CN117405812A - 大枣薄层鉴别方法及含大枣的复方制剂薄层鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种大枣薄层鉴别方法及含大枣的复方制剂薄层鉴别方法。本发明提供的大枣薄层鉴别方法，包括以下步骤：大枣供试品溶液制备：取大枣回流，过滤，纯化，溶解，得大枣供试品溶液；大枣对照药材溶液制备：取大枣对照药材回流，过滤，纯化，溶解，得大枣对照药材溶液；薄层鉴别：吸取大枣供试品溶液和大枣对照药材溶液，分别点于同一薄层板上，以乙酸乙酯‑甲醇‑水溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰，检视。本发明能有效区分大枣的枣肉与枣核，同样能鉴别检测对象为复方制剂中由大枣加水提取得到的大枣提取物时，其是来源于大枣肉或大枣核，且该方法简便、高效，易于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种大枣薄层鉴别方法及含大枣的复方制剂薄层鉴别方法。
背景技术
对大枣肉和大枣核的区别方法仅有目测方法，由于大枣肉和大枣核的性状差异较大，因此可通过目测将二者区别。若检测对象为加水提取的复方制剂，则现无可行的方法区别此复方制剂中的大枣提取物是来源于大枣肉或大枣核。由于现在市场上虽有纯大枣肉的食品在售，但大枣核价格低廉，因此可能存在药厂单独收购大枣核，替代大枣药材投料，用于生产含大枣药味的复方制剂。由于大枣肉和大枣核存在物质成分的差异，用大枣核替代大枣肉所生产出来的产品则无法保证疗效，因此，研发一种简便、有效的大枣肉或大枣核鉴别方法迫在眉睫。
目前，中国药典2015版及2020版均提供了一种大枣鉴别方法，“照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各10μl、上述两种对照品溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14：4：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点”。
再如，学者刘世军、张雪原等的研究分析“大枣中氨基酸类成分的薄层色谱分析”中指出，中药大枣中含有多种氨基酸类成分，因此建立大枣中主要氨基酸类成分的薄层色谱鉴定方法，为大枣的相关研究提供依据。采用薄层色谱法对大枣中氨基酸类成分进行定性鉴别，本法操作简单，重复性好，特征明显，可以作为大枣中四种氨基酸的薄层色谱鉴别依据(2.2.1预实验-供试品溶液的选择分别吸取供试品1、2的量为1uL，点于硅胶G板上，以正丁醇-冰醋酸-水(体积比4：1：1)为展开剂展开，待展开完全后取出，晾干，喷以三酮溶液显色，置于105℃条件下至显色完全)。
然而，上述大枣鉴别方法均无法区分大枣的枣肉与枣核，同样无法鉴别检测对象为复方制剂中由大枣加水提取得到的大枣提取物时，其是来源于大枣肉或大枣核，因此，提供一种简便、有效的大枣肉或大枣核鉴别方法迫在眉睫。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种大枣薄层鉴别方法及含大枣的复方制剂薄层鉴别方法。本发明提供的大枣薄层鉴别方法及含大枣的复方制剂薄层鉴别方法，能有效区分大枣的枣肉与枣核，同样能有效鉴别检测对象为复方制剂中由大枣加水提取得到的大枣提取物时，其是来源于大枣肉或大枣核，且该方法简便、高效，易于推广应用。
本发明的技术方案是：
一种大枣薄层鉴别方法，包括以下步骤：
步骤(1)：大枣供试品溶液制备：
取大枣回流，过滤，纯化，溶解，得大枣供试品溶液；
步骤(2)：大枣对照药材溶液制备：
取大枣对照药材回流，过滤，纯化，溶解，得大枣对照药材溶液；
步骤(3)：薄层鉴别：
吸取大枣供试品溶液和大枣对照药材溶液，分别点于同一薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰，检视。
进一步地，所述展开剂乙酸乙酯-甲醇-水的比例为23～27：5～9：2～5。
更进一步地，所述展开剂乙酸乙酯-甲醇-水的比例为25：7：3。
进一步地，所述步骤(1)、(2)中的纯化是采用柱层析法纯化滤液，滤液通过大孔吸附树脂，先用氨溶液洗脱，弃去氨液；再用水洗脱，弃去水液；继用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干。
更进一步地，所述大孔吸附树为AB-8型大孔吸附树脂，其内径为1.5cm，柱高为8cm。
进一步地，所述步骤(3)薄层鉴别过程中的温度为2-45℃；湿度为10-98％。
更进一步地，所述步骤(3)薄层鉴别过程中的温度为6.8-40℃；湿度为30-75％。
进一步地，所述步骤(3)薄层鉴别过程中使用硅胶HSG薄层板，点样量为5～20μl。
更进一步地，所述步骤(3)薄层鉴别过程中使用硅胶HSG薄层板，点样量为15μl。
进一步地，所述大枣薄层鉴别方法包括以下步骤：
步骤(1)：大枣供试品溶液制备：
取大枣1g，剪碎，加水30ml，加热回流2小时，趁热过滤，滤液通过大孔吸附树脂，先用氨溶液30ml洗脱，弃去氨液；再用水20ml洗脱，弃去水液，；继用10％乙醇50ml洗脱，收集10％乙醇洗脱液，蒸干，用甲醇溶解，再用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得大枣供试品溶液；
步骤(2)：大枣对照药材溶液制备：
