DE69433823T2

DE69433823T2 - Interferon gene aus voegeln und rekombinante dna

Info

Publication number: DE69433823T2
Application number: DE69433823T
Authority: DE
Inventors: Margaret J. Sekellick; Philip I. Marcus; Anthony F. Ferrandino
Original assignee: University of Connecticut
Current assignee: University of Connecticut
Priority date: 1993-10-22
Filing date: 1994-10-21
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2014-10-22
Also published as: US5885567A; EP0724638A1; CA2174621A1; AU8077194A; EP0724638B1; WO1995011302A1; AU684849B2; ATE268383T1; DE69433823D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Säugetier-Interferone sind wertvolle Proteine, die zum Schutz vor und zur Behandlung bei viralen und anderen Erkrankungen von Tieren und Menschen aufgrund der unzähligen unterschiedlichen Wirkungen des Interferons verwendbar sind (IFN). Marcus, Encyclopedia of Virology, 2:733–739 (1994); Krown et al.., Encyclopedia of Virology, 2:739–745 (1994). Die „Food and Drug Administration" (FDA; Lebens- und Arzneimittelamt der USA) hat verschiedene Verwendungen des humanen IFN zugelassen. Vergleichsstudien mit Hühnern und anderen Vogelarten waren bisher wegen der Verfügbarkeit von IFN aus Huhn und Vögeln nur begrenzt möglich. Die Induktion von Geflügelinterferon durch einen Virus war bei primären Hühnerembryozellen, die in vitro „gealtert" waren, erfolgreich, mit Ausbeuten von mehr als 100.000 Einheiten IFN / 10⁷ Zellen (Sekellick und Marcus, Methods in Enzymologya, 119:115–125 (1986)), und vom Interferon aus Huhn (ChIFN) wurde gezeigt, dass es Hühnerzellen-spezifisch gegen die tödliche Wirkung verschiedener Viren schützt (Marcus und Sekellick, Viralogy, 69:378–393 (1976); Marcus et al.., Journal of General Virology, 64: 2419–1431 (1983); Portnoy und Marigan, Journal of Infectious Diseases, 124:545–552 (1971); Vengris und Mare, Avian Diseases, 17:755–767 (1973)).
Virale Erkrankungen stellen eine fortlaufende Bedrohung der Geflügelindustrie dar. Beispielsweise wird in dem „Foreign Animal Disease Report", USDA, 1994, berichtet, dass 1984/1984 der Ausbruch des hochpathogenen H5N2 Vogelgrippevirus in Pennsylvania, Maryland, New Jersey und Virginia zum Tod von 17 Millionen Vögeln führte. Ein weniger pathogener Stamm wurde 1993 auf einer Wildfarm in Maryland isoliert. Die Infektion führte zur Entvölkerung der Herde. Einige wichtige parasitische Erkrankungen von Hühnern, wie die durch Eimeria verursachte könnten durch Interferon über dessen Wirkungen auf das Immunsystem kontrollierbar sein. Interferon gewinnt wachsende Aufmerksamkeit als antiparasitisches Mittel, (Murray, Jornal Interferon Research, 12:319–322 (1992)).
Wie viel Interferon durch einen bestimmten Virus induziert wird, wird durch viele Faktoren beeinflusst. Diese Faktoren umfassen die Herkunft und Passagenhistorie des Virus, die Wirtszelle, die Inkubationsbedingungen, die Zeit und die Multiplizität der Infektion. Stewart, „The Interferon System", zweite Ausgabe, Wien: Springer-Verlag, pp 27–57; Marcus, Sekellick und Nichol, Journal of Interferon Research, 12:297–305 (1992).
Das Journal of Interferon Research, 5:209–214 (1985), Krempien U et al., beschreibt eine verbesserte Reinigungsmethode für Huhn-Interferon aus der Allantoisflüssigkeit von bebrüteten Hühnereiern. Durch Perchlorsäurebehandlung, Zinkacetatfällung und Chromatographie auf SP-Sephadex C-25 vorgereinigtes Interferon wurde weiter angereichert durch Säulenchromatographie auf Zinkchelat. Die Analyse mit Hilfe der Elektrophorese der Interferonpräparation mit einer spezifischen Aktivität von 8 × 10⁵ Einheiten / mg Protein im Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel zeigte, dass die antivirale Hauptaktivität in einer breiten Bande im Bereich eines Molekulargewichts von 20 – 29 kD wanderte. In diesem Molekulargewichtsbereich waren verschiedene Proteinbanden mit Coomassie blue und Silbernitrat anfärbbar. Zwischen 80 bis 95% des Gesamtproteins, welches auf das Gel geladen wurde, konnte von den Interferonenthaltenden Fraktionen durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese getrennt werden.
In J gen Virol (1986), 67, 215–218, beschreiben Kohase M et al., dass in UV-bestrahlten Newcastle-disease-Virus stimulierten primären Hühnerembryozellen (CE) produziertes Huhn-Interferon (IFN) teilweise über eine Zweistufenchromatographie unter Verwendung von Controlled-Pore-Glass und blauer Sepharose gereinigt wurde. Die spezifische Aktivität des IFN stieg bei diesem Verfahren um das 500fache an, und die Gesamtausbeute aus dem Ausgangsmaterial war größer als 95%. Das teilweise gereinigte IFN wurde über SDS-Page analysiert und es wurden zwei Gipfel IFN-Aktivität gefunden. Das durch den scharfen Gipfel repräsentierte Molekulargewicht wurde auf 18.000 (18K) bestimmt und ein breiter Gipfel wurde bei 20K bis 30K gefunden. Eine Glykosidase-Behandlung vor der SDS-Page bewirkte ein Verschwinden des breiten Gipfels und erhöhte die Aktivität des 18K Gipfels. Anti-CE IFN Kaninchenserum und ein monoklonaler Antikörper gegen das CE IFN hob die antivirale Aktivität aller IFN-Proben, die unter verschiedenen Bedingungen hergestellt wurden, auf.
Zusammenfassung der Erfindung
Unter einem Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein isoliertes Gen, welches für Huhn-Interferon mit der Nukleotidsequenz aus SEQ ID NO 1 und für die Aminosäuresequenz aus SEQ ID No 1 kodiert.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine DNA-Sequenz, welche aus einer isolierten Huhn-Interferon-DNA besteht, wobei die isolierte Huhn-Interferon-DNA aus einer DNA-Sequenz aus SEQ ID NO 1 besteht.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Huhn-Interferon, welches

a) das Kultivieren einer Wirtszelle, die fähig ist, Huhn-Interferon zu produzieren, wobei die Zelle eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2 enthält; und
b) die Isolierung des Interferons aus Huhn, wobei bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens in Anspruch 4 beschrieben sind,

Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung die Verwendung des isolierten Gens nach Anspruch 1 oder der DNA-Sequenz nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von oder zur Vorbeugung vor viralen und / oder parasitischen Infektionen in Geflügel. Bevorzugte Ausgestaltung dieser Verwendung sind in Anspruch 6 beschrieben.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung transgenes Geflügel nach Anspruch 7. Bevorzugte Eigenschaften des transgenen Geflügels sind in Anspruch 8 definiert.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines transgenen Geflügels nach Anspruch 9. Bevorzugte Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 10 und 12 beschrieben.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines transgenen Geflügels wie in Anspruch 11 beschrieben.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Huhn-Interferon cDNA-Sonde wie in Anspruch 13 beschrieben.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Plasmid nach Anspruch 14.
Die Erfindung betrifft isolierte Gene und rekombinante DNA, die für Nicht-Säugetier-Interferon kodieren, Verfahren zu deren Herstellung und Isolierung, und deren Verwendung. Das isolierte Gen kodiert vorzugsweise für Vogel-, Fisch- oder Reptilien-Interferon. Bevorzugte Quellen des Interferons aus Vögeln umfassen Geflügel, wie bspw. Hühner, Strauße, Emus, Truthähne, Enten, Gänse, Enten und exotische Vögel wie Papageien, Kakadus, Lymphensittiche und andere kommerziell wertvolle Vögel, ohne hierauf begrenzt zu sein. Die Nukleotidsequenzen, die für Interferon kodieren, werden vorliegend beschrieben.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Interferon, welches die Kultivierung eines transformierten Mikroorganismus, welcher fähig ist, das rekombinante Interferon zu produzieren, wobei der besagte Mikroorganismus ein rekombinantes Interferongen trägt, wie z.B. die DNA-Sequenz aus SEQ ID NO: 1, (die für Huhn-Interferon kodiert, GenBank Accession NO. UO7868) und die Isolierung des Interferons umfasst. Die Aminosäuresequenz, die für das Signalprotein und das reife Huhn-IFN-Protein kodiert, wurde abgeleitet und wird vorliegend beschrieben (SEQ ID NO: 1). Es wurde gezeigt, dass das reife Huhn IFN Protein biologisch funktionell ist. Der verwendete transformierte Mikroorganismus kann irgendeine Wirtszelle oder Zelle sein, die fähig ist, rekombinante Proteine herzustellen. Vorzugsweise stammt die Wirtszelle aus einem Eukaryot, einer Säugerzellkultur oder einem Prokaryot, wobei Eukaryoten (z.B. Insektenzellen) oder Säugerzellkulturen (z.B. CHO-Zellen) besonders bevorzugt sind, um die Glykosylierung zu bewirken. Aktives Material wurde auch aus E. coli erhalten.
