JPWO2016121574A1 - 相互作用する分子を有する血中細胞の同時検出方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、各々相互作用している第一の目的細胞上に発現した分子（分子Ａ）と第二の目的細胞上に発現した分子（分子Ｂ）について、両者の発現状態（発現有無・発現量）を同一基準で測定するために、第一の目的細胞および第二の目的細胞に関する情報を同時に検出する方法を提供することを課題とする。かかる課題を解決するための本発明の方法は、赤血球を除去した血液を細胞展開用基板に添加し、第一の目的細胞と第二の目的細胞に対する各マーカーおよび核マーカーを染色してそれぞれの蛍光画像を取得し、それらの蛍光画像から第一の目的細胞と第二の目的細胞を同定し、さらに分子Ａを発現している第一の目的細胞と分子Ｂを発現している第二の目的細胞を検出することにより、分子Ａおよび分子Ｂの各発現量情報を同時に解析することができる。

Description

本発明は、第一の目的細胞と第二の目的細胞の両者に対して同時に検出を行う方法に関する。

血液中には通常、赤血球、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球）などの血液細胞が含まれているが、さらに循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＣｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、その他の前駆細胞などの稀少細胞が含まれている場合がある。また、培養されている細胞集団には、幹細胞、特定の分化細胞、その他の特徴的な細胞が含まれている場合がある。

たとえばＣＴＣは、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌などの患者の血中に見出される細胞であり、その数は癌の転移性を反映しているなど、臨床上の重要な情報になることで注目されている。しかしながら、血液中のＣＴＣの密度は極めて低く（少ない場合、全血１０ｍＬあたり１〜１０個程度）、その検出および計数は容易ではない。

ＣＴＣ等の稀少細胞や特徴的な細胞の検出をする際に、核染色や蛍光染色などを行い、血液中からＣＴＣ等を検出する方法などが知られている。

その際に、顕微鏡観察や染色を行いやすい状態にするため、たとえば、細胞を収容し保持することができるマイクロチャンバーまたは溝を表面に有する基板上に流路形成枠体を設置して作製された、細胞展開用デバイスを用いて、細胞懸濁液中の細胞を展開するシステムが用いられている（たとえば特許文献１参照）。

このような手段を用いてＣＴＣが発現しているバイオマーカーのプロファイリングを行うことは、その原発性がんのバイオマーカーのプロファイリングとの比較を通じて転移のメカニズムを解明したり、有用な抗がん剤（分子標的薬）を判定したり、ＣＴＣの亜集団（上皮細胞、間葉系細胞、幹細胞などの特性を有するＣＴＣ）を特定したりなど、様々な観点からＣＴＣの研究を進めるためにも重要である。

近年、がん免疫療法において、白血球を標的とする治療薬の開発が活発になっている。免疫システムにより、白血球（Ｔ細胞）はがん細胞を特異的に攻撃することができるが、白血球上に発現したＰＤ−１分子と、がん細胞上に発現したＰＤ−Ｌ１分子とが相互作用すると、免疫が抑制されることが知られている（非特許文献１）。そのため、白血球上に発現したＰＤ−１分子に結合してがん細胞上に発現したＰＤ−Ｌ１分子との相互作用を阻害する物質、たとえば抗ＰＤ−１抗体を有効成分とする、上記の機構による免疫抑制を解除する治療薬が開発されている。これとは逆に、がん細胞上に発現したＰＤ−Ｌ１分子に結合して白血球上に発現したＰＤ−１分子との相互作用を阻害する物質、たとえば抗ＰＤ−Ｌ１抗体を有効成分とする治療薬の開発も可能である。

しかしながら、上述した抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体のような治療薬が有効であるためには、白血球上および癌細胞上にそれぞれＰＤ−１分子およびＰＤ−Ｌ１分子が発現していることによって、免疫が抑制されている状況にあることが前提となる。たとえば、白血球上にＰＤ−１分子が発現していても、がん細胞にＰＤ−Ｌ１分子が発現していなければ、そもそも免疫抑制されずに白血球が、がん細胞を攻撃できるはずであるため、抗ＰＤ−１抗体や抗ＰＤ−Ｌ１抗体のような免疫抑制の解除を目的とした治療薬ではなく、他の作用機序に関係する抗がん剤や白血球の免疫増強剤などが有効な治療薬となり得る。このことは、がん細胞にＰＤ−Ｌ１分子が発現していても、白血球上にＰＤ−１分子が発現していない場合にも当てはまる。

このように、２種類の細胞の相互作用に関係する治療薬の投与判断には、治療薬が対象とする分子がどちらの細胞上に存在していても、両方の細胞における分子発現の情報を同時に調べる必要がある。たとえば、抗ＰＤ−１抗体をがん免疫療法の治療薬とする場合の投与判断には、白血球上の分子（ＰＤ−１）の発現情報だけでなく、ＰＤ−１分子と相互作用するがん細胞上のＰＤ−Ｌ１分子の発現情報も必要となり、がん細胞上にＰＤ−Ｌ１分子が発現していないがん患者に対して抗ＰＤ−１抗体を投与しても治療効果は得られないことが明らかとなっている（非特許文献２）。

従来、血液試料に含まれる様々な細胞からＣＴＣ等の稀少細胞を同定し、解析する方法が知られているが、それらの方法においては、稀少細胞と同時に白血球等の稀少細胞以外の細胞も解析の対象とするようなシステムにはなっていない。たとえば特許文献２には、がん等の患者由来の血液試料を用いて、核および所定の細胞マーカーを染色した蛍光画像や細胞・核の形態画像の画像処理により、ＣＴＣを検出する方法が記載されている。この方法においては、核が染色された細胞をＣＴＣとＣＴＣではない細胞（白血球）の全体とみなしてその合計数を計測することや、所定の細胞マーカーの染色パターンを示した細胞をＣＴＣと同定してその数を計測することが行われ、それらの結果に基づき、細胞の合計数に対するＣＴＣの数の比率や血液試料中のＣＴＣの濃度を算出して、がん等の患者由来の血液試料に含まれるＣＴＣの解析を行っている。しかしながら、ＣＴＣとともにＣＴＣでない細胞も（同定および計数だけでなく）解析の対象とすること、特に細胞表面に所定の分子を発現しているＣＴＣと、その分子と相互作用する所定の分子を細胞表面に発現している白血球の両者を、同一基準で同時に解析することについてはなんら具体的に言及されてはいない。

また、既存のフローサイトメーターによる計測では、理論上は（所定の分子を発現している）ＣＴＣと（所定の分子を発現している）白血球を同時に同定、計数および解析することは可能だが、血液試料中のＣＴＣは非常に数が少ないため検出漏れのおそれがあり、このシステムを用いてＣＴＣが関係する解析を正確に行うことは困難である。

なお、出願人は上述した細胞展開用デバイスを用いて、細胞懸濁液や必要な試薬類を順次流路内に送液することにより、各マイクロチャンバー内において効率的に、そこに回収された細胞に含まれる核酸をＰＣＲ等により増幅する方法を発明しており、その方法等に係る発明について先に出願している（出願番号：特願２０１４−１９１１２９、出願日：平成２６年９月１９日）。

国際公開第２０１４／０６１６７５号 特表２０１３−５０８７２９公報

Nat Rev Cancer. 2012 Mar 22;12(4): 252-64 N Engl J Med 2012; 366:2443-2454June 28, 2012

本発明者は、上述したような課題を解決するために、相互作用している白血球上に発現した分子とＣＴＣ（がん細胞）上に発現した分子について、それぞれの発現状態（発現有無・発現量）を同一基準で測定する意義を見出した。したがって本発明の目的は２種の異なる細胞に関する情報を同時に検出するための方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、各細胞マーカーと核の染色を行い、第一の目的細胞および第二の目的細胞を同定する方法において、さらに、第一の目的細胞と同定した細胞上にある分子Ａと、第二の目的細胞と同定した細胞上にあって、かつＡと結合性をもつ分子Ｂを検出することで、それぞれの発現状態を同一基準で測定し、分子Ａと分子Ｂにおけるそれぞれの発現量情報を解析することが可能になることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は１つの側面において、下記（ａ）〜（ｆ）の各工程を含む血中細胞の同時検出方法：（ａ）患者の血液から赤血球を除去する工程（検体処理工程）；（ｂ）工程（ａ）で処理を行った既定量の血液を細胞展開用基板に添加し、第一の目的細胞および第二の目的細胞を基板上に並べる工程（細胞展開工程）；
（ｃ）第一の目的細胞と第二の目的細胞の各細胞マーカーおよび核マーカーを蛍光体で染色する工程（染色工程）；
（ｄ）工程（ｃ）で染色した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像を取得する工程（画像取得工程）；
（ｅ）工程（ｄ）で取得した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像から、第一の目的細胞および第二の目的細胞を同定する工程（同定工程）；
（ｆ）工程（ｅ）で第一の目的細胞と同定された細胞のうち特定の分子（分子Ａ）を発現している細胞、および工程（ｅ）で第二の目的細胞と同定された細胞のうち分子Ａと相互作用する他の特定の分子（分子Ｂ）を発現している細胞を検出する工程（検出工程）を提供する。

本発明の方法により、第一の目的細胞の分子発現情報と第二の目的細胞の分子発現情報を同一基準で得ることができる。それにより、両者に関わる情報から判定することが必要な、がん免疫療法などの治療の投薬判断の信頼性を向上させることが期待できる。特に検査の結果、互いに相互作用をする第一の目的細胞に発現する分子Ａ（たとえばＣＴＣに発現するＰＤ−Ｌ１）と第二の目的細胞に発現する分子Ｂ（たとえば白血球に発現するＰＤ−１）が共に存在することが判明した場合、分子ＡとＢの相互作用（上記の例では免疫抑制）が生じていると推定できるため、薬剤等で対応を行う必要があると判断できる。また分子ＡもしくはＢのいずれか一方が存在しない場合は、相互作用が生じていないと推定できるため、相互作用を阻害するために一方の分子に作用させる薬剤等の投与は必要ない（その薬剤を投与しても奏功しないので、可能であれば他の薬剤の投与を検討すべきである）と判断できる。

図１は、本発明に係る第一の目的細胞と第二の目的細胞の同時検出方法の一実施形態を示すフローチャートである。

以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
− 第一の目的細胞と第二の目的細胞の同時検出方法 −
本発明における第一の目的細胞と第二の目的細胞の同時検出方法は、少なくとも（ａ）検体処理工程、（ｂ）細胞展開工程、（ｃ）染色工程、（ｄ）画像取得工程、（ｅ）同定工程、および（ｆ）検出工程を含み、必要に応じてさらに（ｇ）データ提示工程を含んでいてもよい。このような検出方法の各工程は、たとえば、図１に示すフローチャートに沿った手順で実施することができる。

（目的細胞）
本発明における目的細胞は二種あり、これらは少なくとも赤血球ではない。第一の目的細胞はたとえば稀少細胞であり、ＣＴＣ、ＣＥＣ、ＣＥＰおよびその他の前駆細胞が含まれ、また、第二の目的細胞はたとえば白血球（リンパ球）である。

（目的分子）
本発明における目的分子は、第一の目的細胞および第二の目的細胞それぞれの細胞表面に発現している２種類の分子（タンパク質、特に第一実施形態においては免疫染色の対象となり得る抗原）であって、互いに相互作用するものを指す。本明細書において、第一の目的細胞が発現する上記特定の分子を「分子Ａ」、第二の目的細胞が発現する上記特定の分子を「分子Ｂ」と表記する。

