ES2943391T3 - Proteína CCN5 para el tratamiento de una enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne - Google Patents

Proteína CCN5 para el tratamiento de una enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento de la fibrosis cardíaca o enfermedades cardíacas acompañadas de fibrosis cardíaca. De acuerdo con la presente invención, la composición de la presente invención tiene el efecto de disolver una matriz de fibrosis y realizar la restauración de los tejidos normales al destruir selectivamente los miofibroblastos en la fibrosis cardíaca que se diagnostica después de que ocurre una enfermedad y, por lo tanto, puede usarse de manera útil como una composición. para el tratamiento de la fibrosis cardíaca, la insuficiencia cardíaca sistólica y la insuficiencia cardíaca diastólica para las que no se ha desarrollado un agente terapéutico debido a que hasta la fecha se considera una progresión de la enfermedad irreversible. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteína CCN5 para el tratamiento de una enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne
Campo técnico
La presente solicitud de patente reivindica el beneficio de la prioridad para Solicitud de patente coreana No. 10-2015­ 0159888, presentada el 13 de noviembre de 2015 a la Oficina de Propiedad Intelectual de Corea.
La presente invención se relaciona con tratamientos para enfermedades del corazón asociadas con la distrofia muscular de Duchenne.
Antecedentes de la técnica
Los miofibroblastos, que son los principales contribuyentes a la fibrosis cardíaca, se derivan de la diferenciación de fibroblastos que están presentes en el tejido cardíaco, células endoteliales vasculares y células mieloides. Aunque las células de origen de los miofibroblastos pueden ser diferentes, los miofibroblastos diferenciados están involucrados en la sobreproducción de la matriz extracelular, como el colágeno fibrótico, etc. y la secreción de estos. La regresión de las células contráctiles debido a la expresión de actina de músculo liso alfa intracelular (a-SMA) se define como un estado disminuido en comparación con un punto temporal en donde se produce el grado de fibrosis, y la reversión o reversibilidad se refiere a un estado completamente recuperado a una estructura tisular normal.
Las enfermedades fibróticas que representan aproximadamente el 45 % de las muertes provocadas en la sociedad occidental son un problema grave que solo puede diagnosticarse clínicamente después de que las enfermedades hayan progresado mucho (G. Garrison, S.K. Huang et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 48:550558(2013); y Rosenbloom J., et al. Biochim. Biophys. Acta., 1832(7):1088-1103(2013)). Junto con la limitación de los tratamientos preventivos, las enfermedades fibróticas pertenecen a un campo clínico serio en el que no existen medios de tratamiento efectivos para tratar directamente la fibrosis progresiva o preexistente hasta el momento actual (Rosenbloom J, Mendoza FA, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1832(7):1088-1103(2013)). Aunque las causas de las enfermedades fibróticas para inducir fibrosis y las formas de enfermedades que ocurren pueden variar, se encontró que los miofibroblastos (MyoFB) en medio del mecanismo de formación de fibrosis, es decir, los fibroblastos activados, actúan como células activadas patológicamente, controlando así la progresión de todas las enfermedades fibróticas (Dufferield J.S., et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis., 8:241-276(2013)).
En particular, el corazón es un órgano representativo del cuerpo humano en el que la remodelación estructural del tejido muscular cardíaco debido a la fibrosis afecta directamente a la función de ejercicio del corazón. El corazón es un tejido muscular compuesto por diversas células, como los cardiomiocitos que desempeñan un papel fundamental en la función del ejercicio, fibroblastos y células endoteliales que están relacionadas con los vasos sanguíneos, etc. Aunque la mayor parte del volumen de los músculos cardíacos está compuesto por cardiomiocitos, los fibroblastos representan el 50 % o más de las células del tejido cardíaco. Las funciones de los fibroblastos son producir y secretar la matriz extracelular (ECM), que crea una estructura precisa que respalda la contracción y relajación eficientes de los cardiomiocitos, y promueve la transferencia de la fuerza adecuada en el microambiente dentro del tejido del músculo cardíaco, transmisión de señal eléctrica, comunicación intracelular, intercambio de metabolitos, etc. (F.G. Spinale, Physiol. Rev. 87:12851342(2007)). Sin embargo, cuando la fibrosis se produce debido a un aumento de la tensión aplicada en la pared del corazón, el daño en la pared del corazón, enfermedades, etc., se producen cambios en la función del corazón debido a la rigidez del tejido cardíaco causada por la sobreacumulación de matriz tisular extracelular fibrótica. (Schroer A.K. et. al., J. Cell. Sci. 128(10):1865-1875(2015)). En la fibrosis cardíaca, los miofibroblastos que son células causantes de la fibrosis exhiben entornos patológicamente comunes, como daño cardíaco, etc. (Kendall R.T., Feghali-Bostwick C.A., Front Pharmacol., 5:123(2014)). Factores de crecimiento inductores de fibrosis y citoquinas como TGF-p, angiotensina-II (ANG-II), endotelina-I (ET-1), IL-6, factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), el dominio A extra (EDA) de fibronectina, etc. que son secretadas por las células musculares cardíacas dañadas y las células inmunes inflamatorias están involucradas en la diferenciación y activación de los miofibroblastos (Frangogiannis N.G., Nat. Rev. Cardiol. 11(5):255-65(2014)). En el estado de enfermedad crónica, los miofibroblastos promueven de forma autónoma un círculo vicioso de procesos fibróticos mediante su proliferación y activación continuas. Estos factores incluyen la secreción autocrina de TGF-p1 y ANG-II, la expresión del receptor de ANG-II tipo I en fibroblastos por estimulación mecánica a través de la rigidez de los tejidos debido a la sobreproducción de matriz extracelular y la provisión de una nueva función celular secretora debido a la activación de genes que previenen la apoptosis (Wynn T.A., Ramalingam T.R. Nat. Med. 18:1028-1040 (2012)). La continua proliferación y activación de miofibroblastos cuya función de apoptosis se ha perdido conducen a la producción y acumulación de la matriz extracelular provocando la remodelación tisular, así como la función de las células inflamatorias. La secreción de radicales libres de oxígeno, sustancias lipídicas que conducen la transducción de señales y citoquinas como TNF-a promueve la entrada de células inmunitarias inflamatorias a través de la inflamación en los tejidos dañados y la secreción de quimiocinas como MCP-1, etc., avanzando así el proceso de fibrosis reactiva (Van Linthout S., et al., Cardiovasc. Res. 102(2):258-269(2014)). En el corazón, donde se induce la activación prolongada de los fibroblastos, se producen tejidos fibróticos, lo que provoca diversos efectos patológicamente adversos. 1) Las células musculares cardíacas circundantes que están envueltas por colágeno fibrótico se atrofian, por lo que existen en diversos tamaños y reducen la carga de ejercicio de las células musculares (Drakos S.G., et al. L. Am. Coll. Cardiol. 27;56(5):382-391(2010)). 2) El aumento de la rigidez pasiva del tejido produce tejidos de fibras contráctiles mediante el entrecruzamiento del colágeno tipo 1 secretado y la unión comunicante de miofibroblastos, lo que da como resultado una disfunción diastólica del corazón (Lo B. et al. Hypertension 60:677683(2012)). 3) La fibrosis perivascular da como resultado la apoptosis de las células del músculo cardíaco debido a una disminución en el metabolismo energético normal porque la anomalía en la contracción y relajación de los vasos de las arterias coronarias reduce el suministro de oxígeno en el músculo cardíaco. Coen, M., Gabbiani, G. & Bochaton-Piallat, ML Arterioscler. Thromb. Vasc.Biol, 31:23912396(2011)). Por lo tanto, cuando dicha remodelación fibrosa se prolonga, se presenta un proceso de relajación a insuficiencia cardíaca sistólica desde insuficiencia cardíaca diastólica debido a la contracción de las células del músculo cardíaco y la aparición de apoptosis (Kamalov G., Zhao W., et al. J Cardiovasc. Pharmacol. 62(6):497-506(2013)).
Las formas de fibrosis de los tejidos cardíacos se clasifican en fibrosis de reemplazo que forma tejidos cicatriciales para evitar una ruptura cardíaca rápida cuando se produce la necrosis de una gran cantidad de células del músculo cardíaco, como el infarto de miocardio, produce una necrosis extensa de las células musculares, como el infarto de miocardio, y fibrosis intersticial y perivascular que es fibrosis reactiva que se propaga gradualmente debido a diversas enfermedades (Bharath Ambale-Venkatesh y Joao AC Lima, Nat. Rev. Cardiol. 12:18-29 (2015)). Las enfermedades cardíacas acompañadas de fibrosis cardíaca incluyen 1) hipertrofia miocárdica asociada con anomalías genéticas, 2) enfermedades cardíacas asociadas con enfermedades metabólicas crónicas como hipertensión, enfermedad renal crónica, diabetes, obesidad, etc., 3) enfermedad de las válvulas cardíacas, 4) enfermedad cardíaca asociada con enfermedades inflamatorias como sarcoidosis, miocarditis autoinmune y respuestas de rechazo relacionadas con el trasplante cardíaco, etc., 5) cardiopatía estructural como disfunción coronaria, estenosis aórtica, miocardiopatía dilatada no isquémica, etc., 6) enfermedades infecciosas como la enfermedad de Chagas, miocarditis viral, etc., 7) enfermedad cardíaca congénita como enfermedad cardíaca cianótica, tetralogía de Fallot, transposición de grandes arterias, ventrículo único, etc., 8) enfermedades cardíacas asociadas con enfermedades genéticas como la distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, enfermedad de Fabry, etc., y 9) enfermedades del corazón que se producen debido a la exposición a sustancias químicas tóxicas como el tabaquismo, consumo de alcohol, fármacos contra el cáncer, etc., y en el proceso natural de envejecimiento (Schelbert E.B., Fonarow G.C., J. Am. Coll. Cardiol.
63(21):2188-2198(2014); Collier P., et al., QJM. 105(8):721-724(2012); Maron B.J, Maron M.S., Lancet.
381(9862):242-255(2013); Kong P., Christia P., et al. Cell. Mol. Life Sci. 71(4):549-574(2014); y Mavrogeni S., Markousis-Mavrogenis G., et al. World J. Cardiol. (7):410-414(2015)). Además, cuando la fibrosis progresa independientemente del tipo de factores causantes de la enfermedad, el corazón muestra una relación causal entre la rigidez de los ventrículos cardíacos y, en consecuencia, la insuficiencia cardíaca, como la disfunción cardíaca sistólica y diastólica (Weber K.T., Sun Y., et al. Nat. Rev. Cardiol. 10 (1): 15-26 (2013)). Recientemente, la insuficiencia cardíaca se ha clasificado clínicamente en dos categorías dependiendo de la función cardíaca anormal, que son fracción de eyección normal cuya causa directa es la rigidez fibrótica del ventrículo izquierdo insuficiencia cardíaca con fracción de eyección conservada (HFpEF) que presenta una función diastólica anormal, e insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (HFrEF) que muestra una fracción de eyección reducida que es la causa de la pérdida de células musculares cardíacas, anomalías en la función sistólica y expansión del corazón (Burchfield J.S., Xie M., Hill J.A., et al. Circulation 128 (4): 388-400 (2013); y Butler J., Fonarow G.C., et al. JACC Heart Fail. 2(2): 97-112(2014)). Los factores de riesgo para HFpEF incluyen envejecimiento, diabetes y enfermedades metabólicas, hipertrofia cardíaca, enfermedad de las arterias coronarias e hipertensión, y estos factores causan fibrosis cardíaca y una insuficiencia cardíaca diastólica progresiva. Además, en el caso de HFrEF, la apoptosis como el infarto de miocardio, etc. es la causa principal, pero además de la fibrosis alternativa, se reportó que un aumento en la difusión de la fibrosis intersticial es proporcional a un aumento en la severidad de la enfermedad, y actúa como un factor de empeoramiento de la enfermedad (Borlaug B.A., Nat. Rev. Cardiol. 11(9):507-515(2014)).
Se informaron estudios preventivos sobre fibrosis cardíaca en el modelo de insuficiencia cardíaca inducida por sobrecarga de presión de ratones transgénicos con factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) sobreexpresado o ratones transgénicos en los que el gen de endoglina, que es un factor de apoyo de TGF-p, es deficiente. En cada modelo de ratón transgénico, se inhibió la transición endotelial a mesenquimatosa (EndoMT) de las células endoteliales vasculares a miofibroblastos, lo que mostró un efecto de prevención del empeoramiento de la función cardíaca de progresión a fibrosis cardíaca e insuficiencia cardíaca, pero no hubo verificación de el efecto terapéutico para la fibrosis que ya se generaba (Okayama
K., Azuma J., et al. Hypertension 59(5):958-965(2012); y Kapur N.K., et al. Circulation 125(22):2728-2738(2012)).
El tratamiento de la fibrosis requiere un medio de tratamiento para promover el regreso reversible de la enfermedad, como la eliminación del exceso de tejido fibrótico acumulado, restauración de la función del tejido dañado, etc. La regulación de la senescencia y muerte de miofibroblastos en el tratamiento de enfermedades fibróticas ha sido presentada utilizando los resultados de muchos estudios con posibilidad de dianas terapéuticas efectivas (Darby I.A., et al. Clin. Cosmet. Investig. Dermatol. 7:301-311(2014)). Recuperación de la estructura y función tisular normal en el proceso de cicatrización de la lesión del tejido in vivo se inicia cuando los fibroblastos activados desaparecen debido a senescencia y apoptosis. La disolución y eliminación de la matriz fibrótica extracelular acumulada se debe a la secreción y acción limpiadora de las colagenasas en macrófagos y fibroblastos, y tras la lesión se produce la recuperación (Wynn T.A, Ramalingam TR. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat Med.