取大枣对照药材1g，加水40ml，加热回流2小时，趁热过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，先用氨溶液30ml洗脱，弃去氨液；再用水20ml洗脱，弃去水液；继用10％-80％乙醇50ml洗脱，收集10％乙醇洗脱液，蒸干，用10％甲醇2ml使溶解，过滤，取续滤液，即得大枣对照药材；
步骤(3)：薄层鉴别：
吸取大枣供试品溶液和大枣对照药材溶液，分别点5、10、15和20μl，分别点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯：甲醇：水＝25：7：3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃加热至斑点清晰，置365nm波长下检视。
而且，本发明还提供了一种含大枣的复方制剂薄层鉴别方法，包括以下步骤：
步骤S1：含大枣的复方制剂供试品溶液制备：
取含大枣的复方制剂溶解，纯化，过滤，得含大枣的复方制剂供试品溶液；
步骤S2：大枣对照药材溶液制备：
取大枣对照药材回流，过滤，纯化，溶解，得大枣对照药材溶液；
步骤S3：薄层鉴别：
吸取含大枣的复方制剂供试品溶液和大枣对照药材溶液，按照上述的大枣薄层鉴别方法中步骤(3)所采用的条件进行检测。
进一步地，所述步骤S1中的的纯化是采用柱层析法纯化滤液，滤液通过大孔吸附树脂，先用氨溶液洗脱，弃去氨液；再用水洗脱，弃去水液；继用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干；其中乙醇浓度为10-80％。更优选的，乙醇浓度为10％。
进一步地，所述步骤S3薄层鉴别过程中点样量为10～30μl。更优选的，点样量为30μl。
与现有技术相比，本发明提供的大枣薄层鉴别方法及含大枣的复方制剂薄层鉴别方法，具有以下优势：
本发明提供的大枣薄层鉴别方法及含大枣的复方制剂薄层鉴别方法，能有效区分大枣的枣肉与枣核，同样能有效鉴别检测对象为复方制剂中由大枣加水提取得到的大枣提取物时，其是来源于大枣肉或大枣核，且该方法简便、高效，易于推广应用。
附图说明
图1为大枣薄层鉴别方法的点样量考察图；图中1.大枣对照药材溶液5μl；2.大枣供试品溶液5μl；3.大枣对照药材溶液10μl；4.大枣供试品溶液10μl；5.大枣对照药材溶液15μl；6.大枣供试品溶液15μl；7.大枣对照药材溶液20μl；8.大枣供试品溶液20μl。
图2为大枣薄层鉴别方法的专属性考察图；图中1.大枣对照药材溶液；2.大枣供试品溶液。
图3为大枣肉和大枣核的专属性考察图；图中1.大枣核供试品溶液；2.大枣肉供试品溶液。
图4为大枣薄层鉴别方法的不同品牌薄层板耐用性考察图；图中1.大枣对照药材溶液；2.大枣供试品溶液。
图5为大枣薄层鉴别方法的温度耐用性考察图；图中1.大枣对照药材溶液；2.大枣供试品溶液。
图6为大枣薄层鉴别方法的湿度耐用性考察图；图中1.大枣对照药材溶液；2.大枣供试品溶液。
图7为大枣薄层鉴别方法的供试品溶液稳定性考察图；图中1.大枣供试品溶液(第二天制备)；2.大枣供试品溶液(第一天制备)。
图8为多批大枣药材薄层鉴别结果图；图中1.大枣对照药材溶液；2.大枣供试品溶液(JDZ16)；3.大枣供试品溶液(JDZ18)；4.大枣供试品溶液(JDZ19)；5.大枣供试品溶液(JDZ20)；6.大枣供试品溶液(JDZ21)；7.大枣供试品溶液(JDZ22)；8.大枣供试品溶液(JDZ23)；9.大枣供试品溶液(JDZ24)；10.大枣供试品溶液(JDZ25)；11.大枣供试品溶液(JDZ26)；12.大枣供试品溶液(JDZ27)；13.大枣供试品溶液(JDZ28)；14.大枣供试品溶液(JDZ29)；15.大枣供试品溶液(JDZ30)；16.大枣供试品溶液(JDZ31)。
图9为含大枣复方制剂的供试品溶液的洗脱溶剂考察图；图中1.大枣核供试品溶液6；2.大枣单方；3.大枣对照药材；4～8.大枣复方制剂供试品溶液1～5。
图10为含大枣复方制剂的不同展开剂考察图(展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液)；图中1.大枣核供试品溶液6；2.大枣单方；3～4.大枣对照药材；5.大枣复方制剂供试品溶液1。
图11为含大枣复方制剂的不同展开剂考察图(展开剂为甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14：4：0.5)溶液)；图中1.大枣核供试品溶液6；2.大枣单方；3～4.大枣对照药材；5.大枣复方制剂供试品溶液1。
图12为含大枣复方制剂的不同展开剂考察图(展开剂为正丁醇-冰醋酸-水(4：1：1)溶液)；图中1.大枣核供试品溶液6；2.大枣单方；3～4.大枣对照药材；5.大枣复方制剂供试品溶液1。
图13为含大枣复方制剂的展开剂不同比例考察图(展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水(27：9：5)溶液)；图中1.大枣核供试品溶液6；2.大枣单方；3.大枣对照药材；4.大枣复方制剂供试品溶液1。
图14为含大枣复方制剂的不同展开剂考察图(展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水(23：5：2)溶液)；图中1.大枣核供试品溶液6；2.大枣单方；3.大枣对照药材；4.大枣复方制剂供试品溶液1。
