CN105267200A - 一种黄酮类化合物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄酮类化合物的应用。本发明公开如式I所示的黄酮类化合物可用于制备mTOR抑制剂，尤其是mTORC1抑制剂。本发明公开的黄酮类化合物在制备预防和/或治疗癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症药物中的应用。所述的疾病包括本领域通过抑制mTORC1的酶的催化活性来预防和/或治疗的疾病，优选癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症。本发明的黄酮类化合物能够有效抑制mTOR的酶的催化活性，对癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症表现出很好的疗效。

Description

一种黄酮类化合物的应用

技术领域

本发明涉及一种黄酮类化合物的应用。

背景技术

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种非典型高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又被称为FK506结合蛋白12(FKBP12)-雷帕霉素复合物的结合蛋白(FRAP)，或者雷帕霉素和FKBP12的靶标蛋白(RAFT)，属于磷酸肌醇激酶相关蛋白激酶家族(Phosphatidylinositol3-kinase(PI3K)-likekinase(PIKK)superfamilyofkinases)。在细胞内，主要通过形成哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)两种功能不同的蛋白复合物，发挥其生理活性。mTORC1包含mTOR，Raptor，Deptor，PRAS40和mLST8，而mTORC2包含mTOR，Riptor，Deptor，Protor，mSin1和mLST8。mTORC1的主要功能是调节蛋白质的合成和细胞周期进程，mTORC2则在肌动蛋白细胞骨架组织和细胞存活方面发挥重要作用。

mTOR是PI3K/Akt/mTOR信号通路的一个效应分子，它作为细胞内重要的生长和代谢调节中枢，参与细胞分化与存活、蛋白质合成、细胞凋亡、细胞自吞噬等重要的细胞生理过程。mTOR信号通路调控异常与肿瘤发生密切相关，通过抑制mTOR通路可以有效阻断各种生长因子异常信号的转导，从而抑制癌症的发生、发展，mTOR已成为治疗癌症的重要靶标，因此，对其抑制剂的筛选显得尤为重要。

mTOR的抑制剂主要有两类，一类是别构抑制剂，主要是雷帕霉素及其结构类似物，通过与FKBP12形成复合物，再靶向结合到mTOR的非磷酸化催化位点域而抑制其激酶活性和mTOR复合物的形成，将肿瘤细胞阻滞在G1期，从而抑制肿瘤细胞生长并阻滞其细胞增殖甚至促使细胞凋亡。另一类是ATP竞争型的小分子抑制剂，属于小分子ATP类似物，可以与ATP竞争结合mTOR的激酶结构域，从而抑制mTOR的激酶活性以及自身磷酸化，同时抑制mTORC1和mTORC2的活性。

据“Zhang,Y.J.DrugDiscovToday2011,325-331和Benjamin,D.NatRevDrugDiscov2011,868-880”报道，mTOR抑制剂的骨架结构为大环内酯类化合物和/或含氮杂环化合物。其中，大环内酯类化合物属于别构抑制剂，主要是雷帕霉素及其结构类似物，虽然这类化合物作为药物已成功应用于肿瘤的治疗，但是抗瘤谱窄，仅被用来治疗淋巴癌、肾癌和子宫内膜癌等某些癌症，同时，该类抑制剂也会激活mTOR依赖的存活通路从而导致治疗效果不好，在临床上已表现出了抗药性。而ATP竞争型的小分子抑制剂主要是含氮杂环化合物，但是部分含氮杂环化合物的ATP竞争型抑制剂特异性较低，容易对正常细胞产生细胞毒性；而且在临床实验中，细胞活性弱，血药浓度低。综上所述，发现新的mTOR抑制剂受到学术界和制药界的广泛关注。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的已用于肿瘤治疗的mTOR的抑制剂抗瘤谱窄，具有耐药性；特异性较低，容易对正常细胞产生细胞毒性；在临床实验中，细胞活性弱，血药浓度低等缺陷，而提供了一种黄酮类化合物的应用。本发明的黄酮类化合物可用于制备mTOR抑制剂，尤其是mTORC1抑制剂。本发明的黄酮类化合物还可用于制备预防和/或治疗癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症的药物。本发明的黄酮类化合物能够有效抑制mTOR的酶的催化活性，其最小抑制浓度为纳摩尔级，对癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症表现出很好的疗效。

