CN116440292A - Danon病和其它自噬障碍的治疗方法 - Google Patents

Danon病和其它自噬障碍的治疗方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116440292A
CN116440292A CN202211177638.3A CN202211177638A CN116440292A CN 116440292 A CN116440292 A CN 116440292A CN 202211177638 A CN202211177638 A CN 202211177638A CN 116440292 A CN116440292 A CN 116440292A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lamp
vector
subtypes
intra
subject
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211177638.3A
Other languages
English (en)
Inventor
埃里克·D·阿德勒
布兰德利·纳尔逊
谢林·哈希姆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Publication of CN116440292A publication Critical patent/CN116440292A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明提供了包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP‑2)的一种或多种亚型的多核苷酸的基因治疗载体，以及使用这种基因治疗载体治疗Danon病和其它自噬障碍的方法。

Description

Danon病和其它自噬障碍的治疗方法
本申请要求2016年1月19日提交的根据35U.S.C.§119(e)的美国临时专利申请No.62/280,269的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
这项工作部分由国家卫生研究院授予的PHS 7K23HL107755和RSA 1268资助。美国政府在这项发明中有一定的权利。
背景技术
Danon病是一种家族性心肌病，与由于编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2，也称为CD107b)的基因突变而导致的自噬受损有关。越来越多的证据强调自噬在调节心肌细胞生物能学、功能和存活中的重要性。然而，自噬潮受损的心肌细胞的细胞功能障碍和死亡的机制尚不清楚。在先前的研究中，为了研究Danon病的分子机制，我们从两个不同LAMP-2突变的患者中制备人诱导的多能干细胞(hiPSCs)(Hashem et al.，Stem Cells.2015Jul；33(7)：2343-50)。Danon-hiPSC衍生的心肌细胞(hiPSC-CMs)表现出受损的自噬潮和心衰的主要特征，如增加的细胞大小，增加的利钠肽的表达，和与对照hiPSC-CMs相比异常的钙处理。此外，Danon-hiPSC-CMs表现出过量的线粒体氧化应激和细胞凋亡。使用巯基抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸清除自由基导致Danon-hiPSC-CMs中凋亡细胞死亡的显著减少。我们还使用慢病毒载体在强啡肽诱导的启动子的控制下在Danon hiPSC系之一中来引入LAMP-2B亚型的编码序列。LAMP-2B的过度表达与多西环素的加入也降低了Danon hiPSC-CMs中的氧化应激水平和凋亡细胞死亡，证实了LAM-2B在疾病病理生理学中的重要性。综上所述，我们用hiPSC-CMs对LAMP-2突变患者进行了Danon病的建模，使我们能够对该病的发病机理进行机械洞察。我们证明LAMP-2缺陷导致自噬潮受损，其导致过度氧化应激和随后的心肌细胞凋亡。用抗氧化剂清除过多自由基和LAMP-2B的过表达改善了体外疾病表型。现有技术并没有公开Danon病或与自噬相关的其它疾病的有效治疗策略，因此本文所述的体内研究对于验证该方法的有效性是必要的。
发明内容
在一个方面，提供了基因治疗载体，例如，用于系统地或局部地增加受试者中溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的一种或多种亚型的表达。基因治疗载体可用于预防、减轻、改善、减少、抑制和/或治疗Danon病或另一种自噬潮不足障碍的一种或多种症状。在不同的实施方式中，基因治疗载体包含表达盒，所述表达盒包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的一种或多种亚型的多核苷酸。在不同的实施方式中，所述载体为病毒载体。在不同的实施方式中，所述病毒载体来自选自由腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒和腺相关病毒(AAV)的病毒组成的组。在不同的实施方式中，所述载体来自腺相关病毒(AAV)血清型1-11或其任何亚组中的一种或多种。在不同的实施方式中，所述病毒载体被封装在阴离子脂质体中。在不同的实施方式中，所述载体为非病毒载体。在不同的实施方式中，所述非病毒载体选自由裸DNA、阳离子脂质体复合物、阳离子聚合物复合物、阳离子脂质体聚合物复合物和外泌体组成的组。在不同的实施方式中，所述表达盒包括可操作地连接在5′至3′方向(从待转录的mRNA的角度)、第一反向末端重复序列、增强子、启动子、编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸、3′非翻译区，多聚腺苷酸化(polyA)信号，和第二反向末端重复序列。在不同的实施方式中，所述启动子选自由巨细胞病毒(CMV)启动子和鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。在不同的实施方式中，所述多核苷酸包括DNA或cDNA。在不同的实施方式中，编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸包括一种或多种人LAMP-2亚型。在不同的实施方式中，编码LAMP-2的一种或多种亚型的多核苷酸包括选自由LAMP-2A、LAMP-2B和LAMP-2C组成的组中的一种或多种LAMP-2亚型。在不同的实施方式中，编码LAMP-2的一种或多种亚型的多核苷酸与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中的一种或多种相比具有至少约90％的序列一致性，例如，至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列一致性。在不同的实施方式中，编码LAMP-2的一种或多种亚型的多核苷酸包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQID NO：3中的一种或多种。
在另一方面，提供了预防、减轻、改善、减少、抑制、消除和/或逆转在需要的受试者中的一种或多种Danon病或另一种自噬障碍的方法，其包括向受试者施用如在上文和此处的基因治疗载体(参见例如图2)。在另一方面，提供了预防、减轻、改善、减少、抑制、消除和/或逆转在需要的受试者中的一种或多种Danon病或另一种自噬障碍的方法，其包括向受试者施用包含表达盒的腺相关病毒(AAV)载体，所述表达盒包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的一种或多种亚型的多核苷酸。在不同的实施方式中，通过选自由静脉内、动脉内、心脏内、冠状动脉内、心肌内、肾内、尿道内、硬膜外、颅内、皮下和肌肉内组成的组的途径施用载体。在不同的实施方式中，通过选自由微注射、射流注射、粒子轰击、水动力输注、电穿孔、声孔效应、激光辐照、磁转染组成的组中的物理或机械方法来递送或施用载体。在不同的实施方式中，在不进行患者的免疫抑制或血浆置换的情况下，多次使用载体。在不同的实施方式中，自噬障碍选自由终末期心力衰竭、心肌梗死、药物中毒、糖尿病、终末期肾衰竭和衰老组成的组。在不同的实施方式中，所述受试者是人。在不同的实施方式中，所述受试者表现Danon病或另一种自噬障碍的症状。在不同的实施方式中，所述受试者已被鉴定为具有减少的或不可检测的LAMP-2表达。在不同的实施方式中，所述受试者已被鉴定为具有突变的LAMP-2基因。
定义
术语“Danon病”是指具有多系统临床表现的X连锁的显性骨骼肌和心肌病症。Danon病突变导致溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)蛋白表达缺失。主要临床特征包括骨骼和心脏肌病、心脏传导异常、认知障碍和视网膜疾病。男性通常比女性更早和更严重地受到影响。
术语“溶酶体相关膜蛋白2”和“LAMP-2”可互换地指核酸和多肽多态性变异体、等位基因、突变体和种间同源物：(1)具有大于约90％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列一致性，优选在至少约25、50、100、200、300、400、或更多氨基酸的区域上，或在全长上，与由LAMP-2核酸(参见，例如，GenBank Accession Nos.NM_02294.2(亚型A)、NM_013995.2(亚型B)、NM_001122606.1(亚型C))编码的氨基酸序列相比，或与由LAMP-2多肽(参见，例如GenBankAccession Nos.NP_00222.5.1(亚型A)、NP_054701.1(亚型B)、NP_001116078.1(亚型C))的氨基酸序列相比；(2)与抗体结合，例如针对包含LAMP-2多肽(例如，本文所述的LAMP-2多肽)的氨基酸序列的免疫原提出的多克隆抗体；或由LAMP-2核酸(例如，本文所述的LAMP-2多核苷酸)编码的氨基酸序列及其适当修饰的变异体；(3)特异性地在严格杂交条件下与编码LAMP-2蛋白的核酸序列相对应的反义链及其适当修饰的变异体杂交；(4)与LAMP-2核酸(例如LAMP-2多核苷酸，如本文所述，和编码LAMP-2多肽的LAMP-2多核苷酸，如本文所述))相比，具有大于约90％，优选大于约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸序列一致性的核酸序列，优选在至少约25、50、100、200、500、1000、2000或更多核苷酸或在全长上。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可在本文互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物(analogs)和氨基酸模拟物(mimetics)，其功能类似于天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、α-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物(analogs)是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物(mimetics)是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的化学化合物，但其功能类似于天然存在的氨基酸。
本文中氨基酸可以通过它们公知的三个字母符号或由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的一个字母符号来表示。同样，核苷酸可以参考它们通常被接受的单字母代码。
