ES2635726T3

ES2635726T3 - Terapia génica para enfermedades de almacenamiento lisosómico

Info

Publication number: ES2635726T3
Application number: ES08756596.6T
Authority: ES
Inventors: James Dodge; Seng H. Cheng
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2008-06-02
Publication date: 2017-10-04
Anticipated expiration: 2028-06-02
Also published as: HUE035779T2; CY1119295T1; WO2008154198A1; PL3252161T3; HRP20171165T1; IL252898B; US20100173979A1; EP2158322B1; US8796236B2; AR070000A1; SI2158322T1; DK2158322T3; IL266734B; EP2158322A4; IL202522A; IL252898A0; EP3252161A1; EP3252161B1; IL266734A; EP2158322A1

Abstract

Un vector de VAA recombinante que comprende un transgén que codifica para esfingomielinasa ácida para uso en un método para tratar la enfermedad de Niemann-Pick A o la enfermedad de Niemann-Pick B en un sujeto, en el que dicho vector de VAA recombinante es un vector de VAA5 y en el que el método comprende administrar el vector a al menos un ventrículo del cerebro del sujeto, de esta forma dicho transgén se expresa y el producto proteico expresado se suministra al sistema nervioso central y, opcionalmente, a los órganos viscerales.

Description

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Enfermedad de almacenamiento lisosómico: Enzima defectuosa

Enfermedad de Batten infantil tardía clásica* (CNL2): Tripeptidil peptidasa

Enfermedad de Batten juvenil* (CNL3): Proteína transmembranaria lisosómica

Batten, otras formas* (CNL4-CNL8): Múltiples productos génicos

Cistinosis: Transportador de cisteína

Farber: Ceramidasa ácida

Fucosidosis: .alfa.-L-fucosidasa ácida

Galactosidosialidosis: Proteína protectora/catepsina A

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Gaucher tipos 1, 2* y 3*: .beta.-Glucosidasa ácida

Gangliosidosis G.sub.M1*: .beta.-Galactosidasa ácida

Hunter*: Iduronato-2-sulfatasa

Hurler-Scheie*: alfa.-L-Iduronidasa

Krabbe*: Galactocerebrosidasa

alfa-Manosidosis*: .alfa.-Manosidasa ácida

beta-Manosidosis*: .beta.-Manosidasa ácida

Maroteaux-Lamy: Arilsulfatasa B

Leucodistrofia metacromática*: Arilsulfatasa A

Morquio A: N-Acetilgalactosamina-6-sulfato

Morquio B: .beta.-Galactosidasa ácida

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Mucolipidosis II/III*: N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa

Niemann-Pick A*, B: Esfingomielinasa ácida (Ema)

Niemann-Pick C*: NPC-1

Pompe* Ácido: .alfa.-glucosidasa

Sandhoff*: .beta.-hexosaminidasa B

Enfermedad de almacenamiento lisosómico: Enzima defectuosa

Sanfilippo A*: Heparán N-sulfatasa

Sanfilippo B*: .alfa.-N-Acetilglucosaminidasa

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Sanfilippo C*: Acetil-CoA: alfa.-glucosaminida

Sanfilippo D*: N-Acetilglucosamina-6-sulfato

Enfermedad de Schindler*: .alfa.-N-Acetilgalactosaminidasa

Schindler-Kanzaki.: Alfa.-N-Acetilgalactosaminidasa

Sialidosis: .alfa.-Neuramidasa

Sly*: .beta.-Glucuronidasa

Tay-Sachs*: .beta.-hexosaminidasa A

Wolman*: Lipasa ácida

*Afectación del SNC

El rasgo típico de la EAL es la acumulación anormal de metabolitos en los lisosomas que conduce a la formación de grandes cantidades de lisosomas distendidos en el pericarión. Uno de los principales desafíos en el tratamiento de EAL (a diferencia del tratamiento de una enzimopatía específica hepática) es la necesidad de revertir la patología del 5 almacenamiento lisosómico en múltiples tejidos separados. Algunas EAL se pueden tratar de forma eficaz mediante infusión intravenosa de la enzima faltante, lo que se conoce como terapia de reemplazo enzimático (TRE). Por ejemplo, los pacientes con Gaucher tipo 1 tienen solo una enfermedad visceral y responden de forma favorable a la TRE con glucocerebrosidasa recombinante (Cerezyme™, Genzyme Corp.). Sin embargo, los pacientes con una enfermedad metabólica que afecta al SNC (por ejemplo, la enfermedad de Gaucher tipo 2 o 3) responden de forma

10 parcial a la TRE intravenosa debido a que la barrera hematoencefálica (BHE) impide que la enzima de reemplazo ingrese al cerebro. Asimismo, los intentos de introducir una enzima de reemplazo en el cerebro mediante inyección directa se han visto limitados en parte debido a la citotoxicidad enzimática a concentraciones locales elevadas y a las tasas de difusión parenquimatosa limitadas en el cerebro (Partridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, 1991).