18: 1028-40 (2012)). Sin embargo, existe un reporte de que la posibilidad de tratamiento reversible de la fibrosis y la recuperación está relacionada con la recuperación reversible de los síntomas de cirrosis hepática entre los pacientes que recibieron tratamiento antirretroviral, y hay un reporte de que la remodelación de la estructura muscular rara vez se revierte debido a la fibrosis cardíaca en el proceso de uso de un dispositivo de asistencia ventricular izquierda para pacientes con insuficiencia cardíaca y se mejora la función del corazón (Sun M., Kisseleva T., Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol. 39 Suppl. 1: S60-63(2015); y Jeff M. Berry, et al. Circ. Res. 109:407417(2011)). Este hecho es un nuevo desafío para el conocimiento convencional de que la fibrosis no se puede tratar de forma reversible hasta la fecha y presenta una nueva estrategia de tratamiento para la fibrosis. Por lo tanto, el tratamiento de la fibrosis progresiva y ya formada se basa en el mecanismo de inhibición de la proliferación de miofibroblastos que son células patógenas que están involucradas en la aparición y el progreso de la fibrosis e induciendo la apoptosis, a través de este método de tratamiento, es necesario desarrollar un medio terapéutico que puede regular la formación y digestión de la matriz extracelular fibrótica y recuperarla a un tejido normal.
CCN5 es una proteína celular de sustrato que pertenece a la familia CCN, y se conocen seis tipos de proteínas en la familia CCN, y se informa que desempeña diversos papeles en la regulación de funciones celulares, como enfermedad vascular, angiogénesis, carcinogénesis, inducción de enfermedades de fibrosis, diferenciación celular y supervivencia (Perbal B. Lancet, 363:62-4(2004)). CCN5 no tiene un dominio C-terminal a diferencia de otras proteínas de la familia CCN y tiene otros nombres como WISP-2, HICP, Cop1, CTGF-L, etc. Además, consta de una sola cadena polipeptídica de 250 secuencias de aminoácidos. CCN5 tiene una secuencia de inducción de secreción de 22 aminoácidos en su terminal N, que se secreta extracelularmente y funciona como una proteína de señalización (Russo J.W., et al. J. Cell. Commun. Signal. 4(3):119-130(2010)).
La terapia génica se utiliza en diversos campos para comprender el mecanismo de las enfermedades cardiovasculares a nivel genético, descubrir genes terapéuticos, diseñar vectores de transferencia de genes y tecnología de empaque, y tecnología de administración para animales grandes en experimentos preclínicos y en ensayos clínicos con pacientes (Mason D., et. al. J. Control Release 215:101-111(2015)). En el caso de un vector no viral para vectores genéticos, se informaron resultados clínicos de fase II para mejorar la función del corazón de pacientes con infarto de miocardio mediante un método de administración que inyecta directamente un vector genético SDF-1 en la región alrededor de una herida del corazón. Además, se utilizaron, en el caso de un vector viral, un método en el que el adenovirus (Ad) y el virus adenoasociado (AAV) se inyectan directamente en el miocardio mediante terapia de administración génica y una técnica de administración al pasar el mismo localmente a las arterias y venas del sistema coronario (Chung E.S., Miller L., et al. Eur. Heart J. 36(33):2228-2238(2015)). Se finalizó la clínica IIb de la terapia génica de AAV1-SERCA2a, que mejora la recuperación de la fuerza de contracción y función de los músculos cardíacos para los pacientes, y AAV9-S 100A1 y Ad5-Adenilil-ciclasa 6 están en etapas clínicas, y no hubo efecto secundario grave debido a vectores de virus (Rincón M.Y., et al. Cardiovasc. Res. 108(1):4-20(2015)). Por lo tanto, a través de los estudios proporcionados aquí, se reveló que la proteína CCN5 es eficaz en el tratamiento de la fibrosis cardíaca preexistente, que se produce por diversas causas, a través de su mecanismo apoptótico selectivo de los miofibroblastos que son las células patógenas de la fibrosis, mediante el método de administración de genes.
El documento EP2556839A2 describe una composición farmacéutica para prevenir o tratar una insuficiencia cardíaca y un método para cribar un agente terapéutico para prevenir o tratar una insuficiencia cardíaca. La composición farmacéutica comprende la proteína CCN5 o CCN2ACT, o un portador genético que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CCN5 o CCN2ACT.
Dongtak Jeong et al. (2016) "Matricellular Protein CCN5 Reverses Established Cardiac Fibrosis", Journal of the American College of Cardiology, vol. 16, núm. 13, 1556-1568, divulga que CCN5 puede revertir la fibrosis cardíaca establecida inhibiendo la generación y potenciando la apoptosis de miofibroblastos en el miocardio.
Dongtak Jeong et al. (2014) " Abstract 20344: CCN5 Reverses Fibrosis and Cardiac Dysfunction Induced by Pressure Overload in Murine Models", Circulation. Vol. 130, A20344, mostró que CCN5 provocó la reversión de la fibrosis cardíaca preformada, que estuvo acompañada por la recuperación funcional de los corazones con fallo a través de la inhibición de la transdiferenciación en miofibroblastos y la inducción selectiva de apoptosis en miofibroblastos.
Yoon et al. (2010) " The Opposing Effects of CCN2 and CCN5 on the Development of Cardiac Hypertrophy and Fibrosis", Journal of Molecular and Cellular Cardiology, vol. 49 (2), 294-303, evaluó el papel de Cc N2 y Cc N5 en el desarrollo de hipertrofia y fibrosis cardíacas. Yoon et al. mostró que CCN2 es prohipertrófico y profibrótico, mientras que CCN5 es antihipertrófico y antifibrótico. CCN5 que carece del dominio CT actúa como una molécula negativa dominante.
Divulgación de la invención
Problema técnico
Los inventores de la presente invención han realizado intensos esfuerzos para desarrollar tratamientos para revertir la fibrosis cardíaca o una enfermedad cardíaca acompañada de fibrosis cardíaca, más específicamente una enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne. Como resultado, se encontró que el gen CCN5 o la proteína CCN5 elimina selectivamente los miofibroblastos, reduce notablemente la fibrosis cardíaca y es capaz de tratar la fibrosis cardíaca progresiva o preexistente. También se confirmó que existe un efecto terapéutico en la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (HFrEF) o insuficiencia cardíaca con fracción de eyección conservada (HFpEF) acompañada de fibrosis cardíaca.
Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de una enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne, en donde dicha composición comprende una proteína CCN5; o un portador de genes que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CCN5, como ingrediente activo y en donde dicho método comprende administrar dicha composición a un sujeto que lo necesita en una cantidad suficiente para inducir la apoptosis específica de miofibroblastos.
Otros objetos y ventajas de la presente invención resultarán más evidentes a partir de la descripción detallada de la presente invención, las reivindicaciones adjuntas y las figuras.
Solución al problema
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para uso en un método para tratar una enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne, en donde dicha composición comprende una proteína CCN5; o un portador de genes que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína CCN5, como ingrediente activo y en donde dicho método comprende administrar dicha composición a un sujeto que lo necesita en una cantidad suficiente para inducir la apoptosis específica de miofibroblastos.
Como resultado de los intensos esfuerzos de investigación para desarrollar un método para tratar de forma reversible la fibrosis cardíaca o una enfermedad cardíaca acompañada de fibrosis cardíaca, más específicamente una enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne, los presentes inventores han descubierto que el gen CCN5 o la proteína CCN5 elimina selectivamente los miofibroblastos para reducir significativamente la fibrosis cardíaca, y es posible tratar la fibrosis cardíaca progresiva o preexistente y tener un efecto terapéutico en la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (HFrEF) o insuficiencia cardíaca diastólica con fracción de eyección conservada (HFpEF).
La enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne tratable de acuerdo con la invención puede implicar fibrosis cardíaca progresiva o fibrosis cardíaca preexistente. Como se describió antes, recientemente, existe la posibilidad de que la fibrosis se pueda tratar de forma reversible y, como se demuestra en el ejemplo a continuación, los miofibroblastos se eliminan selectivamente mediante la composición farmacéutica de la presente invención y, en consecuencia, se recuperó la fibrosis preexistente, por lo tanto, se confirmó el efecto terapéutico para la fibrosis cardíaca progresiva o la fibrosis cardíaca preexistente. Por lo tanto, una característica importante de la presente invención es que la composición farmacéutica de la presente invención induce la apoptosis específica de miofibroblastos.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la proteína CCN5 de uso en la presente invención incluye una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CCN5 de uso en la presente invención consta de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2.
Un portador de genes que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CCN5, que es un ingrediente activo de la composición farmacéutica de la presente invención, se usa en un sistema de administración de genes que transfiere el gen CCN5 al corazón. El término "transferencia de genes", como se usa aquí, significa que un gen se transporta a una célula y tiene el mismo significado que la transducción intracelular de un gen. A nivel de tejido, el término "administración de genes" tiene el mismo significado que "propagación de un gen". Por lo tanto, el sistema de administración de genes de uso en la presente invención se puede describir como un sistema de transducción de genes y un sistema de propagación de genes.
Para preparar el sistema de administración de genes para uso en la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CCN5 (por ejemplo, el gen de la proteína c CN5) puede estar presente en una construcción de expresión apropiada. En la construcción de expresión anterior, el gen de la proteína CCN5 se puede conectar operativamente a un promotor. Como se usa aquí, el término "unido operativamente" se refiere a una asociación funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (por ejemplo, promotor, secuencia señal o una matriz del sitio de enlace de un regulador transcripcional) y otra secuencia de ácido nucleico, por lo que la secuencia de control regula la transcripción y/o traducción de la otra secuencia de ácido nucleico. El promotor unido a la secuencia del gen de la proteína c CN5, de acuerdo con una realización de la presente invención, funciona en una célula animal y, de acuerdo con otra realización, funciona en una célula de mamífero, para regular la transcripción del gen de la proteína CCN5, e incluye un promotor derivado de un virus de mamífero y un promotor derivado del genoma de células de mamífero, y puede incluir, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor tardío de adenovirus, un promotor de virus vaccinia 7.5K, un promotor de SV40, un promotor tk de HSV, un promotor de RSV, un promotor de EF1 alfa, un promotor de metalotioneína, un promotor de beta-actina, un promotor del gen de la IL-2 humana, un promotor del gen del IFN humano, un promotor del gen de la IL-4 humana, un promotor del gen de la linfotoxina humana y un promotor del gen de GM-CSF humano, pero sin limitación. De acuerdo con una realización particular de la invención, el promotor es un promotor de CMV.
Aunque el portador de genes de uso en la presente invención se puede preparar en diversas formas, se puede preparar en forma de un portador de virus o un portador de no virus, y más específicamente, (i) una molécula de ADN recombinante desnuda, (ii) un plásmido, (iii) un vector viral, y (iv) un liposoma o niosoma que encapsula la molécula o plásmido de ADN recombinante desnudo.
La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CCN5 de uso en la presente invención se puede aplicar a todos los sistemas de administración de genes utilizados para la terapia génica convencional, preferiblemente, a plásmidos, adenovirus (Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Re. 3:2075-2080(1997)), virus adenoasociados (AAV, Lashford L.S., et al., Gene Therapy Technologies, Application and Regulations Ed. A. Meager, 1999), retrovirus (Gunzburg W.H., et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Application and Regulations Ed. A. Meager, 1999), lentivirus (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11): R55-62(1999)), virus del herpes simple (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1411-1415(1995)), virus vaccinia (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), liposomas (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds), Humana Press 2002), o niosomas.
Adenovirus
El adenovirus se usa ampliamente como vector de transferencia de genes debido a su tamaño de genoma moderado, conveniencia de operación, alto título, amplia gama de células diana e infectividad superior. Ambos extremos del genoma contienen una repetición terminal invertida (ITR) de 100 a 200 bp, que es un elemento cis esencial para la replicación y el empaquetamiento del ADN. La región E1 del genoma (E1A y E1B) codifica una proteína involucrada en la replicación del ADN viral.
Entre los vectores adenovirales actualmente desarrollados, se usa ampliamente el adenovirus incompetente para la replicación que carece de la región E1. Mientras tanto, la región E3 se elimina del vector adenoviral convencional y proporciona un sitio en el que se insertan genes extraños (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551 (1982); y Riordan, J.R. et al., Science, 245:1066-1073 (1989)). Por lo tanto, es preferible que el gen de la proteína CCN5 de uso en la presente invención se inserte en la región E1 eliminada (región E1A y/o región E1B, preferiblemente región E1B) o región E3, más preferiblemente en la región E3 eliminada. Mientras tanto, la secuencia de nucleótidos diana que se administrará intracelularmente se inserta en la región E1 eliminada (región E1A y/o región E1B, preferiblemente región E1B) o región E3, preferiblemente región E3. Además, también se puede expresar mediante un sistema de expresión bicistrónico en el que "promotor-secuencia de nucleótidos diana-secuencia poli A-gen de la proteína IRES-CCN5" está conectado por el sitio de entrada del ribosoma interno (IRES).
Además, dado que el adenovirus puede empaquetar hasta aproximadamente el 105 % del genoma de tipo salvaje, se pueden empaquetar adicionalmente aproximadamente 2 kb (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739 (1987)). Por lo tanto, las secuencias foráneas descritas anteriormente, que se insertan en el adenovirus, se pueden unir más al genoma del adenovirus.
Los adenovirus tienen 42 serotipos y subgrupos de AF diferentes. Entre ellos, el adenovirus tipo 5 perteneciente al subgrupo C es el material de partida más preferido para la obtención del vector adenoviral de uso en la presente invención. La información bioquímica y genética del adenovirus tipo 5 es bien conocida en la técnica.
Los genes extraños administrados por adenovirus se replican de la misma manera que los episomas, y la toxicidad genética contra las células huésped es muy baja. Por lo tanto, se considera que la terapia génica que usa el sistema de administración de genes de adenovirus que se usa en la presente invención es muy segura.
Retrovirus
Los retrovirus se utilizan como vectores de transferencia de genes porque estos virus pueden insertar sus propios genes en el genoma del huésped, transportar una gran cantidad de material genético extraño y tener un amplio espectro de células que pueden infectarse.
