BR112019011832A2

BR112019011832A2 - métodos de tratar doenças associadas com células ilc2

Info

Publication number: BR112019011832A2
Application number: BR112019011832A
Authority: BR
Inventors: Henrique Veiga Fernandes Jose; Michelle Evelyne Chesne Julie; Rita De Faria Cardoso Vania
Original assignee: Limm Therapeutics Sa
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2019-10-22
Also published as: AU2017378378A1; IL267231A; JP7324707B2; WO2018109540A1; US20190358264A1; EP3554516A1; CN110573168A; CA3046884A1; JP2022050478A; MX2019006886A; JP2020511418A; KR20190096379A

Abstract

a presente invenção refere-se a composições incluindo compostos e/ou células para tratar uma doença associada a células linfoides inatas do grupo 2 (ilc2s), e métodos de tratamento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODOS DE TRATAR DOENÇAS ASSOCIADAS COM CÉLULAS ILC2. Antecedentes [001] Células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) são abundantes barreiras mucosas e atuam como iniciadores principais de inflamação tipo 2 e reparação¹²de tecidos. ILC2s são ativadas por citocinas de células extrínsecas, incluindo IL-25, IL-33 e linfopoietina¹² estromal do timo. Relatos anteriores indicaram que os subconjuntos de linfócitos discretos e progenitores hematopoiéticos são controlados por sinais dietéticos e neuroreguladores²’³’^5-9, sugerindo que ILC2s podem exercer a sua função no contexto de unidades celulares neuroimunes.

SUMÁRIO [002] Como se mostra aqui, o neuropeptídeo Neuromedina U foi determinado para ser um regulador excepcionalmente potente de imunidade inata do tipo 2 no contexto de uma nova unidade de neurônioILC2. Mais especificamente, foi determinado que ILC2s expressam o receptor 1 de Neuromedina U (Nmurl) enquanto Neuromedina U é expressa pelos neurônios entéricos. Ativação de ILC2s com Neuromedina U resultou na produção rápida e forte de citocinas do tipo 2, interleucina 5 (IL-5), IL-13 e Anfirregulina de uma maneira dependente de NMUR1. Neuromedina U controlada ILC2 a jusante da ativação de ERK e ativação dependente de influxo de cálcio de citocinas de Calcineurina e NFAT. Além disso, o tratamento com Neuromedina U in vivo resultou em respostas imediatas do tipo 2. Por conseguinte, a ablação de Nmurt levou a respostas do tipo 2 deficientes e fraco controle da infecção por parasita. Surpreendentemente, neurônios da mucosa foram considerados adjacentes a ILC2s e produtos de diretamente sensíveis a parasitas para controlar a expressão de Neuromedina U e citocinas inatas do tipo

2. Este trabalho divulga novas interações neuroimune no núcleo da homeostase da mucosa o que indica que as unidades de células ILC2 do

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2/65 neurônio estão preparadas para conferir proteção imediata através de respostas sensoriais neuroimunes coordenadas.

[003] De acordo com um aspecto, os métodos para aumentar a atividade ou a proliferação de células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) são fornecidos. Os métodos incluem contatar ILC2s com um agonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) em uma quantidade eficaz para aumentar a atividade das ILC2s. Em algumas modalidades, o agonista de NMUR1 é Neuromedina U (NMU) ou um análogo da mesma, ou um anticorpo que especificamente se liga a e ativa NMUR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, a NMU ou análogo da mesma é NMU25, proteína precursora de NMU, NMU23, ou NMU8.

[004] Em algumas modalidades, o contato é realizado in vitro. Em algumas modalidades, as ILC2s são contatadas em um protocolo de expansão de ILC2.

[005] Em outras modalidades, o contato é realizado in vivo. Em algumas modalidades, o agonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) é administrado a um objeto. Em algumas modalidades, o objeto é um ser humano. Em algumas modalidades, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1.

[006] De acordo com um outro aspecto, os métodos para o tratamento de uma doença associada com as células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) são fornecidos. Em algumas modalidades, os métodos incluem administrar a um objeto em necessidade de tal tratamento um agonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) em uma quantidade eficaz para tratar a doença. Em algumas modalidades, o agonista de NMUR1 é Neuromedina U (NMU) ou um análogo da mesma, ou um anticorpo que especificamente se liga a e ativa NMUR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, a NMU ou análogo da mesma é NMU25, proteína precursora de NMU, NMU23,

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3/65 ou NMU8. Em algumas modalidades, o objeto é um ser humano.

[007] Em algumas modalidades, a doença é uma infecção, a reparação de tecidos, cicatrização de feridas, obesidade, tratável por aumento da indução de respostas imunes do tipo 2, tratável por regulação metabólica, tratável por aumento de eosinófilos ou tratável por aumento de mastócitos. Em algumas modalidades, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1.

[008] Em algumas modalidades, o agonista de NMUR1 é administrado por via intravenosa, por via oral, nasal, retal ou através de absorção através da pele.

[009] De acordo com um outro aspecto, os agonistas de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) são fornecidos para uso no tratamento de uma doença associada com células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s), incluindo administrar a um objeto em necessidade de tal tratamento o agonista de NMUR1 em uma quantidade eficaz para tratar a doença. Em algumas modalidades, o agonista de NMUR1 é Neuromedina U (NMU) ou um análogo da mesma, ou um anticorpo que especificamente se liga a e ativa NMUR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, a NMU ou análogo da mesma é NMU25, proteína precursora de NMU, NMU23, ou NMU8. Em algumas modalidades, o objeto é um ser humano.

[0010] Em algumas modalidades, a doença é uma infecção, reparação de tecidos, cicatrização de feridas, obesidade, tratável por aumento da indução de respostas imunes do tipo 2, tratável por regulação metabólica, tratável por aumento de eosinófilos ou tratável por aumento de mastócitos. Em algumas modalidades, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1.

[0011] Em algumas modalidades, o agonista de NMUR1 é administrado por via intravenosa, por via oral, nasal, retal ou através de absorção através da pele.

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4/65 [0012] De acordo com um outro aspecto, os métodos para o tratamento de uma doença associada com as células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) são fornecidos. Os métodos incluem a administração a um objeto em necessidade de tal tratamento de uma composição compreendendo ILC2s ativadas, em uma quantidade eficaz para tratar a doença. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um agonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1). Em algumas modalidades, o agonista de NMUR1 é Neuromedina U (NMU) ou um análogo da mesma, ou um anticorpo que especificamente se liga a e ativa NMUR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, a NMU ou análogo da mesma é NMU25, proteína precursora de NMU, NMU23, ou NMU8. Em algumas modalidades, o objeto é um ser humano.

[0013] Em algumas modalidades, a doença é uma infecção, reparação de tecidos, cicatrização de feridas, obesidade, tratável por aumento da indução de respostas imunes do tipo 2, tratável por regulação metabólica, tratável por aumento de eosinófilos ou tratável por aumento de mastócitos. Em algumas modalidades, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além das ILC2s ativadas ou do agonista de NMUR1.

[0014] Em algumas modalidades, as ILC2s ativadas ou o agonista de NMUR1 são administrados por via intravenosa, por via oral, nasal, retal ou através de absorção através da pele.

[0015] De acordo com outro aspecto, são proporcionadas composições que incluem células linfoides inatas do Grupo 2 ativadas (ILC2s) para uso no tratamento de uma doença associada com ILC2s incluindo a administração a um objeto em necessidade de tal tratamento da composição compreendendo ILC2s ativadas, em uma quantidade eficaz para tratar a doença. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um agonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1). Em

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5/65 algumas modalidades, o agonista de NMUR1 é Neuromedina U (NMU) ou um análogo da mesma, ou um anticorpo que especificamente se liga a e ativa NMUR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, a NMU ou análogo da mesma é NMU25, proteína precursora de NMU, NMU23, ou NMU8. Em algumas modalidades, o objeto é um ser humano.

[0016] Em algumas modalidades, a doença é uma infecção, reparação de tecidos, cicatrização de feridas, obesidade, tratável por aumento da indução de respostas imunes do tipo 2, tratável por regulação metabólica, tratável por aumento de eosinófilos ou tratável por aumento de mastócitos. Em algumas modalidades, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além das ILC2s ativadas ou o agonista de NMUR1.

[0017] Em algumas modalidades, as ILC2s ativadas ou as ILC2s ativadas e o agonista de NMUR1 são administrados por via intravenosa, por via oral, nasal, retal ou através de absorção através da pele.

[0018] De acordo com um outro aspecto, métodos para diminuir a atividade ou a proliferação de células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) são fornecidos. Os métodos incluem contatar ILC2s com um antagonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) ou Neuromedina U (NMU) em uma quantidade eficaz para diminuir a atividade das ILC2s. Em algumas modalidades, o antagonista de NMUR1 ou NMU é um anticorpo que especificamente se liga a e inibe NMUR1 ou NMU, respectivamente, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o antagonista de NMUR1 ou NMU é uma molécula de ácido nucleico inibidor que reduz a expressão, transcrição ou tradução de NMUR1 ou NMU. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inibidor é uma molécula de ácido nucleico de sRNA, shRNA ou antissenso. Em algumas modalidades, o objeto é um humano.

[0019] Em algumas modalidades, o contato é realizado in vitro.

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6/65 [0020] Em outras modalidades, o contato é realizado in vivo. Em algumas modalidades, o antagonista de NMUR1 ou NMU é administrado a um objeto. Em algumas modalidades, o objeto é um ser humano. Em algumas modalidades, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além do antagonista de NMUR ou NMU 1.

[0021] De acordo com um outro aspecto, os métodos para o tratamento de uma doença associada com as células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) são fornecidos. Os métodos incluem a administração a um objeto em necessidade de tal tratamento de um antagonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) ou Neuromedina U (NMU) em uma quantidade eficaz para tratar a doença. Em algumas modalidades, o antagonista de NMUR1 ou NMU é um anticorpo que especificamente se liga a e inibe NMUR1 ou NMU, respectivamente, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o antagonista de NMUR1 ou NMU é uma molécula de ácido nucleico inibidor que reduz a expressão, transcrição ou tradução de NMUR1 ou NMU. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inibidor é uma molécula de ácido nucleico de sRNA, shRNA, ou antissenso. Em algumas modalidades, o objeto é um ser humano.

[0022] Em algumas modalidades, a doença é a alergia, a asma alérgica, alergia alimentar, esofagite eosinofílica, dermatite atópica, fibrose, rinite alérgica, rinossinusite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística, tratável por redução de respostas imunes do Tipo 2, tratável por redução de eosinófilos, ou tratável por redução de mastócitos. Em algumas modalidades, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1 ou NMU.

[0023] Em algumas modalidades, o antagonista de NMUR1 é administrado por via intravenosa, por via oral, nasal, retal ou através de absorção através da pele.

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7/65 [0024] De acordo com um outro aspecto, os antagonistas de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) ou Neuromedina U (NMU) são fornecidos para uso no tratamento de uma doença associada com as células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) compreendendo a administração a um objeto em necessidade de tal tratamento do antagonista de NMUR1 ou NMU em uma quantidade eficaz para tratar a doença. Em algumas modalidades, o antagonista de NMUR1 ou NMU é um anticorpo que especificamente se liga a e inibe NMUR1 ou NMU, respectivamente, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o antagonista de NMUR1 ou NMU é uma molécula de ácido nucleico inibidor que reduz a expressão, transcrição ou tradução de NMUR1 ou NMU. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inibidor é um sRNA, shRNA, ou molécula de ácido nucleico antissenso. Em algumas modalidades, o objeto é um ser humano.

[0025] Em algumas modalidades, a doença é a alergia, a asma alérgica, alergia alimentar, esofagite eosinofílica, dermatite atópica, fibrose, rinite alérgica, rinossinusite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística, tratável por redução de respostas imunes do Tipo 2, tratável por redução de eosinófilos, ou tratável por redução de mastócitos. Em algumas modalidades, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1 ou NMU.

[0026] Em algumas modalidades, o antagonista de NMUR1 ou NMU é administrado por via intravenosa, por via oral, nasal, retal ou através de absorção através da pele.

[0027] A invenção não está limitada na sua aplicação aos detalhes de construção e a disposição dos componentes apresentados na descrição seguinte ou ilustrados nos desenhos. A invenção é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou de ser realizada de várias maneiras. Além disso, as fraseologia e terminologia aqui utilizadas é para

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8/65 o propósito de descrição e não devem ser consideradas como limitativas. O uso de incluindo, compreendendo ou tendo, contendo, envolvendo, e as suas variantes aqui, destina-se a englobar os itens listados a seguir e os seus equivalentes, assim como os artigos adicionais. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0028] Os desenhos anexos não se destinam a ser desenhados à escala. Nos desenhos, cada um dos componentes idênticos ou praticamente idênticos que é ilustrado em várias figuras é representado por um numeral semelhante. Para fins de clareza, nem todos os componentes podem ser rotulados em cada desenho. Nos desenhos:

[0029] As Figuras 1a-1e. ILC2s expressam receptor 1 de Neuromedina U e estreitamente localizam-se com Neurônios Gexpressando Neuromedina U. Fig.1a, Mapa de calor para 40 transcritos de mRNA relacionadas com neuronais em células T CD4, ILC1 s, ILC2s, NCR’ (CD4+ e CD4 ) e subconjuntos¹⁰ NCR⁺ ILC3s.

[0030] Fig. 1b, Comparação da expressão do gene ILC2 com células¹⁰ ILC 1, ILC3 NCR+ e T CD4, por esquemas volcano. Nmurl é destacado em parasitalho. Fig. 1c, Análise RT-PCR quantitativa de Nmurl em células da lâmina própria intestinal, a menos que indicado de outra forma. Progenitor linfoide comum (CLP); Progenitor linfoide inato auxiliar comum (CHILP); Progenitor de ILC2 de medula (ILC2P); Eosinófilos (EO); Mastócitos (mast); Macrófagos (ΜΘ); Neutrófilos (neu); Células dendríticas (DC); Células T (T); Células B (B); Células gliais da lâmina própria (G) e neurônios (N); Células epiteliais (Ep). n = 6. Fig. 1 d, Análise RT-PCR quantitativa de Nmuem populações intestinais, n = 6. Fig. 1e, Análise confocal da lâmina própria intestinal. Verde: neurônios (Reí°^FP); Parasitalho: KLRG1; Ciano: CD3. Setas Ciano: células T (CD3+). Setas parasitalhas: ILC2s.

[0031] Figuras 2a-2j. Neuromedina U é um regulador exclusivamente potente da citocinas inatas do tipo 2, via ativação de NMUR1.

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Figs. 2a-2f, Ativação de ILC2-intrinseca com NmU23. Fig. 2a, Expressão do gene de citocina do Tipo 2 em ILC2s intestinais, n = 6. Fig. 2b, Expressão do gene de citocina do Tipo 2 em ILC2s pulmonares, n = 6. Fig. 2c, Expressão de Ki67 em ILC2s intestinais. Fig. 2d, Expressão de IL-5 e IL-13 em ILC2s competentes e deficientes de Nmurl. Fig. 2e, Citocinas tipo 2 inflamatórias inatas ao nível da proteína, η = 6. Fig. 2f, Citocina de reparação de tecido de inatas AREG, n = 6. Figuras 2g, 2h, Administração in vivo de NmU23. Fig. 2g, Citocinas do tipo 2 derivadas de ILC2. n = 6. Fig. 2h, Citocinas do tipo 2 derivadas de células T. n = 6. Figuras 2i, 2j, Ablação in vivo die Nmurl. Fig. 2i, ILC2s intestinais de Nmurl ⁷' e seus controles de mesma ninhada WT Nmur1^+/+. WT n = 6; NmurT⁷' n = 9. Fig. 2j, Citocinas do tipo 2 derivadas de ILC2 em quimeras de medula óssea de Nmurl'⁷' e em sua origem de controle de mesma ninhada WTNmur1^+/+. WT n = 6; NmurT⁷' n = 3. Barras de erro mostram s.e.m. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; NS não significativo.

