CN117405804A - 一种南瓜子及制剂的特征图谱、构建方法及质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药制剂质量检测技术领域，具体涉及一种南瓜子药材及制剂的特征图谱，并进一步公开所述特征图谱的构建方法，以及南瓜子药材及制剂的质量检测方法。本发明所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，基于HPLC方法建立南瓜子原药材及南瓜子水提药物制剂的特征图谱方法，并通过对检测方法的优化，色谱条件容易实现，供试品处理方法制作简便。该分析方法验证结果表明，该方法操作简便，结果准确，方法重现性较好，可全面展现南瓜子的化学成分，扩宽南瓜子的使用途径。

Description

一种南瓜子及制剂的特征图谱、构建方法及质量检测方法
技术领域
本发明属于中药制剂质量检测技术领域，具体涉及一种南瓜子药材及制剂的特征图谱，并进一步公开所述特征图谱的构建方法，以及南瓜子药材及制剂的质量检测方法。
背景技术
南瓜子又称南瓜仁、白瓜子、金瓜子，为葫芦科南瓜属植物南瓜Cucurbitamoschata(Duch.)Poiret.的种子，在秋季采摘成熟果实，取出种子后洗净晒干得到。现代药理研究表明，南瓜子油润且富含油脂，含有丰富的氨基酸、不饱和脂肪酸、谷固醇、磷脂、单糖类、维生素、蛋白质、胡萝卜素、生物碱类等多种化合物，以及锌、镁、铁等人体所必需的营养元素。南瓜子性味甘平，归味经、大肠经，有驱虫、润肠通便、健脾、利水、下乳的作用。南瓜子具有驱除寄生虫、降低LDL胆固醇、抗炎、抗氧化、缓解高血压、降低膀胱和尿道压力等作用，且毒性很小，常用于大便秘结，以及肠道丝虫、蛲虫、蛔虫、绦虫驱虫等。南瓜子中含有大量磷脂，经常吃南瓜子可防止矿物质在人的尿道系统凝结，使之随尿排出体外，可以预防肾结石的发生。更重要的是，南瓜子中的活性成分和丰富的锌元素，对前列腺有保健作用，经常吃南瓜子，对预防和改善男子前列腺疾病具有很好的药用功效。同时，南瓜子同时也是一味药食两用的中药。
目前，南瓜子未被收载于《中国药典》中，虽然有省市的中药材标准、中药饮片炮制规范等收载了南瓜子，但研究参考较为局限。尤其是目前文献中尚未见到关于南瓜子指纹图谱的研究报道。
如中国专利CN107389845A公开了一种南瓜子的高效液相色谱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，即利用HPLC法建立南瓜子提取物指纹图谱，以南瓜子醇提物为研究对象，10批南瓜子醇提物样品特征图谱中有18个共有峰，但多批中南瓜子药材的相似度差异较大，且图谱中特征峰较为集中，系统适应性参数缺失，图谱分离度可能难达标，峰对称度较差，供试品前处理方法较为复杂，影响其方法使用局限性很大。
因此，为科学有效地控制其内在质量，有必要建立南瓜子的指纹图谱。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种可全面反映南瓜子及其制剂内在质量和用药安全的特征图谱的构建方法；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种南瓜子及其制剂的质量检测方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，包括对南瓜子及制剂的供试品溶液进行高效液相色谱检测的步骤；
色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：
0-10min，A：B为0→4％：100％→96％；
10-35min，A：B为4％→7％：96％→93％；
35-42min，A：B为7％→22％：93％→78％；
42-50min，A：B为22％→36％：78％→64％。
具体的，所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，所述高效液相色谱检测步骤中，色谱条件还包括：柱温22-28℃，流速为0.8-1.2ml/min，检测波长为210nm。
具体的，所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，所述供试品溶液的制备方法包括：取供试品加水进行加热回流提取，滤过并收集续滤液，即得。
具体的，所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，所述方法还包括制备对照药材参照物溶液的步骤，具体包括：取南瓜子对照药材，加水进行加热回流提取，滤过并收集续滤液，即得所需对照药材参照物溶液。
具体的，所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，所述方法还包括制备对照品参照物溶液，以及，基于所述高效液相色谱法构建对照品指纹图谱的步骤；
所述对照品包括苯丙氨酸。
具体的，所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，所述南瓜子制剂包括南瓜子配方颗粒或南瓜子饮片标准汤剂。
本发明还公开了一种南瓜子及制剂的特征图谱和/或对照特征图谱，所述南瓜子及制剂的特征图谱和/或对照特征图谱由所述方法构建得到。
具体的，供试品色谱中应呈现13个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的13个特征峰保留时间相对应。其中，峰7应与相应的对照品参照物峰的保留时间相对应，与苯丙氨酸对照品参照物峰相对应的峰为S峰；计算其余各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.27(峰1)、0.37(峰2)、0.49(峰2)、0.53(峰4)、0.60(峰3)、0.71(峰6)、1.10(峰8)、1.28(峰9)、1.40(峰10)、1.85(峰11)、2.22(峰12)、2.31(峰13)。