图15为含大枣复方制剂的不同点样量考察图；图中1～3.大枣核供试品溶液6的点样量分别为10μl、20μl、30μl；4～6.大枣单方的点样量分别为10μl、20μl、30μl；7～9.大枣对照药材的点样量分别为10μl、20μl、30μl；10～12.大枣复方制剂供试品溶液1的点样量分别为10μl、20μl、30μl。
图16为6批含大枣复方制剂的大枣薄层鉴别图；图中1.大枣对照药材；2～8.不同批次大枣复方制剂供试品溶液。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
1.1大枣药材的鉴别
1.1.1仪器与试药
仪器：分析天平，型号AL104，梅特勒-托利多；恒温水浴锅，型号HH-4、HH-8，常州澳华仪器有限公司；恒温水浴锅，型号HH-8，常州亿能仪器有限公司；滤膜，0.45μm，SHIMADZU；台式电热鼓风干燥箱，型号DHG-9245A，上海一恒科学仪器有限公司；加热板，型号DB-XAB，上海力辰邦西仪器科技有限公司；自动薄层点样仪，型号ATS 4，瑞士卡玛公司；自动成像仪，型号Visualizer2，瑞士卡玛公司。
试剂：甲醇，AR级，批号2022070108，广州化学试剂厂；无水乙醇，AR级，批号2022020328，广州化学试剂厂；氨水，AR级，批号2022070111，广州化学试剂厂；AB-8大孔吸附树脂，分析纯，批号1116A011，Solarbio；乙酸乙酯，AR级，批号2020010115，广州化学试剂厂；磷钼酸，AR级，批号F2122214，阿拉丁；硫酸，AR级，批号2018110413，广州化学试剂厂；水(M MILLIPORE Synergy UV超纯水一体化系统制备)。
薄层板：详见下表。
表1薄层板
研究用药材见下表2，由国药集团广东环球制药有限公司提供。
表2研究用样品表
对照品：大枣对照药材，批号121040-201809，购自中国食品药品检定研究院。
1.1.2供试品溶液和大枣对照药材溶液的制备方法
大枣供试品溶液制备：取本品约1g，剪碎，加水30ml，回流2小时，趁热过滤，滤液通过AB-8型大孔吸附树脂(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100)30ml洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用10％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
大枣对照药材溶液制备：取大枣对照药材约1g，加水40ml，加热回流2小时，趁热过滤，滤液，通过AB-8型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100)30ml洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用10％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加10％甲醇2ml使溶解，过滤，取续滤液即得。
吸取上述大枣供试品溶液和大枣对照药材溶液各15μl，点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇(10→100)溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视，大枣供试品色谱中，在与大枣对照药材色谱相应的位置上，应呈现两个相同颜色的大枣特征性斑点；若无法呈现两个斑点，则说明投料原料可能为大枣核。
1.1.3点样量考察
取大枣药材(批号：JDZ16)约1g，照上述方法制备大枣供试品溶液。
取大枣对照药材约1g，照上述方法制备大枣对照药材溶液。
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取大枣供试品溶液和大枣对照药材溶液，分别点5、10、15和20μl，分别点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇(10→100)溶液，置105℃加热至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图1。
结果表明，点样量为5～20μl均适用，其中点样量为15μl所得的斑点亮度适宜，背景干扰最小，故本方法优选15μl作为点样量。
1.1.4专属性考察
(1)大枣对照药材的专属性
取大枣药材(批号：JDZ16)约1g，照上述方法制备大枣供试品溶液。
取大枣对照药材约1g，照上述方法制备大枣对照药材溶液。
吸取大枣供试品溶液、大枣对照药材溶液各15μl，分别点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图2。
结果表明，该方法下，供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点，专属性良好。
(2)大枣肉和大枣核的专属性
取大枣药材(批号：JDZ16)，将大枣肉和大枣核分开，各取约1g，照上述方法制备大枣肉、大枣核供试品溶液。
吸取大枣肉、大枣核供试品溶液各15μl，分别点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图3。