Para construir un vector retroviral, el gen de la proteína CCN5 y la secuencia de nucleótidos diana a transferir se insertan en el genoma retroviral en lugar de la secuencia retroviral para producir un virus incompetente para la replicación. Para generar viriones, se construyen líneas celulares de empaquetamiento, que contienen genes gag, pol y env, pero no repeticiones terminales largas (LTR) y secuencias ^ (Mann et al., Cell, 33: 153-159 (1983)). Cuando se transfiere el plásmido recombinante que incluye el gen de la proteína CCN5, la secuencia de nucleótidos diana que se va a administrar, el LTR y la secuencia ^ a la línea celular, la secuencia ^ permite la producción del transcriptoma de ARN del plásmido recombinante, el transcriptoma se envasa en un virus y el virus se descarga en el medio (Nicholas and Rubinstein "Retroviral vectors", In: Vector: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham L Butterworth, 494-513 (1988)). El medio que contiene el retrovirus recombinante se recolecta, concentra y usa como sistema de administración de genes.
Se informó la transferencia de genes utilizando el vector retroviral de segunda generación. Kasahara, et al. (Science, 266: 1373-1376 (1994)) produjeron una variante del virus de la leucemia murina de Mohrluny, donde se insertó una secuencia de eritropoyetina (EPO) en el sitio envolvente para producir una proteína quimérica. El sistema de administración de genes de uso en la presente invención también se puede producir con base en una estrategia de construcción de vectores retrovirales de segunda generación de este tipo.
Vector AAV
El virus adenoasociado (AAV) es adecuado para el sistema de administración de genes de uso en la presente invención porque puede infectar células que no se dividen y tiene la capacidad de infectar diversos tipos de células. Una descripción detallada de la preparación y el uso de vectores AAV se divulga en detalle en las patentes de Estados Unidos 5,139,941 y 4,797,368.
Los estudios sobre AAV como un sistema de administración de genes se describen en LaFace, et al., Viology, 162: 483-486 (1988), Zhou, et al., Exp. Hematol. (NY), 21: 928-933 (1993), Walsh, et al., J. Clin. Invest., 94: 1440-1448 (1994) y Flotte, et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995). Recientemente se lleva a cabo la fase clínica 2 del vector AAV como tratamiento de la insuficiencia cardíaca.
Por lo general, el virus AAV es un plásmido que incluye una secuencia de gen diana (el gen de la proteína CCN5 y la secuencia de nucleótidos diana que se va a administrar), en el que dos repeticiones terminales de AAV se disponen una al lado de la otra (McLaughlin et al., J. Virol. y Samulski, et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)) y plásmidos de expresión que incluyen secuencias codificantes de AAV de tipo salvaje sin repeticiones terminales (McCarty, et al. J. Virol., 65:2936-2945 (1991)).
El virus AAV tiene nueve serotipos diferentes (AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9). Entre estos, AAV1, AAV6, AAV8 o AAV9 es el material de partida más preferido para obtener el vector de virus adenoasociado de uso en la presente invención.
Otros vectores virales
También se pueden usar otros vectores virales como el sistema de administración de genes de uso en la presente invención. Virus vaccinia (Puhlmann M, et al., Human gene therapy 10: 649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," En: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) y Coupar, et al., Gene, 68: 1-10(1988)). Vectores derivados de lentivirus (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104 (11): R55-62 (1999)) o virus del herpes simple (Chamber R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 1411-1415 (1995)) también se puede usar como un sistema de administración capaz de transportar el gen de la proteína CCN5 y la secuencia de nucleótidos de interés para administrarse en la célula.
Liposoma
Los liposomas se generan automáticamente a partir de fosfolípidos dispersos en agua. Los ejemplos de la administración exitosa de moléculas de ADN extraño a liposomas se describen en Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982) y Nicolau, et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987). Por su parte, la lipofectamina (Gibco BRL) es el reactivo más utilizado para la transformación de células animales mediante liposomas. Los liposomas que encapsulan el gen de la proteína CCN5 y la secuencia de nucleótidos diana que se administrarán interactúan con las células y administran el gen de la proteína CCN5 y la secuencia de nucleótidos diana que se administrará a la célula a través de mecanismos tales como endocitosis, adsorción a la superficie celular, fusión con membranas de células plasmáticas, etc.
De acuerdo con la presente invención, cuando se prepara un portador génico a base de un vector viral, el método de inyección de la composición farmacéutica de la presente invención se lleva a cabo de acuerdo con métodos de infección viral conocidos en la técnica. La infección de células huésped usando vectores virales se describe en los documentos de referencia mencionados anteriormente.
De acuerdo con la presente invención, cuando el sistema de administración de genes es una molécula de ADN recombinante desnudo o un plásmido, el método de microinyección (Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980); y Harland y Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), el método de precipitación con fosfato de calcio (Graham, F.L., et al., Virology, 52:456 (1973); y Chen y Okayama, Mol. Cell. Biolo. 7:2745-2752 (1987)), el método de electroporación (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); y Tur-Kaspa, et al., Mol. Cell. Biol., 6:716-718(1986)), el método de transfección mediado por liposomas (Wong, T.K., et al., Gene, 10:87 (1980); Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982); y Nicolau, et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), método de tratamiento con DEAEDextrano (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) y el bombardeo genético (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) se puede utilizar para insertar genes en las células.
La descripción detallada de los portadores de genes que se pueden usar en la presente invención se divulga en detalle en la Publicación de patente de Estados Unidos No. 2013/0287739.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el portador de genes de uso en la presente invención se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un adenovirus, un virus adenoasociado, un retrovirus, un lentivirus, un virus del herpes simple, virus vaccinia, un liposoma y un niosoma. De acuerdo con otra realización de la presente invención, el portador génico de uso en la presente invención es un virus adenoasociado, y de acuerdo con otra realización más de la presente invención, el virus adenoasociado de uso en la presente invención se selecciona del grupo que consiste en el virus adenoasociado serotipo 1, 6, 8 y 9. De acuerdo con una realización particular de la presente invención, el portador génico de uso en la presente invención es el virus adenoasociado serotipo 9.
De acuerdo con la presente invención, la composición farmacéutica de la presente invención induce la apoptosis específica de miofibroblastos y puede inhibir la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos y, por lo tanto, es eficaz en el tratamiento de la enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne.
Como se demuestra en el ejemplo a continuación, la composición farmacéutica de la presente invención expresa CCN5 en un corazón insuficiente a través de la terapia génica de AAV9-CCN5 en un modelo de sobrecarga de presión, que es un modelo de insuficiencia cardíaca sistólica, un modelo de insuficiencia cardíaca diastólica muscular regresiva, y un modelo de ligadura aórtica diastólica-isquemia-reperfusión-desligado (AID), con el fin de tratar reversiblemente la fibrosis cardíaca para prevenir la reducción de la función cardíaca sistólica y diastólica o tratar la misma. Además, dado que la composición farmacéutica de la presente invención también aumenta la proteína SERCA2a responsable de la función de bombeo de la circulación sanguínea al aumentar la fuerza sistólica cardíaca, también se puede predecir el efecto terapéutico directo sobre la HFrEF y, por lo tanto, y, así, el efecto terapéutico también se puede predecir cuando los síntomas de HFrEF y HFpEF coexisten.
Las enfermedades de fibrosis cardíaca incluyen una enfermedad cardíaca seleccionada del grupo que consiste en cardiomiopatía hipertrófica; una enfermedad cardíaca debida a enfermedades metabólicas crónicas tales como hipertensión, enfermedad renal crónica, diabetes y obesidad; enfermedad cardíaca valvular; enfermedad cardíaca inflamatoria como sarcoidosis, miocarditis autoinmune, un rechazo en trasplante cardíaco, etc.; enfermedad cardíaca inflamatoria como disfunción de la arteria coronaria, estenosis aórtica, miocardiopatía dilatada no isquémica, etc.; enfermedad cardíaca estructural; una enfermedad cardíaca debido a una infección patógena contagiosa como la enfermedad de Chagas y miocarditis viral, etc.; enfermedad cardíaca congénita como enfermedad cardíaca cianótica, tetralogía de Fallot, transposición de grandes arterias, ventrículo único, etc.; una enfermedad cardíaca debida a una anomalía hereditaria como la distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, enfermedad de Fabry, etc.; una enfermedad cardíaca debida al tabaquismo, ingesta de alcohol o exposición a fármacos tóxicos (por ejemplo, fármacos contra el cáncer); y enfermedad cardíaca debido al envejecimiento.
La composición farmacéutica de la presente invención puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable. El portador farmacéuticamente aceptable incluido en la composición farmacéutica de la presente invención es el que se usa convencionalmente para la formulación, y los ejemplos del mismo incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato de calcio, alginato, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio, aceite mineral, etc., pero la presente invención no se limita a ello. La composición farmacéutica de la presente invención puede incluir además un lubricante, un agente humectante, un edulcorante, un agente saborizante, un agente emulsionante, un agente de suspensión, un conservante, etc. además de los componentes anteriores. Los portadores y formulaciones farmacéuticamente aceptables adecuados se describen en detalle en Remington's Pharmaceutical Sciences (19.a ed., 1995)). La cantidad de inyección de la composición farmacéutica de la presente invención se determina deseablemente teniendo en cuenta la edad, sexo y estado del paciente, el grado de absorción de los ingredientes activos en el cuerpo, la rata de inactivación y el fármaco que se utilizará en combinación con el fármaco que toma actualmente el paciente, y se puede inyectar a una dosis de 0.0001 mg/kg (peso corporal) a 100 mg/kg (peso corporal) según el nucleótido que codifica el gen de la proteína CCN5.
La composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar por vía oral o parenteral, y la administración parenteral incluye inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección percutánea, inyección directa en tejidos, etc.
La forma de dosificación de la composición farmacéutica puede diferir según el método de uso, pero se puede preparar como emplastos, gránulos, polvos, jarabes, soluciones, extractos fluidos, emulsiones, suspensiones, infusiones, comprimidos, inyecciones, cápsulas y píldoras. etc.
La composición farmacéutica de la presente invención se puede formular usando un portador y/o excipiente(s) farmacéuticamente aceptables de acuerdo con un método que puede ser llevado a cabo fácilmente por una persona con conocimientos ordinarios en el campo técnico al que pertenece la invención, y puede prepararse mediante infusión en forma de volumen unitario o en un recipiente de varios volúmenes y puede incluir además un dispersante o un estabilizador.
Un ingrediente activo utilizado en la composición farmacéutica de la presente invención no es solo el propio portador del gen que incluye la proteína CCN5 anterior o la secuencia de nucleótidos que la codifica, sino también una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable.
Como se usa aquí, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de un ingrediente activo de uso en la presente invención que tiene el efecto farmacológico deseado, es decir, induce la apoptosis específica de miofibroblastos y, opcionalmente, inhibe la diferenciación de fibroblastos y tiene una actividad de destrucción selectiva de fibroblastos. Estas sales se forman usando ácidos inorgánicos como clorhidrato, bromhidrato y yodhidrato y ácidos orgánicos como acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, bisulfato, sulfamato, sulfato, naftilato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, propionato de ciclopentano, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, 2-hidroxietano sulfato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, tosilato y undecanoato. Como se usa aquí, el término "hidrato farmacéuticamente aceptable" se refiere a un hidrato de CCN5 que tiene el efecto farmacológico deseado. Como se usa aquí, el término "solvato farmacéuticamente aceptable" se refiere a un solvato de un ingrediente activo de uso en la presente invención que tiene el efecto farmacológico deseado. El hidrato y solvato mencionados anteriormente también se pueden preparar utilizando los ácidos mencionados anteriormente.
También se describe aquí un método para cribar una composición farmacéutica para tratar la fibrosis cardíaca o una enfermedad cardíaca acompañada de fibrosis cardíaca, que incluye las etapas de: (a) tratar una sustancia de prueba en células que incluyen la proteína CCN5 o el gen CCN5; (b) analizar la expresión de la proteína CCN5 o del gen CCN5.
De acuerdo con el método anterior, en primer lugar, una muestra a analizar se pone en contacto con células que incluyen la proteína CCN5 o el gen CCN5. En ciertos casos, la célula que incluye la proteína CCN5 o el gen CCN5 es una célula derivada de un corazón. El término "sustancia de prueba", que se utiliza para referirse al método de cribado anterior, se refiere a una sustancia desconocida utilizada en el cribado para comprobar si afecta el nivel de expresión del gen de la proteína CCN5 o la cantidad de la proteína CCN5. La sustancia de prueba incluye, pero no se limita a, sustancias químicas, nucleótidos, ARN antisentido, ARNsi (ARN pequeño de interferencia) y extractos de productos naturales.
Posteriormente, se mide el nivel de expresión del gen CCN5 o la cantidad de la proteína CCN5 en las células tratadas con la sustancia de prueba. Como resultado de la medición, cuando se determina que el nivel de expresión del gen CCN5 o la cantidad de proteína CCN5 está sobrerregulado, la sustancia de prueba puede designarse como agente terapéutico para la fibrosis cardíaca; o el de una enfermedad cardíaca acompañada de fibrosis cardíaca.
La medición de los cambios en el nivel de expresión del gen CCN5 se puede llevar a cabo mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, RT-PCR (Sambrook, et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), inmunoprecipitación northern (Peter B. Kaufman, et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC Press), reacción de hibridación utilizando micromatrices de ADNc (Sambrook, et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)) o reacción de hibridación in situ (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), etc.
Cuando se lleva a cabo sobre la base del protocolo RT-PCR, primero se separa el ARN total de las células tratadas con la sustancia de prueba y luego se prepara la primera cadena de ADNc utilizando cebador oligo dT y transcriptasa inversa. Posteriormente, se realiza una reacción de PCR usando el conjunto de cebadores específicos del gen de la proteína CCN5 usando la primera cadena de ADNc como molde. Por lo tanto, los productos de amplificación por PCR se someten a electroforesis y las bandas formadas se analizan para medir los cambios en el nivel de expresión del gen de la proteína CCN5.
También se describe aquí un método para tratar la fibrosis cardíaca o una enfermedad cardíaca acompañada de fibrosis cardíaca mediante la administración a un sujeto de una composición farmacéutica que incluye (a) proteína CCN5; o (b) un portador de genes que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína CCN5, como ingrediente activo.
