DE69631962T2

DE69631962T2 - Verfahren zur modulation der zell-apoptose

Info

Publication number: DE69631962T2
Application number: DE69631962T
Authority: DE
Inventors: Jo Van Damme; Paul Proost; Frederic Houssiau; Jean-Christophe Renauld
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1995-09-12
Filing date: 1996-09-04
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2016-09-05
Also published as: EP0850319A4; JPH11513367A; ATE262594T1; EP0850319A1; WO1997010361A1; EP0850319B1; CA2231433A1; DE69631962D1; AU6966596A; AU711011B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines menschlichen antiapoptotischen Faktors, welcher ein Chemokin ist. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung des β-Chemokins I–309 als antiapoptotischen Faktor.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Chemokine sind eine Unterklasse von Zytokinen. Zytokine sind Regulationsproteine, die durch weiße Blutzellen und durch eine Vielzahl von anderen Zellen im Körper ausgeschieden werden. Die pleiotropischen Wirkungen von Zytokinen beinhalten eine Vielzahl von Wirkungen auf Zellen im Immunsystem und die Modulation von Entzündungsantworten "The Cytokine Handbook", 2. Ausgabe, 1994, Hrsg. A. Thompson, Academic Press, S. 4). Chemokine sind eine Überfamilie von proinflammatorischen Cytokinen. Die Chemokinfamilie besteht aus zwei Zweigen. Bei den α-Chemokinen sind die ersten zwei Cysteine durch einen einzelnen Aminosäurerest (C-X-C) getrennt (z.B. IL–8 und Plättchenfaktor-4), wohingegen bei β-Chemokinen, so wie TCA–3, die ersten zwei Cysteine aneinander angrenzen (C–C) (Laning et al., 1994, J. Immunol. 153: 4625–4635). Moleküle in dieser Familie teilen wenigstens eine 25%ige Aminosäurehomologie, haben ähnliche Strukturen und binden an sieben-Transmembran-übergreifende Rezeptoren der Rhodopsin-Überfamilie. Die Gene, die für die α-Chemokine codieren, sind auf dem human Chromosom 4 angeordnet, und die Gene, die für die β-Chemokine codieren, sind auf dem humanen Chromosom 17 angeordnet.
Von den β-Chemokinen wurde das murine Protein TCA-3 ursprünglich durch Burd et al. beschrieben. (1987, J. Immunol. 139: 3126–3131) . Dessen cDNA wurde aus einer T-Zell-Helferklonbibliothek kloniert unter Verwendung einer Strategie, die auf das Identifizieren von Genen gerichtet war, deren Expression bei der Stimulierung induziert wird. Zwei Jahre später haben Brown et al. (1989, J. Immunol. 142: 679–687) auf ähnliche Art und Weise eine cDNA identifiziert, die P500 genannt wird, welche identisch zu TCA-3 ist, außer einer 99-Nukleotidinsertion, welche durch ein alternative Spleißen in 8% der cDNA-Klone gebildet wurde, die sie analysiert haben. In dieser Publikation wurde TCA–3/P500 ebenso SISe genannt (Small Inducible Secreted protein). Die Sequenz des humanen I–309 wurde durch Miller et al. berichtet (1989, J. Immunol. 143: 2907–2916). Dessen cDNA wurde aus einer IL-2-abhängigen T-Zellinie unter Verwendung einer ähnlichen Strategie isoliert, wie in den vorangegangenen Publikationen für TCA–3 und P500 berichtet. Die Sequenz eines genomischen Klons wurde später durch Miller et al. berichtet (1990, J. Immunol. 145: 2737–2744), und es wurde gezeigt, daß sich das Gen auf dem humanen Chromosom 17 befindet, wie für ein β-Chemokin erwartet wurde. Die genomische Struktur unterstützt die Ansicht, daß TCA-3 das murine Homolog von I–309 ist.
Es gibt drei publizierte Berichte, die die Aktivität eines Beispiels eines β-Chemokins berichten, d.h. humanes I–309 und das murine Homolog TCR–3. Diese sind hierin zitiert. In dem ersten Bericht haben Wilson et al. (1990, J. Immunol. 145:2745–2750) rekombinantes murines TCA–3 in CHO-Zellen hergestellt. Sie zeigten, daß die intradermale Injektion dieses Materials in die Fußballen von Mäusen in einem schnellen Anschwellen als Antwort resultiert, histologisch gekennzeichnet durch eine lokale Ansammlung von Neutrophilen.
In dem zweiten Bericht stellten Miller et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2950–2954) rekombinantes humanes I–309 in CHO-Zellen her und zeigten in vitro, daß aufgereinigtes I–309 die Migration von humanen Monozyten, aber nicht von Neutrophilen stimulierte. Von I–309 wurde ebenso gezeigt, daß es einen transienten Anstieg in zytoplasmatischem freiem Calcium in Monozyten, aber nicht in Neutrophilen oder Lymphozyten induzierte. Die chemotaktische Aktivität erforderte eine 10 nM-Konzentration (ungefähr 150 ng/ml), um detektierbar zu sein. Eine maximale Wirkung wurde bei 100–300 nM und eine halbmaximale Aktivität bei ungefähr 20 nM gefunden.
Laning et al. (1994, J. Immunol. 153: 4625–4635) zeigten, daß ein Maustumor, der TCA–3 exprimierte, dessen Tumorgenizität verlor, wahrscheinlich als ein Ergebnis der Antitumorimmunantwort, folgend auf die Attraktion von Neutrophilen und Makrophagen an den Tumorort.
Luo et al. (1994, J. Immunol. 135: 4616–4624) berichten ebenso die proinflammatorische Aktivität von TCA–3 durch Chemotaxe von Neutrophilen und Makrophagen. Weder in Laning et al. noch in Luo et al. ist die antiapoptotische Aktivität von I–309 offenbart.
