WO2015178381A1 - 細胞展開用デバイスの前処理方法、細胞展開用デバイス、および細胞展開用デバイスの前処理システム - Google Patents

細胞展開用デバイスの前処理方法、細胞展開用デバイス、および細胞展開用デバイスの前処理システム Download PDF

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WO2015178381A1
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WO
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cell
microchamber
air
liquid
wet liquid
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Application number
PCT/JP2015/064348
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English (en)
French (fr)
Inventor
茉奈美 増渕
淳吾 荒木
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D19/00—Degasification of liquids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a pretreatment method for a device for cell deployment using a prewetting liquid that is passed through a microchamber prior to a cell suspension, a device for cell deployment obtained by such a pretreatment, and such a device.
  • the present invention relates to a pretreatment system for a device for cell deployment for performing pretreatment.
  • Circulating tumor cells [CTC], circulating vascular endothelial cells [CEC], circulating vascular endothelial progenitor cells [CEP], various stem cells, etc. are contained in whole blood according to the pathological condition. It is a very rare cell. Despite the obvious clinical utility of rare cell detection, it is extremely difficult to detect. In recent years, various cell separation techniques have been applied to attempt detection and commercialization. In any case, the effectiveness of detection results was evaluated because of the rarity of the target (rare cell loss or unwanted cell contamination). It is important to
  • a cell expansion device 10 including a plurality of microchambers 4 as shown in FIG. 7
  • a cell suspension such as a blood-derived specimen is spread on the surface of the microchamber chip 2
  • the cells are accommodated in the microchambers 4, and the plurality of cells accommodated in the microchambers 4 are accommodated.
  • a method for confirming whether or not a specific cell exists is known.
  • Patent Document 1 discloses that a part or all of the microchamber chip surface and the inner wall surface of the microchamber are coated with a blocking agent (for example, a protein such as casein) that can suppress nonspecific adsorption of cells.
  • a blocking agent for example, a protein such as casein
  • An invention of a microchamber chip for cell deployment is described, which has the effect of facilitating observation under a microscope without being layered inside.
  • the microchamber chip 2 is formed of a hydrophobic material such as polystyrene, Even if the cell suspension is introduced, the cell suspension cannot be filled in all the microchambers 4 due to the surface tension, and bubbles remain in the plurality of microchambers 4 (FIG. 9). reference).
  • an organic solvent having a low surface tension for example ethanol
  • ethanol is passed through the microchamber chip 2 as a “pre-wet liquid” in advance. It is performed to improve the wettability of the chamber 4.
  • pure water is passed through to replace and wash the pre-wet liquid, and then the cell suspension is passed through. It enters the inside of the micro chamber 4 and the cells can be efficiently collected in the micro chamber 4.
  • the present invention can be used even when the cell expansion device is subjected to blocking treatment, and substantially no bubbles remain in all the microchambers.
  • a pre-treatment method for a device for cell deployment that enables filling with a cell suspension to be subsequently passed, and the result of such treatment is that no bubbles remain in the microchamber. It aims at providing the pretreatment system of the device for cell deployment which preserve
  • the inventors of the present invention have applied the pre-wet liquid to the air bubbles (air) when the pre-wet liquid is passed through the micro flow channel and bubbles are generated on the micro chamber. ) Can be dissolved in the pre-wet liquid and removed from the microchamber, and the present invention has been completed.
  • a pretreatment method for a cell deployment device reflecting one aspect of the present invention is as follows. [1] In a cell deployment device in which a plurality of microchambers are formed on the bottom surface of a microchannel, this is a pretreatment method for a cell deployment device for removing bubbles remaining in the microchamber after the pre-wet liquid passing step.
  • a device for cell deployment reflecting one aspect of the present invention is as follows. [8] A device for cell deployment in which the microchamber is filled with a pre-wet liquid by pretreatment, wherein the method is performed.
  • a pretreatment system for a device for cell deployment reflecting one aspect of the present invention is as follows.
  • a device for cell deployment in which a plurality of microchambers are formed, a cell detection device, and a control means;
  • the cell detection device includes at least a drug container holder in which a pre-wet liquid and a cell suspension supplied to the cell deployment device are stored, A fluid passing mechanism arranged movably between the cell deployment device and the drug solution container holder;
  • the control means is required to dissolve the total amount A of air existing in a bubble state on the microchamber in the prewet liquid after at least the prewet liquid is passed through the cell deployment device.
  • An operating pressure calculating means for calculating a correct operating pressure X After the pre-wet liquid stored in the drug solution container holder is passed through the cell deployment device via the drug solution passing mechanism, the pressure equal to or higher than the operating pressure X calculated by the operating pressure calculating means is applied. It is made to act in the device for cell deployment, so that the total amount A of air in the bubble state attached on the micro chamber when the pre-wet liquid is passed is dissolved in the pre-wet liquid.
  • the pre-wet liquid when the pre-wet liquid is passed over the microchamber chip of the device for cell deployment, bubbles that become an obstacle to cell recovery are contained in the pre-wet solution. It melt
  • the device for cell deployment since substantially all the chambers are pre-filled with the pre-wet liquid, it can be used for the rapid development of the cell suspension.
  • the function of the pretreatment system for a cell deployment device according to the present invention can be integrated with a conventional cell recovery system and cell observation system, the cell recovery and cell observation can be performed quickly.
  • the device for cell deployment can be in a state suitable for that purpose.
  • the device for cell deployment according to the present invention which can be shipped as a product suitable for cell recovery and cell observation, can be industrially mass-produced at low cost.
  • FIG. 1 is a schematic plan view showing a cell deployment device according to a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view of the microchamber chip when a blocking agent is applied to the microchamber chip.
  • FIG. 3 is a flowchart showing each step in the pretreatment method for a cell deployment device according to a preferred embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view schematically showing the inside of the cell deployment device when the pretreatment method for the cell deployment device according to a preferred embodiment of the present invention is performed.
  • (A) is a cross-sectional view of the device for cell expansion obtained through the microchamber chip forming step
  • (B) is a bubble obtained by passing a pre-wet liquid through the cell expansion device of FIG. (A).
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing that the bubbles are completely dissolved by being added.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of a pretreatment system for a device for cell expansion according to the present invention, which also has functions as a device for cell expansion and a device for cell observation.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the ethanol concentration and the existence ratio of microchambers having bubbles.
  • FIG. 7 is a schematic view of a conventional cell deployment device.
  • FIG. 8 is a schematic cross-sectional view of the cell expansion device to which the pretreatment method for the cell expansion device according to the present invention is applied, taken along the direction of fluid flow, and is taken along the line XX in FIG.
  • FIG. 9 is an enlarged cross-sectional view showing a state in which prewetting is passed through the cell deployment device shown in FIG. 8 and bubbles are attached on the microchamber.
  • Cell expansion device First, a cell expansion device to which the pretreatment method according to the present invention is applied will be described.
  • FIG. 1 is a schematic view showing a cell expansion device 30 to which a cell expansion device pretreatment method according to a preferred embodiment of the present invention is applied.
  • cross section of the cell deployment device 30 shown in FIG. 1 is substantially the same as that of FIG. 8, and therefore the cross section will be described with reference to FIG.
  • the cell deployment device 30 includes a microchamber chip 2 in which a plurality of microchambers 4 are formed, and one microchannel 5 formed on the plurality of microchambers 4.
  • the flow path forming frame body 8 disposed via the frame-shaped sealing member 34, the inlet portion 3 provided in the flow path forming frame body 8, and the micro flow path 5 introduced from the inlet portion 3
  • an outlet portion 7 provided in the flow path forming frame 8 is provided.
  • the microchamber chip 2 is also referred to as a microchamber array [MCA].
  • MCA microchamber array
  • 1000 to 30000 or more microchambers 4 are formed in a range consisting of a length J and a width H.
  • the length J of the region microchamber 4 is formed is 10mm or more, the cross-sectional area of the micro channel 5 is 5 mm 2 or less.
  • the microchamber 4 is a concave fine hole capable of “accommodating” and “holding” one or more cells, and preferably has a bottom.
  • holding means that the cells contained in the microchamber 4 come out of the microchamber 4 by passing a staining solution or a washing solution through the microchannel 5 of the microchamber chip 2 for cell deployment. It's difficult.
  • the diameter of the upper opening of the microchamber 4 is preferably 20 to 500 ⁇ m. When the diameter is in the range of 20 to 500 ⁇ m, cells can be suitably accommodated and held in the microchamber 4.