目的分子は、病理診断など本発明の定量ないし検出方法の用途を考慮しながら選択すればよく、特に限定されるものではない。本発明における典型的な目的分子としては、ＣＴＣ上に発現しＰＤ−１と相互作用するＰＤ−Ｌ１、および白血球（Ｔ細胞)に発現するＰＤ−１が挙げられる。これらの分子は相互作用することによって免疫を抑制することが知られている。

（血液）
本明細書に記載の「血液」は、赤血球細胞、白血球細胞、血小板、内皮細胞、中皮細胞または上皮細胞を含む、全血の任意の成分を含むことを意図する。血液はまた、タンパク質、脂質、核酸および炭水化物などの血漿の成分、および妊娠、臓器移植、感染、外傷または疾患によって血液中に存在する可能性がある任意の他の細胞、たとえばＣＴＣ、ＣＥＣ、ＣＥＰ、その他の前駆細胞などの稀少細胞も含む。

（白血球）
本明細書に記載の「白血球」は、白血球であるか、または網状赤血球もしくは血小板ではない造血系列の細胞である。白血球は、ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球を含む。白血球はまた、単球、マクロファージ、顆粒球などの貪食細胞およびマスト細胞を含む。

（赤血球）
本明細書に記載の「赤血球」は、赤血球であり、特に非有核赤血球細胞を意味する。

（顆粒球）
上述したように、本明細書に記載の「顆粒球」は、白血球に含まれる細胞の一部であり、これには好中球、好酸球および好塩基球が含まれる。

本発明に係る血中細胞の同時検出方法は、工程（ｆ）：検出工程の行い方により、２通りの実施形態を挙げることができる。第一実施形態では、分子Ａと分子Ｂの各蛍光染色に基づいて、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞の検出を行う。第二実施形態では、細胞展開用基板としてマイクロチャンバーを備えたものを使用し、マイクロチャンバー内における分子Ａと分子Ｂの各遺伝子の核酸増幅反応に基づいて、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞の検出を行う。

―第一実施形態―
―工程（ａ）：検体処理工程―
検体処理工程（ａ）は、少なくとも、患者の血液から赤血球を除去する工程である。本発明に使用する検体を調製する際には、赤血球の除去およびその他の必要な前処理をあらかじめ行っておくことが適切である。なお、本明細書において患者とは癌等に罹患している対象のみならず、罹患が疑われる対象も包含する。

（抗凝固処理）
採取されて体外に取り出された血液（全血）は、そのまま空気に触れさせると時間の経過と共に凝固し、そこに含まれる細胞を回収して観察することができなくなる。そのため、採取された血液は直ちに抗凝固処理することが好ましい。

全血用の抗凝固剤としては様々なものが公知であり、一般的な濃度、処理時間等の条件に従って用いることができる。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やクエン酸（ナトリウム塩等の塩を含む）に代表される、キレート作用によりカルシウムイオンと結合し、反応系から除去することによって凝固を阻止するタイプの抗凝固剤や、ヘパリンに代表される、血漿中のアンチトロンビンＩＩＩと複合体を形成してトロンビンの産生を抑制することにより凝固を阻止するタイプの抗凝固剤が挙げられる。このような抗凝固剤があらかじめ収容された採血管を利用してもよい。

また、細胞に対しては、細胞の自己分解や腐敗を遅延させ、その形態や抗原性を保持するための固定化処理；細胞膜の透過性を向上させて細胞の外部から細胞の内部に物質（細胞内にある抗原を標的とする蛍光標識抗体や、核染色剤等）が浸透しやすくするための浸透化処理；細胞展開用基板上において、マイクロチャンバー等の細胞の固相化に関与する部位以外に細胞が吸着することを防止するとともに、必要に応じて行われる免疫染色において目的とする抗原以外の部位に蛍光標識抗体が非特定的に吸着することを防止するためのブロッキング処理などを必要に応じて行ってもよい。固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理を検体処理工程と同時に行わない場合は、それらの処理は例えば後述するように、染色工程と同時に行うようにしてもよい。

（赤血球および顆粒球等の除去）
展開した細胞を観察する場合においては、観察領域に対象となる細胞同士が重ならないように展開しなくてはならない。それには血液内の有形成分のうち約９６％を占める赤血球を検体から除去することが必要となる。赤血球を除去することで不必要な細胞同士の重なりを抑え、対象となる細胞を効率よく展開することで、検出感度を低下させずに稀少細胞を検出することが可能となる。

赤血球を除去するための手段は特に限定されるものではないが、たとえば、塩化アンモニウム等を使用して赤血球を溶血させてもよい。また、遠心分離処理により、赤血球とそれ以外の細胞を分離して、少なくとも第一の目的細胞および第二の目的細胞を含む細胞画分を精製してもよい。これらの手法は公知であり、適切な遠心分離機および遠心分離条件を用いて実施することができる。

ここで、密度勾配遠心法は、各種の細胞を含む血液中の成分を比重に従って分画することができる方法として知られている。特に、血液中に多量に含まれている赤血球を除去し、好ましくはさらに顆粒球も除去して、第一の目的細胞および第二の目的細胞を含む細胞画分のみを細胞展開工程に供するためには、密度勾配遠心法を用いることが好ましい。

密度勾配遠心法に用いられる分離液は、血液中の細胞の分画に適した比重を有し、また細胞を破壊することのない浸透圧およびｐＨを有するよう調製したものであればよいが、例えば、市販されているフィコール（登録商標）、パーコール（登録商標）などのショ糖溶液を用いることができる。この分離液の比重を、赤血球の比重よりも小さく、白血球の比重よりも大きくなるよう調節した上で密度勾配遠心処理を行うと、血液検体を「赤血球が多く含まれる画分」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」の少なくとも二層に分離することができる。

例えば、本発明における一つの態様において、分離液の比重を１．１１９以下、好ましくは１．１１３以下、より好ましくは１．０８５以下にすると、赤血球以外の有核細胞（つまり第一の目的細胞および第二の目的細胞）が多く含まれる画分への赤血球の混入率を２〜６％またはそれ以下に抑えることができる。

さらに、本発明における一つの態様においては白血球のうちＴ細胞などのリンパ球を第二の目的細胞とするが、この場合は分離液の比重を約１．０７７にすることにより、当該第二の目的細胞（リンパ球）および第一の目的細胞（ＣＴＣ）を、赤血球および当該第二の目的細胞以外の白血球（顆粒球等）から分離することができる。

また、比重の異なる二種以上の分離液を併用してもよい。例えば、比重が約１．０７７と約１．１１３の分離液を併用すれば、第二の目的細胞を多く含む画分と、顆粒球を多く含む画分とを取得することができる。

―工程（ｂ）：細胞展開工程―
細胞展開工程（ｂ）は、検体処理工程（ａ）で処理を行った既定量の血液を細胞展開用基板に添加し、第一の目的細胞および第二の目的細胞を基板上に並べる工程である。

（細胞展開用基板）
本発明における細胞展開用基板は、典型的には、後述する細胞観察方法に用いられるデバイスの基板（流路基板）に相当するものであり、流路形成部材と組み合わせて流路を形成し、その流路に細胞懸濁液を導入することにより、細胞展開用基板の表面に細胞懸濁液中の細胞を展開するようにして用いられる。

本発明における細胞展開用基板には、細胞懸濁液中の細胞を蛍光観察あるいは核酸解析に適した状態で回収することができるように微細なチャンバー（マイクロチャンバー）あるいは溝が形成されていることが好ましい。

細胞展開用基板が溝を持つ形態の場合、前記溝の溝幅が１〜１００μｍの範囲内であるとともに、溝深さが１〜１００μｍの範囲内に設定されることが好ましい。寸法がこのような範囲内であれば、細胞を溝内に確実に展開することができる。前記溝の断面形状については特に限定されるものではないが、断面がＶ字状であれば、細胞を密に並べることができるので好ましい。Ｖ字状以外にも例えば溝の一方の側面のみが斜めに傾斜しているもの、溝の頂部および底部に丸みを帯びているもの、あるいはＵ字状の溝であっても良い。また上記寸法の溝は、溝幅と溝深さとを同じ寸法とすることが好ましい。このように設定すれば、一度溝内に入った細胞が移動し難くなるとともに、溝内に入った細胞が、他の細胞を堰き止めてしまうようなことも防止することができる。

前記溝は、公知の微細加工技術で加工可能であるが、例えば市販のプリズムシートを代用することもできる。通常、プリズムシートは、平板の上面に同じ大きさの溝が複数列状に並設されたものであり、溝の溝幅および溝深さも上記の好ましい範囲に合ったものが市販されている。

細胞展開用基板がマイクロチャンバーを持つ形態の場合、マイクロチャンバーの形状は特に限定されるものではないが、例えば、底面が平坦で側面がテーパー形状である逆円錐台形が好ましい。マイクロチャンバーの底面の直径および深さは、核酸の解析や染色像の観察に適した数の細胞を回収して収容することができるよう、適宜調節することができる。例えば、１つのマイクロチャンバーあたり１〜１００個の細胞を収容できるよう、底面の直径を２０〜５００μｍ、深さを２０〜５００μｍの範囲とすることが好ましい。なお、血液中の種々の細胞（赤血球を除く）の直径は一般的に５〜１００μｍであり、ＣＴＣ等の稀少細胞の直径は１０〜１００μｍ程度と言われている。また、蛍光染色像の観察時に励起光の光源としてレーザーダイオードを用いる場合、その照射領域（スポット）のサイズは、例えば長径１００μｍ×短径１０μｍ程度の楕円形である。マイクロチャンバーの底面のサイズは、このレーザーダイオードの照射領域のサイズよりも大きくし、１つのマイクロチャンバーに光を照射しているときに、隣接するマイクロチャンバーにもまたがって光が照射されて、複数のマイクロチャンバーから同時に蛍光が発せられることがないようにすることが適切である。

細胞展開用基板の表面上における、複数のマイクロチャンバーの配置は特に限定されるものではないが、細胞の回収率（懸濁液中の全ての細胞のうちマイクロチャンバー内に回収できた細胞の割合）がなるべく高くなるよう、配列の向きやマイクロチャンバー同士の間隔を調節されていることが好ましい。例えば、流路に細胞懸濁液を送液したときに流入口から流出口に至るまでのどこか少なくとも１箇所で細胞がマイクロチャンバーに沈降するよう、マイクロチャンバーを配列させることが好ましい。

様々な基板材料が当技術分野において周知であり、たとえば、そのような材料は、ガラス；ポリカルボナートおよびポリメタクリル酸メチル、ポリオレフィンなどの有機プラスチック；ポリアミド；ポリエステル；シリコン；ポリウレタン；エポキシ；アクリル；ポリアクリラート；ポリエステル；ポリスルホン；ポリメタクリラート；ポリカルボナート；ＰＥＥＫ；ポリイミド；ポリスチレン；およびフルオロポリマーの１種または複数種を含んでもよい。

細胞展開用基板は、細胞が接着しやすい材料で作製してもよい。この場合、細胞展開用基板のマイクロチャンバーの内表面あるいは溝内以外の部分には、前述したように、ブロッキング剤等による表面処理を施すことが望ましい。

（細胞の固相化方法：細胞展開用基板の材質および構造）
稀少細胞等の目的細胞の検出効率を高めるためには、細胞を固相化する、つまり細胞展開用基板上の細胞の位置が動かないようにする必要がある。細胞を固相化することにより、観察の対象とする細胞の位置を特定しやすくなり、必要に応じて検出された目的細胞を回収することも可能となる。

細胞の固相化のための手法は、細胞展開用基板の表面の構造によって細胞の移動できる範囲を制限するようにする手法（構造的手法）と、細胞展開用基板の表面の性状によって生じる物理的相互作用により細胞を吸着させて動かないようにする手法（相互作用的手法）とに大別することができる。

