CN102770129A - 治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-基乙炔基)-4-甲基-N-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)-甲基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺治疗癌症的方法、试剂盒以及药物组合物。
Description
发明背景
本发明涉及基于多重激酶抑制剂ponatinib(“化合物1”)的药物组合物和治疗方法,用于治疗与病理性细胞增殖有关的疾病(例如新生瘤、癌症,以及与病理性血管生成有关的病症)。
蛋白激酶为蛋白的大家族,其在广泛的细胞过程调节中起关键作用。此类激酶的部分目录(非限制性)包括abl、Akt、BCR-ABL、Blk、Brk、c-KIT、c-met、c-src、CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8、CDK9、CDK10、cRaf1、CSK、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、Erk、Pak、fes、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5、Fgr、FLT1、FLT3、Fps、Frk、Fyn、Hck、IGF-1R、INS-R、Jak、KDR、Lck、Lyn、MEK、p38、PDGFR、PIK、PKC、PYK2、ros、tie、tie2、TRK和Zap70。异常的蛋白激酶活性已经发现与多种疾病有关,包括从不危及生命的疾病(例如牛皮癣)至及其严重的疾病(例如癌症)。
激酶抑制剂已经被开发出来并用于治疗中,并且取得了一些重要的成功。然而,并非所有的被治疗患者都对那些激酶抑制剂起反应,而且一些患者经过在所述激酶中出现突变株或通过其它机理对所用抑制剂变得难以治疗(refractory)。目前批准的激酶抑制剂可导致麻烦的副作用,而且一些患者对所用抑制剂不耐受或出现不耐受。不幸的是,对新的和更好的治疗的医学需求一直没有得到满足。
异常的酪氨酸激酶(例如BCR-ABL)是慢性髓样白血病(CML)和费城染色体阳性急性成淋巴细胞性白血病(Ph+ALL)的标志。一些用BCR-ABL的酪氨酸抑制剂(“TKI”)伊马替尼治疗的患者出现对伊马替尼耐药。对伊马替尼耐药与BCR-ABL中的多种突变株的出现已经被联系起来。第二代BCR-ABL抑制剂达沙替尼和尼罗替尼,已经做出了重要贡献并抑制许多突变的BCR-ABL种类,但仍不能对抗至少一种此类突变株:T315I突变株。目前,在第二代TKI失效后,对CML或Ph+急性髓细胞性白血病患者尚无标准治疗。重要的是,对携带T315I突变株(对所有目前批准的TKI耐药的突变株)的患者尚无可用的靶向治疗。
涉及多种癌症的开始和进展的酪氨酸激酶的其它实例包括FMS-样酪氨酸激酶3(FLT3)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)受体以及血管生成素受体(TIE2)。
由于内部串联重复(intemal tandem duplication,ITD)组成性激活FLT3在大约三分之一的急性成髓细胞性白血病(AML)患者中出现。
已知在几种实体瘤(包括子宫内膜癌、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和胃癌,以及多发性骨髓瘤)中激活成纤维细胞生长因子受体(FGFR)。
在多种癌症(例如胶质母细胞瘤和结肠直肠癌以及多种其它增生性疾病)中涉及VEGFR和其它激酶介导的不合适的血管生成。
考虑到大量蛋白激酶和相关疾病,对可对多种蛋白激酶具有选择性并且可能有用于治疗相关疾病的新的抑制剂或抑制剂的组合一直存在需要,包括能够抑制BCR-ABLT315I的ABL抑制剂。
发明概述
本发明涉及强效的、口服有效的抑制剂ponatinib(“化合物1”)及其药物组合物和用途。根据生化测试、细胞实验、动物研究和迄今为止来自人类的临床研究的结果,证实了化合物1的非常具有前景的药理学性质。
如下文进一步详细讨论,化合物1为口服有效的多靶点激酶抑制剂。其为至今公开的最强效的BCR-ABL抑制剂以及能够抑制靶点的所有已知突变形式(包括目前无法治疗的对其它药物耐药的T315I突变株)的第一个pan-BCR-ABL抑制剂。在I期临床试验中,在患有难治的血液学癌症的患者(包括患有CML和Ph+ALL的绝大多数患者)中,包括其中达沙替尼和尼罗替尼无效的患者中,证明了吸引人的安全性特性和确凿的抗白血病活性。
化合物1的药代动力学和药效学特性(代表体内其激酶抑制活性、吸收、分布、代谢和排泄行为的总和)为口服可生物利用的化合物的特性(能够达到有效抑制靶点激酶的浓度,并且在BCR-ABL的情况下能够抑制表达耐药突变株细胞的过生长(生长物))。至今为止的吸引人的安全性特性反映了可成功达成这些目标,而没有不当地、不需要地抑制正常功能所需的激酶活性。
选择性和安全性特性的重要性通过化合物1抑制多种BCR-ABL及其突变株之外的激酶的强效活性得以强调。例如,化合物1抑制FLT3、FGF受体家族的所有4种成员、所有3种VEGF受体、血管生成素受体TIE2,但是对许多其它激酶类型(包括胰岛素受体、Aurora激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶家族)无活性。