  • the depth of the microchamber 4 is preferably about 10 to 15 cells per microchamber, and the depth of the microchamber 4 is typically 10 to 250 ⁇ m.
  • the shape of the microchamber 4 is an inverted conical shape with a flat bottom, but is not limited thereto.
  • microchamber chip 2 examples include polymers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyamide, polycarbonate, polydimethylsiloxane [PDMS], polymethyl methacrylate [PMMA], and cyclic olefin copolymer [COC].
  • the microchamber chip 2 may be a combination of a plurality of materials in which a molded polymer is bonded to a substrate made of metal, glass, quartz glass, or the like.
  • the microchannel 5 is not limited to this example as long as the cell suspension can be circulated on the microchamber chip 2.
  • the flow channel forming frame 8 provided on the upper surface side of the microchamber chip 2 with the upper surface of the microchamber chip 2 as the bottom surface
  • the micro flow path 5 is defined by the seal member 34.
  • the same material as that of the microchamber chip 2 is preferably used.
  • the microchannel 5 communicates with the inlet portion 3 and the outlet portion 7 of the channel forming frame 8, and the cell suspension flowing in from the inlet portion 3 flows in the direction indicated by the arrow, and the outlet portion 7 Can be derived from
  • the pretreatment method of the device for cell deployment according to the present invention includes a microchamber chip forming step C, a pre-wet liquid passing step D, a bubbled microchamber detecting step E, and bubbled air.
  • the method includes a volume calculation step F, an operating pressure calculation step G, and a bubble dissolution step H, and these steps are performed in this order.
  • the device for cell deployment after passing through the microchamber chip forming step C is shown in FIG. 4 (A)
  • the device for cell deployment after passing through the pre-wet liquid passing step D is shown in FIG. 4 (B).
  • the device for cell expansion when H is started is shown in FIG. 4 (C)
  • the device for cell expansion after the bubble lysis step H is shown in FIG. 4 (D).
  • the pretreatment method of the device for cell deployment by performing the steps shown in FIG. 3 in this order, for example, as shown in FIG. All the bubbles 9 adhering to the microchamber 4 when passing through the channel 5 can be dissolved in the pre-wet liquid 11 as shown in FIG. Thereby, the wettability of the cell expansion device 30 can be improved.
  • an aqueous solution of an organic solvent compatible with water can be used.
  • an aqueous ethanol solution is preferable, and an aqueous ethanol solution of 30% by volume or less is particularly preferable.
  • an ethanol aqueous solution having such a concentration for example, as shown in FIG. 2, even when a blocking agent 50 for preventing cell adhesion is attached to a portion other than the bottom surface 32 of the microchamber 4. The blocking effect is rarely impaired (for example, see Patent Document 1).
  • an organic solvent (ethanol) aqueous solution having a concentration of 30% by volume or less includes pure water, physiological saline, buffer solution, and other aqueous solutions having an organic solvent (ethanol) concentration of 0% by volume. Is included.
  • the cell suspension may contain rare cells, for example, blood such as human, lymph fluid, tissue fluid, body cavity fluid, etc., and may be appropriately diluted with a diluent or the like.
  • the cell suspension is not limited to those derived from living organisms, and may be a cell dispersion prepared by suspending cells artificially for testing and research.
  • application of a cell suspension after separating red blood cells from blood is suitable for collecting and detecting rare cells such as CTC.
  • rare cells include cancer cells.
  • the rare cells are any of CTC (circulating tumor cells or circulating cancer cells), CEC (circulating vascular endothelial cells) and CEP (circulating vascular endothelial progenitor cells).
  • CTC circulating tumor cells or circulating cancer cells
  • CEC circulating vascular endothelial cells
  • CEP circulating vascular endothelial progenitor cells
  • One or more types of cells may be used.
  • the diameter of various cells contained in such a cell suspension is preferably 10 to 100 ⁇ m, but at least smaller than the diameter of the microchamber 4 is required.
  • the volume V of the microchannel 5 in the region where the microchamber 4 is formed and the total sum W of the volumes of the microchamber 4 formed in the region are calculated. Possible information is preset.
  • the pre-wet liquid passing step D in order to improve the wettability of the micro chamber 4 so that the micro chamber 4 can be filled with the cell suspension, the pre-wet liquid is passed through the micro channel 5 in advance. 11 is passed (the pre-wet liquid is fed and air remains in the micro chamber 4 but the micro channel is filled with the pre-wet liquid 11 except that) It is.
  • the pre-wet liquid 11 may flow in one direction from the inlet 3 to the outlet 7, but the introduction and suction of the pre-wet liquid 11 from the inlet 3 are alternately performed. It is possible to go in both directions.
  • the bubble air volume calculation step F is a step of calculating the total amount A of the air volume (volume) in the bubble state detected in the microchamber with bubble detection step E.
  • the volume is (A + B) / B times
  • at least the operating pressure X of (A + B) / B times the normal pressure P should be applied. good.
  • the volume of air already dissolved in the pre-wet liquid 11 accommodated in the reagent container B 0 is used as it is in the above formula.
  • the amount of remaining bubbles in the microchamber after the pre-wet liquid passing step is set to A 0 .
  • the pre-wet liquid 11 in a state in which the volume of air dissolved by degassing in advance is substantially zero can be stored in the reagent container.
  • the remaining bubble amount A1 in the microchamber after the prewet liquid flow-through step is approximately A0-B0, and the prewet liquid that has not been degassed is used.
  • the remaining bubble amount A0 can be reduced, and as a result, the operating pressure X can be lowered.
  • A0 ⁇ B0 ⁇ the remaining bubble amount A1 becomes substantially zero, and the bubble dissolving step H is no longer necessary.
  • the calculation of the operating pressure X can also be performed by the control means 190, and the obtained information is stored in the control means 190 or the like.
  • a pressure equal to or higher than the operating pressure X obtained in the operating pressure calculating step G is applied to the micro flow path 5 so that air existing as bubbles 9 on the micro chamber with bubbles is removed from the pre-wet liquid 11. It is a process of melting in.
  • the bubble dissolving step H is performed by a pressure pump provided in the liquid passing mechanism 110.
  • the cell detection device 100 fluid passing mechanism 110
  • the control means 190 are configured so that a predetermined pressure is applied to the pre-wet liquid. (Not shown) and its control program.
  • a predetermined operating pressure X can be applied to the pre-wet liquid in the microchannel by the following two methods.
  • the outlet portion 7 is sealed, and then the pre-wet liquid is pushed out by the liquid flow system 110.
  • the pressure applied to the pre-wet liquid can be gradually increased to reach the predetermined operating pressure X. Stop it.
  • the cell detection device 100 includes an exit portion sealing mechanism (not shown), and the control unit 190 automatically performs the exit portion according to a predetermined time schedule. It is preferable that the outlet portion 7 is sealed by a sealing mechanism, and a control program that can be operated to push the pre-wet liquid 11 by the liquid passing mechanism 110 is executable.
  • the pre-wet liquid When the pre-wet liquid is passed through the micro-channel, or after the liquid is passed, the pre-wet liquid is flowed at a high flow rate by the liquid passing mechanism 110 while the outlet portion 7 is kept open without being sealed. Move along the road.
  • the movement of the pre-wet liquid can be performed by discharging and / or suctioning by a liquid passing mechanism, and the direction of movement may be one direction or both directions (reciprocal liquid feeding).
  • the flow rate of the pre-wet liquid necessary to generate at least the predetermined operating pressure X is preferably within the range of the flow rate appropriate for the flow-through system mechanism 110.
  • a predetermined operating pressure X can be generated by discharging and / or sucking for a predetermined time after setting the flow rate of the liquid system mechanism 110 within an appropriate range.
  • control means 190 operates to automatically move the pre-wet liquid 11 at a predetermined high flow rate by the liquid passing mechanism 110 with a predetermined time schedule. It is preferable that a control program that can be executed is executable. Further, the outlet portion 7 of the cell deployment device 30 is preferably one having a small area so that pressure is easily applied to the pre-wet liquid in the microchannel.
  • all the microchambers 4 are filled with the pre-wet liquid 11 by continuously performing the above steps (C) to (H).