固相化の構造的手法としては、たとえば前述したように、細胞展開用基板の表面にマイクロチャンバーまたは溝を複数形成することによって、細胞の移動をチャンバーまたは溝の中だけに制限することが挙げられる。

固相化の相互作用的手法としては、マイクロチャンバーの内面、特に底面または溝の内部の性状を、相互作用によって細胞が吸着しやすい性質、すなわち細胞接着性にすることが挙げられる。具体的には、たとえばマイクロチャンバーまたは溝内壁面あるいは細胞展開用基板全体をポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネートといったプラスチックやガラスのように、細胞が物理的な（分子間の）相互作用によって吸着しやすい疎水性材料で作製する方法がある。基板全体をこのような物質で作製した場合、送液の途中で細胞が吸着してしまいマイクロチャンバーまたは溝に回収されることの妨げとならないよう、細胞自体をブロッキング処理して吸着能力を失わせるか、細胞が吸着しやすい性質を、マイクロチャンバーまたは溝の内壁面等の必要な部分だけに留めることが好ましい。

また、マイクロチャンバーまたは溝の内壁面をポリ−Ｌ−リジンのように細胞の接着性を向上する分子でコーティングする方法が挙げられる。細胞展開用基板の表面のうちマイクロチャンバーまたは溝の内部以外の部分を、細胞が吸着しないようブロッキング剤で処理するか、大気雰囲気下でＵＶを照射するＵＶオゾン処理や酸素プラズマ処理によって適度に親水化する方法もある。マイクロチャンバーまたは溝の内部には、細胞が吸着しやすい材料が露出した状態を保つことにより、そこに細胞を吸着させ、細胞懸濁液の流れによって再びマイクロチャンバーまたは溝の外に出て行かないようにすることができる。

（プレウェット液送液工程）
細胞展開工程（ｂ）において、細胞懸濁液を送液するのに先だって、細胞展開用基板の表面の濡れ性を改善することなどを目的としたプレウェット液を送液する工程を設けてもよい。細胞展開用基板がポリスチレンのような疎水性の材料から形成されている場合、流路内に細胞懸濁液を導入しても、表面張力の関係でマイクロチャンバーまたは溝内に気泡が残存してしまい、細胞懸濁液を全てのマイクロチャンバーまたは溝内に充填させることができないことがある。そのような問題を抑制するため、細胞懸濁液を細胞展開用基板の表面に展開する前に、予め表面張力の低い有機溶剤、例えばエタノールの水溶液をプレウェット液として、流路に導入しておくことにより、細胞展開用基板の表面の濡れ性を向上させることができる。このようにプレウェット液で処理した後、ＰＢＳ等の生理食塩水または純水を通液してプレウェット液を置換、洗浄してから、細胞懸濁液を通液するようにすれば、細胞懸濁液はほとんど全てのマイクロチャンバーまたは溝の内部に入り込み、細胞を効率的に回収することができるようになる。

プレウェット溶液には、水よりも表面張力の低い水溶液であれば特に限定されるものではないが、例えば、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類を含む水溶液、好ましくは３０％（ｗ/ｖ）以下の濃度のエタノール水溶液や、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０， Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ（登録商標）、ＳＤＳ等の界面活性剤を０.０１〜１％（ｗ/ｖ）で含む水溶液を用いることができる。

―工程（ｃ）：染色工程―
染色工程（ｃ）では、第一の目的細胞と第二の目的細胞の各マーカー分子および核マーカーを蛍光体で染色し、第一実施形態ではさらに、第一の目的細胞に発現する分子Ａと、第二の目的細胞に発現し、分子Ａと相互作用する分子Ｂを蛍光体で染色する。このような蛍光体での染色は、第一の目的細胞および第二の目的細胞のマーカー分子のそれぞれに対して特異的な抗体と蛍光体から作製される蛍光標識抗体や、第一の目的細胞が有する分子Ａおよび第二の目的細胞が有する分子Ｂのそれぞれに対して特異的な抗体と蛍光体から作製される蛍光標識抗体、さらに蛍光を発する核マーカーの染色剤を用いた、蛍光染色により行うことができる。

例えば、蛍光標識抗体や核染色剤が溶解した水溶液である染色液を、細胞展開用基板上に設けた流路に送液し、所定の時間、流路を満たして、細胞展開用基板上のマイクロチャンバーまたは溝に収容された細胞と染色液を接触させることにより、その細胞が有する抗原にその蛍光標識抗体を結合させるようにすればよい。

（抗原・抗体）
マーカーならびに目的分子（分子Ａおよび分子Ｂ）のそれぞれに対する蛍光標識抗体は公知の手法により作製することができる。例えば、市販されている各種のモノクローナル抗体および蛍光標識キットを用いて、添付されているプロトコールに従い、モノクローナル抗体と蛍光色素のそれぞれが有する所定の官能基同士を所定の試薬の存在下に反応させて結合させることにより、あるいはビオチン−アビジン結合を利用することにより、所望の蛍光標識抗体を作製することができる。

（蛍光体）
免疫染色のための蛍光体は特に限定されるものではないが、例えば公知の様々な蛍光体（蛍光色素）を用いることが好適である。第一の目的細胞および第二の目的細胞のそれぞれにおける目的分子あるいはマーカーに対する免疫染色のための蛍光物質同士の励起光波長および蛍光波長、ならびに核染色の蛍光波長の関係性を考慮し、適切な複数枚のカットフィルターを用いることでそれぞれの蛍光をうまく測定できるよう、適切な励起光波長および蛍光波長を有する蛍光物質を選択して用いればよい。

なお、細胞の固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理などを検体処理工程で行わない場合、必要に応じて染色工程においてそれらの処理を同時に行ってもよい。すなわち、蛍光標識抗体や核染色剤とともに、固定化剤、浸透化剤、ブロッキング剤のうち必要なものが溶解した水溶液を送液し、所定の時間流路を満たして細胞と反応させるようにしてもよい。

（マーカー分子）
本発明において第一の目的細胞と第二の目的細胞を免疫染色するために利用されるマーカー分子は、公知の顕微鏡技術、組織学的技術、または分子生物学的技術によって同定可能な、試料中に存在する任意の細胞成分であり、たとえば、表面抗原、膜貫通型の受容体またはコレセプター、表面に結合もしくは凝集しているタンパク質、炭水化物等の高分子、および細胞質成分もしくは核成分などの細胞内成分などを包含するが、これらに限定されない。

例えば、細胞表面に発現するタンパク質としては、白血球で陽性となりＣＴＣで陰性となるＣＤ４５、白血球で陰性となりＭＣＦ−７等の上皮細胞としての性質を有するＣＴＣで陽性となるＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule：上皮細胞接着分子）などが挙げられる。細胞内部に発現するタンパク質としては、例えば、ＣＴＣで陽性となり白血球では陰性となるサイトケラチンが挙げられる。すなわち、ＣＴＣの細胞マーカーとしてはＥｐＣＡＭやサイトケラチンなどを用いることができ、白血球の細胞マーカーとしてはＣＤ４５などを用いることができる。これらの例示した抗原（細胞マーカー）を対象として免疫染色を行った場合に、ＣＤ４５が陰性で、サイトケラチンが陽性の細胞が検出されればその細胞はＣＴＣであり、ＣＤ４５が陽性で、サイトケラチンが陰性の細胞が検出されれば白血球であると判定することができる。

染色工程の時間、すなわち細胞と蛍光標識抗体溶液とを接触させる時間は、一般的な蛍光免疫染色を行う場合に準じて、免疫染色が十分に行われるよう適宜調整することができるが、通常は５分〜半日程度とすればよい。

染色工程の温度、すなわち反応温度は、一般的な蛍光免疫染色を行う場合に準じて、免疫染色が十分に行われるよう適宜調整することができるが、通常は４〜３７℃程度とすればよい。

本発明ではさらに、第一の目的細胞であるか第二の目的細胞であるかを問わず有核細胞であることを特定するために、核マーカーに対する染色（核染色）をあわせて行うようにする。核染色のためには、二本鎖ＤＮＡにインターカレートすることにより蛍光を発する蛍光色素（分子）を用いることが好適である。そのような蛍光色素は「核染色剤」として公知であり、例えば、細胞膜透過性があり生細胞の核染色が行えるＨｏｅｃｈｓｔ系色素（Hoechst 33342, Hoechst 33258等）を用いることができる。また、細胞膜透過性がないため生細胞の核染色は行えないが、細胞膜が変質しているため透過可能になっている死細胞の核染色が行えるＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）を用いることもできる。

分子Ａおよび分子Ｂのそれぞれに対する免疫染色は、第一の目的細胞と第二の目的細胞の各細胞マーカーに対する免疫染色と同時に行う、つまりそれらのマーカーと分子ＡおよびＢとを同時に多重染色してもよい。この場合、分子Ａおよび分子Ｂに対応した蛍光標識抗体、ならびに第一の目的細胞および第二の目的細胞の各細胞マーカーに対応した蛍光標識抗体、さらに核染色剤を含有する染色液を、細胞展開基板上に保持された細胞と接触させるようにすればよい。

また、各細胞マーカーと分子ＡおよびＢとを同時に多重染色するのではなく、各細胞マーカーを染色している抗体を外してから、新たに分子Ａと分子Ｂに特異的な抗体で免疫染色して検出してもよい。逆に、分子Ａと分子Ｂを染色している抗体を外してから、新たに各細胞マーカーで免疫染色することも可能である。

例えば前者の場合、まず第一の目的細胞および第二の目的細胞の細胞マーカーに対応した蛍光標識抗体を含有する染色液を用いて、第一の目的細胞と第二の目的細胞の各細胞マーカーの蛍光免疫染色を行う。この染色液にはさらに核染色剤を含有させておき、細胞核も同時に染色できるようにする。次に、細胞と解離液とを接触させることより、第一の目的細胞および第二の目的細胞の各マーカーに結合した蛍光標識抗体を解離させるようにする。この際、核染色剤のように抗原抗体反応以外の様式で結合している蛍光物質は、解離剤の影響を実質的に受けずに結合を維持したままである。マーカーに対する蛍光標識抗体を解離させたあと、分子Ａおよび分子Ｂに対応した蛍光標識抗体を含有する染色液を用いて、同様の手順で各目的分子の蛍光免疫染色を行う。

（解離剤）
解離剤としては、抗原抗体反応の結合に寄与しているアフィニティ（親和力）を弱める作用を有する物質を用いることができ、例えば、酸、アルカリ、塩、界面活性剤などが挙げられる。このうち酸は、細胞膜や抗原に対するダメージが比較的小さいため好ましく、そのｐＨは、１．０〜６．０が好ましい。酸は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸であっても、カルボン酸（ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸等）、スルホン酸等の有機酸であってもよく、例えば、グリシン塩酸塩（ｐＨ１．５〜３程度）のように緩衝作用を有する塩を形成していてもよい。

なお、界面活性剤は細胞膜を破壊する性質を持つ（浸透化剤として利用される）ため細胞に対するダメージが酸よりも強く、アルカリおよび塩は抗原に対するダメージが酸よりも強いが、解離剤として用いることも可能である。アルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、グリシン−水酸化ナトリウム塩（ｐＨ１１程度の緩衝液）を用いることができる。塩としては、例えば塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムを用いることができる。界面活性剤としては、例えばＳＤＳ、塩酸グアニジン、チオ硫酸カリウムを用いることができる。

抗原抗体解離工程の時間、すなわち細胞と解離液とを接触させる時間は、用いる解離剤の種類および濃度に応じて十分に解離する効果が得られるよう、適宜調整することができるが、例えば、ｐＨ１〜６の酸を解離剤として用いる場合は、通常は１０秒〜３０分間程度とすればよい。ただし、抗原性を失う程度の過剰な反応にならないように適宜調整するのが良い。