Wie vorher erwähnt, wurde das humane β-Chemokin I–309 zunächst 1989 durch Miller et al. beschrieben (1989, J. Immunol. 143: 2907–2916). Die Aminosäure- und cDNA-Sequenzen sind darin beschrieben, gemeinsam mit anderen strukturellen Eigenschaften, so wie einer kleinen Polypeptidkette einschließlich einer hydrophoben leitenden Sequenz (Leadersequenz), von welcher vermutet wurde, daß sie bei der Sekretion des entsprechenden Proteins involviert ist. Die Funktion des Proteins war zu diesem Zeitpunkt unbekannt, aber es wurde vorgeschlagen, daß es aufgrund der Natur des Proteins, d.h. dessen relativ kleiner Größe, Ausscheidung durch T-Zellen und anderer gewisser struktureller Eigenschaften, ein Zytokin von unbekannter Funktion war. Es wurde nun herausgefunden, daß gewisse β-Zytokine, einschließlich P500 und TCR-3, I–309, eine antiapoptotische Aktivität zeigen, wenn sie mit dem bekannten antiapoptotischen Mittel IL–9 verglichen werden, das als ein starker antiapoptotischer Faktor für thymische Lymphomazellinien beschrieben wird. Wenn man die wirksame chemotaktische Konzentration dieser Proteine, die infra diskutiert wurden, in Erwägung zieht, schließt man, daß sie starke antiapoptotische Mittel sind. Darüber hinaus, angesichts der strukturellen Ähnlichkeiten zwischen Mitgliedern der β-Chemokingruppe und ebenso der funktionalen Ähnlichkeiten, das heißt, daß von unterschiedlichen Chemokinen gezeigt wurde, daß sie an denselben Rezeptor binden, wird in Erwägung gezogen, daß andere Mitglieder der β-Chemokingruppe ebenso antiapoptotische Aktivität aufzeigen werden. Die folgenden Referenzen stellen Details der β-Chemokingruppe zur Verfügung und heben somit die Ähnlichkeit zwischen den Mitgliedern derselben hervor. T. J. Schall (1991, Cytokine 3: 165–183); und Schall (1994, "The Cytokine Handbook", 2. Ausgabe, Hrsg. A. Thompson, Academic Press, S. 419–460).
"Apoptose", wie hierin verwendet, beschreibt eine Art von Zelltod. Insbesondere beschreibt sie den programmierten Zelltod, wo im normalen Verlauf der Entwicklung Zellen auf eine vorhersagbare und geordnete Art und Weise sterben und sich abbauen. Beispielsweise tendieren solche Zellen dazu, innerhalb ihrer Membran zu schrumpfen, und ihre DNA wird in Nukleosome für die sichere Entfernung von Zellen des Immunsystems und insbesondere weiße Blutzellen gebrochen.
Die wissenschaftliche Gemeinschaft erkennt erst jetzt die klinische Wichtigkeit von Apoptose und beginnt daher erst jetzt mit der Investition in die Forschung, die ein besseres Verständnis des Prozesses und darüber, wie der Prozeß vorteilhafterweise manipuliert werden kann, um entweder den Zelltod zu fördern oder, in einigen Fällen, den Zelltod zu verhindern, zur Verfügung stellt.
Es gibt viele Beispiele von Zuständen und Pathologien, in denen Apoptose eine Rolle spielt.
Herzanfälle sind typischerweise gekennzeichnet durch den Tod von Herzzellen, und es folgt daher, daß Faktoren, die diesen Zelltod mäßigen oder ihn verhindern, zum Vorteil verwendet werden könnten, um gegen die Konsequenzen dieses Umstandes zu schützen. Zusätzlich könnten solche Faktoren ebenfalls zum Vorteil bei einem Chemotherapie-induziertem Herzgewebeschaden oder bei einem Schlaganfall-induziertem Gewebeschaden oder sogar bei Nierenversagen verwendet werden. Die Verwendung solcher Faktoren wäre insbesondere vorteilhaft, wenn ein Individuum eine Geschichte von Herzattacken oder Schlaganfällen aufweist oder sogar zu einer Familie mit solch einer Geschichte gehört.
Chemotherapie und Strahlentherapie induzieren ebenso andere Formen von Gewebeschäden, und es folgt daher, daß die gleichzeitige Verabreichung oder die nacheinander abfolgende Verabreichung von Chemotherapie oder Strahlentherapie mit einem antiapoptotischen Faktor vorteilhaft verwendet werden kann, um diesen weitverbreiteten Schaden abzumildern oder um ihm vorzubeugen.
Zusätzlich spielt verfrühte und weitverbreitete Apoptose vielfach eine Rolle bei dem Schaden, der mit dem Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) in Verbindung steht. Es wird vermutet, daß Apoptose ein wesentlicher Todesgrund bei nichtinfizierten T-Zellen bei AIDS-Patienten sein kann, der letztendlich zur Unterdrückung des Immunsystems des Patienten führt. Daher können Faktoren, welche diese Form des Zelltods abmildern oder ihr vorbeugen, eine Rolle beim Vorbeugen des Schadens zu spielen haben, den das AIDS-Virus bei nichtinfizierten Zellen verursacht.
Zelltod tritt ebenso in Zellen bei Ischämie auf, und daher können die Faktoren der Erfindung ebenso eine Rolle beim Abmildern oder beim Vorbeugen der Apoptose in ischämischen Organen zu spielen haben.
Zusätzlich zu den Verwendungen zur Abmilderung oder zur Vorbeugung der apoptotischen Aktivität ist es ebenso offensichtlich, daß eine der Auswirkungen der Offenbarung die Fähigkeit ist, apoptotische Aktivität zu fördern, wenn dies erwünscht ist. Beispielsweise kann die Realisierung, daß Chemokine und insbesondere β-Chemokine, so wie I–309, und deren Homologe in anderen Spezies eine Rolle beim Vorbeugen der Apoptose zu spielen haben, vorteilhaft bei der Herstellung von Mitteln verwendet werden, die selektiv an diesen Faktor binden, und daher dessen antiapoptotische Funktion unterdrücken und dadurch Zelltod fördern. Natürlich auftretende, künstliche oder synthetische Mittel können verwendet werden. Beispielsweise können monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen den Faktor hergestellt werden und können dann verwendet werden, um an denselben gebunden zu werden mit dem Zweck, dessen antiapoptotische Wirkung zu unterdrücken oder auszulöschen. Daher können Mittel, welche selektiv an den antiapoptotischen Faktor binden, verwendet werden, um Apoptose zu fördern und können darüber hinaus, unter Bezugnahme auf die gezielte Übertragung solcher Mittel, verwendet werden, um selektiv die Apoptose von erkranktem Gewebe zu fördern.
Es kann vorteilhaft sein, Apoptose zu fördern, um die Tumorentwicklung zu unterdrücken oder um sie umzukehren. In dieser Hinsicht ist es bemerkenswert, daß antiapoptotische Faktoren, beispielsweise das Produkt des bcl-2-Gens, welches für ein zytoplasmatisches Protein codiert, das gegen Apoptose schützt, ohne selbst die Proliferation zu induzieren, in einige Arten von Tumoren involviert sind, wie gezeigt wurde.