15 Una EAL ilustrativa es la enfermedad de Niemann-Pick tipo A (NPA). Según UniProtKB/Swiss-Prot entrada P17405, defectos en el gen SMPD1, ubicado en el cromosoma 11, (11p15.4-p15.1), son la causa de la enfermedad de Niemann-Pick tipo A (NPA), también denominada forma infantil clásica. La enfermedad de Niemann-Pick es un trastorno recesivo clínica y genéticamente heterogéneo. Su causa es la acumulación en los lisosomas de esfingomielina y otros lípidos metabólicamente relacionados, que resulta en neurodegeneración que se inicia en los

20 primeros años de vida. Los pacientes pueden presentar xantomas, pigmentación, hepatoesplenomegalia, linfadenopatía y retardo mental. La enfermedad de Niemann-Pick aparece con más frecuencia en individuos con ascendencia judía Ashkenazi que en la población general. La NPA se caracteriza por un inicio muy temprano en la lactancia y por una evolución progresiva rápida que conduce a la muerte en tres años. La enzima esfingomielinasa ácida (EMa) convierte la esfingomielina en ceramida. La EMa también posee actividades de fosfolipasa C en

25 relación con 1,2-diacilglicerolfosfocolina y 1,2-diacilglicerolfosfoglicerol. La enzima convierte Esfingomielina + H2O → N-acilesfingosina + colina fosfato.

Las enfermedades de almacenamiento lisosómico se pueden tratar utilizando suministro intraventricular de la enzima etiológicamente deficiente en la enfermedad. La administración se puede llevar a cabo lentamente para lograr el máximo efecto. Los efectos se observan en ambos lados de la barrera hematoencefálica, lo que lo convierte en un

30 medio de suministro útil para enfermedades de almacenamiento lisosómico que afectan al cerebro y/u órganos viscerales. Por ejemplo,

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familiarizados con la preparación de vectores para terapia génica basados en VAA funcionales. Se pueden encontrar numerosas referencias a diversos métodos de producción de VAA, purificación y preparación para administración a sujeto humanos en el amplio conjunto de la literatura publicada (véase, p. ej., Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Además, la terapia génica basada en VAA orientada a células del SNC se ha descrito en las patentes estadounidenses nºs 6.180.613 y 6.503.888. Los ejemplos adicionales de vectores de VAA son los vectores de serotipo VAA2/1, VAA2/2, VAA2/5, VAA2/7 y VAA2/8 que codifican proteína humana.

En determinados métodos de la descripción, el vector comprende un transgén enlazado funcionalmente con un promotor. El transgén codifica para una molécula biológicamente activa, cuya expresión en el SNC resulta en al menos una corrección parcial de la patología de almacenamiento y/o estabilización de la evolución de la enfermedad. El transgén puede codificar para una o más de aspartilglucosaminidasa, alfa.-galactosidasa A, palmitoil proteína tioesterasa, tripeptidil peptidasa, proteína transmembranaria lisosómica, múltiples productos génicos, transportador de cisteína, ceramidasa ácida, .alfa.-L-fucosidasa ácida, proteína protectora/catepsina A, .beta.glucosidasa ácida, .beta.-galactosidasa ácida, iduronato-2-sulfatasa, alfa.-L-iduronidasa, galactocerebrosidasa, .alfa.-manosidasa ácida, .beta.-manosidasa ácida, arilsulfatasa B, arilsulfatasa A, N-acetilgalactosamina-6-sulfato, .beta.-galactosidasa ácida, N-acetilglucosamina-1-, esfingomielinasa ácida, NPC-1, .alfa.-glucosidasa, .beta.hexosaminidasa B, heparán N-sulfatasa, .alfa.-N-acetilglucosaminidasa, acetil-CoA: alfa.-glucosaminida, Nacetilglucosamina-6-sulfato, alfa.-N-Acetilgalactosaminidasa, alfa.-N-Acetilgalactosaminidasa, .alfa.-neuramidasa, .beta.-glucuronidasa, .beta.-hexosaminidasa A y lipasa ácida.

Una enzima particularmente útil para tratar la enfermedad de Niemann-Pick A o B es esfingomielinasa ácida (EMa), tal como la que se muestra en SEQ ID N.º: 1. (Los residuos 1-46 constituyen la secuencia señal que se escinde tras la secreción). Una enzima particularmente útil para tratar la enfermedad de Gaucher es glucocerebrosidasa. Una enzima particularmente útil para tratar la enfermedad MPS (siglas para «mucopolisacaridosis») I es alfa-Liduronidasa. Una enzima particularmente útil para tratar la enfermedad MPS II es iduronato-2-sulfatasa. Una enzima particularmente útil para tratar la enfermedad de Pompe o enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II (EAGII), también denominada deficiencia de maltasa ácida (DMA) es alfa-glucosidasa ácida. Una enzima particularmente útil para tratar la enfermedad de Batten infantil tardía clásica (CLN2) es tripeptidil peptidasa. Estas enzimas con frecuencia son formas recombinantes de las enzimas producidas utilizando métodos conocidos en la técnica. En una instancia, la enzima es una enzima humana recombinante.