  • a cell deployment device can be provided. That is, in the cell treatment device pretreatment method according to the present invention, simply passing the pre-wet liquid 11 into the microchannel 5 of the cell deployment device 30, as shown in FIG. Since bubbles 9 remain in 4, the bubbles 9 are dissolved in the pre-wet liquid by applying a pressure larger than the normal pressure in the microchannel 5.
  • pretreatment system 200 of the device for cell expansion suitable for implementing the pretreatment method according to the present invention will be described.
  • the pretreatment system 200 includes a cell deployment device 30, a reagent container 20, a cell detection device 100, a control unit 190, and the like.
  • the cell deployment device 30 and the reagent container 20 are used by being set in the cell detection device 100, and the control means 190 is used by being connected so that the cell detection device 100 can be controlled.
  • the cell detection apparatus 100 includes a liquid flow mechanism 110 for passing various liquids through the micro flow path 5 of the cell deployment device 30, an imaging device 120, and a cell collection device holder 160 that holds the cell deployment device 30. , A reagent container holder 170 for holding the reagent container, and a control unit 190 for controlling various devices included in the cell detection device 100. It is desirable that the liquid passing mechanism 110 and the imaging device 120 include a spatial moving means for enabling liquid suction / discharge and cell observation at an arbitrary position.
  • the liquid passing mechanism 110 controls each of the prewet liquid 11 and the cell suspension stored in the reagent container 20 as well as each of the staining liquid, the dissociation liquid, the washing liquid, and other reagents. It is a mechanism that moves between the storage part and the inlet part 3 of the cell deployment device 10 to suck and discharge those liquids. Specifically, a predetermined amount of liquid such as the pre-wet liquid 11 and the cell suspension stored in the reagent container is sucked by the liquid passing mechanism 110, and is predetermined at the inlet 3 of the cell deployment device 30. The liquid is discharged at a flow rate of and introduced into the microchannel 5.
  • the liquid passing mechanism 110 is constructed using, for example, a syringe pump, a replaceable chip, an actuator that can move in the X-axis direction (left-right direction in FIG. 5) and the Z-axis direction (up-down direction in FIG. 5). Can do.
  • the syringe pump has an ability to perform suction and discharge at a desired flow rate in each step related to cell observation.
  • the imaging device 120 is configured in accordance with a fluorescence microscope including an objective lens, an eye lens, a CCD camera, and the like, and can photograph the bubbles 9 attached to the microchamber 4.
  • control means 190 a personal computer connected to various devices of the cell detection apparatus 100 and capable of executing a control program for these devices can be used.
  • the control program may be stored in a storage medium built in the personal computer, or may be placed in a state where the personal computer can be used via a network or a removable storage medium.
  • the control program can automatically obtain from various data the detection of the bubble air 9, the calculation of the operating pressure X, the operation of applying the operating pressure X to the micro flow path 5, and the like. Further, according to a predetermined process for cell observation, the liquid passing mechanism 110 can be operated so as to pass the pre-wet liquid 11 or the cell suspension or the like with a predetermined time schedule.
  • the operating pressure X is calculated by the control means 190, but the present invention is not limited to this.
  • the ratio of the microchamber 4 where the bubbles 9 remain due to the passage of the pre-wet liquid 11 has a certain tendency depending on the embodiment of the pre-wet liquid used. For example, when an ethanol aqueous solution is used as the pre-wet liquid, the pre-wet liquid is used. It is clear from the result of the experiment that the concentration is determined as shown in FIG. 6 depending on the concentration of ethanol in the liquid (in FIG. 6, the maximum value is adopted from a plurality of experimental results). Therefore, based on the graph of FIG. 6 prepared in advance, the ratio of the microchamber 4 to which the bubbles 9 adhere is assumed, and by multiplying this by the volume of the microchamber 4, the total amount A of air in the remaining bubble state A Can also be calculated.
  • the information of FIG. 6 is stored in the control means 190, and the operating pressure X can be approximately obtained from this information.
  • the reagent container 20 stores various liquids that need to be passed through the flow path 1 for cell observation, such as the pre-wet liquid 11, the cell suspension, and the washing liquid.
  • the pretreatment method according to the present invention can be easily performed, whereby substantially all the microchambers are prefilled with the prewetting liquid.
  • a cell deployment device can be produced.
  • the temperature in the microchannel 5 may be kept constant at room temperature or a predetermined temperature. It is preferable to set the temperature of the pre-wet liquid 11 to, for example, about 4 to 10 ° C. after passing the pre-wet liquid 11 through the microchannel 5. If the prewetting liquid 11 is cooled after passing through so as to lower the temperature, the bubbles 9 remaining after passing through the micro flow path 5 are reduced in volume due to the temperature drop. As the temperature of water (pre-wet liquid) decreases and the saturation dissolution amount of air increases, the operating pressure X can be lowered as a result.
  • the cell detection apparatus 100 (cell collection device holder 160) includes a temperature adjustment mechanism (not shown) including, for example, a cooling plate and a small temperature sensor
  • the control unit 190 includes: It is preferable that a control program for temperature adjustment that can be operated to automatically lower the temperature of the pre-wet liquid 11 with a predetermined time schedule by the temperature adjustment mechanism is executable.
  • Example 1 When an outlet is sealed and pressure is applied> A micro of a cell deployment device in which 14,000 cylindrical micro chambers 4 having a diameter of 0.12 mm and a depth of 0.05 mm are arranged on the bottom surface of a micro flow path 5 having a width of 15 mm, a depth of 0.1 mm, and a length of 43 mm. 100 ⁇ l of pure water was slowly passed through the flow path 5 as a prewet liquid at 1 ml / min using a syringe pump. From the image observed with a microscope, it was confirmed that bubbles remained in about 99% of the chamber.
  • the volume of the remaining air bubbles per chamber was about 0.8 nl, and air bubbles remained in 99% of the 14000 microchambers, so the total volume A was about 11 nl.
  • the solubility of air at room temperature of 25 ° C. is about 0.02 cm 3 with pure water in 1 cm 3 (from the scientific chronology)
  • the pre-wet liquid (pure water) is in a state where the relationship between the drive amount of a syringe (Hamilton, 1 ml capacity) sealed with the outlet 7 and the internal pressure is measured with a pressure sensor (Keyence). It applied with the syringe and the syringe pump (micro syringe pump) so that the inside of the micro flow path 5 might be set to the pressure of 9P. When an image was taken again with a microscope, about 99% of the microchamber was filled with the prewetting liquid.
  • a syringe Heamilton, 1 ml capacity
  • Example 2 When pre-wetting at a high flow rate (syringe pump: 40 ml / min) with the outlet portion opened> A micro of a cell deployment device in which 14,000 cylindrical micro chambers 4 having a diameter of 0.12 mm and a depth of 0.05 mm are arranged on the bottom surface of a micro flow path 5 having a width of 15 mm, a depth of 0.1 mm, and a length of 43 mm.
  • a micro flow path 5 having a width of 15 mm, a depth of 0.1 mm, and a length of 43 mm.
  • a flow rate of 40 ml / min is set, and the syringe (manufactured by Terumo Corporation, capacity 50 ml) installed in the microchannel 5 with the outlet 7 opened is connected to the microchannel 5
  • the pressure applied between them was measured with a pressure sensor (manufactured by KEYENCE). It was found that by driving the pump for about 1 minute, the internal pressure was about 9 times the normal pressure P (9P), so the set flow rate of the pump was 40 ml / min for 1 minute (40 ml), and pure water was pre-wet.
  • a liquid was passed through the microchannel 5 as a liquid and a pressure was applied. When an image was taken again with a microscope, about 99% of the microchamber was filled with the prewetting liquid.