染色工程を行った後、画像取得工程において染色された細胞の観察像を撮影する前に、必要に応じて洗浄液を添加し、未反応の蛍光標識抗体を除去してもよい。

―工程（ｄ）：画像取得工程―
画像取得工程（ｄ）では、染色工程（ｃ）で染色した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像を取得する。第一実施形態ではさらにこの工程において、分子Ａと分子Ｂの蛍光画像を取得することもできる。なお、蛍光画像を取得しなかった場合には、検出工程（ｆ）において、別途走査型装置等による蛍光強度の測定を行う。

蛍光画像の撮影は、従来と同様の方法で行うことができる。例えば、第一の目的細胞の細胞マーカー、第二の目的細胞の細胞マーカー、核マーカーそれぞれの蛍光画像を撮影するために、第一実施形態においてはさらに必要に応じて、分子Ａおよび分子Ｂそれぞれの蛍光画像を撮影するために、順次、それぞれの蛍光体に対応した適切な波長の励起光を照射し、適切なフィルターを用いて不要な波長成分をカットして、それぞれの蛍光体から発せられる蛍光を観察しながら撮像すればよい。

また、細胞の形態を確認する等の目的のために、明視野での観察および画像撮影をあわせて行ってもよい。

この工程において取得したそれぞれの画像は、必要に応じて統合や補正を行った上で、続く同定工程および検出工程に用いることができる。

―工程（ｅ）：同定工程―
同定工程（ｅ）では、画像取得工程（ｄ）で取得した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像から、第一の目的細胞、例えばＣＴＣおよび第二の目的細胞、例えば、白血球を同定する。

例えば、本発明の一態様において、白血球マーカー（たとえばＣＤ４５）：陰性、ＣＴＣマーカー（たとえばサイトケラチン）：陽性、核マーカー：陽性と判定される細胞をＣＴＣと同定し、白血球マーカー：陽性、ＣＴＣマーカー：陰性、核マーカー：陽性と判定される細胞を白血球と同定する。検体中に白血球がＣＴＣよりも多量に（例えばＣＴＣの１００倍以上）含まれていることが想定される場合、核マーカーが陽性であるものを細胞全体と同定し、そのうち白血球マーカー：陰性、ＣＴＣマーカー：陽性のものをＣＴＣ、それ以外の細胞すべてを白血球と同定することもできる。

―工程（ｆ）：検出工程―
本発明では、検出工程（ｆ）において、同定工程（ｅ）で第一の目的細胞と同定された細胞のうち分子Ａを発現している細胞、および同定工程（ｅ）で第二の目的細胞と同定された細胞のうち分子Ｂを発現している細胞を検出するようにする。

第一実施形態では、そのような検出を分子Ａと分子Ｂの各蛍光染色に基づいて行うことができる。例えば、染色工程（ｃ）において、各細胞マーカーおよび核マーカーを染色するとともに、分子Ａと分子Ｂを染色し、ここから画像取得工程（ｄ）で得られたそれぞれの蛍光画像を重ねあわせる。その結果、同定工程（ｅ）において第一の目的細胞と同定した細胞を表している領域に分子Ａを染色した蛍光が検出された場合、その細胞は分子Ａを発現している第一の目的細胞であると同定することができ、同様に、第二の目的細胞と同定した細胞を表している領域に分子Ｂを染色した蛍光が検出された場合、その細胞は分子Ｂを発現している第二の目的細胞であると同定することができる。

工程（ｄ）において分子ＡおよびＢについて、蛍光画像を取得しなかった場合、走査型装置により蛍光強度のみを測定する。得られた測定データ（操作距離および分子Ａおよび／またはＢの存在を示す蛍光強度）と、蛍光画像から特定した第一目的細胞および第二目的細胞が存在する細胞展開用基板の位置の情報を対比して、"分子Ａを発現している第一目的細胞"および／または"分子Ｂを発現している第二目的細胞"の存在を検出できる。

第一実施形態においては、たとえば、同定工程（ｅ）において第一の目的細胞と同定された細胞の数を計測するとともに、検出工程（ｆ）において分子Ａを発現している第一の目的細胞と同定された細胞の数を計測し、前者の細胞数に対する後者の細胞数の割合（細胞割合情報）を算出することもできる。同様に、同定工程（ｅ）において第二の目的細胞と同定された細胞の数を計測するとともに、検出工程（ｆ）において分子Ｂを発現している第二の目的細胞と同定された細胞の数を計測し、前者に対する後者の細胞数の割合（細胞割合情報）を算出することもできる。

また、第一実施形態においては、検出工程（ｆ）において、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞を第一実施形態と同様の手法で蛍光染色に基づいて検出し、さらに加えてそれぞれの位置情報を取得することで、それぞれの細胞が互いに近接する群を検出することもできる。位置情報に基づく検出を行うには、基準点（レクチルマーク）を備えた細胞展開基板を用いて細胞展開工程（ｂ）を行うことにより、目的となる蛍光を有する細胞が存在する位置情報をその基準点からの座標として取得することができる。たとえば、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞に対応する蛍光シグナルの位置情報として基準点を用いてそれぞれの座標を求め、座標が一定の範囲内に存在するときに、細胞同士が近接していると判断することができる。上記「一定の範囲」（判断に用いる距離）は目的とする細胞の直径や細胞密度などによって適宜決定することができる。

検出工程（ｆ）においては、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞の存在を検出するだけでなく、それらの細胞に発現している分子Ａおよび分子Ｂの発現量情報を取得するようにしてもよい。

たとえば、分子Ａを発現している第一の目的細胞と同定された細胞から発せられる蛍光の強度、たとえば前述した蛍光画像の重ねあわせにおいて、第一の目的細胞と同定した細胞を表している領域内に含まれる分子Ａに対応した蛍光の強度を、分子Ａの発現量を定量的に示した指標として解析することができる。同様に、第二の目的細胞と同定した細胞を表している領域内に含まれる分子Ｂに対応した蛍光の強度を、分子Ｂの発現量を定量的に示した指標として解析することもできる。その場合は、抗体に標識した蛍光色素の標識率、量子効率、励起波長の強度、露光時間や褪色などの条件の統一に留意する必要がある。

―第二実施形態―
第二実施形態では、検体処理工程（ａ）、細胞展開工程（ｂ）および同定工程（ｅ）は第一実施形態と同様に行うことができるが、その他の工程は第一実施形態と組み合わせるか組み合わせないかによって、第一実施形態と同様に行うか改変するかが異なる。

第一実施形態と組み合わせる場合は、染色工程（ｃ）も、上述した第一実施形態におけるそれらの工程と同様に行うことができる。そして画像取得工程（ｄ）では、第一の目的細胞、第二の目的および核の蛍光画像に加えて細胞分子Ａと分子Ｂの画像を取得することができる。検出工程（ｆ）および（ｆ'）においては、分子Ａ発現細胞（第一の目的細胞）および分子Ｂ発現細胞（第二の目的細胞）の検出や分子Ａおよび分子Ｂにおける発現量情報の解析を、前述した蛍光染色に基づいて行うとともに、次に述べる核酸増幅反応に基づいて行い、それらの両方の結果を利用することができる。

第一実施形態と組み合わせない場合は、染色工程（ｃ）における分子Ａと分子Ｂの蛍光染色は不要である。また、画像取得工程（ｄ）では、第一の目的細胞、第二の目的および核の蛍光画像のみを取得すればよい。検出工程（ｆ'）では、分子Ａ発現細胞（第一の目的細胞）および分子Ｂ発現細胞（第二の目的細胞）の検出および必要に応じて発現量情報の解析を、前述した蛍光染色に基づいて行うことに代えて、次に述べる核酸増幅反応に基づいて行うこととする。

―工程（ｆ'）：核酸増幅反応を利用した検出工程（核酸検出工程）―
第二実施形態における、核酸増幅反応に基づく検出工程（本明細書において「核酸検出工程」と呼ぶ。）は、マイクロチャンバーを備えた細胞展開基板を用いる場合に行われ、核酸増幅反応によって発せられる蛍光に基づいて分子ＡおよびＢそれぞれを検出し、好ましくは詳細に発現量を定量することができる。

第二実施形態においては、同定工程（ｅ）において蛍光染色により第一の目的細胞または第二の目的細胞と同定された各細胞を格納したマイクロチャンバーの全数に対する、核酸検出工程（ｆ'）において分子Ａまたは分子Ｂの存在が検出されたマイクロチャンバーの数の割合を算出することができる。なお、第一の目的細胞としてＣＴＣを用いる場合、ＣＴＣは稀少であることから、１つのマイクロチャンバー内に回収される数はせいぜい１個であるものと想定されるので、ＣＴＣと同定された細胞を格納したマイクロチャンバーの数をＣＴＣの数とみなし、そのマイクロチャンバーのうち分子Ａに対応した蛍光が確認されたマイクロチャンバーの数を分子Ａが発現したＣＴＣの数とみなしてもよい。

このような核酸検出工程は典型的には、細胞を収容し保持することができるマイクロチャンバーが表面に形成された細胞展開用基板と、その基板上に天井を有する流路を形成するための流路形成部材を備えた流路デバイスを用いて行われる。核酸検出工程は、具体的には、細胞に含まれる核酸を増幅するための準備段階として、後述するような核酸増幅反応試薬送液工程（この工程は実質的に前述した細胞展開工程（ｂ）において行われる）、核酸増幅反応試薬送液工程、封止液送液工程、核酸増幅反応進行工程および測定工程を含む。

核酸増幅反応としては様々なものが公知であるが、本発明では、核酸の増幅量を定量的かつ経時的に把握することのできる方法、たとえばＴａｑＭａｎプローブ法、インターカレータ−法またはサイクリングプローブ法のようなリアルタイムＰＣＲ法が好適である。

核酸増幅反応としてリアルタイムＰＣＲ法などを用いる場合は、その反応で表れる蛍光強度を指標として、分子Ａおよび分子Ｂの各発現量をマイクロチャンバーごとに詳細に定量することができる。この場合それぞれのマイクロチャンバーについて、分子Ａおよび分子Ｂの蛍光強度と、同定工程（ｅ）において計測された第一の目的細胞および第二の目的細胞と同定された細胞の数を対比することにより、それらの細胞１つあたりの平均発現量を指標としたより詳細な解析を行うことも可能である。

一方、マイクロチャンバーごとにはそれらの発現量の定量を行うことのできない、リアルタイムＰＣＲ法以外の核酸増幅反応を用いる場合、あるいはリアルタイムＰＣＲ法を用いる場合であってもマイクロチャンバーごとの詳細な定量が必要でない場合は、蛍光によってマイクロチャンバーごとの分子Ａおよび分子Ｂの存在を定性的に検出すればよい。

さらに、第一実施形態において得られる免疫染色に基づく解析結果と、第二実施形態において得られる核酸増幅反応に基づく解析結果とを照合することにより、分子Ａおよび分子Ｂの発現量情報に関する測定値の信頼性をより一層向上させることが可能である。