“适当修饰的变异体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，适当修饰的变异体是指那些编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或其中核酸不编码氨基酸序列，它们基本上是相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸被密码子指定的每个位置上，密码子可以被改变为不改变编码的多肽描述的任何对应密码子。这种核酸变异体是“沉默变异体”，其是适当修饰变异体的一种。编码多肽的每一个核酸序列也描述了核酸的每一种可能的沉默变异体。技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG之外，AUG通常是蛋氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异体在每个描述的序列中是隐式的。
关于氨基酸序列，技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个体替换、删除或添加，其改变、添加或删除编码序列中的一个氨基酸或一小部分的氨基酸是一种“适当修饰的变异体”，其中改变导致用化学相似的氨基酸的氨基酸的替换。提供功能相似的氨基酸的适当的替换表在本领域是众所周知的。这种适当修饰的变异体除了并且不排除本发明的多态性变异体、种间同系物和等位基因。
以下八组各含有相互适当替换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸I、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)。
“多核苷酸”是从5′到3′端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以从天然来源分离，在体外合成，或者由天然和合成分子的组合制备。多核苷酸的大小表示为碱基对(缩写为“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)。在上下文允许的情况下，后两个术语可以描述单链或双链的多核苷酸。当这个术语被应用于双链分子时，它被用来表示总长度，并且将被理解为等效于术语“碱基对”。本领域的技术人员将认识到，双链多核苷酸的两条链在长度上可能略有不同，并且其末端可能由于酶切而交错，因此双链多核苷酸分子中的所有核苷酸可能不是成对的。
在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“一致性”是指相同或具有相同的特定百分比的氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列(即，相对于指定区域上的参考序列，例如，在本文描述的LAMP-2多核苷酸或多肽序列，当在比较窗口或使用以下序列比较算法之一或手动对准和目视检查测量的指定区域上进行比较和对准时，共享至少约80％的一致性，例如，至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的一致性。这样的序列被称为“基本相同”。这个定义也指测试序列的恭维。优选地，该一致性存在于长度至少为25个氨基酸或核苷酸的区域上，例如，在长度为50、100、200、300、400个氨基酸或核苷酸的区域上，或超过参考序列的全长。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，对测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算相对于参考序列的测试序列的百分比序列一致性。为了将核酸和蛋白质序列与LAMP-2核酸和蛋白质进行序列比较，使用了BLAST和BLAST 2.0算法和默认参数。
本文使用的“比较窗口”包括选自由从20至600、通常约为50至约200、更通常地约100至约150组成的组的相邻位置的任意一个段的参考，其中在两个序列最佳对准之后，序列可以与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。比较序列的最佳对准可以进行，例如，通过Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Person & Lipman，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 85：2444(1998)的相似性搜索方法，通过这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA，andTFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Compound Group，575Science Dr.，Madison，WI)的计算机化实现，或通过手动比对和视觉检查(参见，例如，Ausubel et al.，eds.，Current Propocols in Molecular Biology(1995 supplement)。适合于确定百分比序列一致性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschu et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)和Altschul et al.，NucleicAcids Res.25：3389-3402(1977)中描述。进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心是公开可用的(在万维网ncbi.nlm.nih.gov/上)。
一个迹象表明，两个核酸序列或多肽基本相同是指由第一核酸编码的多肽与对第二核酸编码的多肽的抗体的免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽基本相同，例如，在两个多肽不同的地方只有适当的替换。另一个迹象表明，两个核酸序列基本相同是指两分子或它们的补充物在严苛的条件下相互杂交，如下所述。另一个迹象表明，两个核酸序列基本上相同是指相同的可用于扩增序列的引物。
本文所述的“施用”是指局部和全身施用，例如肠内、肠外、肺和局部/经皮施用。在本文所述的方法中使用的化合物(例如，编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸)的施用途径包括，例如向受试者口服(每os(P.O.))施用、鼻腔或吸入施用、作为栓剂的施用、局部接触、透皮给药系统(例如，通过透皮贴剂)、鞘内(IT)施用、静脉内(“iv”)施用、腹腔内(“ip”)施用、或皮下(“sc”)施用，或缓释装置的植入，例如，微量渗透泵，仓库配方等。施用可以通过任何途径，包括肠外和透粘膜(例如，口腔，鼻腔，阴道，直肠，或经皮)。胃肠外施用包括，例如静脉内、肌肉内、动脉内、肾内、尿道内、心脏内、冠状动脉内、心肌内、皮内、硬膜外、皮下、腹腔内、心室内、离子透入和颅内。其它传送方式包括但不限于，脂质体制剂、静脉输注、透皮贴剂等的使用。
术语“全身施用”和“系统施用”是指给哺乳动物施用化合物或组合物的方法使得化合物或组合物包括药物作用的靶部位通过循环系统输送到体内。全身施用包括但不限于口服、鼻内、直肠和肠胃外(例如，除了通过消化道，如肌肉内、静脉内、动脉内、经皮和皮下)施用。
当使用时，术语“共施用”(co-administrating)或“共同施用”(concurrentadminitration)，例如关于化合物(例如，LAMP-2多核苷酸)和/或其类似物和另一种活性剂，指的是化合物和/或类似物和活性剂的施用，使得二者能同时达到生理效应。然而两剂不需要一起施用。在某些实施方式中，一剂的施用可以先于另一剂施用。同时生理效应不一定需要同时在两剂循环下存在。然而，在某些实施方式中，共施用通常导致两剂同时存在于身体中(例如，在血浆中)以任何给定剂量的最大血清浓度的显著分数(例如，20％或更大，如30％或40％或更大，如50％或60％或更大，如70％或80％或90％或更大)。
术语“有效量”或“药学有效量”是指数量和/或剂量，和/或以带来预期效果(例如，增加一种或多种LAMP-2亚型的足够量的表达以减少由受损的或有缺陷的细胞自噬为特征的疾病(例如，Danon病))的最终严重性。
短语“使被施用”是指控制和/或允许剂和/或化合物在争论中向受试者的施用而由医疗专业人员(例如，一个医生)所采取的行动，或一个人控制受试者的医疗问题。使被施用可以涉及适当的治疗或预防方案的诊断和/或确定，和/或使用特定的剂/化合物为受试者开药方。这样的药方可以包括，例如，起草一份处方形式，注解医疗记录等。
术语“共同”当提及本文所述的活性剂(例如，LAMP-2多核苷酸的一种或多种亚型)与本文所述的一种或多种其它药物(例如，乙酰胆碱酯酶抑制剂)共同使用时，活性剂和其它药物被施用以使它们的生理活动在有机体上至少有一些时间上的重叠。当它们不彼此共同施用时，有机体的生理活动没有时间上的重叠。在某些优选的实施方式中，“其它药物”根本不施用(例如，不共同施用)给有机体。
本文所述的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指延缓发病、减缓或逆转进展、减小严重程度、或减轻或预防该术语所适用的疾病或病症，或这种疾病或病症的一种或多种症状。
术语“减轻”是指减少或消除该病理或疾病的一种或多种症状，和/或减少该病理或疾病的一种或多种症状的发病率或延迟发病或严重程度，和/或预防该病理或疾病。在某些实施方式中，减少或消除病理或疾病的一种或多种症状可以包括，例如，一种或多种LAMP-2亚型的表达水平的可测量的和持续的增加。
本文所述的短语“基本上由……组成”是指在方法或组合物中叙述的活性药物制剂的属或种，并且还可以包括其它试剂，它们本身没有对所述说明或目的的实质性活性。
术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换地指哺乳动物，优选人类或非人类灵长类动物，但也指驯养哺乳动物(例如，犬或猫)，实验哺乳动物(例如，老鼠、大鼠、兔子、仓鼠、豚鼠)和农业哺乳动物(例如马，牛，猪，绵羊)。在各种实施方式中，受试者可以是一个人(例如，成年男性、成年女性、青春期男性、青春期女性、男童、女童)，在医院的医生或其它保健工作者的照料下，精神病护理设施，作为门诊病人，或其它临床语义。在某些实施方式中，受试者可能不在医生或其它保健工作者的照料或指示下。
术语“基因转移”或“基因传递”指的是用于将外源DNA可靠地插入宿主细胞的方法或系统。这种方法可以导致非整合转移DNA的瞬时表达、染色体外复制和转移复制子(如游离体)的表达，或将转移的遗传物质整合到宿主细胞基因组DNA中。
“AAV载体”是指从腺相关病毒血清型衍生的载体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6等。AAV载体可具有完整或部分缺失的AAV野生型基因中的一种或多种，例如rep和/或cap基因，但保留功能侧反向末端重复序列(ITR)序列。功能侧ITR序列是拯救、复制和包装AAV病毒粒子所必需的。因此，本文定义的AAV载体包括至少在用于复制和包装(例如，功能侧ITRs)病毒的cis中所需的那些序列。ITRs不需要是野生型核苷酸序列，并且可以被改变，例如通过核苷酸的插入、缺失或替换，只要这些序列提供功能拯救、复制和包装。AAV表达载体是利用已知技术构建的，至少在转录的方向上提供可操作的连接成分，控制要素包括转录起始区、感兴趣的DNA(即LAMP-2基因)和转录终止区。
附图说明
图1示出了腺相关病毒LAMP-2基因传递结构体的示意图。所示的溶酶体相关膜蛋白(LAMP)LAMP-2编码区通常应被理解为包括上游核糖体结合序列和起始密码子，但在一些实施方式中，天然元素可以用异源取代。上游核糖体结合位点不与IRES或自裂解肽下游的编码区结合使用。起始密码子不一定存在于自裂解肽下游的编码区中。图1A-1F示出了含有一个LAMP-2亚型的载体基因组。图1G-1K示出了含有两个LAMP-2亚型的载体基因组。图1L-1O示出了含有三个LAMP-2亚型的载体基因组。图中使用了以下缩写：ITR：反向末端重复序列；LAMP-2：溶酶体相关膜蛋白2型；UTR：非翻译区；Poly A：多聚腺苷酸化信号；CAG：包含CMV增强子和CBA启动子序列的启动子区域；CMV：巨细胞病毒；CBA：鸡β-肌动蛋白；WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件；RBG：兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号；EF-1：人伸长因子-1；IRES：内部核糖体进入位点；P2A：2A肽。