本发明还公开了所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法和/或所述南瓜子及制剂的特征图谱和/或对照特征图谱在南瓜子及其药物制剂质量检测领域的应用。
本发明还公开了一种南瓜子及其药物制剂的质量检测方法，包括按照所述方法构建所述特征图谱和对照特征图谱的步骤，以及，将所述特征图谱与对照特征图谱进行比较的步骤。
具体的，所述南瓜子及其药物制剂的质量检测方法，还包括进行薄层色谱鉴别的步骤；
具体的，所述薄层色谱鉴别的步骤包括：
取供试品加入稀乙醇进行超声，滤过并收取滤液蒸干，取残渣加稀乙醇溶解，得到所需供试品溶液；
取丙氨酸对照品加稀乙醇混匀，得到所需对照品溶液；
按照薄层色谱法试验，以体积比为15：4：5：5的正丁醇-甲醇-冰乙酸-水为展开剂，进行薄层色谱检测。
本发明所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，基于HPLC方法建立南瓜子原药材及南瓜子水提药物制剂的特征图谱方法，并通过对检测方法的优化，色谱条件容易实现，供试品处理方法制作简便。该分析方法验证结果表明，该方法操作简便，结果准确，方法重现性较好，可全面展现南瓜子的化学成分，扩宽南瓜子的使用途径。
本发明所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，以药材及其相关制剂为研究对象，确认了13个共有特征峰，指认了苯丙氨酸和酪氨酸2个特征成分，在该色谱条件下，通过对南瓜子药材及其相关制剂的检测，所建立的特征图谱特征成分显著、分离效果好，可以简单、快速的鉴定南瓜子中药材及其相关制剂(标准汤剂冻干粉、配方颗粒)中所含化学成分的种类和数量。
本发明所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，提供了特征图谱色谱条件优化过程，方法学验证过程及多批次药材、标准汤剂冻干粉、配方颗粒检测结果，确认了13个共有特征峰，指认了苯丙氨酸和酪氨酸2个特征成分；薄层鉴别提供了方法学及其多批检测结果。所建立的南瓜子特征图谱及薄层鉴别方法为南瓜子药材及相关制剂鉴别提供一种快速、可靠的检测方法，也为南瓜子药材及药物制剂提供一种更为全面、客观、快速的质量评价方法，同时对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。
本发明所述南瓜子及其药物制剂的质量检测方法，基于上述建立的特征图谱及薄层色谱法进行鉴别，以药材及其相关制剂为研究对象，确认了13个共有特征峰，指认了苯丙氨酸以及酪氨酸2个特征成分，在该色谱条件下，通过对南瓜子药材及其相关制剂的检测，以南瓜子水溶性成分，建立了南瓜子药材及南瓜子药物制剂的特征图谱方法以及薄层鉴别方法，且薄层鉴别方法RF值较好，斑点较为明显，图谱所展示的结果较为清晰，能够全面反映南瓜子药材及南瓜子药物制剂内在质量和用药安全，为南瓜子药材的鉴别提供一种快速、可靠的检测方法。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为实施例1中南瓜子标准汤剂(冻干粉)样品色谱图；
图2为实施例2中不同梯度洗脱程序下检测的色谱图；
图3为实施例2中不同检测波长下的色谱图；其中，(a)为210nm，(b)为254nm，(c)为300nm；
图4为实施例2中不同流动相组成下检测的色谱图；其中，(a)为纯水溶液系统、(b)为0.1％乙酸系统，(c)为0.1％磷酸系统；
图5为实施例2中不同色谱柱下检测的色谱图；其中，(a)为Waters AtlantisTMT3，(b)为capcell pak adme；
图6为实施例3中考察不同提取溶剂下的特征图谱；其中，(a)为水，(b)为10％甲醇，(c)为70％甲醇；
图7为实施例4中南瓜子标准汤剂HPLC特征图谱；
图8为实施例4中对照品定位谱图；其中，(a)为苯丙氨酸对照品，(b)为酪氨酸对照品；
图9为实施例5中仪器精密度考察色谱图；
图10为实施例5中方法重复性考察色谱图；
图11为实施例5中不同人员考察色谱图结果；
图12为实施例5中稳定性试验考察色谱图；
图13为实施例5中不同流速考察色谱图；
图14为实施例5中不同柱温考察色谱图；
图15为实施例5中南瓜子药材对照谱图；
图16为实施例6中仪器精密度考察色谱图；
图17中(a)为实施例6中南瓜子标准汤剂特征图谱，(b)为实施例6中阴性对照色谱图；
图18为实施例6中方法重复性考察色谱图；
图19为实施例6中稳定性试验考察色谱图；
图20为实施例6中不同人员考察色谱图；
图21为实施例6中不同流速考察色谱图；
图22为实施例6中不同柱温考察色谱图；
图23为实施例8中南瓜子标准汤剂(冻干粉)对照图谱；
图24为实施例10中薄层色谱中不同点样量考察结果；
图25为实施例10中薄层色谱中专属性考察结果；
图26为实施例10中薄层色谱中不同温度下考察结果；其中，(a)为低温5℃条件，(b)为常温25℃条件；
图27为实施例10中薄层色谱中不同湿度下考察结果；其中，(a)为湿度84％条件，(b)为湿度68％条件，(c)为湿度32％条件；
图28为实施例10中薄层色谱中不同厂家薄层板的考察结果；其中，(a)为青岛硅胶G板，(b)为默克硅胶G板，(c)为烟台硅胶G板
图29为实施例11中多批次南瓜子配方颗粒薄层鉴别结果；
图30为实施例12中多批次南瓜子冻干粉薄层鉴别结果。
具体实施方式
本发明如下实施例中，特征图谱的构建过程参照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版通则0512)测定，薄层色谱法照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验。
本发明如下实施例中，涉及的仪器及试剂包括：
仪器