Zusätzlich zu dem obigen kann die Offenbarung ebenso bei Medikamenten-Screeningassays verwendet werden. Beispielsweise kann das Identifizieren von Chemokinen, insbesondere β-Chemokinen, in unterschiedlichen Teilen des Körpers, entweder direkt oder indirekt, verwendet werden, um Apoptose verschiedenen Körperteilen zuzuordnen, und somit können Gebiete, Regionen oder Organe, von denen es am wahrscheinlichsten ist, daß sie an dem Zelltod leiden, für Medikamenten-Screeningzwecke identifiziert werden. Zusätzlich kann die Wirksamkeit von Apoptose-unterstützenden Mitteln und ebenso von Mitteln, die als β-Chemokine agieren, insbesondere I–309-Antagonisten, durch Beobachten der Aktivität solcher Mittel in der Gegenwart des Faktors der Erfindung genauer bestimmt werden. Zusätzlich kann die Offenbarung ebenso verwendet werden, um Zellwachstum und Proliferation zu unterstützen, und kann daher verwendet werden, um proliferatives Gewebe für Medikamenten-Screeningassays zur Verfügung zu stellen.
Der volle Umfang der Erfindung, wie in den anhängenden Ansprüchen definiert, wird vollständiger unter Berücksichtigung der Offenbarung, welche folgt, verstanden werden:
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A zeigt die antiapoptotische Aktivität von verschiedenen Zellüberständen.
1B zeigt den IL-6-Gehalt der Überstände aus 1A.
2 zeigt die Inhibierung der Aktivität von einigen, aber nicht von allen Fraktionen von aktivierten CRL8066-MoT-Überständen durch den IL-6-Antikörper.
3 zeigt die genaue Fraktionierung von IL–6 und die antiapoptotische Aktivität auf Phenylsepharose.
4A zeigt die abschließende Aufreinigung des antiapoptotischen Faktors auf einer Resource S-Säule an.
4B stellt die Ergebnisse eines Aktivitätsassays von verschiedenen Säulenfraktionen dar.
4C ist ein SDS-Gel von verschiedenen Fraktionen.
5A zeigt antiapoptotische und chemotaktische Aktivitäten von aufgereinigtem I–309 auf BW5147-Zellen, wenn Dexamethason vorhanden ist, während 5B dessen Aktivität in humanen THP1-Monozyten zeigt.
6A führt Daten aus, welche zeigen, daß BW5147-Zellen proliferierten, wenn sie mit rekombinantem I–309, exprimiert in COS-Zellen, induziert wurden, während 6B Proliferung zeigt, wenn durch rekombinantes TCA 3 in der Gegenwart von Dexamethason stimuliert wurde.
7A führt Nachweise von der antiapoptotischen Aktivität auf BW5147-Zellen aus.
7B stellt elektrophoretische Daten von DNA, die aus BW5147-Zellen extrahiert wurde, kultiviert in DEX mit oder ohne rekombinantem I–309, dar.
8A und 8B stellen Daten dar, die die Inhibierung von I–309-induzierter Proliferierung in der Gegenwart von Bortadella Pertussis-Toxin zeigen.
9 zeigt die antiapoptotische Aktivität von I–309 auf die thymischen Lymphomazellinien 9T4A2 und NM3T2, folgend auf die Aussetzung gegenüber Dexamethason.
10 vergleicht die antiapoptotische Wirkung von verschiedenen Chemokinen.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfindung betrifft die antiapoptotische Aktivität des β-Chemokins I–309: Kurz gesagt, die Untersuchungen, die hierin beschrieben sind, zeigen, daß murine thymische Lymphoma dazu bewegt werden können, daß sie signifikante proliferative Aktivität und/oder ein Überleben in der Gegenwart des Faktors I–309 beibehalten. Die antiapoptotische Aktivität des Faktors ist signifikant dahingehend, daß die halbe maximale antiapoptotische Aktivität mit einer Konzentration von nur 1,6 ng/ml erhalten wurde. Diese Konzentration ist bemerkenswert geringer (200 mal geringer) als die Konzentration, die für monozytische chemotaktische Aktivität dieses Moleküls erforderlich ist, was suggeriert, daß die primäre Funktion dieses Moleküls die Unterdrückung von Zelltod sein könnte.
Bei den folgenden Daten wird insbesondere Referenz auf BW5147-murinthymische Lymphoma gemacht. Jedoch ist zu bemerken, daß ähnliche Aktivität ebenso für zwei andere Lymphomazellinien erzielt wurde, d.h. 9T4A2 und NM3T2.
Materialien und Methoden
Zellkulturen, Zytokine und andere Reagenzien
Die thymische Lymphomazellinie BW5147 (Ralph et al., 1973, J. Immunol. 110: 1470) wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten. Die NM3T2-Zellinie wurde aus einer DBA-2-Maus etabliert, die mit N-Methyl-N-nitrosoharnstoff (MNU) behandelt wurde, und 9T4A2 aus einer thymischen Lymphoma, die spontan in einer IL-9-transgenen Maus auftrat, die das IL-9-Transgen (Renauld et al., 1994, Oncogene 9: 1327) verloren hatte. Diese Zellen wurden in Iscove's Medium kultiviert, angereichert mit 10%igem fötalem Kalbsserum, 1,5 mM L-Glutamin, 0,24 mM L-Asparagin, 0,55 mM L-Arginin und 50 µM 2-Mercaptoethanol.
Die NK-Zellen Leukämie YT und die T-Zellen Leukämie MoT/CRL8066 (Chen et al., 1983, Nature 305: 502–505) wurden von ATCC erhalten. Mo7E megakaryoblastische Leukämie (Avanzi et al., 1988, Br. J. Haematol. 69: 359-366) wurde erhalten von Dr. L. Pegoraro (University of Perugia). 5B12 und E5 sind humane T-Zellklone, abgeleitet von Blutlymphozyten von gesunden Individuen, und wachsen in der Gegenwart von PHA oder allogenen Feederzellen, PHA, IL–2 und IL–4.