Aunque se muestra una secuencia de aminoácidos específica en SEQ ID N.º: 1, también se pueden utilizar variantes normales en la población humana que conservan la actividad. Típicamente, estas variantes normales difieren en solo uno o dos residuos con respecto a la secuencia que se muestra en SEQ ID N.º: 1. Las variantes a utilizar deberían ser al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a la SEQ ID N.º: 1. Las variantes que se asocian con enfermedad o actividad reducida no se deberían utilizar. Típicamente, se suministrará la forma madura de la enzima. Esta comienza con el residuo 47 como se muestra en SEQ ID N.º: 1. De forma similar, las variantes normales en la población humana de dichas enzimas de EAL como glucocerebrosidasa, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, alfa-glucosidasa ácida y tripeptidil peptidasa que conservan la actividad enzimática se pueden utilizar también.

Las poblaciones tratadas mediante los métodos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, pacientes que padecen o están en riesgo de desarrollar un trastorno neurometabólico, p. ej., una EAL, tal como las enfermedades indicadas en la Tabla 1, particularmente, si dicha enfermedad afecta al SNC y órganos viscerales. En una instancia ilustrativa, la enfermedad es enfermedad de Niemann-Pick, tipo C, enfermedad de Gaucher, Mucopolisacaridosis (MPS), enfermedad de Pompe o enfermedad de Batten. Según la presente invención, el vector de VAA recombinante se utiliza para tratar la enfermedad de Niemann-Pick tipo A o B.

Un transgén que codifica para EMa u otra enzima hidrolasa lisosómica se puede incorporar en una composición farmacéutica útil para tratar, p. ej., inhibir, atenuar, prevenir o mejorar, una afección caracterizada por un nivel insuficiente de una actividad de hidrolasa lisosómica. La composición farmacéutica se administrará a un sujeto que padece una deficiencia de hidrolasa lisosómica o a alguien que está en riesgo de desarrollar dicha deficiencia. Las composiciones deberían contener una cantidad terapéutica o profiláctica del transgén que codifica para una EMa u otra enzima hidrolasa lisosómica en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéutico puede ser cualquier sustancia no tóxica compatible adecuada para suministrar los polipéptidos al paciente. Se puede utilizar agua esterilizada, alcohol, grasas y ceras como el vehículo. También se pueden incorporar adyuvantes farmacéuticamente aceptables, agentes tampón, agentes dispersantes y similares en las composiciones farmacéuticas. El vehículo se puede combinar con la EMa u otra enzima hidrolasa lisosómica en cualquier forma adecuada para administración mediante inyección o infusión intraventricular (también posiblemente intravenosa o intratecal) o de otra forma. Los vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, disolución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.) o disolución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés), otras disoluciones salinas, disoluciones de dextrosa, disoluciones de glicerol, emulsiones de agua y aceites tales como las preparadas con aceites de petrolíferos, animales, vegetales o de origen sintético (aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral o aceite de sésamo). Se puede utilizar LCR artificial como vehículo. El

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vehículo preferiblemente será estéril y libre de pirógenos. La concentración del transgén que codifica para EMa u otra enzima hidrolasa lisosómica en la composición farmacéutica puede variar ampliamente.

El suministro intracerebroventricular o intraventricular de un vector vírico recombinante se puede llevar a cabo en uno cualquier o más de los ventrículos cerebrales que están llenos de líquido cefalorraquídeo (LCR). El LCR es un fluido transparente que llena los ventrículos, está presente en el espacio subaracnoideo y rodea al cerebro y a la médula espinal. El LCR se produce mediante los plexos coroides y a través de la excreción o transmisión de fluido tisular por parte del cerebro hacia los ventrículos. El plexo coroide es una estructura que recubre la parte inferior del ventrículo lateral y la parte superior del tercer y cuarto ventrículo. Ciertos estudios han indicado que estas estructuras son capaces de producir 400-600 cm3 de fluido por día que corresponden a la cantidad para llenar los espacios del sistema nervioso central cuatro veces en un día. En adultos, se ha calculado que el volumen de este fluido es de 125 a 150 ml (4-5 oz). El LCF está en formación, circulación y absorción continuas. Ciertos estudios han indicado que se pueden producir aproximadamente 430 a 450 ml (casi 2 tazas) de LCR por día. Ciertos cálculos estiman que la producción es igual a aproximadamente 0,35 ml por minuto en adultos y 0,15 por minuto en lactantes. Los plexos coroides de los ventrículos laterales producen la mayor parte del LCR. Fluye a través de los forámenes de Monro hacia el tercer ventrículo donde se suma a lo producido por el tercer ventrículo y continúa a través del acueducto de Sylvius hacia el cuarto ventrículo. El cuarto ventrículo suma más LCR; a continuación, el fluido se desplaza por el espacio subaracnoideo a través de los forámenes de Magendie y Luschka. Después circula a través de la base del cerebro, por abajo alrededor de la médula espinal y hacia arriba sobre los hemisferios cerebrales.

