CN113143919B

CN113143919B - 双吲哚马来酰胺类化合物的新应用

Info

Publication number: CN113143919B
Application number: CN202110302524.6A
Authority: CN
Inventors: 余细勇; 赵丽鑫; 申翱
Original assignee: Gmu Medical Drug Development Co ltd; Guangzhou Medical University
Current assignee: Gmu Medical Drug Development Co ltd; Guangzhou Medical University
Priority date: 2021-03-22
Filing date: 2021-03-22
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2041-03-22
Also published as: CN113143919A

Abstract

本发明涉及一种具有式(I)所示结构的双吲哚马来酰胺类化合物或其可接受的盐在制备YAP激活剂中的应用，所述YAP激活剂能够促进YAP进入细胞核诱导促心肌细胞增殖的靶基因表达，从而可以有效促进心肌细胞增殖再生、抑制心脏纤维化。该类双吲哚马来酰胺类化合物实现了心肌再生和修复以及减轻心梗或心衰后心脏纤维化的双重作用，有潜力作为心力衰竭以及心肌梗死后心脏修复的小分子治疗药物。

Description

双吲哚马来酰胺类化合物的新应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，特别是涉及双吲哚马来酰胺类化合物在药物中的新应用。

背景技术

心血管病是全球死亡率最高的疾病，其发病率在我国逐年上升。心肌梗死(心梗)是心血管病最主要的致死类型，病因多为冠状动脉阻塞供血不足导致心肌缺血坏死。成年人的心肌细胞仅有极低程度的更新、绝大部分心肌细胞不能增殖。发生心梗后由于无法提供足够的心肌细胞进行补充，心肌坏死部位随即会被纤维化瘢痕所替代，从而使心功能进一步恶化。因此，补充新的心肌细胞及降低心脏纤维化是心梗发生后恢复受损心脏结构与功能、降低心梗患者死亡率的重要手段。

目前心肌细胞再生的途径主要有三个，一是移植多能干细胞并诱导其定向分化为心肌细胞；二是诱导其他成体细胞(例如心脏成纤维细胞)转分化为心肌细胞；三是促进原有心肌细胞的增殖。对于第一个途径，干细胞移植存在体内转化效率低下、潜在成瘤风险、供体来源及医学伦理等问题。对于第二个途径，目前主要采用将多个心脏发育相关转录因子(如Mef2c、Gata4和Tbx5等(Zhou Y,Liu Z,Welch J D,et al.Single-CellTranscriptomic Analyses of Cell Fate Transitions during Human CardiacReprogramming[J].Cell stem cell,2019,25(1):149-164.e9.))及小分子化合物组合导入人心脏成纤维细胞进行细胞命运重编程产生心肌细胞，多个转录因子的递送一般采用腺病毒或慢病毒作为载体，除了临床使用上的安全性问题，还存在同时递送多种因子效率低下，多种因子及小分子化合物的比例优化、时序表达难以确定等限制。对于第三个途径，目前报道的方式有：通过激活STAT3信号通路、Erk1/2或Akt信号通路可以促进心肌细胞的增殖；抑制脂肪酸代谢(Cardoso A C,Lam N T,Savla J J,et al.Mitochondrial substrateutilization regulates cardiomyocyte cell cycle progression.NatMetab,2020,2:167–178.)(PDK4的小分子抑制剂)、敲除糖酵解酶丙酮酸激酶的同工酶Pkm2可通过调控糖酵解和减少心肌细胞DNA损伤，并在急性或慢性心梗后增加心肌细胞增殖分裂(MagadumA,Singh N,Kurian AA,et al.Pkm2 regulates cardiomyocyte cell cycle and promotescardiac regeneration.Circulation,2020,141:1249–1265.)；激活细胞周期调控因子如CDK1,CDK4,CyclinB1和Cyclin D1等(FanY,ChengY,LiY,et al.Phosphoproteomicanalysis of neonatal regenerative myocardium revealed important roles ofcheckpoint kinase 1via activating mammalian target of rapamycin C1/ribosomalprotein S6 kinase b-1pathway.Circulation,2020,141:1554–1569.)；调控相关转录因子(如E2F、Meis1、Tbx20、GATA4、OSM等(Ebelt H,Zhang Y,Kampke A,et al.E2F2expression induces proliferation ofterminally differentiated cardiomyocytesin vivo.Cardiovasc Res,2008,80:219–226.；Mahmoud A I,Kocabas F,Muralidhar S A,et al.Meis1regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest.Nature,2013,497:249–253.))及非编码RNA等表达可诱导成年心脏的心肌细胞增殖(HuangW,FengY,Liang J,et al.Loss of microRNA-128promotes cardiomyocyte proliferation andheart regeneration.Nat Commun,2018,9:700.)。但是，调控细胞周期调控因子、转录因子及非编码RNA表达多采用病毒载体递送方式，且同时操控多个因子表达存在操作难度大、效率低等问题。因此，采用操作简便、安全高效的途径提高心肌细胞的增殖或分化效率是目前心脏再生治疗亟待解决的关键问题。