结果表明，该方法下，大枣肉供试品色谱中有两个特征斑点，但在大枣核供试品色谱中无法表征此两个斑点，该方法可区别大枣核和大枣肉，专属性良好。
1.1.5耐用性考察
1.1.5.1不同品牌薄层板考察
取大枣药材(批号：JDZ16)约1g，照上述方法制备大枣供试品溶液。
取大枣对照药材约1g，照上述方法制备大枣对照药材溶液。
吸取大枣供试品溶液、大枣对照药材溶液各15μl，分别点在不同品牌(默克、银龙、青岛海洋)的硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图4。
结果表明，在不同薄层板的展开条件下，大枣供试品色谱中，在与对照品和对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点，说明该方法对不同品牌的薄层板的耐用性较好。
1.1.5.2温度考察
取大枣药材(批号：JDZ16)约1g，照上述方法制备大枣供试品溶液。
取大枣对照药材约1g，照上述方法制备大枣对照药材溶液。
分别在低温和高温环境下，吸取大枣供试品溶液、大枣对照药材溶液各15μl于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图5。
结果表明，在不同温度的展开条件下，大枣供试品色谱中，在与对照品和对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点，说明该方法对不同品牌的薄层板的耐用性较好。
1.1.5.3湿度考察
取大枣药材(批号：JDZ16)约1g，照上述方法制备大枣供试品溶液。
取大枣对照药材约1g，照上述方法制备大枣对照药材溶液。
分别在低湿和高湿环境下，吸取大枣供试品溶液、大枣对照药材溶液各15μl于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图6。
结果表明，在不同湿度的展开条件下，大枣供试品色谱中，在与对照品和对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点，说明该方法对不同湿度耐用性较好。
1.1.5.4供试品溶液稳定性考察
分别在第一天和第二天取大枣药材(批号：JDZ16)约1g，照上述方法制备大枣供试品溶液。
分别吸取第一天或第二天制备的大枣供试品溶液各15μl于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图7。
结果表明，第二天制备的大枣供试品色谱中，有两个特征斑点；第一天制备的大枣供试品色谱中，只有一个特征斑点，另外一个特征斑点缺失，因此说明大枣供试品溶液的稳定性不佳，需现配先用。
1.1.6多批药材的检验
按表2，取多批大枣药材，各约1g，照上述方法制备大枣供试品溶液。
取大枣对照药材约1g，照上述方法制备大枣对照药材溶液。
吸取大枣供试品溶液、大枣对照药材溶液各15μl于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图8。
结果表明，多批大枣药材的供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点，说明该方法可行。
1.1.7最终确定的色谱条件
综上所述，大枣药材的薄层鉴别方法为：取取本品约1g，剪碎，加水30ml，回流2小时，趁热过滤，滤液通过AB-8型大孔吸附树脂(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100)30ml洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用10％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使解，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得大枣供试品溶液。另取大枣对照药材约1g，加水40ml。加热回流2小时，趁热过滤，滤液，通过AB-8型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100)30ml洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用10％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加10％甲醇2ml使溶解，过滤，取续滤液，得大枣对照药材溶液。
吸取上述大枣供试品溶液和大枣对照药材溶液各15μl，点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇(10→100)溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视，大枣供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
1.2含大枣的复方制剂鉴别
将上述大枣的薄层鉴别方法应用于一个含大枣的复方制剂——当归建中汤，其由六个药味组成，包括肉桂、当归、白芍、甘草、大枣和生姜，结果表明上述薄层方法可用于区别该复方制剂的原料是否仅为大枣核。
1.2.1仪器与试药