图1A示出了包含一个具有通用的5′和3′控制区域的LAMP-2亚型-A、B或C的蛋白质编码信息的结构体的示意图。
图1B示出了一些实施方式的结构体示意图，并在下面的实施例中使用，由5′和3′的反向末端重复元件、含有CMV增强子和CBA启动子序列的CAG启动子区域、CBA内含子、包括上游核糖体结合序列和起始密码子的一种LAMP-2亚型的编码序列，作为3′UTR的WPRE序列，和兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号组成。
图1C示出了包含天然人LAMP-2启动子区域的结构体的示意图。在一些实施方式中，该结构体用于响应于通常会导致正常细胞中的LAMP-2表达的细胞信号来表达转基因。
图1D示出了包含人伸长因子-1α启动子的结构体的示意图。在一些实施方式中，该结构体被用于在人类启动子区域的控制下组成性地表达转基因。其它组成活性的人启动子也可以用来代替EF-1α。
图1E示出了包含心脏特异性启动子(例如，但不限于心肌肌钙蛋白T2启动子)的结构体的示意图。在一些实施方式中，该结构体被用于仅在心脏组织中表达转基因(并且，例如，避免肝脏表达)。
图1F示出了包含肌肉特异性启动子的结构体的示意图，肌肉特异性启动子例如但不限于肌酸酐激酶启动子。在一些实施方式中，该结构体被用于表达心脏和骨骼肌中的转基因(并且避免肌肉外表达)。
图1G示出了包含两种LAMP-2亚型(使用任何潜在组合)的编码序列在不同启动子区域控制下的结构体的示意图。在一些实施方式中，该结构体(和图1H至1K的那些)被用于使用相同的病毒基因组表达两种不同的LAMP-2亚型。
图1H示出了包含两种LAMP-2亚型(使用任何潜在组合)的序列在不同启动子区域控制下的结构体的示意图。在单链AAV基因组中在(+)方向上编码一种亚型，而另一种亚型在(-)方向编码。在一些实施方式中，该结构体被用于在分离的DNA链上表达两种不同的LAMP-2亚型。
图1I示出了包含在用于分别在启动子区域和内部核糖体进入位点的控制下的两种LAMP-2亚型(使用任何潜在组合)的编码序列的结构体的示意图，以及随后的3′UTR和Poly A信号。在一些实施方式中，该结构体被用于使用相同的病毒基因组表达两种不同的LAMP-2亚型。
图1J示出了包含用于通过P2A裂解位点分离的两种LAMP-2亚型(使用任何潜在组合)的编码序列的结构体的示意图。在一些实施方式中，该结构体用于表达编码单个多肽中两种不同的LAMP-2亚型的mRNA，其将通过使用相同的病毒基因组经2A肽自切割而自发地裂解成单独的LAMP-2蛋白亚型。
图1K示出了包含用于LAMP-2外显子1-8接着包含内含子区域(包含所有必要的剪接信号)，具有3′UTR和Poly A信号的一种LAMP-2亚型的第9外显子编码序列，第二内含子区域(包含所有必要的剪接信号)，和具有3′UTR和Poly A信号的不同LAMP-2亚型的第9外显子编码序列的编码序列的结构体的示意图。在一些实施方式中，该结构体被用于通过选择性剪接来表达两种不同的LAMP-2亚型的mRNA，这是使用相同的病毒基因组在正常细胞中产生不同的LAMP-2 mRNA的机制。
图1L示出了包含在不同启动子区域的控制下具有3′UTR和Poly A信号的三种LAMP-2亚型的编码序列的结构体的示意图。在一些实施方式中，该结构体被用于使用相同的病毒基因组表达所有三种不同的LAMP-2亚型，并允许恢复所有潜在的LAMP-2功能。
图1M示出了包含在启动子区域和两种不同的内部核糖体进入位点的控制下，以及随后的3′UTR和Poly A信号的所有三种的LAMP-2亚型的以任意顺序的编码序列的结构体的示意图。在一些实施方式中，该结构体被用于使用相同的病毒基因组表达所有三种LAMP-2亚型。
图1N示出了包含所有三种被P2A裂解位点分开的LAMP-2亚型的在任何潜在的顺序的编码序列的结构体的示意图。在一些实施方式中，该结构体被用于表达编码单个多肽中三种不同的LAMP-2亚型的mRNA，其将通过使用相同的病毒基因组经2A肽自切割翻译后自发地裂解成单独的LAMP-2蛋白亚型。
图1O示出了包含LAMP-2外显子1-8接着包含内含子区域(包含所有必要的剪接信号)，具有3′UTR和Poly A信号的一种LAMP-2亚型的第9外显子编码序列，第二内含子区域(包含所有必要的剪接信号)，和具有3′UTR和Poly A信号的第二种LAMP-2亚型的第9外显子编码序列，第三内含子区域(包含所有必要的剪接信号)，和具有3′UTR和Poly A信号的第三种LAMP-2亚型的第9外显子编码序列的编码序列的结构体的示意图。在一些实施方式中，该结构体被用于通过选择性剪接来表达所有三种LAMP-2亚型的mRNA，这是使用相同病毒基因组产生正常细胞中不同的LAMP-2 mRNA的机制。外显子9编码序列可以以任何潜在的顺序和组合放置。
图2示出了通过促进LAMP-2的一种或多种亚型的表达的治疗性治疗方法(例如，Danon病或另一种至少部分由自噬障碍引起的疾病)的流程图。
图3A-F描述了LAMP-2亚型编码和蛋白序列：图3A：LAMP-2A编码序列；图3B：LAMP-2A蛋白质序列；图3C：LAMP-2B编码序列；图3D：LAMP-2B蛋白质序列；图3E：LAMP-2C编码序列；和图3F：LAMP-2C蛋白质序列。
图4A-C示出了显示序列一致性的LAMP-2A(图4A)、LAMP-2B(图4B)和LAMP-2C(图4C)的人类和小鼠蛋白质序列的最后90个氨基酸的对比。
图5A-B示出了在施用携带这些基因的AAV9载体后，LAMP-2B(图5A)和LAMP-2A(图5B)mRNA表达的剂量依赖性增加。
图6示出了在施用携带这些基因的AAV9载体后，LAMP-2B和LAMP-2A蛋白表达的剂量依赖性增加。
图7A-C显示了用DAPI(蓝色)和荧光标记抗LAMP-2抗体(白色)染色的心脏切片的荧光显微照片。图7A显示了用AAV9.LAMP-2B处理的Lamp-2击倒(KO)的小鼠的心脏切片。图7B显示了用AAV9.EGFP.处理的Lamp-2 KO的小鼠的心脏切片。图7C显示了未经处理的野生型(WT)小鼠的心脏切片。
图8A-B显示了用DAPI(蓝色)和荧光标记抗LAMP-2抗体(白色；一些实例用箭头突出显示)染色的心脏切片的荧光显微照片。图7A显示了用AAV9.LAMP-2B处理的Lamp-2 KO的小鼠的心脏切片。图7B显示了用AAV9.EGFP.处理的Lamp-2 KO的小鼠的心脏切片。
图9A-H示出了CGA-RFP-EGFP-LC3B自噬报告系统。图9A给出了系统操作的示意图。图9B-G′是荧光显微镜图像；X′(X素数)图像是在没有素数的同一字母标记的图像上概括的插图的放大。关于图9B-G′网格，第一列是红色荧光的图像；第二列是绿色荧光的图像；第三列是第一和第二列的合并图像，黄色代表红色+绿色荧光；前两行是来自表达CAG-RFP-EGFP-LC3B自噬报告结构体的WT小鼠的心脏切片图像，底部两行是来自表达CAG-RFP-EGFP-LC3B自噬报告结构体的Lamp-2 KO小鼠的心脏切片图像。未成熟的自噬体发绿色和红色(或合并图像中的黄色)荧光。成熟的自噬溶酶体仅发红色荧光。黄色箭头突出自噬空泡以两种颜色发荧光，而白色箭头突出自噬空泡仅以红色发荧光。图9H示出了为在WT和Lamp-2 KO小鼠中的自噬体或自噬溶酶体的自噬空泡的数量。
图10A-E示出了使用CAG-RFP-EGFP LC3B自噬报告系统的2基因治疗的效果。图10A为未经处理的WT小鼠心脏切片的图像。图10B为显示了用控制载体AAV9.EGFP.处理的Lamp-2 KO小鼠的转导细胞一个心脏切片的图像。图10C为用基因治疗载体AAV9.LAMP-2A处理的Lamp-2 KO小鼠的一个心脏切片的图像。图10D为用基因治疗载体AAV9.LAMP-2B处理的Lamp-2 KO小鼠的一个心脏切片的图像。在图10A、10C和10D的图像中，红色箭头用来突出一些存在的自噬溶酶体。图10E示出了四种条件下自噬体和自噬溶酶体代表的总自噬泡的比例。
图11A-C′给出了来自WT(图11A，A′)和Lamp-2 KO(图11B，B′)小鼠，以及用AAV9.LAMP-2B处理的Lamp-2 KO(图11C，C′)小鼠的心脏组织的电子显微照片。白色箭头突出了一些自噬空泡。黑色箭头突出了一些受损的线粒体。
具体实施方式
1.引言
Danon病是由突变导致的溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2，也称为CD107b)基因的表达减少或缺失引起的。本发明的方法部分地基于一种或多种编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸的引入，例如，包装在腺相关病毒(AAV)载体中，以将LAMP-2基因/个体亚型递送给Danon患者。在递送编码一种或多种LAMP-2亚型的一种或多种多核苷酸后，由患者自身的细胞表达LAMP-2转基因。在Danon患者中LAMP-2基因表达的恢复可导致疾病表型的改善，作为治疗该疾病的方法。向受试者递送一种或多种编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸也可用于治疗其它自噬病症，包括但不限于终末期心力衰竭、心肌梗死药物毒性、糖尿病、终末期肾衰竭和衰老。自噬的异常，特别是自噬潮的减少，与这些病症以及许多其他病症有牵连。表达较高水平的LAMP-2基因增加自噬潮，因此可作为治疗这些病症的方法。
目前尚无通过基因治疗方法治疗Danon病的技术。Danon病不是一种传统的溶酶体贮积症，其通常被定义为处理特定细胞底物所需的溶酶体蛋白(例如转运蛋白或酶)的缺陷，这导致在溶酶体中该特定底物的毒性的积累。Danon病被认为是自噬或自噬空泡肌病的紊乱，其影响通过自噬途径处理的所有细胞成分的降解，而不是由特定底物的积累引起的。此外，没有现有的技术明确地描述了用于治疗Danon病或其它自噬障碍的LAMP-2基因/个体亚型的递送。因此，本方法提供了一种独特的治疗Danon病的方法和通过明确地包括将作为改善自噬障碍手段的LAMP-2基因的递送改进现有的AAV技术。
2.接受治疗的患者
使用本文所述的方法进行治疗的受试者/患者包括患有以自噬潮不足(例如，Danon病和其它已知自噬障碍，包括但不限于，收缩性和舒张性心力衰竭、心肌梗死、药物毒性(例如，蒽环霉素氯喹及其衍生物)、糖尿病、终末期肾脏疾病和衰老)为特征的疾病或病症但未显示症状的个体以及目前显示症状的受试者。这样的受试者可能已被鉴定为具有突变的LAMP-2基因或具有减少或不可检测的LAMP-2表达水平。
在一些实施方式中，受试者表现出以自噬潮不足(例如，Danon病和其它已知自噬障碍，包括但不限于，收缩性和舒张性心力衰竭、心肌梗死、药物毒性、糖尿病、终末期肾脏疾病和衰老)为特征的疾病或病症的症状。症状可能是积极表现的，或可能是抑制或控制(例如，通过药物)或缓解的。受试者可能或可能没有被(例如由一名合格的医生)诊断出这种病症。
受试者可以是任何哺乳动物在分娩时发育的任何阶段，例如胚胎、胎儿、婴儿、青少年或成人。在不同的实施方式中，受试者是儿童、青少年或成人。在不同的实施方式中，受试者是哺乳动物，例如，人类或驯养哺乳动物(例如，犬科动物或猫科动物)。
3.LAMP-2多核苷酸的载体递送
一般而言，本文所述的基因治疗载体包含表达盒，所述表达盒包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的一种或多种亚型的多核苷酸，其允许LAMP-2表达部分或全部纠正在有需要的受试者中的缺陷LAMP-2蛋白表达和自噬潮(例如，具有Danon病或另一种以缺乏自噬潮为特征的至少部分是由于缺乏LAMP-2表达的疾病的受试者)。基因治疗载体可以是病毒载体或非病毒载体。说明性的非病毒载体包括，例如裸DNA、阳离子脂质体复合物、阳离子聚合物复合物、阳离子脂质体聚合物复合物和外泌体。