Sin ánimo de limitarnos a ninguna teoría ni mecanismo de funcionamiento, la administración al SNC de un sujeto afectado de un vector vírico neurotrófico que lleva un transgén que codifica para un producto terapéutico permite transportar el vector vírico y/o producto expresado a través del LCR a lo largo del SNC y/o hacia los órganos viscerales. El LCR se vacía en la sangre a través de las vellosidades aracnoideas y los senos vasculares intracraneanos, de esta forma se suministran las enzimas y/o los transgenes a los órganos viscerales que se sabe que se ven afectados en EAL. Los órganos viscerales que con frecuencia se ven afectados en la enfermedad de Niemann-Pick enfermedad son, por ejemplo, los pulmones, bazo, riñón e hígado. La terapia génica proporciona cantidades reducidas de sustrato en al menos el cerebro y potencialmente en órganos viscerales. La reducción en el sustrato acumulado en el cerebro, pulmones, bazo, riñón e/o hígado puede ser drástica. Se pueden lograr reducciones superiores al 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %. La reducción lograda no es necesariamente uniforme de paciente a paciente ni incluso de órgano a órgano dentro de un único paciente.

Las enfermedades de almacenamiento lisosómico (EAL) incluye más de cuarenta trastornos genéricos, muchos de estos se relacionan con defectos genéticos en diversas hidrolasas lisosómicas. Las enfermedades de almacenamiento lisosómico representativas y las enzimas defectuosas asociadas se indican en la Tabla 1.

La enfermedad de Gaucher resulta como consecuencia de una deficiencia hereditaria de la hidrolasa lisosómica glucocerebrosidasa (GC) y conduce a la acumulación de su sustrato, glucosilceramida (GL-1), en los lisosomas de histiocitos. La acumulación progresiva de GL-1 en macrófagos tisulares (células de Gaucher) se produce en varios tejidos. La extensión de la acumulación depende en parte del genotipo. Clínicamente, se reconocen tres fenotipos de Gaucher diferentes, el tipo 1 no neuropático, que es el más común y se puede presentar desde la primera infancia hasta la adultez, y los tipos 2 y 3 neuropáticos, que se presentan en la lactancia y primera infancia, respectivamente. Las principales manifestaciones clínicas comunes a todas las formas de la enfermedad de Gaucher son hepatoesplenomegalia, citopenia, fracturas óseas patológicas y, ocasionalmente, insuficiencia pulmonar. Se puede encontrar una descripción detallada de la enfermedad de Gaucher en Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases, Parte 16, Capítulo 146 y 146.1 (2007). En pacientes con enfermedad de Gaucher tipo 2 y tipo 3 que presentan una afectación del sistema nervioso central significativa, el suministro intraventricular de la enzima de EAL defectuosa conduce a un estado metabólico mejorado del cerebro y posiblemente los órganos viscerales (fuera del SNC) afectados. El suministro intraventricular de la enzima de EAL defectuosa en sujeto con enfermedad de Gaucher tipo 1 conduce a un estado metabólico mejorado de los órganos viscerales (fuera del SNC) afectados. Existen modelos animales de la enfermedad de Gaucher que se derivaron de modelos de ratón creados mediante la alteración orientada del gen de ratón correspondiente. Por ejemplo, existe el modelo de ratón de Gaucher que aloja la mutación D409V en el locus de GC de ratón (Xu, Y-H et al. (2003). Am. J. Pathol. 163:2093-2101). El ratón heterocigótico, gbaD409V/completa, exhibe □5 % de la actividad de GC normal en tejidos viscerales y desarrolla macrófagos (células de Gaucher) llenos de lípidos en el hígado, bazo, pulmón y médula ósea a los 4 meses de edad. Otros ejemplos de modelos de ratón de la Enfermedad de Gaucher son los modelos de enfermedad de Gaucher neuronopática aguda desarrollados por Enquist et al. 2007 PNAS 104(44): 17483-17488. Estos ratones exhiben una gran similitud, tanto en signos anatomopatológicos como en manifestaciones clínicas, con pacientes humanos con enfermedad de Gaucher neuronopática grave. Por consiguiente, todos los modelos descritos anteriormente son sistemas adecuados para evaluar los beneficios del suministro intraventricular de un vector neurotrófico vírico que codifica para la enzima de EAL defectuosa en sujetos con enfermedad de Gaucher.