因此,本发明涉及药物组合物和试剂盒,其含有如下所示的3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-基乙炔基)-4-甲基-N-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)-甲基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺(化合物1)或其药学上可接受的盐,以及涉及其治疗癌症和其它疾病的治疗用途:
化合物1
因此,本发明的方面涉及适于口服给药的药物组合物,其包含化合物1或其药学上可接受的盐,以及一种或多种药学上可接受的赋形剂,所述化合物1或其药学上可接受的盐的量为当给予至受试者时有效治疗新生瘤、癌症或过度增生性疾病的量。所述化合物1或其药学上可接受的盐可为例如盐酸盐。在具体实施方式中,所述药物组合物被配制为单位剂型。在一些实施方式中,所述单位剂型可含有30至300mg的化合物1。示例性单位剂型包含5至100mg、5至80mg、5至50mg、5至20mg、7至100mg、7至80mg、7至50mg、7至20mg、10至100mg、10至80mg、10至50mg、15至100mg、15至80mg、15至60mg、15mg至50mg、20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在另一实施方式中,所述单位剂型可包含20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg。示例性单位剂型包括具有5±1mg、7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐的那些。
在另一实施方式中,所述药物组合物被配制为固体单位剂型(例如,片剂、软胶囊或硬胶囊)。在一些实施方式中,所述单位剂型可包含30至300mg的化合物1。示例性单位剂型包括5至100mg、5至80mg、5至50mg、5至20mg、7至100mg、7至80mg、7至50mg、7至20mg、10至100mg、10至80mg、10至50mg、15至100mg、15至80mg、15至60mg、15mg至50mg、20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在另一实施方式中,所述单位剂型可包含5±1mg、7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg。示例性单位剂型包括具有5±1mg、7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐的那些。
在另一个方面中,本发明涉及在有此需要的受试者中治疗新生瘤、癌症或过度增生性疾病的方法,其通过向所述受试者口服给予30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐。示例性单位剂型包括5至100mg、5至80mg、5至50mg、5至20mg、7至100mg、7至80mg、7至50mg、7至20mg、10至100mg、10至80mg、10至50mg、15至100mg、15至80mg、15至60mg、15mg至50mg、20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在另一实施方式中,所述单位剂型可包含5±1mg、7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg。示例性单位剂型包括具有5±1mg、7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐的那些。在具体实施方式中,向所述受试者以单位剂型口服给予30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐的平均日剂量(例如,平均日剂量为20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐;或平均日剂量为20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐)。化合物1或其药学上可接受的盐可每周给予所述受试者多于1天或每7天时间给予所述受试者平均4至7次(例如,每周4次、每周5次、每周6次或每周7次)。在一些实施方式中,化合物1或其药学上可接受的盐,每天给予所述受试者。在具体实施方式中,所述受试者患有慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌或胶质母细胞瘤。在另一实施方式中,所述受试者患有对伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗顽固的病症。在另一实施方式中,所述受试者患有对伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗不耐受的病症。在另一实施方式中,所述受试者患有费城染色体阳性病症。在另一实施方式中,所述受试者患有对使用VEGF或VEGF-R抑制剂或拮抗剂(例如,贝伐单抗、索拉非尼或舒尼替尼)的治疗顽固的实体癌。在另一实施方式中,所述受试者患有对使用VEGF或VEGF-R抑制剂或拮抗剂(例如,贝伐单抗、索拉非尼或舒尼替尼)的治疗不耐受的病症。在一些实施方式中,所述受试者患有表达BCR-ABL突变株(例如,BCR-ABLT315I、BCR-ABLF317L或BCR-ABLF359C)的癌症。在另一实施方式中,所述受试者患有表达FLT3、KIT、FGFR1或PDGFRα突变株(例如,FLT3-ITD、c-KIT、FGFR1OP2-FGFR1或F1P1L1-PDGFRα)的癌症。在另一个实施方式中,所述化合物1或其药学上可接受的盐与mTOR抑制剂一起或并行给药,且各自以一起有效治疗所述新生瘤、癌症或过度增生性疾病的量给药。在一些实施方式中,所述mTOR抑制剂选自西罗莫司、依维莫司、坦罗莫司(temsirolimus)、ridaforolimus、biolimus、佐他莫司(zotarolimus)、LY294002、Pp242、WYE-354、Ku-0063794、XL765、AZD8055、NVP-BEZ235、OSI-027、渥曼青霉素、槲皮素、杨梅苷(myricentin)和星状孢子素及其药学上可接受的盐。
