CN116194474A

CN116194474A - 遗传性扩张型心肌病的治疗

Info

Publication number: CN116194474A
Application number: CN202180060972.8A
Authority: CN
Inventors: I·里夏尔; A·毕奎德
Original assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon
Current assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2021-06-09
Publication date: 2023-05-30
Also published as: WO2021250076A1; EP4162048A1; US20230265427A1; JP2023528663A; CA3185497A1

Abstract

本发明涉及使用Wnt途径或TGF‑β途径的可表达调节剂，优选使用基因转移来治疗遗传性扩张型心肌病。

Description

遗传性扩张型心肌病的治疗

技术领域

本发明涉及使用WNT途径或TGF-β途径的可表达调节剂，优选使用基因转移来治疗遗传性扩张型心肌病。

背景技术

扩张型心肌病(DCM或CMD)的特征在于心肌运动功能减退和心腔扩张。扩张型心肌病期间发生的心脏重塑包括与存在纤维化相关的心肌细胞损伤，它们彼此密不可分。对心肌细胞的损伤包括收缩能力的降低和结构的改变，这会导致细胞凋亡和纤维化的扩大，从而取代坏死的心肌细胞。成纤维细胞的增殖阻止了心肌细胞的代偿性肥大。这些表现在临床上将转化为心脏功能的下降。这种严重的并发症可能导致死亡。

可遗传模式存在于20％-30％的DCM病例中。大多数家族性DCM谱系显示常染色体显性遗传模式，通常出现在生命的第二个或第三个十年(由Levitas等人,Europ.J.Hum.Genet.,2010,18:1160-1165总结)。在杜兴氏肌营养不良症(DMD)中，其是一种由抗肌萎缩蛋白基因突变引起的肌肉疾病，临床上在15岁左右出现扩张型心肌病并且几乎影响所有20岁以后的患者。就贝克尔肌营养不良症(BMD)(DMD的等位基因形式)而言，心脏损伤在20岁时出现，并且70％的患者在35岁后受到影响。肌联蛋白(肌节的一种巨大蛋白质)引起的DCM与1/250例心力衰竭有关(Burke et al.,JCI Insight.2016；1(6):e86898)。

在遗传诱导的扩张型心肌病中，涉及的大部分基因编码心肌细胞的结构元件，包括涉及细胞粘附和信号传导途径的细胞外基质或高尔基体蛋白(层粘连蛋白、fukutin)；涉及细胞连接的桥粒蛋白(桥粒糖蛋白、斑珠蛋白)；涉及钙稳态的肌质网蛋白(RYR2、SERCA2a(ATP2A2)、受磷蛋白)；涉及心肌结构组织的核包膜蛋白(核纤层蛋白A/C)；涉及细胞骨架完整性和肌力传递的细胞骨架蛋白(肌营养不良蛋白、肌钙蛋白、α-辅肌动蛋白、结蛋白、肌聚糖)；以及涉及肌力的产生和传递的肌节蛋白(肌联蛋白、肌钙蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白)。

治疗方法是用于治疗获得性扩张型心肌病的那些，其也有效用于治疗遗传性扩张型心肌病，例如在DMD和肌联蛋白病的情况下。目前对于这些病理没有治愈性治疗。目前可用于治疗获得性扩张型心肌病的药物将改进症状但不治疗病因。开具的治疗是针对心力衰竭的那些治疗，伴随有卫生和饮食措施，例如减少酒精消耗、减少水和盐摄取以及适度和定期的体育锻炼。在药物治疗中，血管紧张素II转化酶抑制剂(ACE抑制剂)阻止血管紧张素II的产生以降低血管收缩和血压。利尿药通过抑制肾钠重吸收从体内除去过量的盐和水。β-阻断剂或β-肾上腺素能受体拮抗剂阻断扩张型心肌病期间刺激的肾上腺素能系统介质的作用并降低心率。盐皮质激素受体拮抗剂阻断醛固酮的结合并降低血压。当心律紊乱严重时，开具抗心律失常药物(如胺碘酮)。也可以考虑植入起搏器和/或自动除颤器。在最严重的病例中，患者可受益于心脏移植(Ponikowski et al.,European Heart Journal,2016,37,2129-2200)。

通常在DMD中开具的皮质类固醇治疗由于减少炎症而允许改进中期肌肉表型，但是其对心脏表型的作用是有争议的。与肌营养不良蛋白和肌联蛋白相关的DMD的治疗需要每年和系统的心脏检查(心电图和超声)。特别地，当作为从儿童期起的预防性治疗时，培哚普利(一种血管紧张素转化酶抑制剂)已经显示出降低DMD患者的死亡率(Duboc et al.,Journal of the American College of Cardiology,2005,45,855-857)。在治疗DMD的心脏损伤中测试的分子主要是已经用于治疗心力衰竭的分子。其它疗法旨在通过减少纤维化来治疗肌肉和心脏损伤。这是潘瑞鲁单抗(II期试验NCT02606136)，一种抗结缔组织生长因子的单克隆抗体，和他莫昔芬(I期试验NCT02835079和III期试验NCT03354039)，一种抗雌激素的情况。

因此，医学上需要开发用于遗传性扩张型心肌病的新治疗策略。

WNT(或Wnt)途径协调各种生物过程，例如细胞增殖、分化、器官发生、组织再生和肿瘤发生。经典地，Wnt信号传导分为β-连环蛋白依赖性(典型的，Wnt/β-连环蛋白途径)和β-连环蛋白非依赖性(非典型的，Wnt/平面细胞极性(PCO)和钙途径)。所有三种都通过不同分泌性糖蛋白(Wnt配体)与卷曲蛋白(FZD)受体家族的结合而激活，以转导细胞中来自散乱蛋白(DVL)的信号级联。Wnt途径由内源性拮抗剂(如dickkopf(DKK3)、Wnt抑制性信号蛋白、分泌型卷曲相关蛋白和cerberus)调节。WNT蛋白的分泌主要依赖于豪猪(PORCN)的酰化。β-连环蛋白是Wnt信号转导中的关键信号转导蛋白。由腺瘤性结肠息肉病(APC)、酪蛋白激酶1(CK1)和糖原合酶激酶3α/β(GSK-3α/β)和轴蛋白组成的β-连环蛋白破坏复合物通过磷酸化介导的蛋白水解紧密控制β-连环蛋白。聚ADP-核糖基化酶端锚聚合酶通过泛素介导的蛋白酶体降解与轴蛋白相互作用并降解轴蛋白。在不存在配体的情况下，积聚在细胞质中的β-连环蛋白被破坏复合物降解。在分泌的Wnt蛋白之一与其卷曲受体(FZD)和脂蛋白共受体(LRP5/6)结合后，细胞质β-连环蛋白被稳定并易位至细胞核中，在其中β-连环蛋白与转录因子TCF/LEF和CBP相互作用以调节其靶基因(Rao et al.,Circ.Res.,2010,106,1798-1806；The Wnt Homepage(http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/)。

WISP2/CCN5或WNT1诱导型信号传导途径蛋白2是WNT典型途径的激活剂和细胞外基质蛋白的NCC家族的成员。WISP2/CCN5蛋白与结缔组织生长因子CTGF/CCN2具有相反的作用：CCN2在诱导纤维发生中充当TGF-β的辅因子，而WISP2/CCN5通过抑制TGF-β信号传导和成纤维细胞分化来抑制心脏纤维化(Yoon et al.,Journal of molecular and cellularcardiology,2010,49,294-303)。

DKK3是存在于发育中心脏和成人心脏中的分泌蛋白，是WNT途径的拮抗剂。

SFRP2是与细胞外Wnt配体和卷曲受体结合的分泌蛋白，因此调节信号级联。SFRP2主要是WNT途径的拮抗剂，但其也可增加其信号传导，因此SFRP2在心脏纤维化中具有主要作用，但其作用仍有争议：一些研究将其描述为促纤维化，或相反地，抗纤维化(He et al.,PNAS,2010,107,21110-21115；Kobayashi et al.Nature Cell Biology,2009,11,46-55；Lin et al.,American Journal of physiology Cell physiology,2016,311,C710-C719；Mastri et al.,American Journal of physiology Cell physiology,2014,306,C531-C539)。低浓度的SFRP2可增强Wnt途径的作用并促进心肌纤维化，而高浓度的SFRP2可拮抗Wnt途径并抑制心肌纤维化(Wu et al.,International Journal of biologicalsciences,2020,16,730-738)。其在心脏成纤维细胞中的作用也似乎涉及TGF-相关的纤维化-β1(Ge and Greenspan,The journal of Cell Biology,2006,175,111-120)。

Wnt信号传导的异常上调与癌症、骨关节炎和多囊肾病有关，而Wnt信号传导的异常下调与骨质疏松症、糖尿病和神经元退行性疾病有关。Wnt/β-连环蛋白途径是人癌症的治疗性靶标，并且已经在各种人癌症的临床前和临床研究中检验了各种Wnt抑制剂：PORCN抑制剂、Wnt配体拮抗剂(FZD诱饵受体)、FZD拮抗剂/单克隆抗体、CBP/β-连环蛋白结合抑制剂和β-连环蛋白靶向抑制剂。也已经开发通过稳定轴蛋白下调β-联蛋白稳定的端锚聚合酶抑制剂，包括XAV939、JW-55、RK-287107和G007-LK(综述于Jung和Park,Experimental&Molecular Medicine,2020,52,183-191；The Wnt Homepage(http://www.stanford.edu/ group/nusselab/cgi-bin/wnt/)。

细胞因子TGF-β参与许多细胞功能，如炎症、细胞增殖和分化。TGF-β途径由三种结构相似的细胞因子组成：TGF-β1、2和3以及跨膜受体。它主要激活Smad通道，但也激活Erk、JNK、p38 MAPK和GTP酶通道(Umbarkar et al.,JACC Basic Transl.Sci.,2019,4,41-53)。TGF-β信号传导的异常上调与癌症和纤维化有关。TGF-β途径是人癌症和纤维化疾病的治疗性靶标。已经在各种人癌症和纤维化疾病(如特发性肺纤维化、硬皮病、瘢痕等)的临床前和临床研究中检验了TGF-β途径抑制剂：抗TGFβ2反义寡核苷酸(AP-12009,AP-11014,NovaRx)；小分子TGFβRI或TGFβRI&RII激酶抑制剂(LY-2157299,SB-431542和许多其他)；抗pan TGFβ抗体(GC-1008；ID11,SR-2F,2G7)；TGFβRIII的肽片段(P-144)；Smad-相互作用的肽适配子(Trx-xFoxH1b/Trx-Lef1)；抗TGFβ2抗体(乐德木单抗或CAT-152)；抗TGFβ1抗体(美替木单抗或CAT-192)；稳定化的可溶性TGFβRII(可溶TBR2-Fc)；综述于Akhurst,RJ,Current Opinion in Investigational Drugs,2006,7,513-521；Nagaraj N.S.&DattaP.K.,Expert Opin.Investig Drugs,2010,19,77-91)。

软骨中间层蛋白1(CILP-1)是一种主要存在于关节软骨的软骨细胞中的基质细胞蛋白，但最近发现其在人特发性扩张型心肌病和梗死中的表达显著较高(vanNieuwenhoven et al.,Scientific Reports,2017,7,16042；Yung et al.,Genomics,2004,83,281-297)。在正常小鼠的心脏中，CILP由心肌细胞和成纤维细胞表达，并且蛋白质在细胞溶质、核级分和细胞外基质中发现(van Nieuwenhoven et al.,ScientificReports,2017,7,16042；Zhang et al.,Journal of molecular and cellularcardiology,2018,116,135-144)。CILP-1蛋白的表达在诱导的心脏纤维化的小鼠模型中增加并且其表达由TGF-β1刺激(Mori et al.,Biochemical and biophysical researchcommunications,2006,341,121-127)。

LTBP-2蛋白是潜在的TGFβ1结合蛋白家族的蛋白，与TGF-β途径相关的胞外基质蛋白。LTBP2调节TGF-β1的释放并且TGF-β1促进LTBP-2的表达(Bai et al.,Biomarkers,2012,17,407-415；Sinha et al.,Cardiovascular Research,2002,53,971-983)。此外，LTBP-2在心搏停止后的小鼠和患者中的心肌的纤维化区域中高度表达和定位(Gabrielsenet al.,Journal of molecular and cellular cardiology,2007,42,870-883；Park etal.,Circulation,2018,138,1224-1235)。

WNT和TGF-β信号传导也是通过哺乳动物多能干细胞群的分化或哺乳动物分化细胞的重编程用于再生医学的靶标。

发明概述

本发明人已经发现，Wnt和TGF-β途径均失调，并且它们的基因在遗传诱导的扩张型心肌病，即杜兴氏肌营养不良(DBA2mdx小鼠)和肌联蛋白病(DeltaMex5小鼠)的两种模型中过表达。最过表达的基因包括Wnt途径的WISP2、DKK3和SFRP2基因以及TGF-β途径的CILP-1和LTBP-2基因。使用作为遗传性扩张型心肌病的严重模型的DeltaMex5小鼠模型，本发明人已经表明，在DeltaMex5小鼠中，通过过表达WISP2、DKK3或SFRP2的Wnt途径的基因转移介导的调节和通过过表达CILP-1或抑制LTBP-2的TGF-β途径的抑制显示心脏纤维化的显著改进。

这些结果表明，Wnt途径的调节(特别是通过过表达WISP2、DKK3或SFRP2)和TGF-β途径的调节(通过过表达CILP-1或抑制LTBP-2)代表了用于遗传诱导的心肌病(例如肌联蛋白病)的治疗方法，对于遗传诱导的心肌病，由于基因的大小，基因转移方法是不可能的。

本发明涉及用于治疗遗传性扩张型心肌病的Wnt或TGF-β途径的可表达调节剂。

在一些实施方案中，调节剂调节Wnt或TGF-β途径的靶蛋白的活性，并且选自下组：适配子、抗体、重组靶蛋白、抑制性肽、融合蛋白、诱饵受体、可溶性蛋白和显性失活突变体。

在一些实施方案中，调节剂调节Wnt或TGF-β途径的靶基因的表达，并且选自下组：干扰RNA分子、核酶、基因组或表观基因组编辑酶复合物和靶标转基因。

在一些实施方案中，调节剂是Wnt途径的抑制剂或激活剂或TGF-β途径的抑制剂。

在一些优选实施方案中，调节剂是CILP-1、CCN5/WISP2、DKK3或SFRP2的激活剂或LTBP2的抑制剂。

在一些更优选的实施方案中，调节剂是特异性降低LTBP2表达的干扰RNA；优选包含选自下组的至少一个序列的shRNA：SEQ ID NO:11-14。

在一些更优选的实施方案中，调节剂是编码CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2蛋白或其变体的转基因。优选地，CILP-1、DKK3、SRFP2、CCN5/WISP2蛋白或其变体包含选自下组的序列：SEQ ID NO:2、4、6和8，和与任一所述序列具有至少85％同一性的序列。

在一些优选实施方案中，调节剂被插入包含选自下组的心脏启动子的核酸构建体中：人心肌肌钙蛋白T启动子(TNNT2)、α肌球蛋白重链启动子(α-MHC)、肌球蛋白轻链2v启动子(MLC-2v)、肌球蛋白轻链2a启动子(MLC-2a)、CARP基因启动子、α-心肌肌动蛋白启动子、α-原肌球蛋白启动子、心肌肌钙蛋白C启动子、心肌肌球蛋白结合蛋白C启动子和肉瘤/内质网Ca²⁺ATP酶(SERCA)启动子；优选人心肌肌钙蛋白T启动子。

在一些更优选的实施方案中，核酸构建体包含在用于基因治疗的载体中；所述载体有利地包含病毒颗粒，优选腺相关病毒(AAV)颗粒。所述AAV颗粒优选包含衍生自选自下组的AAV血清型的衣壳蛋白：AAV-1、AAV-6、AAV-8、AAV-9和AAV9.rh74血清型；更优选AAV9.rh74。