仪器：分析天平，型号AL104，梅特勒-托利多；恒温水浴锅，型号HH-4、HH-8，常州澳华仪器有限公司；恒温水浴锅，型号HH-8，常州亿能仪器有限公司；滤膜，0.45μm，SHIMADZU；台式电热鼓风干燥箱，型号DHG-9245A，上海一恒科学仪器有限公司；加热板，型号DB-XAB，上海力辰邦西仪器科技有限公司；自动薄层点样仪，型号ATS 4，瑞士卡玛公司；自动成像仪，型号Visualizer2，瑞士卡玛公司。
试剂：甲醇，AR级，批号2022070108，广州化学试剂厂；无水乙醇，AR级，批号2022020328，广州化学试剂厂；氨水，AR级，批号2022070111，广州化学试剂厂；AB-8大孔吸附树脂，分析纯，批号1116A011，Solarbio；乙酸乙酯，AR级，批号2020010115，广州化学试剂厂；磷钼酸，AR级，批号F2122214，阿拉丁；硫酸，AR级，批号2018110413，广州化学试剂厂；水(M MILLIPORE Synergy UV超纯水一体化系统制备)。
薄层板：详见下表。
表3薄层板
研究用基准样品由国药集团广东环球制药有限公司提供：
当归建中汤冻干粉1(批号DJ221205-H1)，所用物料为肉桂、当归、白芍、甘草、大枣和生姜，制备方法为加水提取，得煎煮液后冻干。
当归建中汤冻干粉2(批号DJ221205-H2)，所用物料为肉桂、当归、白芍、甘草、大枣核和生姜，制备方法为加水提取，得煎煮液后冻干。
大枣单方冻干粉(批号DJ221020-D-DZ)，所用物料为大枣，制备方法为加水提取，得煎煮液后冻干。
对照品：大枣对照药材，批号121040-201809，购自中国食品药品检定研究院。
1.2.2供试品提取方法考察
分别考察不同醇浓度(10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇)的洗脱剂对供试品溶液的影响。
不同醇浓度洗脱的含大枣的复方制剂供试品溶液的制备：取当归建中汤冻干粉1(批号DJ221205-H1)约3g，精密称定5份，加水40ml，加热使溶解，放冷，通过AB-8型大孔吸附树脂(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100)30ml洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，不同样品分别用10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇各50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得含大枣的复方制剂供试品溶液1～5。
只投料大枣核的供试品溶液的制备：取当归建中汤冻干粉2(批号DJ221205-H2)约3g，精密称定，加水40ml，加热使溶解，放冷，通过AB-8型大孔吸附树脂(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100)30ml洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，用10％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得只含大枣核的供试品溶液6。
大枣单方供试品溶液的制备：取大枣单方冻干粉(批号DJ221020-D-DZ)约1.4g，精密称定，加水40ml，加热使溶解，放冷，通过AB-8型大孔吸附树脂(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100)30ml洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，用10％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
大枣对照药材供试品溶液的制备：取大枣对照药材约1g，加水40ml，加热回流2小时，趁热过滤，滤液，通过AB-8型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100)30ml洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用10％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加10％甲醇2ml使溶解，过滤，取续滤液即得。
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述供试品溶液1-6、大枣单方供试品溶液、大枣对照药材供试品溶液各15μl，分别点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇(10→100)溶液，置105℃加热至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图9。
结果表明，(1)不同醇浓度(10％乙醇、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇)的洗脱剂均可表征两个大枣药材的特征性斑点，无明显差异，但10％乙醇作为洗脱剂最佳；(2)仅投料大枣核的复方制剂的色谱图仅能保证1个大枣药材的特征性斑点(此斑点可能来源于其他药味)，无法表征另1个大枣药材的特征性斑点，可用此斑点区别投料物料为大枣药材或大枣核。
1.2.2不同展开剂的考察