Murines IL–9 wurde durch die Expression in Baculovirus produziert und durch Affinitätschromatographie in unserem Labor aufgereinigt. Sättigende Dosen (200 U/ml) wurden in jedem Experiment verwendet. Rekombinates TCA–3 wurde erworben von R&D Laboratories und Pertussis Toxin war von BIOMOL (Plymouth Meeting, PA). Dexamethason (DEX) wurde erhalten von Sigma und in einer 0,25 µM-Konzentration in allen Experimenten verwendet. Der Ratten-Antimurin-IL-6-Rezeptor, 15A7 (Coulie et al., 1990, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 166: 43–46), und Maus-antihumane IL–6, AH 64 (Brailly et al., 1994, Clin. Chem. 40: 116–123) Antikörper wurden in einer Konzentration von 50 µg/ml bzw. in einer 1/100-Verdünnung von Aszitesfluid verwendet.
Der 7TD1-Bioassay, der verwendet wurde, um IL-6 zu messen, wurde wie vorher beschrieben ausgeführt (Van Snick et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9679-9683). Kurz gesagt wurden 2 × 10³ 7TD1-Zellen in Mikrowells gesät und vier Tage lang in der Gegenwart von seriellen Verdünnungen der Überstände kultiviert. Die Proliferation wurde evaluiert durch kolorimetrische Bestimmung von Hexosamindiasespiegeln, wie beschrieben durch Landegren et al., 1984, Cytokine 3: 165–183.
Antiapoptotische Bioassays
Die Zellebensfähigkeit wurde bestimmt unter Verwendung eines Propidiumiodidinkorporierungsassays, wie beschrieben (Lee et al., 1993, J. Immunol. 151: 5208).
Kurz gesagt wurden die Zellen 30 Minuten mit Propidiumiodid (125 µg/ml) bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die FACS-Analyse mit einem FACScan^TM-Flußzytometer (Becton-Dickinson) ausgeführt wurde. Unter diesen Umständen werden tote Zellen leuchtend gefärbt, während dies bei lebenden Zellen nicht der Fall ist. Ein Minimum von 5000 Zellen wurde pro Probe gezählt.
Um den Einfluß von Zytokinen auf die Proliferation in der Gegenwart von DEX zu testen, wurden BW5147-Zellen dreifach in Mikrotiterwells in der Gegenwart von DEX in einer finalen 0,25 × 10^–6 molaren Konzentration mit oder ohne Zytokine in einem 200 µl-Volumen inkubiert. Die Kulturen wurden 2–4 Tage später 6 h lang mit 0,5 µCi ³H-Thymidin gepulst. Alternativ wurde die Zellproliferation durch einen Hexosaminidase-Assay gemessen; wie beschrieben (Uyttenhove et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6934).
Aufreinigungsverfahren
MoT/CRL8066, ein Haarzellenleukämie-T-Typ, wurde in RPMI-1640-Medium kultiviert, angereichert mit 10% hitzeinaktiviertem FCS (56°C, 30 min), 0,55 mM L-Arginin, 0,24 mM L-Asparagin und 1,25 mM L-Glutamin. Für die Herstellung von großen Mengen wurden die Zellen gewaschen, in demselben Medium, enthaltend 5% FCS, resuspendiert und bei einer Konzentration von 5 × 10⁵ Zellen/ml mit PMA (50 ng/ml) (Sigma) stimuliert. Nach dem Erhitzen für 30 Minuten bei 57°C, um den HTLV-II-Virus zu inaktivieren, wurden die Überstände mit Natriumphosphat, pH 7,0, gepuffert, und Ammoniumsulfat wurde bis zu einer finalen Konzentration von 1,2 M hinzugefügt. Diese Präparation wurde auf einer Phenyl-Sepharose-Schnellflußsäule (Pharmacia) bei 8 ml/min chromatographiert. Nach einer 500 ml-Waschung mit 1,2 M Ammoniumsulfat wurde aktives Material durch eine Zweischritt-Elution bei 3 ml/ml mit 1 Liter 0,7 M und 0,5 M Ammoniumsulfat rückgewonnen.
Nach der Konzentration wurde das Material in einen Natriumacetat 50 mM-Puffer, pH 5,5, enthaltend 0,01 (vol/vol) Tween 20, vor der Kationenaustauschchromatographie auf einem Sulfopropyl-Sepharose^TM-Schnellflußgel (Pharmacia) bei 3 ml/min übertragen. Nach Waschungen mit 100 ml desselben Puffers und mit 140 ml von 0,3 M NaCl in demselben Puffer wurde die Elution ausgeführt mit einem 300 ml linearen Gradienten von NaCl bis auf 1 M, wobei das aktive Material bei 0,5 bis 0,75 M NaCl eluiert wurde.
Die aktiven Fraktionen wurden konzentriert, in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 1 M NaCl und 0,01% (vol/vol) Tween 20, übertragen und auf einer Superdex^TM 70 Größenausschlußsäule (Pharmacia) fraktioniert. Das aktive Material (eluiert mit einem anscheinenden Molekulargewicht von 12–16 kD) wurde in 100 mM Na₂HPO₄-Puffer, pH 7,0, enthaltend 1 M Na₂SO₄, übertragen und auf eine TSK-Phenylsäule (LKB, Bromma, Schweden) mit 0,5 ml/min geladen. Nach einer 5-minütigen Waschung in dem Ausgangspuffer wurde die Elution ausgeführt mit 0,5 ml/min mit einem linearen Gradienten einer 1/1-Mischung aus Natriumphosphat (0,1 M, pH 7,0) und Ethylenglykol (von 0 bis 60% in 30 min), wobei das aktive Material bei 30% dieses Puffers eluiert wurde.
Die aktiven Fraktionen wurden in Natriumacetat 50 mM-Puffer, pH 5,5, enthaltend 0,01 (vol/vol) Tween 20 vor der Kationenaustauschchromatographie auf eine Sulfopropyl-Resource-S-Säule (Pharmacia) mit 0,8 ml/min übertragen. Die Elution wurde mit 0,8 ml/min mit einem 10-minütigen linearen Gradienten von NaCl auf 0,2 M ausgeführt, gefolgt durch einen 30-minütigen Gradienten auf 0,4 M NaCl, wobei das aktive Material bei 0,3 M NaCl eluiert wurde.