[0032] Figuras 3a-3e. Neuromedina U regula citocinas derivadas de ILC2 via ERK1/2 e uma cascata Ca²⁺/Calcineurina/NFAT. Figuras 3a-e, Ativação de ILC2 intestinal por Neuromedina U. Fig. 3a, Percentagem de células pERK n = 4. Intensidade média de fluorescência (IMF) de expressão pERK. n = 4. Fig. 3b, Expressão de IL5, IL13 e Csf2 em ILC2s cultivadas com meio (Controle) (n = 3), NmU23 (n = 3) ou NmU23 e inibidor de ERK PD98059 (n = 3). Fig. 3c, Esquerda e centro: Influxo de Ca, representado por intensidade Fluo-4 AM. NmU23 foi adicionado 60 segundos após aquisição da linha de base de ILC2 (seta). Direita: Intensidade média de Ca²⁺ influxo, η = 3. Fig. 3d, Expressão de IL5, IL13 e Csf2 em ILC2s cultivadas com meio (controle) (n =

6), NmU23 (n = 6) ou NmU23 e Inibidor de Calcineurina de FK506 (n =

6). Fig. 3e, Expressão de IL5, IL13 e Csf2 em ILC2s cultivadas com meio (controle) (n = 3), NmU23 (n = 3) ou NmU23 e inibidor de NFAT

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11R-VIVIT (VIVIT) (n = 3). Barras de erro mostram s.e.m. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; NS não significativo.

[0033] Figuras 4a-4h. O eixo neurorregulador NMU-NMUR1 confere proteção contra a infecção por parasita. Os camundongos foram infectados com larvas Λ/. brasiliensis e pulmões foram analisados às 48 horas. Fig. 4a, Expressão de Nmu em pulmão total de camundongos infectados em comparação com os controles não infectados, n = 3. Fig. 4b, Infiltrados de célula inflamatória pulmonar 48 horas após a infecção. Seções de controle e tratadas com NmU23 são exibidas. Hematoxilina e eosina. Fig. 4c, Seções de pulmão coradas com Mieloperoxidase (granulócitos) e Luna (eosinófilos). Fig. 4d, Contagens de granulócitos e células eosinofílicas (células/mm²). Controle n = 8; NmU23 n = 8. Fig. 4e, Nmurl⁷' e seus controles ninhadas WT foram infectados com N. brasiliensis. Hematoxilina e eosina. Fig. 4f, Seções de pulmão coradas com Mieloperoxidase (granulócitos) e Luna (eosinófilos). Fig. 4g, Contagens de granulócitos e células eosinofílicas (células/mm2). WT n = 8; Nmurl' ^Λ n = 8. Fig. 4h, Carga de infecção por N. brasiliensis às 48 horas no pulmão. WT n = 3; Nmurl^ψ n = 3. Barras de escala: 50 pm. Barras de erro mostram s.e.m. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; NS não significativo.

[0034] Figuras 5a-5c. Perfil transcricional de ILC2 de genoma amplo e interação neurônio-ILC2. Fig. 5a, Análise ponderada Unifrac PCoA de ILC2s, células T CD4+, e ILC1s ILC3s. Fig. 5b, Níveis de expressão de Nmurl em ILC2s, células T CD4, populações ILC1 e ILC3. Fig. 5c, Canais separados de análise confocal na Fig. 1e direita. Verde: neurônios (ReP^FP); Parasitalho: KLRG1; Ciano: CD3.

[0035] Figuras 6a-6f. Neuromedina U é potente regulador de citocinas do tipo 2 inatas de pulmão, via ativação de NMUR1. Figs. 6a, 6b, Ativação de ILC2 intrínseca com NmU23. Fig. 6a, Expressão de IL-5 e IL-13 em ILC2s pulmonares. Fig. 6b, Citocinas do tipo 2 inatas ao

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11/65 nível da proteína, η = 3. Figuras 6c, 6d, Administração in vivo de NmU23. Fig. 6c, citocinas do tipo 2 derivadas de ILC2 no pulmão, n =

3. Fig. 6d, citocinas do tipo 2 derivadas de células T no pulmão, n = 3. Figuras 6e, 6f, Ablação in vivo de NMUR1. Fig. 6e, ILC2s pulmonares em Nmurl^ e nos seus controles de mesma ninhada WT Nmur1^+/+. WT n = 6; Nmurl ⁷' n = 9. Fig. 6f, citocinas do tipo 2 derivadas de células T intestinais em Nmurff' e em seus controles de mesma ninhadas WT Nmur1^+/+. WT n = 6; Nmurl ⁷' n = 6. Barras de erro mostram s.e.m. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; NS não significativo.

[0036] Figuras 7a-7c. NMUR1 é dispensável para desenvolvimento de ILC2. Figuras 7a, 7c, Quimeras de medula óssea competitivas. Fig. 7a, 10⁶ células de cada genótipo (CD45.2), foram injetadas por via intravenosa em competição direta com um competidor WT de terceiros (CD45.1/CD45.2), em uma proporção de 1:1, em camundongos NSG não irradiados letalmente (150 Rad) (CD45.1). Fig. 7b, Percentagem e número de ILC2s doadoras no intestino. WT n = 12; Nmur1^A n =

12. Fig. 7c, Percentagem e número de ILC2s doadoras no pulmão. WT n = 12; Nmurl ⁷' n = 12. Barras de erro mostram s.e.m. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; NS não significativo.

[0037] Figura 8. Uma nova unidade neurônio-ILC2 orquestrada por Neuromedina U. Neuromedina U derivada de neurônio ativa diretamente ILC2s de um modo dependente de NMUR1, resultando em uma produção potente de citocinas do tipo 2 inflamatórias e de reparação de tecido que conferem proteção contra a infecção por parasita. Neuromedina U ativa NMUR1 com induz a expressão de citocinas do tipo 2 a jusante de fosforilação de ERK e a ativação de uma cascata de Ca²⁺ / Calcineurina / NFAT. Este modelo sugere que as unidades celulares neurônio-ILC2 estão preparadas para exclusivamente assegurar respostas do tipo 2 potentes e imediatas em uma forma dependente de Neuromedina U.

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12/65 [0038] Figuras 9a-9i: Fig. 9a, Análise por RT-PCR quantitativa de Nmurt nos pulmões no dia 6 após infecção com Nippostrongylus brasiliensis (NB) nos pulmões. Eosinófilos (EO); Mastócitos (mast); Macrófagos (ΜΘ); Neutrófilos (Neu); Células T puras (T); Células linfoides inatas do tipo 2 (ILC2). Fig. 9b, Expressão de Nmurt em células adaptativas humanas (células T CD4) e linfócitos do tipo 2 inatas ILC2 de sangue. Fig. 9c, Expressão de genes de citocinas do tipo 2 em ILC2 humana e Th2 após estimulação in vitro com o peptídeo NmU25. Fig. 9d, Expressão de Nmurt em ILC2 pulmonar antes e depois da infecção (no dia 6). Fig. 9e, Expressão de Nmurt em estado estacionário em progenitor linfoide comum (CLP); progenitor linfoide inato auxiliar comum (CHILP), progenitor de ILC2 da medula óssea (ILC2P) e Eo, Mast, ΜΘ, Neu, células dendríticas (DC); Células T puras (T); Células T-auxiliares 2 (Th2); Células T de memória, Células B (B), Células gliais da lâmina própria (G) e Neurônios (Ν). n = 3-6. Fig. 9f, Expressão do gene de citocina do Tipo 2 em ILC2 intestinal e Th2 após estimulação in vitro com o peptídeo NmU23 (100 mg/mL). n = 3-6. Fig. 9g, Análise confocal da lâmina própria intestinal. Verde: neurônios (ReP^FP); Ciano: KLRG1; parasitalho: CD3. Ciano: KLRG1. Fig. 9h, Neurônios derivados de Neurosfera. Parasitalho: TUJ1. Azul: DAPI. Fig. 9i, Ativação de neurônios derivados de neuroesferas com proteínas excretoras / secretoras de alarminas, TLRligandos e N. brasiliensis (NES). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****p < 0,0001; NS não significativo.

[0039] Figuras 10a-10d: Fig. 10a, Expressão de Ki67 em ILC2s intestinais após uma estimulação in vitro durante a noite com NmU23 sozinho (100 ng/mL, Phoenix Pharmaceutical) ou NmU23 em conjunto com a citocinas interleucina sobreviventes (IL)-2 e/ou IL-7 (100 ng/mL). Fig. 10b, Expressão de Ki67 em ILC2 intestinal após a administração in vivo de NmU23 (4 pg/dia durante 2 dias), n = 5. Fig. 10c, Citocinas do tipo 2 derivadas de ILC2 (IL-5, IL-13 e Anfirregulina (Areg)) em ILC2

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13/65 intestinal classificada após uma estimulação durante a noite com NmU23, IL-25 ou IL-33 recombinante de camundongo (R&D) (10, 50 e 100 ng/mL). Controle negativo: ILC2 não estimulada, controle positivo: ILC2 ativada com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, 50 ng/ml) mais ionomicina (500 ng/ml). n = 3. Fig. 10d, Esquemas de pontos representativo da produção de citocina com o aumento da dose de NmU23, rlL25 e rlL-33. *P < 0,05; **P < 0,01; ****P < 0,0001; NS não significativo. [0040] Figuras 11a-11b: ILC2 foram privadas de FBS durante 2 horas antes do tratamento quer com (Fig 11 a.) 11R-VIVIT (inibe a ativação de NFAT) (10 μΜ) ou (Fig 11b.) ciclosporina A (CsA, 100 pM). A expressão de citocinas do tipo 2 foi medida por RT-PCR quantitativa (Figuras 11a, 11b). n = 3-6. Fig. 11c, ILC2 privada de Lâmina Própria foi estimulada 90' com NmU23 (100 ng/mL), fixada, permeabilizada e corada com anticorpo monoclonal anti-NFAT2 (abeam). As células foram analisadas por microscopia confocal. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****p < 0,0001; NS não significativo.

[0041] Figuras 12a-12f: (Figuras 12a-12c.) Camundongos foram infectados com larvas Λ/. brasiliensis e tratados com peptídeo NmU23 (8 pg/dia) ou PBS (controle). Os pulmões foram analisados no dia 2 pósinfecção. Fig. 12a, Resposta de ILC2 em pulmões de camundongos tratados com NmU23 (n = 5) comparados com controle (n = 5). Fig. 12b, Carga de infecção nos pulmões de camundongos infectados tratados com PBS (n = 5) ou NmU23 (n = 5). Fig. 12c, Hemorragia pulmonar em pulmão de camundongos infectados tratados com NmU23 comparado com controle. (Figuras 12d-12f) Os camundongos foram infectados com larvas N. brasiliensis e tratados com peptídeo NmU23 (8 pg/dia) ou PBS (controle). Os pulmões e intestino delgado foram analisados no dia 6 pós-infecção. Fig. 12d, Infiltrados de neutrófilos e eosinófilos em lavagem bronco-alveolar (BAL) em animais infectados tratados com NmU23

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14/65 contra PBS. Controle Ν = 5; NmU23 η = 5. Fig. 12e, Infiltrados de mastócitos e macrófagos na lavagem bronco-alveolar (BAL) em animais infectados tratados com NmU23 versus PBS. Controle n = 5; NmU23 n =

5. Fig. 12f, Carga de infecção no intestino delgado de camundongos infectados tratados com PBS (n = 5) ou NmU23 (n = 5). Barras de erro mostram s.e.m. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; NS não significativo.

[0042] Figuras 13a-13c: Nmurff' e os seus controles de mesma ninhada WT foram infectados com N. brasiliensis e analisados no dia 6 pós-infecção. Fig. 13a, Resposta de ILC2 em pulmões infectados Nmurff' e seus controles de mesma ninhada WT pós-infecção D6. WT n = 6; Nmurl ⁷' n = 8. Fig. 13b, Infiltrados de neutrófilos (Neu) e eosinófilos (Eos) na lavagem bronco-alveolar (BAL) em Nmurl ⁷' infectado e os seus controles de mesma ninhada WT. WT n = 6; Nmurff' n = 7. Fig. 13c, Infiltrados de mastócitos e macrófagos na lavagem bronco-alveolar (BAL) em Nmurl ⁷' infectado e os seus controles de mesma ninhada WT. WT n = 6; Nmurl ⁷' n = 7. Barras de erro mostram s.e.m. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; NS não significativo.

[0043] Figuras 14a-14c: Quimeras de medula óssea competitivas tratadas com NmU23. Fig. 14a, 10⁶ células de cadagenótipo (CD45.2), foram injetadas por via intravenosa em competição direta com um competidor WT de terceiros (CD45.1/CD45.2), em uma proporção de 1:1, em camundongos NSG não letalmente irradiados (150 Rad) (CD45.1). Os camundongos receberam uma injeção de PBS ou NmU23 (20 pg). Fig. 14b, Percentagem e número de ILC2s doadoras nos pulmões. WT n = 5; Nmurl ⁷' n = 5. Figura 14c, Percentagem e número de células T doadoras nos pulmões. WT n = 5; Nmurl ⁷' n = 5. Barras de erro mostram s.e.m. *P < 0,05;. **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; NS não significativo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

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15/65 [0044] Células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) são importantes reguladores da inflamação, reparação de tecidos e homeostase metabólica¹’². Ativação de ILC2 foi mostrada por citocinas derivadas de hospedeiro e alarminas¹’², mas, como ILC2s respondem a sinais derivados neuronais permanece por esclarecer.

[0045] Tal como aqui descrito, foi determinado que ILC2s expressam o receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) e que o neuropeptídeo Neuromedina U é um ativador potente de ILC2s. Neuromedina U resultou na produção rápida e forte do citocinas do tipo 2 interleucina 5 (IL5), IL-13 e Anfirregulina de uma forma dependente de NMUR1. Neuromedina U controlou ILC2 a jusante da ativação de ERK e ativação dependente de influxo de cálcio de citocinas Calcineurina e NFAT. Quando usados in vivo, o tratamento com Neuromedina U resultou em respostas de tipo 2 imediatas. Foi também demonstrado que a ablação de Nmurl levou a respostas do tipo 2 deficientes e fraco controle da infecção por parasita.

Atividade crescente de ILC2s [0046] Os métodos aqui descritos incluem métodos para aumentar a atividade ou a proliferação de células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) contatando ILC2s com um agonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) em uma quantidade eficaz para aumentar a atividade das ILC2s.

[0047] Os métodos aqui divulgados também incluem métodos para o tratamento de uma doença associada com as Células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) administrando a um objeto em necessidade de tal tratamento um agonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) em uma quantidade eficaz para tratar a doença.