Vorliegend wird auch eine cDNA-Sonde beschrieben. Bspw. kann die Sonde die Nukleotidsequenz aus SEQ ID NO: 3 umfassen. Diese cDNA-Sonde kann auf Grund der entwicklungsgeschichtlichen Homologie ebenso wie die cDNA aus SEQ ID NO: 1, verwendet werden, um andere Nicht-Säugetier-Interferongene zu isolieren und zu identifizieren, wie bspw. aus anderen Vogelarten, Fischen oder Reptilien. Bspw. kann eine Sonde mindestens eine etwa 20 Basenpaare lange Sequenz aus der DNA-Sequenz aus SEQ ID NO: 1 umfassen, welche an das Komplementärenstrang der besagten Sequenz binden wird.
Die Erfindung betrifft ebenso ein Plasmid umfassend

a) eine DNA-Sequenz, welche für Nicht-Säugetier-Interferon kodiert, vorzugsweise Vogel-, Fisch- und Reptilien-Interferon, besonders bevorzugt Huhn-Interferon, und
b) einer mit der DNA-Sequenz operabel verbundenen Promotor sequenz, vorzugsweise einen Metallothioneinpromoter aus Huhn.

Die erfindungsgemäßen neuen Plasmidkonstrukte können zur Produktion von großen Mengen rekombinanten Interferons zur Verabreichung an Vögel und exotische Vögel um virale und / oder parasitische Infektion zu vermeiden, verwendet werden. Unter einem anderen Ausführungsbeispiel kann die Interferon-DNA durch genetische Stärkung, z.B. genetische Immunisierung eingeführt werden. Bei diesem Verfahren wird die DNA in die Haut des Vogels unter Verwendung eines in der Hand gehaltenen biolistischen Systems eingeführt (Sanford et al.., Technique, 3:3–16 (1992)) und dient als Template für die Herstellung von Interferon. Tang et al.., Nature, 356:152–154 (1992). Alternativ dazu können erfindungsgemäße DNA und die erfindungsgemäßen Konstrukte, welche die DNA umfassen, verwendet werden, um transgenes Geflügel herzustellen. Das transgene Geflügel würde ein Plasmid beherbergen, welches für die transiente Expression von Huhn-Interferon induzierbar wäre. Diese transiente Expression würde in einer Entwicklungsphase des Geflügels induziert werden, in der das Wachstum nicht behindert würde, aber ein Schutz gegen virale und / oder parasitische Infektionen bewirkt würde.
Die Erfindung betrifft weiterhin transgenes Geflügel, dessen Keimzellen und / oder somatischen Zellen, die rekombinante DNA, die ein isoliertes Vogelinterferon-DNA Molekül enthält, welches in einem embryonalen Stadium eingeführt wurde, enthalten, und ein Verfahren zur Herstellung dessen. Vorzugsweise ist die rekombinante DNA im wesentlichen endogen bezogen auf das transgene Geflügel, bspw. kodiert sie für Huhn-Interferon, wenn das transgene Geflügel ein transgenes Huhn ist. In einem Ausführungsbeispiel kann eine Promotor sequenz, welche heterolog zu dem Promotor aus Huhn ist, funktional mit der für Huhn-Interferon kodierenden DNA verbunden sein, um die Expression des Interferongens selektiv zu induzieren. Ein Beispiel für einen heterologen Promotor ist der Metallothioneinpromoter aus Huhn, der reguliert werden kann, indem dem Geflügel eine Metallionenquelle bereitgestellt wird. Über dieses Verfahren ist es möglich, virale und / oder parasitische Infektionen durch die Induktion der Transkription der DNA in dem transgenen Geflügel zu behandeln.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Die Zeichnung zeigt einen Graph, welcher das Verhältnis antiviraler Aktivität, die von L(Y)-Zellen aus 20 Stunden nach einer Lipofectin-vermittelten Transfektion von Hühnerembryozellen produziert wird, zu mRNA, die ausgehend von pCh132 DNA transkribiert wurde, zeigt. Die Aktivität wurde mit einem monoklonalen Antikörper gegen ChIFN komplett neutralisiert. Eine Präparation von Maus-IFN, die bei Maus L(Y)-Zellen mit 25.000 Einheiten/ml getestet wurde, zeigte bei Hühnerembryozellen keine antivirale Aktivität.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Vorliegend werden die erste DNA-Nukleotidsequenz, die für ein Nicht-Säugetier-Interferon, nämlich Hühnerinterferon kodiert, und die erste Sonde hierfür beschrieben. Die Nukleotidsequenz, die für das vollständige Huhn-Interferongen kodiert wird beschrieben und ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Die Sequenz ist 763 Nukleotid lang und umfasst ausgehend vom 5 Ende die folgenden Nukleotide: 54 Basen der 5'flankierenden Sequenz, 93 Basen, die für ein Signalprotein aus 31 Aminosäuren kodieren, 486 Basen, die für das reife Huhn-Interferonprotein kodieren, 3 Basen eines Stopcodons, 127 Basen umfassend die 3'flankierende Region und einen Poly(A)-Schwanz.
Die Sonde ist die erste DNA-Nukleotidsequenz, von der gezeigt werden konnte, dass sie spezifisch für Huhn-Interferon Boten-RNA (mRNA) ist. Ein spezielles System aus „gealterten" primären Huhnembryozellen (Sekellick und Marcus, Methods in Enzymologya, 119:115–125 (1985)) wurde zur Induktion der Boten-RNA für Huhn-Interferon verwendet. Die gezeigte Huhn-Interferonsonde zeigt mit bekannten Säugetier-Interferon α- und β-Spezies weniger als 25% Nukleotidsequenzidentität.
Es wurden auch Primer hergestellt, um einen Teil des Huhn-Interferongens zu fischen und zu synthetisieren. Unter Verwendung dieser Primer zur Amplifikation von Sequenzen aus der Boten-RNA, welche aus den „gealterten" primären Huhnembryonalzellen entsprechend Sekellick und Marcus; „Methods in Enzymologya", 19:115–125 (1986) erhalten wurde, wurden dann PCR-Produkte hergestellt. Es konnte erfolgreich ein Northern Blot unter Verwendung der Huhn-Interferon-DNA-Sonde erhalten werden, wodurch die Größe der Interferonboten-RNA gezeigt werden konnte. Die Huhn-Interferon-DNA-Sonde stellt eine 269 Basensequenz dar, die zwei Primerregionen umfasst. Der Northern Blot wurde unter Verwendung der Huhn-Interferon-DNA-Sonde erhalten, wodurch eine induzierbare Boten-RNA gezeigt werden konnte, die die korrekte Größe und Induzierbarkeit bei Kontrolluntersuchungen mit UV-Vogel Reovirus infizierten „gealterten" primären Huhnembryonalzellen, sowie bei Poly I-Poly C Behandlung und bei Infektion mit vesikulärem Stomatitis Virus (VSV) Serotyp Indiana (IN) #22–20 zeigte, und nicht induzierbar war bei anderen Testbedingungen (z.B. in Gegenwart von Cyclokeximid, Actinomycin D oder 2-Aminopurin oder Infektion mit VSF (IN) #22–25 in gleichem System).
Die auf diese Art und Weise erhaltene DNA-Sonde besitzt die Nukleotidsequenz aus SEQ ID NO: 3. Die Sonde umfasst eine 269 Nukleotidsequenz mit einer 5'Primerregion aus 32 Basen, einer 3'Primerregion aus 20 Basen, und einer 217 Basenpaar langen partiellen Sequenz aus dem Huhn-Interferongen. Die Sonde kann auch über alternative Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Andere nützliche Sonden können wie oben diskutiert auf gleiche oder ähnliche Art und Weise hergestellt werden. Bevorzugte Sonden umfassen solche, die mindestens ein 20 Basenpaarsegment aus der DNA-Sequenz aus SEQ ID NO: 1 umfassen, und die an die komplementäre Sequenz des Interferongens binden. Vorzugsweise wird das Basenpaarsegment in der Gegend liegen, welche ungefähr den Nukleotiden 487 bis ungefähr Nukleotiden 633 aus der SEQ ID NO: 1 entspricht. Eine hochkonservierte Region in Säugerinterferonen wird in dem Segment von 547–579 gefunden.