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Abstract

　予め細胞用展開用デバイスの濡れ性を向上させるために、マイクロ流路内にプレウェット液を通液する場合に、プレウェット液による濡れ性を確実に向上させることができる細胞展開用デバイスの前処理方法、および濡れ性を向上させた細胞展開用デバイス、ならびに濡れ性を向上させるための細胞展開用デバイスの前処理システムを提供することを課題とする。本発明は、複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおいて、プレウェット液通液工程後にマイクロチャンバー内に残存する気泡を除去するための、細胞展開用デバイスの前処理方法であって、前記マイクロチャンバーの１個当たりの体積と、前記マイクロチャンバーの総数とが予め設定されるマイクロチャンバーチップ形成工程と、マイクロ流路にプレウェット液を通液するプレウェット液通液工程と、プレウェット液を通液した後、気泡が存在するマイクロチャンバーの数を検出する気泡付きマイクロチャンバー検出工程と、気泡状態の空気の合計量Ａを算出する気泡空気体積算出工程と、前記気泡状態の空気の合計体積Ａと、前記プレウェット液中に既に溶解している空気の体積Ｂとの和から、（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出し、この算出された値に常圧Ｐを掛けあわせて、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出する作動圧算出工程と、作動圧力Ｘを前記マイクロ流路に作用させることにより、気泡として存在する空気を前記プレウェット液内に溶かし込む気泡溶解工程と、を有する。

Description

細胞展開用デバイスの前処理方法、細胞展開用デバイス、および細胞展開用デバイスの前処理システム
　本発明は、細胞懸濁液に先立ってマイクロチャンバー内に通液されるプレウェット液を用いる細胞展開用デバイスの前処理方法、そのような前処理により得られる細胞展開用デバイス、およびそのような前処理を実施するための細胞展開用デバイスの前処理システムに関する。
　循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕、循環血管内皮細胞〔ＣＥＣ〕、循環血管内皮前駆細胞〔ＣＥＰ〕、各種幹細胞等（本明細書において、まとめて「希少細胞」という。）は病態に応じて全血中に極めて稀に存在する細胞である。希少細胞の検出は臨床的な有用性が明らかであるにもかかわらず、その検出は極めて難しい。近年様々な細胞分離手法を応用してその検出が試みられ製品化がなされているが、いずれにおいても対象の希少性が故、検出結果の有効性を評価（希少細胞のロスや不要細胞の混入の有無）することが重要である。
　採血した血液などの検体中に目的とする希少細胞が存在するか否かを検査するための手法の一つとして、図７に示したような細胞展開用デバイス１０（複数のマイクロチャンバー４を備えたマイクロチャンバーチップ２）の表面に血液由来検体などの細胞懸濁液を平面状に展開し、各マイクロチャンバー４内に細胞を収容し、それらマイクロチャンバー４内に収容された複数の細胞中に、特定の細胞が存在するか否かを確認する方法が知られている。
　そのような稀少細胞の回収方法においては、希少細胞がマイクロチャンバー内に確実に収容されるようにする必要がある。例えば、特許文献１には、マイクロチャンバーチップ表面およびマイクロチャンバー内壁面の一部または全部を、細胞の非特異的吸着を抑制できるブロッキング剤（例えば、カゼイン等のタンパク質）で被覆することにより、血液等に含まれる多種類かつ多量の細胞を当該チップ上に展開した際、細胞がマイクロチャンバー内に格納、保持されやすく、さらに細胞がマイクロチャンバーの内壁面に吸着しにくいため、細胞同士がマイクロチャンバー内で重層化せずに、顕微鏡下での観察が容易になるという作用効果が奏される、細胞展開用マイクロチャンバーチップの発明が記載されている。
ＷＯ２０１４／００７１９２
　前述したような細胞展開用デバイス１０を用いて稀少細胞を検出する方法において、マイクロチャンバーチップ２が、例えば、ポリスチレンなどの疎水性の材料から形成されている場合には、マイクロ流路５内に細胞懸濁液を導入したとしても、表面張力の関係で細胞懸濁液を全てのマイクロチャンバー４内に充填させることができず、複数のマイクロチャンバー４内に気泡が残存してしまう（図９参照）。
　そのような問題を抑制するため、細胞懸濁液を展開する前に、予め表面張力の低い有機溶剤、例えばエタノールを「プレウェット液」として、マイクロチャンバーチップ２内に通液することにより、マイクロチャンバー４の濡れ性を向上させておくことが行われている。このようにプレウェット液で処理した後、純水を通液してプレウェット液を置換、洗浄してから、細胞懸濁液を通液するようにすれば、細胞懸濁液はほとんど全てのマイクロチャンバー４の内部に入り込み、細胞をマイクロチャンバー４で効率的に回収することができるようになる。
　ところが、特許文献１に記載されているように、マイクロチャンバーチップ表面およびマイクロチャンバー内壁面の一部または全部をブロッキング剤で処理する場合、プレウェット液による処理が、ブロッキング剤の効果に悪影響を与えないよう留意する必要がある。例えば、エタノール水溶液をプレウェット液として用いる場合、その濃度を３０容量％以下程度にまで低くすれば、ブロッキング剤の効果に悪影響を与えることは避けられるが、今度は前述したようなプレウェット液自体に求められる効果が十分ではなくなり、マイクロチャンバー４内の気泡の残存を抑制することができなくなる。結果的に、プレウェット液に続いて細胞懸濁液をマイクロ流路５内に展開しても、マイクロチャンバー４内に細胞を効率的に回収することができず、希少細胞の検出結果の有効性を正しく評価することができなくなってしまうという問題が発生する。このような現象は、マイクロ流路５の断面積が小さく、しかもマイクロチャンバー４の密度が大きい程に生じ易い。
　本発明は、このような実情に鑑み、細胞展開用デバイスにブロッキング処理がなされている場合にも利用することができ、かつ実質的に全てのマイクロチャンバーに気泡を残存させず、プレウェット液とそれに続いて通液される細胞懸濁液で充填することができるようにする細胞展開用デバイスの前処理方法、およびそのような処理が実施された結果、マイクロチャンバー内に気泡が残存しない状態で保存されている細胞展開用デバイス、ならびにそのような処理を実施するための細胞展開用デバイスの前処理システムを提供することを目的としている。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、マイクロ流路内にプレウェット液を通液してマイクロチャンバー上に気泡が生じてしまった場合に、プレウェット液を加圧することで、その気泡（空気）をプレウェット液中に溶解させて、マイクロチャンバー内から除去することができることを見出し、本発明の完成に至った。
　すなわち、上述した目的の内少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、細胞展開用デバイスの前処理方法は、以下の通りである。
［１］
　マイクロ流路の底面に複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおいて、プレウェット液通液工程後にマイクロチャンバー内に残存する気泡を除去するための、細胞展開用デバイスの前処理方法であって、
　前記マイクロチャンバーの１個当たりの体積と、前記マイクロチャンバーの総数とが予め設定されるマイクロチャンバーチップ形成工程と、
　前記マイクロチャンバーチップ形成工程で得られた前記複数のマイクロチャンバーの上部に形成されているマイクロ流路にプレウェット液を通液するプレウェット液通液工程と、
　前記プレウェット液を通液した後、前記マイクロチャンバー内に気泡が存在するマイクロチャンバーの数を検出する気泡付きマイクロチャンバー検出工程と、
　前記気泡付きマイクロチャンバー検出工程で検出された気泡状態の空気の合計量Ａを算出する気泡空気体積算出工程と、
　前記気泡空気体積算出工程で得られた前記気泡状態の空気の合計体積Ａと、前記プレウェット液中に既に溶解している空気の体積Ｂとの和から、（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出し、この算出された値に常圧Ｐを掛けあわせて、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出する作動圧算出工程と、
　前記作動圧算出工程で得られた前記作動圧力Ｘ以上の圧力を前記マイクロ流路に作用させることにより、前記気泡付きマイクロチャンバー内に気泡として存在する空気を前記プレウェット液内に溶かし込む気泡溶解工程と、を有する細胞展開用デバイスの前処理方法。
　また、上述した目的の内少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、細胞展開用デバイスは、以下の通りである。
［８］
　前記方法が実施されている、前処理によりマイクロチャンバーがプレウェット液で満たされた細胞展開用デバイス。
　さらに、上述した目的の内少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、細胞展開用デバイスの前処理システムは、以下の通りである。