El método de tratamiento anterior puede utilizar la composición farmacéutica de la presente invención descrita anteriormente, y para los contenidos comunes en relación con la composición farmacéutica de la presente invención mencionada anteriormente, se omite la descripción de esta para evitar una complejidad excesiva.
Efectos ventajosos de la invención
Las características y ventajas de la presente invención se resumen a continuación:
(A) La presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne.
(B) Dado que la composición farmacéutica de la presente invención tiene los efectos de disolver un sustrato fibrótico mediante la destrucción selectiva de miofibroblastos en la fibrosis cardíaca y la recuperación de los mismos en un tejido normal, puede usarse eficazmente como composición farmacéutica para tratar una enfermedad cardíaca asociada con distrofia muscular de Duchenne, que se ha considerado como una progresión de la enfermedad irreversible y para la que hasta ahora no se ha desarrollado un fármaco terapéutico.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es el resultado de determinar los cambios en el nivel de expresión de la proteína CCN5 en el tejido cardíaco de insuficiencia cardíaca de (A) humanos y (B) ratones con anticuerpos anti-CCN5 y anti-GAPDH (** P < 0.01). La figura 2 muestra la cantidad de expresión de proteína CCN5 en tejido cardíaco 4 semanas después de la inyección de AAV9-CCN5 en la vena de la cola de ratas experimentales (n = 6, * P < 0.05).
Las figuras 3a-3e muestran el efecto terapéutico reversible y el efecto protector de la función cardíaca de AAV9-CCN5 para la fibrosis cardíaca preexistente en ratas experimentales modelo de sobrecarga de presión. La figura 3a muestra el programa experimental de inducción del modelo de sobrecarga de presión y la inyección de terapia génica AAV-CCN5 para determinar el efecto terapéutico reversible. La parte superior de la figura 3b muestra el grado de fibrosis de un tejido cardíaco utilizando el método de tinción Masson-Trichrome. La parte superior es fibrosis del tejido intersticial, la parte inferior es fibrosis del tejido perivascular y el porcentaje de fibrosis en cada tejido se indica mediante puntos. La figura 3c es el resultado de teñir la sección transversal del tejido cardíaco con anticuerpo anti-a-SMA (proteína diana de miofibroblastos) usando tinción fluorescente. La imagen representativa de la izquierda muestra un tejido intersticial y la imagen representativa de la derecha muestra un tejido perivascular. La parte inferior es un gráfico que muestra el grado de células que expresan a-SMA. La figura 3d es el resultado de la medición por citometría de flujo (FACS, n = 3, * P< 0.05, ** P < 0.01). La figura 3e midió el acortamiento fraccional (FS) y la dimensión interna del ventrículo izquierdo en sístole (LVIDs) del corazón, y la dimensión interna del ventrículo izquierdo en diástole (LVIDd) (n = 16, * P < 0.05).
Las figuras 4a-4c muestran que las proteínas AAV9-CCN5 y CCN5 inducen la apoptosis de miofibroblastos in vivo y a nivel celular. La figura 4a muestra un programa experimental en un modelo de rata con sobrecarga de presión, y la figura 4b muestra el resultado de la tinción de cortes de tejido cardíaco simultáneamente con la tinción TUNEL (rojo) y el anticuerpo anti-a-SMA (verde), que es una proteína específica de los fibroblastos. La figura 4c también muestra cuantitativamente el grado de apoptosis de los miofibroblastos (n = 3, ** P < 0.01) para cada grupo experimental en la figura 4b.
Las figuras 4d-4f muestran el resultado de los experimentos después de cultivar cardiomiocitos (Myo), fibroblastos (FB) y miofibroblastos (MyoFB) durante 48 horas en un medio de cultivo celular de control y un medio de cultivo celular que incluye proteína CCN5. La figura 4d es el resultado de la tinción con DAPI, en donde la flecha indica los núcleos picnóticos y la figura de la derecha muestra el número de núcleos picnóticos en un gráfico. La figura 4e es el resultado de la tinción de las células cultivadas bajo las mismas condiciones con la tinción TUNEL, en donde la flecha indica los núcleos que muestran TUNEL, y la figura de la derecha es el número de núcleos que muestran la fluorescencia TUNEL que se muestra en un gráfico (n = 3, ** P < 0.01). La figura 4f muestra el resultado del análisis por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) después de cultivar fibroblastos y miofibroblastos en un medio de control (CM-Con) y un medio (CM-CCN5) que incluye proteína CCN5 durante 48 horas (n = 3, ** P < 0.01).
Las figuras 5a-5e muestran el mecanismo de apoptosis selectiva de miofibroblastos por la proteína CCN5 (n = 3, ** P < 0.01). La figura 5a es el resultado de colocar fibroblastos y miofibroblastos en un medio de control (CM-Con) o un medio que incluye proteína CCN5 y cultivar el mismo durante 1 día o 2 días, y luego separar las proteínas de las células y realizar inmunoprecipitación western. La figura 5b es el resultado de realizar el método inmunoquímico utilizando el anticuerpo anticitocromo C en la célula anterior. La figura 5c es el resultado de la inmunoprecipitación western utilizando n F-kB, vimentina y anticuerpo anti-a-SMA en las células anteriores. Además, las figuras 5d-5e son los resultados del análisis del indicador NF-kB y la tinción de fluorescencia con anticuerpo anti-NF-xB en fibroblastos y miofibroblastos.
La figura 6 muestra (A) la preparación de la célula que sobreexpresa la proteína CCN5 y (B) la secreción en líquidos del medio de acondicionamiento y su actividad.
La figura 7 muestra los efectos sobre la inducción de la diferenciación de miofibroblastos y la diferenciación de la proteína CCN5 después de tratar células de músculo cardíaco y miofibroblastos del tejido cardíaco de ratas con TGF-P.
La figura 8 muestra los efectos de AAV9-CCN 5 en la transducción de señales de TGF-p en el grupo de control y ratas modelo con sobrecarga de presión (n = 3, ** P < 0.01).
Las figuras 9a-9c muestran el efecto de la proteína AAV9-CCN5 y CCN5 en el resultado de que las células endoteliales vasculares se transdiferencian en fibroblastos por la actividad de TGF-p (transición endotelial a mesenquimatosa, EndoMT) y progresan en miofibroblastos in vivo y a nivel celular. La figura 9a muestra un programa de inyección del gen AAV-CCN5 y cirugía gastrointestinal/cirugía de estenosis aórtica cruzada del Scl-Cre-ERT; Modelo de ratón transgénico doble R26RparadaYFP. Las figuras 9b-9c son el resultado del método inmunoquímico mediante el cual se sometió a muestreo el tejido cardíaco del modelo de ratón 8 semanas después de la cirugía (n = 3, *P < 0.05, ** P < 0.01). La figura 9d es el resultado de tratar TGF-p en células endoteliales de arteria coronaria humana (HCAEC) y cultivar en un medio de control y un medio que contiene la proteína CCN5 durante 48 horas, y luego llevar a cabo inmunoquímica para teñir con anti-VE-cadherina y anticuerpos anti-vimentina. La figura 9e muestra el resultado de raspar las células endoteliales de arteria coronaria humana cultivadas (HCAEC) por la misma área, cultivarlas bajo las mismas condiciones del medio que la figura 9d, fijar las células y teñirlas con DAPI y medir la movilidad celular (n = 4, * P < 0.05, ** P < 0.01), y la figura 9f es el resultado de la medición de los niveles de expresión de ARNm de a-SMA, colágeno I, colágeno III, Tie2 y CD31 por qRT-PCR (n = 6, * P < 0.05, ** P < 0.01).
Las figuras 10a-10f muestran el efecto de la proteína AAV9-CCN5 y CCN5 en la transdiferenciación de fibroblastos en miofibroblastos por la actividad de TGF-p in vivo y a nivel celular. La figura 10a muestra un programa de inyección del gen AAV-CCN5 y cirugía gastrointestinal/cirugía de estenosis cruzada aórtica de un modelo de ratón de 8 semanas de edad. La figura 10b es el resultado de realizar inmunoquímica tomando muestras del tejido cardíaco del modelo de ratón 8 semanas después de la cirugía. La figura 10c es un gráfico que muestra células que expresan a-SMA simultáneamente en células que expresan vimentina (n = 3, P < 0.05, ** P < 0.01). La figura 10d es el resultado del tratamiento de fibroblastos con TGF-p, cultivar en un medio que contiene la proteína CCN 5 durante 48 horas y teñir con anticuerpo anti-a-SMA realizando DAPI y método inmunoquímico. La figura 10e es el resultado que confirma la inhibición de la diferenciación de fibroblastos por TGF-p de CCN5 utilizando el método de contracción del gel de colágeno (n = 3, P < 0.05, ** P < 0.01), y la figura 10f es el resultado de la medición del grado de los niveles de expresión de ARNm de a-SMA y colágeno I mediante qRT-PCR cuantitativa (n = 6, P < 0.05, ** P < 0.01).
La figura 11 muestra el efecto terapéutico reversible y la protección de la función cardíaca frente a la fibrosis cardíaca de AAV9-CCN5 en ratones modelo de distrofia muscular por regresión (distrofia muscular de Duchenne, DMD). La figura 11A muestra un programa experimental de inducción de envejecimiento muscular en ratones modelo distróficos regresivos e inyección de terapia génica AAV9-CCN5 para confirmar el efecto terapéutico reversible. La figura 11B y figura 11C muestran el grado de fibrosis del tejido cardíaco que se confirmó utilizando la tinción de Masson-Trichrome. El intervalo de fibrosis en cada grupo experimental se expresó como un gráfico de barras de porcentaje (n = 3 a 4, p < 0.001).
La figura 12 muestra los resultados de la medición para mejorar la función cardíaca de AAV9-CCN5 en ratones modelo de distrofia muscular por regresión (DMD). La figura 12A muestra el resultado de medir la proporción de acortamiento ventricular (n = 3 a 7, p < 0.005). La figura 12B muestra el resultado de la medición de la función hemodinámica del corazón con la relación presión-volumen telesistólica media (ESPVR) (N = 6 a 7, p < 0.05).
La figura 13 es el resultado de confirmar cambios en la expresión de proteínas asociadas a fibrosis por AAV9-CCN5 en ratones modelo de distrofia por regresión muscular (DMD) mediante inmunoprecipitación western.
La figura 14 es el resultado de confirmar cambios en la expresión de genes asociados con fibrosis por AAV9-CCN5 en ratones modelo de distrofia por regresión muscular (DMD) por el método qRT-PCR.
La figura 15 muestra el efecto de AAV9-CCN5 sobre el tratamiento reversible de fibrosis cardíaca preexistente y contractilidad cardíaca en un modelo de rata de insuficiencia cardíaca con ligadura aórtica-isquemia-reperfusióndesligado (AID). La figura 15A muestra un programa experimental de la inducción del modelo de rata AID y la inyección de terapia génica AAV-CCN5 para confirmar el efecto terapéutico reversible. La parte superior de la figura 15B muestra el grado de fibrosis cardíaca de las células intersticiales utilizando el método de tinción Masson-Trichrome. La parte inferior muestra el grado de fibrosis cardíaca en la región periférica del vaso sanguíneo. La figura 15C muestra el área relativa donde se produjo la fibrosis cardíaca en cortes de corazón (n = 5 a 8, p < 0.05, B y C).
La figura 16 muestra los resultados de la medición para mejorar la función cardíaca de AAV9-CCN5 en el modelo de rata AID. La figura 16A muestra la rata de acortamiento del ventrículo obtenida mediante análisis ultrasónico cardíaco (n = 5 a 8, ** P < 0.01). La figura 16B muestra el efecto de AAV9-CCN5 sobre la función cardíaca en el modelo de rata AID con resultados de análisis de bucle de presión-volumen. La figura 16C muestra los valores de las relaciones de presión-volumen telesistólica (ESPVR) y las relaciones de presión-volumen diastólica final (EDPVR) que son resultados representativos del análisis hemodinámico de AAV 9-CCN 5 (N = 6, p < 0.05, B y C). Muestra el efecto de AAV9-CCN5 sobre la función cardíaca en el modelo de rata AID mediante resultados hemodinámicos de análisis de bucle de presión-volumen. El valor de ESPVR indica la función sistólica del corazón, y el valor de las relaciones presión-volumen diastólica final (EDPVR) indica la función diastólica del corazón.
Ejemplo
Todos los experimentos con animales se realizaron a base de la aprobación y regulación del Animal Protection and Use Committee of Gwangju Institute of Science and Technology (GIST) y School of Medicine at Mount Sinai. El análisis de los experimentos se realizó de acuerdo con las directrices del NIH sobre protección y uso de animales.
Método experimental
Construcción de modelo animal (modelo de insuficiencia cardíaca) de sobrecarga de presión por constricción aórtica transversa (TAC)
Para el estudio se utilizaron ratones macho C57BL/6 de 8 a 10 semanas de edad (peso corporal de 25 a 30 g) de Jackson Laboratory. Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal usando una solución hecha de 95 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilazina. Se inspiró a los ratones utilizando un respirador de oxígeno a una rata de respiración diaria de 0.2 y una rata de respiración de 11 respiraciones por minuto (aparato de Harvard). Para observar el arco aórtico, se realizó una incisión longitudinal de 2 a 3 mm en la región alrededor del esternón proximal. Se colocó una aguja de calibre 27 entre la arteria innominada y la arteria carótida común izquierda para conectar el arco aórtico en dirección transversal. Se retiró la aguja inmediatamente y se cubrió el sitio de la incisión.
Modelo de insuficiencia cardíaca en animales genéticamente DMD
Se adquirió C57BL/10ScSn (Dmdmdx/Utrntm1Jrs) de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se usaron ratones macho MDX/UTRN (+/-) de 9 meses de edad o más para experimentos para inducir de manera confiable la enfermedad cardíaca distrófica muscular regresiva. Los ratones macho son un modelo que muestra la relevancia clínica de la distrofia muscular de Duchenne, que es un trastorno genético congénito relacionado con el cromosoma X de los humanos.