本发明提供了一种如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐在制备mTOR抑制剂中的应用；

其中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和R¹⁰各自独立地为：氢、卤素(优选氟、氯、溴或碘)、取代或未取代的C₁～C₂₀的烷基、取代或未取代的C₃～C₂₀的环烷基、取代或未取代的C₂～C₂₀的烯基、取代或未取代的C₃～C₂₀的环烯基、取代或未取代的C₂～C₂₀的炔基、取代或未取代的C₅～C₂₀的芳基、取代或未取代的C₂～C₂₀的杂芳基、取代或未取代的C₂～C₂₀的杂环基、-氰基、硝基、 R¹¹和R¹²各自独立地为氢、取代或未取代的C₁～C₂₀的烷基、取代或未取代的C₃～C₂₀的环烷基、取代或未取代的C₂～C₂₀的烯基、取代或未取代的C₃～C₂₀的环烯基、取代或未取代的C₂～C₂₀的炔基、取代或未取代的C₅～C₂₀的芳基、取代或未取代的C₂～C₂₀的杂芳基，或者，取代或未取代的C₂～C₂₀的杂环基；

所述的“取代的C₁～C₂₀的烷基”、所述的“取代的C₃～C₂₀的环烷基”、所述的“取代的C₂～C₂₀的烯基”、所述的“取代的C₃～C₂₀的环烯基”、所述的“取代的C₂～C₂₀的炔基”、所述的“取代的C₅～C₂₀的芳基”、所述的“取代的C₂～C₂₀的杂芳基”，以及所述的“取代的C₂～C₂₀的杂环基”中所述的“取代”是指被一个或多个下列取代基取代：取代或未取代的C₁～C₄的烷基(所述的“取代或未取代的C₁～C₄的烷基”中所述的“取代”是指被一个或多个羟基所取代。所述的“取代或未取代的C₁～C₄的烷基”较佳地为取代或未取代的甲基、取代或未取代的乙基、取代或未取代的正丙基、取代或未取代的异丙基、取代或未取代的正丁基、取代或未取代的异丁基，或者，取代或未取代的叔丁基；所述的取代的甲基较佳地为羟甲基。)、C₁～C₄的烷氧基(所述的C₁～C₄的烷氧基较佳地为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基)、卤素(所述的卤素较佳地为氟、氯、溴或碘)、羟基或氨基；当取代基为多个时，所述的取代基相同或不同；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和R¹⁰至少三个为羟基。

所述的“取代或未取代的C₁～C₂₀的烷基”较佳地为取代或未取代的C₁～C₁₀的烷基，更佳地为取代或未取代的C₁～C₄的烷基。所述的取代或未取代的C₁～C₄的烷基较佳地为取代或未取代的甲基、取代或未取代的乙基、取代或未取代的正丙基、取代或未取代的异丙基、取代或未取代的正丁基、取代或未取代的异丁基，或者，取代或未取代的叔丁基。

所述的“取代或未取代的C₃～C₂₀的环烷基”较佳地为取代或未取代的C₃～C₁₀的环烷基，更佳地为取代或未取代的C₃～C₆的环烷基。所述的取代或未取代的C₃～C₆的环烷基较佳地为取代或未取代的环丙基、取代或未取代的环丁基、取代或未取代的环戊基，或者，取代或未取代的环己基。

所述的“取代或未取代的C₂～C₂₀的烯基”较佳地为取代或未取代的C₂～C₁₀的烯基，更佳地为取代或未取代的C₂～C₄的烯基。所述的取代或未取代的C₂～C₄的烯基较佳地为取代或未取代的乙烯基、取代或未取代的丙烯基、取代或未取代的烯丙基、取代或未取代的1-丁烯、2-丁烯，或者，取代或未取代的异丁烯。