色谱仪1赛默飞UltiMate 3000色谱系统，包括LPG-3400SDN四元泵、WPS-3000SLANALYTICAL自动进样器、TCC-3000SD柱温箱、VWD-3100二极管阵列紫外检测器、色谱工作站；
色谱仪2：高效液相色谱仪：waters e2695色谱系统，包括四元梯度输液泵(ALLiance2695型)、120位高性能自动进样器、原装进口色谱柱温箱、Waters 2998二极管阵列紫外检测器、Empower色谱工作站；
电子分析天平：METTLER TOLEDO(瑞士梅特勒)ME36S(百万分之一)、XSE205(十万分之一)；
超声仪：SK5200H上海科导超声仪器有限公司；
色谱柱：
(1)Waters AtlantisTM T3,(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)；
(2)capcell pak adme(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)；
试剂及试药
甲醇为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯；
苯丙氨酸对照品：购于中国食品药品检定研究院，批号140676-201706，纯度：100.0％；
酪氨酸对照品：购于中国食品药品检定研究院，批号140609-202215，纯度：100.0％；
南瓜子对照药材：购于上海鸿永生物科技有限公司，批号330023-202301。
本发明如下实施例中，南瓜子批次信息如下表1所示。
表1南瓜子批次信息
药材批号 标准汤剂批号 产地
2102001 2103001Y 安徽亳州
2102002 2103002Y 安徽亳州
2102003 2103003Y 安徽亳州
2102004 2103004Y 安徽阜阳
2102005 2103005Y 安徽阜阳
2102006 2103006Y 安徽阜阳
2102007 2103007Y 山东潍坊
2102008 2103008Y 山东潍坊
2102009 2103009Y 山东潍坊
2102010 2103010Y 山东济宁
2102011 2103011Y 山东济宁
2102012 2103012Y 山东济宁
2102013 2103013Y 河南商丘
2102014 2103014Y 河南商丘
2102015 2103015Y 河南商丘
实施例1特征图谱方法建立
参照物溶液的制备
取南瓜子对照药材2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流提取30分钟，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取苯丙氨酸对照品适量，精密称定，加10％甲醇制成每1ml各含50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备
取待测的南瓜子标准汤剂(过5号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件与系统适应性
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以水溶液为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；检测波长210nm，柱温25℃。理论板数按苯丙氨酸峰计算应不低于3000。
表2梯度洗脱程序
测定法
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录系统适应性参数见下表3，记录色谱图见附图1，即得。
表3系统适应性参数
本实施例中，参照南瓜子相关文献中药材的特征图谱条件，对南瓜子标准汤剂(冻干粉)特征图谱进行考察，最终确定了南瓜子标准汤剂(冻干粉)特征图谱的液相色谱条件，该色谱条件系统适应性良好，适合南瓜子标准汤剂(冻干粉)特征图谱的测定。
由图表可知色谱方法系统适应性和专属性良好，可以作为南瓜子及其制剂特征图谱的检测方法。
实施例2色谱条件的选择
本实施例参考南瓜子特征图谱相关研究并根据相关文献，进行相应色谱条件的筛选及优化。
1、洗脱程序优化
本实施例中，通过比较不同洗脱程序所测定的样品色谱图，从中优选色谱信息较丰富，主要色谱峰分离度较好，基线较平稳且分析时间较为合理的梯度。
本实施例中，供试品前处理方法为：取南瓜子标准汤剂冻干粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，即得。
本实施例中，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)，以甲醇为流动相A，以水溶液为流动相B，按下表4中梯度1-9的程序，对同一份提取样品进行洗脱并测定，检测波长210nm，柱温25℃，流速为每分钟1.0ml，进样量10μL。
表4梯度洗脱程序
本实施例中，不同梯度洗脱程序下，检测的色谱图见附图2中(a)-(i)所示，各梯度程序下系统适应性参数结果见下表5。
表5不同梯度条件下系统适应性参数
通过上述考察结果，随着洗脱时间增加色谱峰分离效果变佳；梯度8的色谱峰较前几个梯度，分离效果较佳，而梯度9通过延长时间，提高了分离效果，呈现的图谱，色谱信息较丰富，主要色谱峰较多，分离度较好，基线较平稳，故确定了流动相梯度为梯度9做后续的条件筛选，以期达到更好地分离效果。
2、检测波长选择
取南瓜子标准汤剂(冻干粉)供试品溶液，按上述确定的梯度条件将供试品溶液注入液相色谱仪中，进行全波长扫描，根据图谱信息量，比较3个不同吸收波长下(210nm、254nm、300nm)的色谱图。以检测色谱峰数目，响应值，保留时间作为评选指标，筛选检测波长。
本实施例中，不同检测波长下检测的色谱图见附图3中(a)-(c)所示，各检测波长下系统适应性参数结果见下表6。
表6不同检测波长的系统适应性参数