分别考察不同展开剂对薄层色谱结果的影响。
供试品溶液的制备：同1.2.1中的含大枣的复方制剂供试品溶液1。
大枣单方供试品溶液的制备：同1.2.1。
只投料大枣核的供试品溶液的制备：同1.2.1的大枣核供试品溶液6。
大枣对照药材供试品溶液的制备：同1.2.1。
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取大枣单方供试品溶液、大枣对照药材供试品溶液、供试品溶液1和供试品溶液6各20μl，分别点于同一硅胶HSG薄层板上，分别以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液、甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14：4：0.5)溶液、正丁醇-冰醋酸-水(4：1：1)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃加热至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图10～12。
结果表明，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液，仅投料大枣核的供试品溶液6仅能表征1个大枣特征性斑点，而投料大枣药材的供试品溶液1能表征2个大枣特征性斑点，可用于鉴别投料原料为大枣核或大枣药材。而以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(14：4：0.5)溶液和正丁醇-冰醋酸-水(4：1：1)溶液为展开剂，仅投料大枣核的供试品溶液6也能表征2个大枣特征性斑点，无法区别大枣核和大枣药材，说明此二者的展开剂不适用。
1.2.3展开剂不同比例的考察
分别考察不同展开剂配比对薄层色谱结果的影响。
供试品溶液的制备：同1.2.1中的含大枣的复方制剂供试品溶液1。
大枣单方供试品溶液的制备：同1.2.1。
只投料大枣核的供试品溶液的制备：同1.2.1的大枣核供试品溶液6。
大枣对照药材供试品溶液的制备：同1.2.1。
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取大枣单方供试品溶液、大枣对照药材供试品溶液、供试品溶液1和供试品溶液6，分别点样10μl、20μl、30μl，点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(27：9：5)溶液、乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液、乙酸乙酯-甲醇-水(23：5：2)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃加热至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图13、10、14。
结果表明，展开剂比例微调对薄层展开效果无明显影响，展开剂组成为乙酸乙酯-甲醇-水，其中乙酸乙酯的比例为23～27，甲醇的比例为5～9，水的比例为2～5均适用。但展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)时效果最佳。
1.2.4不同点样量的考察
分别考察不同点样量对薄层色谱结果的影响。
供试品溶液的制备：同1.2.1中的含大枣的复方制剂供试品溶液1。
大枣单方供试品溶液的制备：同1.2.1。
只投料大枣核的供试品溶液的制备：同1.2.1的大枣核供试品溶液6。
大枣对照药材供试品溶液的制备：同1.2.1。
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取大枣单方供试品溶液、大枣对照药材供试品溶液、供试品溶液1和供试品溶液6，分别点样10μl、20μl、30μl，点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃加热至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图15。
结果表明，点样量为10～30μl时均可用于区别大枣核和大枣药材，点样量为30μl时的效果最好。
1.2.5多批次含大枣复方制剂的检验
取7批次含大枣的复方制剂，各约3g，照1.2.2制备含大枣的复方制剂供试品溶液。
取大枣对照药材约1g，照1.2.2制备大枣对照药材溶液。
吸取含大枣的复方制剂供试品溶液、大枣对照药材溶液各30μl于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视。结果见图16。
结果表明，此方法可用于鉴别复方制剂的大枣药味，应与大枣对照药材薄层图谱相应的位置上呈现两个大枣特征性斑点。若无法呈现两个斑点，则说明投料原料可能为大枣核。
1.2.6最终确定的色谱条件