所述的“取代或未取代的C₃～C₂₀的环烯基”较佳地为取代或未取代的C₃～C₁₀的环烯基，更佳地为取代或未取代的C₃～C₆的环烯基。所述的取代或未取代的C₃～C₆的环烯基较佳地为取代或未取代的环丙烯基、取代或未取代的环丁烯基、取代或未取代的环戊烯基，或者，取代或未取代的环丁烯基。

所述的“取代或未取代的C₂～C₂₀的炔基”较佳地为取代或未取代的C₂～C₁₀的炔基，更佳地为取代或未取代的C₂～C₄的炔基。所述的取代或未取代的C₂～C₄的炔基较佳地为取代或未取代的乙炔基、取代或未取代的丙炔基或者，取代或未取代的2-丁炔基。

所述的“取代或未取代的C₅～C₂₀的芳基”较佳地为取代或未取代的C₅～C₁₀的芳基。所述的取代或未取代的C₅～C₁₀的芳基较佳地为取代或未取代的苯基，或者，取代或未取代的萘基。

所述的“取代或未取代的C₂～C₂₀的杂芳基”较佳地是指杂原子为N、O或S，杂原子数为1～4个的取代或未取代的C₂～C₂₀的杂芳基。所述的“杂原子为N、O或S，杂原子数为1～4个的取代或未取代的C₂～C₂₀的杂芳基”较佳地是指杂原子为N、O或S，杂原子数为1或2的C₂～C₆的取代或未取代的杂芳基。所述的取代或未取代的C₂～C₆的杂芳基较佳地为取代或未取代的吡咯基、取代或未取代的呋喃基、取代或未取代的噻吩基，或者，取代或未取代的嘧啶基。

所述的“取代或未取代的C₂～C₂₀的杂环基”较佳地是指杂原子为N、O或S，杂原子数为1～4个的取代或未取代的C₂～C₂₀的杂环基。所述的“杂原子为N、O或S，杂原子数为1～4个的取代或未取代的C₂～C₂₀的杂环基”较佳地是指杂原子为N或O，杂原子数为1或2的C₂～C₆的取代或未取代的杂环基。所述的取代或未取代的C₂～C₆的杂环基较佳地为取代或未取代的四氢吡咯基、取代或未取代的四氢呋喃基，或者，取代或未取代的四氢吡喃基。所述的取代的四氢吡喃基较佳地为

较佳地，如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐中，R¹、R³、R⁶、R⁷和R¹⁰均为氢，R²、R⁴、R⁵、R⁸和R⁹均为羟基；

或者，R¹、R³、R⁶、R⁷和R¹⁰均为氢，R²、R⁴、R⁸和R⁹均为羟基；R⁵为

或者，R¹、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和R¹⁰均为氢，R²、R³和R⁴均为羟基；

其为如下任一化合物：

所述的mTOR抑制剂较佳地为mTORC1抑制剂。

本发明还提供了一种所述的如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症药物中的应用。所述的疾病包括本领域通过抑制mTORC1的酶来预防和/或治疗的疾病，本发明优选癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症(参见Cornu,M.Curropingenetdev2013,23(1),53-62.和Dazert,E.CurrOpinCellBiol2011,744-755)。

所述的癌症较佳地包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺神经内分泌癌、胃食道癌、肝细胞癌、T细胞淋巴癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、卵巢癌、子宫颈癌、成胶质细胞瘤、甲状腺癌、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、大肠癌、直肠癌、白血病、肝癌、小肠癌、大肠癌、脑和中枢神经系统癌或者胆道癌。