在一些实施方式中，载体携带单一亚型LAMP-2A、LAMP-2B或LAMP-2C；参见例如图1A-F，其示出了携带单个LAMP-2亚型基因的AAV载体的示意图。在其他实施方式中，载体携带两种LAMP-2亚型的基因；参见例如图1G-K，其示出了携带两种LAMP-2亚型基因的AAV载体、一个DNA链上的LAMP-2B和另一个DNA链上的LAMP-2A的示意图。还有其它实施方式携带所有三种亚型(见图1L-O)。除了所描绘的基因组结构之外，还可以通过制作所示的各种实施方式的杂交体来构建三种亚型载体。例如，可以有两个启动子，一个单一亚型的驱动表达和两个亚型盒中另一个的驱动表达，通过使用IRES、自裂解肽或选择性剪接。在包括多个亚型的各种实施方式中，亚型以任何顺序出现，或者自然顺序的镜像B、A、C，或改变它。通过在单个载体中携带多个亚型，可以确保转染细胞中的亚型的共表达，并且在剂量中使用更少的总载体颗粒。
病毒载体的实例包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒和腺相关病毒(AAV)载体。本发明的实践中有用的基因递送病毒载体可以利用分子生物学领域中众所周知的方法构建。通常，携带转基因的病毒载体是由编码转基因的多核苷酸、合适的调节元件和用于生产介导细胞转导的病毒蛋白所必需的元素组装而成的。
这样的重组病毒可以通过本领域已知的技术产生，例如，通过转染包装细胞或通过辅助质粒或病毒的瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括但不限于PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。产生这种复制缺陷型重组病毒的详细方案可以在例如WO95/14785、WO96/22378、美国专利5,882,877、美国专利6,013,516、美国专利4,861,719、美国专利5,278,056和WO94/19478中找到，其全部内容通过引入并入本文中。
在一些实施方式中，基因病毒载体是腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。在不同的实施方式中，AAV载体选自AAV血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AA5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh10，以及亚组及其混合物，包括自互补AAV(scAAV)基因组，或任何其它可感染人类、猴子或其它物种的AAV的血清型。在一个实施方式中，AAV载体为AAVrh10。在另一个实施方式中，AAV载体为AAV9。在又一个实施方式中，AAV载体为AAV8。重组AAV(rAAV)载体经常被用于治疗基因的传递，并且已经在人类临床试验中被研究。rAAV载体可被设计为将指定的转基因传递给患者的细胞用于表达。在通过rAAV载体感染和引入病毒基因组后，病毒基因主要存在于不整合到宿主基因组中的外染色体结构中，而是由宿主细胞的翻译机制表达。为了成功的宿主细胞感染和基因表达，rAAV载体需要几种组分(参见图1)：反向末端重复元件(ITRs)、启动子和/或增强子区、转基因和3′非翻译区和多聚腺苷酸化信号。在病毒感染宿主细胞后，启动子区域启动信号，通过宿主细胞的翻译机制翻译病毒传递的转基因。
通常，控制元件被选择为在哺乳动物细胞中起作用。所得的包含操作性连接成分的结构体与功能AAV ITR序列有界(5′和3′)。“腺相关病毒反向末端重复序列”或“AAVITRs”是指在AAV基因组的两端发现的现有的识别区域，所述基因组在cis中作为DNA复制起点和作为病毒的包装信号共同作用。AAV ITRs，连同AAV rep编码区一起，提供了有效的切除和拯救，并将介于两个侧翼ITRs之间的核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中。AAVITR区的核苷酸序列是已知的。对于AAV2序列，参见，例如，Kotin，1994；Berns，K I“Parvoviridae and their Replication”in Fundamental Virology，2nd Edition，(B.N.Fields and D.M.Knipe，eds.，其全部内容通过引用并入本文)。本文所述的“AAVITR”不一定包括野生型核苷酸序列，但可以改变，例如通过插入、删除或替换核苷酸。
此外，AAV ITR可来源于任何AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AA5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh10。此外，在AAV载体中，位于所选择的核苷酸序列侧面的5′和3′ITRs不一定是相同的或源自同一AAV血清型或分离物，只要它们起着预期的作用，即，允许从宿主细胞基因组或载体中切除和拯救感兴趣序列，并允许当细胞中存在AAV Rep基因产物时，异源序列整合到受体细胞基因组中。此外，AAV ITRs可来源于任何AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AA5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAVrh10。此外，在AAV表达载体中，位于所选择的核苷酸序列侧面的5′和3′ITRs不一定是相同的或源自同一AAV血清型或分离物，只要它们起着预期的作用，即，允许从宿主细胞基因组或载体中切除和拯救感兴趣序列，并允许当细胞中存在AAV Rep基因产物时，异源序列整合到受体细胞基因组中。
在不同的实施方式中，使用来自哺乳动物心肌细胞，特别是心肌细胞和心肌祖细胞的具有嗜性和高转导效率的AAV血清型的载体。在Cearley C N et al.，MolecularTherapy 16(10)；1710-1718，2008中提供了不同血清型的转导效率的回顾和比较，其全部内容通过引用并入本文。在其它非限制性的实例中，优选的载体包括来源于像AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AA5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAVrh10的任何血清型的载体，它们也被证明是转导心肌细胞的载体。
在不同的实施方式中，所选择的核苷酸序列可操作地连接到指导其在受试者体内的转录或表达的控制元件。这样的控制元件可以包括通常与所选择的基因相关的控制序列。
或者，可以采用异源控制序列。有用的异源控制序列通常包括那些来源于编码哺乳动物或病毒基因的序列。实例包括但不限于，磷酸甘油酸激酶(PKG)启动子，CAG(CMV增强子与鸡β-肌动蛋白启动子，包括通过第一内含子的序列和兔β-珠蛋白基因的剪接受体)启动子，MCK(肌酸激酶)启动子，SV40早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(AD MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV即刻早期启动区(CMVIE)，劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，合成启动子，杂交启动子等。启动子可以是人类来源的或是来自其它物种的，包括来自小鼠的。此外，从非病毒基因，如海洋金属硫蛋白基因衍生的序列，也将在本文中使用。这样的启动子序列可从例如Stratagene(圣地亚哥，加利福尼亚)商业获得。异源启动子的实例包括但不限于CMV启动子。可诱导启动子的实例包括但不限于蜕皮激素、四环素和低氧和奥芬的DNA应答元件。当多个亚型在单个载体中编码时，它们优选地，但不一定，可操作地连接到不同的控制序列。
类似地，编码区的3′端的控制元件，包括3′非翻译区(3′UTR)和多聚腺苷酸化信号，可以从插入的基因或异源获得。特定的实施方式利用土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)作为3′UTR或兔β珠蛋白多聚腺苷酸化信号或两者。3′控制元件还可以包括连接到编码区域的控制元件。例如，在单个启动子的控制下，通过放置内部核糖体进入位点(IRES)(参见例如图1I和1M)或自切割肽序列(例如小核糖核酸病毒2A肽；参见例如图1J和1N)于第一和第二亚型之间和第二和第三亚型(如果存在的话)之间来表达多个LAMP-2亚型。在IRES的情况下，翻译2或3个多肽。在自裂解肽的情况下，LAMP-2亚型与干预的自裂解肽一起存在于载体中作为单个阅读框，其作为单个多肽被翻译，所述多肽在翻译后或翻译过程中被裂解成其取代基LAMP-2亚型。
当载体被构建为支持选择性剪接时，在单个启动子的控制下转录也是可以实现的。在这样的结构体中，LAMP-2的前八个外显子在cDNA中剪接在一起存在，随后有两个或三个内含子-外显子对，以包括两个或全部三个可产生三个LAMP-2亚型的替代外显子(参见例如附图1K和1O)。在各种实施方式中，内含子-外显子对以任何顺序出现，或者镜像B、A、C的自然顺序，或改变它。本征内含子太长，不能包含在大小受限的载体例如AAV。在这种情况下，内含子通过中心序列的去除而截断，同时保留必要的5′和3′剪接位点和剪接信号。通常，仅在内含子的5′末端保留几个碱基和在内含子的3′末端保留大约100-200个碱基足以保证剪接。或者，异源内含子可以取代天然内含子。
含有由AAV ITRs限定的感兴趣的DNA分子的AAV表达载体可以通过将所选择的序列直接插入AAV基因组而构建，该AAV基因组具有从其中切除的主要AAV开放阅读框(“ORFs”)。AAV基因组的其它部分也可以被删除，只要ITRs的足够部分保留以允许复制和包装功能。这样的构造可以使用本领域中公知的技术设计。参见例如美国专利5，173,414和5,139,941；国际出版物WO92/01070(出版于1992年1月23日)和WO93/03769(出版于1993年3月4日)；Lebkowski et al.，1988；Vincent et al.，1990；Carter，1992；Muzyczka，1992；Kotin，1994；Shelling and Smith，1994；和Zhou et al.，1994，其中每一个的全部内容通过引用并入本文。
或者，AAV ITRs可以从病毒基因组或从AAV载体中切除，所述载体含有相同的和融合的5′和3′的选择的使用标准结扎技术存在于另一载体中的核酸结构体。包含ITRs的AAV载体已被描述在例如美国专利5,139,941中，其全部内容通过引用并入本文中。特别地，其中描述了几个AAV载体，其可从美国菌种保藏中心(“ATCC”)中以编号53222、53223、53224、53225和53226获得。此外，嵌合基因可被合成以包括AAV ITR序列，其排列一个或多个选择的核酸序列的5′和3′。可以使用用于在哺乳动物CNS细胞中表达嵌合基因序列的优选密码子。完整的嵌合序列是由标准方法制备的重叠寡核苷酸组装而成。参见，例如，EdgeNature，vol，292，1981，page 756；Nambair et al.，Science，vol.223，1984，page1299；Jayet al.，J.Biol.Chem.Vol.259，1984，page 6311，其中每一个的全部内容通过引用并入本文中。为了产生AAV病毒粒子，AAV表达载体通过已知的技术，例如通过转染引入合适的宿主细胞中。许多转染技术在本领域中是公知的。参见，例如Graham et al.，Virology，52，456-467，(1973)；Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning，a laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratories，New York，Davis et al.(1986)Basic Methods inMolecular Biology，Elsevier，和Chu et al.(1981)Gene 13：197。特别适合的转染方法包括磷酸钙共沉淀(Graham et al.，1973)，直接显微注射到培养细胞(Capeechi，1980)，电穿孔(Sigekawa et al.，1988)，脂质体介导的基因转移(Mannino et al.，1988)，脂质介导的转导(Felgner et al.，1987，PNAS USA，84，21，7413-17)，以及使用高速微丸的核酸递送(Klein et al.，1987，Endocrinology 120：2339-45)。上述各参考文献的每一个的全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，AAV除了含有LAMP-2亚型编码核酸序列之外，还含有来自AAV2的ITR载体的AAV载体的骨架，启动子，例如小鼠PGK(磷酸甘油酸激酶)基因或巨细胞病毒/鸡β-肌动蛋白杂合启动子(CAG)，其由来自巨细胞病毒即刻基因和启动子组成，剪接供体和来自鸡β-肌动蛋白基因的内含子，来自兔β-珠蛋白的剪接受体，或任何启动子，如PGK，CAG，MCK，EF-1或天然LAMP-2启动子。在不同的实施方式中，病毒载体用阴离子脂质体包封，例如在美国专利公开2015/0284691中描述的。