Construcción de un modelo complejo de insuficiencia cardíaca (modelo AID) de sobrecarga de presión e isquemiareperfusión
Se utilizó un modelo complejo de insuficiencia cardíaca en el que se realizaron simultáneamente la sobrecarga de presión y la isquemia-reperfusión en ratas. Se utilizaron ratas Sprague-Dawley con un peso corporal de 180 a 200 gramos. El segundo espacio intercostal se abrió con toracotomía y la aorta ascendente se rodeó con una porción laminada 4-0 como un tubo PE-50 con un diámetro exterior de 0.965 mm y se extrajo el tubo PE-50. Este procedimiento se utilizó para aplicar una sobrecarga de presión al corazón. Dos meses más tarde, la arteria coronaria descendente anterior izquierda se anudó durante 30 minutos y se reperfundió. En detalle, el vaso sanguíneo se anudó por completo con una sutura 6-0 en un punto 4 mm por debajo del extremo izquierdo del corazón y se liberó 30 minutos después. Además, un mes después, se liberó por completo la sutura que anudaba la aorta ascendente. Este complejo modelo de insuficiencia cardíaca se llama ligadura aórtica-isquemia-reperfusión-desligado (AID), y tarda 4 meses en construirse.
Análisis de la función del corazón: Ecocardiografía transtorácica y dinámica sanguínea in vivo
Se anestesiaron animales experimentales de ratón modelo mediante inyección intraperitoneal de ketamina a una concentración de 100 ug/g. Para las imágenes bidimensionales y el trazado en modo M, se utilizó un convertidor de 15.0 MHz (GE Vivid 7 Vision) para determinar las ratas de acortamiento ventricular y las dimensiones para informar el acortamiento del músculo papilar del ventrículo izquierdo. Las ratas se anestesiaron mediante isoflurano, después de insertar un tubo mediante broncotomía. El corazón se conectó al nudo en el epicardio del ventrículo izquierdo utilizando siete cristales de sonomicrómetro (Sonometrics, London, Ontario, Canadá) realizando una incisión torácica. El convertidor de presión Millar SP-671 se insertó a través de la pared anterior del ventrículo izquierdo. Los datos se recopilaron utilizando el software disponible comercialmente SonoLab, y las mediciones hemodinámicas se realizaron en un intervalo de presión de precarga y poscarga después del cierre temporal de la vena cava inferior y la aorta. Los datos de la función cardíaca se analizaron utilizando una serie de algoritmos generados por MATLAB (v 7.0, The MathWorks, Natick, MA). Los experimentos de ecocardiografía se llevaron a cabo durante todo el período experimental por el mismo experimentador para aumentar la precisión de los experimentos. Se requirió una frecuencia cardíaca mínima de 550 bpm para mejorar la precisión de los experimentos, pero esto se llevó a cabo para incluir una evaluación estructural y funcional minimizando la subestimación de la función cardíaca relacionada con la bradicardia. Las mediciones se realizaron tres veces para cada ratón y el promedio se calculó y expresó como un valor numérico. El análisis hemodinámico in vivo se realizó con un catéter de conductancia presión-volumen (PV) de 1.2 Fr (Scisense, Ontario, Canadá). Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal con una solución compleja de uretano (1 mg/g), etomidato (10 pg/g) y morfina (1 pg/g) y mediante la inserción de un tubo a través de una incisión bronquial, se utilizó ventilación mecánica para establecer respiración a 125 por minuto y la rata de respiración a 7 ul/g. El catéter de PV se colocó dentro del ventrículo izquierdo con una metodología de vértice y los datos de PV se analizaron utilizando el software IOX2 (tecnologías EMKA). El desafío de estrés cardíaco se midió inyectando dobutamina en una solución salina a una concentración creciente de 1 pg/ml, 10 pg/ml, 100 pg/ml y 1 mg/ml, y específicamente, a través de un catéter venoso central insertado en la vena yugular derecha con un intervalo de tiempo de 10 minutos para normalizar los parámetros hemodinámicos.
Construcción e inyección de vector viral adenoasociado (AAV)
Para construir AAV autocomplementario (serotipo 9), el gen CCN5 humano se clonó en el vector pds-AAV2-EGFP. Para evitar la inhibición del empaquetamiento del virus, se preparó la secuencia de eGFP para la construcción del vector AAV. El AAV recombinante se construyó usando células 293T. Las partículas de AAV en la solución de cultivo celular se recolectaron y precipitaron con sulfato de amonio, que luego se purificaron mediante ultracentrifugación usando un gradiente de yodixanol. Las partículas de AAV se concentraron a través de varias diluciones reemplazando el yodixanol con solución de Lactato de Ringer. La concentración de AAV se cuantificó usando RT-PCR cuantitativa y SDS-PAGE. AAV-VLP y AAV-CCN5 se inyectaron con 5 * 1010 - 1 x 1011 genomas de virus en la vena de la cola de ratones y ratas modelo.
Expresión de CCN5 activo recombinante
Para producir la proteína CCN5 se utilizó el plásmido pcDNA3.1-CCN5HA. Las células HEK293 se extendieron en una placa de Petri de 60 mm a 5 * 105 para estabilizar las células durante 1 día. Posteriormente, se infectó ADNpc3.1-CCN5HA utilizando lipofectina. Después de 4 horas, para eliminar la lipofectina, se reemplazó con medios acondicionados (CM) en los que se había eliminado el plasma. A partir de entonces, el CCN5 secretado obtenido después de cultivar durante 24 horas se denominó CM-CCN5, que se usó para el experimento. La expresión de la proteína CCN5 se confirmó mediante inmunoprecipitación western y se confirmó usando un anticuerpo anti-HA marcado con CCN5.
Separación de fibroblastos residentes
Ratas macho de 8 semanas de edad (Damul Science) se sometieron a anestesia respiratoria con isoflurano y se les extrajo el corazón. Después de insertar la cánula aórtica en la aorta, las ratas se colgaron rápidamente del aparato de Langendorff y se extrajeron los tejidos innecesarios adheridos al corazón. Usando una perfusión de rata constante, un fluido fisiológico (regulador de tiroides; composición: 125 mM/L de NaCl, 5 mM/L de KCl, 12.5 mM/L de HEPES, 11 mM/L de glucosa, 10 mM/L de BDM, taurina 5, MgCb 2.4). Utilizando el fluido fisiológico, después de eliminar suficientemente la sangre, se perfundió durante 50 minutos una solución enzimática a 37 ° C (300 pg/mL de enzima colagenolítica II, 80 pg/mL de ácido hialurónico) que estaba saturada al 100 % para descomponer el tejido cardíaco. A través de este proceso, después de que se descompuso el tejido cardíaco, se pipeteó varias veces, y luego los tejidos y las células individuales que no estaban completamente descompuestas se separaron a través del filtro celular de 70 pm. La mayor diferencia entre las células del miocardio y otras células que componen el corazón (fibroblastos, células endoteliales y células del músculo liso) es el tamaño de las células. Utilizando esta característica, la solución de células filtradas se centrifugó a 25 g durante 3 minutos para separar las células miocárdicas. Se eliminó el sobrenadante y se centrifugó durante 10 minutos a 250 g para separar fibroblastos, células endoteliales y células de músculo liso. Las células así obtenidas se mezclaron en un medio de cultivo que contenía DMEM (glucosa baja/FBS al 10 %/antibiótico al 1 %), se esparcieron en una placa de cultivo y se incubaron a 37 ° C en una incubadora con CO2 al 5 % durante 4 horas. Los fibroblastos tienen características estabilizadas de adherirse a las placas de cultivo en poco tiempo, lo que es diferente de otras células. Por lo tanto, después de 4 horas, se reemplazó el medio y se eliminaron entre medio otras células excepto los fibroblastos, que eran células que se estabilizaron adhiriéndose a la placa de cultivo. Después de cambiar el medio al día siguiente, se cultivaron fibroblastos mientras se reemplazaba el medio cada dos días (Skrzypiec-Spring, et al. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 55: 113-126 (2007)).
Inducción de la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos
Los fibroblastos residentes aislados del corazón de rata se trataron con 10 ng/mL de TGF-p (Peprotech) y se cultivaron durante 2 días a 37 ° C en una incubadora con CO2 al 5 %. Para confirmar la diferenciación en miofibroblastos, a­ SMA, que es una proteína marcadora, se confirmó mediante inmunoquímica (Kovacic J.C., et al. Circulation, Apr 10; 125(14):1795-1808 (2012)).
Tinción inmunofluorescente de transdiferenciación de fibroblastos de CCN5, miofibroblastos de células endoteliales en células mesenquimales
Se sembraron fibroblastos y células endoteliales (células endoteliales de arteria coronaria humana, HCAEC) en un cubreobjetos de 16 mm y se cultivaron durante la noche para su estabilización, y luego se trataron con 10 ng/mL de TGF-p y CCN5 y se cultivaron durante 48 horas. Después de la fijación con una solución de paraformaldehído al 4 %, se realizó la permeabilización de la membrana celular con una solución de Triton X-100 al 0.5 %, seguida de un bloqueo con una solución de BSA al 5 %. Anticuerpo anti-VE-Cadherina (Cell Signaling Technology), anti-vimentina (Santa Cruz) o anti-a-SMA (Sigma) se usó para la reacción, y se usó Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 594 (Invitrogen) como el anticuerpo secundario. Los núcleos se tiñeron usando DAPI. Las células que se sometieron a inmunoquímica se analizaron utilizando un microscopio de fluorescencia (Olympus) (Okayama K., et al. Hypertension 59:958-965 (2012)).
Análisis de red de gel de colágeno
En el ensayo de contracción del gel de colágeno, se mezclaron 1 * 106 células/ml de fibroblastos y 1.2 mg/ml de solución de colágeno (Invitrogen) y se añadió NaOH 1 N (aproximadamente 20 pl) para neutralizar el pH de la solución de colágeno. Después de mezclar simplemente pipeteando, se colocaron 500 pL de cada suspensión de gel de colágeno en una placa de 24 pozos y se polimerizaron en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 ° C durante 30 minutos. Después de que se hubo formado el gel de colágeno, el grupo de control y los grupos de tratamiento con TGF-p solo o con CCN5 se cultivaron en el medio DMEM, respectivamente. Después de 48 horas, se observó y analizó el grado de contracción del gel de colágeno utilizando el software Image J (Dobaczewski M., et al. Circ. Res. 107: 418-428 (2010)).
Inducción de diferenciación de células endoteliales vasculares en células mesenquimales (transición endotelialmesenquimatosa; EndMT)
EndMT se indujo utilizando células endoteliales de arteria coronaria humana (HCAEC). Las HCAEC se compraron a través de Lonza y se cultivaron en una incubadora con CO2 al 5% usando la solución de cultivo EGM-2 (Lonza). Las HCAEC, que son células derivadas de humanos, eran células con un número de subcultivo de 3 en el momento de la compra, y para el experimento se usaron células con un número de subcultivo de 5 a 7. Para inducir EndMT usando HCAEC, es importante mantener bien el estado de las células a través de la densidad de las células durante el cultivo, el intercambio de la solución de cultivo, etc. Después de esparcir las HCAEC en la placa de cultivo, se estabilizó durante aproximadamente 12 horas, se trató con 10 ng/mL de TGF-p y se cultivó durante 3 días. Mientras se inducía EndMT, la solución de cultivo no se reemplazó y, después de 3 días, se realizaron inmunocitoquímica y PCR cuantitativa para confirmar si se produjo la transdiferenciación de HCAEC en células mesenquimales. Tie 2 y VE-cadherina (CD 31) se usaron como genes marcadores de HCAEC, y vimentina, a-SMA, C colágeno I, colágeno III y FSP-1 se usaron como genes marcadores de células mesenquimales (Medici D., et al. Biochem. J 437:515-520 (2012)) y (Zeisberg E.M., et al. Nat Med. 13: 952-961 (2007)).
Análisis de migración celular de tubos de ensayo
Se realizó un análisis de rayado para medir la capacidad de migración celular. Las HCAEC se colocaron en una placa de 12 pozos para estabilizar las células durante la noche. Al día siguiente, se reemplazó el medio de cultivo y se realizaron rayados en las células utilizando una punta de 200 pL. Las células rayadas se lavaron con una solución salina y luego se cultivaron con CM-Con o CM-CCN5 tratadas con 10 ng/ml de TGF-p. Después de 48 horas, las células se tiñeron con DAPI y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. La distancia recorrida por las células se analizó mediante el software MetaMorph (Widyantoro B, et al. Circulation 121:2407-2418(2010)).
Análisis del gen informador NF-B
Se colocaron fibroblastos y miofibroblastos de rata a 3 * 105 células/pozo en una placa de 6 pozos y se transfectaron con plásmido informador NF-B (pBIIx), pRenilla y otros plásmidos (vector pcADN3 vacío y pcADN-hCCN 5) con lipofectamina 2000 (Invitrogen). Después de 48 horas, las células se lisaron con un regulador de lisis pasiva y se centrifugaron a 14,000 rpm a 4 ° C para eliminar los restos celulares. La actividad de la luciferasa se midió utilizando el sistema de ensayo informador Dual-luciferasa (Promega).
Análisis TUNEL de apoptosis
Las células miocárdicas cultivadas, fibroblastos y miofibroblastos se extendieron sobre cubreobjetos de vidrio y se tiñeron usando el kit DeadEnd Fluorometric TUNEL (Promega). Se confirmó que la segmentación del ADN se produjo por apoptosis utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Para confirmar la fluorescencia TUNEL se utilizó un microscopio de foco esférico Fluoview FV 1000 (Oberhaus S.M. Methods Mol Biol.218:85-96(2003)).