La enfermedad de Niemann-Pick (ENP) es una enfermedad de almacenamiento lisosómico y es un trastorno neurometabólico hereditario que se caracteriza por una deficiencia genética de esfingomielinasa ácida (EMa; esfingomielina colinafosfohidrolasa, EC 3.1.3.12). La falta de proteína EMa funcional resulta en la acumulación de

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sustrato esfingomielina dentro de los lisosomas de neuronas y glía en todo el cerebro. Esto conduce a la formación de grandes cantidades de lisosomas distendidos en el pericarión, que son un rasgo característico y el principal fenotipo celular de la ENP tipo A. La presencia de lisosomas distendidos se correlaciona con la pérdida de la función celular normal y una evolución neurodegenerativa progresiva que conduce a la muerte del individuo afectado en la primera infancia (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases, eds. Scriver et al., McGraw-Hill, Nueva York, 2001, págs. 3589-3610). Los fenotipos celulares secundarios (p. ej., alteraciones metabólicas secundarias) también se asocia con esta enfermedad, en especial el nivel elevado de acumulación de colesterol en el compartimento lisosómico. La efingomielina tiene una gran afinidad por el colesterol, que resulta en el secuestro de grandes cantidades de colesterol en los lisosomas de ratones aSMKO y pacientes humanos (Leventhal et al. (2001)

J. Biol. Chem., 276:44976-44983; Slotte (1997) Subcell. Biochem., 28:277-293; y Viana et al. (1990) J. Med. Genet., 27:499-504.) Se puede encontrar una descripción detallada de la enfermedad ENP en Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases, Parte 16, Capítulo 144 (2007). Existen modelos animales de ENP. Por ejemplo, los ratones aSMKO son un modelo aceptado de los tipos A y B de la enfermedad de Niemann-Pick (Horinouchi et al. (1995) Nat. Genetics, 10:288-293; Jin et al. (2002) J. Clin. Invest., 109:1183-1191; y Otterbach (1995) Cell, 81:10531061). El suministro intraventricular de un transgén que codifica para la enzima de EAL defectuosa conduce a un estado metabólico mejorado del cerebro y de los órganos viscerales (fuera del SNC) afectados.

Las mucopolisacaridosis (MPS) son un grupo de trastornos de almacenamiento lisosómico provocados por la deficiencia de enzimas que catalizan la degradación de glucosaminoglucanos (mucopolisacáridos). Existen 11 deficiencias enzimáticas conocidas que provocan 7 MPS distintas, incluidas MPS I (Síndromes de Hurler, Scheie y Hurler-Scheie) y MPS II (Síndrome de Hunter). Se puede encontrar una descripción detallada de MPS en Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases, Parte 16, Capítulo 136 (2007). Existen varios modelos animales de MPS que se derivaron de modelos de mutaciones de origen natural en perros, gatos, ratas, ratones y cabras, así como también modelos de ratón creados mediante la alteración orientada del gen de ratón correspondiente. Los rasgos bioquímicos y metabólicos de estos modelos animales en general son bastante similares a los que se encuentran en humanos; sin embargo, las presentaciones clínicas pueden ser más leves. Por ejemplo, los modelos aceptados para MPS I incluye un modelo murino [Clark, LA et al., Hum. Mol. Genet. (1997), 6:503] y un modelo canino [Menon, KP et al., Genomics (1992), 14:763. Por ejemplo, los modelos aceptados para MPS II incluye un modelo de ratón [Muenzer, J. et al., (2002), Acta Paediatr. Suppl.;91(439):98-9]. En la MPS que tiene afectación del sistema nervioso central, tal como la que se encuentra en pacientes con MPS I y MPS II, el suministro intraventricular de un transgén que codifica para la enzima de EAL defectuosa conduce a un estado metabólico mejorado del cerebro y posiblemente de los órganos viscerales (fuera del SNC) afectados.