在不同的实施方式中，载体内的表达盒的结构包括来自任何已知AAV血清型或亚组的第一和第二(例如，5′和3′)反式末端重复序列(ITRS)，所述血清型或亚组包括scAAV，具有或不具有任何已知的增强子元件(例如CMV增强子)的任何已知的启动子区域(例如巨细胞病毒(CMV)启动子或鸡β肌动蛋白启动子)，溶酶体相关蛋白2基因(包括所有已知的亚型，例如，LAMP-2A、LAMP-2B和LAMP-2C，以及这些亚型的所有已知的多态性)，和多聚腺苷酸化信号(包括但不限于兔β-珠蛋白或)。
病毒传递的LAMP-2亚型基因的翻译，或各种亚型基因的组合，导致对于这种特定的亚型的LAMP-2蛋白的表达，其然后靶通过宿主细胞机制靶向宿主细胞的的溶酶体膜。恢复LAMP-2亚型的表达和功能，然后恢复自噬潮(可能包括但不一定限于，所有已知形式的自噬，如巨自噬、线粒体自噬、分子伴侣介导的自噬和DNA/RNA自噬)，这在Danon患者中是缺陷的和具有因果关系的，允许患病的宿主细胞消除有毒的细胞成分和受损的细胞器，从而改善细胞功能和存活。最终，LAMP-2亚型表达的恢复用于治疗引起Danon病的潜在基因缺陷，并减轻疾病的表型和症状。在其它自噬的病症中，LAMP-2可表达，但不足以产生足够的自噬潮，从而促进正常细胞功能和存活，通过rAAV载体递送转基因LAMP-2亚型导致生成物LAMP-2蛋白质的过度表达。这种过度表达恢复自噬潮接近正常，正常或超常水平。疾病的自噬潮的恢复，导致破坏正常自噬，然后减轻、缓和和/或逆转疾病表型和症状。
4.载体药物组合物
本发明提供了药物组合物，例如用于预防或治疗以缺乏自噬潮为特征的疾病(例如，Danon病)，其包含治疗有效量的载体，该载体包含编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸的核酸序列。
可以理解，本发明的化合物和组合物的单一剂量或总日剂量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所使用的特定化合物的活性；所使用的特定组合物，患者的年龄，体重，一般健康状况，性别和饮食；给药时间，给药途径和所使用的特定化合物的排泄率；治疗的持续时间；联合使用的或与所使用的特定核酸或多肽符合的药物；以及在医学领域中众所周知的因素。例如，在本领域的技术范围内，在低于达到所需的治疗效果的水平下的化合物的开始剂量，并逐渐增加剂量直到达到所需的的效果。然而，每个成年人每天产品的日剂量可以在很大范围内变化。根据本发明的载体的应当被施用的治疗有效量和用于治疗病理状态的剂量与病毒或非病毒颗粒和/或本文所描述的药物组合物的数量，将取决于许多因素，包括患者的年龄和健康状况、干扰或障碍的严重程度、给药的方法和频率以及所要使用的特定肽。
含有载体的药物组合物可以是适合于所选择的给药方式的任何形式，例如，心室内、心肌内、冠状动脉内、静脉内、动脉内、肾内、尿道内、硬膜外或肌肉内给药。包含编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸的基因治疗载体可以作为单一活性剂，或与其它活性剂结合，以单位给药形式，作为与常规药物载体的混合物，施用于动物和人。
在不同的实施方式中，药物组合物包含可用于可注射制剂的药学上可接受的载体。这些可以特别是等渗的、无菌的、盐水的溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的，尤其是冷冻干燥的组合物，其根据情况而添加灭菌水或生理盐水，允许注射溶液的构成。
适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体；制剂包括芝麻油、花生油或含水丙二醇；和用于临时制备无菌注射剂溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是液体的。在生产和储存条件下必须保持稳定，必须防止如细菌、真菌等微生物的污染作用。
可以将含有作为游离碱或药理学上可接受盐的基因治疗载体的溶液制备在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇和它们的混合物中以及油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。
可以将基因治疗载体配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，并且由无机酸形成，例如，例如盐酸或磷酸，或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。用游离羧基形成的盐也可以来自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。
载体也可以作为溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。适当的流动性，例如，可以通过使用涂料，如卵磷脂，通过在分散的情况下维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的预防可以由各种抗菌剂和抗真菌剂带来，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，最好包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射的组合物的长时间吸收可由通过在延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)的组合物中使用带来。
无菌可注射溶液通过将所需量的活性多肽与具有上面列举的按照需要的其它成分的适当的溶剂结合在一起，然后通过过滤灭菌来制备。通常，分散体通过将各种灭菌活性成分掺入含有基本分散介质的无菌载体和上面列举的所需的其它成分来制备。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末，再加上先前灭菌过滤溶液的任何额外的所需成分。
5.自噬疾病的治疗方法
本发明还提供了预防、减轻、改善、减少、抑制、消除和/或逆转在有需要的受试者中的Danon病或另一种自噬障碍中的一种或多种症状的方法，其包括向受试者施用如上和此处所述的基因治疗载体，例如，腺相关病毒(AAV)载体，其包含表达盒，所述表达盒包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的一种或多种亚型的多核苷酸。载体被传递给有需要的受试者，由此编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸通过转导的细胞在治疗有效水平上表达。
在一个特定的实施方式中，所述载体为AAV9。在另一特定的实施方式中，所述载体为AAV8。在另一特定的实施方式中，所述载体为AAVrh10。在这些实施方式的另一方面，它们专门用于治疗Danon病。
在不同的实施方式中，通过经选自由静脉内、动脉内、心脏内、冠状动脉内、心肌内、肾内、尿道内、硬膜外、皮下和肌肉内组成的组的途径施用所述载体。在不同的实施方式中，通过经小切口的心外膜注射、经冠状动脉内注射、心内膜心肌注射或通过用于心脏的另一种类型的注射，将所述载体直接递送到心肌。另外的给药途径也可以包括在直接可视化下载体的局部应用，例如，浅皮质应用，或其它非立体定向应用。
病毒载体通常会引起免疫应答，其可以包括抗体反应，当重复给药变得必要或需要时，其可以减少或完全抑制特定载体在该个体中的有效性。重复给药可能是合适的，例如，由于细胞增殖，随着时间的推移，载体可能丢失，特别是附加型载体。更难以进入的组织需要多个载体给药以转染足够数量的细胞以有效治疗疾病。转基因的表达也会随着时间的推移而丢失。在抑制抗体应答方面的施用基因治疗载体的需要可以以各种方式解决。例如，抗体效价可以通过在载体施用前的清血法而减少，或者患者可以用适当的医疗方案免疫抑制。另外，可以在注射含有LAMP-2转基因的治疗性AAV之前，将空AAV衣壳给药以结合宿主抗体和免疫细胞。根据靶组织，直接局部给药而不是全身给药可用于克服或改善抗载体抗体的抑制作用。在另一种方法中，可以使用基于其衍生的病毒的不同血清型的载体。例如，如果最初使用AAV9载体，并且存在抗AAV抗体效价的问题，但需要进一步的基因治疗，则可以施用携带相同(或不同)基因结构体的AAV8载体。
在配制时，溶液可以以与剂型制剂相容的方式和以治疗有效的量给药。所述制剂易于以多种剂型给药，如上述可注射溶液的类型，但也可采用药物释放胶囊等。也可以施用多种剂量。
在适当的情况下，本文所描述的载体可在任何合适的用于递送的媒介中配制。例如，它们可以被放置在药学上可接受的悬浮液、溶液或乳液中。适宜的媒介物包括生理盐水和脂质体制剂。更具体地，药学上可接受的载体可以包括非水溶液、悬浮液和乳剂的无菌水溶液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。含水载体包括但不限于水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。静脉媒介包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂)等。
防腐剂和其它添加剂也可以存在，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
胶体分散体系也可用于靶向基因传递。胶体分散体系包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。
合适的治疗方案可以由医生决定，并将取决于受试者的年龄，性别，体重，和疾病的阶段。作为一个例子，使用病毒表达载体递送编码LAMP-2多肽的核酸序列，每单位剂量的LAMP-2多肽表达载体可以包含2.5μl至100μl的组合物，该组合物包括在药学上可接受的流体中的病毒表达载体，以每ml 1011至1016个病毒基因组的浓度为例。
在一些治疗方案中，使用单LAMP-2亚型的携带基因的载体，例如LAMP-2B。在其它治疗方案中，使用两个LAMP-2亚型的携带基因的载体，例如LAMP-2B和LAMP-2A。在一些实施方式中，两个亚型携带在不同的载体制剂中。在一个方面，两个载体制剂均来自于相同的载体，例如AAV9载体或任何其它如上描述的特定的载体。在其它的实施方式中，多肽均编码在单一载体中；参见例如图1。类似地，如果治疗方案包括编码全部三个亚型的核酸序列，亚型可以被携带在各自的载体中或在单一载体中。在使用由各自载体携带亚型的治疗方案中，多个载体可以同时施用，单独地或混合在一起，或它们可以每隔几小时、几天或几周顺序施用。
6.试剂盒
本发明进一步提供了包含基因治疗载体的试剂盒，所述试剂盒包含编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸，如上文和此处所述。在不同的实施方式中，试剂盒提供以一种或多种单一剂型制备的基因治疗载体施用于受试者，例如在预载注射器或安瓿中。在不同的实施方式中，基因治疗载体以冻干形式提供。
实施例
实施例1 AAV9基因治疗