Die am meisten aktive Fraktion wurde daran angepaßt, 0,1% Trifluoressigsäure zu enthalten, und wurde weiterhin durch Umkehrphasenchromatographie auf einer Vydack C4-Säule analysiert. Die Säule wurde mit 0,8 ml/min mit einem 40-minütigen linearen Gradienten von 8 bis 56% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure entwickelt. Fraktionen wurden in Eppendorf-Röhrchen gesammelt, enthaltend 5 µl Tween 20 (1% in Wasser), lyophilisiert und resuspendiert in Na₂HPO₄-Puffer (50 mM, pH 7,0), bevor die antiapoptotische Aktivität getestet wurde.
cDNA-Klonieren und COS-Zelltransfektionen
Die codierende Sequenz von humaner I–309-cDNA wurde durch RT-PCR amplifiziert unter Verwendung von Gesamt-RNA, extrahiert von einem PHA-aktiviertem T-Zellklon (E5). Reverse Transkription wurde mit 5 µg Gesamt-RNA mit einem Oligo(dT)-Primer durchgeführt, wobei cDNA entsprechend 200 ng Gesamt-RNA 30 Zyklen lang durch PCR mit den folgenden spezifischen Primern amplifiziert wurde, in welche ein EcoRI-Ort inseriert war: sense 5'-TCCAGGAATTCCCAAGCCAGACCRGAA-3' (SEQ ID NO: 1) (von Position 19 der cDNA-Sequenz), antisense 5'-TTGTAGAATTCAAATGTTTAAAGTGCAACA-3' (SEQ ID NO: 2) (von Position 503 der cDNA-Sequenz). Das Amplifikationsprodukt wurde mit EcoRI verdaut und in den pCDSRα-Expressionsvektor (Takebe et al., 1988) kloniert. Die Nukleotidsequenz wurde durch das Dideoxynukleotidkettenterminierungsverfahren unter Verwendung des Taq-Zyklussequenziersystems (Amersham) mit ³²P-ATP-markierten Oligonukleotiden bestimmt, und kein Unterschied wurde zu der publizierten I-309-Sequenz beobachtet (Genbank-Zugangsnummer M57502) (Miller et al., 1989, J. Immunol. 143: 2907–2916).
Antiapoptotische Aktivität und IL-6-Gehalt von verschiedenen humanen Zellüberstanden (Figur 1)

A: Für den antiapoptotischen Assay wurden BW5147-Zellen (10³/well) 3 Tage lang in der Gegenwart von Dexamethason (DEX) (0,25 µM) mit oder ohne murines IL-9 (200 U/ml) oder 3,3% des Überstandes von der Mo7E-megakaryoblastischen Leukämiezellinie, MoT/CRL8066 T-Zell-Leukämiezellinie (stimuliert oder nicht stimuliert mit PMA und IL-2 für 3 Tage), der YT NK-Zell-Leukämie, stimuliert mit PMA und IL-2 oder 10% der T-Zell-Klonüberstände (5B12 und E5), inkubiert. Die Zellproliferation wurde evaluiert durch Messen der Thymidin-Miteinbeziehung, und Standardabweichungen wurden aus dreifachen Kulturen berechnet. In der Abwesenheit von DEX betrug die Thymidin-Miteinbeziehung 117, 947 ± 7,122 cpm.
B: Der IL-6-Gehalt der Überstände wurde durch den 7TD1-Bioassay gemessen, wie beschrieben. 1 U/ml entspricht der erforderlichen Konzentration für halbmaximale Proliferation (ungefähr 5 pg/ml für humanes IL–6).

Inhibierung der Aktivität einiger, aber nicht aller Fraktionen der aktivierten CRL8066-MoT-Überstände durch anti-IL-6-Antikörper (Figur 2)
BW5147-Zellen (10³/well) wurden 3 Tage in der Gegenwart von DEX (0,25 µM) mit oder ohne humanes IL–6 (500 U/ml) oder Aliquots von Elutionsfraktionen der Superose-Chromatographie inkubiert. Der Ratten-Antimurin-IL-6-Rezeptor, 15A7, und die Maus-antihuman-IL-6-Antikörper wurden mit einer Konzentration von 50 µg/ml bzw. in einer 1/100-Verdünnung von Aszitesfluid verwendet. Die Zellproliferation wurde durch das Messen der Thymidinaufnahme evaluiert, und Standardabweichungen wurden aus dreifachen Kulturen berechnet.
Genaue Fraktionierung von IL-6 und antiapoptotische Aktivität auf Phenylsepharose (Figur 3)
Die Überstände von PMA-stimulierten MoT/CRL8066-Zellen wurden 30 Minuten bei 57°C erhitzt, um den HTLV-II-Virus, gepuffert mit Natriumphosphat, pH 7,0, zu inaktivieren, bevor Ammoniumsulfat bis zu einer finalen Konzentration von 1,2 M hinzugefügt wurde und bevor auf eine Phenyl-Sepharose-Schnellflußsäule (Pharmacia) geladen wurde. Nach entsprechendem Waschen wurde eine Dreischritt-Elution mit 0,75, 0,5 und 0,0 M Ammoniumsulfat ausgeführt, und die Aktivität der Fraktionen wurde mit dem 7TD1-Assay für IL-6 und in dem BW5147-antiapoptotischen Assay evaluiert, wie in Material und Methoden beschrieben.
Finale Aufreinigung des antiapoptotischen Faktors auf einer Resource S-Säule und SDS PAGE-Gel (Figur 4)

A: Nach drei aufeinanderfolgenden Schritten der Trennung auf einem Phenylsepharosegel, auf einer Sulfopropyl-Säule und auf einer Superdex-Größenausschlußsäule wurden die aktiven Fraktionen fraktioniert durch Kationenaustauschchromatographie auf einer Sulfopropyl-Resource-S-Säule. Die Elution wurde mit einem NaCl-Gradienten ausgeführt, wie durch die gepunktete Linie angezeigt (Puffer B = 1M NaCl). Die optische Dichte (280 nm) des eluierten Materials (gestreifte Fläche) und die antiapoptotische Aktivität (geschlossene Quadrate) sind gezeigt. 1 U/ml antiapoptotische Aktivität wird willkürlich als die Konzentration definiert, die halbmaximalen Schutz gegen DEX in dem BW5147-Bioassay zur Verfügung stellt, der in Materialien und Methoden beschrieben ist.
B: Während die Fraktionen aus der Resource S-Kationenaustauschsäule entfernt wurden, wurden sie hinsichtlich ihrer antiapoptotischen Aktivität mit dem antiapoptotischen Assay, der supra beschrieben ist, getestet. Die Ergebnisse, dargestellt in 4B, zeigen, daß die Elutionsfraktion 21 tatsächlich die Fraktion war, die die antiapoptotische Aktivität enthielt. Verschiedene der Fraktionen wurden einer Standard-SDS-PAGE-Analyse ausgesetzt, und die Ergebnisse sind in 4C gezeigt.