La enfermedad de Pompe o enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II (EAGII), también denominada deficiencia de maltasa ácida (DMA), es un trastorno hereditario del metabolismo del glucógeno que resulta de defectos en la actividad de la hidrolasa lisosómica alfa-glucosidasa ácida en todos los tejidos de los individuos afectados. La deficiencia enzimática resulta en acumulación intralisosómica de glucógeno de estructura normal en numerosos tejidos. La acumulación se produce con mayor intensidad en el músculo cardíaco y esquelético y en tejidos hepáticos de lactantes con el trastorno generalizado. En EAGII de inicio tardío, la acumulación intralisosómica de glucógeno prácticamente se limita al músculo esquelético y es de menor magnitud. Las alteraciones electromiográficas que sugieren el diagnóstico incluyen descargas seudomiotónicas e irritabilidad, pero en pacientes con inicio juvenil y adulto las alteraciones pueden variar en diferentes músculos. Las tomografías axiales computarizadas pueden revelar el o los sitios de músculos afectados. La mayoría de los pacientes presenta niveles elevados de creatina cinasa (CK) en el plasma sanguíneo y se pueden encontrar elevaciones en las enzimas hepáticas, particularmente en paciente con inicio en la edad adulta. Existen varios modelos animales de origen natural de la enfermedad con inicio en la lactancia y tardío. Existe un modelo de ratón con genes inactivados [Bijvoet AG et al., Hum. Mol. Genet. (1998); 7:53-62.]. Los efectos de mejora de la terapia enzimática se han descrito en ratones con genes inactivados [Raben, N et al., Mol. Genet. Metab. (2003); 80:159-69] y en un modelo de codorniz. El suministro intraventricular de un transgén que codifica para la enzima de EAL defectuosa conduce a un estado metabólico mejorado del cerebro y posiblemente de los órganos viscerales (fuera del SNC) afectados.

Las lipofuscinosis ceroides neuronales (LCN) son un grupo de trastornos neurodegenerativos que se diferencian de otros trastornos neurodegenerativos por la acumulación de material autofluorescente («pigmento de la edad avanzada») en el cerebro y otros tejidos. Los principales rasgos clínicos incluyen convulsiones, deterioro psicomotor, ceguera y muerte prematura. Se han reconocido distintos subgrupos de LCN que difieren en la edad de inicio de los síntomas y la aparición del material de almacenamiento mediante microscopía de electrones. Tres grupos principales -infantil (LCNI), infantil tardío clásico (LCNIT) y juvenil (LCNJ, también denominado enfermedad de Batten) son causados por mutaciones autosómicas recesivas en los genes CLN1, CLN2 y CLN3, respectivamente. Los productos proteicos de los genes CLN1 (palmitoil-proteína tioesterasa) y CLN2 (tripeptidil peptidasa o pepinasa) son enzimas lisosómicas solubles, mientras que la proteína de CLN3 (battenina) es una proteína membranaria lisosómica, como lo es (provisoriamente) la proteína de CLN5. La identificación de mutaciones en genes que codifican para proteínas lisosómicas en varias formas de LCN condujo al reconocimiento de las lipofuscinosis como verdaderos trastornos de almacenamiento lisosómico. Se puede encontrar una descripción detallada de la enfermedad LCN en Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases, Parte 16, Capítulo 154 (2007). Se han descritos trastornos LCN de origen natural en ovejas, perros y se han derivado modelos de ratón mediante

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alteración orientada de un gen de ratón correspondiente [véase, p. ej., Katz, ML et al., J. Neurosci. Res. (1999); 57:551-6; Cho, SK et al., Glycobiology (2005); 15:637-48.] El suministro intraventricular de un transgén que codifica para la enzima de EAL defectuosa conduce a un estado metabólico mejorado del cerebro y posiblemente de los órganos viscerales (fuera del SNC) afectados.

Una descripción detallada de trastornos de almacenamiento lisosómico adicionales descritos en la Tabla 1, en los que el suministro intraventricular de la enzima EAL defectuosa en la enfermedad, se puede encontrar en Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases, Parte 16 (2007).

El nivel de expresión transgénica en células eucariontes se determina en gran medida mediante el promotor transcripcional dentro del casete de expresión transgénica. Los promotores que exhiben actividad a largo plazo y que son específicos para el tejido e incluso específicos para la célula se usan en algunas realizaciones. Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen, pero no se limitan a, el promotor del citomegalovirus (CMV) (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet. 8:148-154), el promotor de CMV/β3-globina humana (Mandel et al. (1998) J. Neurosci. 18:4271-4284), el promotor GFAP (Xu et al. (2001) Gene Ther. 8:1323-1332), el promotor de enolasa específico para neuronas (NSE) de 1,8 kb (Klein et al. (1998) Exp. Neurol. 150:183-194), el promotor de beta actina de pollo (CBA) (Miyazaki (1989) Gene 79:269-277), el promotor de β-glucuronidasa (GUSB) (Shipley et al. (1991) Genetics 10:1009-1018), y promotores de ubiquitina tales como los aislados a partir de ubiquitina A humana, ubiquitina B humana y ubiquitina C humana según se describen en la patente estadounidense n.º 6.667.174. Para prolongar la expresión, además se pueden enlazar funcionalmente otros elementos reguladores con el transgén, tales como, p. ej., el elemento posregulador del virus de la hepatitis de Woodchuck (WPRE, por sus siglas en inglés) (Donello et al. (1998) J. Virol. 72:5085-5092) o el sitio de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (HCB).