[0048] Outros métodos para tratamento da doença incluem a administração a um objeto em necessidade de tal tratamento de uma composição compreendendo ILC2s ativadas, em uma quantidade eficaz

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16/65 para tratar a doença. Em alguns desses métodos, a composição que compreende ILC2s ativadas também inclui um agonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1). Alternativamente, um agonista de NMUR1 pode ser administrado separadamente da composição que compreende ILC2s ativadas.

[0049] Além disso, são providos aqui agonistas de NMUR1 para uso no tratamento de uma doença associada com ILC2s, e composições compreendendo ILC2s (e, opcionalmente, um agonista de NMUR1) para uso no tratamento de uma doença associada com ILC2s.

[0050] Tal como aqui utilizado, Receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) é um receptor transmembranar 7 da família da rodopsina, e também é conhecido como FM3, FM3, GPC-R, receptor acoplado à proteína G 66 (GPR66), e NMU1R. Como descrito aqui em outro local, um agonista de NMUR1 inclui uma Neuromedina U (NMU) ou um análogo da mesma, um anticorpo que especificamente se liga a e ativa NMUR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um ligando de molécula pequena de NMUR1.

[0051] O contato de ILC2s com um agonista de NMUR1 pode ser realizado in vitro, tal como em um protocolo de expansão de ILC2 realizado para produzir ILC2s, ou pode ser realizado in vivo. Em algumas modalidades de métodos em que o contato de ILC2s com um agonista de NMUR1 é realizado in vivo, o agonista de NMUR1 é administrado a um objeto, tal como um humano. Em alguns desses métodos, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1.

[0052] Nos métodos divulgados, o objeto pode ser um humano. Em alguns desses métodos, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1 e/ou tratamento com as ILC2s ativadas.

[0053] Doenças tratáveis pelos métodos descritos incluem infecção,

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17/65 reparação de tecidos, cicatrização de feridas, obesidade, doenças tratáveis por aumento da indução de respostas imunes do tipo 2, doenças tratáveis pela regulação metabólica, doenças tratáveis por aumento de eosinófilos, e doenças tratáveis por aumento de mastócitos.

[0054] O agonista de NMUR1 e/ou as ILC2s ativadas podem ser administrados por qualquer via adequada de administração ou método de entrega. As vias adequadas de administração incluem a intravenosa, oral, nasal, retal ou através de absorção através da pele.

[0055] O agonista de NMUR1 e/ou as ILC2s ativadas podem ser administradas em qualquer intervalo de tempo adequado, incluindo diariamente, duas vezes por dia, três vezes por dia, quatro vezes por dia, em dias alternados, semanalmente, de duas em duas semanas, de quatro em quatro semanas, continuamente (por exemplo, por infusão, adesivo, ou bomba), e assim por diante.

Diminuir atividade de ILC2s [0056] Métodos adicionais aqui divulgados incluem métodos para diminuir a atividade ou a proliferação de células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) contatando ILC2s com um antagonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) ou um antagonista de NMU (ou ambos), em uma quantidade eficaz para diminuir a atividade das ILC2s.

[0057] Os métodos aqui divulgados também incluem métodos para o tratamento de uma doença associada com as células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) por administração a um objeto em necessidade de tal tratamento de uma antagonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) em uma quantidade eficaz para tratar a doença.

[0058] Também aqui proporcionados são antagonistas de NMUR1 para uso no tratamento de uma doença associada com ILC2s.

[0059] Como descrito aqui em outro local, um antagonista de NMUR1 inclui uma molécula de ácido nucleico inibidor que reduz a expressão, transcrição ou tradução de NMUR1, tal como um sRNA,

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18/65 shRNA, ou molécula de ácido nucleico antissenso; um anticorpo que especificamente se liga a e inibe NMUR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um antagonista de pequena molécula de NMUR1.

[0060] O contato de ILC2s com um antagonista de NMUR1 pode ser realizado in vitro, ou pode ser realizado in vivo. Em algumas modalidades de métodos em que o contato de ILC2s com um antagonista de NMUR1 é realizado in vivo, o antagonista de NMUR1 é administrado a um objeto, tal como um humano. Em alguns desses métodos, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além do antagonista de NMUR1.

[0061] Nos métodos divulgados, o objeto pode ser um humano. Em alguns desses métodos, o objeto não está em necessidade de outro tratamento além do antagonista de NMUR1.

[0062] Nos métodos aqui divulgados para o tratamento de doenças por administração de um antagonista de NMUR1, a doença pode ser alergia, asma alérgica, alergia alimentar, esofagite eosinofílica, dermatite atópica, fibrose, rinite alérgica, rinossinusite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística, doenças tratáveis por redução de respostas imunes do Tipo 2, doenças tratáveis por redução eosinófilos, ou doenças tratáveis por redução de mastócitos.

[0063] O antagonista de NMUR1 pode ser administrado por qualquer via adequada de administração ou forma de entrega. As vias adequadas de administração incluem a intravenosa, oral, nasal, retal ou através de absorção através da pele.

[0064] O antagonista de NMUR1 pode ser administrado em qualquer intervalo de tempo adequado, incluindo diariamente, duas vezes por dia, três vezes por dia, quatro vezes por dia, em dias alternados, semanalmente, de duas em duas semanas, de quatro em quatro semanas, continuamente (por exemplo, por infusão, remendo ou bomba), e

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19/65 assim por diante.

Aqonistas de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) [0065] Agonistas de NMUR1 incluem agonistas de peptídeos (incluindo peptídeos e conjugados modificados), ativação de moléculas de anticorpos e moléculas pequenas. Agonistas de peptídeos incluem Neuromedina U (também conhecida como e referida aqui como NMU ou NmU) ou seus análogos. Os agonistas de NMUR1 pode ser inteiramente específico para NMUR1, pode agonizar NMUR1 preferivelmente (em comparação com o receptor 2 de Neuromedina U, NMUR2), ou pode tanto agonizar NMUR1 quanto NMUR2. Estes agonistas podem ser úteis mesmo que NMUR1 seja agonizado menos do que NMUR2, mas prefere-se que os agonistas usados nos métodos aqui descritos agonizem NMUR1 para uma extensão maior do que NMUR2. Tal como utilizado aqui agonizar NMUR1 preferivelmente (em comparação com o receptor 2 de Neuromedina U, NMUR2) significa que o agonista agoniza NMUR1, pelo menos, 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, ou mais do que NMUR2.

[0066] Neuromedina U (também aqui referida como NMU) é um neuropeptídeo conservado em várias espécies, que foi isolado na forma de um peptídeo que consiste em 25 resíduos de aminoácidos (NMU-25) ou como um peptídeo que consiste de 8 resíduos de aminoácidos (NMU-8), a partir de intestino delgado de suínos. NMU-8 consiste em 8 resíduos C-terminais de NMU25 de porcino. NMU-25 também está presente em seres humanos, e é preferido para uso em seres humanos. Os 8 resíduos de aminoácidos C-terminais de NMU-25 humano (também referido como NMU-8) são os mesmos que aqueles 8 resíduos de aminoácidos C-terminais de NMU-8 porcino. Os 8 aminoácidos no Cterminal de NMU-25 são os mais altamente conservados e este peptídeo tem sido mostrado ter uma atividade semelhante a NMU-25. NMU de rato consiste em 23 resíduos de aminoácidos, e é conhecido como

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NMU-23. A sequência de aminoácidos de 8 resíduos C-terminais de NMU-23 de rato difere dos 8 resíduos de C-terminais de NMU-8 de porcino por um resíduo de aminoácido. Proteína precursora de NMU (e seus peptídeos clivados) também pode ser utilizada nos métodos aqui descritos. Proteína precursora de NMU é uma proteína de 174 aminoácidos de comprimento.

[0067] Sequências de aminoácidos da proteína precursora de NMU e NMU são fornecidas como se segue:

Proteína precursora de NMU (P48645INMU_HUMAN Neuromedin-U OS=Homo sapiens GN=NMU PE=1 SV=1) MLRTESCRPRSPAGQVAAASPLLLLLLLLAWCAGACRGAPILPQGLQPEQQLQLWNEIDDTCSSFLSIDSQPQASNALEELCFMIMGMLPKPQEQDEKDNTKRFLF HYSKTQKLGKSNWSSVVHPLLQLVPHLHERRMKRFRVDEEFQSPFASQSRGYFLFRPRNGRRSAGFI (SEQ ID NO: 1)

NMU25

FRVDEEFQSPFASQSRGYFLFRPRN (SEQ ID NO: 2)

NMU23

FKAEYQSPSVGQSKGYFLFRPRN (SEQ ID NO: 3)

NMU8

YFLFRPRN (SEQ ID NO: 4) [0068] Agonistas de NMUR1 incluem análogos de NMU, derivados e conjugados, tais como análogos de NMU tendo variações na sequência de aminoácidos em relação às sequências de NMU naturais, mas que retêm a função de ligação a e ativação de NMUR1. Outros exemplos de análogos, derivados e conjugados de NMU incluem: os peptídeos modificados de Takayama et al. (ACS Med Chem Lett. 12 de março de 2015; 6(3): 302-307); os análogos de NMU-8 de Inooka et al. (Bioorg Med Chem. 21 de fevereiro de 2017. pii: S0968-0896(17)301086); os derivados PEGylados de NMU de Ingallinella et al. (Bioorg Med

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Chem. 1 de agosto de 2012; 20(15):4751-9); o conjugado albumina sérica humana (HSA)-NMU de Neuner et al. (J Pept Sci. Janeiro de 2014; 20(1):7-19); ao análogos de NME conjugados com lipidios / truncados de Micewicz (Eur J Med Chem. 28 de agosto de 2015; 101:616-26); e os análogos de NMU lipidados de DalbOge et al. (J Pept Sci. Fev. de 2015; 21(2):85-94).

[0069] Conforme descrito em US 2011/0294735 e WO 2007/109135 (cada um aqui incorporado por referência para a recitação específica dos compostos que se seguem), agonistas de NMUR1 adicionais compreendem a fórmula geral (I)

Z¹-peptídeo-Z² (I) em que o peptídeo tem a sequência de aminoácidos X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X8- X9 X10 - X11 - X12 - X13 - X14 - X15 - X16 X17 - X18 - X19 - X20 - X21- X22 - X23 - X24 - X25, em que os aminoácidos 1 a 17 pode ser qualquer aminoácido ou ausente, em que o aminoácido X18 está ausente, Y, W, F, um des-aminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é um aminoácido A, W, Y, F ou alifático; aminoácidos X20 está ausente, G, L, sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou A; aminoácido X21 é F, NMe-Phe, um aminoácido alifático, um aminoácido aromático, A ou W; X22 é R, K, A ou G; aminoácidos X23 é P, Sar, A ou G; aminoácido X24 é R, Harg ou K; e aminoácidos X25 é N, qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-NIe, A; e Z1 é um grupo protetor opcionalmente presente, que, se presente, é unido ao grupo amino Nterminal; e Z2 é um grupo NH2 ou um grupo protetor opcionalmente presente que, se presente, está unido ao grupo carbóxi C-terminal, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[0070] Como descrito em US 2012/0094898 (aqui incorporado por referência para a recitação específica dos compostos que se seguem), agonistas de NMUR1 adicionais incluem derivados de peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em

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PEG20k(AL)-p-Ala-Tyr-Nal(l)-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH2, PEG20k(AL)-p-Ala-Tyr-Nal(2)-Leu-Phe-Arg-Pro-Arg-Asn-NH2, PEG20k (AL) -NpipAc-Tyr-Nal (2) -Leu-Arg-Phe-Pro-Arg-Asn-NH2, PEG20k(AL)-NpipAc-Tyr-Nal(2)-Leu-Phe-Arg-Ala-Arg-Asn-NH2. PEG20k(AL)-PEG(2)-Tyr-Nal(2)-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH2, PEG20k(AL)-Pic(4)-Tyr-Nal(2)-Leu-Phe-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH2, PEG20k (AL)-Acp-Tyr-Nal (2) -Leu-Fen-Arg-NMeAla-Arg-Asn-NH2, e PEG20k (AL)-p-Ala-Tir-Nal (2)-Leu-Pya (4)-Arg-Pro-Arg-Asn-NH2, ou um sal de qualquer dos derivados peptidicos.

[0071] Como descrito em WO 2011/005611 (aqui incorporado por referência para a recitação específica dos compostos que se seguem), agonistas de NMUR1 adicionais incluem composições que compreendem a fórmula

Z¹-peptídeo-Z² em que o peptídeo tem a sequência de aminoácidos X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7- X8- X9 X10 - X11 - X12 - X13 - X14 - X15 X16 - X17 - X18 - X19 - X20 - X21- X22 - X23 - X24 - X25 , em que os aminoácidos 1 a 17 podem ser qualquer aminoácido ou ausente; em que o aminoácido X18 está ausente, Tyr ou D-Tyr, Leu, Phe, Vai, Gin, Nle, Glu ou D-Glu, Asp, Ala, D-Lys, um aminoácido aromático, um desaminoácido ou um grupo acila; aminoácido X19 é Ala, Trp, Tyr, Phe, Glu, Nva, Nle ou um aminoácido aromático; aminoácidos X20 está ausente, Leu, Gly, sarcosina (Sar), D-Leu, NMe-Leu, D-Ala ou Ala, ou qualquer D- ou L-aminoácido; aminoácido X21 é Phe, NMe-Phe, um aminoácido alifático, um aminoácido aromático, Ala ou Trp; X22 é Arg, Lys, Harg, Ala, ou Leu; aminoácido X23 é Pro, Ser, Sar, Ala ou Leu; aminoácido X24 é Arg, Harg ou Lys; e aminoácido X25 é Asn, qualquer D- ou L-aminoácido, Nle ou D-NIe, D-Ala ou Ala; Z1 é opcionalmente um grupo protetor que, se presente, está unido ao grupo amino N-terminal; e Z2 é um grupo NH2 ou um grupo protetor opcionalmente presente que, se

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23/65 presente, está unido ao grupo carbóxi C-terminal, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[0072] Como descrito em WO 2010/138343 (aqui incorporado por referência para a recitação específica dos compostos que se seguem), agonistas de NMUR1 adicionais incluem composições que compreendem um agonista do receptor de Neuromedina U, em que Neuromedina U ou um seu análogo é conjugado com resíduo de cisteína 34 de albumina de soro humano por uma ligação não-maleimida ou não-succinimidila ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[0073] Como descrito em WO 2009/042053 (aqui incorporado por referência para a recitação específica dos compostos que se seguem), agonistas de NMUR1 adicionais incluem um agonista do receptor de neuromedina U representado pela seguinte fórmula:

Z¹-peptídeo-Z² em que o peptídeo tem a sequência de aminoácidos

ILQRGSGTAAVDFTKKDHTATWGRPFFLFRPRN (SEQ ID NO: 5), em que o peptídeo pode ter uma ou mais inserções ou substituições da sequência de aminoácido com um aminoácido alternativo e em que o peptídeo pode ter uma ou mais deleções da sequência de aminoácidos; Z é um grupo protetor presente, opcionalmente, que, se presente, está unido ao grupo amino N-terminal; e Z2 é um grupo NH2 ou um grupo protetor opcionalmente presente que, se presente, está unido ao grupo carbóxi C-terminal; e sais farmaceuticamente aceitáveis destes.