在一些更优选的实施方案中，所述遗传性心肌病由选自下组的基因中的突变引起：层粘连蛋白、emergin、fukutin、fukutin相关蛋白、桥粒芯胶蛋白、斑珠蛋白、利阿诺定受体2、肌浆网Ca(2+)ATP酶2亚型α、受磷蛋白、核纤层蛋白A/C、肌营养不良蛋白、telethonin、辅肌动蛋白、结蛋白、肌聚糖、肌联蛋白、心肌肌钙蛋白、肌球蛋白、心肌肌动蛋白、RNA结合基序蛋白20、BCL2相关的永生基因3、桥粒斑蛋白、tafazzin和钠通道；优选由肌营养不良蛋白或肌联蛋白基因中的突变引起。

发明详述

调节剂

本发明涉及Wnt或TGF-β途径的可表达调节剂用于治疗遗传性扩张型心肌病(DCM)的用途。

如本文所用，“调节剂”是指活化剂或抑制剂。

如本文所用，“可表达调节剂”是指可通过重组DNA技术产生或通过基因转移递送的调节剂(活化剂或抑制剂)。因此，可表达调节剂由核糖核酸(RNA)分子或蛋白质、多肽或肽组成。本发明特别涵盖靶向Wnt或TGF-β途径的组分的RNA分子抑制剂，如干扰RNA(siRNA、shRNA)、CRISPR向导RNA、核酶和适配子。本发明还涵盖蛋白质、多肽或肽调节剂，例如Wnt或TGF-β途径的组分、其变体或衍生物(片段，融合蛋白；诱饵受体，可溶性蛋白，显性失活突变体)和针对Wnt或TGF-β途径的组分的抗体，包括其片段和可表达衍生物。

本文所用的肽或多肽可互换地用于指任何长度的肽或蛋白质片段。

本文所用的术语“心脏细胞”特别包括心肌细胞、成肌细胞和干细胞。

“一”、“一个”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”或“至少一个”在本文中可互换使用；除非另外规定，否则“或”意指“和/或”。

如本文所用，“Wnt或TGF-β(TGF-β)途径的组分”是指该途径的任何组分，包括Wnt或TGF-β途径的配体、受体、信号分子或调节剂(激活剂或调节剂)。这样的组分是本领域公知的(参见例如Rao et al.,Circ.Res.,2010,106,1798-1806 and Umbarkar et al.,JACCBasic Transl.Sci.,2019,4,41-53；The Wnt Homepage(http://www.stanford.edu/ group/nusselab/cgi-bin/wnt/)。

“Wnt或TGF-β途径的调节剂”、“Wnt或TGF-β信号传导的调节剂”或“Wnt或TGF-β信号传导途径的调节剂”是指激活或抑制Wnt或TGF-β信号传导的化合物或分子，例如通过Wnt配体或TGF-β细胞因子与其同源受体的结合转导的信号传导级联来激活或抑制Wnt或TGF-β靶基因的转录。调节剂作用于Wnt或TGF-β途径(Wnt或TGF-β途径靶基因或蛋白质)的特定组分。调节剂可抑制或激活该途径组分的表达或活性。靶标可以是Wnt或TGF-β途径的任何组分，例如配体、受体、信号分子或Wnt或TGF-β途径的调节剂。激活剂可以直接激活该途径或抑制抑制剂的表达或活性。同样，抑制剂可以直接抑制该途径或激活抑制剂的表达或活性。调节可以是直接的或间接的。直接调节特异性针对靶标。间接调节针对靶标的任何共同效应器，例如且不限于：所述靶标的配体或共配体、受体或共受体、或辅因子。调节剂(抑制剂或激活剂)可以结合Wnt或TGF-β途径的特定靶蛋白，并破坏或促进靶标的特定蛋白/蛋白相互作用或调节靶标的活性或功能。或者，调节剂抑制或激活Wnt或TGF-β途径的靶基因的表达。调节剂可以是与靶基因转录物(mRNA)的特定序列结合并抑制靶基因表达的抑制剂。调节剂可以是产生靶基因和蛋白的超表达的靶基因的转基因或增加靶蛋白活性的重组靶蛋白。

典型地，Wnt或TGF-β途径的调节剂是指与在施用所述化合物之前或不存在施用所述化合物的Wnt或TGF-β信号传导相比，在受试者中(或在体外细胞中)调节Wnt或TGF-β信号传导至少20％，30％，40％，50％，60％并且优选地大于70％，甚至更优选地大于80％，大于90％，大于95％，大于99％或甚至100％(对应于无可检测活性)的化合物。

Wnt或TGF-β途径的调节剂可通过本领域熟知的各种测定(如细胞Wnt或TGF-β报告基因测定)来鉴定。Wnt报告基因测定的实例包括广泛使用的TOP-flash测定(Molenaar etal.,,Cell,1996,86,391-399)，并且可以获得TOP-flash的变体。另一种测定法是TCF/LEF-报告基因测定，其使用在APC蛋白中携带突变的SW480细胞，所述突变导致组成型活性经典Wnt信号传导(Deshmukh et al.,Osteoarthritis and Cartilage,2018,26,18-27)。TGF-β报告基因测定的实例包括TGF-β/SMAD萦光素酶报告细胞系或慢病毒载体。

典型地，Wnt或TGF-β途径的调节剂可以是与在施用所述化合物之前或不存在施用所述化合物的Wnt或TGF-β途径的组分的表达或活性相比，在受试者(或体外细胞)中调节(增加或降低)Wnt或TGF-β途径的组分(Wnt或TGF-β靶基因或蛋白质)的表达或活性至少20％，30％，40％，50％，60％并且优选地大于70％，甚至更优选地大于80％，大于90％，大于95％，大于99％或甚至100％(对应于无可检测的活性)的化合物。如本文所用，Wnt或TGF-β途径靶基因表达的调节包括与未诱导调节的情况相比，Wnt或TGF-β途径靶基因或由所述Wnt或TGF-β途径靶基因编码的蛋白质的表达或蛋白质活性或水平的任何增加或降低。与未被调节靶向的Wnt或TGF-β途径靶基因的表达或Wnt或TGF-β途径靶蛋白的水平相比，该增加或减少可以是至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％。

Wnt或TGF-β靶基因转录物(mRNA)的表达水平可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法测定。例如，首先根据标准方法提取样品中所含的核酸，例如使用裂解酶或化学溶液，或根据制造商的说明书通过核酸结合树脂提取。然后，通过杂交(例如，Northern印迹分析)和/或扩增(例如，RT-PCR)检测提取的mRNA。靶蛋白的表达水平也可以通过技术人员已知的任何合适的方法来测定。可以例如通过半定量蛋白质印迹、酶标记和介导的免疫测定(如ELISA)、生物素/抗生物素蛋白型测定、放射免疫测定、免疫电泳、质谱或免疫沉淀或通过蛋白质或抗体阵列来测量蛋白质的量。

在本发明的上下文中，根据本发明的Wnt或TGF-β途径的调节剂优选对其靶蛋白或基因具有选择性。“选择性”是指调节剂的亲和力比对另一种蛋白质或基因的亲和力高至少10倍，优选25倍，更优选100倍，还优选500倍。

Wnt或TGF-β途径调节剂用于改进患有遗传性扩张型心肌病(DCM)的受试者的心脏纤维化。如本申请的实施例所示，Wnt或TGF-β途径调节剂是必要的并且足以改进患有遗传性扩张型心肌病(DCM)，特别是遗传性心肌病的受试者的纤维化。纤维化的改进可以通过在DCM的动物模型(如本领域公知)和本申请实施例中公开的小鼠模型中施用Wnt或TGF-β途径调节剂来测定；具有肌联蛋白基因的DeltaMex5小鼠(肌联蛋白^Mex5-/Mex5-；Charton et al.,Human molecular genetics,2016,25,4518-4532)和在肌营养不良蛋白基因的外显子23上具有准时突变的DBA2mdx小鼠。与未处理的对照相比，经处理小鼠通过组织学分析(天狼星红染色)后心脏中纤维化组织的减少或RT-PCR或免疫组织学分析后心脏中纤维化标志物水平(纤连蛋白、波形蛋白、胶原1a1和胶原3a1)的减少可以确定心脏纤维化的改进。正常小鼠(未处理)有利地用作阳性对照以评估患病小鼠的治疗功效。

根据本发明，Wnt或TGF-β途径的调节剂可选自具有调节Wnt或TGF-β途径靶基因的基因表达或Wnt或TGF-β途径靶蛋白的活性的能力的任何可表达化合物。

在一些实施方案中，调节剂调节Wnt或TGF-β途径的靶蛋白的活性。活性调节剂可以选自下组：适配子；针对靶蛋白或其配体、受体、共受体的抗体(激动剂和拮抗剂)，包括其抗体片段和可表达的衍生物；重组靶蛋白、靶蛋白变体或其衍生物，如融合蛋白、可溶性蛋白和显性失活突变体；诱饵受体和抑制性肽。

适配子是一类在分子识别方面代表抗体的替代物的分子。适配子是能够以高亲和力和特异性识别几乎任何种类的靶分子的寡核苷酸或寡肽序列。这种配体可以通过随机序列文库的指数富集(SELEX)系统进化配体来分离，如Tuerk C.和Gold L.,1990所述，并且可以任选地进行化学修饰。Smad相互作用的肽适配子(Trx-xFoxH1b/Trx-Lef1)是TGF-β抑制剂(综述于Akhurst,RJ,Current Opinion in Investigational Drugs,2006,7,513-521；Nagaraj N.S.&Datta P.K.,Expert Opin.Investig Drugs,2010,19,77-91)。

如本文所用，术语“抗体”是指包括免疫球蛋白的至少一个抗原结合区的蛋白质。抗原结合区可以包含一个或两个可变结构域，例如VH结构域和VL结构域或单个VHH或VNAR结构域。术语“抗体”涵盖任何同种型的全长免疫球蛋白、包含至少抗原结合区的其功能片段及其衍生物。抗体的抗原结合片段包括例如Fv、scFv、Fab、Fab’、F(ab')2、Fd、Fabc和sdAb(V_HH,V-NAR)。抗体衍生物包括但不限于多特异性或多价抗体、内抗体和免疫缀合物。内抗体是在同一细胞中产生后在细胞内结合其抗原的抗体(综述参见例如Marschall AL,DübelS and

T“Specific in vivo knockdown of protein function byintrabodies”,MAbs.2015；7(6):1010-35)。抗体可以是糖基化的。抗体对于抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性可以是功能性的，或者对于这些活性中的一种或两种可以是非功能性的。抗体通过本领域熟知的标准方法制备，如杂交瘤技术、选择性淋巴细胞抗体法(SLAM)、转基因动物、重组抗体文库或合成生产。已经在纤维化疾病的人癌症的临床前和临床试验中检验了几种抗TGF-β抗体；抗pan TGFβ抗体(GC-1008；ID11,SR-2F,2G7)；抗TGFβ2抗体(乐德木单抗或CAT-152)；抗TGFβ1抗体(美替木单抗或CAT-192)；综述于Akhurst,RJ,Current Opinion in Investigational Drugs,2006,7,513-521；NagarajN.S.&Datta P.K.,Expert Opin.Investig Drugs,2010,19,77-91。已经开发了与FZD受体结合并阻断与WNT配体结合的FZD拮抗剂单克隆抗体：万替妥单抗(OMP-18R5)；OTSA101(综述于Jung and Park,Experimental&Molecular Medicine,2020,52,183-191；The WntHomepage(http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/)。

TGF-β途径的其它肽抑制剂包括TGFβRIII的肽片段(P-144)和稳定化的可溶性TGFβRII(可溶性TBR2-Fc)；综述于Akhurst,RJ,Current Opinion in InvestigationalDrugs,2006,7,513-521；Nagaraj N.S.&Datta P.K.,Expert Opin.Investig Drugs,2010,19,77-91。WNT途径的肽抑制剂包括：Dickkopf(Dkk)、Axin、GSK、SFRP(分泌型卷曲相关蛋白)和SRFP肽；FZD诱饵受体：OMP-54F28包含融合至人Ig Fc结构域的FZD8的富半胱氨酸结构域；显性阴性散乱或TCF.OTSA101(综述于Jung and Park,Experimental&MolecularMedicine,2020,52,183-191；The Wnt Homepage(http://www.stanford.edu/group/ nusselab/cgi-bin/wnt/)。

在一些实施方案中，调节剂调节Wnt或TGF-β途径的靶基因的表达。表达调节剂可选自下组：干扰RNA分子、核酶和基因组或表观基因组编辑酶复合物以及靶标转基因。干扰RNA分子包括但不限于siRNA和shRNA。基因组和表观基因组编辑系统可以基于任何已知的系统，例如CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶和大范围核酸酶。干扰RNA分子、核酶、基因组和表观基因组编辑酶是本领域熟知的，并且可以基于这些技术使用本领域熟知的WNT或TGF-β途径的基因序列容易地设计根据本发明的WNT或TGF-β途径的靶基因的抑制剂。

在一些具体实施方案中，调节剂是根据本公开的Wnt途径的激活剂或抑制剂或TGF-β途径的抑制剂。在一些具体实施方案中，所述调节剂是Wnt途径的激活剂。在一些具体实施方案中，调节剂是根据本公开的Wnt或TGF-β途径的抑制剂。在一些具体实施方式中，调节剂是根据本公开的Wnt途径的抑制剂。在一些具体实施方案中，调节剂是根据本公开的TGF-β途径的抑制剂。

在一些实施方案中，调节剂靶向选自下组的WNT或TGF-β途径的基因或蛋白质：来自TGF-β途径的CILP-1和LTBP2；来自WNT途径的CCN5/WISP2、DKK3和SFRP2。在一些优选实施方案中，根据本公开的调节剂是CILP-1、CCN5/WISP2、DKK3或SFRP2的激活剂或LTBP2的抑制剂。

基因软骨中间层蛋白(CILP或CILP-1)(GeneID：8483)编码CILP-1前蛋白(GenBank/NCBI登录号：NP_003604.4，于2020年4月25日登录；SEQ ID NO:2)。所述mRNA具有在2020年4月25日登录的序列GenBank登录号NM_003613.4；SEQ ID NO:1)。CLIP-1前蛋白具有包含信号肽的1184个氨基酸序列(第1-21位)；前蛋白(第22-1184位)；CILP-1N端结构域(第22-720位)；CILP-1C端结构域(第725-1184位)。全长和N端结构域起IGF-1拮抗剂的作用。公开了两种CILP-1亚型X1和X2(GenBank登录号XP_016878167.1和XP_016878168.1，于2020年5月28日登录)。

基因dickkopf WNT信号途径抑制剂3(DKK3)(GeneID：27122)编码DKK3蛋白前体(GenBank/NCBI登录号NP_056965.3，于2020年4月27日登录；SEQ ID NO:4)。所述mRNA(转录物变体1)具有在2020年4月27日登录的序列GenBank/NCBI登录号NM_015881.5(SEQ ID NO：3)。DKK3蛋白前体具有包含信号肽(第1-21位)的350个氨基酸。成熟蛋白质来自第22-350位。

基因分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)(GeneID：6423)编码SRFP2蛋白前体(GenBank/NCBI登录号NP_003004.1，于2020年5月31日登录；SEQ ID NO:6)。该mRNA具有2020年5月31日登录的序列GenBank/NCBI登录号NM_003013.3(SEQ ID NO：5)。SRFP2蛋白前体具有包含信号肽(第1-19位)的295个氨基酸序列。成熟蛋白质来自第20-295位。