多项最新研究表明，Hippo-YAP信号通路在心血管的发生、发育中有着重要作用，且与多个信号通路相交叉。心脏中YAP在出生前高度激活，但出生后由于Hippo通路的激活引起YAP发生磷酸化，磷酸化的YAP与DGC(肌营养不良糖蛋白复合物)的核心成分DAG1反应，导致YAP滞留细胞质、不能进入细胞核调控靶基因，进而抑制了心肌细胞的增殖。而当Hippo通路关闭时，YAP去磷酸化并进入细胞核，能够诱导促心肌细胞增殖的靶基因表达。现已发现激活YAP能够促进再生能力较差或受损的器官再生(如成年小鼠的心脏，老年患病小鼠的肝脏和肠道等)。现有激活YAP的技术方案主要有病毒感染过表达YAP1、YAP1SA、YAP5SA等方式，存在病毒载体临床使用的安全性问题以及持续激活YAP带来的潜在致癌问题。因此，通过小分子化合物激活YAP促进心肌细胞增殖是心肌再生和修复的重要手段(Moya,Iván M,Halder G.Hippo–YAP/TAZ signalling in organ regeneration and regenerativemedicine[J].Nature Reviews Molecular CellBiology,2018.)。

目前，通过激活YAP促进心肌增殖的小分子化合物只有TT-10，但是TT-10促进心肌细胞增殖的有效浓度需达到5uM以上，这限制了其进一步的药物开发(Hara H,Takeda N,Kondo M,et al.Discovery ofa Small Molecule to Increase Cardiomyocytes andProtect the Heart After Ischemic Injury[J].JACC:Basic to TranslationalScience,2018,3(5):639-653.)。寻找可以高效激活YAP的小分子化合物对于心肌再生具有重要意义。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种可高效激活YAP的YAP激活剂，该YAP激活剂能够以低浓度(纳摩尔级别)促进YAP进入细胞核诱导促心肌细胞增殖的靶基因表达，从而可以有效促进心肌细胞增殖再生，同时该类化合物可以有效抑制心脏纤维化。

为达到上述目的，本发明采用以下方案：

具有式(I)所示结构的双吲哚马来酰胺类化合物或其可接受的盐在制备YAP激活剂中的应用，所述YAP激活剂能够促进YAP进入细胞核诱导促心肌细胞增殖的靶基因表达；

其中，

R₁、R₂分别独立地选自：氢、C₁-C₆烷基、R₁₁取代的C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基、3-6元杂环烷基、R₁₂取代的C₃-C₆环烷基、R₁₂取代的3-6元杂环烷基；

R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀分别独立地选自：氢、C₁-C₆烷基、卤素、C₁-C₆烷氧基、卤素取代的C₁-C₆烷基、C₆-C₁₀芳基取代的C₁-C₆烷基；

R₁₁选自：-N(R₁₃)₂、

各R₁₂分别独立地选自：C₁-C₃烷基、R₁₄取代的C₁-C₃烷基；

各R₁₃分别独立地选自：氢、C₁-C₆烷基；

R₁₄选自：C₆-C₁₀芳基、5-10元杂芳基。

在其中一些实施例中，R₁选自：氢、C₁-C₃烷基、R₁₁取代的C₁-C₃烷基、6元杂环烷基、R₁₂取代的6元杂环烷基；

R₂选自：氢、C₁-C₃烷基。

在其中一些实施例中，R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀分别独立地选自：氢、C₁-C₃烷基、-Br、-Cl、-F、C₁-C₃烷氧基、三氟甲基、苄基。