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结果表明，波长210nm条件下色谱图的色谱峰较多，信息量大，故选择色谱峰信息相对丰富，系统适应性参数相对较优的吸收波长210nm作为南瓜子标准汤剂(冻干粉)特征图谱的检测波长进行后续考察。
3、流动相组成考察
本实施例考察不同酸浓度对南瓜子标准汤剂特征图谱分离效果的影响，分别比较了甲醇-水溶液系统、甲醇-0.1％乙酸系统、甲醇-0.1％磷酸系统。
本实施例中，不同流动相体系下检测的色谱图见附图4中(a)-(c)所示，各流动相下系统适应性参数结果见下表7。
表7不同流动相体系的系统适应性参数
上述结果表明，不同酸种类对各色谱峰的影响非常大，但甲醇-水洗脱体系呈现的色谱图中主要色谱峰的峰型及分离度较好，故选择甲醇-水做后续条件筛选考察。
4、不同色谱柱考察
按照以上确定的色谱条件，考察不同品牌色谱柱对南瓜子标准汤剂冻干粉特征图谱的影响。考察不同品牌色谱柱为：Waters AtlantisTM T3,(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)、capcell pak adme(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)
本实施例中，不同色谱柱下检测的色谱图见附图5中(a)-(b)所示。
结果表明，不同品牌色谱柱对各色谱峰的保留时间和峰的数目影响较大，WatersAtlantisTM T3，(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)对各色谱峰的分离效果较优，capcellpak adme品牌色谱柱在各色谱峰的保留时间和峰的数目等参数方面均达效果较差。因此，固定色谱柱品牌为Waters AtlantisTM T3，(柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm)色谱柱。
5、色谱条件的确定
按照上述筛选条件，本实施例中，色谱条件与系统适应性筛选结果如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以水溶液为流动相B，按下表8中的规定进行梯度洗脱；检测波长210nm，柱温25℃，流速为每分钟1.0ml，理论板数应不低于3000。
表8流动相洗脱程序
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-10 0→4 100→96
10-35 4→7 96→93
35-42 7→22 93→78
42-50 22→36 78→64
按照上述筛选条件，系统适应性参数见下表9。
表9系统适应性参数
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实施例3溶液的制备
1、对照品参照物溶液制备
本实施例中，采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，采用多批具有代表性南瓜子标准汤剂(冻干粉)样品生成对照特征图谱；并通过查阅文献，对南瓜子标准汤剂(冻干粉)各个特征峰的化学性质进行分析，选用苯丙氨酸对其进行定位指认。
取苯丙氨酸精密称定，加10％甲醇制成每1ml苯丙氨酸50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2、对照药材参照物溶液的制备
由于标准汤剂冻干粉为水提取后得到，为保证与对照药材的一致性，对照药材特征图谱供试品制备方法如下：取南瓜子对照药材2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
3、供试品溶液制备考察
本实施例中，考察不同提取溶剂(水、10％甲醇、70％甲醇)对南瓜子标准汤剂(冻干粉)特征图谱的影响。
分别取本品约0.50g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入不同提取溶剂20ml，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所得谱图结果如附图6中(a)-(c)所示。不同溶剂下色谱适应性参结果见下表10。
表10不同提取溶剂考察色谱适应性参数
/>
结合各峰色谱峰参数，结果表明，不同甲醇浓度提取所得特征图谱色谱峰的总峰面积差异较大且色谱峰少，信息量小，纯水溶液提取检测得到的色谱峰峰面积明显大于其他浓度甲醇提取检测的色谱峰，综合考虑确定提取溶剂为纯水。
综合以上的结果，本实施例中，南瓜子标准汤剂(冻干粉)供试液制备方法确定为：取供试品约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入纯水20ml，密塞，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，并确定进样体积为10μL。
实施例4
1、特征图谱特征峰确认和特征峰指认
本实施例对前述实施例1-3中南瓜子多批供试品指纹图谱的检测结果进行了分析(色谱柱：Waters AtlantisTM T3)，采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版，生成对照特征图谱并得到的南瓜子标准汤剂(冻干粉)HPLC特征图谱如附图7所示，可见其共有色谱峰13个。
如附图7所示谱图，13个特征峰通过对照品定位和指认，确定峰3为酪氨酸，峰7为苯丙氨酸，定位谱图分别见附图8中(a)-(b)，其中，S1为对照特征图谱。
2、特征图谱特征峰规定
特征图谱相对保留时间根据研究结果确定：南瓜子标准汤剂(冻干粉)供试品特征图谱中应呈现13个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的13个特征峰相对应，其中，7号峰的保留时间应与苯丙氨酸对照品参照物峰保留时间相对应。