[0074] Como descrito em WO 2009/044918 (aqui incorporado por referência para a recitação específica dos compostos que se seguem), agonistas de NMUR1 adicionais incluem derivados de Neuromedina U selecionados a partir de polipeptídeos que consistem em uma sequência de aminoácidos que é ligada com um metoxipolietilenoglicol glicol (s) através de um ligante, em que a sequência de aminoácidos contém pelo

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24/65 menos 8 aminoácidos do C-terminal de uma sequência de aminoácidos de Neuromedina U, e é a mesma ou substancialmente a mesma que a sequência de aminoácidos de Neuromedina U.

Antagonistas de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) ou Neuromedina U (NMU) [0075] Antagonistas de NMUR1 incluem antagonistas de peptídeo (incluindo peptídeos e os conjugados modificados), moléculas de anticorpo inibidoras, moléculas de ácidos nucleicos inibidores, e pequenas moléculas. Os antagonistas de NMUR1 podem ser inteiramente específicos para NMUR1, podem antagonizar NMUR1 preferivelmente (em comparação com o receptor 2 de Neuromedina U, NMUR2), ou podem antagonizar tanto NMUR1 quanto NMUR2. Tais antagonistas podem ser úteis mesmo que NMUR1 seja antagonizado menos do que NMUR2, mas prefere-se que os antagonistas utilizados nos processos aqui descritos antagonizem NMUR1 em uma extensão maior do que NMUR2. Tal como aqui utilizado, antagonizar NMUR1 preferivelmente (em comparação com receptor 2 de neuromedina U, NMUR2) significa que o antagonista antagoniza NMUR1, pelo menos, 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, ou mais do que NMUR2.

[0076] Como descrito em US 2011/0165144 (aqui incorporado por referência para a recitação específica dos compostos que se seguem), os antagonistas adicionais de NMU e NMUR1 incluem (i) um ácido nucleico inibidor específico de Neuromedina U (NMU), por exemplo, um siRNA, antissenso, aptâmero, ou ribozimas dirigidos especificamente a NMU;

(ii) um peptídeo inibidor de Neuromedina U (NMU), por exemplo, um peptídeo compreendendo a sequência Phe-Arg-Pro-ArgAsn (SEQ ID NO: 6); ou (iii) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do

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25/65 mesmo que se liga a um NMU-R, por exemplo, NMU-R1, e inibe a sinalização de NMU, por exemplo, inibe a ligação de NMU à NMU-R1.

[0077] Antagonistas de NMUR1 adequados também podem incluir:

(i) um ácido nucleico inibidor específico de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1), por exemplo, um siRNA, antissenso, aptâmeros, ou ribozimas dirigidos especificamente à NMUR1; ou [0078] Antagonistas de NMU adequados também podem incluir:

(i) uma molécula de NMUR1 solúvel que se liga à NMU, tal como uma porção extracelular de NMUR1 (por exemplo, os aminoácidos 1 - 65 de UniProtKB - Q9HB89) opcionalmente ligado ou acoplado a uma outra sequência polipeptídica para a estabilidade ou outras funções, tais como uma região Fc de imunoglobulina; e (ii) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a um NMU, por exemplo, NMU-8, NMU-23, ou NMU25, e inibe a sinalização de NMU, por exemplo, inibe a ligação de NMU à NMU-RL.

[0079] Um objeto deverá significar um mamífero humano ou vertebrado, incluindo, mas não limitado a um cão, gato, cavalo, cabra e primatas não humanos, por exemplo, macaco. De preferência, o objeto é um ser humano. Em algumas modalidades o objeto é um que não esteja de outro modo necessitando de tratamento com um agonista de NMUR1 ou antagonista de NMUR1. Por conseguinte, o objeto, em modalidades especificamente identificadas, pode ser um que não tenha sido previamente diagnosticado com uma doença para a qual um agonista de ou antagonista de NMUR1 é uma forma de tratamento identificada.

[0080] O objeto pode ser identificado pela primeira vez como um objeto em necessidade de tratamento, tal como um tendo uma doença que é tratável pelos métodos aqui descritos, e, em seguida, tratado com um agonista de NMUR1 (e/ou ILC2s ativadas) ou antagonista de

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NMUR1. O especialista na técnica está ciente dos métodos para identificar um objeto como tendo uma doença que é tratável pelos métodos aqui divulgados.

[0081] Tal como aqui utilizado, os termos tratar, tratado ou tratamento refere-se a um tratamento de uma doença que melhora a doença (modificação de doença), melhora sintomas da doença, impede que a doença piore, ou retarda a progressão da doença em comparação com a ausência da terapia.

[0082] Uma doença associada com as células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) como aqui utilizada é uma doença ou distúrbio em que ILC2s desempenham algum papel no desenvolvimento, manutenção ou agravamento da doença ou distúrbio.

[0083] Em alguns dos processos aqui descritos, tais doenças podem ser tratadas eficazmente por aumento da atividade ou proliferação de ILC2s, tal como contatando ILC2s com um agonista de receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) em uma quantidade eficaz para aumentar a atividade das ILC2s; por administração a um objeto em necessidade de tal tratamento de um agonista de NMUR1 em uma quantidade eficaz para tratar a doença; ou por administração de ILC2s ativadas (e, opcionalmente, um agonista de NMUR1) em uma quantidade eficaz para tratar a doença.

[0084] Doenças tratáveis por tais métodos incluem: infecção, reparação de tecidos, cicatrização de feridas, obesidade, doenças tratáveis por aumento da indução de respostas imunes do tipo 2, doenças tratáveis por regulação metabólica, doenças tratáveis por aumento de eosinófilos, e doenças tratáveis por aumento mastócitos [0085] Em outro do método aqui descrito, as doenças podem ser tratadas eficazmente diminuindo a atividade ou a proliferação de ILC2s, tal como contatando ILC2s com um antagonista de receptor 1 de Neu

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27/65 romedina II (NMUR1) em uma quantidade eficaz para diminuir a atividade das ILC2s; ou por administração a um objeto em necessidade de tal tratamento de uma antagonista de NMUR1 em uma quantidade eficaz para tratar a doença.

[0086] Doenças tratáveis por tais métodos incluem: alergia, asma alérgica, alergia alimentar, esofagite eosinofílica, dermatite atópica, fibrose, rinite alérgica, rinossinusite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose cística, doenças tratáveis por redução de respostas imunes do Tipo 2, doença tratável por redução de eosinófilos, ou doenças tratáveis por redução de mastócitos.

[0087] A toxicidade e a eficácia dos métodos da presente invenção podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinação da LD₅o (a dose letal para 50% da população) ou TD₅o (dose tóxica para 50% da população) e ED₅o (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50 ou TD50/ED50. Os agentes terapêuticos que exibem índices terapêuticos grandes são preferidos. Embora possam ser utilizados agentes terapêuticos que exibam efeitos colaterais tóxicos, em tais casos é preferível usar um sistema de entrega que direcione tais agentes para 0 sítio do tecido afetado de modo a minimizar potenciais danos a outras células ou tecidos e, com isso, reduzir os efeitos colaterais.

[0088] Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de células e/ou estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem dos agentes terapêuticos para uso em seres humanos. A dosagem de tais agentes reside de preferência dentro de uma gama de concentrações que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para

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28/65 qualquer agente utilizado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura celular. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma gama de concentração no plasma circulante que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge uma inibição semimáxima dos sintomas) como determinado em cultura celular. Tal informação pode ser utilizada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos.

[0089] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 0,1 % de um composto ativo. Em outras modalidades, 0 composto ativo pode compreender entre cerca de 2% a cerca de 75% do peso da unidade, ou entre cerca de 25% a cerca de 60%, por exemplo, e qualquer gama derivável. Outras percentagens mais elevadas, de um composto ativo também podem ser usadas.

[0090] As composições farmacêuticas podem também ser, e preferivelmente são, estéreis, em algumas modalidades. Em outras modalidades os compostos podem ser isolados. Tal como aqui utilizado, 0 termo isolado significa que 0 material referido é removido do seu ambiente nativo, por exemplo, uma célula. Assim, um material biológico isolado pode ser livre de alguns ou todos os componentes celulares, ou seja, componentes das células nas quais 0 material nativo está ocorrendo naturalmente (por exemplo, componentes, citoplasmáticos ou membrana). No caso de moléculas de ácido nucleico, um ácido nucleico isolado inclui um produto de PCR, um RNA isolado, um RNA produzido sinteticamente (por exemplo, química), tal como um siRNA, um ácido nucleico antissenso, um aptâmero, etc. As moléculas de ácido nucleico isoladas incluem sequências inseridas em plasmídeos, cosmídeos, ou outros vetores para formar parte de um construto de ácido nucleico re

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29/65 combinante, quimérico, ou produzida por expressão de um ácido nucleico que a codifica. Assim, em uma modalidade específica, um ácido nucleico recombinante é um ácido nucleico isolado. Uma proteína isolada pode estar associada com outras proteínas ou ácidos nucleicos, ou ambos, com os quais se associam na célula, ou com membranas celulares se for uma proteína associada por membrana, ou pode ser sinteticamente (por exemplo, quimicamente) produzida, ou produzida por expressão de um ácido nucleico que a codifica. Uma célula isolada, tal como uma célula ILC2, pode ser removida do sítio anatômico em que se encontra em um organismo, ou pode ser produzida por expansão in vitro de uma célula isolada ou população de células. Um material isolado pode ser, mas não precisa de ser, purificado.

[0091 ] O termo purificado, em referência a uma proteína, um ácido nucleico, ou uma célula ou população de células, refere-se à separação da substância desejada de contaminantes a um grau suficiente para permitir que o médico use a substância purificada para o objetivo desejado. De preferência, isto significa que pelo menos uma ordem de grandeza de purificação é alcançada, mais preferivelmente duas ou três ordens de grandeza, mais preferivelmente quatro ou cinco ordens de grandeza de purificação do material de partida ou do material natural. Em modalidades específicas, um agonista purificado de NMUR1 ou antagonista da população de NMUR1 ou ILC2 pelo menos 60%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90% da proteína total ou ácido nucleico ou população celular, conforme o caso, em peso. Em uma modalidade específica, um agonista purificado de NMUR1 ou antagonista da população de NMUR1 ou ILC2 é purificada para homogeneidade como ensaiado por protocolos laboratoriais relevantes, padrão.

[0092] Em algumas modalidades, uma molécula purificada e ou isolada é uma molécula sintética. As doses do objeto dos compostos aqui descritos variam tipicamente entre cerca de 0,1 pg a 10.000 mg, mais

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30/65 tipicamente entre cerca de 1 pg/dia e 8000 mg, e mais tipicamente entre cerca de 10 pg e 100 pg. Dito em termos de peso corporal do objeto, as dosagens típicas variam entre cerca de 1 micrograma/kg/peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 10 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 50 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 100 micrograma/kg/peso corporal, cerca de 200 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 350 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 500 microgramas/kg/peso corporal, cerca de 1 miligrama/kg/peso corporal, cerca de 5 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 10 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 50 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 100 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 200 miligramas/kg/peso, a cerca de 350 miligramas/kg/peso corporal, cerca de 500 miligramas/kg/peso corporal, a cerca de 1000 mg/kg/peso corporal ou mais por administração, e qualquer gama derivável. Em exemplos não limitativos de uma gama derivável a partir dos números listados aqui, uma gama de cerca de 1 mg/kg/peso corporal a cerca de 100 mg/kg/peso corporal, cerca de 5 microgramas/kg/peso corporal a cerca de 500 miligramas/kg/peso corporal, etc., pode ser administrada, com base nos números descritos acima. A quantidade absoluta dependerá de uma variedade de fatores, incluindo o tratamento concomitante, o número de doses e parâmetros individuais do doente incluindo a idade, condição física, tamanho e peso. Estes são fatores bem conhecidos dos versados na técnica e podem ser abordados com não mais do que experimentação de rotina. Prefere-se geralmente que uma dose máxima seja utilizada, ou seja, a dose mais elevada segura de acordo com uma avaliação idônea médica. Múltiplas doses das moléculas da invenção são também contempladas.

[0093] Os compostos e/ou células aqui descritos podem ser usados por si só, sem outros agentes terapêuticos ativos, ou podem ser combi

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31/65 nados com outros compostos terapêuticos para o tratamento das doenças aqui descritas.

[0094] Quando utilizado em combinação com os compostos e as células aqui descritas, as dosagens de terapias conhecidas podem ser reduzidas em alguns casos, para evitar efeitos colaterais. Em alguns casos, quando os compostos e/ou células aqui descritos são administrados com um outro terapêutico, uma dose subterapêutica de qualquer um dos compostos e/ou células aqui descritos ou terapias conhecidas, ou uma dose subterapêutica de ambos, é usada no tratamento de um objeto. Uma dose subterapêutica, tal como aqui utilizada refere-se a uma dosagem que é menor do que a dosagem que iria produzir um resultado terapêutico no objeto, se administrada na ausência de outro agente. Portanto, a dose subterapêutica de uma terapia conhecida é aquela que não produziría o resultado terapêutico desejado no objeto na ausência da administração dos compostos e das células aqui descritos. Terapias existentes para as doenças aqui descritas são bem conhecidas no campo da medicina, e podem ser descritas em referência tal como Remington’s Pharmaceutical Sciences; bem como muitas outras referências médicas invocadas pela profissão médica como orientação para o tratamento.

[0095] Quando os compostos e/ou células aqui descritos são administrados em combinação com outros agentes terapêuticos, tal administração pode ser simultânea ou sequencial. Quando outros agentes terapêuticos são administrados simultaneamente, eles podem ser administrados na mesma formulação ou separados, mas são administrados ao mesmo tempo. A administração do outro agente terapêutico e os compostos e/ou células aqui descritos também pode ser temporalmente separada, o que significa que os outros agentes terapêuticos são administrados a um tempo diferente, quer antes ou após, a administração dos compostos e das células aqui descritos. A separação temporal entre a

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32/65 administração destes compostos pode ser uma questão de minutos, ou pode ser mais longa.

[0096] Os agentes ativos da presente invenção (por exemplo, os compostos e as células aqui descritos) são administrados ao objeto, em uma quantidade eficaz para o tratamento da doença. De acordo com alguns aspectos da invenção, uma quantidade eficaz é aquela quantidade, dependendo da doença a ser tratada, de um agonista de NMUR1 (e/ou ILC2s ativadas) ou antagonista de NMUR1 sozinho ou em combinação com outro medicamento, que quando combinados ou coadministrados ou administrados sozinho, resulta em uma resposta terapêutica para a doença. O efeito biológico pode ser a melhora ou eliminação absoluta da doença, ou dos sintomas resultantes da doença. Em outra modalidade, o efeito biológico é a anulação completa da doença, como evidenciado, por exemplo, pela ausência de um sintoma da doença.

[0097] A quantidade eficaz de um composto (ou seja, qualquer um dos agonistas, antagonistas, ou ILC2s) utilizado nos métodos da invenção no tratamento de uma doença aqui descrita, pode variar dependendo do composto específico utilizado, o modo de entrega do composto, e se é utilizado sozinho ou em combinação. A quantidade eficaz para qualquer aplicação particular pode também variar dependendo de fatores tais como a doença a ser tratada, o composto particular a ser administrado, o tamanho do objeto, ou a gravidade da doença ou condição. Um versado na técnica comum pode determinar empiricamente a quantidade eficaz de uma molécula particular da invenção, utilizando métodos de rotina e aceites conhecidos na técnica, sem necessidade de experimentação indevida. Combinado com os ensinamentos aqui proporcionados, escolhendo entre os vários compostos ativos e fatores de ponderação tais como potência, biodisponibilidade relativa, peso corporal do paciente, gravidade dos efeitos colaterais adversos e modo preferido de administração, pode ser planeado um regime de tratamento

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33/65 terapêutico eficaz que não cause toxicidade substancial e ainda seja eficaz para tratar o objeto em particular.

