CN108778311A - 用于治疗心脏纤维化的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗心脏纤维化或伴随有心脏纤维化的心脏病的药物组合物。根据本发明，本发明的组合物具有通过选择性地破坏心脏纤维化中的肌成纤维细胞来溶解纤维化基质和恢复为正常组织的作用，所述心脏纤维化是在疾病发生后被诊断的。因此本发明的组合物可以有用地用作治疗由于被认为是不可逆疾病进展而至今没有开发出治疗剂的心脏纤维化、收缩性心力衰竭和舒张性心力衰竭的组合物。

Description

用于治疗心脏纤维化的药物组合物

技术领域

本专利申请要求于2015年11月13日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2015-015988号的优先权的权益，其内容通过引用全部并入本文。

本发明涉及用于治疗心脏纤维化的药物组合物，更具体地，涉及用于治疗心脏纤维化或伴随心脏纤维化的心脏疾病的药物组合物。

背景技术

纤维化治疗中形成的罕见疾病源自心脏组织、血管内皮细胞和骨髓细胞中存在的成纤维细胞的分化。虽然肌成纤维细胞的源细胞可能不同，但分化的肌成纤维细胞参与胞外基质如纤维化胶原蛋白等的过度产生及其分泌。由胞内α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达所致的收缩性细胞的退化被定义为与纤维化程度发生的时间点相比减少的状态，而逆转或可逆性是指完全恢复到正常组织结构的状态。

纤维化疾病占西方社会死亡原因的约45％，其是只有在疾病进展很久之后才能被临床诊断的严重问题(G.Garrison,S.K.Huang,et al.,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.,48:550558(2013)；和Rosenbloom J.,et al.Biochim.Biophys.Acta.,1832(7):1088-1103(2013))。除预防性治疗的局限性之外，纤维化疾病还属于严重的临床领域，该领域中直到现在仍没有用于直接治疗进行性或先存性纤维化的有效治疗手段(Rosenbloom J,MendozaFA,et al.,Biochim.Biophys.Acta,1832(7):1088-1103(2013))。虽然纤维化疾病的诱导纤维化的原因和疾病发生的形式可能变化，但是人们发现，作为纤维化形成机制的核心的肌成纤维细胞(MyoFB)(即活化的成纤维细胞)作为病理活性细胞起作用，从而控制所有纤维化疾病的进展(Dufferield J.S.,et al.,Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.,8:241-276(2013))。

特别地，心脏是人体中的代表性器官，其中，由于纤维化引起的心肌组织的结构重构会直接影响心脏的运动功能。心脏是由各种细胞组成的肌肉组织，所述细胞例如心肌细胞(其在运动功能中起关键作用)、成纤维细胞和与血管有关的内皮细胞等。尽管心肌的大部分体积由心肌细胞组成，但成纤维细胞占心脏组织中的细胞的50％以上。成纤维细胞的功能是产生和分泌胞外基质(ECM)，所述胞外基质形成支持心肌细胞的有效收缩和舒张的精确结构，并促进心肌组织内的微环境中适当的力的传递、电信号的传递、胞内通讯、代谢物交换等(F.G.Spinale,Physiol.Rev.87:12851342(2007))。然而，当由于施加在心壁上的应力增加、心壁上的损伤、疾病等而发生纤维化时，心脏功能由于纤维化胞外基质累积过多引起的心脏组织硬化而发生变化(Schroer A.K.,et al.,J.Cell.Sci.128(10):1865-1875(2015))。在心脏纤维化中，作为纤维化致病细胞的肌成纤维细胞呈现出诸如心脏损伤等病理学的共同特点(Kendall R.T.,Feghali-Bostwick C.A.,Front Pharmacol.,5:123(2014))。由损伤的心肌细胞和炎性免疫细胞分泌的诸如TGF-β、血管紧张素-II(ANG-II)、内皮素-I(ET-1)、IL-6、结缔组织生长因子(CTGF)、纤连蛋白的额外结构域A(EDA)等诱导纤维化的生长因子和细胞因子涉及肌成纤维细胞的分化和活化(Frangogiannis N.G.,Nat.Rev.Cardiol.11(5):255-65(2014))。在慢性疾病状态，肌成纤维细胞通过其持续的增殖和活化自行促进纤维化过程的恶性循环。这些因素包括：在通过由于胞外基质过量产生所致的组织硬化而进行的机械刺激下、成纤维细胞中TGF-β1和ANG-II的自分泌和ANG-II I型受体的表达，以及由于防止细胞凋亡的基因的激活而导致的新的分泌细胞功能的提供(Wynn T.A.,Ramalingam T.R.Nat.Med.18:1028-1040(2012))。细胞凋亡功能丧失的肌成纤维细胞的持续增殖和活化导致引起组织重构的胞外基质的产生和积累，以及导致炎性细胞的功能。氧自由基、进行信号转导的脂质物质、以及细胞因子(如TNF-α)的分泌促进了由受损组织中的炎症和趋化因子如MCP-1等的分泌所导致的炎性免疫细胞流入，从而促进反应性纤维化过程(Van Linthout S.,et al.,Cardiovasc.Res.102(2):258-269(2014))。在持续性诱导成纤维细胞活化的心脏中，纤维化组织出现，并由此引起各种病理学不利作用。1)由纤维化胶原蛋白包裹的周围心肌细胞萎缩，因此以各种大小存在并减少肌肉细胞的运动负载(Drakos S.G.,et al.J.Am.Coll.Cardiol.27；56(5):382-391(2010))。2)由于分泌的1型胶原蛋白的交联和肌成纤维细胞的间隙连接，被动组织的刚度增加，使得收缩纤维组织产生，导致心脏舒张功能障碍(Lo B.et al.Hypertension 60:677683(2012))。3)因为冠状动脉血管收缩和松弛异常减少了心肌中的氧供应而使正常能量代谢减少，所以血管周围纤维化导致心肌细胞凋亡(Coen,M.,Gabbiani,G.&Bochaton-Piallat,MLArterioscler.Thromb.Vasc.Biol,31:23912396(2011))。因此，当这种纤维性重构延长时，由于心肌细胞的收缩和细胞凋亡的发生，表现出从舒张性心力衰竭向收缩性心力衰竭发展的过程(Kamalov G.,Zhao W.,et al.J Cardiovasc.Pharmacol.62(6):497-506(2013))。

心脏组织纤维化的形式被分类为替代性纤维化以及间质和血管周围纤维化，所述替代性纤维化形成瘢痕组织，以在大量心肌细胞发生坏死时(例如心肌梗塞)和产生广泛的肌细胞坏死时(例如心肌梗塞)防止心脏快速破裂，所述间质和血管周围纤维化是由于各种疾病症状而逐渐扩散的反应性纤维化(Bharath Ambale-Venkatesh and Joao A.C.Lima,Nat.Rev.Cardiol.12:18-29(2015))。伴随有心脏纤维化的心脏病包括：1)与遗传异常相关的心肌肥厚；2)与慢性代谢疾病(例如高血压、慢性肾病、糖尿病和肥胖症等)相关的心脏病；3)心脏瓣膜疾病；4)与炎性疾病相关的心脏病，例如结节病、自身免疫性心肌炎和心脏移植相关的排斥反应等；5)结构性心脏病，例如冠心病、主动脉瓣狭窄、非缺血性扩张型心肌病等；6)传染病，例如南美锥虫病、病毒性心肌炎等；7)先天性心脏病，例如紫绀型心脏病、法洛四联症、大动脉转位、单心室等，8)与诸如杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良、法布里病等遗传疾病相关的心脏病；以及9)由于接触诸如吸烟、酒精摄入、抗癌药物等有毒化学物质引起的心脏病，以及自然衰老过程中发生的心脏病(Schelbert E.B.,Fonarow G.C.,J.Am.Coll.Cardiol.63(21):2188-2198(2014)；Collier P.,et al.,QJM.105(8):721-724(2012)；Maron B.J,Maron M.S.,Lancet.381(9862):242-255(2013)；Kong P.,ChristiaP.,et al.Cell.Mol.Life Sci.71(4):549-574(2014)；和Mavrogeni S.,Markousis-Mavrogenis G.,et al.World J.Cardiol.(7):410-414(2015))。另外，当不论何种类型的致病因素使纤维化进展时，心脏显示了心室的刚度与由此而来的心力衰竭(例如收缩性和舒张性心功能障碍)之间的因果关系(Weber K.T.,Sun Y.,et al.Nat.Rev.Cardiol.10(1):15-26(2013))。最近，临床上根据心功能异常将心力衰竭分为两类，即左心室心肌纤维性僵硬为直接原因的呈现出射血分数正常而舒张功能异常的舒张性心力衰竭(HFpEF)，以及心肌细胞损失为原因的呈现出射血分数降低、收缩功能异常并且心脏扩张症的收缩性心力衰竭(HFrEF)。(Burchfield J.S.,Xie M.,Hill J.A.,et al.Circulation128(4):388-400(2013)；和Butler J.,Fonarow G.C.,et al.JACC Heart Fail.2(2):97-112(2014))。HFpEF的危险因素包括衰老、糖尿病和代谢性疾病，心脏肥大、冠状动脉疾病和高血压，并且这些因素会导致心脏纤维化并使舒张性心力衰竭进展。此外，在HFrEF的情况下，细胞凋亡例如心肌梗塞等是主要原因，但据报道，除了替代性纤维化之外，间质性纤维化扩散的增加与疾病严重程度的增加成正比，并且是导致疾病恶化的一个因素(Borlaug B.A.,Nat.Rev.Cardiol.11(9):507-515(2014))。

在对具有过表达的肝细胞生长因子(HGF)的转基因小鼠或TGF-β的辅助因子内皮素基因缺陷的转基因小鼠通过压力超负荷诱导的心力衰竭模型中，报道了对心脏纤维化的预防性研究。在各转基因模型小鼠中，血管内皮细胞向肌成纤维细胞的内皮间质转化(EndoMT)受到抑制，这显示出防止进展为心脏纤维化和心力衰竭的心脏功能恶化的作用，但是没有证实已经产生了对纤维化的治疗作用(Okayama K.,Azuma J.,etal.Hypertension 59(5):958-965(2012)；以及Kapur N.K.,et al.Circulation 125(22):2728-2738(2012))。

纤维化的治疗需要一种治疗手段来促进疾病的可逆性恢复，例如去除过量积累的纤维化组织，恢复受损组织的功能等。已经用可能具有有效的治疗靶标的许多研究结果提出了纤维化疾病的治疗中对肌成纤维细胞的衰老和死亡的调节(Darby I.A.,etal.Clin.Cosmet.Investig.Dermatol.7:301-311(2014))。通过使活化的成纤维细胞由于衰老和细胞凋亡而消失，开始恢复体内组织损伤的治愈过程中正常组织结构和功能。由于巨噬细胞和成纤维细胞中胶原酶的分泌和清洁作用，累积的胞外纤维化基质的溶解和消除，使得发生损伤后恢复(Wynn T.A,Ramalingam TR.Mechanisms of fibrosis:therapeutic translation for fibrotic disease.Nat Med.18:1028-40(2012))。然而，有报道称纤维化的可逆性治疗和恢复的可能性与接受抗逆转录病毒治疗的患者中肝硬化症状的可逆性恢复有关，并且有报道称，在对心力衰竭患者使用左心室辅助装置的过程中，由于心脏纤维化引起的肌肉结构的重构罕见地被逆转，并且心脏功能得到改善(Sun M.,Kisseleva T.,Clin.Res.Hepatol.Gastroenterol.39Suppl.1:S60-63(2015)；和JeffM.Berry,et al.Circ.Res.109:407417(2011))。这一事实对目前为止纤维化不能可逆地治疗的传统知识提出了新的挑战，并为纤维化提供新的治疗策略。因此，治疗进行性和已存在的纤维化是基于对作为参与纤维化的发生和进展的致病细胞的肌成纤维细胞的增殖抑制和细胞凋亡诱导的机制，有必要开发可通过该治疗方法来调节纤维化的胞外基质的形成和分解并使其恢复为正常组织的治疗手段。