基因细胞通讯网络因子5(CCN5)(GeneID：8839)编码CCN5/WISP2蛋白前体(GenBank/NCBI登录号NP_003872.1，于2020年5月3日登录；SEQ ID NO:8)。mRNA(转录物变体3)具有2020年5月3日登录的序列GenBank/NCBI登录号NM_003881.3(SEQ ID NO：7)。CCN5/WISP2蛋白前体具有包含信号肽(第1-23位)的250个氨基酸序列。成熟蛋白质来自第24-250位。

基因潜伏转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)(GeneID：4053)编码LTBP2蛋白前体(GenBank/NCBI登录号NP_000419.1，于2020年5月8日登录；SEQ ID NO:10)。所述mRNA具有在2020年5月8日登录的序列GenBank/NCBI登录号NM_000428.3，mRNA；SEQ ID NO:9。LTBP2蛋白前体具有包含信号肽(第1-35位)的1821个氨基酸序列。成熟蛋白来自第36-1821位。

许多不同哺乳动物CILP-1、DKK3、SFRP2、CCN5和LTBP2蛋白的基因序列是已知的，包括但不限于人、猪、黑猩猩、狗、牛、小鼠、兔或大鼠，并且可以容易地在序列数据库中找到。

LTBP2抑制剂

在一些优选实施方案中，调节剂是LTBP2抑制剂。在一个具体实施方案中，所述LTBP2抑制剂是特异性减少、抑制或阻抑LTBP2表达的干扰RNA。

本文所用的术语“iRNA”、“RNAi”，“干扰核酸”或“干扰RNA”是指能够下调靶蛋白表达的任何RNA。核酸分子干扰是指dsRNA以转录后水平特异性抑制靶基因表达的现象。在正常情况下，RNA干扰由长度为几千碱基对的双链RNA分子(dsRNA)引发。在体内，引入细胞的dsRNA被裂解成称为siRNA的短dsRNA分子的混合物。催化切割的酶Dicer是含有RNaseIII结构域的内切-RNA酶(Bernstein,Caudy et al.2001Nature.2001Jan 18；409(6818):363-6)。在哺乳动物细胞中，由Dicer产生的siRNA是长度为21-23bp，具有19或20个核苷酸的双链体序列，两个核苷酸的3'悬垂和5'-三磷酸末端(Zamore,Tuschl etal.Cell.2000Mar31；101(l):25-33；Elbashir,Lendeckel et al.Genes Dev.2001Jan 15；15(2):188-200；Elbashir,Martinez et al.EMBO J.2001Dec 3；20(23):6877-88)。

所述干扰RNA可以是作为非限制性实例的小抑制性RNA(siRNA)或短发夹RNA。

在另一个实施方案中，小抑制性RNA(siRNA)用于降低本公开中的LTBP2表达水平。LTBP2基因表达可以通过向受试者施用小双链RNA(dsRNA)或引起小双链RNA产生的载体或构建体来降低，使得LTBP2表达被特异性抑制(即RNA干扰或RNAi)。用于选择合适的dsRNA或编码dsRNA的载体的方法对于其序列已知的基因是本领域熟知的(例如参见Tuschl,T.etal.(1999)；Elbashir,S.M.et al.(2001)；Hannon,GJ.(2002)；McManus,MT.et al.(2002)；Brummelkamp,TR.et al.(2002)；美国专利6,573,099和6,506,559；和国际专利公开号WO01/36646、WO99/32619和WO01/68836)。

在优选实施方案中，在本公开中使用短发夹RNA(shRNA)来降低CILP-1表达水平。短发夹RNA(shRNA)是产生紧密发夹环的RNA序列，其可用于通过RNA干扰(RNAi)沉默靶基因表达。shRNA在细胞中的表达典型地通过递送质粒或通过病毒或细菌载体来实现。启动子的选择对于实现稳定的shRNA表达是必需的。首先，使用聚合酶III启动子，如U6和HI；然而，这些启动子缺乏空间和时间控制。因此，已经转向使用聚合酶II启动子来调节shRNA的表达。

通常针对翻译起始密码子下游19-50个核苷酸的区域设计干扰核酸，而通常避免5'UTR(非翻译区)和3'UTR。选择的干扰核酸靶序列应该针对EST数据库进行BLAST搜索，以确保仅靶向所需基因。商业上可获得各种产品以帮助制备和使用干扰核酸。

在具体实施方案中，干扰核酸是长度为至少约10-40个核苷酸，优选约15-30个碱基核苷酸的siRNA。特别地，根据本公开的干扰核酸包含选自下组的至少一个序列：5’-GGAAGTCTAGTGACCAGAATA-3’(SEQ ID NO:11)；5’-GCTGGTGAAGGTGCAAATTCA-3’(SEQ ID NO:12)；5’-GCTTCTATGTGGCGCCAAATG-3’(SEQ ID NO:13)；和5’-GCACCAACCACTGTATCAAAC-3’(SEQ ID NO:14)。

在一个更优选的实施方案中，同时使用最多四种各自包含序列SEQ ID NO:11-14的干扰核酸。

在优选的实施方案中，所述干扰核酸是shRNA，其包含选自下组的至少一个序列：SEQ ID NO：11-14，优选包含所有序列SEQ ID NO：11-14。

可以使用本领域已知的方法构建用于本公开的干扰核酸。特别地，干扰RNA可以通过从线性(例如PCR产物)或环状模板(例如病毒或非病毒载体)的体外转录产生，或通过从病毒或非病毒载体的体内转录产生。可以修饰干扰核酸以具有增强的稳定性、核酸酶抗性、靶特异性和改进的药理学性质。例如，反义核酸可以包括经修饰的核苷酸或/和骨架，其被设计成增加反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性。

在另一个具体实施方案中，LTBP2抑制剂是能够靶向并使LTBP2基因失活的特异性核酸酶。可以使用不同类型的核酸酶，例如大范围核酸酶、TAL核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA/DNA引导的核酸内切酶(如Cas9/CRISPR)或Argonaute。

“使靶基因失活”意指目的基因不表达或不以功能性蛋白质形式表达。在具体实施方案中，所述核酸酶特异性催化一个靶向基因中的切割，从而使所述靶向基因失活。

术语“核酸酶”是指能够催化DNA或RNA分子，优选DNA分子内的核酸之间的键水解(裂解)的野生型或变体酶。在一个具体实施例中，根据本公开的所述核酸酶是RNA引导的内切核酸酶，如Cas9/CRISPR复合物。RNA引导的核酸内切酶是基因组工程工具，其中核酸内切酶与RNA分子结合。在该系统中，RNA分子核苷酸序列决定靶特异性并激活内切核酸酶(Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran etal.2013；Mali,Yang et al.2013)。Cas9/CRISPR涉及Cas9核酸酶和向导RNA，在本文中也称为单向导RNA。所述单向导RNA优选能够靶向LTBP2基因。

所述靶基因的失活也可以通过使用位点特异性碱基编辑来进行，例如通过引入提前终止密码子、删除起始密码子或改变RNA剪接。碱基编辑直接在DNA中产生精确的点突变而不产生DNA双链断裂。在一个具体实施方案中，通过使用DNA碱基编辑器进行碱基编辑，所述DNA碱基编辑器包含催化受损的Cas核酸酶和对单链DNA起作用的碱基修饰酶之间的融合体(综述参见Rees H.A.et al.Nat Rev Genet.2018.19(12):770-788)。

CILP-1、DKK3、SRFP2、CCN5/WISP2激活剂

在其它优选的实施方案中，调节剂是CILP-1、DKK3、SRFP2、CCN5/WISP2激活剂。

特别地，激活剂是重组CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2蛋白或编码所述蛋白的转基因。

在一些优选实施方案中，激活剂是编码CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2或其变体的转基因。

本文所用的术语“转基因”是指编码基因产物的外源DNA或cDNA。基因产物可以是RNA、肽或蛋白质。除了基因产物的编码区之外，转基因可以包括或与促进或增强表达的一个或多个元件相关，例如启动子、增强子、应答元件、报告元件、绝缘子元件、聚腺苷酸化信号和/或其它功能元件。本公开的实施方案可以利用任何已知的合适的启动子、增强子、应答元件、报告元件、绝缘子元件、聚腺苷酸化信号和/或其他功能元件。合适的元件和序列是本领域技术人员公知的。

根据本公开的转基因可以是编码CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2蛋白，特别是天然哺乳动物，优选人CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2蛋白或其变体的任何核酸序列。人CILP-1、DKK3、SRFP2和CCN5/WISP2蛋白分别对应于序列SEQ ID NO：2、4、6和8。许多不同哺乳动物CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2蛋白的编码序列是已知的，包括但不限于人、猪、黑猩猩、狗、牛、小鼠、兔或大鼠，并且可以容易地在序列数据库中找到。或者，本领域技术人员可以基于多肽序列容易地测定编码序列。

在优选实施方案中，所述转基因包含CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2蛋白的编码序列，所述编码序列可以选自下组：序列SEQ ID NO：1、3、5和7以及与任一所述序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％或95％同一性的序列。

在一个具体实施方案中，根据本公开的转基因可以是编码CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2蛋白变体的任何核酸序列。

如本文所用，术语“变体”是指例如能够调节Wnt或TGF-β途径的功能性变体。

优选地，如本文所用，术语“变体”是指具有与天然序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的氨基酸序列的多肽。如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”是指来自两个多肽序列的比对的位置上的匹配(相同氨基酸残基)的数目(％)。通过在比对时比较序列来测定序列同一性，以便使重叠和同一性最大化，而使序列空位最小化。特别地，取决于两个序列的长度，可以使用多种数学全局或局部比对算法中的任一种来测定序列同一性。优选使用全局比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch,1970)，其在整个长度上最佳比对序列，而基本上不同长度的序列优选使用局部比对算法(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman，1981)或Altschul算法(Altschul等人，1997；Altschul等人，2005)。用于测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如，使用可在互联网网站(如http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上获得的可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，％氨基酸序列同一性值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle产生的值，其使用Needleman-Wunsch算法产生两个序列的最佳全局比对，其中所有搜索参数设置为默认值，即评分矩阵＝BLOSUM62，空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10和末端空位延伸＝0.5。

更优选地，术语“变体”是指具有与天然序列相差少于30，25，20，15，10或5个取代、插入和/或缺失的氨基酸序列的多肽。在优选实施方案中，变体与天然序列的不同之处在于一个或多个保守取代，优选地少于15、10或5个保守取代。保守取代的实例在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)的组中。变体的CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2活性可通过如上所述的本领域技术人员已知的任何方法评估。

在一些优选实施方案中，所述CILP-1、DKK3、SRFP2和CCN5/WISP2蛋白或变体包含选自下组的序列：序列SEQ ID NO：2、4、6和8以及与任一所述序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的序列或由其组成。

在具体实施方案中，所述转基因可以是编码CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2蛋白或其变体的优化序列，特别是密码子优化序列。

术语“密码子优化的”是指将表达人偏倚的密码子(即在人基因中是常见的，但在其它哺乳动物基因或非哺乳动物基因中是不常见的)改变为不表达人偏倚的同义密码子(编码相同氨基酸的密码子)。因此，密码子的改变不会导致所编码蛋白质的任何氨基酸改变。

根据本发明，Wnt和/或TGF-β途径的几种调节剂可同时、分别或依次用于治疗心肌病。

核酸构建体

在优选实施方案中，所述调节剂包括在包含编码该调节剂的核苷酸序列的核酸构建体中。

本文所用的术语“核酸构建体”是指使用重组DNA技术产生的人造核酸分子。核酸构建体是单链或双链的核酸分子，其已被修饰以包含核酸序列的片段，这些片段以天然不存在的方式组合和并列。核酸构建体通常是“载体”，即用于将外源产生的DNA递送到宿主细胞中的核酸分子。

核酸构建体可包含DNA、RNA或合成或半合成的核酸或由其组成，所述核酸可在个体的靶细胞或组织(例如构成心脏的细胞或心脏细胞)中表达。

优选地，所述核酸构建体包含所述编码调节剂的序列，该序列与指导转基因在心脏组成型细胞中表达的一个或多个控制序列可操作地连接。本领域熟知的此类序列特别包括启动子和能够进一步控制转基因表达的其它调节序列，例如但不限于增强子、终止子、内含子、沉默子，特别是组织特异性沉默子和microRNA。

控制序列可以包括被心脏细胞识别的启动子。启动子含有转录控制序列，其在导入宿主细胞后介导调节剂的表达。启动子可以是在细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子。启动子可以是组成型或诱导型启动子，优选组成型启动子，更优选强组成型启动子。

启动子也可以是组织特异性的，特别是心脏细胞特异性的。在一个具体实施方案中，本公开的核酸构建体还包含可操作地连接至如上所述的转基因的心脏特异性启动子。在本公开的上下文中，“心脏特异性启动子”是在心脏中比在机体的任何其它组织中更有活性的启动子。典型地，心脏特异性启动子的活性在心脏中显著高于在其它组织中。例如，这种启动子的活性可以多至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍或至少10倍(例如，与其在其它细胞或组织中驱动表达的能力相比，通过其在给定组织中驱动表达的能力来测定)。因此，心脏特异性启动子允许与其连接的基因在心脏中的活性表达，并阻止其在其它细胞或组织中的表达。

合适的启动子的实例包括但不限于人肌钙蛋白T基因启动子(TNNT2)、α肌球蛋白重链启动子(α-MHC)、肌球蛋白轻链2启动子(MLC-2)、α-心肌肌动蛋白启动子、α-原肌球蛋白启动子、心肌肌钙蛋白C启动子、心肌肌球蛋白结合蛋白C启动子、肉瘤/内质网Ca²⁺ATP酶(SERCA)启动子、结蛋白启动子、MH启动子、CK8启动子和MHCK7启动子。优选地，所述启动子是人心肌肌钙蛋白T启动子。肌肉杂合启动子(MH启动子)公开于例如Piekarowicz et al.,Molecular Therapy,2019,15,157-169。CK8是肌肉肌酸激酶启动子/增强子元件(

et al.,Mol.Ther.,2011,19,1331-1341)。MHCK7启动子基于肌肉肌酸激酶(CK)和α-肌球蛋白重链基因的增强子/启动子区(Salva et al.,Mol.Ther.,2007,15,320-329)。

控制序列还可以包括适当的转录起始、终止和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；和/或增强蛋白质稳定性的序列。大量的表达控制序列，例如天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的，是本领域已知的，并且可以用于驱动编码CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2的核酸序列的表达。典型地，编码CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2TGF-β的转基因与转录启动子和转录终止子可操作地连接。

在具体实施方案中，核酸构建体包含内含子，特别是置于启动子和编码序列之间的内含子。引入内含子以增加mRNA稳定性和蛋白质产生。此外，经设计以减少所述内含子中发现的交替开放阅读框(ARF)的数目或甚至完全去除所述内含子中发现的交替开放阅读框(ARF)的经修饰内含子可显著改进转基因的表达。

除了以下实施例中具体描述的特定递送系统之外，各种递送系统是已知的，并且可用于施用如上所述的核酸构建体，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2编码序列的重组细胞、受体介导的胞吞作用、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的治疗性核酸的构建体等中。

在一个优选实施方案中，所述核酸构建体包含能够抑制CILP-1基因表达的干扰核酸，所述干扰核酸包含至少一个选自序列SEQ ID NO：1-4的序列。更优选地，所述核酸构建体包含序列SEQ ID NO：1-4的四种干扰核酸。

在另一个优选实施方案中，所述核酸构建体包含编码根据本公开的CILP-1、DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2或其变体的转基因。

表达载体

如上所述的核酸构建体可以包含在表达载体中。

本发明可以使用适合于将核酸递送和表达到个体细胞中的任何载体，特别是适合于基因治疗，更特别是针对个体中的靶组织或细胞的靶向基因治疗。本领域熟知的此类载体包括病毒和非病毒载体，其中所述载体可以是整合的或非整合的；复制的或非复制的。在一些具体实施方案中，基因治疗针对心脏细胞或组织。