また、分子Ａおよび分子Ｂの検出のための核酸増幅反応進行工程と、第一の目的細胞および第二の目的細胞の同定のための染色工程および画像取得工程におけるそれぞれの結果を明確に識別できるようにするため、染色工程において第一の目的細胞および第二の目的細胞を染色するための蛍光と、核酸増幅反応進行工程において分子Ａおよび分子Ｂの核酸増幅を検出するための蛍光とが異なる種類となるようにする、たとえば極大蛍光波長の異なる蛍光色素を用いるようにすることが好ましい。第一実施形態と第二実施形態を組み合わせる場合、（ｉ）分子Ａおよび分子Ｂを免疫染色するための蛍光標識抗体を、前述したような解離剤を用いて分子Ａおよび分子Ｂを解離させてから、マイクロチャンバー内で核酸増幅反応進行工程を行うようにする（その場合、免疫染色用の蛍光物質と核酸増幅反応進行工程用の蛍光物質は、極大蛍光波長が近似している同じ種類のものでも支障はない）か、（ｉｉ）分子Ａおよび分子Ｂを免疫染色するための蛍光標識抗体を残存させたままマイクロチャンバー内で核酸増幅反応進行工程を行うならば、免疫染色用の蛍光物質と核酸増幅反応進行工程用の蛍光物質は、極大蛍光波長が近似していない異なる種類のものにすることが適切である。

以下、核酸検出工程に含まれる各工程について説明する。

（核酸増幅反応試薬送液工程）
核酸増幅反応試薬送液工程では、流路に核酸増幅反応試薬を送液し、マイクロチャンバーを核酸増幅反応試薬で満たすようにする。核酸増幅反応試薬の送液量は、全てのマイクロチャンバーの容積を考慮し、少なくともそれを満たすのに十分な量となるよう適宜調節することができ、流路を含めて核酸増幅反応試薬で満たすようにしてもよい。

核酸増幅反応試薬は、行われる核酸増幅反応に対応したものとする。たとえば、核酸増幅反応としてＰＣＲ法を用いる場合、その核酸増幅反応試薬としては一般的に、プライマー（ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅ）、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、耐熱性のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、その他Ｍｇ²⁺イオンなど必要な要素を含み、ＴａｑＭａｎプローブ等を含む緩衝液（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー等）など用いる核酸増幅法に適当な試薬が用いられる。

核酸増幅反応試薬は、好ましくは、細胞溶解補助および／または細胞由来のＰＣＲ反応阻害物質抑制の効果を有する試薬であり、そのような試薬としては例えば、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）、Ａｌｌｅｌｅ−Ｉｎ−Ｏｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｏｐｔ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（コスモ・バイオ社）、ＥｚＷａｙ（ＴＭ）ダイレクトＰＣＲバッファー（テフコ社）、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（島津製作所）等が挙げられる。

（封止液送液工程）
封止液送液工程では、流路に封止液を送液することにより、流路に残存した核酸増幅反応試薬を押し流すことで、マイクロチャンバーを満たす核酸増幅反応試薬同士が連通しないよう、流路を封止液で満たすようにする。封止液の送液量は、全てのマイクロチャンバーの上部の流路の容積を考慮し、それを満たすのに十分な量となるよう、特にマイクロチャンバー内の核酸増幅反応液同士を連通させないため、細胞展開用基板のマイクロチャンバー以外の表面を封止液で被覆することができるよう、適宜調節することができる。

封止液は、送液したときにマイクロチャンバー内の核酸増幅反応試薬と混合しないよう、核酸増幅反応試薬よりも比重が軽いものが適切である。そのような封止液としては、ＰＣＲ法などの核酸増幅反応に用いられる一般的なものを用いることができ、たとえばミネラルオイルが好ましい。

（核酸増幅反応進行工程）
核酸増幅反応進行工程では、細胞（第一の目的細胞および／または第二の目的細胞）を収容し、核酸増幅反応試薬で満たされ、封止液で封止されたマイクロチャンバー内で、その核酸増幅反応試薬に対応した核酸増幅反応を行い、細胞に含まれる核酸を増幅する。このような核酸増幅反応進行工程は、選択した核酸増幅反応に対応した操作を行えばよい。たとえばリアルタイムＰＣＲ法を選択した場合は、鋳型ＤＮＡを熱変性により一本鎖にする温度処理（約９４℃）、この一本鎖にプライマーを結合させる処理（約４０〜６０℃）、さらにＤＮＡポリメラーゼを結合させてＤＮＡの合成反応を開始し、進行させる温度処理（約７２℃）を所定のサイクル（約３０〜４０サイクル）繰り返し、分子Ａおよび分子Ｂの遺伝子を増幅させる。

（測定工程）
測定工程は、蛍光強度をそのマイクロチャンバーにおける分子Ａおよび分子Ｂの発現量（一定時間経過後の遺伝子の増幅量）を反映した定量的な指標として用いる場合は核酸増幅反応の進行と共に行われ、また蛍光をそのマイクロチャンバーにおける分子Ａおよび分子Ｂの発現を反映した定性的な指標として用いる場合は核酸増幅反応の後に行われる工程である。測定工程では、用いられた蛍光体に対応した所定の励起光を照射しながら、各マイクロチャンバーから発せられる蛍光の強度を測定する。たとえば、光学系機構（ＰＭＴ、ＰＤ等）をマイクロチャンバーの配置に沿って走査させながら位置（移動距離）ごとに、フィルターを通過した蛍光の強度を測定することが好ましい。測定対象とする蛍光に応じて、励起光の光源または励起フィルターと蛍光フィルターとを切り替えればよい。所定の塩基配列を有する核酸を含む細胞を収容しており、その核酸が増幅されたマイクロチャンバーの位置では、測定される蛍光強度が高くなる。また、測定工程では必要に応じて、マイクロチャンバーの位置を取得するための反射光、透過光、自家蛍光等を測定してもよい。

（情報取得工程）
情報取得工程は上記測定工程に代えて核酸増幅反応の後に行われる工程である。上記測定工程と同様に、分子Ａまたは分子Ｂについての核酸増幅反応に用いられた蛍光体に対応した所定の励起光を照射して細胞展開用基板の蛍光画像をそれぞれ撮影し、取得した蛍光画像を重ねあわせることで、マイクロチャンバーにおける蛍光の有無を確認することにより分子Ａおよび分子Ｂの発現情報を定性的に取得することができる。さらにここで分子Ａおよび分子Ｂの発現が確認されたマイクロチャンバーと同定工程（ｅ）で取得された第一の目的細胞または第二の目的細胞が確認されたマイクロチャンバーの位置情報を重ね合わせることにで、より詳細に分子Ａおよび分子Ｂの発現情報を取得することが可能になる。

―工程（ｇ）：データ提示工程―
本発明では、第一実施形態、第二実施形態とも、検出工程（ｆ）のあとに、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞のそれぞれの位置情報および／または分子Ａと分子Ｂのそれぞれの発現量情報の解析結果に基づいて、それらの分子間の相互作用が関与する疾患の、治療または予防に係る薬剤の投与判断に関するデータを提示することができる。

たとえば、分子Ａに結合するなど、なんらかの相互作用を起こして分子Ａの機能を阻害する物質であって薬剤として用いられるものを薬剤ａ、同様に分子Ｂに対する物質を薬剤ｂとする。また、位置情報を解析して、複数のサンプルを解析した定量結果を統計的に処理することにより、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞が互いに近接している群が十分に存在すると判断できる閾値を決定することができる。さらに、発現量情報を解析して、複数のサンプルを解析した定量結果を統計的に処理することにより、分子Ａと分子Ｂが発現していると判断できる閾値を決定することができる。

このとき、ある疾患の患者から採取した血液試料を分析した結果、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞が互いに近接している群の数が閾値以上である、および／または、第一の目的細胞上の分子Ａの発現量および第二の目的細胞上の分子Ｂの発現量がそれぞれ閾値以上である場合には、その患者の症状に分子Ａと分子Ｂの相互作用が影響している可能性があるため、その相互作用を阻害することのできる薬剤ａ，薬剤ｂの両方について薬効が期待できる。逆に、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞が互いに近接している群の数が閾値に達しておらず、かつ分子Ａおよび分子Ｂのいずれかの発現量が閾値に達していない場合は、それらの分子間に相互作用は起こらず、その患者の症状に相互作用は影響していないので、薬剤ａおよびｂのどちらを投与しても効果は期待できない。

具体例としては、癌患者から採取した血液試料を分析し、ＣＴＣ上に前記分子ＡとしてＰＤ−Ｌ１が、かつ白血球上に前記分子ＢとしてＰＤ−１がそれぞれ閾値以上発現しているかどうか、および／またはＰＤ−Ｌ１を発現したＣＴＣとＰＤ−１を発現した白血球が互いに近接している群が閾値以上存在しているかどうかを判断し、前記薬剤ａとしての抗ＰＤ−Ｌ１抗体および前記薬剤ｂとしての抗ＰＤ−１抗体の薬効が期待できるかどうかによって、それらの薬剤の投与判断に資するデータを提示することが挙げられる。

なお、このデータ提示工程においては、分子Ａと分子Ｂの各発現量情報および第一の目的細胞と第二の目的細胞の位置情報解析結果に基づく上記のようなデータのみならず、同定工程におけるＣＴＣの同定およびその計数の結果に基づいて、転移性の癌の予後予測や投与している薬剤の治療効果の判断などに関するデータをあわせて提示するようにしてもよい。

＜細胞解析システム＞
本発明の細胞解析システムは、上述したような細胞染色と、必要に応じて核酸増幅を行う、本発明の第一の目的細胞と第二の目的細胞の同時検出方法を実施するためのものである。

すなわち、本発明の細胞解析システムは、（Ａ）検体処理工程を実施するための、患者の血液から赤血球を除去する手段（検体処理手段）；（Ｂ）細胞展開工程を実施するための、検体処理手段（Ａ）で処理した既定量の血液を細胞展開用基板に添加し、第一の目的細胞および第二の目的細胞を基板上に並べる手段（細胞展開手段）；（Ｃ）染色工程を実施するための、第一の目的細胞と第二の目的細胞の各細胞マーカーおよび核マーカーを蛍光体で染色する手段（染色手段）；（Ｄ）画像取得工程を実施するための、染色手段（Ｃ）で染色した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像を取得する手段（画像取得手段）；（Ｅ）画像取得手段（Ｄ）で取得した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像から、第一の目的細胞および第二の目的細胞を同定する手段（同定手段）；および（Ｆ）同定手段（Ｅ）で第一の目的細胞と同定された細胞のうち、特定の分子（分子Ａ）を発現している細胞、および同定手段（Ｅ）で第二の目的細胞と同定された細胞のうち、分子Ａと相互作用する他の特定の分子（分子Ｂ）を発現している細胞を検出する手段（検出手段）を含む。

上記検出手段（Ｆ）による検出を、分子Ａおよび分子Ｂの各蛍光染色に基づいて行う本発明の第一実施形態においては、染色手段（Ｃ）が分子Ａおよび分子Ｂを蛍光体で染色する手段をさらに含み、画像取得手段（Ｄ）が分子Ａと分子Ｂの蛍光画像を取得する手段をさらに含んでいてもよい。蛍光画像を分子Ａ発現細胞（第一の目的細胞）および分子Ｂ発現細胞（第二の目的細胞）の位置情報を前述した蛍光染色により取得した位置情報に基づいて行い、分子Ａ発現細胞および分子Ｂ発現細胞が互いに近接する群を検出する手段をさらに含む。ここで分子ＡおよびＢについての蛍光画像を取得しなかった場合、走査型装置により蛍光強度のみを測定する手段を含み、得られた測定データ（操作距離および分子Ａおよび／またはＢの存在を示す蛍光強度）と、蛍光画像から特定した第一目的細胞および第二目的細胞が存在する細胞展開用基板の位置の情報を対比して、"分子Ａを発現している第一目的細胞"および／または"分子Ｂを発現している第二目的細胞"の存在を検出する手段を含む。

上記検出手段（Ｆ）による検出を、分子Ａと分子Ｂの各遺伝子の核酸増幅反応に基づいて行う本発明の第二実施形態においては、検出手段（Ｆ）はマイクロチャンバー内で分子Ａと分子Ｂの各遺伝子の核酸（増幅反応物）を検出する手段、具体的には、核酸増幅反応試薬送液手段、封止液送液手段および核酸増幅反応進行手段、ならびに測定手段または情報取得手段となる。