在其中一些实施例中，R₁₁选自：-NH₂、-N(CH₃)₂、

R₁₂选自：吡啶取代的甲基。

在其中一些实施例中，R₁选自：-H、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、

R₂选自：氢、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃。

在其中一些实施例中，所述双吲哚马来酰胺类化合物选自：

本发明还提供了上述的双吲哚马来酰胺类化合物或其可接受的盐在制备促进心肌细胞增殖的促进剂中的应用。

本发明还提供了上述的双吲哚马来酰胺类化合物或其可接受的盐在制备抑制心脏成纤维细胞增殖的抑制剂中的应用。

本发明还提供了上述的双吲哚马来酰胺类化合物或其可接受的盐在制备促进心肌再生和/或修复的药物中的应用。

本发明还提供了上述的双吲哚马来酰胺类化合物或其可接受的盐在制备预防和/或治疗和/或抑制心脏纤维化的药物中的应用。

本发明还提供了上述的双吲哚马来酰胺类化合物或其可接受的盐在制备预防和/或治疗导致心肌细胞死亡的疾病的药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述导致心肌细胞死亡的疾病为心力衰竭、心肌梗塞。

成年人发生心肌梗塞或心衰后，心肌细胞的损失几乎是不可逆的，这与哺乳动物心肌细胞的增殖能力极其有限密切相关。心肌坏死部位随即被纤维化瘢痕所替代，使得心功能进一步恶化。疾病或缺血等因素造成的心肌损伤自身难以修复，本发明为了解决上述问题，通过大量实验研究发现了一类双吲哚马来酰胺类小分子化合物(例如化合物YA-193)可在纳摩尔级别有效激活YAP并促进其进入细胞核，上调心肌细胞中细胞周期相关基因(Aurka、Ccnb1、Ccna2、Cdk2)的表达，从而可以显著促进心肌细胞增殖；同时该类化合物可以有效抑制心脏成纤维细胞的增殖，降低心脏纤维化标志物α-SMA的表达，可以有效减轻心肌纤维化。该类双吲哚马来酰胺类化合物实现了心肌再生和修复以及减轻心梗或心衰后心脏纤维化的双重作用，有潜力作为心力衰竭以及心肌梗死后心脏修复的小分子治疗药物。

附图说明

图1为荧光报告基因载体质粒pcDNA3.1-miniP-EGFP的示意图。

图2为pcDNA3.1-miniP-EGFP荧光报告基因稳转细胞株的构建中G418筛选后第11天的细胞图。

图3为pcDNA3.1-miniP-EGFP荧光报告基因稳转细胞株的构建中单个细胞转入96孔板后第5天的细胞图。

图4为稳转细胞株PCR鉴定结果图。

图5为化合物YA-193和YA-286促进报告基因稳转细胞株A6中GFP的表达的结果图。

图6为荧光素酶报告基因实验结果图。

图7为qRT-PCR检测A549细胞经不同浓度的化合物YA-193处理后CTGF、CYR61的mRNA水平图。

图8为心肌细胞增殖实验示意图。

图9为化合物YA-193(1μM)、化合物YA-286(1μM)处理后的心肌细胞对EdU的摄取率。

图10为化合物YA-193(50nM、100nM、500nM)、化合物YA-286(50nM、100nM、500nM)处理后的心肌细胞对EdU的摄取率。

图11为经100nM的化合物YA-193处理后的大鼠心肌细胞中Aurora B阳性比例变化情况。

图12为经100nM的化合物YA-193处理后的大鼠心肌细胞中Ki67阳性比例变化情况。

图13为经100nM的化合物YA-193处理后的大鼠心肌细胞中磷酸化组蛋白H3阳性比例变化情况。

图14为经100nM的化合物YA-193处理后，YAP在心肌细胞细胞核中的积累。

图15为经100nM的化合物YA-193处理后的大鼠心肌细胞中心肌细胞周期相关基因Aurka、Ccnb1、Ccna2、Cdk2的表达变化情况。

图16为化合物YA-193(100nM、500nM、1μM)处理后的心脏成纤维细胞对EdU的摄取率。

图17为化合物YA-193处理后的心脏成纤维细胞细胞周期相关基因Aurka、Ccnb1、Ccna2、Cdk2的表达变化情况。

图18为化合物YA-193处理后的心脏成纤维细胞中心脏纤维化标志物α-SMA的蛋白表达水平。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