［９］
　複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスと、細胞検出装置と、制御手段とを備え、
　前記細胞検出装置は、少なくとも、前記細胞展開用デバイスに供給されるプレウェット液と細胞懸濁液とが貯留された薬液収容器ホルダーと、
　前記細胞展開用デバイスと前記薬液収容器ホルダーとの間に移動可能に配置された通液系機構とを備え、
　前記制御手段は、少なくとも、前記細胞展開用デバイス内にプレウェット液が通液された後、前記マイクロチャンバー上に気泡状態で存在する空気の合計量Ａを前記プレウェット液に溶解させるのに必要な作動圧力Ｘを算出する作動圧算出手段と、
　前記薬液収容器ホルダーに貯留されたプレウェット液を、前記薬液通液機構を介して前記細胞展開用デバイス内に通液した後、前記作動圧算出手段で算出された作動圧力Ｘ以上の圧力を前記細胞展開用デバイス内に作用させ、これにより、前記プレウェット液を通液したときに前記マイクロチャンバー上に付着した気泡状態の空気の合計量Ａを、前記プレウェット液内に溶解させるように処理する、細胞展開用デバイスの前処理システム。
　本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法によれば、細胞展開用デバイスのマイクロチャンバーチップ上にプレウェット液を通液する場合に、細胞回収の阻害要因となる気泡をプレウェット液中に溶解して、マイクロチャンバー内をプレウェット液で確実に充填することができる。これにより、後に細胞懸濁液を展開した場合に、各マイクロチャンバー内を細胞懸濁液で確実に満たすことが可能となり、細胞の回収率および希少細胞の検出結果の信頼性を向上させることができる。
　また、本発明に係る細胞展開用デバイスによれば、実質的に全てのチャンバーがプレウェット液で予め満たされているため、速やかに細胞懸濁液の展開のために用いることができる。
　さらに、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システムであれば、その機能を従来の細胞回収システムおよび細胞観察システムと統合することが可能であるため、細胞回収および細胞観察に先立って速やかに細胞展開用デバイスをそのために適した状態にすることができる。一方で、細胞回収および細胞観察に適した状態の商品として出荷することのできる本発明に係る細胞展開用デバイスを、低コストで、工業的に連続して大量生産することも可能である。
図１は、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスを示した概略平面図である。 図２は、マイクロチャンバーチップにブロッキング剤を塗布したときのマイクロチャンバーチップの概略図である。 図３は、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスの前処理方法における各工程を示すフローチャートである。 図４は、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスの前処理方法を実施した場合の細胞展開用デバイスの内部の様子を模式的に示す概略断面図である。同図（Ａ）はマイクロチャンバーチップ形成工程を経て得られた細胞展開用デバイスの断面図、同図（Ｂ）は同図（Ａ）の細胞展開用デバイスにプレウェット液を通液して気泡が残存した状態を示す断面図、同図（Ｃ）は同図（Ｂ）のマイクロ流路内に圧力を加えたときの断面図、同図（Ｄ）は同図（Ｃ）からさらに圧力が加えられて、気泡が完全に溶解したことを示す断面図である。 図５は、細胞展開用装置および細胞観察用装置としての機能も兼ね備えた、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システムの概略図である。 図６は、エタノール濃度と、気泡を有するマイクロチャンバーの存在割合との関係を示すグラフである。 図７は、従来の細胞展開用デバイスの概略図である。 図８は、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法が適用される細胞展開用デバイスを、流体が流れる方向に沿って切断した模式的断面図であり、図１のＸ－Ｘ線方向の概略断面図である。 図９は、図８に示した細胞展開用デバイスにプレウェットを通液し、マイクロチャンバー上に気泡が付着している状態を示す拡大断面図である。
　以下、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスの前処理方法、細胞展開用デバイス、および細胞展開用デバイスの前処理システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。
　［細胞展開用デバイス］
　先ず、本発明に係る前処理方法が適用される細胞展開用デバイスについて説明する。
　図１は、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスの前処理方法が適用される細胞展開用デバイス３０を示した概略図である。
　なお、図１に示した細胞展開用デバイス３０の断面は、図８と略同一であるので、断面については図８を参照して説明する。
　図１および図８に示したように、細胞展開用デバイス３０は、複数のマイクロチャンバー４が形成されたマイクロチャンバーチップ２と、複数のマイクロチャンバー４上に一つのマイクロ流路５が形成されるように、枠状のシール部材３４を介して配置された流路形成枠体８と、流路形成枠体８に設けられた入口部３と、入口部３からマイクロ流路５に導入された細胞懸濁液をマイクロ流路５から導出させるために流路形成枠体８に設けられた出口部７などとを有する。
　マイクロチャンバーチップ２は、マイクロチャンバーアレイ〔ＭＣＡ〕とも称され、この実施の形態では、長さＪ、幅Ｈからなる範囲にマイクロチャンバー４が１０００～３００００個以上形成されている。
　また、マイクロチャンバー４が形成される領域の長さＪは１０ｍｍ以上であり、マイクロ流路５の断面積は５ｍｍ2以下である。
　マイクロチャンバー４とは、一個以上の細胞を「収容」し、「保持」することができる凹状の微細穴をいい、有底であることが好ましい。
　ここで、「保持」とは、マイクロチャンバー４に収容された細胞が、細胞展開用のマイクロチャンバーチップ２のマイクロ流路５に対する染色液や洗浄液の通液等によってマイクロチャンバー４の外方に出難いことをいう。
　また、マイクロチャンバー４の開口上部の直径は、２０～５００μｍであることが好ましい。該直径が２０～５００μｍの範囲内であると、マイクロチャンバー４内に好適に細胞を収容、保持することができる。
　マイクロチャンバー４の深さは、マイクロチャンバー１つあたりに細胞を１０～１５個程度収容できることが好ましく、典型的には、マイクロチャンバー４の深さは、１０～２５０μｍである。
　マイクロチャンバー４の形状は、底部が平坦な逆円錐形であるが、これに限定されない。
　マイクロチャンバーチップ２の材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕、ポリメチルメタクリレート〔ＰＭＭＡ〕、環状オレフィンコポリマー〔ＣＯＣ〕などのポリマーが挙げられる。マイクロチャンバーチップ２は、成形されたポリマーに、金属、ガラス、石英ガラスなどからなる基板を貼り合わせたような複数の材料を組み合わせたものであってもよい。
　マイクロ流路５は、細胞懸濁液をマイクロチャンバーチップ２上で流通させることが可能なものであれば、この例に限定されない。
　図１に示した細胞展開用デバイス３０では、図８に示したように、マイクロチャンバーチップ２の上面を底面とし、さらに、マイクロチャンバーチップ２の上面側に設けられた流路形成枠体８とシール部材３４とによりマイクロ流路５が画成されている。
　流路形成枠体８の材料としては、例えばマイクロチャンバーチップ２と同じ材料を用いることが好ましい。
　このマイクロ流路５は、流路形成枠体８の入口部３と出口部７とに連通しており、入口部３から流入した細胞懸濁液が矢印で示す方向に流れて、出口部７から導出できるようになっている。
　［前処理方法］
　以下、図３、図４（Ａ）～（Ｄ）を参照しながら、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法について、また図５を参照しながら、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システムについて説明する。
　図３に示したように、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法は、マイクロチャンバーチップ形成工程Ｃと、プレウェット液通液工程Ｄと、気泡付きマイクロチャンバー検出工程Ｅと、気泡空気体積算出工程Ｆと、作動圧算出工程Ｇと、気泡溶解工程Ｈとを有し、これらの工程をこの順番で行う方法である。マイクロチャンバーチップ形成工程Ｃを経た後の細胞展開用デバイスは図４（Ａ）に示され、プレウェット液通液工程Ｄを経た後の細胞展開用デバイスは図４（Ｂ）に、気泡溶解工程Ｈを始めたときの細胞展開用デバイスは図４（Ｃ）に、気泡溶解工程Ｈを経た後の細胞展開用デバイスは図４（Ｄ）に、それぞれ示されている。