さらに、本発明の好ましい実施形態における細胞検出システムは、検出手段（Ｆ）で取得した分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞のそれぞれの位置情報および／または分子Ａと分子Ｂのそれぞれの発現量情報の解析結果に基づいて、それらの分子間の相互作用が関与する疾患の治療または予防に係る薬剤の投与判断に関するデータを提示する手段（データ提示手段）も備える。

これらの各手段は、例えば以下に記載するような、送液系機構、光学系機構、データ処理機構、およびそれらの制御機構によって、またその他の適切な公知技術を利用して、構築することができる。

細胞解析システムは一般的に、上記の各手段としての機構を備えた細胞解析装置、流路デバイスおよび試薬収容器によって構成される。流路デバイスおよび試薬収容器は、システムの運用時に細胞解析装置（その内部の流路デバイスホルダーおよび試薬収容器ホルダー）にセットして用いられる。細胞解析装置は、上記の全ての手段（機構）を一体的に備えた装置として構築することも、それぞれ一または複数の手段（機構）を備えた複数の装置群として構築することも可能である。

＜細胞解析装置＞
細胞解析装置は少なくとも、細胞展開工程における細胞懸濁液、染色工程における染色液、また必要に応じて、第二実施形態で行われる核酸検出工程における核酸増幅反応試薬および封止液など、各種の液体を流路デバイスの流路に送液するための送液系機構と、それらの工程に用いられる流路デバイスを保持する流路デバイスホルダーおよび試薬収容器を保持する試薬収容器ホルダー、ならびに細胞解析装置が備える各種の機器類の挙動を制御するための制御機構を備える。細胞解析装置はさらに、流路デバイスの細胞展開用基板上に回収され蛍光染色された細胞や、その細胞に含まれる所定の遺伝子（核酸）を増幅させた反応生成物を観察し、それらの蛍光画像を撮像するための光学系機構も、送液系機構と同じ装置内に備えることが好ましい。本発明の第二実施形態においては、細胞解析装置はさらに、マイクロチャンバー温度調節機構などの核酸検出工程を行うために必要な機構も、光学系機構等と同じ装置内に備えることが好ましい。必要であれば、細胞解析装置はさらに、密度勾配遠心等により赤血球等を除去することのできる検体処理機構を、光学系機構等と同じ装置内に備えるようにすることも可能である。

（検体処理機構）
検体処理機構は、患者から採取した血液から、溶解や遠心分離などによって赤血球を除去し、実施形態に応じて好ましくはさらに顆粒球等の不要な白血球も除去するための手段に相当する。検体処理機構はさらに、細胞の固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理等、検体処理と同時に行うことのできる各種の処理を行うための機能を兼ね備えていてもよい。

遠心分離によって赤血球等を除去する場合の検体処理機構は、密度勾配遠心法など所定の手法を用いて遠心分離処理を行うことができる、従来の遠心分離機に準じて構築することができる。また、溶解によって赤血球を除去する場合、さらに必要に応じて細胞の固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理等も行う場合の検体処理機構は、血液に必要な試薬を添加することができるよう、ピペットやチップなどを用いて構築することができる。

検体処理機構が、送液系機構等を備えた細胞解析装置内に設けられている場合、たとえば血液を収容した採血管をその細胞解析装置にセットすることで検体処理が自動的に行われるようにすることが好ましい。一方で、赤血球を溶解により除去する処理や必要に応じて行われる細胞の固定化処理等を、そのための試薬を収容した採血管内に患者の血液を添加するだけで（血液の抗凝固処理と同時に）行える場合、あるいは送液系機構等を備えた細胞解析装置の小型化を図る場合は、検体処理機構は送液系機構等を備えた細胞解析装置内に組み込む必要はなく、必要に応じて別個の検体処理用の装置（一般的な遠心分離機等）を利用すればよい。そのような場合は、処理済みの検体を送液系機構等を備えた細胞解析装置にセットする。

（送液系機構）
送液系機構は、制御手段による制御により、試薬収容器に収容されている細胞懸濁液、染色液、洗浄液、必要に応じて用いられる核酸増幅反応試薬および封止液、その他の試薬類の吸引および吐出を行い、それらの液を流路に送液するための機構である。

送液系機構は、例えば、シリンジポンプ、交換可能なチップ、さらに任意の位置で液の吸引および吐出を可能にするため流路デバイス（細胞展開用基板）に対して平面方向および垂直方向に移動可能なアクチュエーターなどを用いて構築することができる。シリンジポンプは、各工程において用いられる液体を所望の流量で吸引および吐出ができる能力を有する。

具体的には、供給手段および送液手段を個別に備える送液系機構と、流入口側にリザーバーを備える流路デバイスを用いることができる。この実施形態では、供給手段は、試薬収容器に収容されている細胞懸濁液等の液体を所定の量、吸引した後、リザーバーで吐出し、それらの液体はリザーバー内に一時的に貯留される。送液手段は流出口に接続され、吸引により、リザーバー内の液体を所定の流量で流入口から流路に導入する。

また、供給手段および送液手段を兼ね備えた送液系機構と、流出口側にリザーバーを備える流路デバイスを用いることもできる。この実施形態では、送液系機構は、試薬収容器に収容されている細胞懸濁液等の液体を所定の量、吸引した後、それらの液体を流入口において所定の流量で吐出し、流路に直接的に導入する。流路を通過して流出口から流出した液体は、リザーバー内に一時的に貯留することができる。送液により所定の処理が終わった後、送液系機構は流路を満たしていた液体を流入口から吸引して排出する。排出された液体は、試薬収容器の廃液収納部において送液系機構から吐出されるようにしてもよい。

（マイクロチャンバー温度調節機構）
本発明の第二実施形態において、細胞解析装置（送液系機構）を用いて核酸増幅反応試薬および封止液を送液する核酸増幅準備方法を実施し終えた流路デバイスを流路デバイスホルダーにセットしたまま、ＰＣＲ等の核酸増幅反応進行工程を引き続き行う場合、流路デバイスホルダーは、各マイクロチャンバーで核酸増幅反応を進行させるために必要な、細胞展開用基板の温度を調節するための手段を備えることが好ましい。

そのようなマイクロチャンバー温度調節手段は、例えば、ペルチェ素子のような加温と冷却を行う温度調節素子および温度検出素子とを備え、これらは流路デバイスホルダーの細胞展開用基板と接触する部位に設けることができる。そして制御手段が、温度検出素子が測定した細胞展開用基板の温度を参照しながら、温度調節素子による加温又は冷却によって、細胞展開用基板が所定のタイミングで所定の温度となるように温度制御を実行する。

なお、細胞解析装置（送液系機構）がマイクロチャンバー温度調節機構を備えるものでない場合は、核酸増幅準備方法が行われた流路デバイスを細胞解析装置から取り外し、当該装置とは別個に設けられた核酸増幅反応用の装置に移し替えて、核酸増幅反応進行工程およびその他の工程を行うことも可能である。

（光学系機構）
光学系機構は、光源としてのレーザーダイオード（ＬＤ）、集光レンズ、ピンホール部材、ダイクロックミラー、蛍光フィルターなど、蛍光物質を励起して蛍光を発するようにするための部材を含む。ＬＤは、観察の対象とする蛍光物質の励起波長に対応したものとし、必要に応じて複数用意してダイクロックミラーで適切なものが照射されるようにする。蛍光フィルターは、蛍光標識抗体に用いられている蛍光物質の蛍光波長に対応したものとし、必要に応じて複数枚用意してフィルター切り替え器で交換しながら用いるようにする。

光学系機構はさらに、対物レンズ、対眼レンズ、ＣＣＤカメラなど、蛍光染色された細胞や核酸増幅反応が進行し蛍光を発するマイクロチャンバーを目視で観察できるようにするとともに、それらの蛍光画像を撮影するための部材を含み、必要に応じてさらに、光電子倍増管（ＰＭＴ）など蛍光強度を測定するための部材を含んでいてもよい。

これらの部材を含む光学系機構は、蛍光顕微鏡に準じた形態のものとして構築することができ、送液系機構とともに細胞解析装置内に組み込むことが好ましい。そのような実施形態であれば、細胞展開工程および染色工程を行った後、また実施形態に応じて、検出工程または核酸検出工程（測定工程）を行った後ないし行いながら、画像取得工程や核酸検出工程に含まれる測定工程を行い、蛍光を発する細胞またはマイクロチャンバーの観察および撮像をスムーズに行うことができる。また、光学系機構を、送液系機構を中心とする装置とは別個の蛍光顕微鏡に準じた装置に設け、前者の装置によって細胞展開工程および染色工程を行った流路デバイスを後者の装置に移動させて、画像取得工程を行うことも可能である。

マイクロチャンバーを備えた細胞展開用基板を用いて細胞の解析を行う場合、光学系機構はさらに、観察の対象としているマイクロチャンバーの位置、さらにはマイクロチャンバーに収容されている細胞の位置を特定するための手段を備えていてもよい。例えば、細胞展開用基板に基準点（レクチルマーク）を設けておくことにより、目的とするマイクロチャンバー（目的とする細胞または発現分子もしくはその核酸増幅反応物を標識した蛍光を発するマイクロチャンバー）、あるいは目的とする細胞自体の位置の情報をその基準点からの座標として取得することができる。なお、このような基準点に基づく情報を利用すれば、細胞展開用基板を細胞分析装置から別の観察・撮像用の装置に移動させたときにも、その情報に基づき、目的とするマイクロチャンバーまたは細胞を直ちに観察できるようになる。

また、画像を取得しなくとも、光源から蛍光物質に励起光を照射し、その蛍光物質が発する蛍光の強度を測定するよう、細胞展開用基板上で光学系機構を走査させ、移動距離と蛍光強度の関係から、どの位置に蛍光物質で標識された目的物が存在するかという情報を取得することも可能である。さらに、光源から細胞展開用基板に光を照射しながら走査したときに、その透過光または反射光、あるいは細胞展開用基板の作製材料が発する自家蛍光の強度が、マイクロチャンバーとそれ以外の部位とで相違することを利用して、マイクロチャンバーの位置を特定することができる。このような実施形態における光学系機構は、上記の蛍光、透過光、反射光または自家蛍光を測定するためのフォトダイオード（ＰＤ）のような受光器をさらに含んでいてもよい。マイクロチャンバーの位置に関する情報と、蛍光強度に関する情報とを統合すると、どのマイクロチャンバーに所定の種類の細胞（所定の抗原および／または遺伝子を有する細胞）が収容されていたかを正確に特定することができる。

（データ処理機構）
データ処理機構は、画像取得手段や検出手段において光学系機構により取得された、蛍光画像や蛍光強度等のデータの統合、補正などを行うことのできる機構であり、一般的には、画像処理等のデータ処理用プログラム（ソフトウェア）、そのプログラムをコンピュータが実行可能な様式で記憶した記憶媒体、およびそのプログラムを実行するためのコンピュータにより構築することができる。このようなデータ処理機構は、送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置に接続して使用される、別個の装置（パーソナルコンピュータ等）として設けてもよいし、送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置内に組み込むようにしてもよい。

データ処理機構は少なくとも、画像取得手段により取得された蛍光画像から、第一の目的細胞（ＣＴＣ等）および第二の目的細胞（白血球等）を同定するための機能を備え、本発明においてはさらに、蛍光画像またはその他のデータから、それらの細胞のうち分子Ａ（ＰＤ−Ｌ１等）を発現している第一の目的細胞および分子Ｂ（ＰＤ−１等）を発現している第二の目的細胞を検出するための機能を備える。