以下为具体实施例。

实施例1：化合物YA-193和YA-286促进YAP进入细胞核并激活下游靶基因的表达

以下实验均利用SPSS 16.0软件统计进行数据分析。两组之间的数据比较使用T检验。多组的数据比较使用单向方差分析(One-wayANOVA)。p<0.05表明差异具有统计学意义。

一、化合物YA-193和YA-286促进报告基因稳转细胞株A6中GFP的表达

1、荧光报告基因质粒pcDNA3.1-miniP-EGFP的构建

(1)全基因合成构建质粒pGL3-miniP，miniP为YAP-TEAD的响应元件(TEAD为YAP转录共激活因子)。当YAP被激活后，响应元件将被激活从而导致响应元件下游控制的报告基因表达。

(2)以pEGFP-N1为模板，PCR扩增获得EGFP，上下游引物分别含有NcoI和XbaI，PCR产物NcoI-EGFP-XbaI经NcoI/XbaI酶切后用DNA快速回收/纯化试剂盒(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)进行回收，得到产物1a。

PCR引物设计如下：

GFP-F-NcoI：CCACCATGGTGAGCAAGG(SEQ ID NO.1)

GFP-R-XbaI：ATATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG(SEQ ID NO.2)

PCR反应体系见表1，反应条件及程序为：预变性98℃，30s；PCR反应35个循环：98℃，10s；65℃，20s；72℃，30s。

表1.PCR反应体系

酶切反应体系见表2，反应条件为37℃，8h。

表2.酶切反应体系

(3)NcoI/XbaI酶切pGL3-miniP，酶切反应体系见表3，反应条件为37℃，8h。琼脂糖凝胶电泳去除Luc小片段，使用DNA快速回收/纯化试剂盒回收载体大片段(1b)。

表3.酶切反应体系

(4)T4连接酶16℃反应过夜(连接反应体系见表4)，将连接产物(1a+1b)转化获得pEGFP-miniP，质粒使用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工)进行抽提。

表4.连接反应体系

(5)MluI&XbaI酶切pEGFP-miniP，酶切反应体系见表5，反应条件为37℃，8h。琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收片段长度为1018bp的条带(2a)。

表5.酶切反应体系

(6)MluI&XbaI酶切pcDNA3.1，酶切反应体系见表6，反应条件为37℃，8h。琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，使用DNA快速回收/纯化试剂盒回收片段长度为4665bp的条带(2b)。

表6.酶切反应体系

(7)T4连接酶16℃反应过夜，(连接反应体系见表7)，将连接产物(2a+2b)转化获得pcDNA3.1-miniP-EGFP质粒(图1)。

表7.连接反应体系

(8)酶切鉴定和测序鉴定均显示质粒载体构建成功。

2、pcDNA3.1-miniP-EGFP荧光报告基因稳转细胞株的构建

(1)选择人肺癌细胞株A549作为稳定转染实验用细胞，预实验确定G418抗性筛选的最佳作用浓度为900μg/mL。

(2)使用lipofectamine 3000(ThermoFisher)向A549细胞转染pCDNA3.1-miniP-EGFP质粒，操作参考lipofectamine 3000使用说明书标准流程进行。

(3)转染后48h向培养液中添加G418(900μg/mL)进行抗性筛选，每隔3天换一次液并补充新的G418；

(4)转染10-14天后，未表达新霉素抗性的细胞基本死亡，获得抗性的细胞成团聚集生长，胰酶消化细胞后计数，稀释细胞至10个/mL，按1个/孔的密度接种于96孔板，继续使用G418进行筛选；