非病毒载体包括通常用于将核酸引入或维持到个体细胞中的各种(非病毒)试剂。用于通过各种方式将核酸引入个体细胞的试剂特别包括基于聚合物、基于颗粒、基于脂质、基于肽的递送载体或其组合，例如但不限于阳离子聚合物、树枝状聚合物、胶束、脂质体、外泌体、微粒和纳米颗粒，包括脂质纳米颗粒(LNP)；和细胞穿透肽(CPP)。CPP特别是阳离子肽，例如聚-L-赖氨酸(PLL)、寡-精氨酸、Tat肽、Penetratin或Transportan肽及其衍生物，如Pip。用于将核酸维持在个体细胞中(整合入染色体中或以染色体外形式)的试剂特别包括裸核酸载体，例如质粒、转座子和小环，以及基因编辑和RNA编辑系统。转座子特别包括多动睡美人(SB100X)转座子系统(Mates etal.2009)。基因编辑和RNA编辑系统可以使用任何位点特异性核酸内切酶，如Cas核酸酶、TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶等。此外，这些方法可以有利地组合以将本发明的核酸引入和维持到个体细胞中。

根据称为病毒转导的过程，病毒载体本质上能够渗入细胞中并将目标核酸递送到细胞中。

如本文所用，术语“病毒载体”是指经工程化以将遗传物质递送至细胞中的非复制性、非致病性病毒。在病毒载体中，复制和毒力所必需的病毒基因被目标转基因的表达盒替换。因此，病毒载体基因组包含侧翼为病毒载体生产所需的病毒序列的转基因表达盒。

如本文所用，术语“重组病毒”是指通过本领域已知的标准重组DNA技术产生的病毒，特别是病毒载体。

如本文所用，术语“病毒颗粒”或“病毒的颗粒”旨在表示非病原性病毒的细胞外形式，特别是病毒载体，由蛋白质外壳(称为衣壳)包围的DNA或RNA制成的遗传物质组成，并且在某些情况下，包膜衍生自宿主细胞膜的一部分并且包括病毒糖蛋白。

如本文所用，病毒载体是指病毒载体颗粒。

用于递送本发明的核酸(核酸构建体)的优选载体是病毒载体，特别适用于基因治疗，更特别是针对个体中的靶组织或细胞(如心脏细胞或组织)的基因治疗。特别地，病毒载体可以衍生自非致病性细小病毒(如腺相关病毒(AAV))、逆转录病毒(如γ逆转录病毒)、泡沫病毒和慢病毒、腺病毒、痘病毒和疱疹病毒。病毒载体优选是整合载体，例如AAV或慢病毒载体，优选AAV载体。慢病毒载体可以用来自另一种病毒的包膜糖蛋白假型化，以靶向目标细胞/组织。

载体包含病毒载体生产所需的病毒序列，例如慢病毒LTR序列或位于表达盒侧翼的AAV ITR序列。

在具体实施方案中，载体是颗粒或囊泡，特别是基于脂质的微米或纳米囊泡或颗粒，例如脂质体或脂质纳米颗粒(LNP)。在更具体的实施方案中，核酸是RNA并且载体是如上所述的颗粒或囊泡。

在另一个具体实施方案中，载体是AAV载体。作为人基因治疗的潜在载体，AAV载体获得极大的兴趣。所述病毒的有利特性包括其与任何人类疾病都缺乏关联、其能够感染分裂和非分裂细胞、以及衍生自不同组织的广泛的细胞系可以被感染。

AAV基因组由含有4681个碱基的线性单链DNA分子组成(Berns and Bohenzky,1987,Advances in Virus Research(Academic Press,Inc.)32:243-307)。基因组在每个末端包括反向末端重复序列(ITR)，其作为DNA复制的起点和作为病毒的包装信号以顺式起作用。ITR的长度约为145bp。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放阅读框，分别称为AAV rep和cap基因。这些基因编码参与病毒体复制和包装的病毒蛋白。特别地，从AAV rep基因Rep78、Rep68、Rep52和Rep40合成至少四种病毒蛋白，根据它们的表观分子量命名。AAVcap基因编码至少三种蛋白VP1、VP2和VP3。对于AAV基因组的详细描述，参见例如Muzyczka,N.1992Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129。

因此，在一个实施方案中，包含上述转基因的核酸构建体或表达载体还包含腺相关病毒的5'ITR和3'ITR序列，优选5'ITR和3'ITR序列。

如本文所用，术语“反向末端重复序列(ITR)”是指位于病毒的5'-末端(5'ITR)的核苷酸序列和位于3'-末端(3'ITR)的核苷酸序列，其含有回文序列并且可以折叠以形成在DNA复制起始期间充当引物的T形发夹结构。它们也是用于将病毒基因组整合到宿主基因组中；用于从所述宿主基因组的拯救；以及用于将病毒核酸衣壳化成成熟病毒体。载体基因组复制和其包装到病毒颗粒中需要顺式ITR。

用于本公开的病毒载体中的AAV ITR可具有野生型核苷酸序列或可通过插入、缺失或取代而改变。AAV反向末端重复序列(ITR)的血清型可选自任何已知的人或非人AAV血清型。在特定的实施方案中，核酸构建体或病毒表达载体可以通过使用任何AAV血清型的ITR来进行，包括AAV1、AAV2、AAV3(包括3A和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV和现在已知或以后发现的任何其它AAV血清型或工程化AAV。

在一个实施方案中，核酸构建体还包含相应衣壳的5'ITR和3'ITR，或优选血清型AAV-2的5'ITR和3'ITR。

另一方面，本公开的核酸构建体或表达载体可以通过使用合成5'ITR和/或3'ITR；以及使用来自不同血清型病毒的5'ITR和3'ITR来进行。病毒载体复制所需的所有其它病毒基因可以如下所述在病毒生产细胞(包装细胞)中以反式提供。因此，它们在病毒载体中的包含是任选的。

在一个实施方案中，本公开的核酸构建体或病毒载体包含病毒的5′ITR、ψ包装信号和3′ITR。“ψ包装信号”是病毒基因组的顺式作用核苷酸序列，其在一些病毒(例如腺病毒，慢病毒…)中对于复制期间将病毒基因组包装到病毒衣壳中的过程是必需的。

重组AAV病毒颗粒的构建通常是本领域已知的并且已经描述于例如US 5,173,414和US5,139,941；WO 92/01070,WO 93/03769,Lebkowski et al.(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996；Vincent et al.(1990)Vaccines 90(Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Carter,B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129；和Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801。

病毒颗粒

在优选实施方案中，本公开涉及包装如上所述的核酸构建体或表达载体的病毒颗粒。

本公开的核酸构建体或表达载体可以包装到病毒衣壳中以产生“病毒颗粒”，也称为“病毒载体颗粒”。在具体实施方案中，将如上所述的核酸构建体或表达载体包装到AAV衍生的衣壳中以产生“腺相关病毒颗粒”或“AAV颗粒”。本公开涉及包含本公开的核酸构建体或表达载体并且优选包含腺相关病毒的衣壳蛋白的病毒颗粒。

术语AAV载体颗粒涵盖任何基因工程化的重组AAV载体颗粒或突变型AAV载体颗粒。重组AAV颗粒可以通过将包括衍生自特定AAV血清型的ITR的核酸构建体或病毒表达载体包封在由对应于相同或不同血清型AAV的天然或突变Cap蛋白形成的病毒颗粒上来制备。

腺相关病毒的病毒衣壳蛋白包括衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。不同AAV血清型的衣壳蛋白序列之间的差异导致使用不同的细胞表面受体用于细胞进入。与其它胞内加工途径结合，这对每种AAV血清型产生不同的组织向性。

已经开发了几种技术来修饰和改进天然存在的AAV病毒颗粒的结构和功能性质(Bünning H et al.J Gene Med,2008；10:717–733；Paulk et al.Mol ther.2018；26(1):289-303；Wang L et al.Mol Ther.2015；23(12):1877-87；Vercauteren et al.MolTher.2016；24(6):1042-1049；Zinn E et al.,Cell Rep.2015；12(6):1056-68)。

因此，在根据本公开的AAV病毒颗粒中，包括给定AAV血清型的ITR的核酸构建体或病毒表达载体被包装到例如：a)由衍生自相同或不同AAV血清型的衣壳蛋白制成的病毒颗粒；b)由来自不同AAV血清型或突变体的衣壳蛋白的混合物制成的嵌合病毒颗粒；c)由已被不同AAV血清型或变体之间的结构域交换截短的衣壳蛋白制成的嵌合病毒颗粒。

本领域技术人员将理解，根据本公开使用的AAV病毒颗粒可以包含来自任何AAV血清型的衣壳蛋白，所述AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3(包括3A和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV2i8、AAVrh10、AAVrh39、AAVrh43、AAVrh74、AAV-LK03、AAV2G9、AAV.PHP、AAV-Anc80、AAV3B和AAV9.rh74(如WO2019/193119中所公开)。

对于基因转移到人心脏细胞中，AAV血清型1、6、8、9和AAV9.rh74是优选的。AAV血清型9和AAV9.rh74特别适合在心肌细胞/心肌细胞中诱导表达。在一个特定实施方案中，AAV病毒颗粒包含本公开的核酸构建体或表达载体，优选来自AAV9或AAV9.rh74血清型的衣壳蛋白。

药物组合物和治疗

Wnt或TGF-β途径调节剂、核酸构建体、表达载体或病毒颗粒优选以包含治疗有效量的Wnt或TGF-β途径调节剂、核酸构建体、表达载体或病毒颗粒的药物组合物的形式使用。

本发明的核酸构建体、表达载体或病毒颗粒以及衍生的药物组合物可以用于通过基因治疗，特别是针对心脏细胞或组织的靶向基因治疗来治疗疾病。本发明的药物组合物还可以用于通过细胞疗法，特别是针对心脏细胞或组织的细胞疗法来治疗疾病。

如本文所用，“基因治疗”是指涉及为了治疗疾病的目的将目标核酸递送到个体的细胞中的个体的治疗。核酸的递送通常使用递送载体(也称为载体)来实现。病毒和非病毒载体可用于将基因递送至患者的细胞。

如本文所用，“细胞治疗”是指一种方法，其中将通过本发明的核酸或载体修饰的细胞通过任何合适的方式递送给有需要的个体，例如通过静脉注射(输注)，或注射到目标组织中(植入或移植)。在具体实施方案中，细胞治疗包括从个体收集细胞，用本发明的核酸或载体修饰个体的细胞，并将修饰的细胞重新施用于患者。如本文所用，“细胞”是指分离的细胞、天然或人工细胞聚集体、生物人工细胞支架和生物人工器官或组织。

在本发明的上下文中，治疗有效量是指足以逆转、减轻或抑制该术语所适用的疾病或病症的发展，或逆转、减轻或抑制该术语所适用的疾病或病症的一种或多种症状的发展的剂量。术语“有效剂量”或“有效的剂量”定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。

有效剂量的确定和调整取决于多种因素，例如所使用的组合物、施用途径、所考虑个体的身体特征(例如性别、年龄和体重)、同时用药以及其他医学领域技术人员将承认的因素。

在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和/或媒介物。

“药学上可接受的载体”是指当酌情施用于哺乳动物，尤其是人时不产生不利、过敏或其它不适当的反应的媒介物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。

优选地，药物组合物包含载体，其对于能够注射的制剂是药学上可接受的。这些可特别是等渗、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的，尤其是冷冻干燥的组合物，视情况而定，其在添加时使用无菌水或生理盐水构成可注射溶液。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或悬浮液。溶液或悬浮液可包含与病毒载体相容且不阻止病毒载体颗粒进入靶细胞的添加剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是流动的，程度是注射器能够容易注射。它在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。合适溶液的实例是缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或林格乳酸盐。

根据本发明的Wnt或TGF-β途径调节剂、核酸构建体、表达载体或病毒颗粒、药物组合物用于治疗任何遗传性扩张型心肌病(DCM或CMD)。

遗传性扩张型心肌病的治疗优选通过使用根据本公开的核酸构建体、表达载体或病毒颗粒或衍生的药物组合物的基因治疗。

已经发现许多基因中的突变导致不同形式的扩张型心肌病(CMD)。这些特别包括：

－CMD1A，由染色体1q22上的核纤层蛋白A/C基因(LMNA)(OMIM#150330)中的杂合突变；或层粘连蛋白α2(LAMA2或MEROSIN)基因(OMIM#156225；Marques et al.,Neuromuscul.Disord.,2014,doi.org/10.10106/)中的杂合突变引起的扩张型心肌病-1A(OMIM#115200)；

－9q13上的CMD1B(OMIM#600884)；将称为FDC基因座的基因置于D9S153和D9S152之间的间隔中。Friedreich共济失调(OMIM#229300)通常与扩张型心肌病相关，并与调节心脏中钙通道离子传导的cAMP依赖性蛋白激酶(OMIM#176893)定位于同一区域。定位于9q22的原调蛋白(OMIM#190930)是特别有吸引力的候选基因。

－CMD1C(OMIM#601493)，有或无左心室非压实，由10q23上的lim结构域结合3，LDB3(或ZASP)基因(OMIM#605906)中的突变引起；