Antiapoptotische und chemotaktische Aktivitäten von aufgereinigtem I–309 (Figur 5)

A: BW5147-Zellen (10³/well) wurden 3 Tage in der Gegenwart von DEX (0,25 µM) mit oder ohne serielle Verdünnungen der Fraktion 21 der Resouce S-Chromatographie, die in 4 gezeigt ist, inkubiert. Die Zellproliferation wurde eingeschätzt durch einen kolorimetrischen Hexosaminidase-Assay. Die I–309-Konzentrationen wurden von der mikrosequenzierenden Analyse abgeleitet.
B: Das gleiche Verfahren wurde in einem chemotaktischen Assay verwendet unter Verwendung der humanen THP1-monozytischen Zellinie (geschlossene Symbole). Die Resultate sind als chemotaktische Indizes angegeben. Aufgereinigtes humanes MCP-3 wurde als positive Kontrolle für diesen Assay verwendet (offene Symbole).

Proliferation von BW5147-Zellen, induziert durch rekombinantes I–309, exprimiert in COS-Zellen, und durch rekombinantes TCA–3 in der Gegen wart von Dexamethason (Figur 6)

A: BW5147-Zellen (10³/well) wurden 3 Tage lang in der Gegenwart von DEX (0,25 µM) mit oder ohne eine 1/15-Verdünnung des Überstandes von COS-Zellen, transfiziert mit der I–309-cDNA oder einem Kontrollplasmid, inkubiert. Die Zellproliferation wurde evaluiert durch Messen der Thymidinaufnahme, und Standardabweichungen wurden aus dreifachen Kulturen berechnet.
B: Die antiapoptotische Aktivität von seriellen Verdünnungen von rekombinantem murinem TCA–3 wurde gemessen, wie in A beschrieben. Weitere Arbeit wurde dann ausgeführt unter Verwendung von rekombinantem I–309 mit BW5147-Zellen. Bei diesen Experimenten wurden die BW5147-Zellen (nochmal 10³/well) 3 Tage lang in der Gegenwart von 0,25 mM DEX entweder mit oder ohne aufgereinigtes rekombinantes I–309 (50 ng/ml) inkubiert. Durch Messen der Thymidinaufnahme wurde die Zellproliferation evaluiert. Dreifache Kulturen wurden verwendet, um die Daten zu entwickeln und um Standardabweichungen zu berechnen. Die Daten sind in 7A dargestellt. In 7B sind die Resultate der Elektrophorese der DNA gezeigt, die aus BW5147-Zellen extrahiert wurde, welche 24 Stunden lang in der Gegenwart von DEX mit oder ohne 400 ng/ml des rekombinanten I–309 kultiviert worden sind.

Inhibierung durch Pertussis-Toxin von I–309-induzierter Proliferation von BW5147-Zellen in der Gegenwart von Dexamethason (Figur 8)
BW5147-Zellen (10³/well) wurden 3 Tage lang in der Gegenwart von DEX (0,25 µM) mit oder ohne eine 1/15-Verdünnung des Überstandes von COS-Zellen, transfiziert mit der I–309-cDNA oder mit einer sättigenden Konzentration von mIL–9 (200 U/ml), inkubiert. Die Zellproliferation wurde evaluiert durch Messen der Thymidinaufnahme, und Standardabweichungen wurden aus dreifachen Kulturen berechnet.
In einem ähnlichen Experiment wurde DEX mit 0,25 mM mit oder ohne 5% aktivierten Mo-Zell-Überstand und mit oder ohne B. pertussis-Toxin (2,5 ng/ml) oder antihumanem IL–6 mAB AH65 (Aszitesfluid, 0,5%) hinzugefügt. Die Thymidinaufnahme ist in 8B gezeigt.
Antiapoptotische Aktivität von I–309 für 9T4A2 und NM3T2-thymische Lymphomazellinien, die gegenüber Dexamethason ausgesetzt waren (Figur 9)
Die Zellen wurden mit Dexamethason in der Gegenwart oder der Abwesenheit von I–309 (100 U/ml) oder IL-9 (500 U/ml) 20 h lang inkubiert. Die Zellebensfähigkeit wurde gemessen durch FACS-Analyse nach dem Färben mit Propidiumiodid, wie in Material und Methoden beschrieben.
Eine Serie von Experimenten wurde ausgeführt, in welchen die antiapoptotische Aktivität von verschiedenen humanen Chemokinen auf BW5147 getestet wurde. In jedem Fall wurden BW5147-Zellen (10³/well) drei Tage lang in der Gegenwart von DEX (0,25 mM) entweder mit oder ohne I–309 (40 ng/ml), MCP–1 (25 ng/ml), MCP–2 (250 ng/ml), MCP–3 (250 ng/ml), RANTES (250 ng/ml), IL-8 (125 ng/ml), NAP–2 (125 ng/ml, Granulozyten-chemotaktisches Protein –2 (250 ng/ml) und Makrophagen-inflammatorisches Protein 1a (125 ng/ml) inkubiert. Die Zellproliferation wurde in einem Thymidinaufnahmeassay unter Verwendung von Dreifachkulturen gemessen, wie supra beschrieben. 10 stellt diese Ergebnisse dar.