[0098] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz de um ou mais agentes, dissolvidos ou dispersos em um veículo farmaceuticamente aceitável. As frases farmacêuticas ou farmacologicamente aceitáveis referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação inconveniente adversa, alérgica ou outra quando administradas a um animal, tal como, por exemplo, um humano, como apropriado. Além disso, para os animais de administração (por exemplo, humano), deve-se entender que as preparações devem cumprir esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza conforme requerido pelas agências reguladoras governamentais relevantes. Os compostos são geralmente adequados para administração a seres humanos. Este termo requer que um composto ou composição seja não tóxico e suficientemente puro de modo que não seja necessária qualquer manipulação adicional do composto ou composição antes da administração a humanos.

[0099] Tal como aqui utilizado, veículo farmaceuticamente aceitável inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, surfactantes, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de retardamento da absorção, sais, conservantes, medicamentos, estabilizadores de drogas, geles, ligantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, corantes, tais como os materiais e combinações dos mesmos, como seria conhecido de um versado na técnica comum (vide, por exemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences (1990), aqui incorporado por referência). Exceto na medida em que qualquer veículo convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, o seu uso nas composições terapêuticas ou farmacêuticas é contemplado.

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34/65 [00100] As composições terapêuticas utilizadas como aqui descritas podem compreender diferentes tipos de veículos, dependendo de se é para ser administrado no estado sólido, líquido ou aerossol, e, se necessita de ser estéril para tais vias de administração como injeção. Os compostos e/ou células aqui descritos podem ser administrados por via intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intralesional, intracraniana, intra-articular, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, tópica, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, intravesicular, através das mucosas, oral, local, por inalação (por exemplo, inalação de aerossóis), por injeção, por infusão incluindo por infusão contínua, por perfusão localizada, através de um cateter, por meio de uma lavagem, em cremes, em composições de lipídios (por exemplo, lipossomas), ou por outro método ou qualquer combinação dos acima como seria conhecido por um versado comum na técnica (vide, por exemplo, Remington’ Pharmaceutical Sciences) e como é apropriado para a doença a ser tratada.

[00101] Em qualquer caso, a composição pode compreender vários antioxidantes para retardar a oxidação de um ou mais componentes. Além disso, a prevenção da ação de micro-organismos pode ser provocada por vários conservantes, tais como agentes antibacterianos e antifúngicos, incluindo, mas não se limitando a parabenos (por exemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal ou suas combinações.

[00102] Os compostos aqui descritos podem ser formulados em uma composição em uma base livre, neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico ou o ácido mandélico. Os sais formados com

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35/65 os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férricos; ou bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína.

[00103] Em modalidades em que os compostos e/ou células aqui descritos estão em forma líquida, um veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão que compreende, mas não se limita a, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno líquido glicol, etc.), lipídios (por exemplo, triglicerídeos, óleos vegetais, lipossomas) e suas combinações. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como a lecitina; pela manutenção do tamanho de partícula necessária por dispersão em veículos tais como, por exemplo, poliol líquido ou lipídios; pelo uso de surfactantes tais como, por exemplo, hidroxipropilcelulose; ou combinações destes métodos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, tais como, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio ou suas combinações.

[00104] Compostos e/ou células aqui descritos podem ser administrados de vários modos e a diferentes classes de receptores. Em alguns casos, a administração é crônica. A administração crônica refere-se à administração de longo prazo de uma droga para tratar uma doença. A administração crônica pode ser em uma base conforme necessária ou pode ser em intervalos regularmente programados. Por exemplo, os compostos e/ou células aqui descritos podem ser administrados duas vezes por dia, três vezes por dia, quatro vezes por dia, em dias alternados, semanalmente, de duas em duas semanas, de quatro em quatro semanas, continuamente (por exemplo, por infusão, adesivo, ou bomba), e assim por diante.

[00105] Os compostos e/ou células aqui descritos podem ser administrados diretamente a um tecido. Administração direta ao tecido pode

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36/65 ser alcançada através de injeção direta. Os compostos podem ser administrados uma vez ou, alternativamente, eles podem ser administrados em uma pluralidade de administrações. Se administrados várias vezes, os compostos podem ser administrados por diferentes vias. Por exemplo, a primeira (ou as primeiras) administração pode ser feita diretamente ao tecido afetado, enquanto administrações posteriores podem ser sistêmicas.

[00106] Os compostos e/ou células aqui descritos são administradas em soluções farmaceuticamente aceitáveis, que podem, rotineiramente, conter concentrações de sal farmaceuticamente aceitáveis, agentes tamponantes, conservantes, veículos compatíveis, adjuvantes e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos.

[00107] De acordo com os métodos aqui descritos, os compostos e/ou células aqui descritos podem ser administrados em uma composição farmacêutica. Em geral, uma composição farmacêutica compreende o composto da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis úteis com compostos e/ou células aqui descritos são bem conhecidos dos versados na técnica. Tal como aqui utilizado, um veículo farmaceuticamente aceitável significa um material não tóxico que não interfere com a eficácia da atividade biológica dos compostos e/ou células aqui descritos.

[00108] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem diluentes, enchimentos, sais, tampões, estabilizantes, solubilizantes e outros materiais que são bem conhecidos na técnica. Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares para peptídeos, em particular, são descritos na Patente U.S. No. 5.211.657. Tais preparações podem rotineiramente conter sais, agentes de tamponamento, conservantes, veículos compatíveis, e opcionalmente outros agentes terapêuticos. Quando usados na medicina, os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas sais

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37/65 não farmaceuticamente aceitáveis podem ser convenientemente utilizados para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis e não são excluídos do âmbito da invenção. Tais sais farmacologicamente e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malônico, succínico, e outros semelhantes. Além disso, os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados como sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos, tais como sais de sódio, potássio ou cálcio.

[00109] Os compostos e/ou células aqui descritos podem ser formulados em preparações em formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas, tais como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pomadas, soluções, depositários, inalantes e injeções, e os modos habituais para administração oral, administração parentérica ou cirúrgica. A invenção também abrange composições farmacêuticas que são formuladas para administração local, tal como por implantes.

[00110] As composições adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas, tais como cápsulas, comprimidos, pastilhas, cada uma contendo uma quantidade predeterminada do agente ativo. Outras composições incluem suspensões em líquidos aquosos ou líquidos não aquosos, tais como um xarope, um elixir ou uma emulsão.

[00111] Para administração oral, os compostos podem ser facilmente formulados combinando os compostos ativos com veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais veículos permitem que os compostos da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um paciente a ser tratado. As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas como exci

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38/65 piente sólido, opcionalmente triturando uma mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Os excipientes adequados são, em particular, enchimentos tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma de tragacanto, metil-celulose, hidroxipropilmetil-celulose, carboximetilcelulose de sódio, e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes de desintegração podem ser adicionados, tais como polivinil pirrolidona reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um seu sal tal como alginato de sódio. Opcionalmente, as formulações orais também podem ser formuladas em solução salina ou tampões para neutralizar as condições de ácido internas ou podem ser administradas sem qualquer veículo.

[00112] Núcleos de drágeas são fornecidos com revestimentos adequados. Para este fim, podem ser utilizadas soluções de açúcar concentrado, que podem opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos das drágeas para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de composto ativo.

[00113] Preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, bem como cápsulas seladas, moles feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os ingredientes ativos em mistura com enchimentos tal como lactose, ligantes tais como amidos e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como

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39/65 óleos graxos, parafina líquida, ou polietileno glicóis líquidos. Além disso, podem ser adicionados estabilizantes. Microesferas formuladas para administração oral podem também ser usadas. Tais microesferas foram bem definidas na técnica. Todas as formulações para administração oral devem estar em dosagens adequadas para tal administração.

[00114] Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou pastilhas formulados de modo convencional.

[00115] Para administração por inalação, os compostos e/ou células aqui descritos podem ser convenientemente entregues na forma de uma apresentação de spray de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para entregar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido. As técnicas para preparar sistemas de distribuição de aerossol são bem conhecidas dos versados na técnica. Geralmente, tais sistemas devem utilizar componentes que não prejudicam de forma significativa as propriedades biológicas do agente ativo (vide, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences). Aqueles versados na técnica podem prontamente determinar os vários parâmetros e condições para a produção de aerossóis sem recurso da experimentação indevida.

[00116] Os compostos, quando é desejável entrega-los sistemicamente, podem ser formulados para administração parentérica por injeção, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contínua. As formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes multidose, com um

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40/65 conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação, tais como suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes.

[00117] Preparações para administração parentérica incluem soluções estéreis aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas / aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato, ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer) e semelhantes. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e semelhantes. Doses mais baixas irão resultar de outras formas de administração, como a administração intravenosa. No caso em que uma resposta em um objeto seja insuficiente nas doses iniciais aplicadas, doses maiores (ou doses mais elevadas de forma eficaz por uma via de entrega diferente, mais localizada) pode ser empregue na medida em que permite a tolerância do paciente. Doses múltiplas por dia são contempladas para atingir os níveis sistêmicos apropriados dos compostos.

[00118] Em ainda outras modalidades, veículo para os compostos e/ou células aqui descritos é uma micropartícula ou implante biocompatível que adequado para implantação em um receptor mamífero. Implantes bioerodíveis exemplares são conhecidos na técnica. O implante pode ser uma matriz polimérica sob a forma de uma micropartícula, como uma microesfera (na qual o agente é disperso através de uma

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41/65 matriz polimérica sólida) ou uma microcápsula (na qual o agente é armazenado no núcleo de um invólucro polimérico). Outras formas da matriz polimérica para conter o agente incluem filmes, revestimentos, géis, implantes e próteses endovasculares. O tamanho e composição do dispositivo de matriz polimérica são selecionados para resultar na cinética de liberação favorável no tecido em que o dispositivo de matriz é implantado. O tamanho do dispositivo de matriz polimérica adicional é selecionado de acordo com o método de entrega que está sendo utilizado, tipicamente injeção em um tecido ou administração de uma suspensão por aerossol nas áreas nasal e/ou pulmonares. A composição de matriz polimérica pode ser escolhida para ter ambas as taxas de degradação favoráveis e também de ser formada de um material que seja bioadesivo, para aumentar ainda mais a eficácia de transferência, quando o dispositivo é administrado a uma superfície vascular, pulmonar, ou em outra. A composição da matriz também pode ser selecionada para não degradar, mas sim, para liberar por difusão ao longo de um período de tempo prolongado.

[00119] Ambas as matrizes poliméricas não biodegradáveis e biodegradáveis podem ser utilizadas para administrar os compostos e/ou células aqui descritos ao objeto. As matrizes biodegradáveis são as preferidas. Tais polímeros podem ser polímeros naturais ou sintéticos. O polímero é selecionado com base no período de tempo durante o qual a liberação é desejada, geralmente na ordem de algumas horas a um ano ou mais. Tipicamente, a liberação ao longo de um período variando entre algumas horas e três a doze meses é a mais desejável. O polímero é, opcionalmente, sob a forma de um hidrogel que pode absorver até cerca de 90% do seu peso em água e ainda, opcionalmente, é reticulado com íons multivalentes ou outros polímeros.

[00120] Em geral, os compostos e/ou células aqui descritos podem ser entregues utilizando o implante bioerodível por meio de difusão ou,

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42/65 mais preferivelmente, por degradação da matriz polimérica. Exemplos de polímeros sintéticos que podem ser utilizados para formar o sistema de liberação biodegradável incluem: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenoglicóis, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, álcoois polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinilicos, haletos de polivinila, polivinilpirrolidona, poliglicolidas, polissiloxanos, poliuretanos e seus copolímeros, alquil celulose, hidroxialquil celuloses, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitro celuloses, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, metil celulose, etil celulose, hidroxipropil celulose, metil hidroxipropil celulose, metil hidroxibutil celulose, acetato de celulose, poli (metacrilato de butila), poli (metacrilato de isobutila), poli (metacrilato de hexila), poli (metacrilato de isodecila), poli (metacrilato de laurila), poli (metacrilato de fenila), poli (acrilato de metila), poli (acrilato de isopropila), poli (acrilato de isobutila), poli (acrilato de octadecila), polietileno, polipropileno, poli (etileno glicol), poli (óxido de etileno), poli (tereftalato de etileno), poli (álcoois vinílicos), acetato de polivinila, cloreto de polivinila, poliestireno e polivinilpirrolidona.

[00121] Exemplos de polímeros não biodegradáveis incluem acetato de etileno vinila, ácido poli(met)acrílico, poliamidas, copolímeros e suas misturas.

[00122] Outros sistemas de entrega podem incluir sistemas de liberação temporal, liberação retardada ou liberação controlada. Tais sistemas podem evitar administrações repetidas dos compostos, aumentando a conveniência para o objeto e o médico. Muitos tipos de sistemas de liberação de entrega estão disponíveis e são conhecidos para os versados na técnica. Eles incluem sistemas de base de polímero, tais como poli (lactida-glicolida), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido poli-hidroxibutírico, e polianidridos. Tais sistemas de entrega incluem sistemas não poliméricos, tais como lipídios, incluindo esteróis tais como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos

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43/65 graxos ou gorduras neutras, tais como mono-, di- e triglicerídeos; sistemas de liberação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas baseados em peptídeos; revestimentos de cera; comprimidos prensados utilizando aglutinantes e excipientes convencionais; implantes parcialmente fundidos; e similares. Além disso, os sistemas de entrega de hardware com base em uma bomba podem ser utilizados, alguns dos quais são adaptados para implantação.

[00123] O uso de um implante de liberação sustentada de longo prazo pode ser particularmente adequado para o tratamento de doenças crônicas. Liberação de longo termo, tal como aqui utilizado, significa que o implante é construído e disposto para entrega níveis terapêuticos do ingrediente ativo durante pelo menos 30 dias, e de preferência pelo menos 60 dias. Implantes de liberação controlada de longo prazo são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem alguns dos sistemas descritos acima.

[00124] Assim, os compostos e/ou células aqui descritos podem, em algumas modalidades, ser montados em farmacêuticos ou kits de pesquisa para facilitar o seu uso em aplicações terapêuticas ou de investigação. Um kit pode incluir um ou mais recipientes que alojam os componentes da invenção e instruções para uso. Especificamente, tais kits podem incluir um ou mais compostos e/ou células aqui descritos, juntamente com instruções que descrevem a aplicação terapêutica pretendida e a administração adequada destes agentes. Em certas modalidades, os compostos e/ou células aqui descritos em um kit podem estar em uma formulação farmacêutica e dosagem adequada para uma determinada aplicação e para um método de administração dos agentes.

[00125] O kit pode ter uma variedade de formas, tais como uma bolsa de blister, uma bolsa de encolhimento enrolada, uma bolsa vedável a vácuo, uma bandeja termoformada vedável, ou uma forma de bolsa ou bandeja semelhante, com os acessórios ligeiramente empacotados

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44/65 dentro da bolsa, um ou mais tubos, recipientes, uma caixa ou um saco. O kit pode ser esterilizado após os acessórios serem adicionados, permitindo desse modo que os acessórios individuais no recipiente sejam de outra forma desempacotados. Os kits podem ser esterilizados utilizando quaisquer técnicas de esterilização apropriadas, tais como a esterilização por radiação, esterilização por calor, ou outros métodos de esterilização conhecidos na técnica. O kit pode também incluir outros componentes, dependendo da aplicação específica, por exemplo, recipientes, meios celulares, sais, tampões, reagentes, seringas, agulhas, um tecido, tal como gaze, para a aplicação ou remoção de um agente desinfetante, luvas descartáveis, um suporte para os agentes antes da administração, etc.

