基底外側面に面している。

細胞と細胞間の堅固な接合部の組合せにより液と上と下とのチャンバーは物理的 に隔てられている（先端面か結腸の内側管腔と隣接し、基底外側面か組織側と（ 従って、血液循環と）隣接しているｉｎ　ｖｉｖｏにおける状況に相当する。図 ２参照）。細胞を２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地で３７”Ｃにて１．５時間 、次いてアデノウィルスを添加しない、またはＡｄ−αＩＡＴを添加した（ｉｎ 　ｖｉｖ。

で起きているように先端側から添加する）１０％０％ウシ胎清含１ｒＤＭＥＭ培 地て３７°Ｃにて２４時間培養した。感染の強さは３段階にした［プラーク形成 単位（ｐｆｕ）、液］、ｍ１当たりの感染ウィルス粒子の数：５ＸＩＯ”、１０ １０．および２゜５ｘ　Ｉ　Ｏ”　ｐｆｕ／培養物］。培地を集め、酵素結合イ ムノアッセイ（Ｗｅｗｅｒｓ　ＭＤｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　卜堕担−Ｊ　 Ｍｅｄ　３１６：　１０５５−１０６２）によりヒトα１−アンチトリプシンの 存在を評価した。このデータは、Ａｄ−αＩＡＴ感染によりヒト結腸上皮細胞か αＩＡＴを分泌し、両方向（すなわち、先端面と基底外側面）に分泌しているこ とを示すものである。先端面への分泌量を基底外側面への分泌量に対して比較す ると、３．９８〜４．６９の範囲（平均４．３４）であった。すなわち、管腔内 へ４．３４分子か分泌されるごとに（これは最終的にｉｎ　ｖｉｖｏで排出され る）、１分子が組織内へ分泌される（これは血液循環に入り利用される）。

実施例１の結果を表１に示す。

表１ 組換えアデノウィルスＡｄ−αＩＡＴに感染させたヒトＴ８４結腸癌腫細胞株に よるヒトαｌ−アンチトリプシン分泌の極性２４時間中のαＩＡＴ の分泌量（μｇ）２　先端と基底外側とのコンバート□　メントにおけるαＩＡ Ｔの比 感染１　先端　基底外側 ５ＸｌＯ’　３．５４　０．８９　３．９８１０”　７，４２　１，５８　４． ６９２．５ＸＩＯ”　８，８９　２．０５　４．３４１培養液に添加したＡｄ− αＩＡＴのｐｆｕ数、全ての細胞は４．７ｃｍ”微細孔膜上で堅固な接合部を形 成するまで培養した（を気抵抗＞１５０　ｏｈｍ／Ｃｍす。

２酵素結合イムノアッセイ（Ｗｅｗｅｒｓ　ＩＪＤ　ｅｔ　ａｔ、　（＋９８７ ）　Ｎ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ　Ｍｅｄ　３１６＋０５５−１０６２）により測定した 。

このモデルは、細胞か正常な状態（Ｔ８４モデルのような腫瘍由来の細胞ではな い）にあり、かつ正常な構築配置にある結腸上皮細胞に組換えアデノウィルスを 感染させることかできるかを示すために使用した。これを行うために、ラット結 腸を切除し、洗浄した後、２〜３ｃｍの区画の両端を結紮して閉じた「ソーセー ジ」を作成した（図３）。Ａｄ−αＩＡＴを管腔内に注入した（例えば、生きた 組換えアデノウィルスか腸溶性皮膜カプセルから放出されるのに相当する）。こ の「ノーセージ」を培養培地中に３７°Ｃで２４時間置き、２つの方法で評価し た。

第一の方法は、結腸を１ｍｍ３の断片にし、）５３−メチオニンを添加して３７ °Ｃて２４時間さらに培養を続け、結腸のヒトαｌ　ＡＴ　ｄｅ　ｎｏｖｏ合成 能および分泌能を、免疫沈降、ドデシル硫酸ナトリウム／アクリルアミノゲルお よびオートラジオグラフィーを用いて評価した（この方法の詳細はＲｏｓｅｎｆ ｅｌｄ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ、　（＋９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１−４ ３４を参照）。その結果は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて非感染ラット結腸はヒト αＩＡＴを合成、分泌しないか、Ａｄ−αＩＡＴ感染ラット結腸はヒトαＩＡＴ を合成、分泌することを示している（図３）。