(5)4-6天后，显微镜下观察并记录有单个细胞集落的孔；

(6)将符合条件的单克隆细胞扩大培养，并提取基因组DNA，经PCR反应鉴定获得两个用于药物筛选的稳定细胞株A4、A6，荧光报告基因已成功整合进入基因组，如图4所示：左边框中的样品PCR反应使用miniP-EGFP特异性引物；右边框中的样品PCR反应使用EGFP特异性引物，A7仅EGFP整合进细胞基因组、缺失了miniP，因此被排除。

稳转细胞株PCR鉴定相关引物设计如下：

miniP-EGFP-F：TAGCTCTGCGAGCTGGAGTGT(SEQ ID NO.3)

miniP-EGFP-R：CTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQ ID NO.4)

PCR反应体系见表8，反应条件及程序为：预变性98℃，30s；PCR反应35个循环：98℃，10s；60℃，5s；72℃，70s。

表8.PCR反应体系

3、化合物YA-193和YA-286促进报告基因稳转细胞株A6中GFP的表达

A6细胞以2000个/孔的密度均匀接种于96孔板，使用DMEM高糖培养基(加入10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、50mg/ml的青霉素/链霉素双抗溶液)在37℃、5％CO₂环境的恒温培养箱中培养。24小时后分别加入不同化合物处理，化合物终浓度统一为10μM，每块96孔板设置10孔作为空白对照组(不加化合物处理)。48小时后去除培养基，PBS漂洗2遍后用4％多聚甲醛固定，15分钟后吸去4％多聚甲醛，PBS漂洗一遍，每孔加入30μL Hoechst33342染色液，5分钟后吸去染色液，PBS漂洗2遍，最终每孔加入100μLPBS。

使用ThermoScientific Cellinsight CX7LZR高内涵药物分析系统图像采集和数据处理。96孔板每孔选取25个视野，每个视野分别拍摄405nm和488nm激发波长下的图像；Hoechst33342染色后细胞核在405nm激发波长下呈蓝色，细胞中受YAP激活表达的荧光蛋白在488nm激发波长下呈绿色；系统通过识别蓝色区域精确定位细胞核位置，以细胞核外扩固定值识别细胞范围，并计算每个细胞范围内绿色荧光值，最后计算出25个视野中所有标记细胞范围内的绿色荧光平均值。结果如图5所示，化合物YA-193处理组和化合物YA-286处理组细胞平均绿色荧光强度分别为空白对照组的7.60倍(P<0.0001)、3.24倍(P<0.05)，可见化合物YA-193和YA-286都能促进报告基因稳转细胞株A6中GFP的表达。

二、荧光素酶报告基因实验显示化合物YA-193和YA-286可促进YAP转录共激活因子TEAD下游靶基因的表达

HEK293T以1×10⁴个/孔的密度均匀接种于96孔板，使用DMEM高糖培养基(加入10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、50mg/ml的青霉素/链霉素双抗溶液)在37℃、5％CO₂环境的恒温培养箱中培养。18小时后使用Lipofectamine 3000向HEK293T细胞转染8×GTIIC-luciferase质粒(购自Addgene)和pYAP1-mcherry质粒(1：1)；6小时后，分别用100nM化合物YA-193、化合物YA-286处理细胞，空白对照组不做处理。化合物处理24小时后，去除培养基，PBS轻轻漂洗1遍，用Promega荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测(过程按照试剂盒说明书)。结果如图6所示，化合物YA-193处理组和化合物YA-286处理组细胞荧光值显著高于空白对照组(P<0.001)。

三、qRT-PCR检测A549细胞经不同浓度的化合物YA-193处理后CTGF、CYR61的mRNA水平

A549细胞以2×10⁵个/孔的密度均匀种于6孔板中。24小时后，使用不同浓度的YA-193(10nM、100nM、1μM)进行处理，以0.1％DMSO处理作为对照组。化合物处理24小时后，进行细胞总RNA提取，总RNA提取使用英泽细胞/组织总RNA提取试剂盒，过程按照试剂盒说明书。反转录与实时荧光定量PCR反应使用的试剂盒均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司(EvoM-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCRAG11705；