所述的代谢紊乱综合症较佳地包括高血压、糖尿病、冠心病、中风、肥胖或者加速粥样硬化性血管病。

所述的神经退行性疾病较佳地包括阿尔茨海默病、帕金森症、亨廷顿氏疾病、肌萎缩侧索硬化症、小脑萎缩症、多发性硬化病或者脊髓性肌萎缩症。

所述的炎症较佳地包括类风湿关节炎、牛皮癣、淋巴结炎、肝炎、肺炎或者肾炎。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含所述的如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐及其生理学或药学上可接受的载体。其中，所述的如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐的质量为治疗有效量以上，一般为0.01％～99％，所述的百分比是指质量百分比。所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料可为本领域常规适用的药物辅料，较佳地为增稠剂、填充剂、稀释剂和药物载体中的一种或多种。所述的增稠剂较佳地为葡聚糖或其衍生物。所述的药物载体较佳地为明胶微球和/或脂质体。

本发明还提供了一种上述药物组合物在制备mTOR抑制剂中的应用。

所述的mTOR抑制剂较佳地为mTORC1抑制剂。

本发明还提供了一种上述药物组合物在制备预防和/或治疗癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症药物中的应用。所述的疾病包括本领域通过抑制mTORC1的酶来预防和/或治疗的疾病，本发明优选癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症。

所述的癌症较佳地包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺神经内分泌癌、胃食道癌、肝细胞癌、T细胞淋巴癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、卵巢癌、子宫颈癌、成胶质细胞瘤、甲状腺癌、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、大肠癌、直肠癌、白血病、肝癌、小肠癌、大肠癌、脑和中枢神经系统癌或者胆道癌。

所述的代谢紊乱综合症较佳地包括高血压、糖尿病、冠心病、中风、肥胖或者加速粥样硬化性血管病。

所述的神经退行性疾病较佳地包括阿尔茨海默病、帕金森症、亨廷顿氏疾病、肌萎缩侧索硬化症、小脑萎缩症、多发性硬化病或者脊髓性肌萎缩症。

所述的炎症较佳地包括类风湿关节炎、牛皮癣、淋巴结炎、肝炎、肺炎或者肾炎。

所述的药物可为任何适用的常规剂型。所述的药物可以仅以如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐作为唯一活性成分，也可还含有除如式I所示的如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐以外的其它活性成分。所述的其它活性成分为对如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐没有不良影响可联合适用的其他活性成分(如拮抗作用等)，较佳地为具有预防和/或治疗癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症的药物。

本发明中，所述的如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐可为本领域常规的制备方法制得的如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐，或者市售可得的如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐(纯度：HPLC≥98％)。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明发现了一种如式I所示的黄酮类化合物的新用途，即上述化合物在制备mTORC1抑制剂中的用途，上述黄酮类化合物能够有效抑制mTORC1的酶催化活性。利用含有如式I所示的黄酮类化合物作为活性成分制备的药物治疗癌症，代谢紊乱综合征，神经性退行性疾病或炎症，均能获得显著的疗效。

附图说明

图1A为2μMmTORC1底物肽体系的激光诱导荧光吸收色谱图。

图1B为2μMmTORC1底物肽体系中加入31.1nMmTORC1蛋白，25℃反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光诱导荧光吸收色谱图。

图1C为在mTORC1催化底物肽磷酸化反应体系中加入0.5μM槲皮素，25℃反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光诱导荧光吸收色谱图。

图2A为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的紫外吸收色谱图。

图2B为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的荧光吸收色谱图。

图2C为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的BasePeak色谱图。

图2D为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液中底物提取流色谱图。

图2E为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液中产物提取流色谱图。

图3为mTORC1底物肽的质谱图。

图4为mTORC1催化底物肽磷酸化反应的产物质谱图。

图5为mTORC1催化底物肽磷酸化反应的产物的二级质谱图。

图6为槲皮素对mTORC1催化底物肽磷酸化反应活性的抑制曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

底物肽STTPGGTLFSTTPG(所述底物肽的序列如序列表中SEQIDNO:1所示，参见PerkinElmer公司的mTOR激酶测试方法)，由吉尔生化(上海)有限公司合成该底物肽，并对其N端进行5-羧基荧光素(5-FAM)标记，以便于荧光检测以及提高检测的灵敏度，所得底物肽的肽段结构如式II所示：