Die Sonde kann dann verwendet werden, um eine Nicht-Säugetier, bspw. Vogel-, insbesondere Huhn- oder Enten- cDNA-Bank unter Anwendung der unten im Detail beschriebenen Verfahren zu durchmustern. Bspw. konnten bei einem Durchmustern einer Huhn cDNA-Bank mit diesem Verfahren 5 Klone, die die vollständigen kodierenden Regionen trugen und ein Klon, der eine verkürzte Insertion trug, isoliert werden. Die mRNAs, die für Huhn- und Enteninterferon kodierten, wurden erfolgreich erhalten. Die Synthese von cDNA aus mRNA, die für das Interferon kodiert, kann unter Verwendung der unten im Detail beschriebenen Methoden durchgeführt werden.
Die so erhaltene cDNA kann in Kloniervehikel eingebaut werden, um Transformanten zu erhalten. Kloniervehikel, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen Plasmide, wie bspw. das SuperScript Plasmid System für die cDNA-Synthese und das Plasmid-Klonieren (erhältlich von GIBCO/BRL; Life Technologies, Inc.). Die auf diese Weise klonierte cDNA wird mit Not I und Sal-I-Enden für das gerichtete Klonieren in ein Not I – Sal-I-geschnittes Plasmid pSPORT I kloniert.
Unter Verwendung von geeigneten Plasmiden oder Kloniervehikeln kann die DNA in eine geeignete Zelle wie bspw. eine prokaryotische oder eukaryotische, entsprechend den im Fachgebiet bekannten Methoden eingebaut werden, bspw. wie in in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel, et al.., (Herausgeber) beschrieben. Die Transformanten werden kultiviert, um dabei das Zellprotein zu exprimieren. Die Überprüfung der Expression von Huhn-Interferon kann über bekannte Testverfahren erreicht werden. Das exprimierte Huhn-Interferon kann aus der Kultur unter Anwendung bekannter Techniken, einschließlich bspw. Sekellick und Marcus, Methods in Enzymol., 19:115–125 (1986) isoliert werden. Es konnte hierin gezeigt werden, dass die Expression des isolierten Gens zur Produktion von funktionalem Huhn-Interferon führt.
Die Aminosäuresequenz, welche die Signalregion und das reife Huhn-Interferonprotein kodiert, wurde abgeleitet (SEQ ID NO: 1). Das Protein weist die Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2 auf. Huhn-Interferon ist ein 20–30 KD glykosyliertes Protein, welches säurestabil ist. Das nichtglykosylierte Molekül ist ein 18 KD Protein. Die gerichtete Mutagenese an den vier potentiellen N-Glycosylierungsstellen könnte zu Huhn-Interferonmolekülen mit unterschiedlichen Graden an Stabilität und verstärkter biologischer Aktivität führen. Die sechs Cysteinreste im Huhn-Interferonmolekül stellen eine Möglichkeit zur Veränderung der Anzahl der potentiellen Disulfidbrücken und damit der Stabilitäteigenschaften des Moleküls dar, wie für Säugetiereinterferone berichtet wurde. Day et al.., Journal of Interferon Research, 12:139–143 (1992). Übrigens könnte die säurelabile Form des Chickeninterferons, wie sie von Yoshida und Marcus (Journal of Interferon Research, 19:461–468 (1990)) berichtet wurde, solche vorübergehenden Veränderungen widerspiegeln.
Unter Verwendung von IFN cDNA aus Huhn als Hybridisierungssonde haben wir ein 2,7 kb HinDIII-Fragment genomischer Enten-DNA kloniert, welche ein Gen für IFN aus Ente enthält. Es weist einen offenen Leserahmen auf, von dem angenommen wird, dass er ein Protein von 191 Aminosäuren kodiert, einschließlich eines Signalpeptids von 30 Resten. Wie die Gene des Säugetiertyp I IFN's und dem Interferon aus Huhn besitzte das Enten-IFN keine Introns. Das IFN aus Ente zeigt etwa 50% Sequenzidentität zu dem IFN aus Huhn, besitzt 6 konservierte Cysteinreste und 2 potentielle Glycosylierungsstellen. Die Northernblot Analyse zeigte, dass die IFN mRNA aus Ente etwa 900 Nukleotide lang ist.
Ohne Induktion kann sie in kultivierten Enten-Embryonalzellen nicht nachgewiesen werden, akkumuliert aber zu hohen Spiegeln in Zellen, die mit UV-inaktiviertem Newcastle-disease-Virus behandelt wurden.
Bei Säugetieren wurden vier Familien von Typ I Interferongenen beschrieben (z.B. Interferon-alpha, beta, -omega und -tau) und eine Familie von Typ II Interferon (z.B. Interferon-Gamma). Die Southern-Analyse von genomischer DNA aus Huhn, die mittels Verwendung der hierin vorgestellten Sonden für Interferon aus Huhn durchgeführt wurden, weisen darauf hin, dass es möglicherweise nur ein Huhn-Interferongen gibt. Auf Aminosäurelevel weist das Interferongen aus Huhn nur etwa eine 22%ige Homologie mit allen anderen Typ I Interferonen aus Säugetieren auf, d.h. Interferon -alpha, -beta, -omega und -tau, und weniger als eine 3%ige Homologie mit dem Typ II Interferon aus Säugetieren, d.h. Interferon-gamma. Es wurde hier vorliegend gefunden, dass das Interferon aus Huhn insofern ungewöhnlich ist, als es 6 Cysteinreste und 4 potentielle N-Glykosylierungsstellen aufweist. Auf Grund seiner geschichtlichen Herkunft kann das Huhn-Interferon nützlich sein beim Nachweisen und Isolieren von Interferongenen aus anderen Nicht-Säugetierarten, bspw. Hühnern, Fischen und Reptilien.
Verschiedene in vitro Studien haben gezeigt, dass ChIFN als antivirales Mittel gegen Vogelviren in Zellen aus Huhn wirksam ist, und diese Studien haben IFN als Schutzmittel impliziert, wenn Hühner mit einem IFN induzierenden Mittel behandelt wurden und mit Vogelgrippevirus infiziert wurden (Portnoy und Merigan, J. Infectious Desease, 124:545–552 (1971). Es wurde gefunden, dass Vogelgrippevirus gegenüber ChIFN sensitiv ist, etwa in gleichem Maße wie der vesikuläre Stomatitisvirus. Glycosyliertes rekombinantes ChIFN (Glyco rChIFN) welches wie unten beschrieben erhalten wurde, wirkt gegen Vogelgrippevirus (Stamm A/ Truthahn / Ont / 7732/66-H5N9), vesikulärem Stomatitis Virus und infektiösem Bursal-Virus in vitro.
Es wurde außerdem gezeigt, dass ChIFN biologisch aktiv ist, z.B. bei Zellen anderer Vogelarten wie z.B. Truthahn, Wachtel, Rebhuhn und Perlhuhn eine antivirale Wirkung hervorruft, (Moehring und Steinebring, Nature, 226:360–361 (1970)).
Säugetier-Interferone wurden genetisch modifiziert, damit sie wünschenswerte Eigenschaften, bspw. eine veränderte Wirtsspezifität und eine veränderte spezifische Aktivität aufweisen. Day et al.., Ibid. Daher könnte es möglich sein, dass Huhn-Interferongen unter Verwendung ähnlicher Techniken in der gleichen Weise zu manipulieren.