本发明中使用的CCN5是属于CCN家族的基质细胞蛋白，已知CCN家族中有六种蛋白，据报道它在调节细胞功能诸如血管疾病、血管生成、致癌作用、纤维化疾病诱导、细胞分化和存活中起着各种作用(Perbal B.Lancet,363:62-4(2004))。与CCN家族中的其它蛋白质不同，CCN5不具有C-端结构域，并且CCN5具有其它名称如WISP-2、HICP、Cop1、CTGF-L等。另外，它由250个氨基酸的序列的单多肽链组成。CCN5在其N-端具有22个氨基酸的分泌诱导序列，所述序列在细胞外分泌并充当信号传导蛋白(Russo J.W.,etal.J.Cell.Commun.Signal.4(3):119-130(2010))。

本发明中使用的基因治疗用于各种领域，以用于在基因水平上理解心血管疾病的疾病机理、发现治疗基因、设计基因转移载体和包装技术、以及用于大动物的临床前实验和用于患者的临床试验中的递送技术(Mason D.,et al.J.Control Release 215:101-111(2015))。在基因载体为非病毒载体的情况下，临床试验II期已报道通过直接将SDF-1基因载体注射至心脏创伤周围的区域来改善患有心肌梗塞的患者的心脏功能。另外，在病毒载体的情况下，使用通过基因递送治疗将腺病毒(Ad)和腺相关病毒(AAV)直接注射至心肌的方法和通过将腺病毒和腺相关病毒局部地传递至冠状动脉和静脉的递送技术(ChungE.S.,Miller L.,et al.Eur.Heart J.36(33):2228-2238(2015))。AAV1-SERCA2a基因治疗的临床IIb期完成了，这改善了患者心肌收缩力和功能的恢复，而AAV9-S100A1和Ad5-腺苷酸环化酶6处于临床阶段，没有严重的由病毒载体引起的副作用(Rincon M.Y.,etal.Cardiovasc.Res.108(1):4-20(2015))。因此，通过本发明，揭示了CCN5蛋白质通过对作为纤维化致病细胞的肌成纤维细胞的选择性凋亡机制，对多种原因引起的已存在的心脏纤维化用基因递送方法治疗的效果。

在本说明书中引用了许多论文和专利文件，并且指明了这些引用。所引用的文章和专利文献的公开内容通过引用全部并入本文，以更清楚地解释本发明所属技术领域的水平和本发明的内容。

发明内容

技术问题

本发明的发明人致力于开发一种可逆地治疗心脏纤维化或伴随有心脏纤维化的心脏病的方法。结果发现CCN5基因或CCN5蛋白能够选择性地杀伤肌成纤维细胞，显著减少心脏纤维化，并能够治疗进行性或已存在的心脏纤维化，通过证实对伴随有心脏纤维化的收缩性心力衰竭(HFrEF)或舒张性心力衰竭(HFpEF)有治疗作用，而完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供治疗心脏纤维化或伴随心脏纤维化的心脏病的药物组合物，所述组合物包含：CCN5蛋白、或包含编码CCN5蛋白的核苷酸序列的基因载体。

本发明的另一个目的是提供治疗心脏纤维化或伴随有心脏纤维化的心脏病的方法，包括将本发明的药物组合物施用于对象的步骤。

由本发明的详细描述、所附权利要求和附图，本发明的其它目的和优势将变得更明显。

解决问题的技术方案

根据本发明的一个方面，本发明提供了用于治疗心脏纤维化或伴随心脏纤维化的心脏病的药物组合物，该药物组合物包含以下物质作为活性成分：(a)CCN5蛋白；(b)基因载体，其包含编码CCN5蛋白的核苷酸序列。

作为开发用于可逆地治疗心脏纤维化或伴随有心脏纤维化的心脏病的方法的深入研究的结果，本发明人已经发现，CCN5基因或CCN5蛋白选择性地杀伤成纤维细胞以显著降低心脏纤维化，可以治疗进行性或已存在的心脏纤维化，并且对收缩性心力衰竭(HFrEF)或舒张性心力衰竭(HFpEF)具有治疗作用。

根据本发明的一种实施方式，本发明的心脏纤维化是进行性心脏纤维化或已存在的心脏纤维化。如上所述，最近，纤维化可以被可逆地治疗，并且如在以下实施例中所证明的，肌成纤维细胞被本发明的药物组合物选择性杀伤，使得已存在的纤维化由此恢复，从而证实了对进行性心脏纤维化或已存在的心脏纤维化的治疗作用。因此，本发明的一重要特征是本发明的药物组合物诱导肌成纤维细胞特异性凋亡。

根据本发明的一种实施方式，本发明的CCN5蛋白包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列。

根据本发明的一种实施方式，本发明的编码CCN5蛋白的核苷酸序列由SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列组成。

基因载体包括编码作为本发明的活性成分的CCN5蛋白的核苷酸序列，并且用于将CCN5基因转移至心脏的基因递送系统。本文中使用的术语“基因转移”是指基因被携带到细胞中，并具有与基因的胞内转导相同的含义。在组织水平上，术语“基因递送”具有与“基因的传播”相同的含义。因此，本发明的基因递送系统可以被描述为基因转导系统和基因传播系统。

为了制备本发明的基因递送系统，编码CCN5蛋白的核苷酸序列(例如CCN5蛋白基因)可以存在于适当的表达构建体中。在上述表达构建体中，CCN5蛋白基因可以可操作地连接于启动子。如本文使用的，术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子、信号序列或一批转录调节因子的结合位点)和另一个核酸序列之间的功能性关联，由此该控制序列调节其它核酸序列的转录和/或翻译。在本发明中，根据本发明的一种实施方式，连接于CCN5蛋白基因序列的启动子在动物细胞中起作用，而根据另一种实施方式在哺乳动物细胞中起作用，以此调节CCN5蛋白基因的转录，所述启动子包括来自哺乳动物病毒的启动子和来自哺乳动物细胞的基因组的启动子，并且可以包括例如巨细胞病毒(CMV)启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV的tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL-2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子、人GM-CSF基因启动子，但不限于此。根据本发明的特别的实施方式，所述启动子是CMV启动子。

尽管本发明的基因载体可以以各种形式制备，但基因载体也可以以病毒载体或非病毒载体的形式制备，更具体地，以如下形式制备：(i)空重组DNA分子，(ii)质粒，(iii)病毒载体，以及(iv)包封有空重组DNA分子或质粒的脂质体或囊泡。

编码本发明的CCN5蛋白的核苷酸序列可以应用于常见基因治疗所使用的所有基因递送系统，优选应用于质粒、腺病毒(Lockett LJ,et al.,Clin.Cancer Re.3:2075-2080(1997))、腺相关病毒(AAV,Lashford L.S.,et al.,Gene Therapy Technologies,Application and Regulations Ed.A.Meager,1999)、逆转录病毒(Gunzburg W.H.,etal.,Retroviral vectors.Gene Therapy Technologies,Application and RegulationsEd.A.Meager,1999)、慢病毒(Wang G.et al.,J.Clin.Invest.104(11):R55-62(1999))、单纯性疱疹病毒(Chamber R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1411-1415(1995))、痘苗病毒(Puhlmann M.et al.,Human Gene Therapy 10:649-657(1999))、脂质体(Methodsin Molecular Biology,Vol 199,S.C.Basu and M.Basu(Eds),Humana Press 2002)或囊泡。

腺病毒

由于腺病毒的基因组大小适当、操作方便、滴度高、靶细胞范围宽并且感染性优秀，因此腺病毒被广泛用作基因转移载体。基因组的两个末端均包含100至200bp的末端反向重复序列(ITR)，所述末端反向重复序列是DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的E1区(E1A和E1B)编码涉及病毒DNA复制的蛋白。

在当前开发的腺病毒载体中，广泛使用缺少E1区的复制缺陷型腺病毒。同时，使E3区从常用的腺病毒载体上缺失，并且该区提供插入外源基因的位点(Thimmappaya,B.etal.,Cell,31:543-551(1982)；和Riordan,J.R.et al.,Science,245:1066-1073(1989))。因此，本发明的CCN5蛋白基因优选插入至缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，优选E1B区)或E3区，更优选插入至缺失的E3区。同时，要在胞内递送的靶核苷酸序列插入至缺失的E1区(E1A区和/或E1B区，优选E1B区)或E3区，优选插入至E3区。另外，其也可以通过双顺反子表达系统来表达，其中通过内部核糖体进入位点(IRES)连接“启动子-靶核苷酸序列-多聚腺苷酸序列-IRES-CCN5蛋白基因”。

另外，由于腺病毒可以包装最高达野生型基因组的约105％，所以可以额外包装约2kb(Ghosh-Choudhury et al.,EMBO J.,6:1733-1739(1987))。因此，插入至腺病毒的上述外源序列可以进一步连接于腺病毒基因组。

腺病毒具有42种不同的血清型和A至F亚型。其中，属于C亚型的5型腺病毒是用于获得本发明的腺病毒载体的最优选的起始材料。5型腺病毒的生化信息和基因信息是本领域熟知的。

通过腺病毒递送的外源基因以与附加体相同的方式复制，并且对宿主细胞的遗传毒性非常低。因此，判断使用本发明的腺病毒基因递送系统的基因治疗是非常安全的。

逆转录病毒

因为逆转录病毒可以将其自身的基因插入宿主的基因组，携带大量外来遗传物质，并具有广泛的可感染细胞谱，所以使用逆转录病毒作为基因转移载体。

要构建逆转录病毒载体，将CCN5蛋白基因和要转移的靶核苷酸序列取代逆转录病毒序列而插入至逆转录病毒基因组，以产生复制缺陷型病毒。构建包含gag、pol和env基因而不含长末端重复序列(LTR)和ψ序列的包装细胞系，以便产生病毒粒(Mann et al.,Cell,33:153-159(1983))。当将包含CCN5蛋白基因、要递送的靶核苷酸序列、LTR和ψ序列的重组质粒递送至细胞系时，ψ序列使得产生重组质粒的RNA转录组，转录组被包装在病毒中，而病毒被释放到培养基中(Nicholas and Rubinstein"Retroviral vectors",In:Vector:Asurvey of molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez and Denhardt(eds.),Stoneham L Butterworth,494-513(1988))。将含有重组逆转录病毒的培养基收集、浓缩，并用作基因递送系统。

已报道了使用第二代逆转录病毒载体的基因转移。Kasahara等人(Science,266:1373-1376(1994))产生了莫伦尼鼠白血病病毒(Mohrluny murine leukemia virus)的变体，其中将红细胞生成素序列插入在包膜位点来产生嵌合蛋白。基于这样的第二代逆转录病毒构建策略，可以产生本发明的基因递送系统。

AAV载体

腺相关病毒(AAV)适用于本发明的基因递送系统，因为腺相关病毒可以感染非分裂细胞，并且具有感染各种类型的细胞的能力。美国专利第5,139,941号和第4,797,368号详细地公开了AAV载体的制备和使用的详细描述。

文献[LaFace,et al.,Viology,162:483-486(1988)],[Zhou,et al.,Exp.Hematol.(NY),21:928-933(1993)],[Walsh,et al.,J.Clin.Invest.,94:1440-1448(1994)]和[Flotte,et al.,Gene Therapy,2:29-37(1995)]中描述了对AAV作为基因递送系统的研究。最近对AAV载体作为对心力衰竭的治疗进行了临床2期试验。