参照峰S峰的选择依据：根据南瓜子冻干粉中特征峰的峰指认和峰选择结果，对照品易得的色谱峰为苯丙氨酸，且苯丙氨酸响应适中，出峰时间处于整个图谱的中部。
综上所述，将苯丙氨酸作为该特征图谱的S峰计算各特征峰的相对保留时间，结果见下表11-12。
表11南瓜子标准汤剂(冻干粉)对照图谱相对保留时间
峰1 峰2 峰3 峰4 峰5 峰6 峰7(S)
保留时间 5.283 7.4 9.823 10.437 11.87 14.133 19.87
相对保留时间 0.27 0.37 0.49 0.53 0.60 0.71 1.00
峰8 峰9 峰10 峰11 峰12 峰13
保留时间 21.857 25.357 27.717 36.683 44.15 45.887
相对保留时间 1.10 1.28 1.39 1.85 2.22 2.31
表12南瓜子对照药材特征图谱相对保留时间
峰1 峰2 峰3 峰4 峰5 峰6 峰7
保留时间 5.274 7.396 9.803 10.442 11.874 14.126 19.813
相对保留时间 0.27 0.37 0.49 0.53 0.60 0.71 1.00
峰8 峰9 峰10 峰11 峰12 峰13
保留时间 21.869 25.305 27.707 36.602 44.137 45.878
相对保留时间 1.10 1.28 1.40 1.85 2.23 2.32
实施例5南瓜子药材方法学考察
1、仪器精密度试验
取同一南瓜子药材供试品溶液，按前述确定的【特征图谱】方法重复进样6次，测定谱图见附图9，测定13个共有峰的相对保留时间、相对峰面积，具体结果见下表13-14。
表13仪器精密度相对保留时间结果
/>
表14仪器精密度相对峰面积结果
/>
上述结果表明，各共有峰与参照峰(峰S)的相对保留时间RSD值小于2.0％，表明仪器精密度良好。
2、方法重复性试验
取同一批次南瓜子药材供试品溶液，按前述实施例中【特征图谱】项下方法平行制备6份供试品溶液，测定谱图见附图10，测定13个共有峰的相对保留时间、相对峰面积，详细结果见下表15-16。
表15方法重复性相对保留时间结果
/>
表16方法重复性相对峰面积结果
结果表明，各共有峰与参照峰(峰S)的相对保留时间RSD值小于2.0％，相对峰面积RSD值小于4％，表明该方法重复性良好。
3、中间精密度(不同操作人员)
同一批南瓜子药材供试品溶液，实验人员甲、乙、丙，按前述实施例【特征图谱】项的供试品制备方法制备样品，并且用同一台设备测定各共有峰的相对保留时间，测定谱图见附图11，详细结果见下表17-18。
表17不同人员相对保留时间结果
表18不同人员相对峰面积结果
结果表明，各共有峰与参照峰(峰S)的相对保留时间RSD值均小于2.0％，相对峰面积RSD值小于4％，表明该方法的中间精密度良好。
4、耐用性(稳定性)考察
取同一南瓜子药材供试品溶液，分别在0h、4h、8h、12h、16h、24h按前述实施例【特征图谱】项下色谱条件测定，结果见附图12，计算13个特征峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见下表19-20。
表19稳定性试验相对保留时间结果
表20稳定性试验相对峰面积结果
结果表明，各共有峰与参照峰(峰S)的相对保留时间RSD值小于2.0％，相对峰面积RSD值小于2.6％，说明供试品溶液在24小时内稳定，满足测定需求。
5、不同流速的考察
取同一份南瓜子药材供试品溶液，按前述实施例中【特征图谱】测定方法，分别用0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min的流速进行测定，测定谱图见附图13，测定13个共有峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见下表21-22。
表21不同流速相对保留时间结果
表22不同流速相对峰面积结果
结果表明，不同流速发生微小变化时对各特征峰的相对峰面积稍有影响。因此，建议将该方法的流速固定在1.0mL/min。
6、不同柱温的考察
取同一份南瓜子药材供试品溶液，按前述实施例中【特征图谱】测定方法，分别在23℃、25℃、27℃的柱温下进行测定，测定谱图见附图14，测定13个共有峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见下表23-24。
表23不同柱温相对保留时间结果
/>
表24不同柱温相对峰面积结果
结果表明，峰8，峰10的相对保留时间稍有影响，说明柱温的微小变动对特征峰的相对保留时间影响较小，相对峰面积影响较大，故建议将柱温固定为25℃。
综上，本实施例中，由上述方法学考察结果，在建立的南瓜子药材【特征图谱】的13个共有峰中，以苯丙氨酸参照物峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间。各色谱峰在不同流速、不同柱温等因素上受一定程度的影响，为适应其耐用性，考虑将规定值范围控制在±10％以内。
由上述方法学考察结果，建立的南瓜子药材【特征图谱】的13个特征峰中，各色谱峰受不同流速、柱温因素均有一定程度上的影响，相对保留时间值处在-10％-10％范围，为适应其耐用性，考虑将S峰的相对保留时间范围控制在规定值的±10％范围之内；并选择固定色谱柱Waters T3 5μm，250×4.6mm为色谱柱，以甲醇为流动相A，以水溶液为流动相B，按规定程序进行梯度洗脱；柱温25℃；流速每分钟为1.0ml；检测波长210nm。理论板数按苯丙氨酸峰计算应不低于3000。
南瓜子药材供试品特征图谱中应呈现13个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的13个特征峰相对应，其中，7号峰的保留时间应与苯丙氨酸对照品参照物峰保留时间相对应。
实施例6 15批药材特征图谱测定