Para algunas aplicaciones de terapia génica en el SNC, puede ser necesario controlar la actividad transcripcional. Con este fin, se pueden obtener la regulación farmacológica de la expresión génica con vectores víricos mediante la inclusión de diversos elementos reguladores y promotores sensibles a fármaco como se describen, por ejemplo, en Haberman et al. (1998) Gene Ther. 5:1604-16011; y Ye et al. (1995) Science 283:88-91.

En determinadas realizaciones, la concentración o título del vector en la composición es de al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o 50 (×1012 pg/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o 50 (×109 ut/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25

o 50 (×1010 ui/ml).

En un aspecto, el transgén codifica para una molécula biológicamente activa, cuya expresión en el SNC resulta en al menos una corrección parcial de la patología de almacenamiento y/o estabilización de la evolución de la enfermedad. El producto transgénico terapéutico es una proteína EMa que puede aliviar y/o prevenir los síntomas de Niemann-Pick A y B. Véanse Roaul et al. (2005) Nat. Med. 11(4):423-428 y Ralph et al. (2005) Nat. Med. 11(4):429

433. En otras instancias de la presente descripción, los transgenes que codifican para las enzimas defectuosas en otras EAL se suministran, según sea apropiado para el paciente específico.

En un aspecto, cuando se llevan a cabo los métodos de la presente descripción, el transgén expresa una cantidad terapéutica de una enzima seleccionada del grupo que consiste en aspartilglucosaminidasa, alfa.-galactosidasa A, palmitoil proteína tioesterasa, tripeptidil peptidasa, proteína transmembranaria lisosómica, múltiples productos génicos, transportador de cisteína, ceramidasa ácida, .alfa.-L-fucosidasa ácida, proteína protectora/catepsina A, .beta.-glucosidasa ácida o .beta.-galactosidasa ácida, iduronato-2-sulfatasa, alfa.-L-iduronidasa, galactocerebrosidasa, .alfa.-manosidasa ácida, .beta.-manosidasa ácida, arilsulfatasa B, arilsulfatasa A, Nacetilgalactosamina-6-sulfato, .beta.-galactosidasa ácida, N-acetilglucosamina-1-, esfingomielinasa ácida, NPC-1, .alfa.-glucosidasa, .beta.-hexosaminidasa B, heparán N-sulfatasa, .alfa.-N-acetilglucosaminidasa, acetil-CoA: alfa.glucosaminida, N-acetilglucosamina-6-sulfato, alfa.-N-Acetilgalactosaminidasa, alfa.-N-Acetilgalactosaminidasa, .alfa.-neuramidasa, .beta.-glucuronidasa, .beta.-hexosaminidasa A y lipasa ácida.

Para la identificación de las estructuras del cerebro humano, véase, p. ej., The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply, 2ª ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997; y Co-Planar Stereotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medical Pub., 1988. Para la identificación de las estructuras del cerebro de ratón, véase, p. ej., The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 2ª ed., Academic Press, 2000.

Para suministrar la disolución u otra composición que contiene el vector vírico específicamente a una región específica del sistema nervioso central, tal como un ventrículo específico, p. ej., a los ventrículos laterales o al cuarto ventrículo del cerebro, se puede administrar mediante microinyección estereotáxica. Por ejemplo, el día de la cirugía, se colocará la base del marco estereotáxico a los pacientes (atornillada al cráneo). Se obtendrán imágenes del cerebro con la base del marco estereotáxico (compatible con MRI con marcas fiduciarias) utilizando resonancia magnética nuclear de alta resolución MRI. Las imágenes de MRI después se transferirán a una computadora que ejecuta el programa informático estereotáxico. Se utilizará una serie de imágenes coronales, sagitales y axiales para determinar el sitio diana de la inyección del vector y la trayectoria. El programa informático traduce directamente la trayectoria a coordenadas tridimensionales adecuadas para el marco estereotáxico. Se perforarán agujeros de

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Los siguientes ejemplos respaldan la presente invención. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden llevar a cabo numerosas modificaciones y variaciones sin alterar el espíritu ni alcance de la descripción.

Los ejemplos no limitan la invención de ningún modo.

Ejemplos

Titulación de vectores recombinantes

Se miden los títulos de vector de VAA según la cantidad de copias de genoma (partículas de genoma por mililitro). Las concentraciones de partículas de genoma se basan en la PCR Taqman® del ADN del vector informada con anterioridad (Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278).