典型地，AAV病毒由包含两个AAV末端重复序列并排排列的靶基因序列(CCN5蛋白基因和要递送的靶核苷酸序列)的质粒(McLaughlin,et al.,J.Virol.和Samulski,etal.,J.Virol.,63:3822-3828(1989))和包含不含末端重复序列的野生型AAV编码序列的表达质粒(McCarty,et al.J.Virol.,65:2936-2945(1991))共转染而制备。

AAV病毒具有九种不同的血清型(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9)。其中，AAV1、AAV6、AAV8或AAV9是用于获得本发明的腺相关病毒载体的最优选的起始材料。

其它病毒载体

其它病毒载体可以用作本发明的基因递送系统。痘苗病毒(Puhlmann M,et al.,Human gene therapy 10:649-657(1999)；Ridgeway,"Mammalian expression vectors,"In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses.Rodriguez andDenhardt,eds.Stoneham:Butterworth,467-492(1988)；Baichwal and Sugden,"Vectorsfor gene transfer derived from animal DNA viruses:Transient and stableexpression of transferred genes,"In:Kucherlapati R,ed.Gene transfer.New York:Plenum Press,117-148(1986)以及Coupar,et al.,Gene,68:1-10(1988))、来自慢病毒的载体(Wang G.,et al.,J.Clin.Invest.104(11):R55-62(1999))或来自单纯疱疹病毒的载体(Chamber R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA92:1411-1415(1995))也可以用作能够携带CCN5蛋白基因和要递送至细胞的感兴趣的核苷酸序列的递送系统。

脂质体

脂质体由分散在水中的磷脂自动生成。文献[Nicolau and Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)]以及[Nicolau,et al.,Methods Enzymol.,149:157-176(1987)]中描述了将外源DNA分子成功递送至脂质体的实例。同时，阳离子脂质体(Lipofectamine)(Gibco BRL)是在使用脂质体转化动物细胞中最广泛使用的试剂。包封CCN5蛋白基因和要递送的靶核苷酸序列的脂质体与细胞相互作用，并经由诸如内吞作用、对细胞表面吸附、与细胞质膜融合等机制递送CCN5蛋白基因和要递送的靶核苷酸序列。

在本发明中，当基于病毒载体制备基因载体时，根据本领域已知的病毒感染方法来进行注射本发明的药物组合物的方法。在上述参考文献中描述了使用病毒载体对宿主细胞的感染。

在本发明中，当基因递送系统是裸重组DNA分子或质粒时，微注射法(参见[Capecchi,M.R.,Cell,22:479(1980)]和[Harland and Weintraub,J.Cell Biol.101:1094-1099(1985)])、硫酸钙沉淀法(参见[Graham,F.L.,et al.,Virology,52:456(1973)]和[Chen and Okayama,Mol.Cell.Biolo.7:2745-2752(1987)])、电穿孔法(参见[Neumann,E.,et al.,EMBO J.,1:841(1982)]和[Tur-Kaspa,et al.,Mol.Cell.Biol.,6:716-718(1986)])、脂质体介导转染法(参见[Wong,T.K.,et al.,Gene,10:87(1980)]、[Nicolauand Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)]和[Nicolau,et al.,MethodsEnzymol.,149:157-176(1987)])、DEAE-葡聚糖处理法(参见[Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190(1985)])和基因轰击法(参见[Yang,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:9568-9572(1990)])可以用于将基因插入至细胞。

美国专利公开号第2013/0287739号中详细地公开了可以用于本发明的基因载体的详细描述，并且该详细描述作为参考插入到本发明的说明书中。

根据本发明的一种实施方式，本发明的基因载体选自质粒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、脂质体和囊泡。根据本发明的另一种实施方式，本发明的基因载体是腺相关病毒，根据本发明的又另一种实施方式，本发明的腺相关病毒选自1、6、8、9型腺相关病毒。根据本发明的特别的实施方式，本发明的基因载体是9型腺相关病毒。

根据本发明，本发明的药物组合物诱导肌成纤维细胞特异性凋亡并抑制成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，并因而对伴随心脏纤维化的收缩性心力衰竭或伴随有心脏纤维化的舒张性心力衰竭具有治疗作用。

如以下实施例所示，为了可逆地治疗心脏纤维化以防止或治疗收缩性和舒张性心脏功能下降，本发明的药物组合物在压力超负荷模型中通过AAV9-CCN5的基因治疗在患病心脏中表达CCN5，所述压力超负荷模型是收缩性心力衰竭模型、肌肉退化性舒张性心脏病模型，以及一种舒张性主动脉结扎-缺血-再灌注-去结扎(Aortic banding-Ischemia-reperfusion-Debanding,AID)模型。另外，由于本发明的药物组合物还使SERCA2a蛋白增加，所述SERCA2a蛋白通过增加心脏收缩力来负责血液循环的泵血功能，也可以预计到对HFrEF的直接治疗作用，因此，从而在HFrEF和HFpEF症状共存时也可以预计到治疗作用。

根据本发明的一种实施方式，伴随有心脏纤维化的心脏病包括肥厚性心肌病，由慢性代谢疾病引起的心脏病，心脏瓣膜病，炎症性心脏病，结构性心脏病，由传染性病原体感染引起的心脏病，先天性心脏病，由遗传性异常引起的心脏病，由吸烟、饮酒或暴露于有毒药物(例如抗癌药物)引起的心脏病以及由衰老引起的心脏病。

根据本发明的另一种实施方式，本发明的心脏纤维化疾病是选自以下的心脏病：肥厚性心肌病；由慢性代谢疾病(例如高血压、慢性肾病、糖尿病和肥胖症)引起的心脏病；心脏瓣膜病；炎症性心脏病，例如结节病、自身免疫性心肌炎、心脏移植排斥反应等；炎症性心脏病，例如冠状动脉功能障碍、主动脉瓣狭窄、非缺血性扩张型心肌病等；由传染性病原体感染引起的心脏病，例如南美锥虫病和病毒性心肌炎等；先天性心脏病，例如紫绀型心脏病、法洛四联症、大动脉转位、单心室等；由遗传性异常(例如杜氏肌营养不良、贝克肌营养不良、法布里病等)引起的心脏病；由吸烟、饮酒或暴露于有毒药物引起的心脏病；以及由衰老引起的心脏病。

本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。本发明的药物组合物中包含的药学上可接受的载体是通常用于制剂的载体，其实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等，但本发明不限于此。除了上述成分以外，本发明的药物组合物还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)(19th ed.,1995)中详细地描述了适合的药学上可接受的载体和制剂。考虑患者的年龄、性别和状况、活体成分在体内的吸收程度、失活率以及与患者当前正在使用的药物组合使用的药物，理想地确定本发明的药物组合物的注射量，基于编码CCN5蛋白基因的核苷酸，可以以0.0001mg/kg(体重)至100mg/kg(体重)的剂量注射。

本发明的药物组合物可以口服给药或胃肠外给药，胃肠外给药包括静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹腔内注射、经皮注射、直接注射至组织内等。

尽管药物组合物的剂型可以根据使用方法而不同，但也可以制备成硬膏剂、颗粒剂、粉剂、糖浆剂、溶液剂、流浸膏剂I、乳剂、混悬剂、浸剂、片剂、注射剂、胶囊剂和丸剂等。

通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂，根据本发明所属技术领域普通技术人员可以容易地进行的方法，可以配制本发明的药物组合物，所述药物组合物可以通过以单位体积形式或在多体积容器中灌注来制备，并且可以进一步包含分散剂或稳定剂。

本发明的药物组合物中所使用的活性成分不仅是包含上述CCN5蛋白或编码CCN5蛋白的核苷酸序列的基因载体本身，而且是药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。

如本文使用的，术语“药学上可接受的盐”是指具有期望的药理作用的本发明的活性成分的盐，所述期望的药理作用即抑制成纤维细胞的分化并具有选择性杀伤成纤维细胞的活性。这些盐通过使用无机酸盐和有机酸盐来形成，所述无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐，所述有机酸盐例如醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、硫酸氢盐、氨基磺酸盐、硫酸盐、萘酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、2-羟基乙烷硫酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。如本文使用的，术语“药学上可接受的水合物”是指具有期望的药理作用的CCN5的水合物。如本文使用的，术语“药学上可接受的溶剂化物”是指具有期望的药理作用的本发明的活性成分的溶剂化物。使用上述酸也可以制备上述水合物和溶剂化物。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了筛选用于治疗心脏纤维化或伴随有心脏纤维化的心脏病的药物组合物的方法，包括以下步骤：(a)用测试物质处理包含CCN5蛋白或CCN5基因的细胞；(b)分析CCN5蛋白或CCN5基因的表达。

根据本发明的方法，首先，使待分析的样品与包含CCN5蛋白或CCN5基因的细胞接触。根据本发明的一种实施方式，包含CCN5蛋白或CCN5基因的细胞是来自心脏的细胞。在参照本发明的筛选方法时使用的术语“测试物质”是指用于筛选以检查其是否影响CCN5蛋白基因的表达水平或CCN5蛋白的量的未知物质。测试物质包括但不限于化学物质、核苷酸、反义RNA、siRNA(小干扰RNA)和天然产物提取物。

随后，在用测试物质处理的细胞中检测CCN5基因的表达水平或CCN5蛋白的量。测量的结果是，当确定CCN5基因的表达水平或CCN5蛋白的量被上调时，可以将测试物质指定为心脏纤维化的治疗剂；或伴随有心脏纤维化的心脏病的治疗剂。

可以通过各种本领域已知的方法对CCN5基因的表达水平的变化进行检测。例如，RT-PCR(Sambrook,et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,3rd ed.ColdSpring Harbor Press(2001))、Northern印迹(Peter B.Kaufman,et al.,Molecular andCellular Methods in Biology and Medicine,102-108,CRC Press)、使用cDNA微阵列的杂交反应(Sambrook,et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,3^rd ed.ColdSpring Harbor Press(2001))或原位杂交反应(Sambrook,et al.,Molecular Cloning.ALaboratory Manual,3^rd ed.Cold Spring Harbor Press(2001))等。

当基于RT-PCR方案进行时，首先，将总RNA从用测试物质处理的细胞中分离，然后使用寡聚dT引物和逆转录酶来制备第一链cDNA。随后，使用CCN5蛋白基因特异性的引物集以第一链cDNA作为模板进行PCR反应。然后，将PCR扩增产物进行电泳，分析形成的条带以检测CCN5蛋白基因的表达水平的变化。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了通过将药物组合物施用于对象来治疗心脏纤维化或伴随有心脏纤维化的心脏病的方法，所述药物组合物包含以下物质作为活性成分：(a)CCN5蛋白；或(b)基因载体，该基因载体包含编码CCN5蛋白的核苷酸序列。

本发明的治疗方法是使用本发明的上述药物组合物的方法，并且省略了与本发明的上述药物组合物相关的内容的描述以避免过于复杂。

本发明的有益效果

本发明的特征和优势概括如下：

(A)本发明提供了用于治疗心脏纤维化或伴随有心脏纤维化的心脏病的药物组合物。

(B)由于本发明的药物组合物具有通过选择性杀死心脏纤维化中的肌成纤维细胞来溶解纤维化基质并将其恢复至正常组织的作用，所述药物组合物可以有效地用作治疗目前被认为疾病进展不可逆且尚未开发出针对性治疗药物的心脏纤维化和伴随有心脏纤维化的心脏病的药物组合物。