Resultate
Identifizierung von antiapoptotischer Aktivität in humenen T-Zell-Überständen, die von IL-6 verschieden ist
In einem vorherigen Bericht wurde gezeigt, daß murine thymische Lymphoma BW5147 gegen Dexamethason-induzierte Apoptose durch IL-9, IL-4 und in einem geringen Ausmaß durch IL-6 geschützt sind. Im Gegensatz dazu waren IL–1, IL-2, IL-7, IL-10, IL-13, IFNγ und TNFα in diesem Assay nicht aktiv (Renauld et al., 1995, Blood 85: 1300–1305), ebenso wie IL3, IL-11, LIF, GM-CSF und Steel Factor (unpublizierte Daten). Da humanes IL-9 und humanes IL-4 bei murinen Zellen nicht aktiv sind, haben wir diesen Bioassay verwendet, um eine Serie von humanen Überständen für eine andere antiapoptotische Aktivität zu screenen. Da humanes IL-6 bei murinen Zellen aktiv ist, haben wir simultan die IL-6-Titer dieser Überstände gemessen. Wie in 1A gezeigt, wurde eine Proliferation der BW5147-Zellen, die in der Gegenwart von Dexamethason kultiviert wurden, mit murinem IL-9 beobachtet, aber ebenso mit einigen humanen Zellüberständen, so wie denjenigen von aktivierten T-Zell-Leukämie (CRL8066-MoT) oder von CD4+ T-Zell-Klonen (5B12, E5). Interessanterweise war diese Aktivität nicht strikt mit der Konzentration von IL-6 in diesen Überständen, wie gezeigt in 1B, korreliert. Auch wenn der potenteste Überstand (aktiviertes CRL8066-MoT) große Mengen IL-6 enthielt, waren andere aktive Proben (5B12- und E5-Überstände) im wesentlichen frei von IL-6, was suggerierte, daß ein Faktor, der von den vorher untersuchten Zytokinen verschieden war, BW5147-Zellen gegen Dexamethason-induzierte Apoptose schützen konnte.
Um diesen putativen Faktor von IL-6 weiterhin zu unterscheiden, wurden CRL8066-MoT-Zellüberstände, konzentriert durch Adsorption an Sulfopropyl-Sephadex-Perlen, auf einem Größenausschlußgel durch FPLC chromatographiert. Dies Experiment zeigte, daß ein Faktor, der eine geringere Größe hatte als IL-6 und der durch antihumane IL-6- oder anti-Maus-IL-6-Rezeptor-Antikörper nicht inhibiert wurde, bei diesem Assay ebenso aktiv war (2). Diese Schlußfolgerung wurde durch Ergebnisse bestätigt, die durch eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie auf Phenylsepharose erhalten wurden. Wie in 3 gezeigt, wurde die hauptsächliche antiapoptotische Aktivität bei 0,75 M Ammoniumsulfat eluiert, während IL-6 nur mit 0,0 M Salz rückgewonnen wurde.
Aufreinigen und Mikrosequenzieren des Faktors, der für die antiapoptotische Aktivität verantwortlich ist
CRL8066-MoT-Zellen wurden produziert durch Stimulieren der Zellen mit einer Konzentration von 500.000 Zellen/ml mit PMA bei 50 ng/ml 3 Tage lang in einem Medium, das 5% FCS enthielt. Nach Chromatographie auf einer Phenyl-Sepharose-Säule wurde das Material auf einem Kationenaustauschgel bei pH 5 fraktioniert. Die aktiven Fraktionen wurden in einen neutralen Phosphatpuffer, enthaltend 1 M NaCl und eine 10^–4-Verdünnung von Tween 20, übertragen und einer Gelfiltrationschromatographie ausgesetzt. Die antiapoptotische Aktivität eluierte mit einem anscheinenden Molekulargewicht im Bereich von 10 bis 20 kD mit einem Peak bei 15 kD. Weitere Fraktionierung wurde ausgeführt durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie auf einer TSK-Phenylsäule, von welcher das aktive Material bei 0,7 M Na₂SO₄ und 15% Ethylenglykol eluierte. Schließlich wurden die aktiven Fraktionen bis zur Homogenität mit einer Resource S-Kationenaustauschsäule durch FPLC aufgereinigt. Die Resultate dieses letzten Chromatographieschrittes sind in 4 gezeigt, gemeinsam mit der entsprechenden SDS PAGE-Analyse der aktiven Fraktionen.
Die Reinheit dieser Präparation wurde durch die Tatsache bestätigt, daß die HPLC-Analyse der aktivsten Fraktion (Fraktion 21, siehe 4) einen einzelnen Proteinpeak zeigte, von welchem die antiapoptotische Aktivität erhalten wurde. Das Sequenzieren von 30 pmol des Proteins aus Fraktion 21 der Resource S-Säule (4) ergab die folgende 27-Aminosäuresequenz: NH₂-Lys-Ser-Met-Gln-Val-Pro-Phe-Ser-Arg-Cys-Cys-Phe-Ser-Phe-Ala-Glu-Gln-Glu-Ile-Pro-Leu-Arg-Ala-Ile-Leu-Cys-Tyr (SEQ ID NO: 3), welche vollständig identisch mit den Aminosäuren 1 bis 27 des β-Chemokins I–309 (Miller et al., 1989, J. Immunol. 143: 2907–2916; Miller et al., 1990, J. Immunol. 145: 2737–2744) war.
Vergleich der spezifischen Aktivität von I-309 in chemotaktischen und antiapoptotischen in vitro-Assays
Basierend auf Konzentrationen, die von der Mikrosequenzieranalyse abgeleitet waren, wurde die spezifische Aktivität von aufgereinigtem I–309 in dem antiapoptotischen Assay gemessen. Die maximale schützende Aktivität von BW5147-Zellen wurde mit einer Konzentration von 3 ng/ml erreicht (5A). Wenn man bei diesem Assay eine Einheit als die Konzentration definiert, die erforderlich ist, um halbmaximalen Schutz gegen Dexamethason zur Verfügung zu stellen, wäre eine Einheit äquivalent zu 1,65 ng/ml (ungefähr 100 pM). Interessanterweise wurde gefunden, daß diese spezifische Aktivität sich in einem ähnlichen Bereich befindet wie die von murinem IL-4 in dem gleichen Bioassay (Renauld et al., 1995, Blood 85: 1300–1305).
Dasselbe aufgereinigte Material wurde in einem chemotaktischen Assay unter Verwendung der humanen monozytischen Zellinie THP1 getestet. Wie in 5B gezeigt, erforderten signifikante chemotaktische Antworten auf I–309 bemerkenswert größere Konzentrationen. Ähnliche Resultate wurden unter Verwendung von normalen Monozyten erhalten (Daten nicht gezeigt). Zusammengefaßt zeigen diese Daten, daß die antiapoptotische Wirkung, von der hier berichtet wird, ein viel sensitiverer Assay ist und daß I–309 tatsächlich sehr viel wirksamer in vivo als ein antiapoptotisches Mittel sein könnte als als ein chemotaktischer Faktor.