Rekombinantes Interferon aus Vögeln, wie Ente oder Huhn, kann an Geflügel, vorzugsweise Hühnern und exotischen Vögeln, in einer Menge verabreicht werden, die wirksam ist, viralen und / oder parasitischen Infektionen vorzubeugen oder diese zu behandeln und / oder um das Immunsystem (bspw. um die Wirkung von Vakzinen zu unterstützen) zu verstärken. Beispiele für Vogelviren, für die Huhn-Interferon zur Behandlung / Vorbeugung von Erkrankungen, die durch diese Viren verursacht werden, verwendet werden könnte, umfassen Orthomyxovirus (z.B. Grippe); Paramyxovirus (z.B. Newcastle disease Virus); Coronavirus (z.B. infektiöse Bronchitis); Hepa-DNA-Virus (z.B. Hepatitis); Poxvirus (z.B. Geflügelpest); Adenovirus (z.B. Adenovirus); Retrovirus (z.B. Leukosisvirus); Herpesvirus (z.B. Marek's Erkrankung und Laryngotracheitis-Virus). Infektionen durch den Rousacroma-Virus und den infektiösen Bursal-Virus können mit dem rekombinanten Interferon der vorliegenden Erfindung ebenso vorgebeugt bzw. behandelt werden. Parasitische infektionen wie die, die durch Eimeria oder andere Parasiten bewirkt werden, und welche durch Interferon kontrollierbar sind, können ebenso durch das rekombinante Interferon der vorliegenden Erfindung behandelt / oder vorgebeugt werden.
Interferone wie bspw. das Interferon aus Huhn sind potente Induktoren des Mx-Gens (welches ein IFN-stimuliertes Antwortelement (ISRE) enthält), welches eine Familie von GTP-bindenden Proteinen kodiert (Pavlovic und Stackeli, J. Interferon Res., 11:215–219 (1991)). Wird das Gen durch die Wirkung von Interferon stimuliert, macht das intrazelluläre Mx-Gen-Produkt die Zellen gegenüber einer Infektion durch den Vogelgrippevirus unempfänglich (Garer et al.., Virology, 180:754–762 (1991)). Daher kann die Gabe eines Rekombinations- Interferons wie bspw. Glyco-rChIFN, einer viralen Infektion wie der Infektion durch den Vogelgrippevirus, vorbeugen.
Das Interferon kann als Tierarzneimittelpräparation bspw. in halbflüssiger oder flüssiger Form formuliert werden, welche das rekombinante Interferon aus Huhn als aktiven Bestandteil in Mischungen mit geeigneten organischen oder anorganischen Trägern oder Excipienten enthält. Der aktive Bestandteil kann bspw. mit den normalen nicht-toxischen Tierarzneimittelträgern für Lösungen, Emulsionen, Suspensionen und jeder anderen für die Verwendung geeigneten Formen vorliegen. Die Träger, die verwendet werden können, umfassen Albumin, Wasser (bspw. Trinkwasser), Glukose, Laktose, Akaziengummi, Gelatine, Mannitol, Stärkepaste, Salzlösung und andere Träger, wie sie für die Herstellungsverfahren geeignet sind. Zusätzlich können Hilfsstoffe, Stabilisierungsmittel und Verdickungsmittel Verwendung finden.
Die Zusammensetzung wird im Geflügel durch eine wirksame Verabreichungsmethode verabreicht. Beispiele für Verabreichungsverfahren umfassen die genetische Immunisierung wie oben beschrieben, die intraperitoneale, die intravenöse, die intratracheale und die respiratorische Inhalation wie die Aerosolisierung und per os. Die Menge einer effektiven Dosierung an Huhn-Interferon wird von dem Alter und der Verfassung des Geflügels abhängen. Eine typische Tagesdosis beträgt 2–10 × 10⁴ Einheiten /kg, bspw. 5 × 10⁴ Einheiten/kg. Da die Erfindung es ermöglicht, große Mengen an biologisch aktivem rChIFN zu produzieren, können Dosierungen von ChIFN gegeben werden, wie sie bisher nicht im Bereich des Möglichen lagen. Siehe Sekellick und Marcus (1986), Ibid., für Standardverfahren zur Bestimmung der Einheitsmessung für Interferon. Ein alternatives Verfahren zur Verabreichung ist es, eine transgene Pflanze herzustellen, bspw. Mais, welches das rekombinante Interferon produziert. Diese Pflanze oder ein Teil davon (bspw. die Maiskörner) können dann an das Geflügel verfüttert werden.
Ein alternatives Verfahren zum Vorbeugen und / oder Behandeln von viralen und parasitischen Infektionen ist es, transgenes Geflügel zu produzieren, wobei das Geflügel ein induzierbares Gen, welches für das Geflügel endogene Interferon kodiert, trägt. Das Verfahren zur Herstellung des transgenen Geflügels umfasst die Stufen des Einführens und Einbauens rekombinanter DNA, welche eine Nukleotidsequenz umfasst, die für Interferon aus Vogel kodiert, in einem embryonalen Stadium, vorzugsweise im Spermium, im Ei, der Zygote oder dem Embryo eines Geflügels und der Inkubation des besagten Embryonalstadiums unter Bedingungen, die für die Entwicklung des Geflügels notwendig sind. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Geflügel um Huhn. Bspw. kann das transgene Geflügel hergestellt werden, indem die DNA vorzugsweise mit einem vorher bestimmten Promotor in einen eukaryotischen Expressionsvektor, Bspw. Plasmid pcDNA3 (Invitrogen) eingebaut wird. Die so erhaltene Plasmid-DNA kann dann in das gewünschte Geflügel über im Fachgebiet al.Igemein bekannte Verfahren eingebaut werden. Simkiss, Comparative Biochemistry and Physiology, 104A:411–417, 1993; Ono et al.., Developmental Biology, 161:126–130, (1994). Die Expression des Interferon in Geflügel kann dann das Geflügel von viralen und / oder parasitischen Erkrankungen schützen.
Im allgemeinen wird das Interferongen aus Huhn funktionsfähig hinter einen Promotor platziert, der auf andere äußere Reize antwortet als der endogene Promotor für das Gen. Z.B. kann doppelsträngige (DS) RNA verwendet werden, um den Promotor zu stimulieren (Marcus, „In Interferon 5", Edition I, Gresser, Academic Press, pp. 115–180, 1983). Auch kann ein Metallothioneinpromoter aus Huhn verwendet werden (Vernando und Andrews, Gene, 81:177–183 (1989)), so dass die Zellen oder Hühner, die dieses Konstrukt enthalten auch Metallionen wie bspw. Cd++ oder Zn++ antworten würden, und wie gewünscht transient Interferon produzieren würden.
Die Metallionen können über jedwede wirksame Methode einschließlich der oralen und der parenteralen verabreicht werden. Ein besonders bevorzugtes Ausführungsbeispiel ist die orale Verabreichung. Die Metallionen können in jede wirksame Zusammensetzung formuliert sein. Geeignete Trägermittel umfassen die oben Beschriebenen. Bspw. können die Metallionen in dem Futtermittel des Geflügels aufgenommen werden, wobei die Aufnahme der Metallionen den Metallothioneinpromoter induziert. Die wirksame Dosierung der Metallionen kann in einfacher Weise durch den Fachmann bestimmt werden, und hängt vom Alter und der Verfassung des Geflügels ab.
Die Erfindung wird benutzt werden, um transgene Hühner herzustellen, die entweder das Huhn-Interferongen konstitutiv expremieren, so dass das Huhn eine Resistenz gegenüber einem breiten Spektrum von viralen Infektionen zeigt, vergleichbar zu dem in vitro Ergebnis, oder wobei das Huhn-Interferon transient exprimiert, wie es notwendig ist, um eine Virusinfektion vorzubeugen oder zu bekämpfen. Die transiente Expression des Interferons wird bevorzugt, da eine konstitutive Expression in einem Interferonspiegel resultiert, der für die Embryonalentwicklung möglicherweise schädlich sein könnte. Siehe Müller et al.., Gene, 121:263–270 (1992), wo gezeigt wurde, dass die frühe Expression des Mx'1 Gens bei transgenen Schweinen schädlich war. Mit dem Aktivieren des Interferongensystem hat dieser Ansatz den Vorteil, dass das Interferonsystem nur dann ins Spiel gebracht wird, wenn es notwendig ist, bspw. beim Ausbruch einer viralen Erkrankung und nicht während kritischer Entwicklungsstadien bei der Herstellung von transgenen Hühnern.
Interferon aus Huhn, welches auf diese Weise exprimiert wird hat den zusätzlichen Vorteil, dass es ebenso das Mx-System aktiviert, wie es das natürlicherweise auch tut, und die Hühner ebenso gegenüber dem Vogelgrippenvirus resistent macht. Vogelgrippe und andere Vogelviren können die Bestände dezimieren und Hühner, die intrinsisch gegenüber diesem Virus resistent wären oder die durch ein einfaches Umstellen des Futtermittels resistent gemacht werden könnten, wären von großem kommerziellem Wert. Die Hühnerindustrie ist eine Multimillionendollar-Industrie.