与上述描述一致的特定载体构建为具有源于AAV2的ITRs和在具有CMV增强子(CAG启动子)的鸡β肌动蛋白启动子的控制下编码LAMP-2A或LAMP-2B的AAV9载体。此外，这些载体整合了土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件和兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号(参见图1B)。这些载体是从宾夕法尼亚大学国家心脏、肺和血液研究所基因治疗资源计划的临床前载体核心设施获得的。人类LAMP-2序列被纳入在小鼠中具有功能性的预期，因为同系物之间的序列高度一致性，特别是在C-末端区域，其形成蛋白质的跨膜和胞质尾部成分(参见图4)。
载体用于在体内递送LAMP-2亚型。AAV9血清型对心脏和骨骼肌以及神经组织具有良好的取向性，器官受Danon病的影响最大。然而，Danon是一种多系统病症，许多不同的器官可能涉及；因此，转基因LAMP-2亚型的表达是在一个组成性活跃的鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和巨细胞病毒(CMV)增强子(CAG结构体)的控制下。该启动子是无处不在地活跃，并将允许LAMP-2转基因在所有组织中依赖感染效率表达。还获得了用作控制试剂的携带增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的AAV9载体。
实施例2 AAV9 LAMP-2亚型载体向LAMP-2敲除小鼠的施用
Lamp-2 KO小鼠(Nature.2000 Aug 24；406(6978)：902-6；Basic ResCardiol.2006 Jul；101(4)：281-91)发展了一种类Danon综合征，虽然疾病的严重程度比人类疾病更温和，可能至少部分是由于小鼠较短的寿命提供了由于自噬潮受损而积累的时间较短。因此，需要等到小鼠至少3个月大，最好是5-6个月前才开始治疗，以便有足够的病理积累，其逆转很容易被检测到。
在理想化的过程中，6个月大的Lamp-2 KO小鼠，通过静脉注射到颈外静脉接受AAV载体的5×1011、1×1012或2×1012基因组拷贝(GC)。在各种实验中，WT小鼠接受LAMP-2亚型载体，而Lamp-2 KO小鼠接受eGFP载体作为对照。使用足够数量的小鼠，从而可以在不同时间点处死和评估亚群，例如，在给药后1、2和6个月。
实施例3 在载体给药后LAMP-2亚型基因转录的评估
约3-4个月龄的Lamp-2 KO小鼠以5×1011、1×1012或2×1012gc/小鼠接受了剂量增加的AAV9.LAMP-2B和AAV9.LAMP-2A载体(参见图1B和以上描述)。每种情况下处死一只小鼠，并在消化心肌组织上进行RT-qPCR，一式三份，以评估人类转基因的mRNA表达(基因转录)。未经处理的WT小鼠被用来证明没有人LAMP-2亚型的表达。数据显示人类转基因表达的剂量依赖性增加(参见图5)。
实施例4 在载体给药后LAMP-2亚型蛋白表达的评估
使用与实施例3相同的小鼠，在消化心肌组织上进行免疫印迹，以评估相对于GAPDH的人类转基因的蛋白表达。用AAV9.EGFP处理的对照Lamp-2 KO小鼠没有表现出显著的LAMP-2蛋白表达。数据显示，在接受病毒载体的小鼠中，人类转基因表达的剂量依赖性增加(参见图6)。
实施例5 在载体给药后转基因LAMP-2B载体介导的亚细胞定位
来自接受2×1012gc/小鼠的AAV9.LAMP-2B或AAV.EGFP的递送1个月后处死的Lamp-2 KO小鼠的心脏切片用DAPI(结合至富AT DNA，从而使细胞核可见)和荧光标记抗LAMP-2抗体染色(参见图7)。LAMP-2染色的模式表明人类转基因的LAMP-2B蛋白定位于细胞内空泡，并且类似于在WT小鼠对小鼠Lamp-2蛋白的控制所见的染色。在接受AAV9.EGFP载体控制的Lamp-2 KO小鼠中没有观察到人LAMP-2染色。这些数据表明，用AAV9.LAMP-2B载体治疗导致人LAMP-2B蛋白在生理上合适的位置的表达。
在类似的实验中，在试验小鼠中在以5×1011gc/小鼠的剂量递送AAV9.LAMMP-2B2个月后维持人类LAMP-2染色。虽然与实施例4一致，但用这种较低的载体剂量观察到较少的染色。通过比较，递送5×1011gc/小鼠的AAV9.EGEP载体3个月后显示没有发现人LAMP-2染色。参见图8。
实施例6 CAG-RFP-EGFP-LC3B自噬报告系统
CAG-RFP-EGFP-LC3B自噬报告系统允许评估大自噬潮。微管相关蛋白1轻链3(LC3)在自噬体表面表达。构建基因融合表达融合到红色荧光蛋白(RFP)和eGFP的LC3。当该融合蛋白表达时，RFP组分在自噬体和溶酶体中均发荧光，而eGFP组分在自噬体中发荧光，但被溶酶体的酸性环境淬灭。因此，在合并的图像中，自噬体是黄色的，溶酶体是红色的(参见图9A)。当在WT背景下表达时，在单独的红色和绿色图像中看到比绿色点更多的红色点，而在合并的图像中看到红色和黄色点的混合(参见图9B-D’)。Lamp-2是自噬体与溶酶体正常融合形成自噬溶酶体所必需的。因此，当在Lamp-2 KO小鼠中表达该结构体时，在单独的红色和绿色图像中看到大致相等数量的红色和绿色点和在合并的图像中看到几乎全部黄色点(参见图9E-G′)。自噬体的积累和几乎没有自噬溶酶体，伴随着更多的自噬空泡(AVs)，反映了由于Lamp-2缺乏导致的自噬潮的缺陷(参见图9H)。
实施例7 携带LAMP-2A或LAMP-2B恢复自噬潮的载体的施用
向表达CAG-RFP-EGFP-LC3B结构体的Lamp-2 KO小鼠(Lamp-2 KO/CAG-RPG-EGFP-LC3B报告小鼠)施用AAV9.LAMP-2B或AAV9.LAMP-2A，并与表达CAG-RFP-EGFP-LC3B自噬报告系统的Lamp-2 KO小鼠(CAG-RFP-EGFP-LC3B报告小鼠)进行比较。载体递送一个月后，处死小鼠，并通过评估自噬潮的荧光显微镜评估心脏切片。未经处理的Lamp-2 KO/报告小鼠继续显示几乎只有黄色自噬空泡，即自噬体(参见图10B和图9G’)。相反，接受基因治疗载体AAV9.LAMP-2B或AAV9.LAMP-2A的Lamp-2 KO/报告小鼠表现出许多红色自噬空泡，即自噬溶酶体，与对照WT报告小鼠的比例相似(参见图10A、C和D以及其中用箭头表示的示例性点)。AVs的定量表明，与WT小鼠相比，Lamp-2 KO小鼠的未成熟自噬体与成熟自噬溶酶体的比例相似(参见图10E)。因此，AAV9.LAMP-2B或AAV9.LAMP-2A的基因治疗恢复了正常的自噬体-溶酶体在Lamp-2 KO小鼠的心肌细胞中融合。
实施例9 通过电子显微镜的心肌细胞超微结构的恢复
用5×1011gc/小鼠的AAV9.LAMP-2B静脉注射Lamp-2 KO小鼠，并与年龄匹配的Lamp-2 KO小鼠和未经治疗的WT小鼠进行比较。载体递送一个月后，处死小鼠，并通过电子显微镜分析心脏切片。与WT(参见图11A，A′)相比，未经处理的Lamp-2 KO小鼠表现出AVs的积累和增加(参见图11B、B′、黄色箭头)和异常线粒体数目的增加(参见图11B，红色箭头)。相反，用AAV9.LAMP-2B处理的Lamp-2 KO小鼠的电子显微照片更接近于未经处理的WT小鼠的超微结构(见图11C，C′)。因此，用基因治疗载体治疗恢复心肌细胞的超微结构。
综上所述，这些实施例表明，基于腺相关病毒编码LAMP-2A和LAMP-2B亚型的基因治疗载体可以静脉给药，以成功地在心脏组织中实现转基因表达。此外，这种表达导致自噬潮和心肌细胞超微结构缺陷的逆转，缺陷也与Danon病相关。这些数据支持在治疗Danon病和其它与自噬潮缺陷相关的疾病中使用这种载体进行基因治疗。
在结束时，应当理解，尽管本说明书的各方面通过参照具体的实施方式而突出显示，但本领域的技术人员将容易理解，这些公开的实施方式仅说明本文所公开的主题的原则。因此，应该理解，所公开的主题决不限于本文所描述的特定方法、协议和/或试剂等。因此，在不偏离本说明书的精神的情况下，可以根据本文的教导对所公开的主题进行各种修改或改变或替代配置。最后，本文使用的术语仅用于描述特定的实施方式，并且不意欲限制本发明的范围，其仅由权利要求限定。因此，本发明不限于如精确所示和描述的那样。
本文描述了本发明的某些实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。当然，在阅读上述描述时，这些描述的实施方式的变化对本领域普通技术人员将变得明显。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这种变化，发明人打算在本发明中实践，而不是在此具体描述的。因此，本发明包括在适用法律允许的随附权利要求中记载的主题的所有修改和等效物。此外，在所有可能的变化中，上述实施方式的任何组合都包含在本发明中，除非此处另有说明或除非上下文明确地矛盾。
本发明的替代实施例、元素或步骤的组不应被解释为限制。每个组成员指和要求可单独地或与本文公开的其它组成员的任何组合。预期由于便利性和/或专利性的原因，一个或多个组成员可以被包括在组中或从组中删除。当任何这样的包含或删除发生时，该说明书被认为包含修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
除非另有说明，所有在本说明书和权利要求书中使用的表示特征、项目、数量、参数、属性、术语等的数字应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。如本文所使用的，术语“约”指的是特征、项目、数量、参数、属性或术语，使其包含所述特征、项目、数量、参数、属性或术语的值以上和以下的正负百分之十的范围。因此，除非相反地指出，在说明书和随附的权利要求书中提出的数值参数是可以变化的近似值。至少，并不是试图将等同原则的应用限制在权利要求的范围内，每个数字指示至少应根据报告的有效数字的数量和应用普通舍入技术来解释。尽管设置本发明的广泛范围的数值范围和数值是近似值，但在具体实施例中阐述的数值范围和数值尽可能精确地被报告。然而，任何数值范围或值固有地包含一定的误差，这些误差必然是由它们各自的测试测量中发现的标准偏差引起的。这里的数值范围的记载仅仅是作为一种单独地引用到落在范围内的每个单独的数值的速记法。除非这里另有说明，数值范围的每一个单独值都被纳入本说明书中，就好像本文单独记载一样。
在描述本发明的上下文中使用的术语“一”、“一个”、“这个”和类似的参照物(特别是在权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或由上下文明确矛盾。本文中所描述的所有方法可以以任何适当的顺序执行，除非本文另有说明，或除非由上下文清楚地矛盾。本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅仅是为了更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围提出限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为指示本发明的实践所必需的任何未要求的元素。
本文所公开的具体实施方式可以进一步限制在使用包含或基本上由……组成语言的权利要求。当在权利要求中使用时，无论是作为修改或提交的补充，“由……组成”的过渡属于排除了在权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。“基本上由……组成”的过渡术语将权利要求范围限制在指定的那些实质上不影响基本特征和新特性的材料或步骤上。如此要求的本发明的实施方式在这里被内在地或明确地描述和启用。
在本说明书中引用和标识的所有专利、专利出版物和其它出版物，都是单独和明确地将全部内容并入本文，以描述和公开，例如，在这些出版物中描述的组合物和方法可能与本发明有关。这些出版物仅在本申请的提交日期之前提供。这方面的任何东西都不应被解释为承认发明人没有权利通过事先发明或任何其它原因提前公开此类信息。关于这些文件内容的日期或陈述的所有陈述都基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