综上所述，含大枣的复方制剂的大枣药味薄层鉴别方法为：取含大枣的复方制剂供试品约3g，精密称定，加水40ml，加热使溶解，放冷，通过AB-8型大孔吸附树脂(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100)30ml洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用10％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。另取大枣对照药材约1g，加水40ml。加热回流2小时，趁热过滤，滤液，通过AB-8型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为8cm，加水预洗至无醇味)，用氨溶液(4→100)30ml洗脱，弃去氨液，再用水20ml洗脱，弃去水液，继用10％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加10％甲醇2ml使溶解，过滤，取续滤液即得大枣对照药材溶液。
吸取含大枣的复方制剂供试品溶液和对照药材溶液各30μl，点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(25：7：3)溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇(10→100)溶液，置105℃至斑点清晰，置365nm波长下检视，供试品色谱中，在与大枣对照药材色谱相应的位置上，应呈现两个相同颜色的大枣特征性斑点。若无法呈现两个斑点，则说明投料原料可能为大枣核。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种大枣薄层鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：大枣供试品溶液制备：
取大枣回流，过滤，纯化，溶解，得大枣供试品溶液；
步骤(2)：大枣对照药材溶液制备：
取大枣对照药材回流，过滤，纯化，溶解，得大枣对照药材溶液；
步骤(3)：薄层鉴别：
吸取大枣供试品溶液和大枣对照药材溶液，分别点于同一薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰，检视。
2.如权利要求1所述的大枣薄层鉴别方法，其特征在于，所述展开剂乙酸乙酯-甲醇-水的比例为23～27：5～9：2～5。
3.如权利要求1所述的大枣薄层鉴别方法，其特征在于，所述展开剂乙酸乙酯-甲醇-水的比例为25：7：3。
4.如权利要求1所述的大枣薄层鉴别方法，其特征在于，所述步骤(1)、(2)中的纯化是采用柱层析法纯化滤液，滤液通过大孔吸附树脂，先用氨溶液洗脱，弃去氨液；再用水洗脱，弃去水液；继用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干。
5.如权利要求1所述的大枣薄层鉴别方法，其特征在于，所述步骤(3)薄层鉴别过程中的温度为2-45℃；湿度为10-98％。
6.如权利要求1所述的大枣薄层鉴别方法，其特征在于，所述步骤(3)薄层鉴别过程中使用硅胶HSG薄层板，点样量为5～20μl。
7.如权利要求1所述的大枣薄层鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：大枣供试品溶液制备：
取大枣1g，剪碎，加水30ml，加热回流2小时，趁热过滤，滤液通过大孔吸附树脂，先用氨溶液30ml洗脱，弃去氨液；再用水20ml洗脱，弃去水液；继用10％乙醇50ml洗脱，收集10％乙醇洗脱液，蒸干，用甲醇溶解，再用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得大枣供试品溶液；
步骤(2)：大枣对照药材溶液制备：
取大枣对照药材1g，加水40ml，加热回流2小时，趁热过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，先用氨溶液30ml洗脱，弃去氨液；再用水20ml洗脱，弃去水液；继用10％-80％乙醇50ml洗脱，收集10％乙醇洗脱液，蒸干，用10％甲醇2ml使溶解，过滤，取续滤液，即得大枣对照药材；
步骤(3)：薄层鉴别：
吸取大枣供试品溶液和大枣对照药材溶液，分别点5、10、15和20μl，分别点于同一硅胶HSG薄层板上，以乙酸乙酯：甲醇：水＝25：7：3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置105℃加热至斑点清晰，置365nm波长下检视。
8.一种含大枣的复方制剂薄层鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：含大枣的复方制剂供试品溶液制备：
取含大枣的复方制剂溶解，纯化，过滤，得含大枣的复方制剂供试品溶液；
步骤S2：大枣对照药材溶液制备：
取大枣对照药材回流，过滤，纯化，溶解，得大枣对照药材溶液；
步骤S3：薄层鉴别：
吸取含大枣的复方制剂供试品溶液和大枣对照药材溶液，按照权利要求2-5、7任一所述的大枣薄层鉴别方法步骤(3)所采用的条件进行检测。
9.如权利要求8所述的含大枣的复方制剂薄层鉴别方法，其特征在于，所述步骤S1中的的纯化是采用柱层析法纯化滤液，滤液通过大孔吸附树脂，先用氨溶液洗脱，弃去氨液；再用水洗脱，弃去水液；继用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干；其中乙醇浓度为10-80％。
10.如权利要求8所述的含大枣的复方制剂薄层鉴别方法，其特征在于，所述步骤S3薄层鉴别过程中点样量为10～30μl。
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