Green Premix Pro Taq HSqPCR KitAG11701)，过程按照试剂盒说明书。利用qRT-PCR所得CT值计算样品中基因的相对表达量2^-△△CT；△△CT＝(CT目标基因-CT内参基因)处理—(CT目标基因-CT内参基因)对照。qRT-PCR反应的引物设计采用软件NCBI的primer-blast或者参考文献，具体序列见表9。

表9.实时荧光定量PCR反应所需的引物

qRT-PCR实验结果如图7所示：化合物YA-193(10nM、100nM、1μM)均可显著上调YAP下游靶基因CTGF及CYR61的表达。

实施例2：化合物YA-193和化合物YA-286促进心肌细胞增殖

5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)，是一种新型胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，EdU可以在DNA合成过程中替代胸苷掺入到新合成的DNA中。EdU上的乙炔基能与荧光标记的小分子叠氮化物探针(如AzideAlexa Fluor 488、AzideAlexa Fluor 555、AzideAlexaFluor594、AzideAlexaFluor 647等)通过一价铜离子的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，通过点击反应，新合成的DNA会被相应的荧光探针所标记，从而可以使用适当的荧光检测设备检测到增殖的细胞(图8)。

本实施例中，SD乳鼠心肌细胞与心脏成纤维细胞的分离培养具体操作如下：

a.二型胶原酶80mg溶解于68mLPBS，溶解后加入32mL 0.25％无EDTA胰酶进行稀释，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌；在两个50mL离心管中，加入5mL10％FBS，分别标上“终A”、“终B”用于终止消化，在另外两个50mL离心管上分别标上A、B，用于剪碎心脏组织。两个大皿中倒入适量的PBS。在两个小烧杯中倒入适量的75％酒精。

b.将乳鼠(1-2日龄)平均分成A、B两组，左手拿纱布，右手拿镊子，夹住乳鼠的背部，在75％酒精中漂洗两次(每次5秒左右)，放在左手纱布上固定乳鼠背部，右手用灭菌过的直剪从乳鼠的心脏剑突处轻轻剪开，左手轻轻用力挤压乳鼠的后背，乳鼠的心脏即可突出，用灭菌的弯镊子取出心脏放入装有PBS的培养皿中，如此循环地取出所有乳鼠的心脏。

c.所有心脏取出之后，用直剪去除心脏外周的结蹄组织，血块等，并将心腔剪开，洗去心脏内的瘀血，然后转移至另一装有PBS的培养皿，再一次清洗(清洗2次，洗去血块)。

d.将洗好的心脏分别转入A、B离心管，用弯剪剪碎(2min)，加入5mL的混合酶冲洗管壁和弯剪上黏附的组织块，用巴氏吸管轻轻吹打2min，洗去组织块中的红细胞，静置片刻(2min)，去掉上清液(第一次是去掉上清，前两次去掉上清，以清洗血块)。A管静置时吹打B管，如此循环。

e.去掉上清后每管加入5mL的混合酶，摇散组织块，用巴氏吸管继续轻轻吹打2min，放37℃水浴消化2min，再静置2min，分别吸取上清液到“终A”、“终B”终止消化；再加混合酶到A、B管，轻吹组织块，分散后放到37℃水浴箱2min，然后取上清，重复至消化完全即可如此循环至看不见明显的组织块为消化完全(A、B管同时进行)。

f.“终”管过滤(用100目不锈钢细胞筛网过滤)，拿到1120离心(250C，1500-1700rpm,15min),可见离心管底部有白色的细胞沉淀，弃上清，加10％完全培养基重悬细胞，将其接种于25瓶中，每瓶约5mL细胞悬液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养1-2h，用差速贴壁原理分离心肌细胞和心脏成纤维细胞(心脏成纤维细胞贴壁速率比心肌细胞快)。

g.在12孔板或6孔板每个孔中加入1-2mL 1％明胶，置于温箱中包被至少15min。

h.差速贴壁2h后,收集培养瓶中的上清液，再用1mL的含双抗完全培养基轻轻冲洗培养瓶，使心肌细胞收集完全，贴壁生长的细胞为心脏成纤维细胞，然后吸掉12孔板或6孔板中提前15min包被的1％明胶，将心肌细胞收集液重悬后均匀铺到12孔板中，每孔约1.5mL，同时加入1μL/1mL 10％FBS的Brdu抑制成纤维细胞增值(1μM)，然后将细胞置于温箱培养。稳定培养24h后,换液(吸掉心肌细胞培养基，再加含有10％FBS及双抗的培养基换液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