Los vectores que llevan un gen marcador que se puede someter a ensayo tal como β-galactosidasa (Lac Z) o gen de proteína verde fluorescente (PVF) se pueden someter a titulación utilizando un ensayo de infectividad. Se transducen células susceptibles (p. ej., células HeLa o COS) con el VAA y se lleva a cabo un ensayo para determinar la expresión génica tal como la tinción de células transducidas con vector β-galactosidasa con X-gal (5bromo-4cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) o microscopía fluorescente para las células transducidas con PVF. Por ejemplo, el ensayo se lleva a cabo de la siguiente forma: se colocan 4 ×104 de células HeLa en pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos utilizando medios de cultivo normales. Después del acoplamiento, es decir, alrededor de 24 horas después, las células se infectan con Ad tipo 5 a una multiplicidad de infección (MDI) de 10 y se transducen con diluciones en serie del vector empaquetado e incubado a 37 °C. De uno a tres días después, antes de que se observen efectos citopáticos extensos, se lleva a cabo un ensayo adecuado con las células (p. ej., tinción con X-gal o microscopía fluorescente). Si se utiliza un gen reportero tal como β-galactosidasa, las células se fijan en paraformaldehído al 2 %, glutaraldehído al 0,5 % y se tiñen para determinar la actividad de β-galactosidasa utilizando X-gal. Se cuentan las diluciones de vector que proporcionan células bien separadas. Cada célula positiva representa 1 unidad de transducción (ut) de vector.

Modelo animal

Los ratones ASMKO son un modelo aceptado de los tipos A y B de la enfermedad de Niemann-Pick (Horinouchi et al. (1995) Nat. Genetics, 10:288-293; Jin et al. (2002) J. Clin. Invest., 109:1183-1191; y Otterbach (1995) Cell, 81:1053-1061). La enfermedad de Niemann-Pick (ENP) se clasifica como una enfermedad de almacenamiento lisosómico y es un trastorno neurometabólico hereditario que se caracteriza por una deficiencia genética de esfingomielinasa ácida (EMa; esfingomielina colinafosfohidrolasa, EC 3.1.3.12). La falta de proteína EMA funcional resulta en la acumulación de sustrato esfingomielina dentro de los lisosomas de neuronas y glía en todo el cerebro. Esto conduce a la formación de grandes cantidades de lisosomas distendidos en el pericarión, que son un rasgo característico y el principal fenotipo celular de la ENP tipo A. La presencia de lisosomas distendidos se correlaciona con la pérdida de la función celular normal y una evolución neurodegenerativa progresiva que conduce a la muerte del individuo afectado en la primera infancia (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases, eds. Scriver et al., McGraw-Hill, Nueva York, 2001, págs. 3589-3610). Los fenotipos celulares secundarios (p. ej., alteraciones metabólicas secundarias) también se asocian con esta enfermedad, en especial el nivel elevado de acumulación de colesterol en el compartimento lisosómico. La efingomielina tiene una gran afinidad por el colesterol, que resulta en el secuestro de grandes cantidades de colesterol en los lisosomas de ratones ASMKO y pacientes humanos (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983; Slotte (1997) Subcell. Biochem., 28:277-293; y Viana et al. (1990) J. Med. Genet., 27:499-504.) Otros modelos para otras EAL se describieron anteriormente y se pueden utilizar según sea adecuado.

La visualización de la expresión de la proteína verde fluorescente (PVF) en ratones que se trataron con VAA4-PVF indicó que la PVF se distribuyó por toda la capa de ependimocitos del sistema ventricular. Por ejemplo, se visualizó la PVF en los ventrículos laterales anteriores, los ventrículos laterales, el tercer ventrículo y el cuarto ventrículo (figura 1). También se visualizó la PVF en el plexo coroide del sistema ventricular y la capa de ependimocitos del canal central de la médula espinal (incluidas las regiones cervicales, torácicas y lumbares) (figura 2).

Inyección intracerebroventricular de VAA recombinante que codifica para glucocerebrosidasa en un modelo de ratón neuronopático de enfermedad de Gaucher

Existen modelos animales de la enfermedad de Gaucher que se derivan mediante la alteración orientada del gen de ratón correspondiente. Por ejemplo, hay modelos de enfermedad de Gaucher neuronopática aguda desarrollados por Enquist et al. 2007 PNAS 104(44): 17483-17488. Estos ratones exhiben una gran similitud, tanto en signos anatomopatológicos como en manifestaciones clínicas, con pacientes humanos con enfermedad de Gaucher neuronopática grave. Se llevó a cabo un experimento en uno de los dos modelos, el K14-lnl/lnl (también denominado en la presente ratón «K2»). El modelo K2 es la forma más grave de los modelos descritos por Enquist et al. ya que el ratón manifiesta una evolución clínica y patológica de los síntomas más rápida.

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reivindicaciones, se encuentran modificadas en todos los casos por la expresión «alrededor de». Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos presentados son aproximaciones y que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener en la presente invención. A menos que se indique lo contrario, se entenderá que la expresión «al menos» antes de una serie de elementos hace referencia a cada elemento en la serie. Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar, utilizando no más que los experimentos de rutina, muchos equivalentes de realización específicas de la invención descrita en la presente memoria.

Referencias

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Claims

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