Claims (10)

1.一种基因治疗载体，其包含表达盒，所述表达盒包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的一种或多种亚型的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的基因治疗载体，其特征在于，所述载体为病毒载体；优选地，所述病毒载体来自选自由腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒和腺相关病毒(AAV)组成的组中的病毒；更优选地，所述载体来自腺相关病毒(AAV)血清型1-11或其任何亚组中的一种或多种；和/或，所述病毒载体被封装在阴离子脂质体中。
3.根据权利要求1所述的基因治疗载体，其特征在于，所述载体为非病毒载体；优选地，所述非病毒载体选自由裸DNA、阳离子脂质体复合物、阳离子聚合物复合物、阳离子脂质体聚合物复合物和外泌体组成的组。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的基因治疗载体，其特征在于，所述表达盒包含在5′至3′方向上可操作地连接的第一反向末端重复序列、增强子/启动子区域、编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸、包括多聚腺苷酸化信号的3′非翻译区和第二反向末端重复序列；优选地，所述启动子选自由巨细胞病毒(CMV)启动子和CAG启动子组成的组。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的基因治疗载体，其特征在于，所述多核苷酸包含DNA或cDNA。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的基因治疗载体，其特征在于，编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸包括一种或多种人LAMP-2亚型；优选地，编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸包括选自由LAMP-2A、LAMP-2B和LAMP-2C组成的组的一种或多种LAMP-2亚型。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的基因治疗载体，其特征在于，编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中的一种或多种具有至少约90％的序列一致性；优选地，编码一种或多种LAMP-2亚型的多核苷酸包括SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中的一种或多种。
8.一种预防、减轻、改善、减少、抑制、消除和/或逆转在有需要的受试者中的Danon病或另一种自噬障碍中的一种或多种症状的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1-7中任意一项所述的基因治疗载体；优选地，所述载体通过选自由静脉内、动脉内、心脏内、冠状动脉内、心肌内、肾内、尿道内、硬膜外和肌肉内组成的组的途径来施用；和/或，所述载体被多次施用；和/或，所述自噬障碍选自由终末期心力衰竭、心肌梗死、药物中毒、糖尿病、终末期肾衰竭和衰老组成的组。
9.一种预防、减轻、改善、减少、抑制、消除和/或逆转在有需要的受试者中的Danon病或另一种自噬障碍中的一种或多种症状的方法，其包括向受试者施用包含表达盒的腺相关病毒(AAV)载体，所述表达盒包含编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)的一种或多种亚型的多核苷酸；优选地，所述载体通过选自由静脉内、动脉内、心脏内、冠状动脉内、心肌内、肾内、尿道内、硬膜外和肌肉内组成的组的途径来施用；和/或，所述载体被多次施用；和/或，所述自噬障碍选自由终末期心力衰竭、心肌梗死、药物中毒、糖尿病、终末期肾衰竭和衰老组成的组。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述受试者是人；和/或，所述受试者表现Danon病或另一种自噬障碍的症状；和/或，所述受试者已被鉴定为具有减少的或不可检测的LAMP-2表达；和/或，所述受试者已被鉴定为具有突变的LAMP-2基因。
CN202211177638.3A 2016-01-19 2017-01-19 Danon病和其它自噬障碍的治疗方法 Pending CN116440292A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662280269P 2016-01-19 2016-01-19
US62/280,269 2016-01-19
CN201780017989.9A CN109069671B (zh) 2016-01-19 2017-01-19 Danon病和其它自噬障碍的治疗方法
PCT/US2017/014164 WO2017127565A1 (en) 2016-01-19 2017-01-19 Methods for the treatment of danon disease and other disorders of autophagy