实施例中使用的mTORC1购自sigma试剂有限公司，产品货号：SRP0364。

配制酶反应缓冲液25mL：50mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，pH值由4MNaOH调节至7.5，2mM1,4-二硫代苏糖醇，10mM氯化镁，1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，0.01％(v/v，下同)吐温20和3mM氯化锰。

使用2μL酶反应缓冲液溶解底物肽(含有5×10^-8M荧光素钠作为内标，提高定量的准确性)与mTORC1。其中，底物肽的浓度为2μM，mTORC1的浓度为31.1nM。

利用配制有激光诱导荧光检测器的毛细管电泳仪(CE)分离31.1nMmTORC1与2μMmTORC1底物肽的反应体系，并考察不存在黄酮类化合物(即不存在槲皮素)(加入0.25％二甲基亚砜作为对照)与分别在反应体系中加入0.5μM黄酮类化合物(槲皮素，0.25％二甲基亚砜溶解黄酮类化合物)后该反应体系的差异。

实验所用仪器为P/ACEMDQ毛细管电泳仪(BeckmanCoulter,CA,USA)，配有激光诱导荧光检测器，氩离子激光源，激发波长488nm，发射波长520nm；数据通过装有32KaratSoftware的计算机采集；弹性石英毛细管柱规格为50μmI.D.(370μmO.D.)×30cm(有效柱长19.5cm，PolymicroTechnologies，AZ，USA)。如没有特殊注明，所有分析的电泳条件都为：柱温25℃，反端压力进样。

结果如图1A～1C所示，其中图1A为2μMmTORC1底物肽的激光诱导荧光吸收色谱图。图1B为2μMmTORC1底物肽体系中加入31.1nMmTORC1蛋白，25℃反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光诱导荧光吸收色谱图。图1C为在mTORC1催化底物肽磷酸化反应体系中加入0.5μM槲皮素，25℃反应20分钟后所得的激酶反应溶液的激光诱导荧光吸收色谱图。

结果表明在包含31.1nMmTORC1与2μMmTORC1底物肽的反应体系中分别加入黄酮类化合物(槲皮素)，可以有效抑制mTORC1对底物肽的磷酸化反应。mTORC1催化5-FAM修饰的底物肽磷酸化反应如下所示：

为了进一步证明激光诱导荧光吸收色谱图中各峰的归属，证明磷酸化产物的生成，我们利用高效液相色谱(HPLC)-紫外检测器(UV)-荧光检测器(FLD)和电喷雾离子阱质谱(ESI/MS)的技术对mTORC1催化底物肽磷酸化反应进行了测试，进一步确证了磷酸化产物肽的存在。

检测条件为：安捷伦1260液相色谱系统，配有紫外检测器(UV)和荧光检测器(FLD)；色谱柱为AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱(2.1mm×150mm，3.5-Micron)；UV检测波长为220nm；FLD激发波长为488nm，发射波长为520nm；进样量5μL；流速0.3mL/min；柱温30℃。流动相A和B分别为水和乙腈，两者均含0.1％甲酸(v/v，下同)。采用梯度洗脱，具体为：0-20分钟，20％-40％B；20-25分钟，40％-100％B。HPLC与LCQ-Fleet离子阱质谱(ThermoScientific,CA)偶联，所有质谱均在正离子模式下获得；喷雾电压为4.5kV；毛细管电压为30V；毛细管温度为320℃。检测结果如图2A～2E、图3、图4和图5所示，图2A为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的紫外吸收色谱图。图2B为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的荧光吸收色谱图。图2C为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液的BasePeak色谱图。图2D为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液中底物提取流色谱图。图2E为mTORC1催化底物肽磷酸化反应后所得的激酶反应溶液中产物提取流色谱图。图3为mTORC1的底物肽的质谱图。图4为mTORC1催化底物肽磷酸化反应所得产物的质谱图。图5为mTORC1催化底物肽磷酸化反应所得产物的二级质谱图。图3中底物肽分子离子峰理论值为1681.71，实测值为841.65([M+2H]²⁺)。图4中磷酸化产物分子离子峰理论值为1759.67，实测值为881.30([M+2H]²⁺)。上述结果表明mTORC1能够有效催化其底物肽的磷酸化反应。根据mTORC1催化底物肽磷酸化反应所得产物的二级碎片离子对底物磷酸化位点进行了确证，从图5碎片离子的信息可知，底物肽发生磷酸化的位点只能是短肽序列中第12位氨基酸—苏氨酸。其中，b离子和y离子指的是多肽离子在质谱碰撞室内经惰性气体碰撞解离时，在肽链酰胺键处断裂产生的离子，经过这样的过程形成的N端离子为b离子，C端离子为y离子。