－CMD1D(OMIM#601494)，由1q32上的肌钙蛋白T2，心脏(TNNT2)基因(OMIM#191045)中的突变引起；

－CMD1E(OMIM#601154)，由3p22上的SCN5A基因(OMIM#600163)中的突变引起；

－CMD1F：符号CMD1F以前用于随后发现与结蛋白相关肌病或肌病，肌原纤维(MFM)相同的病症(OMIM#601419)；

－CMD1G(OMIM#604145)，由2q31上的肌联蛋白(TTN)基因(OMIM#188840)中的突变引起；

－2q14-q22上的CMD1H(OMIM#604288)；

－CMD1I(OMIM#604765)，由2q35上的结蛋白(DES)基因(OMIM#125660)中的突变引起；

－CMD1J(OMIM#605362)，由6q23上的EYA4基因(OMIM#603550)中的突变引起；

－6q12-q16上的CMD1K(OMIM#605582)；

－CMD1L(OMIM#606685)，由5q33上的肌聚糖delta(SGCD)基因(OMIM#601411)中的突变引起；

－CMD1M(OMIM#607482)，由11p15上的CSRP3基因(OMIM#600824)中的突变引起；

－CMD1N(OMIM#607487)，由TITIN-CAP(telethonin或TCAP)基因(OMIM#604488)中的突变引起。

－CMD1O(OMIM#608569)，由12p12上的ABCC9基因(OMIM#601439)中的突变引起；

－CMD1P(OMIM#609909)，由6q22上的受磷蛋白(PLN)基因(OMIM#172405)中的突变引起；

－7q22.3-q31.1上的CMD1Q(OMIM#609915)；

－CMD1R(OMIM#613424)，由15q14上的肌动蛋白α，心肌(ACTC1)基因(OMIM#102540)中的突变引起；

－CMD1S(OMIM#613426)，由14q12上的肌球蛋白重链7，心肌β(MYH7)基因(OMIM#160760)中的突变引起；

－CMD1U(OMIM#613694)，由14q24上的PSEN1基因(OMIM#104311)中的突变引起；

－CMD1V(OMIM#613697)，由1q42上的PSEN2基因(OMIM#600759)中的突变引起；

－CMD1W(OMIM#611407)，由编码10q22上的metavinculin(VCL；OMIM#193065)中的突变引起；

－CMD1X(OMIM#611615)，由编码9q31上的fukutin(FKTN；OMIM#607440)基因中的突变引起；

－CMD1Y(OMIM#611878)，由15q22上的TPM1基因(OMIM#191010)中的突变引起；

－CMD1Z(OMIM#611879)，由3p21上的肌钙蛋白C(TNNC1)基因(OMIM#191040)中的突变引起；

－CMD1AA(OMIM#612158)，由1q43上的辅肌动蛋白α-2(ACTN2)基因(OMIM#102573)中的突变引起；

－CMD1BB(OMIM#612877)，由18q12上的DSG2基因(OMIM#125671)中的突变引起；

－CMD1CC(OMIM#613122)，由1p31上的NEXN基因(OMIM#613121)中的突变引起；

－CMD1DD(OMIM#613172)，由10q25上的RNA结合基序蛋白20(RBM20)基因(OMIM#613171)中的突变引起；

－CMD1EE(OMIM#613252)，由14q12上的肌球蛋白重链6，心肌，alpha(MYH6)基因(OMIM#160710)中的突变引起；

－CMD1FF(OMIM#613286)，由19q13上的肌钙蛋白I，心脏(TNNI3)基因(OMIM#191044)中的突变引起；

－CMD1GG(OMIM#613642)，由5p15上的SDHA基因(OMIM#600857)中的突变引起；

－CMD1HH(OMIM#613881)，由10q26上的BCL2相关永生基因3(BAG3)基因(OMIM#603883)中的突变引起；

－CMD1II(OMIM#615184)，由6q21上的CRYAB基因(OMIM#123590)中的突变引起；

－CMD1JJ(OMIM#615235)，由6q21上的层粘连蛋白α4(LAMA4)基因(OMIM#600133)中的突变引起；

－CMD1KK(OMIM#615248)，由10q21上的MYPN基因(OMIM#608517)中的突变引起；

－CMD1LL(OMIM#615373)，由1p36上的PRDM16基因(OMIM#605557)中的突变引起；

－CMD1MM(OMIM#615396)，由11p11上的MYBPC3基因(OMIM#600958)中的突变引起；

－CMD1NN(OMIM#615916)，由3p25上的RAF1基因(OMIM#164760)中的突变引起；

－CMD2A(OMIM#611880)，由19q13上的肌钙蛋白I，心脏(TNNI3)基因中的突变引起；

－CMD2B(OMIM#614672)，由7q21上的GATAD1基因(OMIM#614518)中的突变引起；

－CMD2C(OMIM#618189)，由1p34上的PPCS基因(OMIM#609853)中的突变引起；

－CMD3A，发现先前指定的X-连锁形式与Barth综合征相同(OMIM#302060)；和

－CMD3B(OMIM#302045)，一种CMD的X-连锁形式，由肌营养不良蛋白基因(DMD，OMIM#300377)中的突变引起。

结蛋白相关肌病或肌病，肌原纤维(MFM)(OMIM#601419)是指一组形态学上同质但遗传上异质的慢性神经肌肉疾病的非正式术语。MFM中骨骼肌的形态改变是由于肌节Z盘和肌原纤维的分解，随后是Z盘结构中涉及的多种蛋白的异常异位积累，包括结蛋白、α-B-晶状体蛋白(CRYAB；OMIM#123590)、肌营养不良蛋白(OMIM#300377)和肌球蛋白(TTID；omim#604103)。肌原纤维肌病-1(MFM1)由染色体2q35上的结蛋白基因(DES；OMIM#125660)中的杂合子、纯合子或复合杂合子突变引起。MFM的其它形式包括MFM2(OMIM#608810)，由CRYAB基因(OMIM#123590)中的突变引起；MFM3(OMIM#609200)(OMIM#182920)，由MYOT基因(OMIM#604103)中的突变引起；MFM4(OMIM#609452)，由ZASP基因(LDB3；OMIM#605906)中的突变引起；MFM5(OMIM#609524)，由FLNC基因(OMIM#102565)中的突变引起；MFM6(OMIM#612954)，由BAG3基因(OMIM#603883)中的突变引起；MFM7(OMIM#617114)，由KY基因(OMIM#605739)中的突变引起；MFM8(OMIM#617258)，由PYROXD1基因(OMIM#617220)中的突变引起；和MFM9(OMIM#603689)，由TTN基因(肌联蛋白；OMIM#188840)中的突变引起。

还发现其它基因中的突变导致不同形式的扩张型心肌病。这些包括：

－桥粒芯胶蛋白2(DSC2，OMIM#125645)，导致致心律失常性右心室发育不良11(OMIM#610476)和扩张型心肌病(Elliott et al.,Circ.Vasc.Genet.,2010,3,314-322)；

－结合斑珠蛋白(JUP或斑珠蛋白；OMIM#173325)，导致致心律失常性右心室发育不良12(OMIM#611528)和扩张型心肌病(Elliott et al.,Circ.Vasc.Genet.,2010,3,314-322)；

－利阿诺定受体2(RYR2；OMIM#180902)，导致致心律失常性右心室发育不良2(OMIM#600996)和室性心动过速，儿茶酚胺能多晶型1(OMIM#604772)和扩张型心肌病(Zahurul,Circulation,2007,116,1569-1576)；

－ATP酶，Ca(2+)-转运慢开关(ATP2A2；ATP2B，肌质网Ca(2+)ATP酶亚型α(SERCA2a)；和

－emerin(EMD)；fukutin相关蛋白(FKRP)；Tafazzin(TAZ)；桥粒斑蛋白(DSP)；以及钠通道，例如SCN1B、SCN2B、SCN3B、SCN4B、SCN4A、SCN5A等。

在一些实施方案中，所述遗传性扩张型心肌病由选自下组的基因中的突变引起：层粘连蛋白，特别是层粘连蛋白α2(LAMA2)和层粘连蛋白α4(LAMA4)；emerin(EMD)；fukutin(FKTN)；fukutin相关蛋白(FKRP)；桥粒芯胶蛋白，特别是桥粒芯胶蛋白2(DSC2)；斑珠蛋白(JUP)；兰诺定受体2(RYR2)；肌质网Ca(2+)ATP酶亚型α(SERCA2a)；受磷蛋白(PLN)；核纤层蛋白A/C(LMNA)；肌营养不良蛋白(DMD)；TITIN-CAP或telethonin(TCAP)；辅肌动蛋白，特别是辅肌动蛋白α-2(ACTN2)；结蛋白(DES)；肌动蛋白，特别是心脏肌动蛋白、肌动蛋白α、心肌(ACTC1)；肌聚糖，特别是肌聚糖δ(SGCD)；肌联蛋白(TTN)；肌钙蛋白，特别是心肌肌钙蛋白、肌钙蛋白T2、心肌(TNNT2)；肌钙蛋白C(TNNC1)和肌钙蛋白I，心肌(TNNI3)；肌球蛋白，特别是肌球蛋白重链7，心肌，β(MYH7)和肌球蛋白重链6，心肌，α(MYH6)；RNA结合基序蛋白20(RBM20)；BCL2相关的永生基因3(BAG3)；桥粒斑蛋白(DSP)；Tafazzin(TAZ)和钠通道如SCN1B、SCN2B、SCN3B、SCN4B、SCN4A、SCN5A等。

在一些具体实施方案中，所述遗传性扩张型心肌病由选自下组的基因中的突变引起：层粘连蛋白，特别是层粘连蛋白α2(LAMA2)和层粘连蛋白α4(LAMA4)；emerin(EMD)；fukutin(FKTN)；fukutin相关蛋白(FKRP)；桥粒芯胶蛋白，特别是桥粒芯胶蛋白2(DSC2)；斑珠蛋白(JUP)；兰诺定受体2(RYR2)；肌质网Ca(2+)ATP酶亚型α(SERCA2a)；受磷蛋白(PLN)；肌营养不良蛋白(DMD)；TITIN-CAP或telethonin(TCAP)；辅肌动蛋白，特别是辅肌动蛋白α-2(ACTN2)；结蛋白(DES)；肌动蛋白，特别是心脏肌动蛋白，肌动蛋白α，心肌(ACTC1)；肌聚糖，特别是肌聚糖δ(SGCD)；肌联蛋白(TTN)；肌钙蛋白，特别是心肌肌钙蛋白，肌钙蛋白T2，心肌(TNNT2)；肌钙蛋白C(TNNC1)和肌钙蛋白I，心肌(TNNI3)；肌球蛋白，特别是肌球蛋白重链7，心肌，β(MYH7)和肌球蛋白重链6，心肌，α(MYH6)；RNA结合基序蛋白20(RBM20)；BCL2相关的永生基因3(BAG3)；桥粒斑蛋白(DSP)；Tafazzin(TAZ)和钠通道，如SCN1B、SCN2B、SCN3B、SCN4B、SCN4A、SCN5A等。优选肌养蛋白(DMD)或肌联蛋白(TTN)。

本发明还提供了用于治疗根据本公开的遗传性扩张型心肌病的方法，包括：向患者施用治疗有效量的根据本公开的Wnt或TGF-β调节剂、核酸构建体、表达载体、病毒颗粒或其组合或药物组合物。

本发明的另一方面涉及根据本公开的Wnt或TGF-β途径调节剂、核酸构建体、表达载体、病毒颗粒或其组合或药物组合物，其用于制备用于治疗遗传性扩张型心肌病的药物。

本发明的另一方面涉及根据本公开的Wnt或TGF-β途径调节剂、核酸构建体、表达载体、病毒颗粒或其组合或药物组合物用于治疗遗传性扩张型心肌病的用途。

本发明的另一方面涉及根据本公开的用于治疗遗传性扩张型心肌病的药物组合物，其包含作为活性化合物的Wnt或TGF-β途径调节剂、核酸构建体、表达载体、病毒颗粒或其组合。

本发明的另一方面涉及根据本公开的包含Wnt或TGF-β途径调节剂、核酸构建体、表达载体、病毒颗粒或其组合的药物组合物，其用于治疗根据本公开的遗传性扩张型心肌病。

本文所用的术语“患者”或“个体”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。优选地，根据本发明的患者或个体是人。

本文所用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”定义为向患者应用或施用一种治疗剂或多种治疗剂(例如，Wnt途径抑制剂和/或TGF-β途径抑制剂)的组合，或向来自患有遗传性扩张型心肌病的患者的分离的组织或细胞系应用或施用所述治疗剂，其目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响遗传性扩张型心肌病或遗传性扩张型心肌病的任何症状。特别地，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指减轻或缓解与遗传性扩张型心肌病相关的至少一种不良临床症状，例如心脏扩张，特别是左心室扩张和收缩功能降低(例如射血分数降低)。

术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”在本文中也用于预防性地施用治疗剂的上下文中。

本发明的药物组合物通常根据已知的方法以有效诱导患者的治疗效果的剂量和时间段施用。药物组合物可以通过任何方便的途径施用，例如以非限制性方式通过输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收。施用可以是全身性的、局部的、或全身性与局部的组合；全身性包括肠胃外和口服，并且局部包括局部和限于局部。全身性施用优选肠胃外施用，如皮下(SC)、肌内(IM)、血管内(如静脉内(IV)或动脉内)；腹膜内(IP)；皮内(ID)、硬膜外或其他。肠胃外施用有利地是通过注射或灌注。

根据本公开的Wnt或TGF-β途径调节剂、核酸构建体、表达载体或病毒颗粒或药物组合物可以与其它治疗活性剂组合使用，其中组合使用是通过同时、分别或顺序施用。

除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员已知的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。

现在将参考附图通过以下实施例举例说明本发明，这些实施例不是限制性的，其中：

附图说明

图1：RNAseq中几个失调基因的qPCR分析(n＝4/组，Student测试)。

图2：转基因表达

A)注射或未注射AAV9-hTnnt2-hCILP载体的DeltaMex5小鼠中hCILP转基因的相对RT-qPCR丰度。B)注射或未注射载体AAV9-4in1shRNA-mLTBP2-GFP的DeltaMex5小鼠中GFP转基因的相对RT-qPCR丰度。Student测试和GFP。n＝4。Student测试。

图3：形态学分析。

A)小鼠的总质量。B)心脏肥大的测量：心脏质量/小鼠总质量(％)

图4：在用AAV9-hTnnt2-hCILP或AAV-shLTBP2处理后的DeltaMex5小鼠和注射PBS的对照中心脏的组织学表征。A)心脏的HPS染色。B)心脏的天狼星红染色。标尺，500μm。C)与健康组织相比，纤维化类型的比例的定量。Student测试。

图5：在用CILP和shLBTP2载体注射的C57BL/6小鼠、DeltaMex5小鼠和DeltaMex5小鼠之间在超声中测量的DCM标志物(左心室质量)的比较。Student测试。

图6：涉及心脏的不同RNA标志物的RT-qPCR测量。测量值表示为与C57BL/6小鼠的比率。Student测试。

图7：心脏纤维化的各种RNA标志物的RT-qPCR测量。测量值表示为与C57BL/6小鼠的比率。Student测试。

图8：WISP2、DKK3和SFRP2转基因的表达。

分别注射或未注射载体AAV9-hTnnt2-hWISP2、AAV9-hTnnt2-hDKK3和AAV9-hTnnt2-hSFRP2的DeltaMex5小鼠中转基因hWISP2、hDKK3、hSFRP2的相对RT-qPCR丰度。测量值表示为与C57BL/6小鼠的比率。n＝4。Student测试。

图9：用AAV9-hTnnt2-hWISP2、DKK3或SFRP2处理后DeltaMex5小鼠中心脏的组织学表征。

与健康组织相比，纤维化类型的比例的定量。Student测试。

图10：WNT研究中涉及心脏和纤维化的不同RNA标志物的RT-qPCR测量。

测量值表示为与C57BL/6小鼠的比率。Student测试。

具体实施方式

1.材料和方法

1.1小鼠模型

本研究中使用的小鼠是雄性肌联蛋白^Mex5-/Mex5-(DeltaMex5)和DBA/2J-mdx(DBA2mdx)品系，以及它们各自的对照，品系C57BL/6和DBA/2。DeltaMex5小鼠缺失了titin基因的倒数第二个外显子(Mex5)(titin^Mex5-/Mex5-；Charton et al.,Human moleculargenetics,2016,25,4518-4532)。DBA2mdx小鼠是由于肌营养不良蛋白基因的外显子23上的点突变引起的杜兴氏肌营养不良的模型。DBA2mdx小鼠在DBA/J背景上，其在调节TGF信号传导途径β活性的蛋白质的LTBP4基因上具有突变(Fukada,et al.2010.Am J Pathol 176,2414-2424)。所有小鼠均根据欧洲人对实验动物的护理和使用指令进行处理，并且动物实验已由Evry动物实验伦理委员会C2AE-51以项目授权申请2015-003-A和2018-024-B的编号批准。

1.2肌肉取样冷冻

收集目标肌肉，称重并在液氮(用于分子生物学分析的样品)或冷却的异戊烷(用于组织学的样品)中冷冻，然后横向或纵向放置在一片涂有阿拉伯树胶的软木塞上。将心脏在心脏舒张期冷冻，然后用稀释的丁二酮溶液(5mM)在tyrode中冷冻。然后将样品储存在-80℃下直至使用。对于整个心脏的天狼星红纤维化观察方案，将整个心脏包埋在石蜡中并在室温下储存。对于透明性方案，将取样的心脏全部储存在4％多聚甲醛中并保持在+4℃。

1.3RNA提取和定量

在-20℃下在低温恒温器(LEICA CM 3050)上将冷冻的异戊烷肌肉切成30μm厚的切片，分成约10-15个切片的eppendorf管并储存在-80℃下。基于核酸在有机溶剂中的溶解性质，使用

法萃取总RNA。以0.5μL/mL/>

的速率向肌肉回收管再提供0.8mL补充有糖原(Roche)的/>

(ThermoFisher)。将管置于FastPrep-24(Millipore)均化器中20s，4m.s.循环。为了回收核酸，在冰上孵育5分钟后，添加0.2mL氯仿(Prolabo)并与/>