Es kann jede wirksame Methode zum Einbauen des cDNA-Plasmids in das Geflügel verwendet werden. Beispiele für solche Methoden umfassen die Mikroinjektion, die Elektroporation, die Spermientransfektion, die Liposomfusion und das Mikroprojektilbombardment. Das gewünschte Gen kann in die Spermienzelle auch durch die Cornell Partikel Kanone eingeführt werden. Das Mikroprojektilbombardment unter Verwendung der Cornell Partikel Kanone wurde entwickelt, um gewünschte genetische Konstrukte in Zellen durch Abschießen von mit DNA-beschichteten inerten Mikropartikeln, wie bspw. Wolfram zu verfrachten. Hough und Foote, „The Effect of the Cornell Particle Gun on Bull and Rabbit Spermatatozoa", Abs. Biol. Reprod. Suppl. 1 42:65, (1990), United States Patent NO. 5,100,792, Sanford et al.., erteilt am 31. März, 1992.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von transgenen Hühnern ist die Verwendung von retroviralen „one round" Vektoren. Siehe Salter, et al.., Transgenic Chickens: Insertion of Retroviral Genes into the Chicken Germ Line, Virology, 157:236–240 (1987). Es wird berichtet, dass die Insertion von Fremd-DNA in frühen Hühnerembryos auftrat, wenn die DNA in den Dottersack nahe des Embryos in einen frisch gelegten befruchteten Ei injiziert wurde. Die verwendete Prozedur wird bei Salter et al.., Poult. Sci., 65: 1445–1458 (1986) beschrieben, welche hier durch Bezugnahme voll inhaltlich miteingeschlossen ist.
Es ist insbesondere vorteilhaft, die retroviralen Vektoren zu modifizieren, um deren Effizienz zu verbessern und die Pathogenizität zu reduzieren. Ein Verfahren, das verwendet werden kann, ist die Deletion von mindestens einem Replikationsgen des retroviralen Vektors. Crittenden und Salter, Poc. UCLA Symp., Transgenic Models in Med and Agr., pp 73–87, 1990; Salter und Crittenden, Theor. App. Genetics, 77:457–461 (1989); Crittenden, Salter und Federspiel, Theor. Appl. Genetics, 77:505–515, 1989; Salter und Crittenden, „Proc. Discoveries in Antisense Nucleic Acids", pp 95–110, (1989); Salter et al.., Virology, 157: 236–240, 1987; Crittenden et al.., J. Virol., 61:772–775, 1987; Crittenden, Poultry Sci., 65: 1468–1473 (1986); Crittenden, Avian Dis., 30:43–46 (1986); Hughes, Poultry Sci., 65: 1459–1467 (1986); Salter et al.., Poultry Sci., 65: 1445–1458 (1986); Crittenden und Salter, Canadian J. of Animal Science, 65: 553–562 (1985), Simkiss, Comparative Biochemistry und Physiology, 104A: 411-417, (1993); und Ono et al.., Developmental Biology, 161: 126–130, (1994).
Die Produktion eines erfolgreichen transgenen Huhns mit nicht-replizierenden Vektoren wurde beschrieben. Shuman, J. of Dairy Sci., 72 (suppl 1):61 (1989); Lee, M.R., Dissertation, North Carolina State University (1989); Shuman et al.., Poultry Sci., 67: 136 (1988). Keines dieser transgenen Hühner enthält die hier beschriebene cDNA für Interferon aus Huhn.
Bei der erfindungsgemäßen Methode ist das oben diskutierte DNA-Konstrukt, welches ggf. mit einem geeigneten Promotor verbunden ist, entweder an einen inerten Mikropartikel imprägniert oder auf ihn aufgebracht. Der mit DNA beschichtete oder imprägnierte Mikropartikel wird dann in eine geeignete Zelle verbracht, einschließlich Spermien, Eizellen, Zygoten oder dem Embryo. Da Spermienzellen natürliche Vektoren sind, ist es bevorzugt, das der mit DNA beschichtete Mikropartikel in ein Spermium verbracht wird. Es ist bevorzugt, dass die Cornell Partikel Kanone verwendet wird, um den Mikropartikel in die Zelle zu verbringen. Es kann jedoch jede effektive Überbrückungsmethode verwendet werden, einschließlich derer, wie sie im Sanford Patent beschrieben sind. Da ein bestimmter Verlust an Spermienmotilität auftreten kann, kann die Anwendung von Vakuum und der Zusatz von ATP einen Teil oder die vollständige Motilität wiedergewinnen. Bevorzugte ATP-Konzentrationen liegen bei 0,05–1,0 mM ATP.
Frisch geschlüpfte Küken können auf Anwesenheit des Interferongens aus Huhn durchmustert werden, indem Leukozyten aus Blutproben Zn++ oder Cd++ Ionen ausgesetzt werden, um das von einem Metallothioneinpromoter angesteuerte ChIFN Gen zu induzieren.
In einem anderen Ausführungsbeispiel wird die Fähigkeit des rekombinanten Interferons, das Mx-Gen-System zu aktivieren verwendet. Beispielsweise wird der Promotor des Mx-Gen funktionsfähig neben einem heterologen Gen platziert, welches in einer Wirtszelle exprimiert werden soll. Die Wirtszelle (bspw. eine Vogel- oder eine Hühnerzelle) wird mit dem Mx-Gen-Promotor und dem heterologen Gen transfiziert. Die Expression des heterologen Gens wird dann induziert, indem die Zelle rekombinantem Interferon ausgesetzt wird.
Die cDNA-Sonde und / oder das Interferongen aus Huhn und / oder irgendein funktionierendes Fragment davon kann als Sonde verwendet werden, um das Interferongen aus anderen Vogelarten, aus Fischen oder Reptilien zu isolieren. Die zu verwendende Methode ist im wesentlichen die gleiche wie die hier beschriebene und für das Isolieren des Interferongens aus Huhn verwendete Methode.
Das so isolierte Interferongen kann dann auf die oben beschriebene Weise zur Herstellung des rekombinanten Interferonproteins oder für die Herstellung eines transgenen Tieres verwendet werden. Das rekombinante Interferonprotein kann einem geeigneten Vogel, Fisch oder Reptil in der oben beschriebenen Art und Weise verabreicht werden. Die Verabreichung von Interferon an einen Fisch kann außerdem bspw. durch Zusatz des Interferons zu der wässrigen Umgebung bewerkstelligt werden. Das Interferon kann über die Kiemen des Fisches absorbiert werden.
Interferon kann unter Verwendung bekannter Techniken in die Eier injiziert werden, um den Embryo zu schützen.
Die Erfindung wird weiter mit Hilfe der folgenden Beispiele illustriert werden:
Beispiele
Material und Methoden
Zellen und Medien:
Monolayer von primären Hühnerembryonenzellen wurden von 10 Tage alten Hühnerembryonen wie bereits beschrieben hergestellt (Sekellick und Marcus, Methods Enzymol., 119:115–125, (1986); Sekellick, Biggers und Marcus, In vitro Cell Dev. Biol., 26:997–1003 (1990)). Die Zellen wurden in vitro ohne Mediumwechsel für die angegebenen Zeiträume gealtert, normalerweise 8–10 Tage, um ihre IFN-induzierende Kapazität zu verstärken (Sekellick und Marcus, (1986); Sekellick, Biggers und Marcus (1990)).
Virusquelle, Herstellung und Test:
Die Herkunft, das Wachstum und die Quelle des Vogel-Reovirus wie auch verschiedene Stämme des Wildtyp VSV IN wurden schon beschrieben (Winship und Marcus, J. Interferon Res., 1:155–167 (1980); Sekellick und Marcus, J. Gen. Virol., 70:405–415 (1989); Sekellick und Marcus, Yirology, 95: 36–47 (1979); Marcus, Sekellick und Nichol (1992); Marcus et al.., J. Interferon Res., 13:547 (1993)). Die Plaque assays, die Stammvermehrung und die UV-Bestrahlung des Vogel-Reovirus wurden wie bereits beschrieben unter Verwendung von primären Embryonalzellen aus Huhn als Wirt durchgeführt (Winship und Marcus, (1980)). Die VSV-Präparationen wurden in GMK-Vero-Zellen wie vorher beschrieben gezüchtet und ausgesät (Sekellick und Marcus, (1989)).
IFN-Induktion und Test:
Die Details für die Verfahren, die verwendet werden, um säurestabiles IFN in gealterten primären Embryonalzellen aus Huhn zu induzieren und zu testen, wurden bereits beschrieben (Sekellick und Marcus (1986); Sekellick, Biggers und Marcus, (1990); Yoshida und Marcus, J. Interferon Research, 10:461–468, (1990)). UV-bestrahlter Vogel-Reovirus wurde verwendet, um primäre Embryonalzellen aus Huhn mit einer Infektionsmultiplizität von 5 wie vorher beschrieben zu infizieren (Winship und Marcus, (1980)) um IFN maximal zu induzieren.