对酶的催化活性进行抑制作用研究时，需要在反应体系中分别加入不同浓度的黄酮类化合物(槲皮素)，进行磷酸化反应，黄酮类化合物(槲皮素)往反应体系中的加入浓度如表1所示：

表1黄酮类化合物的添加浓度

实验方法为：将新毛细管柱在30psi压力条件下用0.1MNaOH溶液处理30分钟，再分别用超纯水、背景电解质分别冲洗10分钟。每次运行间隔在30psi压力条件下以1MNaOH、超纯水、背景电解质各冲洗3分钟。样品在0.2psi条件下进样5s；分离电压为-15kV；柱温维持在25℃。分离缓冲液为100mMHepes，pH值由NaOH调节至7.5，荧光素钠为内标以校正进样量。

mTORC1的活性通过检测磷酸化产物肽的生成来确定，即通过磷酸化产物肽校正峰面积的测定(校正峰面积即磷酸化产物肽和内标的峰面积比)，可以定量测定mTORC1的活性。对于抑制活性研究或抑制剂筛选，将纳摩尔至微摩尔浓度上述黄酮类化合物(槲皮素)分别加入到反应溶液中，上述化合物的抑制活性可以通过与空白对照(即不加入黄酮类化合物)相比，根据磷酸化产物肽峰面积的减少来确定，上述化合物的抑制百分比可以通过以下公式计算：

$I\%=(1-\frac{A_x}{A_o})\×100\%.$

其中，I％是抑制百分数；A_x和A_o分别是加入抑制剂和不加任何抑制剂时的磷酸化产物肽的峰面积，取抑制作用百分比为50％时所对应的抑制剂浓度得到的半数抑制浓度即抑制剂的IC₅₀值。

经检验确定，当mTORC1的底物肽浓度为2μM时，mTORC1浓度为31.1nM和46.7nM时，孵育时间在0-20分钟内，产物生成量与孵育时间成正比关系；当mTORC1浓度为31.1nM，孵育时间为20分钟时，底物转化率不超过10％，符合酶促反应动力学的初速度条件。同时还检验确定mTORC1催化底物肽磷酸化反应在25℃下的反应效率比37℃高。最终选定反应体系为：mTORC1的底物肽的浓度为2μM，mTORC1的浓度为31.1nM，孵育时间为20分钟，在底物的转化率不超过10％条件进行以下的酶抑制剂筛选工作。

按照表1所示，将不同浓度的黄酮类化合物(槲皮素)分别加入到上述反应体系中进行酶促反应(反应体系中mTORC1的底物肽的浓度为2μM，mTORC1的浓度为31.1nM，孵育时间为20分钟)，按照上述毛细管电泳法检测黄酮类化合物(槲皮素)对mTORC1活性的抑制百分比，检测结果如表2所示。

表2不同浓度的槲皮素对mTORC1活性抑制百分比

槲皮素浓度(nmol/L)	0.05	0.5	5	50	250	500	5×103	5×104	5×105
										抑制百分比(％)	0	0	0	8	47	53	97	100	100

将所得槲皮素的抑制百分比结果，利用通用型数据处理软件Origin8.0非线性拟合方法进行处理，得到了槲皮素对mTORC1的抑制曲线，其中槲皮素对mTORC1催化底物肽去磷酸化反应活性的抑制曲线如图6所示。