　本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法によれば、図３に示した各工程をこの順番で行うことにより、例えば、図４（Ｂ）に示したように、プレウェット液をマイクロ流路５に通液した場合にマイクロチャンバー４上に付着してしまった気泡９を、図４（Ｄ）に示したようにプレウェット液１１内に全て溶解させることが可能となる。これにより、細胞展開用デバイス３０の濡れ性を向上させることができる。
　＜プレウェット液＞
　プレウェット液としては、水と相溶性のある有機溶媒の水溶液を用いることができる。例えば、エタノール水溶液であることが好ましく、特には３０容量％以下のエタノール水溶液であることが好ましい。このような濃度のエタノール水溶液であれば、例えば、図２に示したように、マイクロチャンバー４の底面３２以外の部分に、細胞の付着を防止するブロッキング剤５０を付着させた場合であっても、ブロッキング効果が損なわれることは少ない（例えば、特許文献１参照）。なお、「濃度が３０容量％以下の有機溶媒（エタノール）水溶液」には、当該有機溶媒（エタノール）の濃度が０容量％に相当する、純水、生理食塩水、緩衝液その他の水溶液自体も包含される。
　＜細胞懸濁液＞
　細胞懸濁液は、希少細胞を含んでいる可能性がある、例えばヒトなどの血液、リンパ液、組織液、体腔液などであり、希釈液などで適宜希釈されていてもよい。また、細胞懸濁液は、生体由来のものに限定されず、試験・研究等のために人工的に細胞を懸濁させて調製した細胞の分散液であってもよい。特に、血液から赤血球を分離した後の細胞懸濁液を適用することがＣＴＣ等の希少細胞の回収・検出には好適である。
　希少細胞としては、例えば癌細胞などが挙げられる。特に、細胞懸濁液が血液または血液由来検体である場合、希少細胞は、ＣＴＣ〔循環腫瘍細胞または循環癌細胞〕、ＣＥＣ〔循環血管内皮細胞〕およびＣＥＰ〔循環血管内皮前駆細胞〕のいずれか一種以上の細胞であってもよい。
　このような細胞懸濁液に含まれる種々の細胞の直径は、１０～１００μｍであることが好ましいが、少なくともマイクロチャンバー４の直径より小さいことが必要である。
　上記マイクロチャンバーチップ形成工程Ｃでは、少なくとも、マイクロチャンバー４が形成される領域のマイクロ流路５の体積Ｖと、その領域内に形成されるマイクロチャンバー４の体積の総和Ｗとを算出することのできる情報が予め設定される。
　例えば、マイクロチャンバー４が長方形の領域に形成されている場合、前記マイクロ流路５の体積Ｖは、マイクロチャンバー４が形成される領域の長さＪおよび幅Ｑと、マイクロ流路５の高さＨとから、式：Ｖ＝Ｊ×Ｑ×Ｈにより算出することができる。
　また、前記マイクロチャンバー４の体積の総和Ｗは、前記領域内に形成されるマイクロチャンバー４の総数Ｎと、マイクロチャンバー１個当たりの体積Ｕとから、式：Ｗ＝Ｕ×Ｎにより算出することができる。マイクロチャンバー１個当たりの体積Ｕは、例えばマイクロチャンバー５が円柱の形状である場合、マイクロチャンバー４の直径Ｌと深さＤとから、式：Ｕ＝π（Ｌ／２）2Ｄにより算出することができる。
　これら設定された値は、既知情報として、例えば図５に示した細胞展開用デバイスの前処理システム２００の制御手段１９０などに保存される。上記プレウェット液通液工程Ｄは、マイクロチャンバー４の濡れ性を向上させて、細胞懸濁液でマイクロチャンバー４を満たすことができるようにするために、マイクロ流路５内に予めプレウェット液１１を通液する（プレウェット液を送液して、マイクロチャンバー４の内部に空気は残存しているものの、それを除いてマイクロ流路がプレウェット液１１で満たされた状態とする）工程である。
　プレウェット液通液工程Ｄでは、入口部３から出口部７に向かうプレウェット液１１の一方向の流れで行っても良いが、入口部３からプレウェット液１１の導入と吸引を交互に行って両方向の流れで行っても良い。
　上記気泡付きマイクロチャンバー検出工程Ｅは、プレウェット液通液工程Ｄによりマイクロ流路５内にプレウェット液１１を通液したときに、マイクロチャンバー４の内部に気泡９が存在する（マイクロチャンバー４の底面に気泡９が付着している）マイクロチャンバー４の数ｎを検出する工程である。マイクロチャンバー４上に付着した気泡９の検出は撮像装置などで行うことができる。撮像装置を介して行う場合には、単位面積（視野面積）当たりの気泡数を測定して、その単位面積内で気泡が残存するマイクロチャンバー４の割合を算出し、それをマイクロチャンバー４が形成される領域全体で気泡が残存するマイクロチャンバー４の割合Ｒとみなし、前記内部に気泡９が残存するマイクロチャンバー４の数ｎを、式：ｎ＝Ｎ×Ｒにより算出することができる。また、その情報は制御手段１９０などに保存される。
　気泡空気体積算出工程Ｆは、気泡付きマイクロチャンバー検出工程Ｅで検出された気泡状態の空気体積（容積）の合計量Ａを算出する工程である。この気泡状態の空気体積の合計量Ａの算出は、各種データが保存された制御手段１９０などにより行われ、制御手段１９０などに保存される。例えば、マイクロチャンバー４の１個あたりの内部に残存する気泡９の体積を、マイクロチャンバー４の１個あたりの体積Ｕとみなせば、気泡状態の空気体積の合計量Ａは、式：Ａ＝Ｕ×ｎで算出することができる。
　上記作動圧算出工程Ｇは、気泡空気体積算出工程Ｆで得られた気泡状態の空気の合計体積Ａと、プレウェット液１１中に既に溶解している空気の溶解体積Ｂから、（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出し、この算出された値に常圧Ｐを掛けあわせて、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出する工程である。
　作動圧力Ｘは、気泡９として残存する空気泡を全てプレウェット液１１内に溶解させるために、マイクロ流路内に印加する圧力であり、以下のような原理に基づいて求められる値である。ヘンリーの法則により、気体の溶解度は圧力に比例するため、常圧Ｐにおいて体積Ｂの空気が溶解しているプレウェット液１１中には、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂ（＞Ｐ）において、気泡９として残存する空気泡の体積Ａと、既にプレウェット液１１中に溶解している空気の体積Ｂの合計体積Ａ＋Ｂを溶解させることができる。ボイルの法則より、一定温度における気体の体積は、圧力に反比例するため、体積が（Ａ＋Ｂ）／Ｂ倍の場合は、少なくとも、常圧Ｐの（Ａ＋Ｂ）／Ｂ倍の作動圧力Ｘを掛ければ良い。また、溶解させるためには作動圧力Ｘ以上の圧力をかけても良いが、マイクロチャンバー部に対して破損等を生じない程度の圧力にする必要がある。
　ここで、試薬収容器に収容したプレウェット液１１が、脱気していない通常の状態のものである場合、その試薬収容基に収容したプレウェット液１１中に既に溶解している空気の体積Ｂ0がそのまま、前記式に用いられるＢとなる。このような脱気していないプレウェット液１１を用いた場合の、プレウェット液通液工程後のマイクロチャンバー内の残存気泡量をＡ0とおく。
　一方、試薬収容器には、予め脱気することで溶解している空気の体積が実質的にゼロである状態のプレウェット液１１を収容しておくこともできる。このような脱気したプレウェット液１１を用いた場合の、プレウェット液通液工程後のマイクロチャンバー内の残存気泡量Ａ1はおよそＡ0－Ｂ0となり、脱気していないプレウェット液を用いた場合の残存気泡量Ａ0に比べて少なくすることができ、その結果作動圧力Ｘを低くすることができる。Ａ0－Ｂ0≦０のときは、残存気泡量Ａ1は実質的にゼロになり、気泡溶解工程Ｈはもはや必要なくなる。したがって、Ａ1＝Ａ0－Ｂ0＞０のときだけ、上記式のＡにＡ1を代入し、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出し、気泡溶解工程Ｈを実施すればよい。また、このプレウェット液通液工程によって、試薬収容器に収容された状態では実質的にゼロであったプレウェット液への空気の溶解体積はＢ0となり、このＢ0を前記式のＢとすることになる。
　この作動圧力Ｘの算出も、制御手段１９０で行うことができ、得られた情報は制御手段１９０などに保存される。
　上記気泡溶解工程Ｈは、作動圧算出工程Ｇで得られた作動圧力Ｘ以上の圧力をマイクロ流路５に作用させることにより、気泡付きマイクロチャンバー上に気泡９として存在する空気をプレウェット液１１内に溶かし込む工程である。
　＜圧力の印加方法＞
　気泡溶解工程Ｈは、通液系機構１１０に具備された圧力ポンプなどにより行われる。また、細胞検出装置１００（通液系機構１１０）および制御手段１９０は、所定の圧力がプレウェット液に印加されることを確実なものとするために、マイクロ流路内の圧力の測定機構（図示せず）およびその制御プログラムを備えていることが好ましい。
　代表的には、次の２通りの方法で、所定の作動圧力Ｘをマイクロ流路内のプレウェット液に印加することができる。
　（１）マイクロ流路内にプレウェット液を通液した後、出口部７を封止してから、さらに通液系機構１１０によりプレウェット液を押し出すようにする。通液系機構１１０による吐出操作を繰り返す（所定の時間続ける）ことにより、徐々にプレウェット液に印加される圧力を高め、所定の作動圧力Ｘに到達させることができ、到達すればその操作を止めればよい。