附图说明

图1是用抗CCN5和抗GAPDH抗体确定来自(A)人和(B)小鼠的心力衰竭心脏组织中CCN5蛋白的表达水平的变化的结果(**P<0.01)。

图2示出了将AAV9-CCN5注射入实验大鼠的尾静脉后4周时，心脏组织中CCN5蛋白的表达量(n＝6,*P<0.05)。

图3a至图3e示出了压力超负荷模型实验大鼠中AAV9-CCN5对已存在的心脏纤维化的可逆治疗作用和心脏功能保护作用。图3a示出了用于确定可逆治疗效果的、压力超负荷模型诱导和AAV-CCN5基因治疗注射的实验时间表。图3b的上部使用马松三色染色法示出了心脏组织纤维化的程度。上部是间质组织纤维化，下部是血管周围组织纤维化，每个组织中纤维化的百分比通过点来表示。图3c是借助抗α-SMA(肌成纤维细胞靶蛋白)使用荧光染色对心脏组织的横截面进行染色的结果。左部代表性图片示出了间质组织，右部代表性图片示出了血管周围组织。下部是示出了α-SMA表达细胞的程度的图。图3d是通过流式细胞术测量的结果(FACS,n＝3,*P<0.05,**P<0.01)。图3e测量了缩短分数(FS)和心脏的左心室收缩期内径(LVIDs)，以及左心室舒张期内径(LVIDd)(n＝16,*P<0.05)。

图4a至4c示出了AAV9-CCN5和CCN5蛋白在体内和在细胞水平上诱导肌成纤维细胞的凋亡。图4a示出了压力超负荷大鼠模型的实验时间表，图4b示出了同时用TUNEL染色(红色)和用作为成纤维细胞的特异性蛋白的抗α-SMA抗体染色(绿色)的心脏组织切片的染色结果。图4c还定量地示出了图4b中每个实验组的肌成纤维细胞的凋亡程度(n＝3,**P<0.01)。

图4d至4f示出了在对照细胞培养基和含有CCN5蛋白的细胞培养基中培养心肌细胞(Myo)、成纤维细胞(FB)和肌成纤维细胞(MyoFB)48小时后的实验结果。图4d是用DAPI染色的结果，其中箭头是指固缩核，右图示出了图像中固缩核的数量。图4e是在相同条件下用TUNEL染色对培养的细胞染色的结果，其中箭头是指显示TUNEL的细胞核，右图是图像中所示的显示TUNEL的细胞核的数量(n＝3,**P<0.01)。图4f示出了在对照培养基(CM-Con)和包含CCN5蛋白的培养基(CM-CCN5)中培养成纤维细胞和肌成纤维细胞48小时后用荧光活化细胞分选术(FACS)分析的结果(n＝3,**P<0.01)。

图5a至5e示出了通过CCN5蛋白使肌成纤维细胞选择性凋亡的机制(n＝3,**P<0.01)。图5a是将成纤维细胞和肌成纤维细胞放置在对照培养基(CM-Con)或包含CCN5蛋白的培养基(CM-CCN5)中，并将其培养1天或2天，然后从细胞分离蛋白，并进行蛋白免疫印迹的结果。图5b是在上述细胞中使用抗细胞色素C抗体进行免疫化学法的结果。图5c是在上述细胞中使用NF-κB、波形蛋白和抗α-SMA抗体的蛋白免疫印迹的结果。另外，图5d至5e是在成纤维细胞和肌成纤维细胞中NF-κB报告蛋白分析和用抗NF-κB抗体进行荧光染色的结果。

图6示出了(A)过表达CCN5蛋白的细胞的制备和(B)该CCN5蛋白向条件培养基液体的分泌和其活性。

图7示出了大鼠的心脏组织中的心肌细胞和成纤维细胞的分离，用TGF-β处理分离的成纤维细胞后所得的肌成纤维细胞的分化诱导，以及CCN5蛋白质对分化的影响。

图8示出了在对照组和压力超负荷模型大鼠中AAV9-CCN5对TGF-β信号转导的作用(n＝3,**P<0.01)。

图9a至9c示出了体内和细胞水平上AAV9-CCN5和CCN5蛋白对血管内皮细胞通过TGF-β的活性转分化为成纤维细胞(内皮细胞向间充质细胞转化，EndoMT)并进展为肌成纤维细胞的结果的作用。图9a示出了Scl-Cre-ERT；R26RstopYFP双转基因小鼠模型的AAV-CCN5基因注射和假手术/主动脉交叉缩窄手术的时间表。图9b至9c是在手术后8周对小鼠模型的心脏组织进行取样的免疫化学法的结果(n＝3,*P<0.05,**P<0.01)。图9d是在人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)中处理TGF-β，并在对照培养基和含有CCN5蛋白的培养基中培养48小时，然后用抗VE-钙粘蛋白和抗波形蛋白抗体进行免疫化学染色的结果。图9e示出了将培养的人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)刮划同样面积，在与图9d相同的培养基条件下培养它们，固定细胞并用DAPI染色，并测量细胞迁移率的结果(n＝4,*P<0.05,**P<0.01)，图9f是通过qRT-PCR测量α-SMA、胶原蛋白I、胶原蛋白III、Tie2和CD31的mRNA表达水平的结果(n＝6,*P<0.05,**P<0.01)。

图10a至10f示出了在体内和细胞水平上AAV9-CCN5和CCN5蛋白对成纤维细胞通过TGF-β的活性转分化为肌成纤维细胞的作用。图10a示出了8周龄小鼠模型的AAV-CCN5基因注射和假手术/主动脉交叉缩窄手术的时间表。图10b是通过对手术后8周的小鼠模型的心脏组织采样进行免疫化学的结果。图10c是示出了在表达波形蛋白的细胞中同时表达α-SMA的细胞的图像(n＝3,P<0.05,**P<0.01)。图10d是用TGF-β处理成纤维细胞，在含有CCN5蛋白的培养基中培养48小时，并通过进行DAPI和免疫化学法用抗α-SMA抗体染色的结果，图10e是使用胶原蛋白凝胶收缩法证实CCN5通过TGF-β对成纤维细胞的分化进行抑制的结果(n＝3,P<0.05,**P<0.01)，图10f是通过定量qRT-PCR测量α-SMA和胶原蛋白I的mRNA表达水平的程度的结果(n＝6,P<0.05,**P<0.01)。

图11示出了肌肉萎缩性营养不良(杜氏肌营养不良，DMD)模型小鼠中AAV9-CCN5对抗心脏纤维化的可逆治疗作用和心脏功能保护作用。图11A示出了诱导衰老肌肉萎缩性营养不良模型小鼠和AAV9-CCN5基因治疗注射以证实所述可逆治疗作用的实验时间表。图11B和图11C示出了使用马松三色染色证实的心脏组织纤维化程度。每个实验组中纤维化的范围以百分比条形图表示(n＝3至4，p<0.001)。

图12示出了肌肉萎缩性营养不良(DMD)模型小鼠中AAV9-CCN5的改善心脏功能的检测结果。图12A示出了检测心室缩短比的结果(n＝3至7,p<0.005)。图12B示出了用平均收缩末期压-容积关系(ESPVR)检测心脏的血液动力学功能的结果(N＝6至7,p<0.05)。

图13是通过免疫蛋白印迹证实肌肉萎缩性营养不良(DMD)模型小鼠中AAV9-CCN5改变纤维化相关蛋白的表达的结果。

图14是通过qRT-PCR方法证实肌肉萎缩性营养不良(DMD)模型小鼠中AAV9-CCN5改变纤维化相关基因的表达的结果。

图15示出了在主动脉结扎-缺血-再灌注-去结扎(AID)心力衰竭大鼠模型中AAV9-CCN5对可逆性治疗已存在的心脏纤维化和对心肌收缩性的作用。图15A示出了AID大鼠模型诱导和AAV-CCN5基因治疗注射以确认可逆治疗效果的实验时间表。图15B的上部使用马松三色染色法示出了间质细胞的心脏纤维化程度。下部示出了血管的周围区域中心脏纤维化的程度。图15C示出了心脏切片中发生心脏纤维化的相对面积(n＝5至8,p<0.05,B和C)。

图16示出了AID大鼠模型中AAV9-CCN5的改善心脏功能的检测结果。图16A示出了通过心脏超声分析获得的心室的缩短率(n＝5至8，**P<0.01)。图16B用压力-容积循环分析结果示出了AID大鼠模型中AAV9-CCN5对心脏功能的作用。图16C示出了收缩末期压力-容积关系(ESPVR)和舒张末期压力-容积关系(EDPVR)的值，这是AAV 9-CCN5的血液动力学分析的代表性结果(N＝6，p<0.05，B和C)。它通过血液动力学和压力-容积循环分析结果，显示了在AID大鼠模型中AAV9-CCN5对心脏功能的影响。ESPVR的值表示心脏的收缩功能，而舒张末期压力-容积关系(EDPVR)的值表示心脏的舒张功能。

具体实施方式

在下文中，通过实施例详细地解释本发明。以下实施例旨在进一步说明本发明而不限制其范围，并且对本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的范围不受实施例的限制。

实施例

所有动物实验均基于光州理工学院(GIST)动物保护与利用委员会和西奈山医学院的批准和监管而进行。实验分析符合NIH关于动物保护和使用的指导原则。

实验方法

通过横向主动脉缩窄(TAC)构建压力超负荷的动物模型(心力衰竭模型)

使用来自杰克逊实验室的8至10周龄C57BL/6雄性小鼠(体重25至30g)进行研究。使用由95mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪制成的溶液通过腹膜内注射麻醉小鼠。使用氧气呼吸器(Harvard Apparatus)以0.2的日呼吸量和每分钟11次呼吸的呼吸速率使小鼠呼吸。为了观察主动脉弓，将近端胸骨周围的区域纵向切入2至3mm。将27号针刺于无名动脉和左颈总动脉之间，沿横向结扎主动脉弓。立即取出针，并将切口部位覆盖。

遗传性DMD动物的心力衰竭

从杰克逊实验室(Bar Harbor,ME)购买C57BL/10ScSn(Dmd^mdx/Utrn^tm1Jrs)。使用9月龄或更大的雄性MDX/UTRN(+/-)小鼠进行实验，以可靠地诱导肌肉萎缩性营养不良心脏病。雄性小鼠是显示杜氏肌营养不良的临床相关性的模型，杜氏肌营养不良是与人类X染色体相关的先天性遗传疾病。

构建压力超负荷和缺血再灌注的复杂心力衰竭模型(AID模型)

使用在大鼠中同时出现压力超负荷和缺血再灌注的复杂心力衰竭模型。使用体重为180至200g的斯普拉格-杜勒大鼠(Sprague-Dawley rats)。用胸廓切开术使第二肋间打开，通过4-0缝线如外径为0.965mm的PE-50管包围升主动脉，然后拔出PE-50管。这个过程被用来对心脏施加压力超负荷。两个月后，将左前降支冠状动脉打结30分钟并再灌注。具体地，在左心室末端下方4mm处将血管用6-0缝线完全结扎并在30分钟后释放。进一步地，一个月后，完全释放结扎升主动脉的缝线。该复杂的心力衰竭模型被称为主动脉结扎-缺血-再灌注-去结扎(AID)，其要用4个月来构建。