[00126] A presente invenção também engloba um pacote acabado, e produto farmacêutico rotulado. Este artigo de fabricação inclui a forma de dosagem unitária apropriada em um vaso ou recipiente apropriado, tal como um frasco de vidro ou outro recipiente que seja hermeticamente vedado. No caso de formas de dosagem adequadas para administração parentérica, o ingrediente ativo é estéril e adequado para administração como uma solução de partículas livre. Em outras palavras, a invenção engloba ambas as soluções parenterais e pós liofilizados, cada um sendo esterilizado, e o último sendo adequado para reconstituição antes da injeção. Alternativamente, a forma de dosagem unitária pode ser uma substância sólida adequada para entrega oral, transdérmica, tópica ou mucosa.

[00127] Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar casos específicos da prática da presente invenção e não se destinam a limitar o âmbito da invenção. Como será evidente para um versado na técnica comum, a presente invenção encontrará aplicação em uma variedade de composições e métodos.

EXEMPLOS

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Materiais e métodos [00128] Camundongos: Camundongos C57BL/6J (B6) foram adquiridos de Charles River. Camundongos Nod/Scid/Gama (NSG) foram trazidos de Jackson Laboratory. Esperma da cepa C57BL/6N-NMUR1 tmur1^tm1'¹(^KOMp)^vlc9, que contém uma deleção Nmurl, foi obtida do Repositório KOMP, localizado na Universidade da Califórnia Davis e Instituto de Pesquisa do Hospital Infantil de Oakland, EUA. Camundongos Nmurl foram gerados por fertilização in vitro no Centro Champalimaud para os camundongos desconhecidos, Portugal. Camundongos Ret^{GFP 16} foram estavam em um fundo C57B1/6J. Camundongos foram criados e mantidos no biotério iMM Lisboa sob condições específicas livres de agentes patogênicos. Camundongos foram sistematicamente comparados com controles da mesma ninhada coalojados. Ambos machos e as fêmeas foram utilizados neste estudo. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelos comitês éticos nacionais e institucionais, respectivamente Direção Geral de Veterinária e Comitê Ético de Lisboa iMM. Randomização e teste cego não foram utilizados, salvo indicação contrária. Análise de energia foi realizada para estimar o número de camundongos experimentais.

[00129] Análise de dados de micromatriz de expressão de gene: O perfil de 239 genes relacionados com as vias neurais foi realizado em células linfoides de camundongo com base no conjunto de dados de matriz 1.0 ST do Gene de camundongo Affymetrix (número de registro GEO GSE37448)¹⁰. O pré-processamento dos dados de micromatriz (incluindo a correção de fundo e normalização) foi realizado aplicando o método³⁰ multimatriz robusta (RMA), incluído no pacote Biocondutor af/y³¹ para o ambiente de software estatístico R³². Modelos lineares e a estatística B (Bayes empírico) foram utilizados na análise de expressão diferencial de genes, utilizando o pacote de Biocondutor limmaP³. Os es

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46/65 quemas associados com as análises de dados de micromatriz foram gerados em R.

[00130] Transplante de medula óssea: Células da medula óssea foram lavadas a partir de fêmures e tíbias de Nmuri ⁷' e controles WT da mesma ninhada. Células da medula óssea foram esgotadas de CD3 usando Aglutinante de Biotina Dynabeads (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. 10⁶ células de cada genótipo (CD45.2) foram injetadas por via intravenosa em competição direta com um competidor WT de terceiros (CD45.1/CD45.2), em uma proporção de 1:1, em camundongos NSG não irradiados letalmente (150 Rad) (CD45.1). Os camundongos foram analisados em 8 semanas após o transplante.

[00131] Ativação de Neuromedina U in vitro e in vivo: Para as experiências in vitro, pulmão purificado e ILC2s de lâmina própria de intestino delgado foram privados de FBS durante 2 horas antes da estimulação e cultivados em meio RPMI completo (suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), HEPES a 1%, piruvato de sódio, glutamina, penicilina e estreptomicina) a 37 ^QC. Para a análise de mRNA, ILC2s foram estimuladas durante a noite com peptídeo de Neuromedina U 23 de camundongo recombinante (NmU23, 100 ng/mL; Phoenix Pharmaceuticals). Ambas ILC2s estimuladas com NmU23 e de controle foram cultivadas na presença de IL-2 e IL-7 (10 ng/ml; Peprotech). ILC2s foram Usadas utilizando tampão RLT (Qiagen). Para análise da proteína citocina, ILC2s foram incubadas exclusivamente com brefeldina A (eBioscience) durante 12 horas antes da coloração intracelular. Para experiências in vivo, camundongos B6 foram injetados via intraperitoneal com o peptídeo NmU23 (2 pg/dia) durante a infecção com Nippostrongylus brasiliensis ou com uma dose única de NmU23 (20 pg) e analisados após 8 horas. Os camundongos de controle foram tratados apenas com PBS.

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47/65 [00132] Infecção parasita: Nippostrongylus brasiliensis foi mantido por passagens mensais em ratos de Lewis como anteriormente descrito³⁴. Parasitas infecciosos (IL-3) foram gentilmente cedidos por Nicola Harris (Lausanne, Suíça). Larvas de IL-3 foram tratadas durante 15 minutos com penicilina / estreptomicina (300 U/mL; Thermo Fisher Scientific), gentamicina (1,5 mg/mL; Sigma) e tetraciclina (30 pg/mL; Sigma), lavadas com PBS e contadas sob um estereomicroscópio. Os camundongos foram injetados subcutaneamente com 500 de iL-3 em 200 pL de PBS estéril, utilizando uma agulha de 21G. Os camundongos foram sacrificados no dia 2 pós-infecção e os pulmões foram recolhidos e analisados.

[00133] Carga de infecção: Carga parasitária em pulmão foi quantificada nos pulmões finamente moídos e como previamente descrito³⁴. Pulmão foi colocado em gaze estéril e suspenso em um tubo de 50 mL contendo PBS a 37 ^QC durante pelo menos 4 horas. Parasitas viáveis que migram para fora no fundo do tubo foram contados sob um microscópio estereoscópico (steREO Lumar V12; Zeiss).

[00134] Isolamento de células: Pulmões foram perfundidos com uma solução de PBS fria e 2% de heparina através do ventrículo direito do coração e foram, subsequentemente, finamente moídos e digeridos em RPMI completo complementado com colagenase D (0,1 mg/mL; Roche) e DNase I (20 U/mL; Affymetrix) por 1 h a 37^QC sob agitação suave. Para o isolamento das células da lâmina própria do intestino delgado, intestino foi cuidadosamente lavado com PBS, cortado em pedaços de 1 cm, e agitados durante 30 minutos em PBS contendo 2% de FBS, 1% de HEPES e 5 mM de EDTA para remover as células epiteliais e intraepiteliais. Os intestinos foram então digeridos com colagenase D (0,5 mg/mL; Roche) e DNase I (20 U/mL; Affymetrix) em RPMI completo, durante 30 minutos a 37^QC, sob agitação suave. Neurônios entéricos e

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48/65 células gliais foram isolados como anteriormente descrito^4,35. Resumidamente, tecidos isolados foram digeridos com Liberase TM (7,5 pg/ml; Roche) e DNase I (20 U/mL; Affymetrix) em RPMI completo, durante 30 minutos a 37^QC, sob agitação suave. Órgãos digeridos foram rompidos por passagem através de um coador de células 100 μιτι (BD Biosciences). A centrifugação em gradiente de Percoll a 40-80% (2400 rpm, 30 minutos à temperatura ambiente) foi utilizada para a purificação adicional de leucócitos a partir do pulmão e as suspensões de células do intestino delgado. Os eritrócitos de pulmão, intestino delgado e preparações de medula óssea foram lisados com tampão de lise de RBC (eBioscience).

[00135] Citometria de fluxo e triagem celular: Coloração intracelular foi realizada utilizando Kit de fixação / permeabilização IC (eBioscience). Análise de citometria de fluxo e triagem celular foram realizadas usando citômetros de fluxo BD LSRFORTESSA e BD FACSAria (BD Biosciences). Análise dos dados foi feita utilizando software FlowJo (Tristar). Populações classificadas foram >95% puras. Suspensões celulares foram coradas com anti-CD45 (30-F11), anti-Ter119 (Ter119), TCRP (H57-597), anti-CD3s (eBio500A2), anti-CD19 (eBiolD3), antiNKL. I (PK136), anti-CD11c (N418), anti-Grl (RB6-8C5), anti-CD11b (Mi/70), anti-CCR6 (29-2L17), anti-CD 127 (IL-7RA; A7R34), anti-a4p7 (DATK32), anti-Flt3 (A2F10), anti-CD25 (PC61.5), anti-ckit (2B8), antiThy1.2 (53-2.1), anti-CD49b (DX5), anti-CD49a (HMaL), anti-TCRõ (GL3), anti-NKp46 (29A1.4), anti-CD4 (GK1.5), anti-CD31 (390), anti-IL-13 (eBiol3A), anti-IL-4 (AAB 11), anti-QCA 2 (MP1-22E9), anti-F4/80 (BM8), anti-FccR1 (MAR-1), viabilidade de corante 7AAD, CD16/CD32 Anticamundongo (bloco Fc) todos da eBioscience; anti-CD8a (53-6.7), anti-KLRG1 (2F1), anti-sca1 (D7), anti-CCR-3 (J073E), anti-MHC-ll (M5/114.15.2) da BioLegend, anti-IL-5 (MH9A3) da BD Biosciences, anti-Anfirregulina (R&D). Kit De Coloração de Célula Morta LIVE/DEAD

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Fixable Aqua foi adquirido de Invitrogen. Populações de células foram definidas como: ILC2 - CD45⁺LinThy1.2⁺KLRG1+Sca1⁺; ILC3 CD45⁺Lin Thy1.2^hiIL7Ra⁺RORyt⁺; para subconjuntos ILC3 foram empregues marcadores adicionais: LTi - CCR6⁺NKp46^_; ILC3 NCR' - CCR6' Nkp46^_; ILC3 NCR⁺ - CCR6NKp46⁺; células NK - CD45⁺Lin’ NKp46⁺NK1.1⁺CD49b⁺CD49aCD127’; Linhagem foi composta por CD3s, CD8a, TCRp, TCRyõ, CD19, Gr1, CD11c e Ter119; Células gliais entéricas - CD45CD3TTER119CD49b⁺; Células T CD45⁺CD3⁺TCRPp⁺; Células B - CD45⁺CD19⁺; Neurônios entéricos CD45 CD31TER119 RET⁺; Eosinófilos - MHC-II CCR3^hiGR1^int; Neutrófilos - MHC-II CCR3 GR1^hi; Macrófagos - CD3 MHC-ll⁺F4/80⁺; Mastócitos/Basófilos - CD3 FcsR1⁺; Progenitor Linfoide Comum (CLP) - Lin CD127⁺Flt3⁺Scaí^ntcKIT^int; Progenitor Linfoide Inato Auxilia Comum (CHILP) - Lin CD127⁺a4p7⁺Flt3 CD25-; Precursor de ILC2 (ILC2P) - Lim CD127⁺a4p7⁺Flt3CD25⁺.

[00136] RT-PCR quantitativa: RNA total foi extraído utilizando micro kit RNeasy (Qiagen), de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração de RNA foi determinada usando espectrofotômetro Nanodrop (Nanodrop Technologies). RT-PCR quantitativa em tempo real foi realizada como anteriormente descrito⁵⁸. Hprtl, gapdh e Eef1a1 foram utilizados como genes de limpeza. Para ensaios TaqMan (Applied Biosystems) RNA foi retrotranscrito usando um Kit RNApara cDNA de elevada capacidade (Applied Biosystems), seguido de uma pré-amplificação por PCR utilizando Misturador TaqMan PreAmp Master (Applied Biosystems). Misturador de Expressão de Gene TaqMan Master (Applied Biosystems) foi utilizado em PCR em tempo real. Ensaios de Expressão de Gene TaqMan (Applied Biosystems) foram os seguintes: Hprtl Mm00446968_m1; gapdh Mm99999915_g1; Eef1a1 Mm01973893_g1; IL5 Mm00439646_m 1; IL 13 Mm00434204_m 1; Areg Mm01354339_m 1; IL4 Mm00445259_m1; Csf2 Mm01290062_m1; Gata3

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Mm00484683_m1; Flora Mm01173766_m1; Nmu Mm00479868_m1; Nmurl Mm04207994_m1. Análise de PCR em tempo real foi realizada utilizando o sistema PCR em Tempo Real StepOne (Applied Biosystems).

[00137] Sinalização celular: ILC2s purificadas de intestino delgado e pulmão foram privadas de FBS durante 2 horas antes da ativação in vitro com NmU23 a 37^QC. Para o ensaio da fosforilação de ERK (Cell Signaling Technology), ILC2s purificados foram ativados com NmU23 (100 ng/mL; Phoenix Pharmaceuticals) na presença de IL-2 e IL-7 (10 ng/ml; Peprotech) durante 10 minutos antes da coloração intracelular. Para teste ERK, calcineurina e ativação de NFAT, ILC2s foram cultivadas durante 1 hora com o seu respectivo inibidor e em seguida estimuladas com NmU23 de um dia para o outro antes de análise de expressão de mRNA. Inibidor de ERK - PD98059 (Sigma); Inibidor de Calcineurina - FK506 (Tocris Bioscience); Inibidor NFAT - 11R-VIVIT (Tocris Bioscience).

[00138] Sinalização de cálcio: ILC2s purificadas a partir do intestino delgado foram cultivadas com IL-2 e IL-7 (10 ng/ml) e privadas de FBS durante 6 horas antes de experiências de sinalização de cálcio. ILC2s foram coradas com Kit de Ensaio de Cálcio Direto Fluo-4 (Thermo Fisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. Influxo de cálcio (Ca²⁺), representado pelo Fluo-4 AM, foi registrado ao longo do tempo em um citômetro de fluxo BD Accuri C6 (BD Biosciences) tal como anteriormente relatado³⁶. A NmU23 de camundongo recombinante foi adicionada 60 segundos após o registro de linha de base de ILC2. Os dados foram representados pelos valores médios de cinéticas de influxo de Ca²⁺ entre a resposta de linha de base de ILC2 e o pico de resposta após adição de NmU23 camundongo recombinante.