同様の手法を用いてコツトンラット結腸を評価した。但し、管腔内に分泌された ヒトαＩＡＴの定量（すなわち、先端分泌；このモデルでは基底外側分泌を測定 することはできない）には酵素結合イムノアッセイ（ＥＬ［ＳＡ）を使用した。

約１０１１ｐｆｕのＡｄ−αＩＡＴをｉｎ　ｖｉｔｒｏコツトンラット結腸「ソ ーセージ」の管腔内に注入し、感染４８時間後、管腔液を測定したところヒトα ＩＡＴは３．３±０．６μこのモデルは、生きている動物のｉｎ　ｖｉｖｏにお いても本発明のコンセプトか作用することを示すために使用した。２つのストラ テジ−（共にコツトンラットにおける）を用いた。第一は、通常の麻酔および開 腹を行なった後、結腸の一区画を２カ所で結紮し、正常な血流か当該区画に流れ るようにしてｉｎ　ｖｉｖｏ　ｒソーセージ」を形成した。Ａｄ−αＩＡＴを管 腔内に注入し開腹部を縫合した。この動物を経口摂取させずにおく。４８時間後 、血清サンプルを取りＥＬＩＳＡ法によりヒトαＩＡＴの存在を評価した。第二 は、通常の麻酔および開腹を行なった後、１０１°〜ｔｏ”　ｐｆｕのＡｄ−α ＩＡＴを結腸の管腔内に結紮することなく注入した。

４８時間後、血清サンプルを取り、ＥＬＩＳＡ法によりヒトαＩＡＴの存在を評 価した。いずれの場合もヒトαＩＡＴか明らかに存在した。

結果を表２に示す。

Ａｄ−αＩＡＴをｉｎ　ｖｉｖｏて結腸管腔に投与した４８時間後のコツトンラ ットにおけるヒトαｌ−アンチトリプシンの血清濃度状態　血清（２１ＡＴ濃度 （ｎｇ／ｍｌ）”模擬感染　０ 「ソーセージ」感染１１４５±２９ 直接感染２　７４±　９ １両端を結紮することにより分離し、た腸の区画の管腔内にＡｄ−αＩＡＴ（５ ０〜１００μｆ、約１０”　ｐｆｕ）を注入した。

２　「ソーセージ」感染と同様にする（但し、結紮（ごより腸の区画を分離する 二上記の発明は、発明を明確にしかつ理解させる目的で詳細に説明されているか 、当分野の知識を育する者はこの開示を読んで形式および詳細において本発明な らびに添付された請求の範囲の正確な範囲から逸脱することなく種々の変更を行 い得ることか認識されるであろう。

アデノウィルス 挿入 図１ 図２Ａ ・１ｍｍ’断片 ・　３５Ｓ−メチオニン、２４時間、３７°Ｃ・ヒトα１−アンチトリプシン合 成および　１２３分泌の評価 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）ｌ　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０７０２９ ２、発明の名称 アデノウィルスか介在する胃腸管への遺伝子の輸送３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国、２０８９２−９９０２メリーランド州、ベセスダ、ナシ ョナルインスティテユーツ　オヴ　ヘルス、 オフィス　オヴ　テクノロジー　トランスファー、ボックス　オーティーティー （番地なし）名称　アメリカ合衆国 国籍　アメリカ合衆国 ４、代理人■５４１ 住所　大阪府大阪市中央区平野町三丁目３番９号（湯水ビル） 高島国際特許事務所 １９９３年８月６日 請求の範囲 １　生物学的に活性なタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む増殖欠損性アデ ノウィルスを、該タンパク質か生産される条件下で個体の胃腸管に投与すること を含む、該タンパク質を個体の胃腸管内において生産する方法。

２、　該タンパク質が、治療タンパク質である請求の範囲第１項記載の方法。

３　（補正後）該タンパク質か、血液凝固因子、脳下垂体ホルモン、ペプチドホ ルモン、サイトカイン、腫瘍抑制タンパク質、血液学的成長因子、レセプターア ゴニストおよびレセプターアンタゴニストからなる群より選ばれる請求の範囲第 １項記載の方法。