心脏功能分析-经胸超声心动图和体内血液动力学

通过腹膜内注射浓度为100μg/g的氯胺酮来对模型小鼠实验动物进行麻醉。对于二维图像和M模式追踪，使用15.0MHz转换器(GE Vivid 7Vision)来确定心室收缩率和尺寸，以报告左心室乳头状肌的缩短。在经支气管切开术插入管后，通过异氟烷麻醉大鼠。通过进行胸部切开术，使用7个超声显微镜晶体(Sonometrics,London,Ontario,Canada)在左心室外膜通过打结连接。通过左心室的前壁插入Millar SP-671压力转换器。使用市售软件SonoLab收集数据，并且在暂时关闭下腔静脉和主动脉之后，在一系列前负荷和后负荷压力下进行血液动力学测量。使用由MATLAB(v 7.0,The MathWorks,Natick,MA)生成的一系列算法分析心脏功能数据。在整个实验期间由相同的实验者进行心脏造影实验以增加实验的准确性。需要550bpm的最低心率来提高实验的准确性，而这是为了包括使与心动过缓相关的心脏功能低估减少到最小的结构和功能评估。对每只小鼠进行三次测量，计算平均数，并将其表示为数值。使用1.2Fr压力-容积(PV)电导导管(Scisense,Ontario,Canada)进行体内血液动力学分析。通过腹膜内注射氨基甲酸乙酯(1mg/g)、依托咪酯(10μg/g)和吗啡(1μg/g)的复合溶液将小鼠麻醉，并通过经支气管切口插入管，使用机械通气来设定每分钟125次的呼吸和7μl/g的呼吸量。通过穿刺方法将PV导管定位在左心室内部，并且使用IOX2软件(EMKA technologies)分析PV数据。为了使血液动力学参数标准化，特别地，通过经插入至右颈动脉内的中心静脉导管以10分钟的间隔以1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml和1mg/ml的增加的浓度注射多巴酚丁胺盐水溶液，以此测量心脏压力挑战(cardiac stress challenge)。

腺相关病毒载体(AAV)的构建和注射

将人CCN5基因克隆至pds-AAV2-EGFP载体，以构建自身互补的AAV(9型)。制备用于AAV载体构建的eGFP序列，以防止病毒包装的抑制。使用293T细胞构建重组AAV。收集细胞培养物溶液中的AAV颗粒，并用硫酸铵使其沉淀，然后使用碘克沙醇梯度经超速离心纯化。离心后，通过用乳酸林格氏溶液代替碘克沙醇，经多次稀释和浓缩过程，浓缩AAV颗粒。使用定量RT-PCR和SDS-PAGE将AAV浓度定量。以5×10¹⁰至1×10¹¹个病毒基因组将AAV-VLP和AAV-CCN5注射至模型小鼠和大鼠的尾静脉内。

重组活性CCN5的表达

使用pcDNA3.1-CCN5HA质粒，以产生CCN5蛋白。将HEK293细胞以5×10⁵个铺布在60mm Petri皿上以使细胞稳定1天。然后，使用脂质体感染pcDNA3.1-CCN5HA。4小时后，为了移除脂质体，用已移除血浆的条件培养基(CM)将其替换。然后，培养24小时后获得的分泌的CCN5被命名为CM-CCN5以用于实验。通过蛋白免疫印迹来证实CCN5蛋白的表达，并用CCN5标记的抗HA抗体来证实CCN5蛋白的表达。

固有成纤维细胞的分离

使用异氟烷对8周龄雄性大鼠(Damul Science)进行呼吸麻醉，移除其心脏。将主动脉插管插入主动脉后，将大鼠快速悬挂在朗根多夫仪器上，并除去附着在心脏上的不需要的组织。使用恒速灌注，用100％O₂饱和的37℃生理液体(泰洛依德缓冲液(Tyroidbuffer)；组成：125mM/L NaCl、5mM/L KCl、12.5mM/L HEPES、11mM/L葡萄糖、10mM/L BDM、5牛磺酸、2.4MgCl₂)进行灌注。使用生理液体，在充分移除血液后，用100％饱和的37℃酶溶液(300μg/mL胶原蛋白酶II、80μg/mL透明质酸)灌注50分钟以使心脏组织分解。通过该过程，在心脏组织分解后，进行数次移液器吹打(pipetting)，然后经70μm的细胞过滤器将未完全分解的组织和单个细胞分离。心肌细胞和组成心脏的其它细胞(成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞)的最大差异是细胞的大小。利用该特性，将经过过滤的细胞溶液以25g离心3分钟，以分离心肌细胞。将上清移除并以250g离心10分钟以分离成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞。将由此获得的细胞在含有DMEM的培养基(低葡萄糖/10％FBS/1％抗生素)中混合，在培养皿上铺布，并在5％CO₂培养箱中、在37℃下温育4小时。成纤维细胞具有在短时间内附着于培养皿的稳定化特性，这是不同于其他细胞的。因此，4小时后更换培养基，除了成纤维细胞之外的其他细胞(它们是通过粘附于培养皿而稳定的细胞)被除去。在更换培养基后的第二天，培养成纤维细胞，同时每两天更换培养基(Skrzypiec-Spring,etal.J.Pharmacol.Toxicol.Methods 55:113-126(2007))。

成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化诱导

用10ng/mL TGF-β处理分离自大鼠心脏的固有成纤维细胞，并在5％CO₂培养箱中、在37℃下培养2天。为了证实分化为肌成纤维细胞，使用免疫化学法证实作为标记物蛋白的α-SMA(Kovacic J.C.,et al.Circulation,Apr 10；125(14):1795-1808(2012))。

CCN5的成纤维细胞、内皮细胞的肌成纤维细胞向间充质细胞的转分化的免疫荧光染色

将成纤维细胞和内皮细胞(人冠状动脉内皮细胞，HCAEC)接种在16mm盖玻片上，培养过夜以稳定化，然后用10ng/mL TGF-β和CCN5处理，并培养48小时。用4％多聚甲醛溶液固定后，用0.5％Triton X-100溶液进行细胞膜透化，然后用5％BSA溶液封闭。将抗VE钙粘蛋白(Cell Signaling Technology)、抗波形蛋白(Santa Cruz)或抗α-SMA(Sigma)抗体用于反应，将Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594(Invitrogen)用作二抗。使用DAPI将细胞核染色。使用荧光显微镜(Olympus)分析经受免疫化学的细胞(Okayama K.,etal.Hypertension 59:958-965(2012))。

胶原蛋白凝胶格分析

在胶原蛋白凝胶收缩测定中，将1×10⁶个细胞/mL的成纤维细胞和1.2mg/mL胶原蛋白溶液(Invitrogen)混合，添加1N NaOH(约20μL)以中和胶原蛋白溶液的pH。通过移液器吹打简单地混合后，将500μL每种胶原蛋白凝胶悬液置于24孔板并在5％CO₂培养箱中在37℃下聚合30分钟。胶原蛋白凝胶形成后，将对照组和单独含TGF-β的处理组或含CCN5的处理组在DMEM培养基中各自培养。48小时后，观察胶原蛋白凝胶收缩的程度并使用Image J软件进行分析(Dobaczewski M.,et al.Circ.Res.107:418-428(2010))。

血管内皮细胞向间充质细胞的分化诱导(内皮-间充质转化；EndMT)

使用人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)诱导EndMT。通过Lonza购买HCAEC，并使用EGM-2(Lonza)培养液将其培养在5％CO₂培养箱中。HCAEC是人源细胞，其在购买时为3次传代的细胞，使用5至7次传代的细胞进行实验。为了用HCAEC诱导EndMT，通过在培养期间的细胞密度、更换培养溶液等来维持良好的细胞状态是很重要的。将HCAEC铺布在培养皿上后，使其稳定约12小时，用10ng/mL TGF-β处理，并培养3天。当诱导EndMT时，不更换培养溶液，并且在3天后进行免疫细胞化学和定量PCR，以证实是否发生了HCAEC向间充质细胞的转分化。使用Tie 2和VE-钙粘蛋白(CD31)作为HCAEC的标记基因，使用波形蛋白、α-SMA、C型胶原蛋白I、胶原蛋白III和FSP-1作为间充质细胞的标记基因(Medici D.,et al.Biochem.J 437:515-520(2012))and(Zeisberg E.M.,et al.Nat Med.13:952-961(2007))。

测试管的细胞迁移分析

进行划痕分析来测量细胞迁移能力。将HCAEC置于12孔板上以使细胞稳定过夜。第二天，更换培养基，使用200μL枪头(tip)在细胞上造成划痕。用盐水溶液洗涤经刮划的细胞，然后用10ng/mL TGF-β处理过的CM-Con或CM-CCN5培养。48小时后，用DAPI染色，并通过荧光显微镜分析。使用MetaMorph软件分析细胞移动的距离(Widyantoro B,etal.Circulation 121:2407-2418(2010))。

NF-B报告基因分析

将大鼠成纤维细胞和肌成纤维细胞以3×10⁵个细胞/孔置于6孔板，并用NF-B报告质粒(pBIIx)、pRenilla和其他质粒(空pcDNA3载体和pcDNA-hCCN5)用阳离子脂质体2000(Invitrogen)转染。48小时后，用被动裂解缓冲液裂解细胞，并在4℃下以14,000rpm离心以移除细胞碎片。使用双荧光素酶报告物测定系统(Promega)测量荧光素酶活性。

细胞凋亡的TUNEL分析

在盖玻片上铺布培养的心肌细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞，并用DeadEnd荧光TUNEL试剂盒(Promega)染色。使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)证实了由于细胞凋亡导致DNA分段发生。使用Fluoview FV 1000球面聚焦显微镜来证实TUNEL荧光(OberhausS.M.Methods Mol Biol.218:85-96(2003))。

免疫组织化学

使用OCT化合物(Tissue-Tek)冻存小鼠心脏组织，然后将其切割成6μm厚的切片。将组织固定后，在-20℃下用丙酮-甲醇使组织反应20分钟形成可透膜。使用PBS将组织再水化并用5％BSA溶液封闭1小时。然后，在4℃下使用抗α-SMA、抗GFP和抗波形蛋白抗体进行反应12小时。用盐水溶液洗涤与一抗反应后的组织，并将该组织与连接了荧光Alexa546或Alexa488的二抗在室温下反应1小时。对于通过荧光免疫化学法检查过的心脏组织，使用Fluoview FV 1000共聚焦显微镜证实结果。

组织病理学染色(马松三色染色)

从模型动物获得心脏组织后，立刻将其在适当的切割温度下浸入购自FisherHealthcare(Pittsburgh,PA)的包埋溶液，然后新鲜冷冻并切成8μm厚的切片。马松三色(Abcam)染色后用光学显微镜观察切片样品以便确定纤维化的程度。

流式细胞术

用含有0.2％胎牛血浆(FBS)的生理盐水洗涤分离的成纤维细胞层，并将其用2.5％甲醛溶液固定。用0.5％Triton X-100溶液使细胞膜透化后，使用与FITC连接的抗α-SMA抗体(Abcam)进行反应。用0.2％FBS溶液洗涤培养的成纤维细胞和肌成纤维细胞，并用连接至PE的抗膜联蛋白抗体(eBioscience)与所述成纤维细胞和肌成纤维细胞反应。使用Guava easyCye HT(Millipore)分析染色的细胞(Saada J.I.,et al.J.Immunol.177:5968-79(2006))。

蛋白免疫印迹分析

对于细胞和组织的均质溶液，使用SDS-PAGE凝胶按大小分离蛋白，并将其转移至PVDF膜(Millipore)。根据基础实验方案进行蛋白表达的证实(Kawaki,et al.,2011)。将所制备的膜与抗CCN2、抗CCN5(Lifespan Biosciences)、抗SERCA2a(21st CenturyBiochemicals)、抗Smad4、抗p-Smad2、抗Smad2/3(Cell signaling)、抗Smad7(LifespanBiosciences)、抗LOX(Abcam)、抗α-辅肌动蛋白、抗α-SMA(Sigma)、抗vimentin、抗Bcl-2(Santa Cruz)和抗半胱天冬酶抗体试剂盒(Cell signaling)温育。