Antiapoptotische Aktivität von rekombinantem I–309 und TCA–3
Um formal zu etablieren, daß die antiapoptotische Aktivität, die mit unserem aufgereinigten Material beobachtet wurde, dem I–309 zugeschrieben werden kann, wurde cDNA durch RT-PCR aus einem PHA-aktivierten T-Zellklon amplifiziert, in einen Expressionsvektor inseriert und in COS-7-Zellen transfiziert. Wie in 6 gezeigt, stimulierte der Überstand von I–309-transfizierten COS-Zellen stark die Proliferation von BW5147-Zellen in der Gegenwart von Dexamethason, während ein Kontroll-COS-Zellüberstand vollständig inaktiv war. Zusätzlich hatte Baculovirus-abgeleitetes TCA–3, das als das murine Homolog von I–309 angesehen wird, eine ähnliche Aktivität mit halbmaximaler Wirkung, beobachtet bei ungefähr 0,5 ng/ml.
Inhibierung von antiapoptotischer Aktivität von I-309 durch Pertussis-Toxin
Das Rezeptormolekül für I–309/TCA–3 wurde bis jetzt nicht identifiziert. Jedoch besteht jeder chemokine Rezeptor, der bis jetzt identifiziert wurde, aus einem Transmembranprotein mit sieben Transmembrandomänen, die das Signal durch G-Proteine übertragen. Da vom Pertussis-Toxin bekannt ist, daß es die Aktivierung, die durch eine Unterklasse dieser Rezeptoren vermittelt wird, stört, haben wir die Wirkung dieses Moleküls auf die antiapoptotische Aktivität von I–309 analysiert. Wie in 8 angezeigt, brach Pertussis-Toxin vollständig die Proliferation, induziert durch I–309 in der Gegenwart von DEX, ab, wenn BW5147-Zellen gegenüber Dexamethason in der Gegenwart von rekombinantem I–309 ausgesetzt waren. Im Gegensatz dazu inhibierte Pertussis-Toxin nicht die IL-9-induzierte Zellproliferation, was demonstrierte, daß vollständig unterschiedliche Mechanismen der Signalübertragung involviert sind. Diese Resultate suggerieren ebenso, daß Chemokinrezeptoren, die mit G-Proteinen in Verbindung stehen, eine unerwartete Rolle bei der Kontrolle des Zellüberlebens bei Apoptosefördernden Bedingungen spielen können.
Antiapoptotische Aktivität von I-309 auf andere thymische Lymphoma-Zellinien
Um zu sehen, ob die antiapoptotische Aktivität von I–309/TCA–3 auf andere thymische Lymphomazellinien ausgedehnt werden kann, haben wir die Aktivität von aufgereinigtem I–309 auf zwei andere Dexamethasonsensitive Zellinien, 9T4A2 und NM3T2, durch die Messung des Zelltods 20 Stunden nach dem Aussetzen gegenüber Dexamethason getestet. Wie in 9 gezeigt, wurde gefunden, daß I–309 beim Inhibieren der Apoptose in diesen Zellen genauso potent ist wie IL-9. Diese Ergebnisse suggerieren, daß die antiapoptotische Aktivität von I–309 ein gewöhnliches Phänomen für diese Arten von Tumorlinien sein kann.
Die vorangehenden Beispiele und die vorangehende Offenbarung beschreiben ein Verfahren zum Modulieren der Zellapoptose. In einem Aspekt der Offenbarung involviert die Modulation die Inhibition der Zellapoptose durch Verabreichen einer Menge eines β-Chemokins an eine Zellprobe in einer Menge, die ausreichend ist, um die Apoptose der Zellen in der Probe zu inhibieren. Insbesondere bevorzugt sind Proteine, welche I–309-Aktivität haben, einschließlich der Säugetieranaloga von I–309, so wie TCA–3, P500 usw., ebenso wie antiapoptotische Fragmente dieser β-Chemokine. Insbesondere bevorzugt sind Verfahren zum Inhibieren der T-Zell-Apoptose unter Verwendung der β-Chemokine auf die Art und Weise, die beschrieben ist. "Wirksame Menge", wie hierin verwendet, betrifft jegliche Menge der β-Chemokine, die ausreichend ist, um Zellapoptose zu inhibieren. Bevorzugt wird sich die Menge der β-Chemokine, die verwendet wird, im Bereich von ungefähr 0,1 ng/ml bis zu ungefähr 100 ng/ml bewegen. Besonders bevorzugt wird sich die dosierte Menge im Bereich von ungefähr 1,0 ng/ml bis zu ungefähr 3,0 ng/ml bewegen. Bei der Verwendung in vivo kann das Protein in Übereinstimmung mit jedem der normalerweise verwendeten therapeutischen Regime verwendet werden, so wie oral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intranasal oder intradermal, mit oder ohne einen Träger, Hilfsstoff oder zusätzliches Material, um den aktiven Inhaltsstoff vor der Zersetzung durch normale physiologische Prozesse zu schützen. Bei der Verwendung in vitro können Lösungen, Emulsionen usw. verwendet werden, um die Anwendungen des Materials zu vereinfachen.
Man kann ebenso Zellapoptose inhibieren, wie hierin angezeigt, durch die Verabreichung von Antagonisten von β-Chemokinen, so wie I–309-Antagonisten, an ein Subjekt. Wie angezeigt, können diese Antagonisten Antikörper sein, so wie polyklonale oder monoklonale Antikörper, lösliche Formen des I–309-Rezeptors und ebenso Derivate der β-Chemokine, welche ausreichende strukturelle Ähnlichkeiten zu den β-Chemokinen haben, um an β-Chemokinrezeptoren zu binden, aber die ausreichend unterschiedlich sind, so daß sie apoptotisch inert sind.
Andere Aspekte der Erfindung werden dem Fachmann klar sein und müssen hier nicht wiederholt werden.

Claims

Verwendung von β-Chemokin I–309 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Apoptose bei Herzanfall.
Verwendung von β-Chemokin I–309 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Apoptose bei Schlaganfall.
Verwendung von β-Chemokin I–309 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Apoptose bei Ischämie.
Verwendung von β-Chemokin I–309 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Chemotherapie-induzierter Apoptose.
Verwendung von β-Chemokin I–309 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Radiotherapie-induzierter Apoptose.
Verwendung von β-Chemokin I–309 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Apoptose bei Nierenversagen.
In vitro-Verfahren zur Apoptosehemmung, umfassend die Verabreichung von β-Chemokin I–309 an eine Zellkultur.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das β-Chemokin I–309 in einer Menge im Bereich von 0,1 ng/ml bis 100 ng/ml verabreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das β-Chemokin I–309 in einer Menge im Bereich von 1,0 ng/ml bis 3,0 ng/ml verabreicht wird.