RNA-Reinigung:
Zelluläre Gesamt-RNA wurde aus UV-bestrahlten und mit Vogel-Reovirus infizierten primären Embryonalzellen aus Huhn zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion präpariert. Die Zellen wurden mit SDS/EDTA lysiert und die Gesamt-RNA wurde mit Wasser-gesättigtem sauren Phenol extrahiert, wonach eine Ethanolpräzipitation durchgeführt wurde (Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Die auf diese Weise extrahierte RNA diente als Template für die PCR-Reaktion oder für die Northern blot Analyse.
Oligonukleotid-Synthese:
Bekannte IFN-α/β und Aminosäuresequenzen aus Wirbeltieren wurden unter Verwendung des Wisconsin Sequence Analysis Package, Verson 7, von Genetics Computer Group (Madison, WI) erhalten und wurden so aligned, dass die Lücken minimiert wurden und die Homologie maximiert wurde. Gegenden nahe dem Carboxylende und der Mitte des reifen Proteins mit hoher Homologie wurden im Detail auf Aminosäureebene untersucht, und es wurden zwei Sonden konstruiert, die auf der Nukleotidsequenzen aus diesen Regionen basierten. Die Nukleotidsequenzen wurden von den Aminosäuresequenzen abgeleitet, unter Beachtung der Codon Usage Präferenzen wie sie aus bereits bekannten Hühnergene abgeleitet wurden, und wobei bei degenerierten Positionen zwei oder mehr Nukleotide substituiert wurden. Für die PCR wurde der „downstream" Primer in Antisense-Orientierung bezogen auf die cDNA-Synthese abgeleitet und der „upstream" Primer war in Senseorientierung zur Amplifikation der cDNA mit dem „downstream Primer". Die Sense und Antisense degenerierten PCR-Primer entsprachen jeweils den Nukleotidpositionen 307–338 bzw. 556–575 (SEQ ID NO: 1). Der Sense-Primer war ein 32-mer, welches aus der Sequenz 5'-TTGGCCATCTATGAGATGCTCCAGMANATHTT-3'(SEQ ID NO: 4) bestand. Der Antisense-Primer war ein 20-mer bestehend aus der Sequenz 5'-CGGACCACTGTCCANGCRCA-3'(SEQ ID NO: 5).
Polymerase Kettenreaktion (PCR):
Eine RNA PCR wurde entsprechend dem mit dem Perkin Elmer-Cetus Geneamp RNA PCR Kit gelieferten Protokoll durchgeführt. Es wurde ein Mikrogramm der aus primären Embryonalzellen aus Huhn, die induziert waren Interferon herzustellen, isolierten Gesamt-RNA wurde in einer 20 μl Reverse Transkriptase Reaktion unter Verwendung des downstream-Primers zur cDNA-Synthese verwendet. Die Reaktion wurde bei 42°C für 15 Minuten durchgeführt, und dann wurde bei 99°C 5 Minuten inkubiert, um die reverse Transkriptase zu inaktivieren. Nach Abkühlen auf 5°C wurde die Reaktionsbestandteile hinzugefügt und ein Volumen von 100 μl wurde eingestellt, wobei beide Primer jetzt bei einer Konzentration von 0,5 μM vorhanden waren. Die PCR wurde für 35 Zyklen bei 95° für 1 Minute, 37°C für 1 Minute und 72°C für eine Minute durchgeführt.
Reinigung der PCR-Produkte:
Die PCR-Produkte wurden mit Ethanol präzipitiert, in Wasser aufgelöst, und auf einer 3% Nusieve GTG Agarose (FMC) Gel getrennt. Die Bande mit der erwarteten Größe wurde aus dem Gel ausgeschnitten, geschmolzen, und mit sterilem Wasser 1:10 verdünnt. Ein 10 μl Volumen dieser Lösung wurde in einer weiteren PCR-Reaktion verwendet, um noch mehr des Fragments zu amplifizieren, damit eine hinreichende Menge für das Klonieren zur Verfügung stand. Die Reaktionsbedingungen waren wie vorne angegeben, außer, dass das Annealing bei 50°C durchgeführt wurde. Die PCR-Produkte wurden wieder Gel-gereinigt, wobei die ausgeschnittenen Banden von der Agarose gereinigt wurden, indem sie in einer Mikrofuge in Costar Spin-X Zentrifugefilter Units bei 4° C abzentrifugiert wurden. Die Proben wurden dann mit Sec-Butanol extrahiert, um das Ethidiumbromid zu entfernen, quantifiziert, Ethanol-präzipitiert und in sterilem Wasser wieder aufgenommen.
Synthese des cDNA-Fragments:
Das Phagemid bBluescript KS (–) wurde mit Eco RV geschnitten, um ein Blunt-end zu produzieren und es wurde ebenso mit Eag I geschnitten, um am anderen Ende ein 3'überhängendes Ende zu kreieren. Das gereinigte PCR-Produkt enthielt eine einzelne Restriktionsschnittstelle für Eae I am 5'Ende des upstream-Primers, welcher ein 3'Überhang kreierte, der komplementär war zu dem durch Eag I produzierten Überhang. Das Fragment wurde in pBluescript unter Bedingungen legiert, welche die Blunt-end-Ligation favorisieren, wobei ein molares Verhältnis von Insert : Vektor von 10:1 vorlag. Rekombinante Plasmide wurden in XL1-Blue E. coli transformiert. Positive Colonien wurden identifiziert unter Verwendung der blau/weiß Kolonie-Selektion. Die Rekombinanten wurden durch Restriktionsverdaus verifiziert, die Inserts der erwarteten Größe zeigten. Ein Klon, der ein 269-Basenpaar-Insert (genannt pCh269) enthielt, wurde für die Verwendung in den nachfolgenden Untersuchungen ausgewählt.
DNA-Sequenzanalyse des klonierten PCR-Fragmentes:
Doppelsträngige DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung der TAQuence Version 2.0 von USB durchgeführt. Das Plasmid wurde aus 500 ml Kulturen mit Hilfe der alkalischen Lysemethode präpariert. Kontaminierende RNA wurde über Lithiumchloridpräzipitation und RNase-Behandlung gefolgt von einer organischen Extraktion und einer Ethanolpräzipitation abgetrennt. Das Plasmid wurde hitzedenaturiert und auf Trockeneis und Ethanol blitzgefroren, bevor die Sequenzanalyse durchgeführt wurde. Die vollständige Reaktion wurde dann auf einem 7% Long Ranger (J.T. Baker) Polyacrylamidgel unter Verwendung von Sequenzierreaktionen von beiden Strängen des Plasmid-Inserts analysiert.
cDNA-Klonieren:
Unter Verwendung von gealterten primären Embryonalzellen aus Huhn, die mit UV-AVR infiziert waren, also unter Bedingungen, von denen bekannt war, dass hohe Interferonausbeuten erzielt wurden, wurde Gesamt-RNA aus den Zellen ungefähr 8 Stunden nach der Infektion wie oben beschrieben isoliert. Poly(A)+ RNA wurde unter Verwendung von Oligo(dT)-Cellulose Zentrifugenröhrchen, die mit einem Pharmacia mRNA Reinigungskit geliefert wurden, isoliert. Die cDNA wurde ausgehend von dieser Poly(A)+ RNA synthetisiert und unter Verwendung des Superscript Plasmidsystems (Gibco/BRL) in mit Not I und Sal I geschnittenem Plasmid pSPORT I kloniert. Das Plasmid wurde in ElectroMAX DH10B (Gibco/BRL) Zellen unter Verwendung der „Electroporator" Elektroporationsvorrichtung von Invitrogen elektroporiert. Die Klone wurden unter Verwendung von biotinyliertem PCR Produkt, welches ausgehend vom pCh269 Template hergestellt wurde, durchmustert und mit DNA von Colony Lifts, welche mit UV an MSI Nylonmembranen (82 mm Durchmesser) kreuzvernetzt waren, hybridisiert und mit dem Colony Images Non-Isotopic Colony/Plaque Screening Kit (USB) nachgewiesen.