取15批南瓜子药材，按前述实施例5中拟定南瓜子药材【特征图谱】测定方法操作，南瓜子药材对照谱图见附图15，其中，峰3为酪氨酸，峰7(S)为苯丙氨酸。测定结果见下表25-26。
表25 15批南瓜子药材特征图谱测定相对保留时间结果
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/>
表26 15批南瓜子药材特征图谱测定相对峰面积结果
/>
/>
上述测定结果表明，15批南瓜子药材特征图谱呈现13个特征峰，与对照药材参照物色谱中的13个特征峰相对应，峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰8、峰9、峰10、峰11、峰12和峰13与S峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内。
实施例6南瓜子标准汤剂冻干粉分析方法学验证
1、仪器精密度试验
取同一南瓜子标准汤剂供试品溶液，按【特征图谱】方法重复进样6次，测定谱图见附图16，测定13个共有峰的相对保留时间、相对峰面积。具体结果见以下表27-28。
表27仪器精密度相对保留时间结果
/>
表28仪器精密度相对峰面积结果
/>
结果表明，各共有峰与参照峰(峰S)的相对保留时间RSD值小于2.0％，相对峰面积小于3％，表明仪器精密度良好。
2、专属性
供试品采用提取溶剂为水，精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，按确定的【特征图谱】的方法试验，南瓜子标准汤剂特征图谱见附图17中(a)，阴性对照色谱图见附图17中(b)所示。结果显示阴性无干扰。
3、重复性实验
取同一批次南瓜子标准汤剂供试品溶液，按【特征图谱】项下方法平行制备6份供试品溶液，测定谱图见附图18，测定13个共有峰的相对保留时间、相对峰面积，件下表29-30。
表29方法重复性相对保留时间结果
/>
表30方法重复性相对峰面积结果
结果表明，各共有峰与参照峰(峰S)的相对保留时间RSD值小于2.0％，相对峰面积小于5％，表明该方法重复性良好。详细结果见下列图表。
4、稳定性实验
取同一南瓜子标准汤剂供试品溶液，分别在0h、4h、8h、12h、16h、24h按【特征图谱】项下色谱条件测定，测定谱图见附图19，计算13个特征峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见下表31-32。
表31稳定性试验相对保留时间结果
表32稳定性试验相对峰面积结果
结果表明，各共有峰与参照峰(峰S)的相对保留时间RSD值小于2.0％，相对峰面积小于4％，表明供试品溶液在24小时内稳定，满足测定需求。
5、不同人员(中间精密度)
同一批南瓜子标准汤剂供试品溶液，实验人员甲、乙、丙，按【特征图谱】项的供试品制备方法制备样品，测定谱图见附图20，并且用同一台设备测定13个共有峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见下表33-34。
表33不同人员相对保留时间结果
表34不同人员相对峰面积结果
结果表明，各共有峰与参照峰(峰S)的相对保留时间RSD值小于2.0％，相对峰面积小于5％，表明该方法的中间精密度良好。
6、不同流速的考察
取同一份南瓜子标准汤剂供试品溶液，按【特征图谱】测定方法，分别用0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min的流速进行测定，测定谱图见附图21，测定13个共有峰的相对保留时间、相对峰面积，测定结果见下表35-36。
表35不同流速相对保留时间结果
/>
表36不同流速相对峰面积结果
结果表明，不同流速发生微小变化时，峰12、峰13的相对保留时间影响稍大，说明流速的微小变动对特征峰的相对保留时间影响较小。因此，建议将该方法的流速固定在1.0mL/min。
7、不同柱温的考察
取同一份南瓜子标准汤剂供试品溶液，按前述确定的【特征图谱】测定方法，分别在23℃、25℃、27℃的柱温下进行测定，测定谱图见附图22，测定13个共有峰的相对保留时间、相对峰面积，结果见下表37-38。
表37不同柱温相对保留时间结果
表38不同柱温相对峰面积结果
结果表明，峰8，峰10的相对保留时间影响稍大，说明柱温的微小变动对特征峰的相对保留时间影响较小，故建议将柱温固定为25℃。
综上，本实施例中，由上述方法学考察结果，在建立的南瓜子标准汤剂【特征图谱】的13个共有峰中，以苯丙氨酸参照物峰相应的峰为S峰，计算相对保留时间和相对峰面积。各色谱峰在不同流速、不同柱温等因素上受一定程度的影响，为适应其耐用性，建议将规定值范围控制在±10％以内。
实施例7 15批南瓜子标准汤剂特征图谱测定
取15批南瓜子标准汤剂(冻干粉)，按拟定南瓜子标准汤剂(冻干粉)【特征图谱】测定方法操作，结果见下表39-40。
表39 15批南瓜子标准汤剂相对保留时间结果
/>
/>
表40 15批南瓜子标准汤剂相对峰面积结果
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/>
测定结果表明，15批南瓜子标准汤剂(冻干粉)各特征峰的相对保留时间均在南瓜子标准汤剂对照图谱规定值的±10％范围之内，与对照药材参照物色谱中的13个特征峰保留时间相对应。通过结合原料及标准汤剂的峰传递信息，建议以整体特征峰信息的相对保留时间作为评价南瓜子标准汤剂特征量值传递指标。
实施例8药材及标准汤剂特征图谱传递关系
本实施例中，根据前述实施例中选用的15批南瓜子药材和对应的15批标准汤剂，按特征图谱方法进行测定，南瓜子标准汤剂(冻干粉)对照图谱见附图23，其中，峰7(S峰)苯丙氨酸；保留时间测定结果见下表41。
表41药材、标准汤剂对照图谱相对保留时间比较
/>