混合。在室温下孵育3分钟后，通过在4℃下以12000g离心15分钟来分离水相和有机相的两相。取出含有核酸的水相并置于新管中。然后，通过添加0.5mL异丙醇(Prolabo)沉淀RNA，然后在室温下孵育10分钟，并在4℃下以12000g离心15分钟。用0.5mL 75％乙醇(Prolabo)洗涤核酸沉淀，并再次在4℃以12000g离心10分钟，然后风干。将核酸吸收在50μL无核酸酶的水中，留出20μL用于病毒DNA分析，将30μL添加到以1/50稀释的RNAsin(Promega)中以防止RNA降解。然后，用TURBO DNA酶(Ambion)处理RNA以除去残留的DNA。对用于测序的样品进行双重DNA酶处理。

对于特异于信号传导途径的转录组分析，使用RT2 Profiler PCR Array(Qiagen)板。筛选板需要使用相容的RNA提取试剂盒，RNeasy Mini Kit(Qiagen)，其在柱上提取RNA，按照供应商的说明书使用试剂盒，然后通过Free DNAse RNAse(Qiagen)处理RNA。

然后，在ND-8000分光光度计(Nanodrop)上从2μL RNA读取OD读数以测定它们的浓度。将RNA储存在-80℃下并且将DNA储存在-20℃下。

1.4RNA质量的测量

在制备用于测序的RNA的情况下，在Bioanalyzer 2100(Agilent)上测量RNA的质量，所述Bioanalyzer 2100进行核酸的毛细管电泳，然后进行它们的分析。通过电泳图谱形式的样品的保留率和浓度显现质量。在0-10的标度上计算每个样品的以RIN(用于RNA完整性数)表示的质量得分。根据供应商的说明使用RNA纳米芯片(Agilent)。首先通过尺寸标志物(RNA 6000Nano Ladder,Agilent)，以允许评估样品中的RNA尺寸。将标志物添加到每个样品中，以确定的尺寸出现。对于每个样品，将1μL的RNA沉积在芯片上。在RNA电泳图谱上，观察到核糖体RNA峰：28S(约4000nt)，18S(约2000nt)和5S(约100nt)。内部标志物出现在25nt位置。将INR计算为18S和28S峰值的高度和位置，18S、18S和28S峰值之比以及信噪比的函数。对于RNA-seq，所需的质量要求INR至少为7。

1.5实时定量PCR

基因组和病毒DNA通过qPCR定量，并且基因表达通过实时定量PCR定量。使用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis试剂盒(Thermo-Fisher)对完整信使RNA进行逆转录步骤。两种类型的寡核苷酸：所谓的“随机”六聚体，含有随机序列，和“dT”寡核苷酸，脱氧胸腺嘧啶聚合物，其与polyA序列杂交，使得可以产生完整的cDNA。所使用的混合物示于表1中。

表1：用于逆转录的反应混合物

将混合物置于热循环仪中进行以下循环：在25℃下10min，然后在酶的作用温度42℃下1h15，然后在70℃下10min使酶失活。将cDNA在+4℃短期储存或在-20℃长期储存。

对基因组或病毒DNA进行实时定量PCR用于载体滴定和测量组织中的载体拷贝数，或对从RNA获得的cDNA进行实时定量PCR用于定量转录物。在LightCycler

(Roche)384孔板上进行。包含在ABsolute QPCR ROX Mix(ThermoFisher)中的Thermo-Start DNA聚合酶的核酸酶活性允许通过释放萦光报告基因在每次扩增循环中检测PCR产物。该萦光报告基因是萦光团(对于6-羧基萦光素而言是FAM，或对于2′-氯-7′苯基-1,4-二氯-6-羧基-萦光素而言是VIC)，其位于核苷酸探针的5'，核苷酸探针也在3'标记有淬灭剂(对于四甲基罗丹明而言是TAMRA)。报告基因和猝灭剂的分离导致报告基因的萦光，其通过仪器测量。每种目的基因的混合物由0.2mM的两种寡聚物F(正向，有义)和R(反向，反义)以及相应的0.1mM探针组成。使用对应于携带FAM报告基因的待定量mRNA的20X Taqman GeneExpression Assay(ThermoFisher)引物的商业混合物(表7)。使用VIC报告基因选择在不同条件下不变的编码核糖体蛋白的核糖体磷酸基因RPLP0作为归一化基因。用于扩增RPLP0的引物和Taqman探针如下：m181PO.F(5'-CTCCAAGCAGATGCAGCAGA-3'；SEQ ID NO:15),m267PO.R(5'-ACCATGATGATGCG CAAGGCCAT-3'；SEQ ID NO:16)和m225PO.P(5'-CCGTGGTGCTGATGGGGGGCAAGA A-3'；SEQ ID NO:17)。DNA样品是逆转录后获得的cDNA样品或病毒DNA。PCR反应在384孔板中进行，每个孔以表2中所示的量复制。/>

表2：用于定量PCR的反应混合物

应用以下PCR程序：在95℃预孵育15分钟，然后使用LightCycler480(Roche)在95℃进行45个15秒的扩增循环，然后在60℃进行1分钟。

基因	参照	基因	参照
				miR 142-3p	hsa-miR-142-3p	Tgfb1	Mm01178820_m1
miR 21	hsa-miR-21	Ctnnb1	Mm004893039_m1
				miR 31	mmu-miR-31	mCilp	Mm00557687_m1
Col1a1	Mm00801666_g1	hCilp	Hs01548460_m1
				Myh8	Mm01329494_m1	GFP	Mr 03989638
Tmem8c	Mm00481256_m1	mLtbp2	Mm01307379_m1
				Nppa	Mm01255747_g1	hLtbp2	Hs00166367_m1
Myh7	Mm0060555_m1	mWisp2	Mm00497471_m1
				Myh6	Mm00440359_m1	hWisp2	Hs1031984_m1
Fn	Mm01256744_m1	mDkk3	Mm00443800_m1
				Vim	Mm01333430_m1	hDkk3	Hs00247429_m1
Col1a1	Mm00801666_g1	mSfrp2	Mm01213947_m1
				Col3a1	Mm00802300_m1	hSfrp2	Hs00293258_m1
Timp1	Mm01341361_m1

表3：所用taqman基因表达引物的列表

使用最大二阶导数法，使用

480SW 1.5.1软件(Roche)计算循环定量。定量PCR结果以“Cq”表示，即达到萦光阈值后的循环数。然后，将该值归一化为参照基因RPLP0获得的值。

根据制造商的说明书(RT2 Profiler PCR Arrays,Qiagen)使用线粒体PCR试剂盒(PAMM-087Z)和WNT(PAMM-243Z)和TGF-B(PAMM-235Z)靶筛选。使用

微阵列组织试剂盒(Qiagen)从冷冻组织中进行RNA提取，并用无RNA酶的DNA酶组(Qiagen)处理。使用RT2第一链试剂盒(Qiagen)从500ng RNA获得cDNA，并用作PCR的模板。使用LightCycler480(Roche,Basel,Switzerland)进行qRT-PCR。

1.6RNA测序

1.6.1RNAseq

用于测序的样品是用TRIzol提取的总RNA，用DNA酶处理两次，并且INR质量>7.7。将100ng/μL的2μg RNA样品送至Karolinka研究所进行测序。使用TruSeq Stranded TotalRNA Library Prep Kit(Illumina)制备所用的测序文库，并根据Illumina方案进行测序。使用Fastq-对关联读数，并使用STAR比对与小鼠基因组(mm10)比对。读数的数目与样品中相应RNA的丰度成比例。然后，测序平台提供每个样品的几个文件，包含bam格式的比对文件，用比较的每个样品的读数鉴定的基因列表和伴随以每kb每百万读数片段表示的标准化数字计数值(FPKM)的基因列表。

1.6.2分析

一旦接收到包含测序转录物列表的文件，相互比较样品的第一步是合并不同样品的文件。目标是获得单个表格，对于在研究中鉴定的每个转录物，该表格包含其在每个样品中的读数的数目。然后，用DESeq2软件包在R软件下进行分析：根据读数的数目，将样品归一化，并相对于其对照计算每个样品的差异基因表达。表达差值(或倍数变化)以二进制对数(log2.FC)表示，它们与其调整的P值padj相关联。然后，进行分选步骤以除去：在所有条件下含有少于10个读数的基因、没有显著padj的基因、对于所有条件log2.FC为-0.5至0.5的基因。最终的表用于鉴定在不同条件之间显著差异表达的基因。

1.6.3图形表示

通过用整合基因组观察器(IGV)软件观察bam文件可以观察小鼠基因组(mm10)上读数的比对。不同的R软件包用于RNAseq结果的图形表示。对于Venn图，使用VennDiagram软件包。对于Volcano图，使用ggplot2软件包。使用智能途径分析软件(IPA，Qiagen)和基因本体分类系统PANTHER来可视化数据集中失调的信号传导途径。

1.7组织学

在-20℃下在低温恒温器(LEICA CM 3050)上将冷冻的异戊烷肌肉切成8μm厚的切片。将切片置于刀片上并储存在-80℃下。

1.7.1苏木精-焰红-番红染色

苏木精-焰红-番红(HPS)标记允许观察肌肉的一般外观并突出显示不同的组织和细胞结构。苏木精将核酸染成深蓝色，焰红将细胞质染成粉红色，番红将胶原染成红橙色。

将截面(Cross sections)用Harris苏木精(Sigma)染色5分钟。用水洗涤2分钟后，将切片浸入0.2％(v/v)盐酸醇溶液中10秒以除去过量的染色剂。再次用水洗涤1分钟后，将组织在Scott水浴(0.5g/l碳酸氢钠和20g/l硫酸镁溶液)中染色1分钟，然后再次用水漂洗1分钟并用1％(w/v)焰红染料(Sigma)染色30秒。用水冲洗1分钟30秒后，将切片用70°乙醇脱水1分钟，然后在无水乙醇中冲洗30秒。然后将组织用1％番红(v/v，在无水乙醇中)染色3分钟，并用无水乙醇漂洗。最后，将切片在二甲苯浴中减薄2分钟，然后用切片固定在Eukitt介质中。用耦合到计算机和机动化载物台的Zeiss AxioScan白光显微镜上的物镜10进行图像获取。

从HPS染色的切片，中心核化指数通过中心核化纤维的数目与切片面积(mm²)之比来计算。

1.7.2天狼星红染色

这种染色使胶原纤维染成红色并突出显示纤维化组织的存在。细胞质被染成黄色。

将截面用丙酮脱水1小时，用于冷冻切片或用热和甲苯浴脱蜡。然后将其用4％甲醛固定5分钟，然后在Bouin溶液中固定10分钟。用水洗涤两次后，将切片浸入天狼星红溶液(0.1g天狼星红/100mL苦味酸溶液)中染色1小时。用水冲洗1分钟30秒后，将切片在连续的乙醇浴中脱水：70°乙醇1分钟，95°乙醇1分钟，无水乙醇1分钟，然后第二无水乙醇浴2分钟。最后，将切片在两个二甲苯浴中薄化1分钟，然后用薄片固定在Eukitt介质中。用耦合到计算机和机动化载物台的Zeiss AxioScan白光显微镜上的物镜10进行图像获取。

使用改进的右LEICA显微镜获得偏振光图像，其中偏振器沿着光的路径置于样品之前(偏振器)；并且另一个偏振器置于样品之后(分析器)，其可以用手旋转，给出同时观察透射光和偏振光的可能性。偏振器的主轴彼此成90度取向。使用耦合到Cartograph软件(Microvision,France)的Retiga 2000CCD sensor(QImaging)获得偏振光图。总之，光在到达样品之前穿过第一偏振器，胶原是双折射的，穿过它的光被分成两条光线，这两条光线一旦穿过第二偏振器，将允许对两种类型的天狼星红和剩余心脏组织进行差异观察。

1.7.3天狼星红定量

1.7.3.1天狼星定量

天狼星定量是内部显影的ImageJ pluggin(Schneider et al.,Nature methods,2012,9,671-675)。它是允许分离和定量红色图像像素的阈值宏。其在3个步骤中起作用：第一步是将图像转换为黑色和白色。由天狼星红染色产生的图像对比非常强，因此简单的黑白转换足以保持所有有用的信息。第二步是非常粗略的阈值，以便只保留图像的彩色像素，换句话说，保留属于整个切割的像素。使用具有适应的对象尺寸的分析颗粒函数允许自动检测切片的轮廓，然后存储切片的轮廓。第三步是由用户手动确定阈值，其允许仅将与标记相关联的那些像素保持为红色。手动校正工具可以去除已经检测到的并且没有标记的区域(灰尘、切割褶皱等)，或者增加没有考虑的区域。一旦阈值化图像令人满意，则测量阈值化像素的数目和整个部分中像素的总数。这两个数值之比最终给出切片中的纤维化指数。

1.7.3.2WEKA

通过WEKA plugin(ImageJ)使用人工智能算法处理图像。WEKA分类器插件是使用包含17个代表待分类的不同条件的图像的训练数据集来实现的。将分类指定为健康组织(黄色)，两种类型的染色和切片破裂(白色)。原始映射是大小约为225兆像素(15k×15k)的镶嵌图像，其被分成400帧(20行，20列)，每帧测量约750×750像素。每帧被独立地分类，然后重建完整的图像。测量每个类别中的像素数。将属于心脏的像素总数计算为健康组织和两种类型染料摄取的总和。然后，通过将类别中的像素数除以心脏中的像素总数来计算每个类别的比率。

1.7.3.3整个心脏重构和定量

用具有10X透镜的扫描仪(AxioscanZI，Zeiss)扫描由天狼星红染色的整个心脏的切片。共获得483个图像。使用ImageJ's pluggin对它们进行对准：使用SIFT的线性堆叠对准(Lowe et al.,International Journal of Computer Vision,2004,60,91-110)。当软件不允许令人满意的对准时，一些图像被手动对准。将图像载入Imaris(BitPlane,USA)进行重建和3D可视化。一旦图像对准，使用Otsu阈值(Otsu N,Cybernetics,1979,9,62-66)的全自动模式中的Sirius Quant pluggin产生对应于每个图像的483纤维化比值。使用滑动平均法过滤这些值，滑动平均法是一种减少信号中的噪声以避免使算法自动化中固有的误差的方法。移动平均法的使用允许通过将图像的每个纤维化比率替换为其自身的平均值、在其之前的图像的比率和在其之后的图像的比率来限制这些误差。

1.7.4萦光免疫组织标记

将切片从冰箱中取出并在室温下干燥10分钟，之后用DAKOpen包裹切片。然后，将切片在PBS 1X中再水合5分钟。如果目标蛋白质位于细胞核中，将切片在PBS 1X中的0.3％triton溶液中渗透15分钟，然后在PBS中洗涤3次5分钟。然后，将切片用10％山羊血清、10％胎牛血清、PBS 1X在室温下在湿度室中饱和30分钟。用在PBS 1X+10％封闭溶液中稀释的一抗溶液代替饱和培养基，在湿室中在4℃过夜。在1X PBS中进行四次连续洗涤5分钟，然后在避光湿室中，在室温下，在1X PBS+10％封闭溶液中，与偶联Alexa 488或594(1/1000)萦光染料的二抗溶液杂交1小时。在PBS 1X中进行最后系列的4次5分钟洗涤，并进行含有DAPI的封片剂切片组件。然后，使用萦光显微镜(Zeiss AxioScan或Leica TCS-SP8共焦显微镜)观察切片。

表4：用于免疫组织学的抗体列表.