DNA-Sequenzanalyse der cDNA-Klone:
Die Plasmide wurden unter Verwendung der alkalischen Standard-Lysemethode isoliert, gefolgt von einer Ammoniumacetatpräzipitation (bei 10 ml Kulturen) oder einer Lithiumchloridpräzipitation (für 500 ml Kulturen). Danach folgte ein RNase Behandlung, um verbleibende kontaminierende bakterielle RNA zu entfernen. Die Plasmide wurden dann unter Verwendung des Pharmacia AutoRead Sequencing Kit für doppelsträngige Templates mit T7 und SP6 Fluorescein markierten Primern (hergestellt von dem Biotechnology Center, Univ. of CT) sequenziert. Nach Terminierung wurden die Sequenzierungsreaktionen auf dem Pharmacia Automated Laser Fluorescent A.L.F. DNA-Sequenziervorrichtung unter Verwendung eines 6%igen Polyacrylamidgels analysiert.
Northern-blot-Analyse:
Die RNA-Proben wurden drei Stunden auf einem 1 %igen Agarosegel, welches 2.2 M Formaldehyd enthielt getrennt, und über Kapillarelution in 10fach SSC auf eine Nylonmembran überführt. Die RNA wurde mit der trockenen Membran kreuzvernetzt mit 254 nm UV (0.15 J/cm²). Das Gibco/BRL Photogene Protokoll wurde für die Sondenhybridisierung und die nicht radioaktive Nukleinsäure Detektion verwendet. Die Hybridisierungslösungen enthielten 50% iges Formamid und die Reaktionen wurden bei 42°C durchgeführt. Stringente Waschschritte wurden unter moderaten Bedingungen unter Verwendung von 0,1 % SSC und 1 % (w/v) SDS bei 50°C für 30 Minuten durchgeführt. Die Membranen wurden normalerweise für zwei bis vier Stunden mit Kodak XAR-5 Film exponiert, um eine ausreichende Signalintensität zu erhalten.
Biologische Aktivität des pCh132 Genprodukts:
pCh132 DNA wurde mit Hind III geschnitten und als Template in einer in vitro Transkriptionsreaktion unter Verwendung des mCAP kits (Stratagene, La Jolla, CA) verwendet, um eine gecappte mRNA mit der T7 RNA Polymerase herzustellen. Nach DNAse-Abbau wurde das RNA-Produkt über Phenolextraktion gereinigt und mit Ethanol präzipitiert. Die RNA wurde für die Verwendung in TE-Puffer resuspendiert.
Die pCH132 mRNA wurde in die Maus L(Y)-Klon 40 Zellen unter Verwendung von Lipofectin Reagenz (Gibco/BRL) nach Herstellerangaben transfiziert. Monolayer der Zellen in 60 mm Kulturgefäßen wurden viermal mit serumfreien minimalen essentiellen Medium (MEM) gewaschen, bevor der Lipofectin-mRNA Komplex in 2 ml serumfreien MEM zugefügt wurde. Die Zellen wurden bei 37° für vier bis 20 Stunden inkubiert. Die Überstände wurden bei –20° aufbewahrt, bevor der IFN Test an primären Hühnerembryonalzellen wie beschrieben durchgeführt wurde. Sekellick und Marcus, Methods in Enzymol., 119: 115–125 (1986).
In einem davon getrennten Experiment enthielt das Überstandsmedium von Maus L(Y)-Klon 40 Zellen, welche mit 5 μg RNA transfiziert wurden, und wobei das Medium 4 Stunden nach der wie oben beschriebenen Transfektion gesammelt wurde, 26 Einheiten /ml antivirale Aktivität, wie auf primären Hühnerembryonalzellen getestet wurde. Diese Aktivität wurde vollständig durch Inkubation mit einer 1:25 Verdünnung eines monoklonalen Antikörpers gegen ChIFN unterdrückt, welche ausreichend war um 40–60 Internationale Einheiten ChIFN zu neutralisieren (Masayoshi, Kohase, persönliche Mitteilung).
Biologische Expression von ChIFN Gen in Maus L(Y) Zellen:
In vitro präparierte Boten-RNA unter Verwendung von pCh132 DNA als Template wurde in Maus L(Y) Zellen transfiziert und das Medium wurde auf die Anwesenheit von antiviraler Aktivität nach einem Standardverfahren für Zellen aus Huhn getestet (Sekellick und Marcus, Methods in Enzymol., 119: 115–125, 1986), welches in Gegenwart oder in Abwesenheit eines ChIFN spezifischen monoklonalen Antikörpers ausgeführt wurde. (Kohase et al.., J. Interferon Res., 13: S93, 1993). Die höchsten Spiegel an antiviraler Aktivität, die in das Medium umgebend die Maus L(Y) Zellen freigesetzt wurde, wurde vier Stunden nach Transfektion beobachtet, und fiel auf 1/3 nach acht Stunden ab, wonach die antivirale Aktivität für mindenstens 20 Stunden konstant blieb. Zellextrakte enthielten etwa 10% der von den Zellen freigesetzten antiviralen Aktivität. Die Abbildung zeigt, dass die von transfizierten Maus L(Y) Zellen gewonnene Aktivität in Zellen aus Huhn einen antiviralen Effekt bewirkte, der proportional zu der Menge an mRNA war, die bei der Lipofectin-vermittelten Transfektion zugefügt wurde. Diese Aktivität wurde sowohl durch polyklonale als auch monoklonale Antikörper gegen ChIFN neutralisiert. Maus IFN war bei Zellen aus Huhn nicht aktiv, und daher konnte der antivirale Effekt auch nicht einem IFN zugeschrieben werden, welches endogen während des Transfektionsverfahrens induziert wurde. Die letzte Kontrolle war notwendig, da manche Plasmidpräparationen möglicherweise mit doppelsträngiger (DS) RNA kontaminiert sind, einen potenten IFN Induktor. Marcus und Sekellick, Nature, 266: 815–819 (1977).
Biologische Expression von glykosyliertem rChIFN in humanen WISH-Zellen und COS-1-Zellen:
DNA wurde ausgehend von dem eukaryotischen Expressionsplasmid pcDNA3 (erworben von Invitrogen, San Diego, CA) und von Klon pCh132 präpariert. Beide Plasmid-DNA-Präparationen wurden mit den Restriktionsenzymen Eco R1 und Not 1 geschnitten. Das linearisierte pcDNA3 Plasmid wurde unter Verwendung einer Phenol/Chloroformextraktion gereinigt, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation und die DNA wurde in TE-Puffer resuspendiert. Die aus der Restriktion des Plasmid pCh132 resultierenden DNA-Produkte wurden auf einem 1%igen Agarosegel getrennt und die DNA-Bande, die das Insert mit der für Interferon aus Huhn kodierenden Sequenz enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Das Insert wurde aus der Agarose gereinigt unter Verwendung eines Spin-X-Säule (Costar) gefolgt von Butanolextraktion und einer Ethanolpräzipitation. Das DNA-Insert wurde in TE-Puffer resuspendiert. Die Ligation des Inserts in den pcDNA3-Vektor wurde unter Verwendung von T4 DNA-Ligase bei 16°C mit einem Verhältnis von Insert : Vektor von 10:1 durchgeführt.
Die Produkte dieser Ligationsreaktion wurden verwendet, um DH5a-Zellen zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden unter Verwendung einer Ampicillinselektion isoliert. Es wurden 10 Kolonien selektiert, die DNA wurde präpariert und einem Restriktionsverdau unterzogen, und die Produkte wurden auf einem Agarosegel analysiert. 5 der 10 Klone enthielten Plasmide mit Inserts einer Größe, die mit der für das aus pCh132 stammende Insert erwartet wurde überein.
DNA-Präparationen aus den positiven Klonen (bezeichnet A1, A2, A3, A7, A10) wurden verwendet, um COS-1-Zellen (erhalten von der ATCC, Rockville, MD) und WISH-Zellen, die jeweils in 60 mm Kulturschalen kultiviert wurden, zu transfizieren. Die Zellen wurden 4× mit Medium gewaschen, welches serumfrei und antibiotikumfrei war (CO₂-unabhängiges Medium [Gibco/BRL] für COS-1; MEM für WISH). Etwa 2–4 μg DNA aus jedem der 5 Klone wurde in getrennten Reaktionen mit 25 μl Lipofectinreagenz (Gibco/BRL) kombiniert und wie vom Hersteller beschrieben inkubiert. Der Lipofectin-DNA-Komplex wurde zu den Zellen (COS-1 und WISH) in Medium zugefügt, welches serumfrei / antibiotikumfrei war. Die transfizierten Zellen wurden bei 37,5°C inkubiert und Medium wurde nach 12, 24, 28 und 72 Stunden gesammelt. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen abtrypsiniert und vereinigt (d.h. die fünf Kulturen der COS-1-Zellen, welche mit den 5 Klonen transfiziert waren, wurden vereinigt und die 5 Kulturen der WISH-Zellen, die mit den 5 Klonen transfiziert waren, wurden ebenfalls vereinigt. Die transfizierten COS-1-Zellen wurden in DME mit 10% FBS und 400 μg/ml G418 ausplatiert. Die transfizierten WISH-Zellen wurden in MEM mit 10% FBS und 1000 μg/ml G418 ausplatiert. Ein Test des überstehenden Mediums von den transfizierten Zellen (an primären Embryonalzellen aus Huhn) gesammelt nach 12 bis 72 Stunden zeigte, dass alle 5 Klone (A1, A2, A3, A7, A10) signifikante Mengen an antiviraler Aktivität sowohl bei den COS-1 als auch bei den WISH-Zellen produzierten.