４、　該タンパク質が、α１−アンチトリプシン、エリスロポエチン、第■因子 、成長ホルモン、腫瘍壊死結合性タンパク質、インターロイキン−ｌレセプター アンタゴニスト、インターフェロンγ、インターフェロンαおよびインシュリン からなる群より選ばれる請求の範囲第１項記載の方法。

５、　該アデノウィルスが、ＡＣ！−αＩＡＴである請求の範囲第１項記載の方 法。

６、　該アデノウィルスが、腸溶性カプセルに入れて投与される請求の範囲第１ 項記載の方法。

７、（補正後）治療タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含むアデノウィルスを 含有し、該アデノウィルスの増殖を促進し得る他のウィルスを含有しない腸溶性 カプセル。

８、　生物学的に活性なタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む増殖欠損性ア デノウィルスの有効量を、該タンパク質が生産される条件下で動物の胃腸管内に 投与することを含む、該タンパク質を動物の胃腸管内において生産する方法。

９、　該動物か、哺乳類、鳥類または魚類である請求の範囲第８項記載の方法。

１０、　該動物かブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコおよびイヌからなる群より選 ばれる請求の範囲第９項記載の方法。

Ｉｌ、該動物がニワトリである請求の範囲第９項記載の方法。

１２、（補正後）治療タンパク質をコードする少なくとも一つのＤＮＡ断片を含 む増殖欠損性アデノウィルスであって、酸耐性および塩基感受性であるベヒクル に含まれた該アデノウィルスを含有しく但し、該アデノウィルスの増殖を促進し 得る他のウィルスを含存しない）、かつ製薬上許容される希釈剤、担体または賦 形剤を含有する医薬組成物。

１３、タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む増殖欠損性アデノウィルスの有 効量を、該タンパク質か生産され、かつ該タンパク質に対する免疫を生起させる 条件下で動物の胃腸管内に投与することを含む、タンパク質に対する免疫を動物 に生起させる方法。

フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、ＣＩ。５　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　４８１００　８ ３１４−４ＣＣ１２Ｎ　１５／８７ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５／１５ （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｉ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的に活性なタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む増殖欠損性アデ ノウイルスを、該タンパク質が生産される条件下で個体の胃腸管に投与すること を含む、該タンパク質を個体の胃腸管内において生産する方法。
2. ２．該タンパク質が、治療タンパク質である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該タンパク質が、血液凝固因子、脳下垂体ホルモン、ペプチドホルモン、リ ンホカイン、サイトカイン、腫瘍抑制タンパク質、血液学的成長因子、レセプタ ーアゴニストおよびレセプターアンタゴニストからなる群より選ばれる請求の範 囲第１項記載の方法。
4. ４．該タンパク質が、α１−アンチトリプシン、エリスロポエチン、第ＶＩＩＩ 因子、成長ホルモン、腫瘍壊死結合性タンパク質、インターロイキン−Ｉレセプ ターアンタゴニスト、インターフェロンγ、インターフェロンαおよびインシュ リンからなる群より選ばれる請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．該アデノウイルスが、Ａｄ−αＩＡＴである請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．該アデノウイルスが、腸溶性カプセルに入れて投与される請求の範囲第１項 記載の方法。
7. ７．治療タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む増殖欠損性アデノウイルスを 含有する腸溶性カプセル。
8. ８．生物学的に活性なタンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む増殖欠損性アデ ノウイルスの有効量を、該タンパク質が生産される条件下で動物の胃腸管内に投 与することを含む、該タンパク質を動物の胃腸管内において生産する方法。
9. ９．該動物が、哺乳類、鳥類または魚類である請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．該動物がブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコおよびイヌからなる群より選ば れる請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．該動物がニワトリである請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．治療タンパク質をコードする少なくとも一つのＤＮＡ断片を含む増殖欠損 性アデノウイルスであって、酸耐性および塩基感受性であるベヒクルに含まれた 該アデノウイルス、および製薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有す る医薬組成物。
13. １３．タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む増殖欠損性アデノウイルスの有 効量を、該タンパク質が生産され、かつ該タンパク質に対する免疫を生起させる 条件下で動物の胃腸管内に投与することを含む、タンパク質に対する免疫を動物 に生起させる方法。