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780017989.9A Division CN109069671B (zh) 2016-01-19 2017-01-19 Danon病和其它自噬障碍的治疗方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116440292A true CN116440292A (zh) 2023-07-18

Family

ID=59362835

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211177638.3A Pending CN116440292A (zh) 2016-01-19 2017-01-19 Danon病和其它自噬障碍的治疗方法
CN201780017989.9A Active CN109069671B (zh) 2016-01-19 2017-01-19 Danon病和其它自噬障碍的治疗方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780017989.9A Active CN109069671B (zh) 2016-01-19 2017-01-19 Danon病和其它自噬障碍的治疗方法

Country Status (14)

Country Link
US (2) US11065347B2 (zh)
EP (2) EP3405215B1 (zh)
JP (2) JP7219452B2 (zh)
KR (1) KR20180102172A (zh)
CN (2) CN116440292A (zh)
AU (1) AU2017209189B2 (zh)
BR (1) BR112018014633A2 (zh)
CA (1) CA3011731A1 (zh)
DK (1) DK3405215T3 (zh)
ES (1) ES2926977T3 (zh)
HU (1) HUE059752T2 (zh)
PL (1) PL3405215T3 (zh)
PT (1) PT3405215T (zh)
WO (1) WO2017127565A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3311830A1 (en) * 2012-02-14 2018-04-25 The Regents of The University of California Systemic delivery and regulated expression of paracrine genes for cardiovascular diseases and other conditions
AU2017209189B2 (en) 2016-01-19 2024-03-28 The Regents Of The University Of California Methods for the treatment of Danon disease and other disorders of autophagy
US20210260215A1 (en) * 2018-06-08 2021-08-26 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav cardiac gene therapy for cardiomyopathy
WO2020014523A1 (en) * 2018-07-12 2020-01-16 Rocket Pharmaceuticals, Ltd. Gene therapy vectors for treatment of danon disease
CN109880849B (zh) * 2019-01-03 2023-04-11 四川大学 靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物及其应用
US20220143215A1 (en) * 2019-02-12 2022-05-12 Spacecraft Seven, Llc Gene therapy vectors for treatment of danon disease
CN111500634B (zh) * 2020-05-12 2023-04-25 河南省眼科研究所 一种外泌体包裹aav载体、aav-靶基因载体及其制备方法和应用
JP2023535632A (ja) 2020-07-27 2023-08-18 アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー Ｄｎａ分子の組成物、その作製方法、及びその使用方法
AU2021320902A1 (en) 2020-08-07 2023-04-06 Spacecraft Seven, Llc Plakophilin-2 (PKP2) gene therapy using AAV vector
US20240033325A1 (en) * 2020-12-07 2024-02-01 Spacecraft Seven, Llc Treatment of danon disease
CN113637674B (zh) * 2021-08-16 2022-02-01 百世诺（北京）医疗科技有限公司 一种LAMP2突变基因及突变体、以及Danon病检测试剂盒

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
WO1992001070A1 (en) 1990-07-09 1992-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
WO1993003769A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTEMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
CA2156725A1 (en) 1993-02-22 1994-09-01 Warren S. Pear Production of high titer helper-free retroviruses by transient transfection
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US20020065236A1 (en) 1998-09-09 2002-05-30 Yew Nelson S. CpG reduced plasmids and viral vectors
WO2004048537A2 (en) 2002-11-25 2004-06-10 Exelixis, Inc. Lamps as modifiers of the p53 pathway and methods of use
US10265412B2 (en) * 2006-02-06 2019-04-23 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Enzyme replacement therapy for treating lysosomal storage diseases
US8324367B2 (en) * 2006-11-03 2012-12-04 Medtronic, Inc. Compositions and methods for making therapies delivered by viral vectors reversible for safety and allele-specificity
ES2635726T3 (es) * 2007-06-06 2017-10-04 Genzyme Corporation Terapia génica para enfermedades de almacenamiento lisosómico
EP2571530A4 (en) 2010-05-20 2014-03-05 Univ Rochester METHOD AND COMPOSITIONS FOR AUTOPHAGIA MODULATION
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
HUE041553T2 (hu) * 2012-07-11 2019-05-28 Sangamo Therapeutics Inc Lizoszomális tárolási betegségek (LSD) kezelése és génterápia
AU2013332061A1 (en) * 2012-10-17 2015-05-07 Fondazione Telethon Gene therapy for glycogen storage diseases
WO2014070659A1 (en) 2012-10-29 2014-05-08 The Regents Of The University Of California Composition of viral vectors in lecithin liposomes, preparation method and treatment methods
US9391875B2 (en) 2013-02-11 2016-07-12 Fujitsu Limited Resource oriented dependency graph for network configuration
AU2017209189B2 (en) 2016-01-19 2024-03-28 The Regents Of The University Of California Methods for the treatment of Danon disease and other disorders of autophagy

Also Published As

Publication number Publication date
US20190054190A1 (en) 2019-02-21
EP3405215A4 (en) 2019-08-28
US11065347B2 (en) 2021-07-20
CA3011731A1 (en) 2017-07-27
CN109069671B (zh) 2022-10-18
EP4119168A1 (en) 2023-01-18
HUE059752T2 (hu) 2022-12-28
DK3405215T3 (da) 2022-09-19
JP2019505588A (ja) 2019-02-28
KR20180102172A (ko) 2018-09-14
PL3405215T3 (pl) 2022-10-31
WO2017127565A1 (en) 2017-07-27
AU2017209189B2 (en) 2024-03-28
EP3405215B1 (en) 2022-06-15
PT3405215T (pt) 2022-09-20
JP7219452B2 (ja) 2023-02-08
US20210379201A1 (en) 2021-12-09
AU2017209189A1 (en) 2018-08-02
RU2018129975A (ru) 2020-02-20
RU2018129975A3 (zh) 2020-06-22
EP3405215A1 (en) 2018-11-28
JP2022188227A (ja) 2022-12-20
BR112018014633A2 (pt) 2019-10-01
CN109069671A (zh) 2018-12-21
ES2926977T3 (es) 2022-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210379201A1 (en) Methods for the treatment of danon disease and other disorders of autophagy
US10799566B2 (en) Modified factor IX, and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs, and tissues
EP4324845A2 (en) Methods and pharmaceutical composition for the treatment and the prevention of cardiomyopathy due to energy failure
US20220143215A1 (en) Gene therapy vectors for treatment of danon disease
WO2018209205A1 (en) Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
US11400167B2 (en) Gene therapy for the treatment of a retinal degeneration disease
AU2019265663A1 (en) AAV-compatible laminin-linker polymerization proteins
RU2777571C2 (ru) Способы лечения болезни данона и других нарушений аутофагии
CA3218631A1 (en) Vector system
WO2024069144A1 (en) Rna editing vector
CA3218689A1 (en) Compositions and methods for enhancing visual function
WO2024079661A1 (en) Atp7b gene therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40096493

Country of ref document: HK