Transfizierte Zellen, die die anfängliche G418-Selektion überlebten, wurden unter Mediumwechsel (ohne G418) und / oder unter Passagen in Kultur gehalten, bis sie stabile Kulturen entwickelten. Im Falle der transfizierten COS-Zellen, die die G418-Behandlung überlebten, wurden die Zellen in eine einzelene Vertiefung einer 24er Lochplatte vereinigt und ungefähr 5 Wochen nach der anfänglichen Transfektion in eine 60 mm Kulturgefäß überführt. Medium (5 ml), welches 10 Tage nach dem Aussäen der Zellen in das 60 mm Kulturgefäß gesammelt wurde, wurde auf Huhn-Interferon getestet und es wurde gefunden, dass es etwa 1 × 10⁶ Einheiten/ml oder insgesamt 5 × 10⁶ Einheiten enthielt.
Antivirale Wirkung von Glyco-rChIFN:
Wie in Fußnote 2 aus Tabelle 1 angegeben wird der vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) als internationaler Standard zur Definition von einer Plaque-Reduktions-50% Einheit (PR₅₀) von ChIFN verwendet. Der PR₅₀ ist ein allgemein bekanntes biologisches Standardtestverfahren zur Messung der Aktivität von IFN (Interferon und Interferoninducers, überarbeitete Ausgabe, herausgegeben von N.B. Finter, North Holland / American Elsevier Press, Seiten 139–142, 1973).
Jeder Virus wird über einen Plaque-Assay mit Hilfe gut bekannter Standardtechniken (R. Dulbecco, 1952) getestet, wobei zuerst ungeschützte Embryonalzellen aus Huhn in Abwesenheit von IFN getestet werden, um den Kontroll-Plaque-Titer zu erhalten und dann wird in Gegenwart von unterschiedlichen Verdünnungen von IFN getestet. Der Kehrwert der Verdünnung von IFN, welcher den Kontroll-Plaque-Titer um 50% reduziert, enthält definitionsgemäß eine PR₅₀-Einheit IFN. Ein Wert von 1 in der Spalte „relative Empfindlichkeit gegenüber Glyco-rChIFN bedeutet in Tabelle 1, dass der Virus die gleiche Sensitivität gegenüber IFN zeigt wie der Standard-VSV. VSV wird als besonders sensitiv gegenüber der Wirkung von IFN angesehen, und daraus ergibt sich, dass ein Vogelgrippevirus, welcher einen Wert von 1 erhält, ebenso sensitiv gegenüber der Wirkung von IFN ist, wie VSV. Der infektiöse Bursal-Virus ergab einen Wert von 2, und daraus ergibt sich, dass dieser Virus doppelt so viel IFN braucht, um seine Plaquebildungsfähigkeit um 50% zu reduzieren.
Tabelle 1 Antirvirale Wirkung von Glyco-rChIFN ⁽¹⁾
Äquivalente:
Ohne mehr als reine Routineexperimente auszuführen, werden die Fachleute viele Äquivalente zu den hier beschriebenen spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsbeispielen erkennen oder sich vorstellen können. Solche Äquivalente sollen auch im Schutzumfang der folgenden Ansprüche enthalten sein:
SEQUENZ-PROTOKOLL

Claims

Ein isoliertes Gen, kodierend für Interferon aus Huhn mit der Nukleotidsequenz in SEQ ID NO 1, und kodierend für die Aminosäure Sequenz dargestellt in SEQ ID NO 1 codiert.
Eine DNA Sequenz, bestehend aus: Einer isolierten Interferon DNA aus Huhn, worin die isolierte Interferon DNA aus Huhn aus einer DNA Sequenz aus SEQ ID NO 1 besteht.
Verfahren zur Herstellung von Interferon aus Huhn, umfassend: a) Kultivierung einer Wirtszelle welche fähig ist, Interferon aus Huhn zu produzieren, wobei die Wirtszelle eine DNA Sequenz nach Anspruch 2 enthält; und b) Isolieren des Interferons aus Huhn.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus Escherichia coli, einer Insektenzelle oder einer CHO Zelle.
Verwendung des isolierten Gens nach Anspruch 1 oder der DNA Sequenz nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Vorbeugung von viralen und/oder parasitischen Infektionen bei Geflügel.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Medikament geeignet ist zur oralen, parentalen, oder genetischen Immunisierung oder zur Verabreichung als Aerosol.
Transgenes Geflügel, wobei dessen Keimbahn Zellen und/oder somatischen Zellen die DNA Sequenz nach Anspruch 2 enthalten, wobei die Interferon DNA aus Huhn in einem embryonalen Stadium eingeführt wird und die Transkription der Interferon DNA aus Huhn unter der Kontrolle einer Promotorsequenz steht, die unterschiedlich ist von der Promotorsequenz, die die Transkription der endogenen Interferonen DNA kontrolliert.
Transgenes Geflügel nach Anspruch 7, worin: a) ein Chromosom des Geflügels eine endogene kodierende Sequenz, die die gleiche ist wie die kodierende Sequenz der Interferon DNA aus Huhn umfasst und ggf. worin b) die Promotorsequenz, die die Transkription der Interferon DNA aus Huhn kontrolliert, ein Metallothionein Promotor aus Huhn ist.
Verfahren zur Herstellung von transgenem Geflügel umfassend: a) Einführen und Einbauen eines isolierten Gens nach Anspruch 1 oder einer DNA Sequenz nach Anspruch 2 in einem embryonalen Stadium eines Geflügels; und b) Inkubieren des embryonalen Stadiums unter Bedingungen, die notwendig sind für die Entwicklung des Geflügels.
Verfahren nach Anspruch 9 wobei in Stufe a): das isolierte Gen oder die DNA Sequenz durch einen retroviralen Vector eingeführt wird, der dadurch gekennzeichnet ist, das mindestens ein Replikationsgen deletiert ist, oder b) das isolierte Gen oder die DNA Sequenz durch Mikropartikelbombardierung eingeführt wird.
Verfahren zur Herstellung von transgenem Geflügel umfassend: a) Beschichten oder Imprägnieren eines isolierten Gens nach Anspruch 1 auf einem Mikropartikel; b) Verbringen des beschichteten Mikropartikels in eine Zelle oder eine Vielzahl von Zeilen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Geflügelsperma, Ei, Zygote oder Embryo; c) falls nötig Befruchten des Eis, woraus ein embryogenes Geflügel resultiert, welches das isolierte Gen eingebaut besitzt; und d) Inkubieren des embryonalen Geflügels unter Bedingungen, welche notwendig sind für die Entwicklung des Geflügels.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei: a) das isolierte Gen weiterhin eine Promotorsequenz umfasst, welche unterschiedlich ist von der Promotorsequenz, die die Transkrip tion der endogenen Interferon DNA kontrolliert, und ggf. wobei: b) die Promotorsequenz, die die Transkription des Gens kontrolliert, ein Metallothionein Promoter aus Huhn ist.
Eine Interferon cDNA Sonde aus Huhn, welche mindestens ein 20 Basenpaar langes Segment aus SEQ ID NO 1 umfasst, und welche an die komplementäre Sequenz binden wird, oder eine cDNA Sonde für Interferon aus Huhn, welche die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO 3 besitzt.
Plasmid, umfassend: Eine DNA Sequenz, wobei die DNA Sequenz die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO 1 besitzt, und eine Promotorsequenz, welche funktionell mit der DNA Sequenz der Nukleotidsequenz aus SEQ ID NO 1 verbunden ist, und wobei die Promotorsequenz unterschiedlich ist von der Promotorsequenz, die die Transkription von endogener Interferon DNA kontrolliert und worin ggf. die Promotorsequenz, die die Transkription der DNA Sequenz mit der Nukleotidsequenz aus SEQ ID NO 1 kontrolliert, ein Metallothionein Promotor aus Huhn ist.