根据上述检测结果和抑制曲线，计算出槲皮素的半数抑制浓度IC₅₀值分别为：槲皮素的IC₅₀值是377nM，所得实验结果说明槲皮素都可以有效地抑制mTORC1对底物肽的磷酸化活性，上述黄酮类化合物都具有极强的mTORC1抑制活性，能够用于制备mTORC1的抑制剂。

对比实施例1

按照实施例1完全相同的方法，将不同浓度的黄芩苷、金丝桃苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷和千层纸素A分别加入到实施例1相同的反应体系中进行酶促反应(反应体系中mTORC1的底物肽的浓度为2μM，mTORC1的浓度为31.1nM，孵育时间为20分钟)，按照实施例1中的毛细管电泳法检测黄芩苷、金丝桃苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷和千层纸素A对mTORC1活性的抑制百分比。

实验结果表明这6种化合物在浓度为1.25μM时，仅黄芩素和金丝桃苷对mTORC1的酶的催化活性的抑制作用达到25％，其余四种化合物在浓度为1.25uM时，对mTORC1的酶的催化活性没有任何抑制作用。

Claims (10)

1.一种如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐在制备哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂中的应用；

其中，R¹、R³、R⁶、R⁷和R¹⁰均为氢，R²、R⁴、R⁵、R⁸和R⁹均为羟基；

或者，R¹、R³、R⁶、R⁷和R¹⁰均为氢，R²、R⁴、R⁸和R⁹均为羟基；R⁵为

或者，R¹、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹和R¹⁰均为氢，R²、R³和R⁴均为羟基；

所述的如式I所示的化合物为如下任一化合物：

2.如权利要求1所述的如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐在制备哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂中的应用，其特征在于，所述的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1抑制剂。

3.一种如权利要求1所述的如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的癌症包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺神经内分泌癌、胃食道癌、肝细胞癌、T细胞淋巴癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、卵巢癌、子宫颈癌、成胶质细胞瘤、甲状腺癌、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、大肠癌、直肠癌、白血病、肝癌、小肠癌、大肠癌、脑和中枢神经系统癌或者胆道癌；

和/或，所述的代谢紊乱综合症包括高血压、糖尿病、冠心病、中风、肥胖或者加速粥样硬化性血管病；

和/或，所述的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森症、亨廷顿氏疾病、肌萎缩侧索硬化症、小脑萎缩症、多发性硬化病或者脊髓性肌萎缩症；

和/或，所述的炎症包括类风湿关节炎、牛皮癣、淋巴结炎、肝炎、肺炎或者肾炎。

5.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的如式I所示的黄酮类化合物、其立体异构体、互变异构体、水合物或药学上可接受的盐，及其生理学或药学上可接受的载体。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的载体为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料；所述的药物辅料为增稠剂、填充剂、稀释剂和药物载体中的一种或多种。

7.一种如权利要求5或6所述的药物组合物在制备哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂中的应用。

8.如权利要求7所述的药物组合物在制备哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂中的应用，其特征在于，所述的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1抑制剂。

9.一种如权利要求5或6所述的药物组合物在制备预防和/或治疗癌症、代谢紊乱综合症、神经退行性疾病或炎症药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的癌症包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺神经内分泌癌、胃食道癌、肝细胞癌、T细胞淋巴癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、卵巢癌、子宫颈癌、成胶质细胞瘤、甲状腺癌、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌、黑色素瘤、大肠癌、直肠癌、白血病、肝癌、小肠癌、大肠癌、脑和中枢神经系统癌或者胆道癌；

和/或，所述的代谢紊乱综合症包括高血压、糖尿病、冠心病、中风、肥胖或者加速粥样硬化性血管病；

和/或，所述的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森症、亨廷顿氏疾病、肌萎缩侧索硬化症、小脑萎缩症、多发性硬化病或者脊髓性肌萎缩症；

和/或，所述的炎症包括类风湿关节炎、牛皮癣、淋巴结炎、肝炎、肺炎或者肾炎。