[00139] Histopatologia de análise: Camundongos foram sacrifica

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51/65 dos por deslocamento cervical, e lobo caudal do pulmão direito foi coletado, fixado em formalina a 10% tamponada neutra e processado para embebimento em parafina. Seções de 4pm em série foram coradas por hematoxilina e eosina (H&E), corante de Luna, e imuno-histoquímica para mieloperoxidase (MPO) foi realizada. Resumidamente, utilizando protocolos padrão, recuperação por calor de antígeno foi realizada a pH³⁷ baixo no módulo Dako PT, seguido por incubação com o anticorpo primário (mieloperoxidase policlonal de coelho anti-humano, Dako Corp). A incubação com o kit ENVISION (sistema de detecção de Peroxidase / DAB, Dako Corp) foi seguida por contracoloração com hematoxilina de Harri (Bio Otica). Controle negativo incluiu a ausência de anticorpos primários. As lâminas foram analisadas por um patologista de teste cego para os grupos experimentais e as imagens foram obtidas em um microscópio Leica DM2500, juntamente com uma câmara de microscópio Leica MC170 HD. Quantificação da infiltração de células inflamatórias do pulmão foi realizada em seções de coradas com MPO por contagem manual das células MPO-positivas com ampliação de 20x original, correspondente a 0,2 mm² por campo. Quantificação de eosinófilos pulmonares foi realizada em lâminas de coradas com Luna por contagem manual o número de granulócitos com citoplasma granular eosinofílicos em campos de baixa potência (1 mm² por campo).

[00140] Microscopia: Análise de seções de intestino espessas, intestinos foram fixados com PFA a 4% a 4^QC durante a noite e, em seguida, foram incluídos em 4% de agarose de baixa temperatura de fusão (Invitrogen). Seções de 100 pm foram obtidas com um vibratome Leica VT1200/VT1200S. As seções foram incubadas durante a noite ou durante 1-2 dias, respectivamente, a 4^QC, utilizando os seguintes anticorpos: anti-KLRG1 monoclonal de camundongo (2F1/KLRG1; BioLegend); anti-CD3 (17A2; BioLegend). Anti-hamster de cabra A647 cabra e anti-rato de cabra A568 foram adquiridos de Invitrogen. Após várias

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52/65 etapas de lavagem com PBS as amostras foram incubadas com anticorpos durante 3 horas à temperatura ambiente e, em seguida, montadas em Mowiol⁵. As amostras foram adquiridas em um microscópio confocal Zeiss LSM710 utilizando objectivas CE Plano-Neofluar 10x/0.30 M27, Apochromat Plano 20x/0,8 M27 e EC Plano-Neofluar 40x/1.30.

[00141] Estatísticas: Resultados são mostrados como média ±SEM. Análises estatísticas foram realizadas com software GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, Calif). Teste t de Studentfoi realizado em populações homocedásticas. Teste t não pareado foi aplicado em amostras com variâncias diferentes. Resultados foram considerados significantes a *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

Exemplo E1: Expresões de Receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) em ILC2s [00142] Células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) são abundantes em barreiras da mucosa e atual como inibidores principais de inflamação do tipo 2 e reparação de tecido¹'². ILC2s são ativadas por citocinas de células extrínsecas, incluindo IL-25, IL-33 e linfopoietina estromal tímica¹'². Relatórios anteriores indicaram que subconjuntos de linfócito discretos e progenitores hematopoiéticos são controlados por sinais dietéticos e neurorreguladores²’³⁵'⁹, sugerindo que ILC2s podem exercer sua função no contexto de unidades celulares neuroimunes.

[00143] Para interrogar se ILC2s diretamente e seletivamente percebem moléculas neuronais derivadas, foi empregue análise de perfil transcricional de genoma amplo de ILC2s versus suas contrapartes¹⁰adaptativas (linfócitos T auxiliares) e inatas (ILC1 e ILC3) (Fig. La-lb). Esta análise identificou o gene do receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) como sendo seletivamente enriquecido em ILC2s quando comparado com ILC1 s, ILC3s e células T auxiliares 2 (Figs, 1a-1b e as Figs. 5a, 5b). Esta descoberta foi confirmada por ensaios de expressão quantitativos independentes em vários subconjuntos de células imunes,

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53/65 incluindo ILC1 s, ILC3s, células NK, eosinófilos, mastócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, células T e células B (Fig. 1c).

[00144] Nmurt codifica para um receptor transmembranar de Neuromedina U. Este último é um neuropeptídeo segregado encontrado no cérebro e altamente expresso no trato gastrointestinal¹¹'¹⁴. Como tal, Neuromedina U (NMU) atua como um regulador neuronal derivado em diversos processos fisiológicos¹⁴. Mostrou-se que Neuromedina U é produzida por neurônios entéricos, que também expressam o receptor do fator neurotrófico RET¹¹'¹³¹⁵. Em acordo, os neurônios na lâmina própria foram principais expressores do gene Neuromedina U (Nmu), enquanto estas transcrições não eram detectáveis em neuroglia entérica e células epiteliais (Fig. 1d). Da mesma forma, todas os subconjuntos de células imunes analisados, incluindo as células dendríticas, os macrófagos e as células B, não tiveram qualquer expressão de Nmu significativa (Fig. 1d). Surpreendentemente, camundongos repórter de neurônios entéricos (ReP^FPY⁶ revelaram que ILC2s candidatos de lâmina própria CD3' KLRG1⁺ são adjacentes à rede neuronal de lâmina própria intestinal ReP^FP (Fig. 1 e e Fig. 5c). Tomados em conjunto estes dados sugerem uma diafonia neurônio parácrina - ILC2 orquestrada pelas interações NMUNMUR1.

Exemplo 2: Ativação de ILC2s com Neuromedina U [00145] Para explorar esta hipótese, ILC2s derivadas de intestino e pulmão foram purificadas e ativadas com Neuromedina U (neuropeptídeo NmU23) (Figs. 2a-2f). Surpreendentemente, a ativação de células autônomas de ILC2s com NmU23 resultou em expressão rápida e muito potente das pró-inflamatórias e genes de citocinas do tipo 2 protetores de tecido IL5, IL13, AreG e Qsf2, que foi acompanhada por um aumento da expressão do fato de transcrição do tipo 2 mestre Gata3 (Figs.2a, 2b). Descoberta semelhante foi obtida com ILC2 humana (Fig.9b, c).

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Ativação dependente de NmU23 de ILC2s aumentadas com proliferação de ILC2 como medido por Ki67 (Figura 2c; Fig. 10a, 10b). NmU mostrou ligar-se com afinidade semelhante a dois receptores acoplados à proteína G de classe A órfã, NMUR1 e NMUR2¹⁴ [00146] Definição formal de que a ativação NMUR1 é a ligação molecular entre a ativação de ILC2 dependente de NMU e produção de citocina de tipo foi fornecida por ablação genética de Nmurl. Ativação de ILC2s purificadas com NmU23 conduziu à expressão potente das proteínas de citocina de tipo 2 IL-5 e IL-13 de um modo dependente de NMUR1 (Figuras 2d-2f e 6a, 6b).

[00147] Importante, a administração in vivo do neuropeptídeo NmU23 resultou na produção de citocinas de tipo 2 imediata e seletiva a partir de ILC2s, enquanto que os seus homólogos derivados de células T auxiliares adaptativos foram imperturbáveis (Figuras 2g, 2h e 6c, 6d). Em acordo, os camundongos deficientes em NMUR1 tinham um compartimento de ILC2 intacto, mas reduziu expressão de IL-5 e IL-13 inata quando comparada com os seus controles de mesma ninhada tipo selvagem (WT) (Figuras 2i, 2j; 6e, 6f e 7a-7c). É digno de nota que as citocinas derivadas de células T auxiliares foram imperturbáveis em camundongos knockout NMUR1 (Fig. 6f).

[00148] Estes dados indicam que o neuropeptídeo Neuromedina U é um regulador potente de citocinas de reparação de tecidos e inflamatórias inatas do tipo 2, através da ativação de NMUR1.

Exemplo 3: Sinalização por NMUR1 ativada em ILC2s [00149] Para examinar melhor como Neuromedina U controla respostas inatas do tipo 2 os sinais de sinalização fornecidos pela NMUR1 ativada em ILC2s foram investigados. Em neurônios, ativação de receptores de Neuromedina U leva a um aumento de influxo de cálcio (Ca²⁺) e ativação de ERK1/2, enquanto que a atividade de NFAT é necessária

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55/65 para a produção de citocinas do tipo 2^17-20. Ativação induzida por Neuromedina II de ILC2s levou a ativação de ERK1/2 imediata e eficiente, enquanto que a inibição da atividade de ERK sobre ativação de ILC2 induzida por NmU23 resultou na expressão de genes de cotocinas tipo diminuída 2 (Fig. 3a, 3b).

[00150] Análise de ativação induzida por Neuromedina U de ILC2s também levou a influxo de Ca²⁺ imediato e robusto, sugerindo um papel da Calcineurina fosfatase de proteína serina / treonina dependente de cálcio em respostas do tipo 2 induzidas por NmU23 (Fig. 3c). Em acordo, a inibição da Calcineurina sobre ativação de NmU23 levou a expressão de IL5, IL13 e Csf2 inata prejudicada (Fig. 3d).

[00151] Finalmente, a inibição de atividade de NFAT sobre Ativação de NMUR1 induzida por NmU23 levou à diminuição de modo semelhante de IL5, IL13 e CSF2 (fig. 3e). Assim, concluiu-se que o peptídeo neuronal derivado Neuromedina U pode operar de uma maneira ILC2intrínseca ativando NMUR1, que regula citocinas inatas do tipo 2 a jusante de uma cascata Ca²⁺ / Calcineurina / NFAT e ERK1/2 fosforilação. Exemplo 4: Regulação de Defesa da Mucosa por Células ILC2 [00152] Para interrogar se peptídeos neuronais regulam a defesa da mucosa, como graus variados de sinais NMUR1 podem controlar a agressão da mucosa logo após a infecção com o parasita helmíntico Nippostrongylus brasiliensis^, e antes de respostas de células T adaptativas serem estabelecidas²² foi testado. Surpreendentemente, a infecção de camundongos WT com N. brasiliensis resultou em forte aumento da expressão de NMU no pulmão (Fig. 4a), o que sugere que Neuromedina U pode regular respostas in vivo para infecção por parasitas. Por conseguinte, a administração do neuropeptídio NmU23 em camundongos infectados com N. brasiliensis resultou em respostas do tipo 2 inatas muito robustas e imediatas caracterizadas pelo aumento de eosinófilos

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56/65 infiltrados no pulmão quando comparado com suas contrapartes tratadas com veículo (PBS) (Fig. 4b-4d).

[00153] Para explorar ainda mais o papel de NMUR1 em respostas do tipo 2 inatas, camundongos deficientes em NMUR1 e seus controles da mesma ninhada foram infectados com N. brasiliensis (Fig. 4e-4i). Surpreendentemente, quando comparados com suas contrapartes da mesma ninhada WT, os camundongos knockout NMUR1 tinham diminuído as respostas do tipo 2, a saber reduziram marcadamente infiltrados de eosinófilos e granulócitos (Figuras 4e-4g). De acordo com estes resultados, os camundongos deficientes em NMUR1 tinham aumentado a carga de infecção por N. brasiliensis (Fig. 4i). No seu conjunto, estes dados indicam que o neuropeptídeo Neuromedina U fornece sinais críticos que regulam as respostas de tipo 2 in vivo, aumentando assim a proteção da mucosa imediata contra infecções por parasitas.

Exemplo 5: Integração de Sinal por Células ILC2 [00154] Decifrar os mecanismos pelos quais ILC2s percebem, integram e respondem a sinais ambientais é fundamental para entender a homeostase de tecido e órgão. Os resultados aqui relatados estabelecem relações inesperadas entre ILC2s e seu ambiente. Uma nova unidade celular neurônio-ILC2 orquestrada por Neuromedina U foi decifrada (Fig. 8). Este neuropeptídeo ativa diretamente ILC2s de um modo dependente de NMUR1, resultando em uma produção de citocina do tipo 2 inata potente a jusante de fosforilação de ERK e a ativação de uma cascata Ca²⁺ / Calcineurina / NFAT (Fig. 8).

[00155] Embora seja bem estabelecido que ILC2s integram os sinais de citocinas, incluindo IL-25, IL-33 e o linfopoietina estromal tímica ¹²’²³, os resultados aqui relatados demonstram que ILC2s podem mais amplamente integrar os sinais de diferentes tecidos derivados camada germinativa para simultaneamente regular respostas de tipo 2 de reparação inflamatória e de tecidos e de defesa de órgãos. Assim, propõe-se que

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57/65 as unidades celulares neurônio-ILC2 estejam preparadas para assegurar excepcionalmente respostas do tipo 2 potentes e imediatas em uma forma dependente de Neuromedina U (Fig. 8).

[00156] Estudos anteriores demonstraram que ILC2s contribuem para vários processos homeostáticos, incluindo a detecção de nutrientes, metabolismo, reparação de tecidos e controle de infecções¹’²’²¹’²³' ²⁷. Aqui tem sido demonstrado que Neuromedina U é a ligação molecular entre a atividade neuronal, respostas do tipo 2 inatas e a proteção das mucosas. Assim, o acoplamento de atividade neuronal e regulação imune dependente de ILC2 pode ter assegurado respostas multitecido potentes, eficazes e integradas aos desafios ambientais ao longo da evolução. Notavelmente, coordenada, contração¹⁴ coordenada do músculo liso dependente de Neuromedina U e imunidade inata do tipo 2 podem ter coevoluído para controlar parasitas que têm sido parceiros de evolução íntimos de mamíferos. De acordo com esta hipótese, Neuromedina U é altamente conservada através de espécies de mamíferos, anfíbios, aves e peixes¹⁴. Finalmente, os dados atuais e outros estudos independentes indicam que os parceiros do sistema nervoso da mucosa com ILCs e macrófagos para assegurar uma regulamentação tecido local ³’⁴’²⁸’²⁹; assim, é tentador especular a existência de unidades sensoriais neuroimunes que regulam a fisiologia e a homeostase a nível organísmico.

Exemplo 6: Expressão Seletiva de NMUR1 e Ativação de ILC2s [00157] Análise transcricional identificou o gene do receptor 1 de Neuromedina U (NMUR1) como sendo seletivamente enriquecido em ILC2s quando comparado com ILC1s, ILC3s e células T auxiliares 2 (Figs, 1a, 1b e Figs. 5a, 5b). Esta descoberta foi confirmada por ensaios de expressão quantitativos independentes em vários subconjuntos de células imunes, incluindo ILC1 s, ILC3s, células NK, eosinófilos, mastócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, células T e células B

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58/65 (Fig. 9e). Em conformidade com esta constatação, a ativação de ILC2 com NMU23, resultou na regulação para cima de IL5 e IL13 imediata inata, enquanto que suas contrapartes de célula T adaptativa foram imperturbáveis (Fig. 9f). Digno de nota, após a infecção com Nippostrongylus brasiliensis, expressão de NMUR1 foi aumentada seletivamente em ILC2 (Figs. 9a, 9d).

[00158] Neurônios na lâmina própria foram considerados como os principais expressadores do gene da Neuromedina U (NMU), enquanto estas transcrições não foram detectáveis em neuroglia entérica e células epiteliais (Fig. 1d). Da mesma forma, todos os subconjuntos de células imunes analisados, incluindo eosinófilos, células dendríticas, macrófagos, células B e células T, não tiveram expressão de NMU significativa (Fig. 1d). Surpreendentemente, camundongos repórteres para neurônios entéricos revelaram que ILC2s candidatas de lâmina própria CD3KLRG1 ⁺ foram encontrados a 4.716 μιτι ± 0,656 de neurônios adjacentes, enquanto as suas contrapartes de células T adaptativas foram encontrados a uma distância significativamente maior (8.623 μιτι ± 1,447) (Fig 1e; Fig. 5c, e Fig. 9g). Surpreendentemente, os neurônios derivados de neuroesferas estimuladas com N brasiliensis / proteínas secretoras (NES) rapidamente supra-regularam expressão de NMU (Fig.9h, i), indicando que os neurônios podem detectar diretamente produtos de parasita para regular a produção de NMU.