1.8心脏功能超声分析

通过吸入异氟烷将小鼠麻醉并置于加热平台(VisualSonics)上。连续监测温度和心率。图像由具有707B探针的Vevo 770高频超声心动图(VisualSonics)拍摄。2D模式和M模式(运动)中的超声测量沿左心室最宽水平处的大和小胸骨旁轴进行。使用Vevo 770软件进行定量和定性测量。使用以下公式估计左心室质量：

左心室质量(g)＝0.85(1.04(((心脏舒张期末的左心室直径+心脏舒张期末的心室内隔厚度+心脏舒张期末的后壁厚度)³－心脏舒张期末的心室直径³)))+0.6。

对于小鼠心脏的每次超声，取约5个测量点。然后，使用对应于心脏舒张期左心室最大尺寸的测量点，因为它表示小鼠心脏可以达到的最大舒张。

1.9AAV转移质粒的构建

从Genewiz订购包含表达盒的AAV质粒载体，所述表达盒用于表达侧翼为两个AAV2ITR的完整候选人蛋白(CILP、DKK3、SFRP2和CCN5/WISP2)。表达盒包含在人心肌肌钙蛋白T启动子(hTNNT2)和SV40聚腺苷酸化信号控制下的嵌合内含子之后的编码序列。hCILP的编码序列是在2020年4月25日获得的核苷酸序列GenBank/NCBI登录号NM_003613.4或编码SEQID NO：2的hCILP蛋白的SEQ ID NO：1。hDKK3的编码序列是2020年4月27日获得的核苷酸序列GenBank/NCBI登录号NM_015881.5或编码SEQ ID NO：4的hDKK3蛋白的SEQ ID NO：3。hSFRP2的编码序列是2020年5月31日获得的核苷酸序列GenBank/NCBI登录号NM_003013.3或编码SEQ ID NO：6的hSFRP2蛋白的SEQ ID NO：5。CCN5/WISP2的编码序列是2020年5月3日获得的核苷酸序列GenBank/NCBI登录号NM_003881.3或编码SEQ ID NO：8的hCCN5WISP2蛋白的SEQ ID NO：7。通过在两个AAV2 ITR之间插入不同的表达盒构建AAV转移载体。

从Vigene Bioscience订购用于LTBP2基因抑制的shRNA质粒构建体。构建体包含4个靶向人LTBP2转录物的不同序列的单独shRNA序列和在CMV启动子控制下的GFP报告基因，所述人LTBP2转录物由相反方向的两组H1和hU6启动子表达。shRNA质粒构建体侧接2个AAV2ITR。表5中描述了为LTBP2基因选择的序列。

shRNA序列	SEQ ID NO
		GGAAGTCTAGTGACCAGAATA	11
GCTGGTGAAGGTGCAAATTCA	12
		GCTTCTATGTGGCGCCAAATG	13
GCACCAACCACTGTATCAAAC	14

表5：shRNA序列

1.10质粒的生产

通过用2μL质粒转化45μL DH10B细菌来产生质粒。通过在冰中交替5分钟，在42℃下30秒和在冰上冷却来实现热冲击。然后，加入250μL SOC(超最佳肉汤)培养基，然后在37℃下搅拌孵育1小时。通过在37℃下在含有氨苄青霉素的LB盒(溶原性肉汤)上培养50μL过夜来分离由此转化的细菌，以便选择具有整合的质粒的细菌。第二天移植克隆，在3mL含有抗生素的LB培养基中在37℃预培养几小时。将样品保存在50％甘油中冷冻。然后，在37℃下在含有500mL含有抗生素的培养基和1mL预培养物的2L Erlenmeyer中进行过夜培养。然后，根据供应商的说明书使用NucleoBond PC 2000EF(Macherey Nagel)试剂盒纯化质粒，然后通过0.22μm过滤灭菌并用Nanodrop分析。

用限制酶SMA1和NHE1进行酶消化以检查质粒。将含有1μgDNA、2μL缓冲液快速消化green 10X、1μl每种酶的无菌水(总量为20μl)的混合物在37℃下搅拌20分钟。倒入含有SYBR^TMSafe DNA Gel Stain(Invitrogen)的在TAE(Tris、醋酸盐、EDTA)中的1％琼脂糖凝胶，然后将消化产物和尺寸标志物O'GeneRuler^TMDNA Ladder混合物沉积。

1.11病毒载体生产

使用三转染方法制备重组病毒。HEK293细胞用作包装细胞以产生病毒颗粒。需要三个质粒：提供目的基因的载体质粒、提供Rep和Cap病毒基因的辅助质粒pAAV2-9_Genethon_Kana(Rep2Cap9)病毒基因和含有腺病毒基因并由AAV复制所必需的腺病毒取代共感染的质粒pXX6。然后裂解细胞并纯化病毒颗粒。载体在悬浮液中产生。

细胞接种(第1天)：使用汇合时的HEK293T克隆17细胞接种于1L搅拌烧瓶中：2E5个细胞/mL于400mL F17培养基(Thermo Fisher scientific)中。在37℃-5％CO2-潮湿气氛下搅拌(100rpm)孵育。

细胞转染(第3天)：在培养72小时后，对细胞进行计数并在Vi-CELL上测量细胞活力。对于每种质粒，根据其浓度、大小和烧瓶中细胞的量，在Hepes缓冲液中制备10mg/mL的转染混合物，每种质粒的比例为1。添加转染剂并均化溶液后，在室温下孵育30分钟。将转染混合物和3979μL培养基(F17 GNT改良)转移至含有400mL培养物的摇瓶中，将其在37℃-5％CO2-湿气氛下在搅拌(130rpm)下孵育。48小时后，用Benzonase处理细胞：在F17培养基中稀释Benzonase(终浓度25U/mL)和MgCl2(终浓度2mM)，每个烧瓶添加4mL。

病毒载体收获(第6天)：对细胞计数并在Vi-CELL上测量细胞活力，然后添加2mLtriton X-100(Sigma,1/200th稀释度)，然后在37℃搅拌下孵育2.5小时。将锥形瓶转移至Corning 500mL中并在4℃下以2000g离心15分钟。将上清液转移至新的Corning 500mL中，然后添加100mL的PEG 40％+NaCl并在4℃下孵育4小时。将悬浮液在4℃下以3500g离心30分钟。将沉淀重悬于20mL pH8的TMS(50mM的Tris HCl，150mM的NaCl和2mM的MgCl2，在水中稀释)中，并转移至Eppendorf 50mL中，然后添加8μL benzonase。在37℃下孵育30分钟后，将管在4℃下以10,000g离心15分钟。

氯化铯梯度纯化：为了实现梯度，将10mL的氯化铯以1.3克/mL的密度沉积在超速离心管中。然后，将5mL体积的氯化铯以1.5克/mL的密度置于下面。将上清液轻轻地沉积在氯化铯的顶部，并将管在20℃下以28,000RPM超速离心24小时。观察到两个条带：上带包含空衣壳，和下带对应于完整衣壳。收集两个条带，避免除去杂质。将样品与1.379g/mL密度的氯化铯在新的超速离心管中混合，然后在20℃下以38,000RPM超速离心72小时。除去固体衣壳条。

浓缩和过滤：从病毒制备物中除去氯化铯并在

(Merck)过滤器上进行浓缩。在/>

(Merck)过滤器上，通过截留分子量为100kDa的超滤浓缩载体。Amicon膜首先用14mL 20％乙醇水合，以3000g离心2分钟，然后用14mL PBS平衡，以3000g离心2分钟，然后用14mL 1,379ClCs平衡。将收集的固体衣壳条置于过滤器上并以3000g离心4分钟。添加15mL PBS 1X+F68制剂缓冲液，然后以1500g进一步过滤2分钟。将前三个步骤再重复6次，然后回收最终浓缩物。然后，以0.22μm过滤样品。

滴定：然后，通过定量PCR分析载体。

1.12小鼠处理

将1月龄小鼠(DeltaMex5)和DBA/2J-mdx(DBA2mdx)品系，以及它们各自的对照(品系C57BL/6和DBA/2)以^2e11 vg//小鼠(对于约20g的小鼠，相当于1e13vg/kg的剂量)的剂量静脉内注射AAV载体或PBS。载体表达3个月后，对小鼠的心脏进行超声，然后收集。然后，研究心脏的总体组织学和功能结果。本研究中使用的小鼠是雄性肌联蛋白^Mex5-/Mex5-。

1.13统计

在所有统计分析中，差异在P<0.05(*)时视为显著，在P<0.01(**)时视为中度显著，并在P<0.001(***)时视为高度显著，其中P＝概率。柱状图显示为平均值±SEM标准偏差。使用GraphPad软件制作图表。

纤维化在整个心脏中的分布分析：为了确保纤维化在心脏中是均匀的(H0假设)，我们从483个纤维化比值中随机抽取20个值。将这些值与Wilcoxon检验(软件R)进行10比10的比较以获得p值。该操作重复1000次，得到1000个p值。在这些值中，一些低于0.05，表明在一些情况下我们的纤维化不变性假设是无效的。在1000次统计测试中，我们计数了多少给出了低于0.05的值。我们将整个过程重复100次以获得我们的H0假设为假的百分比的平均值。该平均值为4％。这意味着我们的假设在96％的时间内有效，因此对应于0.04的总p值，这是统计学上可接受的。

超声分析：为了确定参数之间的关系以及哪些参数对于研究是感兴趣的，使用统计软件R。使用scatterplotMatrix函数来可视化不同年龄的测量之间的相关性并选择待研究的参数。统计分析用Rcmdr进行，并且图表用graphpad软件进行。

2.结果

发明人想要确定两种心肌病模型之间是否存在共同的基因表达修饰：DeltaMex5模型和DBA/2-mdx模型，并建立这些失调的年龄和它们的特异性。为此，本发明人对不同年龄的转录组进行了比较研究。

2.1两种心肌病模型的RNAseq分析

在涉及心脏的早期和晚期年龄对来自DeltaMex5和DBA/2-mdx小鼠及其对照的心脏样品进行总RNAseq(RNAseq)测序分析。对于DeltaMex5小鼠，选择1和4月龄，对于DBA/2-mdx小鼠，选择1和6月龄。本文的主要目的是鉴定在建立两种心肌病模型共有的病理学时存在的基因。

根据Illumina方案进行测序。根据其读数(>10)相对于其对照计算每个样品的基因差异表达。表达差值(或倍数变化)以二进制对数(log2FC)表示，它们与其调整的P值padj相关联。不同条件之间显著差异表达的基因通过log2.FC>|0.5|和padj<0.05确定。

RNAseq数据的volcano图允许对心脏中基因分布和基因失调程度以及基因表达程度的每种情况进行可视化。DeltaMex5模型在4月龄时心脏中30个最失调(过表达)的基因的列表呈现于表6中。

表6：在4月龄时DeltaMex5模型心脏中前30个最失调(过表达)的基因。下划线＝特定模型

对于DBA/2-mdx模型，在6月龄时心脏中30个最失调(过表达)的基因的列表呈现于表7中。

表7：在6月龄时DBA/2-mdx模型的心脏中前30个最失调(过表达)的基因。下划线＝特定模型

在4月龄时DeltaMex5模型的心脏中前30个增加的基因包括WNT和TGF-β信号传导途径的基因。特别地，直接属于WNT信号传导途径的两个基因被过表达：编码分泌型卷曲相关蛋白-2的SFRP2(log2FC＝3.62，P＝2.08E-55)，和编码Dickkopf相关蛋白-3的DKK3(log2FC＝3.01，P＝2.78E-32)。直接属于TGF-βWNT信号传导途径的两个基因也被过表达：CILP基因(log2FC＝4.77，P＝4.70E-278)，其编码软骨中间层蛋白，TGF-β途径的负性调节剂(Shindo et al.Int.Journal of Gerontology,2017,11,67-74)和LTBP2(log2FC＝4.74，P＝2.97E-174)，其编码潜在转化生长因子β结合蛋白2，TGF-β途径的调节剂(Sinhaet al.,Cardiovascular Research,2002,53,971-983)。在6月龄时的DBA/2-mdx模型中，发明人发现CILP基因的前5个位置是最失调的基因之一。在1月龄时，失调基因的数目小得多并且失调基因的失调程度较低，其中最大log2FC为1。

RNAseq结果的Venn图表示允许模型或疾病进展阶段中共同或特定失调基因的数目可视化。在RNAseq分析中包括的46,717个基因中，发现与对照相比，在涉及心脏的早期或晚期年龄的任一模型中，4,850个基因显著失调(|log2FC|>0.5且p值<0.05)。在较小的年龄，DeltaMex5小鼠的心脏仅具有44个失调基因，而DBA/2-mdx小鼠的心脏已经具有2,186个，在两种模型中仅共有4个基因。在较大的年龄，DeltaMex5心脏具有2,621个失调基因，并且DBA/2-mdx心脏具有2,202个，其中1,175个为两种模型所共有，其中708个基因对高龄心肌病是特异性的。只有9个基因特异于DeltaMex5模型，而232个特异于DBA/2-mdx模型。在所有失调基因中，较大比例的基因被过表达而不是低表达。大多数过表达的基因在两种模型中是常见的。然而，在4月龄时在DeltaMex5小鼠的心脏中失调基因比在6月龄时在DBA/2-mdx小鼠的心脏中失调基因更强烈地失调(log2FC最大值为4VS6.6)。还观察到，尽管两种模型之间的心脏参与是不同的，但是与它们相关的转录失调主要涉及晚期的相同基因和信号传导途径。

为了完成该分析，使用了Ingenuity Pathway Analysis(IPA,Qiagen)软件，该软件使用生物相互作用和功能注释库以帮助将数据解释为生物机制。在1月龄时，在DeltaMex5和DBA/2-mdx小鼠的心脏中没有发现信号传导途径的增加。通过IPA的分析可以突出其基因在晚期失调基因中最具代表性的生物功能。在两个模型的第一个位置，在RNAseq分析中发现了超过150涉及心血管疾病的基因。在第二个位置，超过150个失调基因被分类为器官的损害和异常家族。最后，在第三个位置，发现了近200个与心血管系统功能和发育相关的基因。

本发明人还使用IPA软件的另一功能来测定与观察到的基因表达变化相关的毒性，并且这仅在晚期。鉴定了许多失调基因：在DeltaMex5模型中86个与心脏增大相关的基因和在DBA/2-mdx模型中85个与心脏增大相关的基因，45/48个可导致心脏功能障碍的基因，38/36个可导致心脏扩张的基因，27/28个可导致心脏纤维化的基因和35/37个可导致心脏坏死的基因。

PANTHER基因本体分类系统也用于确定晚期模型中最失调的信号传导途径。在两种模型中，扰动似乎非常相似，如在Venn Diagrams的分析中所看到。在晚期模型中，WNT信号传导途径发现于DeltaMex5小鼠心脏中最失调的信号传导途径的第4位和DBA/2-mdx小鼠心脏中的第3位。属于该途径的总共40个基因被失调(过表达)，包括SFRP2和DKK3。TGF-β途径发现于DeltaMex5和DBA/2-mdx心脏的第22和19位，具有多于15个失调基因，CILP和LTBP2(两种最过度表达的基因)属于所述失调基因。

2.2失调基因验证

在不同条件下评估了CILP-1、DKK3、SFRP2、LTBP2的失调。还选择了来自Wnt途径的WISP2。

这些基因中没有一个在1月龄时在DeltaMex5模型中过表达，而DKK33已经在DBA2-mdx模型中过表达。所有基因在疾病的晚期都过表达(表8)。

表8：模型中目的基因的失调

然后，通过单独的qPCR对不同年龄(2、4和6月龄)的DeltaMex5模型的心脏进行RNAseq数据的验证，以确认它们的过表达并评估它们随时间的改变。除了DKK3和基因过表达随年龄递增外，所有基因在模型中从2月龄开始显著过表达(图1)。