可见，图示得到的特征峰数量一致，均出现13个特征峰，说明南瓜子从药材净制为饮片，再制备为南瓜子标准汤剂过程中，主要化学成分未发生变化，物质基础一致，按传统制备方法制得的标准汤剂冻干粉中，与原料的化学成分一致，各个特征峰的相对保留时间均在南瓜子标准汤剂对照图谱规定值的±10％范围之内，与对照药材参照物色谱中的13个特征峰保留时间相对应。说明南瓜子药材经水煮后物质基础未发生改变，量值传递关系良好。
实施例9 3批南瓜子配方颗粒特征图谱测定
取3批南瓜子配方颗粒，因配方颗粒与标准汤剂冻干粉性质接近，均为水提取制剂，故直接按拟定前述实施例中南瓜子标准汤剂(冻干粉)【特征图谱】测定方法操作，结果见下表42-43。
表42 3批南瓜子配方颗粒相对保留时间结果
表43 3批南瓜子配方颗粒相对峰面积结果
/>
实施例10薄层鉴别实验
本实施例中，涉及的仪器、试剂、试药信息如下：
仪器：万分之一天平(瑞士梅特勒)METTLER TOLEDO XSE 205；薄层自动成像仪(TLC visualizer2)；硅胶G板：烟台新诚硅胶材料有限公司；超声仪：上海冠特超声仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；常规仪器：50ml、100ml圆底烧瓶、移液管、双槽层析缸、镊子、玻璃漏斗、温湿度计、三角喷瓶等；
试剂：正丁醇(广东光华科技股份有限公司；20230316)、甲醇(广州化学试剂厂；20230301-10)、冰乙酸(广东光华科技股份有限公司；20221118)、乙醇(广州化学试剂厂；2021031013)、茚三酮(天津市大茂化学试剂厂)等均为分析纯；水为超纯水；
试药：丙氨酸(批号：140680-202207，中国食品药品检定研究院)；南瓜子配方颗粒(NGZ1Y、NGZ2Y、NGZ3Y)。
供试品溶液的制备：取供试品0.3g，研细，加稀乙醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇2ml使溶解，作为南瓜子配方颗粒供试品溶液。
参照物溶液的制备：取丙氨酸对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
阴性对照溶液的制备：取麦芽糊精0.3g，研细，加稀乙醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇2ml使溶解，作为阴性对照溶液。
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-甲醇-冰乙酸-水(15：4：5：5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置白光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例10薄层色谱方法学考察
本实施例中，分别对薄层色谱法中不同点样量考察、不同温度考察、不同湿度考察、不同薄层板的影响进行考察，各溶剂配制方法同实施例9。
1、点样量考察
分别吸取南瓜子配方颗粒供试品溶液1μl、2μl、3μl、4μl、5μl，丙氨酸对照品溶液2μl、3μl、5μl、8μl、10μl，点于同一硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件展开，取出，晾干，喷以2％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，结果见附图24，其中，从左至右依次为：南瓜子配方颗粒(1μl、2μl、3μl、4μl、5μl)、丙氨酸(2μl、3μl、5μl、8μl、10μl)、阴性对照5μl。
结果可见，南瓜子配方颗粒供试品色谱中，在与丙氨酸色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，根据斑点的分离度及清晰度，确定南瓜子配方颗粒供试品溶液与对照品溶液点样量均为2μl。该供试品溶液在确定点样量下，斑点清晰，浓度适宜检测与结果判断。
2、专属性考察
分别吸取南瓜子配方颗粒供试品溶液2μl，丙氨酸溶液2μl，阴性对照溶液2μl点于同一硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件展开，取出，晾干，喷以2％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，结果见附图25，图中，从左至右依次为：南瓜子配方颗粒NGZ1Y、南瓜子配方颗粒NGZ2Y、南瓜子配方颗粒NGZ3Y、丙氨酸对照品、阴性对照。
结果可见，南瓜子配方颗粒供试品色谱中，在与苯丙氨酸色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，空白在相应位置无斑点，无干扰，故该方法专属性良好。
3、不同温度考察
分别吸取南瓜子配方颗粒粉供试品溶液2μl、丙氨酸溶液2μl，点于同一硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件，分别在5℃、25℃条件下展开，取出，晾干，喷以2％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，结果见附图26，图中，从左至右依次为：南瓜子配方颗粒NGZ1Y、南瓜子配方颗粒NGZ2Y、南瓜子配方颗粒NGZ3Y、丙氨酸对照品、阴性对照。
结果可见，在不同温度条件下，南瓜子配方颗粒色谱在与丙氨酸对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，且色谱斑点分离效果都较好，实验结果表明，温度对南瓜子配方颗粒薄层鉴别无显著影响，该薄层鉴别方法对温度有较好的耐用性。
4、不同湿度考察