Inmunohistoquímica
El tejido cardíaco de ratón se crioconservó utilizando compuesto OCT (Tissue-Tek) y luego se seccionó en cortes de 6 pm de espesor. Después de la fijación del tejido, se dejó reaccionar usando acetona-metanol a -20 ° C durante 20 minutos para convertirse en una membrana permeable. Los tejidos se rehidrataron usando PBS y se bloquearon con una solución de BSA al 5 % durante 1 hora. Posteriormente, la reacción se llevó a cabo utilizando anticuerpos anti-a-SMA, anti-GFP y anti-vimentina a 4 ° C durante 12 horas. El tejido que reaccionó con el anticuerpo primario se lavó con solución salina y reaccionó con los anticuerpos secundarios a los que se conectó la fluorescencia Alexa546 o Alexa488 durante 1 hora a temperatura ambiente. Para el tejido cardíaco examinado por inmunoquímica de fluorescencia, el resultado se confirmó utilizando el microscopio confocal Fluoview FV 1000.
Tinción histopatológica (tinción de Masson-Trichrome)
Después de obtener el músculo cardíaco del animal modelo, se sumergió inmediatamente en una solución de inclusión a la temperatura de corte adecuada, que se adquirió de Fisher Healthcare (Pittsburgh, PA), y luego se congeló recientemente y se seccionó en rebanadas de 8 um de espesor. Las muestras seccionadas se observaron con un microscopio óptico después de la tinción de Masson-Trichrome (Abcam) para determinar el grado de fibrosis.
Citometría de flujo
La capa de fibroblastos separada se lavó con solución salina fisiológica que contenía plasma fetal bovino (FBS) al 0.2 % y se fijó con una solución de formaldehído al 2.5 %. T ras permeabilizar la membrana celular con solución de T riton X-100 al 0.5 %, la reacción se llevó a cabo utilizando anticuerpo anti-a-SMA (Abcam) al que se conectó FITC. Los fibroblastos y miofibroblastos cultivados se lavaron con solución de FBS al 0.2 % y se hicieron reaccionar con un anticuerpo anti-anexina (eBioscience) al que se conectó PE. Las células teñidas se analizaron usando Guava easyCye HT (Millipore) (Saada J.I., et al. J. Immunol. 177:5968-79(2006)).
Inmunoprecipitación western
Para soluciones homogéneas de células y tejidos, las proteínas se separaron por tamaño utilizando gel SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore). La confirmación de la expresión de proteínas se realizó de acuerdo con el protocolo experimental básico (Kawaki, et al., 2011). La membrana preparada se incubó con anti-CCN2, anti-CCN5 (Lifespan Biosciences), anti-SERCA2a (21st Century Biochemicals), anti-Smad4, anti-p-Smad2, anti-Smad2/3 (Cell signaling), anti-Smad7 (Lifespan Biosciences), anti-LOX (Abcam), anti-a-actinina, anti-a-SMA (Sigma), anti-vimentina, anti-Bcl-2 (Santa Cruz) y kit de anticuerpos anti-caspasa (Cell signaling).
RT-PCR cuantitativo
El PCR en tiempo real se realizó utilizando el kit de PCR en tiempo real QuantiTect SYRB Green (Qiagen Ltd.), y el nivel de transcripción se analizó con el mismo. Se usó Trizol (gibco BRL) para separar el ARN de un tejido cardíaco y lo sintetizó en ADNc. Diversas condiciones cuantitativas de PCR en tiempo real fueron 37 ciclos: 94 ° C durante 10 segundos, 57 ° C durante 15 segundos y 72 ° C durante 5 segundos. La información sobre los cebadores utilizados en el experimento se muestra en la Tabla 1 a continuación.
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Procesamiento estadístico
Los datos se expresaron como valor medio ± SD. El promedio del grupo se comparó usando ANOVA unidireccional (Statview, V5.0, SAS) con la prueba t de Student o la postprueba de Bonferroni. P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.
Resultado experimental
A. Modelo animal de sobrecarga de presión por constricción aórtica transversa (TAC)
Reducción de la expresión de la proteína CCN5 en tejido cardíaco de insuficiencia cardíaca
Como resultado de la comparación de proteínas obtenidas del tejido cardíaco de pacientes con insuficiencia cardíaca durante la cirugía de trasplante de corazón y el tejido cardíaco de personas normales (Tabla 1) mediante inmunoprecipitación western, el nivel de expresión de la proteína CCN5 en pacientes con insuficiencia cardíaca se redujo en aproximadamente 24 % (figura 1A). La expresión de CCN5 en el modelo de ratón de insuficiencia cardíaca inducida por sobrecarga de presión se redujo en aproximadamente un 90 % (figura 1B). Como resultado de este experimento, la expresión reducida de CCN5 de un tejido cardíaco en estado de insuficiencia cardíaca se mostró de manera similar en humanos y ratones, lo que indica una correlación clínica entre humanos y ratones. Se usaron 15 |jg del extracto de proteína CCN5 para la electroforesis y se confirmaron como anticuerpos anti-CCN5 y anti-GAPDH (** P < 0.01).
Recuperación reversible de fibrosis cardíaca por transferencia del gen CCN5
El AAV9-CCN5 construido y el vector del virus de control AAV9-VLP se inyectaron en la vena de la cola del ratón en dos concentraciones de AAV-CCN5, y la concentración efectiva se determinó mediante inmunoprecipitación western después de 4 semanas. Al confirmar que AAV-CCN5 inyectado se expresaba específicamente para el corazón, se estudió la relación de la actividad patológica de la fibrosis cardíaca y miofibroblastos (n = 6, Error brs = S.D., * P < 0.05, figura 2). Se confirmó que, en el modelo de enfermedad cardíaca por sobrecarga de presión inducida por TAC, la fibrosis cardíaca se produjo 8 semanas después de la cirugía TAC. AAV-CCN5 y AAV-VLP, que es el grupo de control, se inyectaron a través de la vena de la cola de ratas experimentales inducidas por fibrosis cardíaca a una concentración de 5 * 1010 del genoma viral, respectivamente (n = 16, figura 3a). Después de más de 8 semanas después de la transferencia del gen CCN5, se tomó una muestra de tejido cardíaco y se cuantificó el grado de fibrosis del tejido mediante la tinción de Masson-Trichrome para confirmar el efecto terapéutico de la fibrosis cardíaca. Además, se separó el corazón de cada grupo experimental, se separaron los fibroblastos utilizando el sistema de perfusión de velocidad constante de Langendorff y se midió el grado de células que expresaban a-SMA mediante citometría de flujo.
Como resultado, la extensión de la fibrosis ya progresada en el tejido intersticial y los tejidos que rodean los vasos sanguíneos fue similar a la del grupo al que se inyectó CCN5 en el mismo grado que en el grupo de cirugía placebo (simulada), y mostró un efecto terapéutico reversible similar al grado de recuperación a tejido normal (figuras 3b-3c). Además, la cantidad de miofibroblastos aumentó en el estado fibrótico del corazón en el grupo al que se inyectó AAV9-CCN5 y disminuyó en una cantidad similar a la del grupo de cirugía con placebo (figura 3d). Estos resultados demuestran que CCN5 tiene un efecto terapéutico que muestra la descomposición del trastorno fibrótico y la recuperación reversible de la estructura tisular normal del tejido cardíaco con fibrosis avanzada. Además, se confirmó que el tratamiento reversible de la fibrosis cardíaca de CCN5 estaba relacionado con la disminución de la proliferación de fibroblastos por CCN 5, en donde los fibroblastos son células de ejecución patológica de aparición y progresión de todas las enfermedades fibróticas.
La relación entre el tratamiento de la fibrosis cardíaca y el efecto protector de la función cardíaca se examinó mediante un examen ecocardiográfico. La prevención de una disminución en la fracción de acortamiento (FS) del corazón y la supresión de un aumento en la sístole terminal (dimensión interna del ventrículo izquierdo en sístole, LVID) y el diámetro diastólico de la cavidad ventricular izquierda (LVIDd) se suprimieron notablemente en el grupo de tratamiento con CCN5 (AAV-CCN5), en comparación con el grupo inyectado con virus de control (AAV-VLP). Por lo tanto, la proteína CCN5 mostró un efecto terapéutico para la insuficiencia cardíaca sistólica al prevenir el deterioro de la función cardíaca en el estado de insuficiencia cardíaca a través del tratamiento de la fibrosis cardíaca preexistente, y (n = 16, barras de error = S.D. * P < 0.05, figura 3e).
Apoptosis selectiva de fibroblastos por transferencia del gen CCN5
Se realizó un análisis de correlación para determinar si la recuperación de la fibrosis cardíaca está provocada por la apoptosis de los miofibroblastos. Junto con la inducción del modelo de ratón con sobrecarga de presión, se inyectaron AAV9-CCN5 y AAV9-VLP y, después de 2 semanas, se tiñeron simultáneamente cortes de tejido cardíaco con tinción TUNEL (rojo) y anticuerpo anti-a-SMA (verde), que es una proteína específica de fibroblasto, y se confirmó si se produjo la apoptosis de las células de fibroblastos (figura 4b). Como resultado, casi no hubo células que respondieran a los dos métodos de tinción (los miofibroblastos sufrieron apoptosis) en los grupos de cirugía con placebo, aproximadamente 9 % en el grupo de control al que se inyectó AAV9-VLP al grupo con enfermedad y aproximadamente 72 % en el grupo de AAV9-CCN5 (n=3). Un número notablemente mayor de células estaba presente en el grupo modelo de enfermedad inyectado con AAV9-CCN5 (figuras 4b y 4c). Por lo tanto, el deterioro de la fibrosis cardíaca y la proliferación de miofibroblastos fueron proporcionales, y el efecto terapéutico reversible de AAV9-CCN5 inyectado en un modelo animal en el que la fibrosis cardíaca ha progresado resultó de la apoptosis de los miofibroblastos, y se confirmó que el efecto terapéutico de la fibrosis por inyección del gen CCN5 y la disminución de miofibroblastos por apoptosis estaban directamente relacionadas.
Además, se confirmó si CCN5 eliminaba selectivamente los miofibroblastos (figuras 4d a 4f). Las células del músculo cardíaco y los fibroblastos usados en el experimento se obtuvieron del corazón de rata, y los miofibroblastos se indujeron tratando los fibroblastos con TGF-p. Se cultivaron células de músculo cardíaco, fibroblastos y miofibroblastos de rata en un medio CM-Con o CM-CCN5, y después de 48 horas, se realizó la tinción usando tinción de núcleos picnóticos con DAPI, tinción TUNEL para medir la apoptosis y tinción con un anticuerpo antianexina-V (marcador de apoptosis) para realizar citometría de flujo (n = 3, Error brs = S.D., ** P < 0.01). Como resultado, solo en el caso de los miofibroblastos cultivados en el medio CM-CCN5, se confirmó que aumentó la picnosis, aumentó el número de núcleos que mostraban fluorescencia TUNEL y aumentó notablemente el número de miofibroblastos positivos para anexina-V. Estos resultados muestran los mismos resultados que los de los experimentos con animales en los que CCN5 provoca selectivamente la apoptosis solo en miofibroblastos que son las células de ejecución patológica de la fibrosis cardíaca.
Al tomar los dos resultados juntos, se encontró que CCN5 puede inducir la apoptosis de miofibroblastos en el modelo de enfermedad de fibrosis cardíaca y puede mostrar mecanismos selectivos que no afectan las células del músculo cardíaco ni los fibroblastos.
Investigación del mecanismo de apoptosis selectiva (vía de apoptosis intrínseca) de la proteína CCN5
Se añadió CM-Con o CM-CCN5 a miofibroblastos diferenciados de fibroblastos bajo condiciones de TGF-p y se cultivaron durante 1 o 2 días, y luego se separaron las proteínas de las células y se sometieron a inmunoprecipitación western (figura 5a). Los anticuerpos utilizados fueron anti-Bcl2, anti-BAX, anti-Pro-Caspasa3, anti-Caspasa3 escindida, Anti-Pro-Caspasa7, Anti Caspasa7 escindida, Anti-Pro-Caspasa8, Anti-Caspasa8 escindida, anti-Pro-Caspasa9, anti-Caspasa9 escindida y anticuerpos anti-GAPDH, que son proteínas relacionadas con la apoptosis. Se comprobó que en el grupo tratado con la proteína CCN5, la expresión de BCL-2, proteína que previene la apoptosis, disminuyó considerablemente, mientras que la de BAX y caspasa 3, 7 y 9, proteínas que promueven la apoptosis, aumentó con el tiempo.
Además, los miofibroblastos se trataron con CM-Con o CM-CCN5 durante 2 días bajo las mismas condiciones que en el cultivo celular de inmunoprecipitación western, y luego se llevó a cabo inmunoquímica utilizando anticuerpo anticitocromo C (figura 5b). Las flechas en la figura 5b significan que se produjo la apoptosis y que el citocromo C salió al citoplasma de las mitocondrias, y la apoptosis de los miofibroblastos mediante el tratamiento de la proteína CCN5 se confirmó mediante inmunoquímica fluorescente.
Además, se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones western utilizando anticuerpos anti-NF-KB, anti-vimentina y anti-a-SMA en fibroblastos y miofibroblastos inducidos bajo las mismas condiciones que la inmunoprecipitación western y la inmunoquímica descritas anteriormente y, como resultado, se confirmó que la expresión de NF-kB dentro del núcleo que hace que la resistencia a la apoptosis fuera alta específicamente en miofibroblastos (figura 5c). Como resultado del análisis del informador NF-kB y la inmunotinción con un anticuerpo anti-NF-KB, se confirmó que la migración de NF-kB al núcleo se suprimió por completo en el grupo tratado con proteína CCN5 (figuras 5d y 5e). Estos resultados prueban que la inducción de apoptosis selectiva de miofibroblastos por parte de la proteína CCN5 se debe a un mecanismo de inhibición de la migración de NF-kB en el núcleo (n = 3, Error brs = S.D., ** P < 0.01)
Confirmación de expresión y actividad de CM-CCN5
Para sobreexpresar CCN5 como la proteína secretada por las células, se inyectó el plásmido Ad-CCN5 marcado con HA en células HEK293 y se cultivó durante 24 horas, y luego las proteínas secretadas se obtuvieron de la solución de cultivo celular sin suero (figura 6a). Se separaron el medio de cultivo y las células y, mediante el uso de anticuerpos anti-HA, se determinaron la expresión y la cantidad secretada de CCN5, y se confirmó que CCN5 secretado en el medio de cultivo por un anticuerpo anti-GAPDH, una proteína diana citoplásmica, no estaba contaminado junto con el citoplasma.