　このような（１）の実施形態を採用する場合、細胞検出装置１００は、出口部封止機構（図示せず）を備え、制御手段１９０は、所定のタイムスケジュールで自動的に、当該出口部封止機構により出口部７を封止し、通液系機構１１０でプレウェット液１１を押すよう操作することのできる制御プログラムを実行可能なものとすることが好ましい。
　（２）マイクロ流路内にプレウェット液を通液させる時から、あるいは通液した後、出口部７を封止せず開放したまま、通液系機構１１０によりプレウェット液を高流量でマイクロ流路中を移動させる。プレウェット液の移動は、通液系機構による吐出および／または吸引により行うことができ、移動の方向は、一方向でもよいし、双方向（往復送液）でもよい。少なくとも所定の作動圧力Ｘを生み出すために必要なプレウェット液の流量は、通液系機構１１０にとって適切な流量の範囲内に収まっていることが好ましいが、もしもその範囲外にある場合でも、通液系機構１１０の流量を適切な範囲内で設定した上で、所定の時間、吐出および／または吸引することで、所定の作動圧力Ｘを生み出すことが可能である。
　このような（２）の実施形態を採用する場合、制御手段１９０は、所定のタイムスケジュールで自動的に、通液系機構１１０でプレウェット液１１を所定の高流量で移動させるよう操作することのできる制御プログラムを実行可能なものとすることが好ましい。また、細胞展開用デバイス３０の出口部７は、マイクロ流路内のプレウェット液に圧力がかかりやすくするよう、面積が小さいものの方が好ましい。
　以上のように、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法では、上記の各工程（Ｃ）～（Ｈ）を連続的に行うことにより、全てのマイクロチャンバー４をプレウェット液１１で満たした細胞展開用デバイスを提供することができる。すなわち、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法では、細胞展開用デバイス３０のマイクロ流路５内に、単にプレウェット液１１を通液しただけでは、図９に示したようにマイクロチャンバー４内に気泡９が残存してしまうので、このマイクロ流路５内に常圧より大きい圧力を印加することにより、気泡９をプレウェット液中に溶解させている。
　［前処理システム］
　以下に、本発明に係る前処理方法を実施するのに好適な細胞展開用デバイスの前処理システム２００について説明する。
　前処理システム２００は、細胞展開用デバイス３０と、試薬収容器２０と、細胞検出装置１００と、制御手段１９０などとから構成されている。細胞展開用デバイス３０および試薬収容器２０は、細胞検出装置１００にセットして用いられ、また制御手段１９０は細胞検出装置１００を制御可能なよう接続して用いられる。
　細胞検出装置１００は、細胞展開用デバイス３０のマイクロ流路５に、各種の液体を通液するための通液系機構１１０、撮像装置１２０、細胞展開用デバイス３０を保持する細胞回収デバイスホルダー１６０、試薬収容器を保持する試薬収容器ホルダー１７０、ならびに細胞検出装置１００が備える各種の機器類を制御するための制御手段１９０を備える。通液系機構１１０および撮像装置１２０は、任意の位置で液の吸引・吐出および細胞観察を可能にするための空間的な移動手段を備えることが望ましい。
　通液系機構１１０は、制御手段１９０の制御により、試薬収容器２０内に貯留されたプレウェット液１１や細胞懸濁液の他、染色液、解離液、洗浄液、その他の試薬類のそれぞれの収納部と、細胞展開用デバイス１０の入口部３との間を移動し、それらの液の吸引および吐出を行う機構である。具体的には、通液系機構１１０によって、試薬収容器に収容されているプレウェット液１１、細胞懸濁液などの液体を所定の量吸引し、細胞展開用デバイス３０の入口部３で所定の流量で吐出して、マイクロ流路５に導入する。
　また、通液により所定の処理が終わった後は、マイクロ流路５を満たしていた液体を入口部３から吸引して排出し、試薬収容器２０の廃液収納部で吐出する。通液系機構１１０は、例えば、シリンジポンプ、交換可能なチップ、Ｘ軸方向（図５の左右方向）およびＺ軸方向（図５の上下方向）に移動可能なアクチュエーターなどを用いて構築することができる。シリンジポンプは、細胞観察に関する各工程において、所望の流量で吸引および吐出ができる能力を有する。
　撮像装置１２０は、対物レンズ、対眼レンズ、ＣＣＤカメラなどを含む蛍光顕微鏡に準じた形態とし、マイクロチャンバー４に付着した気泡９を撮影することができる。
　制御手段１９０としては、細胞検出装置１００の各種の機器類に接続され、それらの機器類の制御プログラムを実行可能なパーソナルコンピュータを用いることができる。制御プログラムは、パーソナルコンピュータが内蔵する記憶媒体に記憶されていても良いし、ネットワークまたは取り外し可能な記憶媒体を介してパーソナルコンピュータが利用できる状態に置かれていても良い。
　制御プログラムは、気泡空気９の検出や作動圧力Ｘの算出、作動圧力Ｘをマイクロ流路５に作用させる操作などを、各種データから自動化して求めることができるものである。また、細胞観察のための所定の工程に従って、所定のタイムスケジュールで、プレウェット液１１や細胞懸濁液などを通液するよう通液系機構１１０を操作したりできるものである。
　本発明の好ましい実施の形態では、制御手段１９０により作動圧力Ｘを算出するようにしているが、本発明は、これに限定されない。
　プレウェット液１１の通液により気泡９が残存するマイクロチャンバー４の割合は、用いるプレウェット液の実施形態によって一定の傾向が定まっており、例えばプレウェット液としてエタノール水溶液を用いる場合、当該プレウェット液中のエタノールの濃度によって図６のように定まることが実験の結果から明らかである（なお、図６では、複数回の実験結果の中から最大値を採用している）。そのため、予め用意された図６のグラフに基づいて、気泡９が付着するマイクロチャンバー４の割合を仮定し、これにマイクロチャンバー４の体積を掛けあわせることで残存する気泡状態の空気の合計量Ａを算出することもできる。
　このように、本発明では、制御手段１９０に図６の情報を記憶させておき、この情報から作動圧力Ｘを近似的に求めることもできる。
　試薬収容器２０には、プレウェット液１１、細胞懸濁液、洗浄液など、細胞観察を行う上で流路１に通液する必要のある各種の液体が収容されている。
　本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システム２００によれば、本発明に係る前処理方法を容易に実施することができ、これにより実質的に全てのマイクロチャンバーがプレウェット液で予め満たされた細胞展開用デバイスを作製することができる。
　なお、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システム２００では、マイクロ流路５内の温度を室温あるいは定められたある温度で一定に維持するものであってもよいが、細胞展開用デバイス３０のマイクロ流路５内にプレウェット液１１を通液した後に、プレウェット液１１の温度を、例えば４～１０℃程度に下げるように設定することが好ましい。プレウェット液１１の温度を下げるように通液後に冷却すれば、マイクロ流路５に通液した後に残存した気泡９は、温度低下により体積が減少するため、気泡状態の空気の合計体積Ａが少なくなり、また水（プレウェット液）の温度が低いほど空気の飽和溶解量が増加するので、結果として、作動圧力Ｘを低くすることができる。
　このような実施形態を採用する場合、細胞検出装置１００（細胞回収デバイスホルダー１６０）は、例えば冷却用プレートや小型の温度センサーを含む温度調節機構（図示せず）を備え、制御手段１９０は、当該温度調節機構により所定のタイムスケジュールで自動的にプレウェット液１１の温度を下げるよう操作することのできる、温度調節用の制御プログラムを実行可能なものとすることが好ましい。
　＜比較例１：純水をプレウェットとして、低流量（１ｍｌ／ｍｉｎ）で通水した場合＞
　幅１５ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ４３ｍｍのマイクロ流路５の底面に、直径０．１２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの円柱状のマイクロチャンバー４が１４０００個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路５中に、シリンジポンプを用いて１ｍｌ／ｍｉｎで１００μｌの純水（エタノール濃度０％）をゆっくりと通液した。顕微鏡で観察した画像より、チャンバー数の全体の約９９％のチャンバーに気泡が残存し、プレウェット液が満たされていない状態が生じた。
　＜比較例２：３０％エタノール水溶液を低流量（シリンジポンプ：１ｍｌ／ｍｉｎ）で通水した場合＞
　幅１５ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ４３ｍｍのマイクロ流路５の底面に、直径０．１２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの円柱状のマイクロチャンバー４が１４０００個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路５中に、シリンジポンプを用いて１ｍｌ／ｍｉｎで１００μｌの３０％のエタノール水溶液をゆっくりと通液した。顕微鏡で観察した画像より、チャンバー数の全体の約１５％のチャンバーに気泡が残存し、プレウェット液が満たされていない状態が生じた。