分别吸取南瓜子配方颗粒供试品溶液2μl、丙氨酸溶液2μl，点于同一硅胶G薄层板上，按上述薄层色谱条件，分别在84％、68％、32％湿度条件下展开，取出，晾干，喷以2％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，结果见附图27，图中，从左至右依次为：南瓜子配方颗粒NGZ1Y、南瓜子配方颗粒NGZ2Y、南瓜子配方颗粒NGZ3Y、丙氨酸对照品、阴性对照。
结果可见，在考察的不同湿度条件下，南瓜子配方颗粒色谱在与丙氨酸色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，且色谱斑点分离效果都较好，实验结果表明，湿度对南瓜子配方颗粒薄层鉴别无显著影响，该薄层鉴别方法对湿度有较好的耐用性。
5、不同厂家薄层板的考察
别吸取南瓜子配方颗粒供试品溶液2μl、丙氨酸溶液2μl，点于不同厂家的硅胶薄层板(青岛硅胶G板、烟台硅胶G板、默克硅胶G板)上，按上述薄层色谱条件展开，取出，晾干，喷以2％茚三酮乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，结果见附图28，图中，从左至右依次为：南瓜子配方颗粒NGZ1Y、南瓜子配方颗粒NGZ2Y、南瓜子配方颗粒NGZ3Y、丙氨酸对照品、阴性对照。
结果可见，不同厂家生产薄层硅胶板，南瓜子配方颗粒色谱在与丙氨酸色谱相应的位置显相同颜色的斑点，且色谱斑点分离效果都较好，实验结果表明，不同厂家薄层板对南瓜子配方颗粒薄层鉴别无显著影响，该薄层鉴别方法的耐用性良好。
实施例11多批次南瓜子配方颗粒薄层鉴别
按照上述确定的薄层鉴别方法对三批次南瓜子配方颗粒进行薄层鉴别，结果如附图29所示，图中，从左至右依次为：南瓜子配方颗粒NGZ1Y、南瓜子配方颗粒NGZ2Y、南瓜子配方颗粒NGZ3Y、丙氨酸对照品、阴性对照。
可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
综合以上的结果说明了该薄层方法的耐用性良好，斑点清晰，可作为南瓜子配方颗粒薄层鉴别方法。
实施例12多批次南瓜子标准汤剂冻干粉薄层鉴别
按照上述确定的薄层鉴别方法对15批次南瓜子标准汤剂冻干粉进行薄层鉴别，结果如附图30所示，图中，1-南瓜子冻干粉2103001Y，2-南瓜子冻干粉2103002Y，3、南瓜子冻干粉2103003Y，4-南瓜子冻干粉2103004Y，5-南瓜子冻干粉2103005Y，6-南瓜子冻干粉2103006Y，7-南瓜子冻干粉2103007Y，8-南瓜子冻干粉2103008Y，9-南瓜子冻干粉2103009Y，10-南瓜子冻干粉2103010Y，11-南瓜子冻干粉2103011Y，12-南瓜子冻干粉2103012Y，13-南瓜子冻干粉2103013Y，14-南瓜子冻干粉2103014Y，15-南瓜子冻干粉2103015Y，16-丙氨酸(2μL)。
可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，其特征在于，包括对南瓜子及制剂的供试品溶液进行高效液相色谱检测的步骤；
色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相A，以水为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：
0-10min，A：B为0→4％：100％→96％；
10-35min，A：B为4％→7％：96％→93％；
35-42min，A：B为7％→22％：93％→78％；
42-50min，A：B为22％→36％：78％→64％。
2.根据权利要求1所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测步骤中，色谱条件还包括：柱温22-28℃，流速为0.8-1.2ml/min，检测波长为210nm。
3.根据权利要求1或2所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括：取供试品加水进行加热回流提取，滤过并收集续滤液，即得。
4.根据权利要求1-3任一项所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，其特征在于，所述方法还包括制备对照药材参照物溶液的步骤，具体包括：取南瓜子对照药材，加水进行加热回流提取，滤过并收集续滤液，即得所需对照药材参照物溶液。
5.根据权利要求1-4任一项所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，其特征在于，所述方法还包括制备对照品参照物溶液，以及，基于所述高效液相色谱法构建对照品特征图谱的步骤；
所述对照品包括苯丙氨酸。
6.根据权利要求1-5任一项所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法，其特征在于，所述南瓜子制剂包括南瓜子配方颗粒或南瓜子标准汤剂。
7.一种南瓜子及制剂的特征图谱和/或对照特征图谱，其特征在于，所述南瓜子及制剂的特征图谱和/或对照特征图谱由权利要求1-6任一项所述方法构建得到。
8.权利要求1-6任一项所述南瓜子及制剂的特征图谱构建方法和/或权利要求7所述南瓜子及制剂的特征图谱和/或对照特征图谱在南瓜子及其药物制剂质量检测领域的应用。
9.一种南瓜子及其药物制剂的质量检测方法，其特征在于，包括按照权利要求1-6任一项所述方法构建所述特征图谱和对照特征图谱的步骤，以及，将所述特征图谱与对照特征图谱进行比较的步骤。
10.根据权利要求9所述南瓜子及其药物制剂的质量检测方法，其特征在于，还包括进行薄层色谱鉴别的步骤；
所述薄层色谱鉴别的步骤包括：
取供试品加入稀乙醇超声，滤过并收取滤液蒸干，取残渣加稀乙醇溶解，得到所需供试品溶液；
取丙氨酸对照品加稀乙醇混匀，得到所需对照品溶液；
按照薄层色谱法试验，以体积比为15：4：5：5的正丁醇-甲醇-冰乙酸-水为展开剂，进行薄层色谱检测。
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