Se llevó a cabo el siguiente experimento para confirmar si el CCN5 recombinante operaba funcionalmente. Se aislaron células de músculo cardíaco de ratas recién nacidas, se cultivaron en un medio del que se había extraído el plasma durante 12 horas y luego se trataron con fenilefrina 100 pM durante 24 horas. La fenilefrina induce la hipertrofia de las células cardíacas. Se observó si se suprime la hipertrofia de las células cardíacas mediante inmunoquímica fluorescente usando anticuerpo anti-a-actina al tratar simultáneamente CM-CCN5 a una concentración de 200 ng/mL con fenilefrina en el grupo de tratamiento simultáneo. La superficie celular se midió utilizando el programa MetaMorph (n = 50, barras de error = S.D., ** P < 0.01). Como resultado, el CCN5 recombinante inhibió completamente la hipertrofia de las células del músculo cardíaco inducidas por fenilefrina, lo que confirma que el CCN5 recombinante operaba funcionalmente (figura 6b).
Confirmación de la diferenciación en miofibroblastos (MyoFB)
Se realizó inmunoprecipitación western para confirmar que los miofibroblastos diferenciados (MyoFB) se separaron y diferenciaron bien en presencia de cardiomiocitos de rata (Myo), fibroblastos (FB) y TGF-p, respectivamente, y se confirmó usando anticuerpos anti-a-actinina, anti-vimentina, anti-a-SMA y anti-GAPDH. Incluso después de la transdiferenciación de fibroblastos en miofibroblastos, la vimentina, que es una proteína marcadora de fibroblastos, no desapareció. Por lo tanto, al confirmar que tanto la vimentina como la a-SMA se expresaron a partir de miofibroblastos, se confirmó que los miofibroblastos se separaron y diferenciaron, mejorando así la confiabilidad del experimento (figura 7).
Inhibición de la transducción de señales de fibrosis por CCN5 expresado en el corazón
AAV9-VLP o AAV9-CCN5 (5 * 1010 portadores del gen del virus por ratón) se inyectaron en el modelo de ratón 8 semanas después de la cirugía con placebo o la cirugía de estenosis cruzada aórtica (TAC), y después de 8 semanas adicionales, se confirmó la expresión de una proteína relacionada con la transducción de señales de la fibrosis mediante inmunoprecipitación western en el corazón de un modelo sacrificado (n = 3, figuras 8a y 8b). La proteína obtenida del tejido cardíaco se utilizó a una concentración de 50 |jg y se confirmó mediante anticuerpos anti-SERCA2a, anti-CCN5, anti-Smad4, anti-p-Smad2, anti-Smad7, anti-CCN2, anti-LOX y anti-GAPDH. Como resultado, en el grupo de control, Smad2 involucrado en la activación de la señalización de TGF-p fue fosforilado, pero la expresión de p-Smad2 fue inhibida en el grupo inyectado con CCN5. Además, Smad7, que está involucrado en la inhibición de la señalización de TGF-p, se expresó solo en el grupo CCN5. La lisil oxidasa (LOX), un importante fármaco diana para inhibir la progresión de la fibrosis, es una enzima que entrecruza y polimeriza el colágeno secretado en el proceso de fibrosis y desempeña un papel importante en la curación del entorno externo de los tejidos. Aunque aumentó en el grupo de control, se confirmó que disminuyó considerablemente en el grupo inyectado con CCN5. Además, fue posible predecir el efecto de mejora de la función cardíaca de la sístole por la fuerza contráctil del corazón debido al aumento de la proteína SERCA2a responsable de la función de bombeo de la circulación sanguínea al aumentar la fuerza sistólica del corazón.
El ARN se extrajo utilizando el mismo tejido cardíaco, se sintetizó ADNc y se determinó el nivel de expresión del ARNm implicado en la transducción de señales de fibrosis mediante RT-PCR cuantitativa (figura 8b). Se midieron los ARNm de TGF-p1, TGF-p2, CCN2, galectina 3, colágeno 1A, colágeno 3A1 y fibronectina. Como resultado del análisis del gen diana de la fibrosis cardíaca mediante RT-PCR cuantitativa, se confirmó que el gen que dirige la transducción de señales de la fibrosis, como el tipo TGF-p, CCN2, galectina 3, etc. y los genes de proteínas fibróticas que aumentaron a través de su mecanismo transcripcional aumentaron en el grupo de control, disminuyeron en el grupo inyectado con CCN5 (n = 3, ** P < 0.01).
Inhibición de la transdiferenciación de células endoteliales en miofibroblastos por CCN5
Como resultado de estudios recientes, se encontró que los fibroblastos que proliferan en el curso de la fibrosis cardíaca se forman en parte por transdiferenciación de células endoteliales (EndoMT) y promueven la formación de miofibroblastos, y se confirmó si CCN5 inhibe dicha transdiferenciación usando el Scl-Cre-ERT; Modelo de ratón transgénico doble R26RpareYFP.
En el Scl-Cre-ERT; Modelo de ratón transgénico doble R26 Rpare YFP, se trató con tamoxifeno durante 5 días, y después de 4 semanas, se inyectaron AAV9-VLP o AAV9-CCN5 (5 * 1010 portadores del gen del virus por ratón) y, simultáneamente, se realizó cirugía placebo o cirugía de constricción aórtica transversa (TAC) (figura 9 a). Después de 8 semanas de cirugía TAC, se tomaron muestras de tejido cardíaco y se realizó inmunoquímica (figuras 9b y 9c). La sección transversal del tejido cardíaco se tiñó con anticuerpos anti-YFP (verde) y anti-vimentina (rojo), y se midieron las células que expresaban simultáneamente YFP inducida por tamoxifeno y vimentina, que es un gen diana de los fibroblastos. Las células que expresan YFP y vimentina al mismo tiempo pueden ser células en las que las células endoteliales se convierten en células mesodérmicas. Como resultado, se confirmó que aproximadamente 8.5 % de las células expresaron YFP y vimentina al mismo tiempo en el grupo inyectado con AAV-VLP, pero solo aproximadamente 1 % de las células expresaron simultáneamente y Fp y vimentina en el grupo inyectado con AAV-CCN5. Los resultados anteriores demuestran que CCN5 es capaz de inhibir la transdiferenciación y proliferación de miofibroblastos, que son la célula causante de la fibrosis, a partir de diversas células precursoras.
Además, dependiendo del sitio de daño de los tejidos y órganos, junto con fibroblastos y pericitos, las células endoteliales se transdiferencian en fibroblastos para finalmente diferenciarse en miofibroblastos debido a factores inductores de fibrosis como el TGF-p. Se confirmó si CCN5 inhibía la transdiferenciación de las células endoteliales en células mesodérmicas por TGF-p (figura 9d). Para inducir células endoteliales en células mesodérmicas mediante transdiferenciación, se trataron células endoteliales de arteria coronaria humana (HCAEC) con 10 ng/ml de TGF-p2 durante 72 horas. Las células se cultivaron en un medio que contenía un medio de control (CM-Con) y 200 ng/ml de CCN5 (CM-CCN5) para observar los resultados. Se realizó inmunoquímica para teñir con anticuerpos anti-VEcadherina y anti-vimentina, y los núcleos se tiñeron con DAPI. Como resultado, en el caso de tratar células endoteliales de arteria coronaria humana (HCAEC) con TGF-p, se expresaron a-actina de músculo liso (a-SMA) y vimentina, que son marcadores de miofibroblastos, y en el grupo simultáneamente tratados con CCN5, se suprimió la expresión.
Además, cuando las células endoteliales se transdiferencian, se desarrollan características similares a las de los miofibroblastos y tienen la capacidad de migrar al sitio de la herida, y se confirmó si CCN5 suprime esto mediante citometría de flujo (figura 9e). Después de esparcir y estabilizar las HCAEC en una placa de cultivo, se hicieron rayados con una punta de pipeta de 200 pL y luego las células se cultivaron bajo las condiciones de inmunoquímica que se muestran en la figura 9d. Después de 48 horas, las células se fijaron y tiñeron con DAPI, y se midió la extensión de la migración de las células. Como resultado, en el grupo tratado con TGF-p, la capacidad migratoria de las células aumentó en comparación con el grupo control, y en el grupo tratado simultáneamente con TGF-p y CCN5, no se produjo migración celular. Además, después de extraer el ARN mediante el cultivo de células endoteliales bajo las mismas condiciones que en la inmunoquímica de la figura 9d, se sintetizó ADNc y se realizó una RT-PCR cuantitativa para medir el grado de expresión del ARNm de a-SMA, colágeno I, colágeno III, Tie2 y CD31 para analizar la expresión génica (figura 9f). Como resultado, la expresión de a-SMA, colágeno I y colágeno III, que son genes relacionados con los fibroblastos inducidos por TGF-p en el grupo tratado simultáneamente con CCN5, y la expresión de los genes Tie 2 y CD31, que son inherentes de células endoteliales, se demostró que eran similares al grupo de control no tratado con TGF-p (n = 6, barras de error = S.D., * P < 0.05, ** P < 0.01). Por lo tanto, se demostró que CCN5 inhibía el mecanismo de transdiferenciación de células endoteliales a células mesodérmicas para suprimir la fibrosis.
Inhibición de la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos por CCN5
Se realizó el siguiente experimento para confirmar si CCN5 inhibe la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos. A un modelo de ratón de 8 semanas se le inyectó AAV9-VLP o AAV9-CCN5 (5 * 1010 portadores del gen del virus por ratón), al mismo tiempo que se realizaba cirugía con placebo o cirugía de constricción aórtica transversa (TAC), y después de 8 semanas, se realizaba inmunoquímica utilizando el tejido cardíaco (figura 10a). La sección transversal del tejido cardíaco se tiñó con anticuerpos anti-vimentina (rojo) y anti-a-SMA (verde). Las células que expresan simultáneamente vimentina y a-SMA pueden ser células en las que se produjo la conversión a fibroblastos (figura 10 b). Las células que expresan a-SMA simultáneamente entre las células que expresan vimentina se analizaron y se mostraron en un gráfico (n = 3, barras de error = S.D., ** P <0.01). Como resultado, a-SMA y vimentina se expresaron simultáneamente en aproximadamente el 17 % de las células en el grupo inyectado con AAV9-VLP, mientras que en el grupo inyectado con AAV9-CCN5, aproximadamente el 4 % de las células expresaron a-SMA y vimentina al mismo tiempo. Este es el resultado que muestra que el aumento de la expresión de CCN5 en el corazón suprime eficazmente el mecanismo patológico por el cual los fibroblastos que causan fibrosis se diferencian y proliferan en miofibroblastos (n = 3, barras de error = S.D., ** P < 0.01, figura 10c).
Se realizó el siguiente experimento para confirmar que la proteína CCN5 recombinante también suprime la diferenciación de miofibroblastos por TGF-p. Para inducir la diferenciación de los fibroblastos en miofibroblastos, se trataron 10 ng/mL de TGF-p durante 48 horas. Las células se cultivaron en un medio de grupo de control y un medio CCN5 de 200 ng/mL, respectivamente, y se observaron los resultados. Se tiñeron con un anticuerpo anti-a-SMA y el núcleo se tiñó con DAPI para realizar la inmunoquímica. Se confirmó que se suprimió el aumento en el nivel de expresión de proteína de actina de músculo liso a, que proporciona fuerza contráctil de miofibroblastos en el grupo tratado simultáneamente con CCN5 (figura 10d).
Dado que TGF-p aumenta la fuerza contráctil del gel de colágeno, mediante el ensayo de contracción de gel de colágeno, se confirmó que CCN5 inhibe la diferenciación de miofibroblastos por TGF-p (figura 10d). El gel de red de colágeno se preparó utilizando fibroblastos y colágeno, y se cultivó bajo las mismas condiciones que en el experimento relacionado con la figura 10d, y luego se midió el tamaño del gel de colágeno 48 horas después. Como resultado, se confirmó que la fuerza contráctil del gel de colágeno debida a TGF-p disminuyó significativamente en el grupo tratado con CCN5.
Se realizó una RT-PCR cuantitativa para medir los niveles de expresión de ARNm de a-SMA y colágeno I (figura 10f). Los fibroblastos también se cultivaron bajo las mismas condiciones que en el experimento relacionado con la figura 10 para extraer el ARN, se sintetizó el ADNc y se realizó una RT-PCR cuantitativa para medir el grado de expresión del ARNm de a-SMA y colágeno I. Como resultado, se encontró que la expresión de los genes de actina de músculo liso a y colágeno 1, que es un mecanismo transcripcional específico de los miofibroblastos inducidos por TGF-p, se suprimió al mismo nivel que los fibroblastos en el grupo tratado simultáneamente con CCN5 (n = 6, Barras de error = S.D., * P < 0.05, ** P < 0.01). Por lo tanto, se demostró que CCN5 inhibe eficazmente la diferenciación y producción de miofibroblastos por TGF-p.
B. Modelo genético de insuficiencia cardíaca con distrofia muscular de Duchenne (modelo DMD)
El efecto terapéutico de AAV-CCN5 sobre la fibrosis cardíaca en el modelo DMD
El efecto terapéutico de AAV-CCN5 en ratones MDX/UTRN (+/-) envejecidos, que son animales modelo de distrofia muscular de Duchenne, se probó de acuerdo con el programa de la figura 11a. La extensión de la fibrosis se confirmó mediante el método de criocorte del músculo cardíaco mediante la tinción de Masson-Trichrome (figura 11b). Como resultado de medir el intervalo de fibrosis cardíaca, el intervalo de fibrosis disminuyó 2.6 veces en promedio en el grupo inyectado con AAV-CCN5 (3.39 % /- 0.58) en comparación con el grupo inyectado con AAV-v Lp (10.14 % /-5.11) (figura 11b). La supresión de la acumulación de fibrosis intersticial en el corazón inyectado con AANV-CCN5 mostró un efecto mejorado de remodelación estructural y un efecto terapéutico de normalización de la disposición del tejido del músculo cardíaco (n = 3 a 4, p < 0.001).