本实施例中，利用0.08％胰蛋白酶及0.08％胶原酶II分离1-2日龄SD乳鼠的心肌细胞。36小时后，分别用化合物YA-193(50nM、100nM、500nM、1μM)、化合物YA-286(50nM、100nM、500nM、1μM)和化合物BIO(1μM)处理心肌细胞(BIO购自上海陶素生化科技有限公司)，心肌细胞使用DMEM高糖培养基(加入0.1％胎牛血清、1％谷氨酰胺、50mg/ml的青霉素/链霉素双抗溶液)在37℃、5％CO₂环境的恒温培养箱中培养，并在培养基中添加5μMEdU。EdU孵育40小时后固定细胞，固定后进行细胞通透(0.3％Triton X-100的PBS)，洗涤1-2次后加入Click反应液，室温避光孵育30分钟，吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。用心肌细胞标志物cTnT(肌钙蛋白T)进行免疫荧光染色，再用Hoechst 33342进行细胞核染色；ArrayScanVTI(Thermo Fisher Scientific)计数EdU⁺心肌细胞数量，并计算EdU⁺心肌细胞比例。如图9、图10所示，与空白对照组相比，不同浓度的化合物YA-193、化合物YA-286均显著提高了心肌细胞EdU的摄取率(P<0.01)；且化合物YA-193(1μM)、化合物YA-286(1μM)处理后的心肌细胞对EdU的摄取率显著高于化合物BIO(1μM)处理组(阳性对照)。

磷酸化组蛋白H3(pH3)、Ki67都是细胞增殖的标记蛋白，AuroraB是细胞分裂标志物。如前述方法提取的大鼠心肌细胞培养36小时后，更换新鲜培养基并使用浓度为100nM的化合物YA-193处理，继续培养48小时后，利用磷酸化组蛋白H3、Ki67、AuroraB及YAP抗体做免疫荧光染色，再复染心肌细胞标志物cTnT抗体和Hoechst 33342；通过高内涵细胞药物分析系统成像和分析后，统计不同处理组大鼠心肌细胞的磷酸化组蛋白H3、Ki67及AuroraB的阳性比例变化情况。结果如图11、图12、图13所示，结果表明，经100nM的化合物YA-193处理48小时后，大鼠心肌细胞中磷酸化组蛋白H3、Ki67及Aurora B的阳性比例显著高于空白对照组(P<0.05)。YAP与Hoechst 33342染色的共定位结果(图14)显示，与空白对照组相比，化合物YA-193(100nM或1μM)均显著提升了YAP在心肌细胞细胞核中的积累(P<0.01)。

如前述方法提取的大鼠心肌细胞以5×10⁵个/孔的密度均匀种于6孔板中。36小时后，使用化合物YA-193(100nM)进行处理，化合物处理24小时后，使用英泽细胞总RNA提取试剂盒进行细胞总RNA提取，过程按照试剂盒说明书。反转录与实时荧光定量PCR反应使用的试剂盒均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司(Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean forqPCR；SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCRKit)，过程按照试剂盒说明书。利用qRT-PCR所得CT值计算样品中基因的相对表达量2^-△△CT；△△CT＝(CT目标基因-CT内参基因)处理—(CT目标基因-CT内参基因)对照。qRT-PCR反应的引物设计采用软件NCBI的primer-blast或者参考文献，具体序列见表10。

表10.实时荧光定量PCR反应所需的引物

结果如图15所示，与空白对照组相比，化合物YA-193显著提升了心肌细胞周期相关基因Aurka、Ccnb1、Ccna2、Cdk2的表达。

以上结果说明化合物YA-193和化合物YA-286都能有效促进心肌细胞增殖。

实施例3：化合物YA-193抑制心脏成纤维细胞的增殖并减轻心脏纤维化

本实施例中，利用0.08％胰蛋白酶及0.08％胶原酶II分离1-2日龄SD乳鼠的心脏成纤维细胞(具体操作步骤见实施例2)。心脏成纤维细胞使用DMEM低糖培养基(加入10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、50mg/ml的青霉素/链霉素双抗溶液)在37℃、5％CO₂环境的恒温培养箱中培养；取第二代细胞进行下述实验。