　＜実施例１：出口部を封止して圧力を掛けた場合＞
　幅１５ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ４３ｍｍのマイクロ流路５の底面に、直径０．１２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの円柱状のマイクロチャンバー４が１４０００個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路５中に、シリンジポンプを用いて１ｍｌ／ｍｉｎで１００μｌの純水をプレウェット液としてゆっくりと通液した。顕微鏡で観察した画像より、約９９％のチャンバーに気泡が残存したことが確認できた。チャンバー１個当たりの残存空気泡の体積が約０．８nlで、１４０００個のマイクロチャンバーの９９％に空気泡が残存しているため、その体積の合計量Ａは約１１nlであった。２５℃の室温における空気の溶解度が、１ｃｍ3中純水で約０．０２ｃｍ3であるとする（理科年表より）と、マイクロ流路体積８６μｌ中のプレウェット液には既に約１．５μｌ（Ｂ）の空気が溶解していると考えられるため、全ての空気を溶解するためには、（Ａ＋Ｂ）／Ｂ＝約８となり、少なくとも常圧Ｐの８倍の空気（８Ｐ）を印加する必要があることがわかった。事前に、出口部７を封止したシリンジ（ハミルトン社製、容量１ｍｌ）の駆動量と内部圧力の関係を圧力センサ（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で測定し、プレウェット液（純水）が入った状態のマイクロ流路５内が９Ｐの圧力となるように、シリンジとシリンジポンプ（マイクロシリンジポンプ）で印加した。再度顕微鏡で画像を撮影したところ、約９９％のマイクロチャンバーがプレウェット液で満たされていた。
　＜実施例２：出口部を開放した状態で高流量（シリンジポンプ：４０ｍｌ／ｍｉｎ）でプレウェットした場合＞
　幅１５ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ４３ｍｍのマイクロ流路５の底面に、直径０．１２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの円柱状のマイクロチャンバー４が１４０００個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路５にプレウェット液として純水を通液した場合、全てのマイクロチャンバーに、空気の気泡が残存することを仮定し、マイクロチャンバー１個当たりの残存空気泡の体積が約０．８ｎｌで、１４０００個のチャンバーがあるため、その体積の合計量Ａは約１１μｌと算出された。２５℃の室温における空気の溶解度が、１ｃｍ3中純水で約０．０２ｃｍ3であるとする（理科年表）と、マイクロ流路体積８６μｌ中のプレウェット液には常圧で約１．５μｌ（Ｂ）の空気が溶解していると考えられるため、全ての空気を溶解するためには、少なくとも（Ａ＋Ｂ）／Ｂ＝約８倍の圧力を印加する必要があることが分かった。流量は、マイクロシリンジポンプで制御した。マイクロ流路デバイスの耐圧性を考慮して、４０ｍｌ／ｍｉｎの流量を設定し、出口部７を開放したマイクロ流路５に設置したシリンジ（テルモ社製、容量５０ｍｌ）とマイクロ流路５との間にかかる圧力を圧力センサ（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で測定した。約１分間ポンプを駆動させることで、内部圧力が常圧Ｐの約９倍（９Ｐ）となることが分かったため、ポンプの設定流量を４０ｍｌ／ｍｉｎとして１分間（４０ｍｌ）、純水をプレウェット液としてマイクロ流路５に通液して圧力を印加した。再度顕微鏡で画像を撮影したところ、約９９％のマイクロチャンバーがプレウェット液で満たされていた。
２　　　マイクロチャンバーチップ
３　　　入口部
４　　　マイクロチャンバー
５　　　マイクロ流路
７　　　出口部
８　　　流路形成枠体
９　　　気泡
１１　　プレウェット液
２０　　試薬収容器
３０　　細胞展開用デバイス
３４　　枠状のシール部材
１００　細胞検出装置
１１０　通液系機構
１２０　撮像装置
１７０　試薬収容器
１９０　制御手段
２００　細胞展開用デバイスの前処理システム
Ｂ　　　既に溶解している空気の溶解量
Ｃ　　　マイクロチャンバーチップ形成工程
Ｄ　　　プレウェット液通液工程
Ｅ　　　気泡付きマイクロチャンバー検出工程
Ｆ　　　気泡空気体積算出工程
Ｇ　　　作動圧力算出工程
Ｈ　　　気泡溶解工程
Ｊ　　　長さ
Ｘ　　　作動圧力

Claims (9)

  1. 　マイクロ流路の底面に複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおいて、プレウェット液通液工程後にマイクロチャンバー内に残存する気泡を除去するための、細胞展開用デバイスの前処理方法であって、
    　前記マイクロチャンバーの１個当たりの体積と、前記マイクロチャンバーの総数とが予め設定されるマイクロチャンバーチップ形成工程と、
    　前記マイクロチャンバーチップ形成工程で得られた前記複数のマイクロチャンバーの上部に形成されているマイクロ流路にプレウェット液を通液するプレウェット液通液工程と、
    　前記プレウェット液を通液した後、前記マイクロチャンバー内に気泡が存在するマイクロチャンバーの数を検出する気泡付きマイクロチャンバー検出工程と、
    　前記気泡付きマイクロチャンバー検出工程で検出された気泡状態の空気の合計量Ａを算出する気泡空気体積算出工程と、
    　前記気泡空気体積算出工程で得られた前記気泡状態の空気の合計体積Ａと、前記プレウェット液中に既に溶解している空気の体積Ｂとの和から、（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出し、この算出された値に常圧Ｐを掛けあわせて、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出する作動圧算出工程と、
    　前記作動圧算出工程で得られた前記作動圧力Ｘ以上の圧力を前記マイクロ流路に作用させることにより、前記気泡付きマイクロチャンバー内に気泡として存在する空気を前記プレウェット液内に溶かし込む気泡溶解工程と、を有する細胞展開用デバイスの前処理方法。
  2. 　前記マイクロチャンバーチップは、前記マイクロチャンバーが形成される領域の長さが１０ｍｍ以上であり、かつその領域内に１０００～３００００個のマイクロチャンバーが形成されている請求項１に記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
  3. 　前記マイクロ流路の断面積が５ｍｍ2以下である請求項１または２に記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
  4. 　前記マイクロチャンバーの開口上部の直径が２０～５００μｍ、深さが１０～２５０μｍである請求項１～３のいずれかに記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
  5. 　前記プレウェット液は、予め脱気されている請求項４に記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
  6. 　前記プレウェット液は、濃度が３０容量％以下のエタノール水溶液である請求項１～５のいずれかに記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
  7. 　前記マイクロ流路内の温度が４～１０℃になるように、前記プレウェット液が通液された後に冷却される請求項１～６のいずれかに記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
  8. 　請求項１～７のいずれかの方法が実施されている、前処理によりマイクロチャンバーがプレウェット液で満たされた細胞展開用デバイス。
  9. 　複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスと、細胞検出装置と、制御手段とを備え、
    　前記細胞検出装置は、少なくとも、前記細胞展開用デバイスに供給されるプレウェット液と細胞懸濁液とが貯留された薬液収容器ホルダーと、
    　前記細胞展開用デバイスと前記薬液収容器ホルダーとの間に移動可能に配置された通液系機構とを備え、
    　前記制御手段は、少なくとも、前記細胞展開用デバイス内にプレウェット液が通液された後、前記マイクロチャンバー上に気泡状態で存在する空気の合計量Ａを前記プレウェット液に溶解させるのに必要な作動圧力Ｘを算出する作動圧算出手段と、
    　前記薬液収容器ホルダーに貯留されたプレウェット液を、前記薬液通液機構を介して前記細胞展開用デバイス内に通液した後、前記作動圧算出手段で算出された作動圧力Ｘ以上の圧力を前記細胞展開用デバイス内に作用させ、これにより、前記プレウェット液を通液したときに前記マイクロチャンバー上に付着した気泡状態の空気の合計量Ａを、前記プレウェット液内に溶解させるように処理する、細胞展開用デバイスの前処理システム。
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