たとえば、同一の視野における第一の目的細胞の細胞マーカーを標識した蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像、第二の目的細胞の細胞マーカーを標識した蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像、および核マーカーを標識した蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像を統合する処理；その統合画像内でピクセル情報（輝度、色彩）が所定の特徴を有する領域を第一の目的細胞または第二の目的細胞であると同定する処理；そのように同定されたそれぞれの細胞の数を計測する処理；これらの処理を撮像した全ての視野について順次行う処理などを、自動的に実行することのできるプログラムが好ましい。

本発明の第一実施形態における上記のプログラムはさらに、上記の３種の蛍光画像に、分子Ａを標識した蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像および分子Ｂを標識した蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像も加えて統合する処理；その統合画像内でピクセル情報（輝度、色彩）が所定の特徴を有する領域を、分子Ａを発現している第一の目的細胞または分子Ｂを発現している第二の目的細胞として検出する処理；そのようにして検出されたそれぞれの細胞の数を計測する処理；これらの処理を撮像した全ての視野について順次行う処理などを、自動的に実行できるようにすることが好ましい。

上記の処理と同時に、第一の目的細胞上の分子Ａの蛍光強度および第二の目的細胞上の分子Ｂの蛍光強度から、分子Ａおよび分子Ｂのそれぞれの発現量情報を取得することができる。また、第一の目的細胞および第二の目的細胞の位置情報から、第一の目的細胞および第二の目的細胞が互いに近接する群を検出することもできる。これらの処理も自動的に実行できるようにすることが好ましい。

一方、本発明の第二実施形態における上記のプログラムはさらに、核酸増幅反応を行ったマイクロチャンバーに含まれる蛍光体から発せられる蛍光を表した蛍光画像について、その画像内でピクセル情報（輝度、色彩）が所定の特徴を有する領域を、分子Ａを発現している第一の目的細胞および／または分子Ｂを発現している第二の目的細胞を収容したマイクロチャンバーとして検出する処理；そのようにして検出されたマイクロチャンバーの数を計測する処理；これらの処理を撮像した全ての視野について順次行う処理などを、自動的に実行できるようにすることが好ましい。また、蛍光画像ではなく、例えば前述した走査型の装置により分子Ａおよび分子Ｂの蛍光強度に関するデータを取得した場合も、分子Ａを発現している第一の目的細胞および／または分子Ｂを発現している第二の目的細胞を収容したマイクロチャンバーとして検出する処理など、上記と同様の処理を自動的に実行できるようにすることが好ましい。さらに、第一実施形態のときと同様、蛍光強度に基づいて発現量情報および／または位置情報を取得することもできる。なお、細胞展開用基板上に形成された１つのマイクロチャンバー内にそれらの細胞の両方が含まれている（分子Ａおよび分子Ｂの両方の蛍光が検出される）ときに、それらの細胞が近接しているとみなすことが可能であるが、より至適な場合は、１つのマイクロチャンバー内に存在する分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞の少なくとも一方の数が十分に大きな場合である。

データ処理機構はさらに、上述したような同定および検出の結果を用いて次のような情報を解析する機能を備えていてもよい。本発明の第一実施形態における上記プログラムは、たとえば、第一の目的細胞および第二の目的細胞のそれぞれの計測数と、分子Ａを発現している第一の目的細胞および分子Ｂを発現している第二の目的細胞のそれぞれの計測数を対比し、第一の目的細胞の全数に対する分子Ａを発現している第一の目的細胞の数の比率と、第二の目的細胞の全数に対する分子Ｂを発現している第二の目的細胞の数の比率を、自動的に算出できるようにすることが好ましい。また、本発明の第二実施形態における上記プログラムは、たとえば、核酸検出工程を行う前に撮影された３種の蛍光画像の統合画像とその画像内のマイクロチャンバーの位置を示す情報から計測した、第一の目的細胞を収容したマイクロチャンバーおよび第二の目的細胞を収容したマイクロチャンバーのそれぞれの数と、核酸検出工程において撮影された蛍光画像とその画像内のマイクロチャンバーの位置を示す情報から計測した、分子Ａを発現している第一の目的細胞を収容したマイクロチャンバーおよび分子Ｂを発現している第二の目的細胞を収容したマイクロチャンバーのそれぞれの数を対比し、第一の目的細胞を収容したマイクロチャンバーの全数に対する分子Ａを発現している第一の目的細胞を収容したマイクロチャンバーの数の比率と、第二の目的細胞を収容したマイクロチャンバーの全数に対する分子Ｂを発現している白血球を収容したマイクロチャンバーの数の比率を、自動的に算出できるようにすることが好ましい。

データ処理機構は、さらにデータ提示手段として、上述したような解析の結果を用いて、それらの分子間の相互作用が関与する疾患の治療または予防に係る薬剤の投与判断に関するデータを提示する機能を備えることが好ましい。たとえば、ＣＴＣにおいて分子Ａが発現している、ないし患者由来の血液検体が分子Ａを発現しているＣＴＣを含有していると判定するための閾値を予め記憶しておき、検出工程で得られた発現量情報の測定値と対比して、後者の測定値が前者の閾値以上である場合に、分子Ａの機能を阻害する物質であって薬剤として用いられるもの（前記薬剤ａ）および分子Ｂの機能を阻害する物質であって薬剤として用いられるもの（前記薬剤ｂ）は、その患者の疾患の治療または予防に有効であるとの判定結果を示すようにしてもよい。同様に、検出工程で得られた位置情報に基づく、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞が互いに近接している群の数と、それに関する閾値とを対比して、前記薬剤ａおよび前記薬剤ｂの有効性に関する判定結果を示すようにしてもよい。

（制御機構）
制御機構は、所定の工程ないし手順にしたがって細胞検出方法を実施できるよう、細胞解析装置の各種の機器類に接続され、それらの機器類の挙動を制御することのできる機構であり、一般的には、そのような制御用プログラム、そのプログラムをコンピュータが実行可能な様式で記憶した記憶媒体、およびそのプログラムを実行可能なコンピュータにより構築することができる。このような制御手段は、送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置に接続して使用される、別個の装置（パーソナルコンピュータ等）として設けてもよいし、マイコンのように送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置内に組み込まれるものであってもよい。制御プログラムは、コンピュータが内蔵する記憶媒体に記憶されていてもよいし、ネットワークまたは取り外し可能な記憶媒体を介してパーソナルコンピュータが利用できる状態に置かれていてもよい。

制御プログラムにより、細胞展開手段（工程）、染色手段（工程）、画像取得手段（工程）などに関する操作を自動化することができる。例えば、所定のタイムスケジュールで、細胞展開工程における細胞懸濁液や、染色工程における染色液を送液するよう送液系機構を操作したり、染色剤に含まれる蛍光体に対応した所定の励起光を照射し、その蛍光画像を撮影するよう光学系機構を操作したりできるものである。本発明の第二実施形態においてはさらに、所定のタイムスケジュールで、核酸検出工程における核酸増幅反応試薬、封止液などを送液するような送液系機構の操作、核酸増幅反応に従いマイクロチャンバーを加熱または冷却するためのマイクロチャンバー温度調節機構の操作、核酸の増幅産物から発せられる蛍光を検出するための、蛍光標識核酸増幅用プローブの蛍光体に対応した所定の励起光の照射および蛍光画像の撮影を行う光学系機構の操作などを、制御プログラムによって自動的に行うことができる。

さらに、制御機構は、細胞の染色や核酸の増幅に関して取得されたデータ、例えば目的細胞の同定や目的分子の遺伝子の検出に関する蛍光、および任意で行ってもよい、マイクロチャンバーの位置特定に関する透過光、反射光または自家蛍光や、撮影された蛍光画像を記憶し、適切な工程でそれらを読み出したり、適切な機構にそれらを受け渡したりする機能、そのためのプログラムをさらに有することが好ましい。

＜流路デバイス＞
流路デバイスは、細胞展開用基板および流路形成部材によって構築されており、これらによって閉鎖されている空間が、細胞懸濁液等の液体を送液して満たすことのできる流路となっている。細胞展開用基板と流路形成部材とは、観察やメンテナンスのしやすさの観点から、係合、ねじ固定、粘着等の手段で取り付け・取り外しが可能なようになっていてもよい。流路の上流側および下流側の末端付近の天井側、すなわち流路形成部材には、上記の各種の液体を流入および排出させるための流入口および排出口が形成されている。

流路の高さ（細胞展開用基板と天板部材の間隔、すなわち枠部材の厚さ）は、５０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。流路の高さがそのような範囲内であると、流路内の細胞懸濁液（そこに含まれる細胞）を送液の力で容易に移動させることができるとともに、流路の細胞による目詰まりが発生しにくいため、細胞を円滑に展開することができる。

流路形成部材は、流路に所定の高さを持たせるための空隙を生み出すとともに流路の平面的な範囲を形作る、流路の側壁を形成する枠部材と、枠部材の上に載せられ流路の天井を形成する天板部材によって構築することができる。天板部材は、流出口と連通している、細胞懸濁液等の液体を一時的に貯留する空間（リザーバー）を備えていてもよい。また、細胞がマイクロチャンバーに細胞が入り込みやすい流れを生じるように、流路の天井部は凹凸のような構造を有してもよい。前記凹凸の位置は、例えばマイクロチャンバーの中心と凹部および凸部の中心とがずれる（垂直線上に来ない）ように調整することができ、そのような位置とすることで細胞懸濁液等の流れが凹部および凸部を境にマイクロチャンバー方面に変化し、細胞が入り込みやすくなる。

細胞展開用基板および流路形成部材は、例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンコポリマー等のプラスチック、あるいは石英ガラス等のガラスなど、透明な材料で作製されたものが好ましい。細胞解析システムでは通常、蛍光染色された細胞を観察し、撮像するので、細胞解析装置の光学検出系によって特定の細胞を標識した蛍光を測定できるよう、少なくとも流路形成部材のうち天板部材に相当する部分は透明な素材で作製する必要がある。また、枠部材は、適度な弾性と粘着性を有するシリコン樹脂（ポリジメチルシロキサン：ＰＤＭＳ等）のような材料で作製されていてもよく、この枠部材を細胞展開用基板および天板部材で挟み込むことによって流路デバイスを構築するようにしてもよい。

＜試薬収容器＞
試薬収容器には、細胞懸濁液、染色液（蛍光標識抗体溶液、核染色剤溶液、またはそれらの混合溶液等）、洗浄液、また本発明の第二実施形態においては核酸増幅反応試薬および封止液、その他の必要な溶液など、細胞検出方法を実施する上で流路に送液する必要のある各種の液体が収容されている。例えば、封止液、洗浄液など比較的保存性の高い液体は、密封された状態であらかじめ試薬収容器の所定の部位に収容しておくことが可能であり、細胞懸濁液、染色液、核酸増幅反応試薬など細胞の染色や核酸の増幅を行う直前に調製する必要のある液体は、調製後に試薬収容器の所定の部位に添加して収容させることができるようにする。洗浄液などのように複数回使用される溶液は、各工程に対応した容量の溶液を別個の部位に収容しておいてもよいし、各工程で同一の組成の溶液を繰り返し使用する場合はそれらの合計の用量の液体を１つの部位に収容しておいてもよい。また、試薬収容器には必要に応じて、送液後に吸引して流路から排出させた廃液を貯留する部位を設けておくようにする。