定量RT-PCR

使用QuantiTect SYRB Green实时PCR试剂盒(Qiagen Ltd.)进行实时PCR，并通过实时PCR分析转录水平。使用Trizol(gibco BRL)从心脏组织分离RNA，并将其合成为cDNA。多种定量实时PCR条件为37个循环：94℃持续10秒，57℃持续15秒，以及72℃持续5秒。实验中所使用的引物的信息如下表1所示。

【表1】

统计处理

数据以平均值±SD值表示。使用单因素ANOVA(Statview,V5.0,SAS)以学生t检验或邦弗朗尼事后检验来比较组平均值。P<0.05被认为是统计学显著的。

实验结果

A.横向主动脉缩窄(TAC)压力超负荷动物模型

心力衰竭的心肌组织中CCN5蛋白表达的降低

通过蛋白免疫印迹将获自心脏移植手术期间提供的心力衰竭患者的心脏组织的蛋白与正常人的心脏组织的蛋白进行比较，结果是，心力衰竭患者中CCN5蛋白的表达水平降低约24％(图1A)。由压力超负荷诱导的心力衰竭的小鼠模型中CCN5的表达降低了约90％(图1B)。该实验的结果是，人和小鼠中类似地显示了心力衰竭状态的心脏组织的CCN5的表达降低，这表明人和小鼠之间的临床相关性。将15μg CCN5蛋白提取物用于电泳并用抗CCN5和抗GAPDH抗体证实(**P<0.01)。

通过CCN5基因转移对心脏纤维化的可逆性恢复

将构建的AAV9-CCN5和对照病毒载体AAV9-VLP以两种浓度的AAV-CCN5注射至小鼠的尾静脉内，4周后通过蛋白免疫印迹确定有效浓度。通过证实注射的AAV-CCN5的心脏特异性表达，研究了心脏纤维化与肌成纤维细胞的病理活性的关系(n＝6,Error brs＝S.D.,*P<0.05,图2)。证实了在TAC诱导的压力超负荷心脏病模型中，心脏纤维化发生在TAC手术8周后。将AAV-CCN5和对照组AAV-VLP各自以5×10¹⁰个病毒基因组的浓度经心脏纤维化诱导的实验大鼠的尾静脉注射(n＝16，图3a)。CCN5基因转移超过8周后，取样心脏组织，经马松三色染色为心脏纤维化的程度定量以确认心脏纤维化的治疗作用。另外，分离每个实验组的心脏，使用朗根多夫匀速灌注系统分离成纤维细胞，通过流式细胞术测量表达α-SMA的细胞的程度。

结果是，在用CCN5注射的组中，间质组织和血管周围组织中已经发展的纤维化的程度减少到与假手术组(Sham)类似的程度，并且显示出类似于恢复到正常组织的程度的可逆治疗效果(图3b至3c)。另外，AAV9-CCN5注射组中，心脏纤维化状态下增加的肌成纤维细胞量减少了与假手术组相似的量(图3d)。这些结果说明CCN5具有治疗作用，该治疗作用显示了纤维化病症的分解和从具有进行性纤维化的心脏组织到正常组织结构的可逆性恢复。另外，证实了CCN5的心脏纤维化的可逆性治疗与通过CCN5使作为所有纤维化疾病发生和发展的病理执行细胞的成纤维细胞的增殖减少有关。

通过超声心动图检查检验心脏纤维化的治疗与心脏功能的保护作用之间的关系。与对照病毒感染组(AAV-VLP)相比，在CCN5治疗组(AAV-CCN5)中，防止了心脏的缩短分数(FS)减少，并且对心脏的左心室收缩期内径(LVIDs)和左心室舒张期内径(LVIDd)增加的抑制所表现出的抑制效果非常显著。因此，CCN5蛋白通过治疗已存在的心脏纤维化而发挥防止心力衰竭状态中的心脏功能退化的作用，显示了对收缩性心力衰竭的治疗作用(n＝16,误差棒＝S.D.*P<0.05，图3e)。

通过CCN5基因转移使成纤维细胞选择性凋亡

进行相关性分析以确定心脏纤维化的恢复是否由肌成纤维细胞凋亡所导致。在诱导压力超负荷小鼠模型的同时，注射AAV9-CCN5和AAV9-VLP，2周后，将心脏组织切片同时用TUNEL染色(红色)和抗α-SMA抗体(其为肌成纤维细胞特异性蛋白)(绿色)染色，并证实肌成纤维细胞的凋亡是否发生(图4b)。结果是，假手术组中几乎没有细胞响应于两种染色方法，而在疾病动物中用AAV9-VLP注射的对照组中为约9％，在AAV9-CCN5组中为约72％(n＝3)，在AAV9-CCN5注射的疾病模型组中存在明显更多的细胞(图4b和4c)。因此，心脏纤维化的恶化与肌成纤维细胞的增殖成正比，在心脏纤维化进展的动物模型中注射的AAV9-CCN5的可逆治疗效果是由肌成纤维细胞的凋亡引起的，并且证实了通过CCN5基因注射对纤维化的治疗效果与由于细胞凋亡导致的肌成纤维细胞的减少直接相关。

另外，证实了CCN5是否选择性地杀死肌成纤维细胞(图4d至4f)。实验中使用的心肌细胞和成纤维细胞获得自大鼠心脏，肌成纤维细胞通过用TGF-β处理成纤维细胞来诱导。在CM-Con或CM-CCN5培养基中培养大鼠心肌细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞，48小时后，利用借助DAPI的固缩核染色、用于检测细胞凋亡的TUNEL染色、以及借助抗膜联蛋白-V抗体(细胞凋亡的标记物)的染色进行染色，以执行流式细胞术(n＝3,误差棒＝S.D.,**P<0.01)。结果是，只有在CM-CCN5培养基中培养肌成纤维细胞的情况下，证实了固缩增加，显示TUNEL荧光的细胞核数量增加，并且膜联蛋白-V阳性的肌成纤维细胞的数量显著增加。这些结果显示了与动物实验相同的结果，其中CCN5选择性地仅在作为心脏纤维化的病理执行细胞的肌成纤维细胞中导致细胞凋亡。

通过综合两个结果，发现了CCN5可以诱导心脏纤维化疾病模型中肌成纤维细胞的凋亡，并且可以显示出不影响心肌细胞或成纤维细胞的选择性机制。

CCN5蛋白的选择性细胞凋亡(内源性凋亡途径)机制的研究

在TGF-β的条件下将CM-Con或CM-CCN5添加至从成纤维细胞分化的肌成纤维细胞，并培养1天或2天，然后从细胞分离蛋白并进行蛋白免疫印迹(图5a)。使用的抗体是抗Bcl2抗体、抗BAX抗体、抗半胱天冬酶3酶原抗体、抗切割半胱天冬酶3抗体、抗半胱天冬酶7酶原抗体、抗切割半胱天冬酶7抗体、抗半胱天冬酶8酶原抗体、抗切割半胱天冬酶8抗体、抗半胱天冬酶9酶原抗体、抗切割半胱天冬酶9抗体和抗GAPDH抗体，它们是与细胞凋亡相关的蛋白。证实了在CCN5蛋白处理组中，BCL-2(一种防止细胞凋亡的蛋白)的表达大大降低，同时促进细胞凋亡的BAX和半胱天冬酶3、7和9的表达随时间而增加。

另外，在与蛋白免疫印迹的细胞培养相同的条件下用CM-Con或CM-CCN5处理肌成纤维细胞2天，然后使用抗细胞色素C抗体进行免疫化学(图5b)。图5b中的箭头是指发生的细胞凋亡和细胞色素C离开线粒体进入细胞质，通过荧光免疫化学证实了通过CCN5蛋白处理使肌成纤维细胞凋亡。

此外，在与上述的蛋白免疫印迹和免疫化学相同的条件下，在成纤维细胞和诱导的肌成纤维细胞中使用抗NF-κB抗体、抗波形蛋白抗体和抗α-SMA抗体进行蛋白免疫印迹，结果是，证实了细胞核内提供对细胞凋亡的抗性的NF-κB的表达在肌成纤维细胞中特别高(图5c)。NF-κB报告物分析和使用抗NF-κB抗体的免疫染色的结果是，证实了在CCN5蛋白处理组中，NF-κB向细胞核内的迁移被完全抑制(图5d和5e)。这些结果证实了通过CCN5蛋白对肌成纤维细胞选择性细胞凋亡的诱导是由于NF-κB的核内迁移抑制机制导致的(n＝3,误差棒＝S.D.,**P<0.01)。

CM-CCN5的表达和活性的证实

为了在细胞中过度表达CCN5作为分泌蛋白，将HA标记的Ad-CCN5质粒注射至HEK293细胞内并培养24小时，然后从无血清细胞培养溶液获得分泌蛋白(图6A)。分离培养基和细胞，然后通过使用抗HA抗体，确定CCN5的表达和分泌量，并且通过作为细胞质靶向蛋白的抗GAPDH抗体，证实了分泌至培养基中的CCN5未与细胞质一起被污染。

进行以下实验来证实本发明中所使用的重组CCN5是否在功能上起作用。分离新生大鼠的心肌细胞，并将其在已经移除血浆的培养基中培养12小时，然后用100μM苯肾上腺素处理24小时。苯肾上腺素诱导心肌细胞肥大。用浓度为200ng/mL的CM-CCN5与苯肾上腺素同时处理后，在同时处理组中使用抗α-肌动蛋白抗体通过荧光免疫化学观察心肌细胞肥大是否被抑制。使用MetaMorph程序检测细胞表面(n＝50,误差棒＝S.D.,**P<0.01)。结果是，重组CCN5完全抑制苯肾上腺素诱导心肌细胞肥大，由此证实了本发明所使用的重组CCN5在功能上起作用(图6B)。

对分化为肌成纤维细胞(MyoFB)的证实

为了证实大鼠心肌细胞(Myo)、成纤维细胞(FB)和TGF-β分别存在的情况下分化而成的肌成纤维细胞(MyoFB)各自良好地分离和分化，进行蛋白免疫印迹，并且使用抗α-辅肌动蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗α-SMA抗体和抗GAPDH抗体来证实。即使在成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化之后，作为成纤维细胞的标记物蛋白的波形蛋白也没有消失。因此，通过证实由肌成纤维细胞表达波形蛋白和α-SMA两者，证实了肌成纤维细胞被分离和分化，从而改善了实验的可靠性(图7)。

在心脏中表达的CCN5对成纤维细胞的信号转导的抑制

在假手术或主动脉交叉缩窄手术(TAC)之后8周时，将AAV9-VLP或AAV9-CCN5(每只小鼠5×10¹⁰个病毒基因载体)注射至小鼠模型，再过8周后，在处死的模型的心脏中使用蛋白免疫印迹证实与成纤维细胞的信号转导相关的蛋白的表达(n＝3,图8A和8B)。使用50μg浓度的、获自心脏组织的蛋白，并用抗SERCA2a、抗CCN5、抗Smad4、抗p-Smad2、抗Smad7、抗CCN2、抗LOX和抗GAPDH抗体来证实该蛋白。结果是，在对照组中，与激活TGF-β信号转导相关的Smad2被磷酸化，而在CCN5注射组中p-Smad2的表达被抑制。另外，与抑制TGF-β信号转导相关的Smad7仅在CCN5组中表达。赖氨酰氧化酶(LOX)作为一种抑制纤维化进展的重要药物靶标，是一种使纤维化过程中分泌的胶原蛋白交联和聚合的酶，在治疗组织外部环境中起着重要作用。虽然它在对照组中增加，但是证实了它在CCN5注射组中明显减少。此外，由于负责引起心脏收缩力的血液循环泵血功能的SERCA2a蛋白增加的结果，可以预测对收缩期心脏功能具有改善作用。