Exemplo 7: Citocinas do Tipo 2 Expressas após Ativação de ILC2s [00159] ILC2s derivadas de intestino e pulmão foram purificadas e ativadas com Neuromedina U (neuropeptídeo NmU23) (Figs. 2a-2f). Surpreendentemente, a ativação de células autônomas de ILC2s com NmU23 resultou em expressão rápida e muito potente dos genes de citocina do tipo 2 protetores de tecido e pró-inflamatórios IL5, IL13, Areg e Csf2, que foram acompanhados por um aumento da expressão do fator de transcrição do tipo 2 mestre Gata3 (Figuras 2a, 2b). Ativação

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59/65 dependente de NmU23 de ILC2s aumentou proliferação de ILC2 como medido por Ki67 in vitro e in vivo (Fig. 2c e Figuras 10a, 10b).

[00160] Sequencialmente, a resposta de ILC2 a NMU, IL-33 e IL-25, de um modo dependente de dose, foi comparada. Surpreendentemente, quando comparada com suas contrapartes de citocinas, ativação de IL33 e IL-25, NMU de ILC2 levou a uma expressão rápida e muito robusta de IL-5 e IL-13 inatas. Esta suprarregulação imediata de citocinas do tipo 2 inatas induzidas por NMU foi comparável para os efeitos observados com ativação PMA-ionomicina, indicando que Neuromedina U é um regulador exclusivamente potente de citocinas do tipo 2 derivadas de ILC2 (Figuras 10c, 10d).

Exemplo 8: Efeito de Ativação de Células induzida por NmU23 em NFAT [00161] Ativação induzida por Neuromedina U de ILC2s levou a ativação imediata e eficiente de ERK 1/2, enquanto que a inibição da atividade de ERK sobre ativação de ILC2 induzida por NmU23 resultou na expressão de genes de citocinas do tipo 2 diminuída (Figuras 3a, 3b). Análise de ativação induzida por Neuromedina U de ILC2s também levou a influxo de Ca²⁺ imediato e robusto, sugerindo um papel da Calcineurina fosfatase da proteína serina/treonina dependente de cálcio em respostas do tipo 2 induzidas por NmU23 (Fig. 3c).

[00162] Em acordo, a inibição da Calcineurina ou suas interações com NFAT, mediante ativação de NmU23 levou à expressão de IL5, IL13e Csf2 inatas diminuída (Fig. 3d e Figuras 11a, 11b). Em acordo, a ativação de célula induzida por NmU23 levou a translocação eficiente de NFAT do citoplasma para o núcleo de ILC2 (Fig. 11c). Finalmente, a inibição de atividade de NFAT após ativação de NMUR1 induzida por NmU23 levou à diminuição de modo semelhante de IL5, IL13 e CSF2 (fig. 3e). Assim, concluiu-se que o peptídeo neuronal derivado de Neuromedina U, pode operar de um modo ILC2-intrínseca ativando NMUR1, que regula citocinas inatas do tipo 2.

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Exemplo 9: Efeitos do Tratamento de NmU23 em Camundonqos infectados com N. brasiliensis [00163] Para interrogar se peptídeos neuronais regulam a defesa da mucosa, como vários graus de sinais de NMUR1 podem controlar a agressão da mucosa logo após a infecção com o parasita helmíntico Nippostrongylus brasiliensis, e antes de respostas de células T adaptativas serem estabelecidas, foi testado. Surpreendentemente, a infecção de camundongos WT com N. brasiliensis resultou em forte aumento da expressão de NMU no pulmão (Fig. 4a), o que sugere que Neuromedina U pode regular respostas in vivo para infecção por parasitas. Por conseguinte, a administração do neuropeptídeo NmU23 em camundongos infectados com N. brasiliensis resultou em respostas do tipo 2 inatas muito robustas e imediatas caracterizadas pelo aumento de IL-5, IL-13 derivados de ILC2 e Anfirregulina, e aumento de eosinófilos no pulmão quando comparado a suas contrapartes tratadas com veículo (PBS) (Figuras 4b-4d e Fig. 12a). Por conseguinte, tratamento com NmU23 em camundongos infectados com N. brasiliensis levou a hemorragia pulmonar reduzida e diminuição da carga parasitária de pulmão e intestino (Figuras 12b, 12f).

Exemplo 10: Confirmação do Papel de NMUR1 Usando Camundonqos Deficientes em NMUR1 [00164] Para explorar ainda mais o papel de NMUR1 em respostas inatas tipo 2, camundongos deficientes em NMUR1 e seus controles da mesma ninhada foram infectados com N. brasiliensis (Fig. 4e-4i). Surpreendentemente, quando comparados com os seus homólogos da mesma ninhada WT, os camundongos knockout NMUR1 tinham diminuído respostas do tipo 2, a saber IL-5, IL-13 e Anfirregulina derivados de ILC2 marcadamente reduzidos, infiltrados de eosinófilos e granulócitos reduzidos (Figuras 4e-4g e Figuras 13a-13c). De acordo com estes resultados, os camundongos deficientes em NMUR1 tinha aumentado

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61/65 carga de infecção por Λ/, brasiliensis no pulmão e no intestino (Fig. 4i e Fig. 13d). No seu conjunto, estes dados indicam que o neuropeptídeo Neuromedina U fornece sinais críticos que regulam as respostas de tipo 2 in vivo, aumentando assim a proteção imediata da mucosa contra infecções por parasitas.

Exemplo 11: Ativação de ILC2 leva à Produção de Citocinas do Tipo 2 Inatas in vivo [00165] Para estabelecer formalmente a ligação entre ativação de ILC2 autônoma via NMUR1 e produção de citocinas inatas do tipo 2 in vivo, Mistura de quimeras de medula óssea (BM) com células BM suficientes e deficientes de NMUR1 foi realizada. Verificou-se que após administração de NMU, ILC2 deficiente de NMUR1 tinha reduzido expressão de IL-5 e IL-13 inatas quando comparada com suas contrapartes competitivas do tipo selvagem (Figs. 14a, 14b). Notavelmente, células T deficientes ou competentes de Nmurt tinham expressão imperturbável destas citocinas do tipo 2 (Fig. 14c). Assim, NMU-NMUR1 operam de uma maneira ILC2-intrínseca para controlar a expressão de citocinas do Tipo 2 in vivo.

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65/65 [00166] Tendo assim descrito vários aspectos de, pelo menos, uma modalidade desta invenção, deve ser apreciado várias alterações, modificações, e melhoramentos irão rapidamente ocorrer aos versados na técnica. Tais alterações, modificações e melhorias pretendem ser parte da descrição, e destinam-se a estar dentro do espírito e âmbito da invenção. Por conseguinte, a descrição anterior e os desenhos são a título de exemplo somente.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para aumentar a atividade ou proliferação de células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s), caracterizado pelo fato de que compreende contatar ILC2s com um agonista do receptor 1 da neuromedina U (NMUR1) em uma quantidade eficaz para aumentar a atividade das ILC2s.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agonista de NMUR1 é neuromedina U (NMU) ou um análogo do mesmo, ou um anticorpo que especificamente se a liga e ativa NMUR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a NMU ou o análogo da mesma é NMU25, proteína precursora de NMU, NMU23 ou NMU8.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o contato é in vitro.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as ILC2s são contatadas em um protocolo de expansão ILC2.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o contato é in vivo.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agonista do receptor 1 de neuromedina U (NMUR1) é administrado a um indivíduo.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1.

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10. Método para tratar uma doença associada a células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s), caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade de tal tratamento um agonista do receptor 1 de neuromedina U (NMUR1) em uma quantidade eficaz para tratar a doença.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agonista de NMUR1 é neuromedina U (NMU) ou um análogo da mesma, ou um anticorpo que especificamente se liga a e ativa NMUR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a NMU ou seu análogo é NMU25, proteína precursora de NMU, NMU23 ou NMU8.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

10 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a doença é infecção, reparo tecidual, cicatrização de feridas, obesidade, tratável pelo aumento da indução de respostas imunes tipo 2, tratável pela regulação metabólica, tratável pelo aumento de eosinófilos ou tratável por aumento de mastócitos.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que o agonista de NMUR1 é administrado por via intravenosa, oral, nasal, retal ou por absorção cutânea.
17. Agonista do receptor 1 de neuromedina U (NMUR1) para uso no tratamento de uma doença associada a células linfoides inatas

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3/9 do Grupo 2 (ILC2s), caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade de tal tratamento o agonista de NMUR1 em uma quantidade eficaz para tratar a doença.
18. Agonista de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o agonista de NMUR1 é neuromedina U (NMU) ou um análogo do mesmo, ou um anticorpo que especificamente se liga a e ativa a NMUR1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
19. Agonista de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a NMU ou seu análogo é NMU25, proteína precursora de NMU, NMU23 ou NMU8.
20. Agonista de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
21. Agonista de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que a doença é infecção, reparo de tecidos, cicatrização de feridas, obesidade, tratável aumentando a indução de respostas imunes tipo 2, tratável por regulação metabólica, tratável pelo aumento de eosinófilos, ou tratável por aumento de mastócitos.
22. Agonista de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1.
23. Agonista de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que o agonista de NMUR1 é administrado por via intravenosa, oral, nasal, retal ou por absorção cutânea.
24. Método para tratar uma doença associada a células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s), caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade de tal tratamento uma composição compreendendo ILC2s ativadas em uma quantidade

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25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um agonista do receptor 1 de neuromedina U (NMUR1).
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o agonista de NMUR1 é neuromedina U (NMU) ou um análogo da mesma, ou um anticorpo que especificamente se liga a e ativa NMUR1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a NMU ou seu análogo é NMU25, proteína precursora de NMU, NMU23 ou NMU8.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

24 a 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que a doença é infecção, reparo tecidual, cicatrização de feridas, obesidade, tratável pelo aumento da indução de respostas imunes tipo 2, tratável por regulação metabólica, tratável pelo aumento de eosinófilos, ou tratável por aumento de mastócitos.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não está em necessidade de outro tratamento além das ILC2s ativadas ou o agonista de NMUR1.
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30, caracterizado pelo fato de que as ILC2s ativadas ou o agonista de NMUR1 são administrados por via intravenosa, oral, nasal, retal ou por absorção cutânea.
32. Composição caracterizada pelo fato de que compreende células linfoides inatas ativadas do Grupo 2 (ILC2s) para uso no tratamento de uma doença associada a ILC2s, compreendendo administrar

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5/9 a um indivíduo em necessidade de tal tratamento a composição compreendendo ILC2s ativadas em uma quantidade eficaz para tratar a doença.
33. Composição de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um agonista do receptor 1 de neuromedina U (NMUR1).
34. Composição de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o agonista de NMUR1 é neuromedina U (NMU) ou um análogo da mesma, ou um anticorpo que especificamente se liga a e ativa NMUR1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
35. Composição de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a NMU ou seu análogo é NMU25, proteína precursora de NMU, NMU23 ou NMU8.
36. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é um humano.
37. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 36, caracterizada pelo fato de que a doença é infecção, reparo tecidual, cicatrização de feridas, obesidade, tratável pelo aumento da indução de respostas imunes do tipo 2, tratável pela regulação metabólica, tratável pelo aumento de eosinófilos ou tratável por aumento de mastócitos.
38. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 37, caracterizada pelo fato de que o indivíduo não está em necessidade de outro tratamento além das ILC2s ativadas ou o agonista de NMUR1.
39. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 38, caracterizada pelo fato de que as ILC2s ativadas ou as ILC2s ativadas e o agonista de NMUR1 são administrados por via intravenosa, oral, nasal, retal ou por absorção cutânea.

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40. Método para diminuir a atividade ou proliferação de células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s), caracterizado pelo fato de que compreende contatar ILC2s com um antagonista de receptor 1 de neuromedina U (NMUR1) ou neuromedina U (NMU) em uma quantidade eficaz para diminuir a atividade das ILC2s.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o antagonista de NMUR1 ou NMU é um anticorpo que especificamente se liga a e inibe NMUR1 ou NMU, respectivamente, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
42. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o antagonista de NMUR1 ou NMU é uma molécula de ácido nucleico inibidor que reduz a expressão, transcrição ou tradução de NMUR1 ou NMU.
43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibidor é uma molécula de ácido nucleico de sRNA, shRNA ou antissenso.
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, caracterizado pelo fato de que o contato é in vitro.
45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 43, caracterizado pelo fato de que o contato é in vivo.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o antagonista de NMUR1 ou NMU é administrado a um indivíduo.
47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
48. Método de acordo com a reivindicação 46 ou reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não está em necessidade de outro tratamento além do antagonista de NMUR ou NMU 1.

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49. Método para tratar uma doença associada a células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s), caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade de tal tratamento um antagonista do receptor 1 de neuromedina U (NMUR1) ou neuromedina U (NMU) em uma quantidade eficaz para tratar a doença.
50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o antagonista de NMUR1 ou NMU é um anticorpo que especificamente se liga a e inibe NMUR1 ou NMU, respectivamente, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
51. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o antagonista de NMUR1 ou NMU é uma molécula de ácido nucleico inibidor que reduz a expressão, transcrição ou tradução de NMUR1 ou NMU.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibidor é uma molécula de ácido nucleico de sRNA, shRNA ou antissenso.
53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 52, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 53, caracterizado pelo fato de que a doença é alergia, asma alérgica, alergia alimentar, esofagite eosinofílica, dermatite atópica, fibrose, rinite alérgica, rinossinusite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), fibrose cística, tratável pela redução das respostas imunes tipo 2, tratável pela redução de eosinófilos, ou tratável pela redução de mastócitos.
55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 54, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1 ou NMU.
56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

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49 a 55, caracterizado pelo fato de que o antagonista de NMUR1 é administrado por via intravenosa, oral, nasal, retal ou por absorção cutânea.
57. Antagonista do receptor 1 de neuromedina U (NMUR1) ou neuromedina U (NMU) para uso no tratamento de uma doença associada a células linfoides inatas do Grupo 2 (ILC2s) caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade de tal tratamento do antagonista de NMUR1 ou NMU em uma quantidade eficaz para tratar a doença.
58. Antagonista de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o antagonista de NMUR1 ou NMU é um anticorpo que especificamente se liga a e inibe NMUR1 ou NMU, respectivamente, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
59. Antagonista de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o antagonista de NMUR1 ou NMU é uma molécula de ácido nucleico inibitória que reduz a expressão, transcrição ou tradução de NMUR1 ou NMU.
60. Antagonista de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibidor é uma molécula de ácido nucleico de sRNA, shRNA ou antissenso.
61. Antagonista de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 60, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
62. Antagonista de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 61, caracterizado pelo fato de que a doença é alergia, asma alérgica, alergia alimentar, esofagite eosinofílica, dermatite atópica, fibrose, rinite alérgica, rinossinusite algérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), fibrose cística, tratável por redução das respostas imunes tipo 2, tratável por redução de eosinófilos, ou tratável por redução de mastócitos.

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63. Antagonista de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 62, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não está em necessidade de outro tratamento além do agonista de NMUR1 ou NMU.
64. Antagonista de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 63, caracterizado pelo fato de que o antagonista de NMUR1 ou NMU é administrado por via intravenosa, oral, nasal, retal ou por absorção cutânea.