［実施例１：免疫染色による検出］
（ａ）検体処理工程
分離液としてPercoll（ＧＥヘルスケア、比重１．１１３）を利用した密度勾配遠心により、健常者由来の血液検体から赤血球を除去した。その血液検体に、ＰＤ−Ｌ１陽性のＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞（ヒト膵臓癌由来細胞株）とＰＤ−１を過剰発現させたＴ細胞をそれぞれ約１０００個、約１００００個ずつ添加したものを患者検体に代わるモデルサンプルとした。このサンプルを遠心して上清を除いた後、２０ｖ／ｖ％ホルマリン液（和光純薬）（ホルムアルデヒドの濃度としては、８ｗ／ｗ％）をホルムアルデヒドが４ｗ／ｗ％になるようにＰＢＳで希釈した溶液と、２０分間室温で反応させて、細胞の固定化処理を行った。

（ｂ）細胞展開工程
直径１００μｍ、深さ５０μｍのマイクロチャンバーを２００００個形成した細胞展開用基板と出入口を有する高さ０．１ｍｍ、幅１５ｍｍの流路を形成できる流路形成部材とで流路デバイスを形成し、一方の出入口をシリンジポンプに連結し、もう一方に試薬を添加するためのリザーバーを形成した。プレウェット液としてＰＢＳをシリンジポンプによる押出で、吸引部側からリザーバー側に、４０ｍＬ、４０ｍＬ／ｍｉｎの流量で、流路内に導入した。固定化された細胞サンプルは、使用する直前にＰＢＳで２回遠心洗浄を行った後、リザーバーに添加し、シリンジポンプによる吸引で、１００μＬ、０．１ｍＬ／ｍｉｎの流量で流路内に導入して、マイクロチャンバー内に細胞を収容した。

（ｃ）染色工程
浸透化処理のためのＴｗｅｅｎ２０を０．１％、およびブロッキング処理のためのＢＳＡを３ｗ／ｖ％含むＰＢＳ溶液に、白血球の特定のためのＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体（ベックマンコールター）、ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞（ヒト膵臓癌由来細胞株）の特定のためのＰＥ標識抗サイトケラチン抗体（ベクトンディッキンソン）、および細胞核に結合するＨｏｅｃｈｓｔ、さらにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７標識抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＣＳＴ）とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ７５０標識抗ＰＤ−１抗体（Miltenyi Biotec）を加えた溶液を調製した。この溶液をリザーバーからシリンジポンプによる吸引で導入し、３０分間静置して固定化した細胞と反応させ、その後ＰＢＳで３回洗浄した。

（ｄ）画像取得工程
染色された細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、ＦＩＴＣ、ＰＥ、Ｈｏｅｃｈｓｔ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ７５０のそれぞれに対応した画像を撮影し、それらの撮影画像を統合した。

（ｅ）同定工程
画像取得工程（ｄ）において統合された撮影画像から、ＣＤ４５（ＦＩＴＣ）陰性、サイトケラチン（ＰＥ）陽性、核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）がある細胞をがん細胞＝ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞と同定し、それ以外の核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）がある細胞を白血球と同定した。

（ｆ）検出工程
さらに、同定工程（ｅ）においてがん細胞と同定した細胞のうち、ＰＤ−Ｌ１（Alexa Fluor(登録商標) 647）陽性の細胞をＰＤ−Ｌ１発現細胞数として検出し、その細胞数は８６０個と計測された。また、白血球と同定した細胞のうち、ＰＤ−１（Alexa Fluor(登録商標) 750）陽性の細胞をＰＤ−１発現細胞数として検出し、その細胞数は９３００個と計測された。がん細胞のうちＰＤ−Ｌ１分子を発現している細胞の割合は９１％（８６０／９５０）であり、白血球のうちＰＤ−１分子を発現している細胞の割合は３％（９３００／３１００００）であった。

以上のように、一定容量の血液検体中に含まれるＰＤ−Ｌ１発現がん細胞数およびＰＤ−１発現白血球数がそれぞれ示されることで、抗ＰＤ−Ｌ１抗体等の薬剤における有効性について判断することができる。また、全がん細胞中のＰＤ−Ｌ１を発現しているがん細胞の割合および全白血球中のＰＤ−１を発現している白血球の割合をそれぞれ示すこともできる。

［実施例２：ＰＣＲによる検出］
目的分子の発現量情報を、ＰＣＲで計測した"マイクロチャンバー数"に基づいて解析する実施形態として、工程（ａ）、（ｂ）および（ｅ）は実施例１と同様に行い、また工程（ｃ）および（ｄ）においてはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７標識抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＣＳＴ）とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ７５０標識抗ＰＤ−１抗体（Miltenyi Biotec）を添加せず、したがってそれぞれに対応する画像の取得は行わないこと以外は実施例１と同様に行った。工程（ｆ）および（ｇ）は以下のような工程（ｆ'）および（ｇ'）に変更して行った。

（ｆ'）核酸検出工程
核酸増幅反応試薬として、ＰＤ−Ｌ１遺伝子およびＰＤ−１遺伝子を増幅対象とするリアルタイムＰＣＲ用の反応試薬（TaqMan Universal Master Mix II, Life Technologies）を２００μＬ調製した。プライマー（forward およびreverse）、プローブの塩基配列は下記の通りである。
（ｉ）ＰＤ−Ｌ１遺伝子増幅用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄプライマー： ５'−ＧＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧ−３'
ｒｅｖｅｒｓｅプライマー： ５'−ＴＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＴ−３'
プローブ： ５'−ＦＡＭ−ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３'
（ｉｉ）ＰＤ−１遺伝子増幅用プライマー
ｆｏｒｗａｒｄプライマー： ５'−ＡＴＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧ−３'
ｒｅｖｅｒｓｅプライマー： ５'−ＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＧＧＴＴＧＧＣＣＧ−３'
プローブ： ５'−ＨＥＸ−ＧＧＧＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＣＡ−ＢＨＱ−２−３'
（ｆ'−１）核酸増幅反応試薬送液工程
上記反応試薬２００μＬを、シリンジポンプによる吸引で、リザーバー側から０．１ｍＬ／ｍｉｎの流量で流路内に導入した。

（ｆ'−２）封止液送液工程
ミネラルオイル（MP Biomedicals, Inc. 194836）２００μＬを、シリンジポンプによる吸引で、リザーバー側から０．１ｍＬ／ｍｉｎの流量で流路内に導入した。

（ｆ'−３）核酸増幅反応進行工程および測定工程
マイクロチャンバー内に細胞および核酸増幅反応試薬が格納され、ミネラルオイルで封止された流路デバイスに対して、９５℃で３０秒、６０℃で１分間の熱反応サイクルを４０サイクル行った。その後、全てのマイクロチャンバーに対してＦＡＭおよびＨＥＸの蛍光強度を測定した。

（ｆ'−４）検出工程
同定工程（ｅ）においてがん細胞が存在していたマイクロチャンバーの数は９３０個であり、そのうち８４０個、９０％に相当するマイクロチャンバーでＰＤ−Ｌ１の発現を示すＦＡＭによる蛍光を認めた。また、同定工程（ｅ）において白血球が存在していたマイクロチャンバーの数は２００００個（白血球と同定された細胞は２７００００個）であり、そのうち５７００個、全白血球数の２％（５７００／２７００００）に相当するマイクロチャンバーでＰＤ−１の発現を示すＨＥＸによる蛍光を認めた。

以上のように、一定容量の血液検体中に含まれるＰＤ−Ｌ１発現がん細胞数およびＰＤ−１発現白血球数がそれぞれ示されることで、抗ＰＤ−Ｌ１抗体等の薬剤における有効性について判断することができる。また、全がん細胞中のＰＤ−Ｌ１を発現しているがん細胞の割合および全白血球中のＰＤ−１を発現している白血球の割合をそれぞれ示すこともできる。

配列番号１；ＰＤ−Ｌ１ ｆｏｒｗａｒｄ プライマー
配列番号２；ＰＤ−Ｌ１ Ｒｅｖｅｒｓｅ プライマー
配列番号３；ＦＡＭ修飾プローブ
配列番号４；ＰＤ−１ ｆｏｒｗａｒｄ プライマー
配列番号５；ＰＤ−１ Ｒｅｖｅｒｓｅ プライマー
配列番号６；ＨＥＸ修飾プローブ

Claims (11)

1. 下記（ａ）〜（ｆ）の各工程を含む血中細胞の同時検出方法：（ａ）患者の血液から赤血球を除去する工程（検体処理工程）；（ｂ）工程（ａ）で処理を行った既定量の血液を細胞展開用基板に添加し、第一の目的細胞および第二の目的細胞を基板上に並べる工程（細胞展開工程）；
   （ｃ）第一の目的細胞と第二の目的細胞の各細胞マーカーおよび核マーカーを蛍光体で染色する工程（染色工程）；
   （ｄ）工程（ｃ）で染色した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像を取得する工程（画像取得工程）；
   （ｅ）工程（ｄ）で取得した各細胞マーカーおよび核マーカーの蛍光画像から、第一の目的細胞および第二の目的細胞を同定する工程（同定工程）；
   （ｆ）工程（ｅ）で第一の目的細胞と同定された細胞のうち特定の分子（分子Ａ）を発現している細胞、および工程（ｅ）で第二の目的細胞と同定された細胞のうち分子Ａと相互作用する他の特定の分子（分子Ｂ）を発現している細胞を検出する工程（検出工程）。
2. 上記工程（ｆ）における検出を、分子Ａと分子Ｂの各蛍光染色に基づいて行い、
   そのために上記工程（ｃ）において分子Ａと分子Ｂを蛍光体で染色することをさらに含む、請求項１に記載の血中細胞の同時検出方法。
3. 上記細胞展開用基板としてマイクロチャンバーを備えたものを使用し、
   上記工程（ｆ）における検出を、分子Ａと分子Ｂの各蛍光染色に基づいて行うのに代えて、またはそれを行うとともに、マイクロチャンバー内における分子Ａと分子Ｂの各遺伝子の核酸増幅反応に基づいて行う、請求項１または２に記載の血中細胞の同時検出方法。
4. 上記工程（ｆ）における検出が、分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞のそれぞれの位置情報を取得し、互いに近接する群を検出することをさらに含む、請求項１または２に記載の血中細胞の同時検出方法。
5. 上記工程（ｄ）において分子Ａと分子Ｂの蛍光画像を取得することをさらに含み、または上記工程(ｆ)において細胞展開用基板の蛍光画像を取得することを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
6. 上記細胞展開用基板として基準点（レクチルマーク）を備えたものを用いることで、細胞展開用基板上の細胞の位置またはマイクロチャンバーの位置を特定した上で蛍光を測定することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
7. 上記工程（ｆ）においてさらに、第一の目的細胞の分子Ａと第二の目的細胞の分子Ｂのそれぞれの発現量情報を取得することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
8. 上記工程（ａ）において、密度勾配遠心によって赤血球と顆粒球を除去する方法をとる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
9. さらに、（ｇ）
   (i)工程（ｆ）で取得した分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞のそれぞれの細胞割合情報、
   (ii)工程（ｆ）で取得した分子Ａを発現する第一の目的細胞と分子Ｂを発現する第二の目的細胞のそれぞれの位置情報、および
   (iii)工程（ｆ）で取得した分子Ａと分子Ｂのそれぞれの発現量情報、
   から選ばれる少なくとも一つの情報に基づいて、それらの分子間の相互作用が関与する疾患の治療または予防に係る薬剤の投与判断に関するデータを提示する工程（データ提示工程）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
10. 上記第一の目的細胞がＣＴＣであり上記第二の目的細胞が白血球である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の血中細胞の同時検出方法。
11. 上記第一の目的細胞であるＣＴＣが発現する分子ＡはＰＤ−Ｌ１であり、上記第二の目的細胞である白血球が発現する分子ＢはＰＤ−１である、請求項１０に記載の血中細胞の同時検出方法。

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