大鼠心脏成纤维细胞以1×10⁴个/孔的密度均匀种于96孔板，24小时后，更换新鲜的DMEM低糖培养基(加入0.1％胎牛血清、1％谷氨酰胺、50mg/ml的青霉素/链霉素双抗溶液)，并在培养基中添加5μM EdU。EdU孵育24小时后固定细胞，固定后进行细胞通透(0.3％TritonX-100的PBS)，洗涤1-2次后加入Click反应液，室温避光孵育30分钟，吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。用Hoechst 33342进行细胞核染色，ArrayScanVTI(Thermo Fisher Scientific)计数EdU⁺细胞数量，并计算EdU⁺细胞比例。结果如图16所示，与空白对照组相比，化合物YA-193(100nM、500nM、1μM)均显著降低了心脏成纤维细胞EdU的摄取率(P<0.05)，且化合物YA-193的浓度越高，心脏成纤维细胞的EdU摄取率越低。

大鼠心脏成纤维细胞以5×10⁵个/孔的密度均匀种于6孔板中。24小时后，使用500nM的化合物YA-193进行处理，化合物处理24小时后，使用英泽细胞总RNA提取试剂盒进行细胞总RNA提取，过程按照试剂盒说明书。反转录与实时荧光定量PCR反应使用的试剂盒均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司(Evo M-MLVRTKitwith gDNAClean forqPCR；SYBRGreenPremix Pro Taq HS qPCR Kit)，过程按照试剂盒说明书。利用qRT-PCR所得CT值计算样品中基因的相对表达量2^-△△CT；△△CT＝(CT目标基因-CT内参基因)处理—(CT目标基因-CT内参基因)对照。qRT-PCR反应的引物设计采用软件NCBI的primer-blast或者参考文献，具体序列见表2。结果如图17所示，与空白对照组相比，化合物YA-193显著降低了心脏成纤维细胞细胞周期相关基因(Aurka、Ccnb1、Ccna2、Cdk2)的表达(P<0.05)。

大鼠心脏成纤维细胞以1×10⁶个/皿的密度均匀种于60mm无菌细胞培养皿中。24小时后，分别使用100nM、500nM的化合物YA-193进行处理。化合物处理48小时后，提取细胞的总蛋白，以GAPDH作为内参，检测目的蛋白α-SMA的表达水平。总蛋白提取步骤如下：化合物处理48小时后，吸出培养液，用预冷的PBS洗2次，按每皿100μL用量加入含有1×磷酸酶抑制剂和1×PMSF的细胞裂解液，细胞刮将贴壁的细胞全部刮落(冰上进行)，完全吸尽细胞悬液，转移至1.5mLEP管中，做好标记，用超声破碎仪破碎(冰浴)或者用涡旋振荡仪最高速剧烈涡旋10s，冰浴1min，每隔5min振荡一次，重复操作30min，然后12000rpm，4℃离心15min，取上清(不要吸到沉淀)转移到新标记好的EP管中，保存至-80℃，待测浓度；BCA法测定蛋白浓度后按标准程序进行Western-blot检测。结果如图18所示，与空白对照组相比，化合物YA-193(100nM)及化合物YA-193(500nM)处理组均降低了心脏纤维化标志物α-SMA的蛋白表达水平。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州医科大学、广州医大新药创制有限公司

<120> 双吲哚马来酰胺类化合物的新应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ccaccatggt gagcaagg 18

<210> 2

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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<213> Artificial sequence

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ctcttgctag tccaaagtca gcc 23

Claims

1.双吲哚马来酰胺类化合物或其可接受的盐在制备治疗心脏纤维化的药物中的应用；所述双吲哚马来酰胺类化合物选自：

。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的双吲哚马来酰胺类化合物或其可接受的盐是通过促进心肌细胞增殖和/或抑制心脏成纤维细胞增殖的机制起治疗作用的。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的双吲哚马来酰胺类化合物或其可接受的盐是通过促进心肌再生和/或修复的机制起治疗作用的。