Tratamiento de mejora de la función cardíaca por AA V-CCN5 en modelo DMD
La ecocardiografía se realizó 8 semanas después de la inyección de AAV-VLP y AAV-CCN5. Como resultado de la medición de la proporción de acortamiento ventricular, se demostró un efecto terapéutico del acortamiento ventricular por CCN5 de 58.70 % ± 1.05 (n = 3), 45.75 % ± 1.29 (n = 7) y 53.88 ± 1.21 (n = 6) en el grupo WT (+/-) con operación simulada normal, el grupo AAV-VLP y el grupo AAV-CCN5, respectivamente (P < 0.005, figura 12a). Además, como resultado de medir la función hemodinámica del corazón, la relación presión-volumen telesistólica promedio (ESPVR) del grupo inyectado con AAV-CCN5 fue de 3.54 ± 2.49 (n = 7), mientras que la del grupo inyectado con AAV-CCN5 fue 6.10 ± 2.25 (n = 6). Este resultado demuestra el efecto terapéutico de la proteína CCN5 sobreexpresada que mejora la elasticidad y contractilidad sistólica terminal del corazón (p < 0.05, figura 12b).
Efecto inhibidor de AA V-CCN5 sobre la expresión de genes relacionados con la fibrosis cardíaca
En los animales modelo DMD, para los ratones normales y los ratones MDX/UTRN (+/-) envejecidos inyectados con AAV-VLP y AAV-CCN5, SERCA2a que está relacionado con la contracción del músculo cardíaco; Col1A2, proteína activadora de fibroblastos (FAP), p-SMAD y a-SMA que son genes relacionados con la fibrosis; y la proteína CCN5 se sometieron a inmunoprecipitación western. En el grupo inyectado con AAV-CCN5, aumentó la expresión de la proteína SERCA2a, que es importante para la sístole cardíaca, y disminuyeron las expresiones de Col1A2, proteína activadora de fibroblastos (FAP), p-SMAD y a-SMA, que son proteínas marcadoras de fibrosis (figura 13). Como resultado de la determinación de las expresiones a nivel genético mediante qRT-PCR, se confirmó que la expresión de Col1A2 y TGF-p1 disminuyó en el grupo inyectado con AAV-CCN5, y aumentó la expresión de IL-10 que es una citoquina antiinflamatoria (figura 14). Por lo tanto, en el grupo al que se inyectó AAV-CCN5, se descubrió que la proteína CCN5 sobreexpresada era eficaz en el tratamiento de la fibrosis cardíaca a través de experimentos de expresión de proteínas y genes.
C. Modelo de insuficiencia cardíaca con ligadura aórtica-isquemia-reperfusión-desligado (AID)
Efecto terapéutico sobre la fibrosis cardíaca por transferencia del gen CCN5
El modelo de insuficiencia cardíaca diastólica utilizado aquí es un modelo construido en ratas mediante el método quirúrgico de ligadura aórtica-isquemia-reperfusión-desligado (AID). Este modelo refleja mejor la situación de los pacientes con insuficiencia cardíaca que el modelo de sobrecarga de presión comúnmente utilizado para los estudios de insuficiencia cardíaca. Es decir, muchos pacientes con insuficiencia cardíaca a menudo experimentan una sobrecarga de presión debido a la presión arterial alta, etc. e isquemia por angina de pecho, infarto de miocardio, etc. al mismo tiempo. Sin embargo, aunque la carga de presión se elimine mediante el método quirúrgico y el tratamiento farmacológico, y se logre la perfusión de las arterias coronarias, la condición del corazón aún no mejora, sino que progresa a insuficiencia cardíaca (figura 15a). Los presentes inventores descubrieron que la fibrosis cardíaca había progresado seriamente desde el corazón del modelo AID, reduciendo así en gran medida la función diastólica del corazón. Por otro lado, la disminución de la función sistólica del corazón no fue lo suficientemente grande como para tener significación estadística. Por tanto, el modelo AID representa mejor la situación de los pacientes con insuficiencia cardíaca y sobre todo tiene las características de insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada entre otras. Después de dividir el modelo de rata con insuficiencia cardíaca AID en un grupo de control y un grupo de tratamiento, AAV 9-CCN 5 (1 * 1011 genomas de virus por ratón) se inyectaron en la vena de la cola y se analizaron 2 meses después. Las secciones cardíacas se tiñeron con Masson-Trichrome y se observaron bajo el microscopio. El colágeno que se secretaba en la fibrosis cardíaca se tiñó de azul mediante la tinción de Masson-Trichrome.
Como resultado, se confirmó que la fibrosis cardíaca significativa progresó en las regiones intersticiales y perivasculares en ratas AID. Sin embargo, en ratas a las que se les inyectó AAV-CCN5, la fibrosis cardíaca se trató en un grado similar al de las ratas sin cirugía (n = 5 a 8, p < 0.05, figuras 15b y 15c).
Confirmación de la función sistólica y diastólica del corazón mediante análisis hemodinámico
Cuando se sobreexpresó CCN5 en células de músculo cardíaco usando AAV-CCN5, el acortamiento fraccional obtenido por análisis ecocardiográfico en el modelo AID no mostró diferencias significativas entre los grupos experimentales, pero mostró una función cercana a la normal (figura 16a). El efecto CCN5 se confirmó en el modelo de insuficiencia cardíaca AID mediante análisis hemodinámico. En este análisis, el valor de la relación presión-volumen diastólica final (ESPVR) es proporcional a la función contráctil del corazón (contractilidad), y el valor de (EDPVR) es inversamente proporcional a la función diastólica del corazón (distensibilidad). Los resultados experimentales mostraron una disminución insignificante de ESPVR y un aumento significativo de EDPVR en el grupo inyectado con AAV-CCN5 en ratas AID (n = 6, p < 0.05, figuras 16b y 16c). Esto significa que, en comparación con las ratas normales, las ratas AID no tienen una fuerza contráctil significativamente reducida, pero sí una función diastólica significativamente reducida. No se observó reducción en esta función diastólica en las ratas inyectadas con AAV-CCN5. Estos resultados significan que la función cardíaca diastólica reducida se puede restaurar en ratas modelo AID que sobreexpresan la proteína CCN5.
Análisis de los resultados y discusión adicional
Las enfermedades fibróticas, que son enfermedades irreversibles, tienen el problema de que se diagnostican después de la aparición de las enfermedades. Hasta la fecha no se ha desarrollado ningún agente terapéutico reparador exitoso. Como característica de las enfermedades fibróticas, los fibroblastos, que son células de ejecución patógena, juegan un papel central en la aparición y progresión de las enfermedades independientemente del tipo de tejidos y órganos. Los miofibroblastos tienen características de células que se inducen temporalmente y desaparecen en el proceso de cicatrización de heridas normales, pero en el estado de enfermedad fibrótica, tienen una función y actividad de proliferación continua al adquirir un mecanismo para prevenir la apoptosis. Tal actividad persistente de los fibroblastos se muestra en el camino de la enfermedad común en enfermedades en las que progresa la fibrosis. Los miofibroblastos patógenos tienen una función de células secretoras que sobreproducen y acumulan la matriz extracelular fibrótica, una función de células inflamatorias de entrada de células inmunitarias inflamatorias y autosecreción de sustancias inflamatorias, y una función celular de transducción de señales que interrumpe la función de células estructurales de composición debido a la conexión anormal con las células circundantes y las sustancias secretadas circundantes. En consecuencia, la proliferación sostenida y la activación de los miofibroblastos no solo son las causas de la fibrosis que causa la remodelación del tejido, sino que también desempeñan un papel en la promoción del proceso de fibrosis reactiva por la función de las células inflamatorias.
A través de los presentes estudios, se reveló por primera vez a nivel celular y a nivel biológico del estado de la enfermedad que la proteína CCN5 provoca la destrucción selectiva de miofibroblastos, que son las células centrales del proceso de fibrosis cardíaca. La proteína CCN5 puede controlar la actividad patológica continua de los miofibroblastos y promover la apoptosis selectiva para proporcionar un método para tratar de forma reversible la fibrosis cardíaca preexistente con sustancias en el cuerpo humano. En particular, el desarrollo de un fármaco que regula la apoptosis de los fibroblastos con fines terapéuticos no ha tenido éxito, pero la apoptosis selectiva de los fibroblastos por la proteína CCN5 tiene una característica del mecanismo de imitación del cuerpo humano que ocurre en el período de resolución del proceso normal curativo de la herida. Estos hechos sugieren que el mecanismo por el cual solo los miofibroblastos patógenos mueren sin afectar a los fibroblastos, que son células precursoras y células del músculo cardíaco, puede minimizar los efectos secundarios y es una nueva terapia biomimética. Por lo tanto, para el tratamiento de la fibrosis preexistente, la actividad de la proteína CCN5 restablece la disolución de la matriz fibrótica y la composición estructural normal y, por lo tanto, se puede proporcionar un método de tratamiento para la enfermedad fibrótica que es una enfermedad incurable que incluye la fibrosis cardíaca.
CCN5 es una proteína matricelular que se secreta extracelularmente y muestra actividad terapéutica y, por lo tanto, CCN5 tiene el potencial de poder tratar diversas enfermedades y una amplia gama de sitios mediante un método de administración de fármacos como la formulación de proteínas, un agente terapéutico génico, un agente terapéutico celular en el que se amplifica un gen, etc. Con base en estas características, como resultado de la expresión de CCN5 en el corazón mediante la transferencia del gen AAV9-CCN5 en diversos modelos animales con un progreso considerable de fibrosis cardíaca, el tejido fibroso preexistente es tratado de forma reversible. El mecanismo de tratamiento reversible de CCN5 reprodujo el efecto in vivo del tratamiento mediante la inducción selectiva de la apoptosis de miofibroblastos como en los experimentos a nivel celular. En particular, el efecto terapéutico para la fibrosis cardíaca se confirmó mediante el tratamiento de la fibrosis intersticial y la fibrosis perivascular del tejido del músculo cardíaco. Además, como resultado del efecto terapéutico de CCN5 a través del análisis de proteínas y genes, cada una de las disminuciones de la enzima LOX aumenta la rigidez al provocar el entrecruzamiento del colágeno (Rosin N.L., et al., Am. J. Pathol. 185(3):631-642(2015), el aumento en la expresión de la proteína Smad7 que es un inhibidor de la señalización de TGF-p (Wei L.H., Huang X.R., et al. Cardiovasc. Res. 1;99(4): 665-73(2013)), la disminución de galectina-3 que promueve la entrada de células inmunitarias inflamatorias y la proliferación de miofibroblastos (Ho J.E., Liu C, et al. J. Am. Coll. Cardiol. 60(14):1249-1256(2012)), y la disminución de las expresiones de TGF-p1 y 2 fue el fármaco diana del tratamiento de la fibrosis, lo que demostró que el mecanismo de tratamiento de CCN5 es fuerte. Por lo tanto, la proteína CCN5 puede proporcionar un medio de tratamiento eficaz para el tratamiento de diversas enfermedades fibróticas cardíacas.
La disfunción cardíaca acompañada de fibrosis cardíaca es la principal causa de insuficiencia cardíaca con fracción de eyección conservada (HFpEF). La rigidez del ventrículo provoca problemas en la atrofia de las células del músculo cardíaco y la contracción y relajación cardiovascular debido a anomalías en la función relajante del músculo cardíaco y un aumento del tejido intersticial extracelular. Como resultado, la inducción de hipoxia, el deterioro del metabolismo de la energía celular y la entrada continua de células inflamatorias provocan necrosis de las células del músculo cardíaco, y la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF) progresa a insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (HFrEF). Además, en el caso de insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (HFrEF) en la que se produce una gran cantidad de muertes de células del músculo cardíaco similar al infarto de miocardio, se produce fibrosis de reemplazo en el sitio dañado, pero la fibrosis intersticial progresa en tejidos límite y distantes. En consecuencia, la fibrosis cardíaca puede actuar como un factor de riesgo para exacerbar las condiciones de insuficiencia cardíaca sistólica. En los presentes estudios, se encuentra que la proteína CCN5 es eficaz en el tratamiento reversible de la fibrosis cardíaca y el efecto de recuperación y protección en la insuficiencia cardíaca sistólica en el modelo de sobrecarga de presión (TAC) y el modelo de distrofia muscular de Duchenne muscular (DMD) que es una enfermedad poco común en modelos in vivo. Además, la proteína CCN5 pudo tratar de manera reversible la fibrosis cardíaca y restaurar la reducción de la función cardíaca diastólica a través de un experimento modelo AID en ratas en el que se produce insuficiencia cardíaca diastólica. Este resultado indica que la proteína CCN5 puede desarrollarse como un agente terapéutico para el tratamiento reversible de la fibrosis cardíaca o insuficiencia cardíaca sistólica (HFrEF) e insuficiencia cardíaca diastólica (HFpEF) acompañada de fibrosis cardíaca.
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Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para uso en un método para tratar una enfermedad cardíaca asociada con la distrofia muscular de Duchenne, en donde dicha composición comprende una proteína CCN5; o un portador de genes que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína CCN5, como ingrediente activo donde dicho método comprende administrar dicha composición a un sujeto que lo necesita en una cantidad suficiente para inducir la apoptosis específica de miofibroblastos.
2. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde la proteína CCN5 incluye una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1.
3. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína CCN5 consta de una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2.
4. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, en donde el portador del gen se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un adenovirus, un virus adenoasociado, un retrovirus, un lentivirus, un virus del herpes simple, un virus vaccinia, un liposoma y un niosoma.
5. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 1, en donde el portador del gen es un virus adenoasociado.
6. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 5, en donde el virus adenoasociado se selecciona del grupo que consiste en virus asociado a adenovirus serotipo 1, virus asociado a adenovirus serotipo 6, virus asociado a adenovirus serotipo 8 y virus asociado a adenovirus serotipo 9.
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