使用相同的心脏组织提取RNA，合成cDNA，通过定量RT-PCR确定与纤维化的信号转导相关的mRNA的表达水平(图8B)。检测了TGF-β1、TGF-β2、CCN2、半乳糖凝集素3、胶原蛋白1A、胶原蛋白3A1和纤连蛋白的mRNA。使用定量RT-PCR分析心脏纤维化靶基因，结果是，证实了指导纤维化的信号转导的基因(例如TGF-β类、CCN2、半乳糖凝集素3等)和通过其转录机制增加的纤维化蛋白基因在对照组中增加，而在CCN5注射组中减少(n＝3,**P<0.01)。

CCN5对内皮细胞向肌成纤维细胞转分化的抑制

最近研究的结果发现，在心脏纤维化过程中增殖的成纤维细胞一部分是通过由内皮细胞(EndoMT)转分化形成的，并且促进了肌成纤维细胞的形成，使用Scl-Cre-ERT；R26RstopYFP双转基因小鼠模型证实CCN5是否抑制这样的转分化。

在Scl-Cre-ERT；R26Rstop YFP双转基因小鼠模型中，用他莫昔芬处理5天，4周后向小鼠注射AAV9-VLP或AAV9-CCN5(每只小鼠5×10¹⁰个病毒基因载体)，同时进行假手术或横向主动脉缩窄(TAC)手术(图9a)。TAC手术8周后，取样心脏组织，进行免疫化学(图9b和图9c)。用抗YFP(绿色)和抗波形蛋白(红色)抗体将心脏组织的横截面染色，检测同时表达他莫昔芬诱导的YFP和作为成纤维细胞的靶基因的波形蛋白的细胞。同时表达YFP和波形蛋白的细胞可以被认为是发生了由内皮细胞转化为中胚层细胞的细胞。结果是，证实了AAV-VLP注射组中存在约8.5％的同时表达YFP和波形蛋白的细胞，而AAV-CCN5注射组中仅有约1％的细胞同时表达YFP和波形蛋白。以上结果说明CCN5能够抑制作为纤维化的致病细胞的肌成纤维细胞从各种前体细胞转分化以及增殖。

另外，根据组织和器官的损伤部位，除了纤维细胞和周皮细胞以外，内皮细胞转分化为成纤维细胞并由于诸如TGF-β的纤维化诱导因子而最终分化为肌成纤维细胞。证实了CCN5是否抑制由TGF-β使内皮细胞转分化为中胚层细胞。为了诱导内皮细胞通过转分化成为中胚层细胞，用10ng/mL TGF-β2处理人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)72小时。在对照培养基(CM-Con)和含有200ng/mL CCN5(CM-CCN5)的培养基中培养细胞以观察结果。进行免疫化学，以便用抗VE-钙粘蛋白抗体和抗波形蛋白抗体染色，细胞核用DAPI染色。结果是，在用TGF-β处理人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)的情况下，作为肌成纤维细胞的标记物的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白均被表达，而在同时用CCN5处理的组中，表达则被抑制。

此外，当内皮细胞经历转分化时，产生与肌成纤维细胞相似的特性并具有向损伤部位迁移的能力，通过使用流式细胞术证实了CCN5是否抑制上述情形(图9e)。将HCAEC在培养皿上铺布并稳定，使用200μL移液器枪头造成划痕，然后在图9d所示的免疫化学的条件下培养细胞。48小时后，固定细胞并用DAPI染色，检测细胞迁移的程度。结果是，与对照组相比，用TGF-β处理的组中的细胞迁移能力增加，在同时用TGF-β和CCN5处理的组中细胞迁移没有发生。另外，通过在与图9d的免疫化学相同的条件下培养内皮细胞来提取RNA后，合成cDNA，进行定量RT-PCR来检测α-SMA、胶原蛋白I、胶原蛋白III、Tie2和CD31的mRNA表达的程度，以分析基因表达(图9f)。结果是，作为与TGF-β诱导成纤维细胞相关的基因的α-SMA、胶原蛋白I和胶原蛋白III在同时用CCN5处理的组中的表达，以及内皮细胞固有的Tie 2和CD31基因的表达，显示出与TGF-β未处理对照组相似(n＝6,误差棒＝S.D.,*P<0.05,**P<0.01)。因此，显示了CCN5抑制了内皮细胞向中胚层细胞的转分化机制以抑制纤维化。

CCN5对成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的抑制

进行以下实验以证实CCN5是否抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。用AAV9-VLP或AAV9-CCN5(每只小鼠5×10¹⁰个病毒载体)注射8周龄小鼠模型，同时进行假手术或横向主动脉缩窄(TAC)手术，8周后，用心脏组织进行免疫化学(图10a)。用抗波形蛋白抗体(红色)和抗α-SMA抗体(绿色)使心脏组织的横截面染色。同时表达波形蛋白和α-SMA的细胞可以是其中发生了向肌成纤维细胞的转化的细胞(图10b)。分析表达波形蛋白的细胞中同时表达α-SMA的细胞，并示于图像中(n＝3,误差棒＝S.D.,**P<0.01)。结果是，AAV9-VLP注射组中约17％的细胞同时表达α-SMA和波形蛋白，而AAV9-CCN5注射组中，约4％细胞同时表达α-SMA和波形蛋白。该结果显示，心脏中CCN5表达增加能够有效抑制导致纤维化的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞以及增殖的病理机制(n＝3,误差棒＝S.D.,**P<0.01,图10c)。

进行以下实验来证实重组CCN5蛋白还抑制成纤维细胞通过TGF-β分化为肌成纤维细胞。为了诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，用10ng/mL TGF-β处理48小时。在对照组培养基和200ng/mL CCN5培养基中分别培养细胞，并观察结果。用抗α-SMA抗体染色，以及用DAPI对细胞核进行染色以进行免疫化学。证实了在用CCN5同时处理的组中，提供了肌成纤维细胞的收缩力的α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达水平的增加被抑制(图10d)。

由于TGF-β增加了胶原蛋白凝胶的收缩力，使用胶原蛋白凝胶收缩测定，证实了CCN5抑制通过TGF-β分化为肌成纤维细胞(图10d)。使用成纤维细胞和胶原蛋白制作胶原蛋白格凝胶，在与图10d相关的实验相同的条件下培养，然后在48小时后检测胶原蛋白凝胶的大小。结果是，证实了在用CCN5处理的组中，由TGF-β引起的胶原蛋白凝胶的收缩力显著下降。

进行定量RT-PCR以测量α-SMA和胶原蛋白I的mRNA表达水平(图10f)。在与图10d相关的实验相同的条件下培养成纤维细胞以提取RNA，合成cDNA，进行定量RT-PCR以测量α-SMA和胶原蛋白I的mRNA表达程度。结果是，发现了作为TGF-β诱导的肌成纤维细胞的特异性转录机制的α-平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白1基因的表达在同时用CCN5处理的组中被抑制到与成纤维细胞相同的水平(n＝6,误差棒＝S.D.,*P<0.05,**P<0.01)。因此，证明了CCN5有效地抑制了通过TGF-β分化为并产生肌成纤维细胞。

B.遗传性杜氏肌营养不良心力衰竭模型(DMD模型)

AAV-CCN5在DMD模型中对心脏纤维化的治疗作用

根据图11A的时间表，检测AAV-CCN5在老年MDX/UTRN(+/-)小鼠(即杜氏肌营养不良模型动物)中的治疗作用。利用马松三色染色，通过对心肌的冷冻切割法来证实纤维化的程度(图11B)。检测心脏纤维化的范围的结果是，与AAV-VLP注射组(10.14％+/-5.11)相比，在AAV-CCN5注射组(3.39％+/-0.58)中纤维化的范围平均减少2.6倍(图11B)。注射AANV-CCN5的心脏中，间质性纤维化积累的抑制显示了结构重构的改善作用和使心肌组织分布正常化的治疗作用(n＝3至4,p<0.001)。

AAV-CCN5在DMD模型中对心脏功能的改善治疗

在注射AAV-VLP和AAV-CCN5 8周之后，进行超声心动图。测量心室缩短比的结果是，CCN5对心室缩短的治疗效果显示为，在正常假手术WT(+/-)组、AAV-VLP组和AAV-CCN5组中分别是58.70％±1.05(n＝3)、45.75％±1.29(n＝7)和53.88％±1.21(n＝6)(P<0.005,图12A)。另外，检测心脏的血液动力学功能的结果是，AAV-VLP注射组的平均收缩末期压力-容积关系(ESPVR)为3.54±2.49(n＝7)，而AAV-CCN5注射组的ESPVR为6.10±2.25(n＝6)。该结果证实了过表达的CCN5蛋白的治疗效果，其改善了心脏的收缩末期弹性和收缩力(p<0.05,图12B)。

AAV-CCN5对心脏纤维化相关基因的表达的抑制作用

在DMD模型动物中，对于注射了AAV-VLP和AAV-CCN5的正常小鼠和老年MDX/UTRN(+/-)小鼠，对以下物质进行蛋白免疫印迹：与心肌的收缩相关的SERCA2a；与纤维化相关的基因Col1A2、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、p-SMAD和α-SMA；以及CCN5蛋白。在注射AAV-CCN5的组中，对心脏收缩重要的SERCA2a蛋白的表达增加，而纤维化标记物蛋白Col1A2、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、p-SMAD和α-SMA减少(图13)。使用qRT-PCR确定基因水平上的表达的结果是，证实了AAV-CCN5注射组中Col1A2和TGF-β1表达的降低，作为抗炎细胞因子的IL-10的表达增加(图14)。因此，在AAV-CCN5注射组中，通过蛋白和基因表达实验，发现过表达的CCN5蛋白在心脏纤维化治疗中是有效的。

C.主动脉结扎-缺血-再灌注-去结扎(AID)心力衰竭模型

CCN5基因转移对心脏纤维化的治疗作用

本发明中使用的舒张性心力衰竭模型是对大鼠通过主动脉结扎-缺血-再灌注-去结扎(AID)手术方法构建的模型。该模型比通常用于心力衰竭研究的压力超负荷模型更好地反映了心力衰竭患者的状态。也就是说，许多心力衰竭患者经常同时经历由于高血压等导致的压力超负荷以及由于心绞痛、心肌梗塞等导致的局部缺血。然而，尽管通过手术方法和药物治疗去除了压力负荷，并且实现了冠状动脉的灌注，但心脏的状况仍未改善，仍进展至心力衰竭(图15a)。本发明人从AID模型的心脏中发现了心脏纤维化进展严重，从而大大降低了心脏的舒张功能。另一方面，心脏收缩功能的下降没有大到具有统计学意义。因此，AID模型较好地代表了心力衰竭患者的情况，特别是具有舒张性心力衰竭的特征。在将AID心力衰竭大鼠模型分为对照组和治疗组之后，将AAV9-CCN5(每只鼠1×10¹¹个病毒基因组)注射至尾静脉内，并在两个月后分析。用马松三色对心脏切片染色，并在显微镜下观察。心脏纤维化中分泌的胶原蛋白通过马松三色染色染成蓝色。

结果是，证实了AID大鼠中间质和血管周围区域中有显著的心脏纤维化进展。然而，在用AAV-CCN5注射的大鼠中，心脏纤维化被治疗到与没有经过手术的大鼠相似的程度(n＝5至8,p<0.05,图15B和15C)。