RNAseq分析表明Wnt和TGF-β途径均受损，并且它们的基因，特别是CILP-1、DKK3、SFRP2和LTBP2在遗传诱导的扩张型心肌病，杜兴氏肌营养不良(DBA2mdx小鼠)和肌联蛋白病(DeltaMex5小鼠)的两种模型中过表达。通过qPCR分析验证所选基因(CILP-1、DKK3、SFRP2、LTBP2和WISP2)的过表达。这些结果促使发明人评估Wnt和TGF-β途径的调节对模型的心脏表型的影响，特别是通过使用基因转移方法调节CILP-1、DKK3、SFRP2和LTBP2基因的表达。

2.3通过基因转移途径的WNT和TGF-β途径的调节

然后，发明人想要评估WNT和TGF-β途径的调节对模型的心脏表型的影响。他们选择通过过表达或通过使用基因转移策略的抑制来研究属于WNT和TGF-β途径的若干基因的调节。

对于基因转移途径，从最失调的基因中选择几个候选基因：属于TGF-β途径的CILP和LTBP2，和属于WNT途径的WISP2/CCN5、DKK3和SFRP2。选择AAV血清型9是因为其被描述为具有显著的心脏向性(Zincarelli et al.,Molecular Therapy,2008,16,1073-1080)。对于转基因表达，选择的启动子是人心肌肌钙蛋白Tnnt2(cTnT)启动子，一种心肌细胞特异性启动子(Wei et al.,Gene,2016,582,1-13)。使用GFP-萦光素酶报告基因验证AAV9载体构建体。

基于这种GFP-萤光素酶构建，本发明人用他们选择的在嵌合内含子之前的转基因取代了编码GFP和萤光素酶的区域。选择的编码序列是以下人序列：TGF-β途径的CILP(NCBI/GenBank登录号NM_003613.4)，以及WNT途径的DKK3(NCBI/GenBank登录号NM_015881.5)、SFRP2(NCBI/GenBank登录号NM_003013.3)和WISP2(NCBI/GenBank登录号NM_003881.3)。

选择用于抑制LTBP2基因表达的策略是使用shRNA。这些是具有发夹结构的小RNA，它们的作用是基于干扰RNA的原理，中和靶的信使RNA。发明人选择了4合1的shRNA以提高转基因中和的效率：四个单独的sh序列一起组合在一个质粒中。使用Thermofisher的RNAi设计器工具选择shRNA。选择对目的基因具有最佳特异性恢复评分的4个shRNA。然后，在H1和U6遍在启动子的控制下从Vigene Bioscience订购它们。

在所考虑的载体的体外和体内验证之后，在DeltaMex5模型(两者中更严重的模型)上进行体内基因转移对纤维化状态和心脏功能的后果的评估。测试了表达TGF-β途径的人CILP基因和WNT途径的WISP2、SFRP2和DKK3的载体以及LTBP2的shRNA抑制载体的效果。目前对DeltaMex5模型感兴趣的方法正在应用于DBA/2-mdx模型。

2.3.1TGF-β途径基因(CILP和LTBP2)的调节

通过CILP(载体AAV9-hTnnt2-hCILP)的过表达和LTBP2(AAV9-4in1shRNA-mLTBP2-GFP)的抑制测试TGF-β途径的调节。将1月龄小鼠以^2e11 vg/小鼠的剂量(对于约20g的小鼠，相当于1e13vg/kg的剂量)静脉内注射AAV载体或PBS。载体表达3个月后，收集前对小鼠的心脏进行超声。然后，研究心脏的总体组织学和功能结果。

通过在RT-qPCR中测定hCILP的相对丰度，在注射AAV9-hTnnt2-hCILP的小鼠中验证心脏中的载体表达。因为转基因是人转基因，所以它仅在注射载体的小鼠中检测到，而在注射PBS的小鼠中检测不到(图2A)。使用GFP报告基因检测载体AAV9-4in1shRNA-mLTBP2-GFP的表达，所述GFP报告基因仅存在于用载体注射的小鼠中(图2B)。这些RT-qPCR测定证实了载体注射后3个月转基因的存在。

2.3.1.1形态学评估

在用AAV9-hTnnt2-hCILP载体处理3个月后的小鼠中，小鼠质量显著降低(29.38±1.29g，n＝4，VS 34.9±1.3g，n＝8，P＝0.024)。用AAV9-4in1shRNA-mLTBP2-GFP载体处理的小鼠的质量保持相似(32.13±1.76，P>0.05)。该值与C57BL/6小鼠的平均体重(28.81±0.72，n＝11)不再显著不同(图3A)。在用AAV9-hTnnt2-hCILP载体处理的小鼠中，心脏肥大(通过心脏质量与总小鼠质量的比率测量)保持接近DeltaMex5小鼠(0.68±0.04，n＝4VS0.63±0.02％，n＝8，P>0.05)，但与C57BL/6小鼠(0.57±0.02％，n＝7，P＝0.027)相比显著增加。相反，与未处理的DeltaMex5小鼠相比，在用AAV9-4in1shRNA-mLTBP2-GFP载体处理的小鼠中其显著降低(0.53±0.048，P＝0.03)，并且变得与C57BL/6小鼠相当(图3B)。

然后，对小鼠心脏进行组织学分析。HPS染色显示用不同载体处理的小鼠中损伤组织的持久性(图4A)。天狼星红染色仍然显示在用两种载体处理的小鼠心脏中存在纤维化组织，但与DeltaMex5对照小鼠相比数量较少(图4B)。通过用天狼星红染色的胶原对组织中的WEKA纤维化的定量证实，与DeltaMex5-PBS小鼠的心脏相比，用AAV9-hTnnt2-hCILP处理的DeltaMex5小鼠心脏中的总体纤维化速率降低(17.59±1.27％VS33.31±4.65％，P＝0.017，n＝4)，尽管其仍高于C57BL/6小鼠中的心脏纤维化速率(7.11±0.77％，P＝0.0004，n＝4)。观察不同类型的纤维化，观察到所安装的纤维化变化很小(4.14±0.45％VS4.95±1.95％，P>0.05)，但最近的纤维化显著较少存在于给予AAV9-hTnnt2-hCILP的DeltaMex5小鼠中(12.64±2.04％VS29.17±4.24，P＝0.0126)(图4C)。用shRNA对AAV处理的样品的定量还没有进行，但是切片的观察表明减少。

2.3.1.2功能评价

在4月龄，载体表达3个月后进行心脏功能的超声分析(图5)。在评估的参数(估计的左心室质量和体积，射血分数)中，在注射AAV9-4in1shRNA-mLTBP2-GFP的小鼠中估计的左心室质量存在显著变化，与DeltaMex5对照相比降低几乎40％(133±4.74mg，n＝4，P＝0.01)。(127±11.05mg，

2.3.1.3分子评估

通过RT-qPCR测量心脏受累的组织RNA标志物(Nppa、Myh7、Myh6、Timp1、Tgf-β1)(图6)。与DeltaMex5-PBS小鼠相比，注射AAV9-hTnnt2-hCILP载体的小鼠中只有TGF-β1显著降低，其中比率接近1(1.25±0.25VS2.13±0.14，P＝0.02)。与DeltaMex5-PBS小鼠相比，注射小鼠中仅Timp1显著降低(31.67±6.98，P＝0.001)。在注射AAV9-4in1shRNA-mLTBP2-GFP载体的小鼠中，Myh6和β-连环蛋白相对于未注射的小鼠增加(0.77±0.035，P＝0.0001和0.99±0.008，P＝0.008)并且相对于C57BL/6小鼠以接近1的比率归一化。相反，TIMP1和TGF-β降低(12.31±3.49，P＝0.0001和1.24±0.11，P＝0.002)，并且TGF-β相对于C57BL/6小鼠归一化。

还通过RT-qPCR测量了纤维化RNA组织标志物(纤连蛋白、波形蛋白、胶原1a1和胶原3a1)(图7)。与注射PBS的小鼠相比，在注射AAV9-hTnnt2-hCILP的小鼠中，纤维化的3个主要标志物显著减少：纤连蛋白(7.72±2.95VS15.67±1.4，P＝0.05)、波形蛋白(1.77±0.43VS3.45±0.27，P＝0.016)和胶原1a1(3.95±1.13VS6.92±0.41，P＝0.049)。胶原3a1呈非显著下降趋势(5.72±1.68VS9.35±0.49，P＝0.08)。这些结果与之前的结果相关：处理小鼠的心脏功能没有改进，但纤维化有改进。有趣的是，与C57BL/6小鼠相比，对于所有标志物，显示最佳结果归一化的小鼠是具有最高hCILP水平的小鼠。在注射AAV9-4in1shRNA-mLTBP2-GFP的小鼠中，纤连蛋白和波形蛋白均降低(4.68±1.91，P＝0.0035和1.25±0.10，P＝0.0003)。波形蛋白相对于C57BL/6小鼠归一化。

2.3.2WNT途径基因(WISP2、DKK3、SFRP2)的调节

通过过表达WISP2、DKK3和SFRP2测试WNT途径的调节。以^2e11 vg/小鼠的剂量或通过PBS静脉内注射1月龄小鼠。载体表达3个月后，在取样前对小鼠的心脏进行超声。

分别通过RT-qPCR测定hWISP2、hDKK3和hSFRP2的相对丰度，在注射AAV9-hTnnt2-hWISP2、AAV9-hTnnt2-hDKK3和AAV9-hTnnt2-hSFRP2的小鼠中测试心脏中的载体表达(图8)。

2.3.2.1形态评估

用三种载体处理的小鼠的质量保持与未处理的DeltaMex5小鼠相似(WISP2:35.7±1.106；DKK3:32.58±1.31g；SFRP2:32.8±1.45g)，以及以心脏质量占小鼠总质量的比例测量的心脏肥大(WISP2:0.55±0.02％；DKK3:0.68±0.05％；SFRP2:0.64±0.06％)。

组织学上，HPS染色显示用三种载体处理的小鼠中损伤组织的持久性。天狼星红染色仍然显示在经处理的小鼠的心脏中存在纤维化组织，但对于AAV9-hTnnt2-DKK3和SFRP2载体似乎较弱。通过天狼星红胶原染色定量组织中的WEKA纤维化显示，对于AAV9-hTnnt2-hDKK3和SFRP2载体，总体纤维化速率降低(DKK3:17.31±4.79％；SFRP2:18.38±3.69％ VS33.31±4.65％,P＝0.01和P＝0.046n＝4)，并且这仅是由于近期纤维化减少(DKK3:11.5±1.01％；SFRP2:12.18±4.66％ VS 29.17±4.24％,P＝0.007和P>0.035n＝4)(图9)。

2.3.2.2功能评估

心脏功能和心室扩张的超声分析显示，与注射PBS的小鼠相比，注射AAV9-hTnnt2-hWISP2、DKK3和SFRP2的小鼠的参数没有变化。在注射AAV9-hTnnt2-DKK3载体的小鼠中，仅左心室质量显著降低30％(133.34±8.44mg,n＝4,VS 190±12.77mg,n＝8,P＝0.01)。

2.3.2.3分子评估

在RT-qPCR中评估的注射AAV9-hTnnt2-hWISP2的小鼠心脏的心脏损伤和纤维化的标志物仅针对相对于注射PBS的小鼠降低的TGF-β和胶原1a1进行修饰，(1.64±0.94，P＝0.03和4.49±0.83，P＝0.04)(图10)，其他标志物未被修饰(图10)。有趣的是观察到，对于所有标志物，相对于C57BL/6小鼠显示最佳恢复比率的小鼠是具有最高hWIPS2水平的小鼠。在注射AAV9-hTnnt2-DKK3的小鼠的心脏中没有标志物显著改变。在注射AAV9-hTnnt2-hSFRP2的小鼠的心脏中，观察到的唯一差异是心脏中胶原1a1和3a1的减少(4.70±0.77，P＝0.043和6.76±0.77，P＝0.048)。再次，观察到对于所有标志物，与C57BL/6小鼠相比显示最佳比率恢复的小鼠是具有最高转基因水平的小鼠。

结论

通过超表达WNT途径基因WISP2、DKK3、SFRP2和TGF-β途径基因CILP-1或抑制TGF-β途径LTBP2基因的表达来调节WNT或TGF-β途径改进了处理3个月后的组织纤维化。经处理小鼠的心脏功能没有改进，但纤维化有改进。

Claims

1.Wnt或TGF-β途径的可表达调节剂，其用于治疗遗传性扩张型心肌病。

2.根据权利要求1所述的用于用途的调节剂，其调节Wnt或TGF-β途径的靶蛋白的活性且选自下组：适配子、抗体、重组靶蛋白、抑制性肽、融合蛋白、诱饵受体、可溶性蛋白和显性失活突变体。

3.根据权利要求1所述的用于用途的调节剂，其调节Wnt或TGF-β途径的靶基因的表达并且选自下组：干扰RNA分子、核酶、基因组或表观基因组编辑酶复合物和靶转基因。

4.根据前述权利要求任一项所述的用于用途的调节剂，其是Wnt途径的抑制剂或激活剂或TGF-β途径的抑制剂。

5.根据权利要求4所述的用于用途的调节剂，其是CILP-1、CCN5/WISP2、DKK3或SFRP2的激活剂或LTBP2的抑制剂。

6.根据权利要求5所述的用于用途的调节剂，其是特异性降低LTBP2表达的干扰RNA；优选包含选自下组的至少一个序列的shRNA：SEQ ID NO:11-14。

7.根据权利要求5所述的用于用途的调节剂，其是编码CILP-1，DKK3、SRFP2或CCN5/WISP2蛋白或其变体的转基因。

8.根据权利要求7所述的用于用途的调节剂，其中所述CILP-1、DKK3、SRFP2、CCN5/WISP2蛋白或其变体包含选自下组的序列：序列SEQ ID NO：2、4、6和8以及与所述序列中的任一个具有至少85％的同一性的序列。

9.根据权利要求5-8任一项所述的用于用途的调节剂，其被插入包含选自下组的心脏启动子的核酸构建体中：人心肌肌钙蛋白T启动子(TNNT2)、α肌球蛋白重链启动子(α-MHC)、肌球蛋白轻链2v启动子(MLC-2v)、肌球蛋白轻链2a启动子(MLC-2a)、CARP基因启动子、α-心肌肌动蛋白启动子、α-原肌球蛋白启动子、心肌肌钙蛋白C启动子、心肌肌球蛋白结合蛋白C启动子和肉瘤/内质网Ca²⁺ATP酶(SERCA)启动子、结蛋白启动子、MH启动子、CK8启动子和MHCK7启动子；优选包含人心肌肌钙蛋白T启动子。

10.根据权利要求9所述的用于用途的调节剂，其中所述核酸构建体包含在用于基因治疗的载体中。

11.根据权利要求10所述的用于用途的调节剂，其中所述载体包含病毒颗粒。

12.根据权利要求11所述的用于用途的调节剂，其中所述病毒颗粒是腺相关病毒(AAV)颗粒。

13.根据权利要求12所述的用于用途的调节剂，其中所述AAV颗粒包含衍生自选自下组的AAV血清型的衣壳蛋白：AAV-1、AAV-6、AAV-8、AAV-9和AAV9.rh74血清型；优选AAV9.rh74血清型。

14.根据前述权利要求任一项所述的用于用途的调节剂，其中所述遗传性心肌病由选自下组的基因中的突变引起：层粘连蛋白、emergin、fukutin、fukutin相关蛋白、桥粒芯胶蛋白、斑珠蛋白、利阿诺定受体2、肌浆网Ca(2+)ATP酶2亚型α、受磷蛋白、核纤层蛋白A/C、肌营养不良蛋白、telethonin、辅肌动蛋白、结蛋白、心肌肌动蛋白、肌聚糖、肌联蛋白、心肌肌钙蛋白、肌球蛋白、RNA结合基序蛋白20、BCL2相关的永生基因3、桥粒斑蛋白、tafazzin和钠通道。

15.根据权利要求14所述的用于用途的调节剂，其中所述遗传性心肌病由肌营养不良蛋白或肌联蛋白基因中的突变引起。