使用血液动力学分析证实心脏的收缩和舒张功能

当使用AAV-CCN5的心肌细胞中CCN5过表达时，AID模型中通过超声心动图分析获得的缩短分数显示实验组之间没有显著差异，但是表现出接近于正常的功能(图16A)。在AID心力衰竭模型中通过血液动力学分析证实CCN5作用。在该分析中，收缩末期压力-容积关系(ESPVR)的值与心脏的收缩功能(收缩力)成正比，而EDPVR的值与心脏的舒张功能(顺应度)成反比。实验结果显示AID大鼠中AAV-CCN5注射组中ESPVR微微地降低，EDPVR显著提高(n＝6,p<0.05,图16B和C)。这意味着与正常大鼠相比，AID大鼠没有显著降低的收缩力，而是具有显著降低的舒张功能。在用AAV-CCN5注射的大鼠中没有观察到该舒张功能的降低。这些结果意味着在CCN5蛋白过表达的AID模型大鼠中可以使降低的心脏舒张功能得到恢复。

结果分析和进一步讨论

纤维化疾病是不可逆转疾病，存在着在疾病发生后才能被诊断出来的问题。迄今尚未开发任何成功的恢复性治疗剂。纤维化疾病的特征在于，无论何种组织和器官的类型，作为致病性执行细胞的成纤维细胞在疾病的发生和进展中起核心作用。肌成纤维细胞具有在正常创伤愈合过程中暂时被诱导并消失的细胞特征，但是在纤维化疾病状态下，它们通过获得防止细胞凋亡的机制而具有持续的增殖功能和活性。这样的肌成纤维细胞的持久活性是纤维化进展的疾病中常见的疾病途径。致病性肌成纤维细胞具有以下功能：使纤维化胞外基质过量产生和积累的分泌细胞的功能，使炎性免疫细胞流入和炎性物质自动分泌的炎性细胞的功能，以及由于与周围细胞的异常连接和周围分泌物质的分泌而使组织组成细胞的功能被破坏的信号转导细胞功能等。因此，肌成纤维细胞的持续增殖和活化不仅是导致组织重构的纤维化的原因，而且还通过炎性细胞的功能在促进反应性纤维化的过程中起作用。

通过本发明的研究，首先在疾病状态的体内水平和细胞水平揭示了CCN5蛋白导致作为心脏纤维化过程的中心细胞的肌成纤维细胞的选择性细胞凋亡。CCN5蛋白可以控制肌成纤维细胞的持续性病理活性并促进选择性细胞凋亡，从而提供一种用人体内的物质可逆地治疗已有的心脏纤维化的方法。特别地，用于治疗目的的调节肌成纤维细胞凋亡的药物的开发尚未成功，而CCN5蛋白对肌成纤维细胞的选择性细胞凋亡具有在正常组织伤口愈合过程的消退期中发生的人体模仿机制的特性。这些事实表明，只杀死致病性肌成纤维细胞而不影响作为前体细胞的成纤维细胞和心肌细胞的机制可以使副作用最小化，并且这是一种新的仿生疗法。因此，根据本发明，为了治疗已存在的纤维化，通过CCN5蛋白质活性使纤维化基质溶解并使正常组织结构恢复，由此可以提供用于包括心脏纤维化的难治病的纤维化疾病的新的治疗方法。

CCN5是胞外分泌的基质细胞蛋白，并显示出治疗活性，因此，CCN5具有能够通过诸如蛋白质制剂、基因治疗剂、扩增基因的细胞治疗剂等药物递送方法对各种疾病和广泛的部位进行治疗的潜力。基于这些特性，在具有相当大的心脏纤维化进展的各种动物模型中通过AAV9-CCN5基因转移而在心脏中表达CCN5，结果是，已存在的纤维组织被可逆地治疗。通过如在细胞水平的实验中那样选择性诱导肌成纤维细胞凋亡，CCN5的可逆治疗机制再现了体内治疗作用。具体地，通过治疗心肌组织的间质性纤维化和血管周围纤维化来证实对心脏纤维化的治疗作用。另外，通过蛋白和基因分析CCN5的治疗作用，结果是，以下每一个都是纤维化治疗的药物靶标：通过引起胶原蛋白交联而增加刚性的LOX酶减少(RosinN.L.,et al.,Am.J Pathol.185(3):631-642(2015))，作为TGF-β信号传导抑制剂的Smad7蛋白的表达增加(Wei L.H.,Huang X.R.,et al.Cardiovasc.Res.1；99(4):665-73(2013))，促进炎性免疫细胞的流入和肌成纤维细胞的增殖的半乳糖凝集素-3减少(HoJ.E.,Liu C.,et al.J Am.Coll.Cardiol.60(14):1249-1256(2012))以及TGF-β1和TGF-β2的表达减少；这显示了CCN5的治疗机制很强。因此，CCN5蛋白可以为治疗各种心脏纤维化疾病提供有效的治疗手段。

伴随有心脏纤维化的心脏功能障碍是舒张性心力衰竭(HFpEF)的最大疾病原因。由于心肌的松弛功能异常和胞外间质组织的增加，心室的硬化导致心肌萎缩和心血管收缩和松弛的问题。结果是，诱导缺氧、细胞能量代谢受损、炎性细胞的持续流入导致心肌细胞坏死，以及舒张性心力衰竭(HFpEF)进展为收缩性心力衰竭(HFrEF)。另外，在收缩性心力衰竭(HFrEF)中，与心肌梗塞相似地发生大量心肌细胞死亡的情况下，在损伤部位发生替代性纤维化，而在边界和远端组织处发展为间质性纤维化。因此，心脏纤维化可能成为使收缩性心力衰竭病症恶化的风险因素。在本发明中，通过体内模型发现CCN5蛋白在压力超负荷(TAC)模型和作为罕见病的肌肉杜氏肌营养不良模型(DMD)中具有对心脏纤维化的可逆性治疗以及收缩性心力衰竭的恢复和保护作用。另外，通过发生舒张性心力衰竭的大鼠AID模型试验，CCN5蛋白能够可逆地治疗心脏纤维化并恢复降低的心脏舒张功能。该结果表明，通过本发明，可以开发CCN5蛋白作为用于心脏纤维化或伴随有心脏纤维化的收缩性心力衰竭(HFrEF)和舒张性心力衰竭(HFpEF)的可逆性治疗的治疗剂。

已经如此详细描述了本发明的某些部分，本领域技术人员将会理解，这些具体技术仅仅是优选实施方式，并且显然本发明的范围不受其限制。因此，本发明的实质范围可以由所附权利要求及其等同物限定。

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序列表

<110> 贝特基因

<120> 用于治疗心脏纤维化的药物组合物

<130> PCB705025BPG

<150> KR 10-2015-0159888

<151> 2015-11-13

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> PRT

<213> CCN5的氨基酸序列()

<400> 1

Met Arg Gly Asn Pro Leu Ile His Leu Leu Ala Ile Ser Phe Leu Cys

1 5 10 15

Ile Leu Ser Met Val Tyr Ala Gln Leu Cys Pro Ala Pro Cys Ala Cys

20 25 30

Pro Trp Thr Pro Pro Gln Cys Pro Pro Gly Val Pro Leu Val Leu Asp

35 40 45

Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Arg Arg Leu Gly Glu Ser Cys

50 55 60

Asp His Leu His Val Cys Asn Pro Ser Gln Gly Leu Val Cys Gln Pro

65 70 75 80

Gly Ala Gly Pro Ser Gly Arg Gly Val Val Cys Leu Phe Glu Glu Asp

85 90 95

Asp Gly Ser Cys Glu Val Asn Gly Arg Arg Tyr Leu Asp Gly Glu Thr

100 105 110

Phe Lys Pro Asn Cys Arg Val Leu Cys Arg Cys Asp Asp Gly Gly Phe

115 120 125

Thr Cys Leu Pro Leu Cys Ser Glu Asp Val Arg Leu Pro Ser Trp Asp

130 135 140

Cys Pro Arg Pro Arg Arg Ile Gln Val Pro Gly Arg Cys Cys Pro Glu

145 150 155 160

Trp Val Cys Asp Gln Ala Val Met Gln Pro Ala Ile Gln Pro Ser Ser

165 170 175

Ala Gln Gly His Gln Leu Ser Ala Leu Val Thr Pro Ala Ser Ala Asp

180 185 190

Gly Pro Cys Pro Asn Trp Ser Thr Ala Trp Gly Pro Cys Ser Thr Thr

195 200 205

Cys Gly Leu Gly Ile Ala Thr Arg Val Ser Asn Gln Asn Arg Phe Cys

210 215 220

Gln Leu Glu Ile Gln Arg Arg Leu Cys Leu Ser Arg Pro Cys Leu Ala

225 230 235 240

Ser Arg Ser His Gly Ser Trp Asn Ser Ala Phe

245 250

<210> 2

<211> 756

<212> DNA

<213> CCN5的核苷酸序列()

<400> 2

atgaggggca acccactgat ccatcttctg gccatttcct tcctctgcat tctctcaatg 60

gtgtatgccc agctgtgccc agcaccctgt gcctgtcctt ggacaccacc ccagtgccca 120

ccgggggtac ccctggtgct ggatggctgt ggctgctgtc gagtgtgtgc acggaggctg 180

ggggagtcct gcgaccacct gcatgtctgc aaccccagcc agggcctggt ttgtcagcct 240

ggggcaggcc ccagtggccg tggtgttgtg tgcctcttcg aagaggatga cgggagctgt 300

gaggtgaacg gccgcaggta cctggatggg gagaccttta aacccaattg cagggttttg 360

tgccgctgtg atgacggtgg tttcacctgc ctgccgctgt gcagtgagga tgtgcggctg 420

cccagctggg actgcccacg ccccaggaga atacaggtgc caggaaggtg ctgccccgag 480

tgggtgtgtg accaggcagt gatgcagccg gcaatccagc cctcctcagc ccaaggacac 540

caactttctg cccttgtcac tcctgcatct gccgatggcc cctgtccaaa ctggagcaca 600

gcctggggcc cctgctcaac cacctgtggg ttgggcatag ccacccgagt atccaaccag 660

aaccgattct gccaactgga gatccagcgt cgcctgtgtc tgtccagacc ctgcctggca 720

tccaggagcc acggctcatg gaacagtgcc ttctag 756

Claims (12)

1.一种用于治疗心脏纤维化或伴随有心脏纤维化的心脏病的药物组合物，包含以下物质作为活性成分：

(a)CCN5蛋白；或

(b)基因载体，其包含编码CCN5蛋白的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述心脏纤维化是进行性心脏纤维化或已存在的心脏纤维化。

3.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物诱导肌成纤维细胞特异性凋亡。

4.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述CNN蛋白包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列。

5.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述编码CCN5蛋白的核苷酸序列由S EQID NO:2表示的核苷酸序列组成。

6.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述基因载体选自质粒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯性疱疹病毒、痘苗病毒、脂质体和囊泡。

7.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述基因载体是腺相关病毒。

8.权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述腺相关病毒选自1型腺相关病毒、6型腺相关病毒、8型腺相关病毒和9型腺相关病毒。

9.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述伴随有心脏纤维化的心脏病是伴随有心脏纤维化的收缩性心力衰竭或伴随有心脏纤维化的舒张性心力衰竭。

10.权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物诱导肌成纤维细胞特异性凋亡或抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。

11.权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述伴随有心脏纤维化的心脏病选自：肥厚性心肌病，由慢性代谢疾病引起的心脏病，心脏瓣膜病，炎症性心脏病，结构性心脏病，由传染性病原体感染引起的心脏病，先天性心脏病，由遗传性异常引起的心脏病，由吸烟、饮酒或暴露于有毒药物引起的心脏病，以及由衰老引起的心脏病。

12.一种用于治疗心脏纤维化或伴随有心脏纤维化的心脏病的方法，包括：

将药物组合物给药至对象的步骤，所述药物组合物包含作为活性成分的：(a)CCN5蛋白；或(b)包含编码CCN5蛋白的核苷酸序列的基因载体。