在另一个方面中,本发明涉及试剂盒,其包括(i)化合物1或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的适于口服给药的药物组合物,其中,所述化合物1或其药学上可接受的盐的量为当给予至受试者时有效治疗新生瘤、癌症或过度增生性疾病的量;和(ii)向受试者说明给药药物组合物以治疗新生瘤、癌症或过度增生性疾病的说明书。在一些实施方式中,所述受试者患有慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌或胶质母细胞瘤。
在另一方面,本发明涉及在有此需要的受试者中治疗新生瘤、癌症或过度增生性疾病的方法,其通过向所述受试者口服给予5至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐。示例性单位剂型包括5至100mg、5至80mg、5至50mg、5至20mg、7至100mg、7至80mg、7至50mg、7至20mg、10至100mg、10至80mg、10至50mg、15至100mg、15至80mg、15至60mg、15mg至50mg、20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在另一实施方式中,所述单位剂型可包含5±1mg、7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,向所述受试者以单位剂型口服给予5至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐的平均日剂量(例如,平均日剂量为5至100mg、5至80mg、5至50mg、5至20mg、7mg至100mg、7mg至80mg、7至50mg、7至20mg、10mg至100mg、10mg至80mg、10至50mg、15mg至100mg、15mg至80mg、15至60mg、15mg至50mg、20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐;或平均日剂量为5±1mg、7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐)。在另一方面,所述方法包括通过向所述受试者以产生40至600nM的化合物1的平均稳态波谷浓度的量、给药频率和持续时间给药化合物1或其药学上可接受的盐在受试者中抑制癌细胞的增殖;通过向所述受试者以产生40至600nM的化合物1的平均稳态波谷浓度的量、给药频率和持续时间给药化合物1或其药学上可接受的盐在受试者中抑制血管生成;通过每天向所述受试者口服给予30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐在有此需要的受试者中抑制血管生成;通过向所述受试者以产生40至600nM的化合物1的平均稳态波谷浓度的量、给药频率和持续时间给药化合物1或其药学上可接受的盐在受试者中抑制BCR-ABL-表达细胞的增殖;通过将细胞与化合物1或其药学上可接受的盐接触抑制BCR-ABL-表达细胞的增殖同时抑制耐药亚克隆的出现,所述化合物1或其药学上可接受的盐的量为足以抑制耐药亚克隆的出现的量;抑制BCR-ABL-表达细胞的增殖同时抑制复合突变株的出现,所述方法包括将细胞与化合物1或其药学上可接受的盐接触,所述化合物1或其药学上可接受的盐的量为足以抑制复合突变株的出现的量;通过每天向所述受试者口服给予30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐在有此需要的受试者中抑制BCR-ABL-表达细胞或其突变株的增殖;或通过每天向所述受试者口服给予30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐在有此需要的受试者中抑制突变株-表达细胞的增殖。
在本文所述的任一方面中,以单位剂型形式的化合物1的量和平均日剂量可修改为较低剂量(例如,用于儿童的较低剂量)。在一些实施方式中,所述单位剂型包括5至300mg或所述平均日剂量为5至300mg。在一些实施方式中,所述单位剂型可包含5至100mg、5至80mg、5至50mg、5至20mg、7至100mg、7至80mg、7至50mg、7至20mg、10至100mg、10至80mg、10至50mg、15至100mg、15至80mg、15至60mg、15mg至50mg、20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。示例性单位剂型包括具有5±1mg、7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐的那些。
在一方面中,本发明涉及以单位剂型配制用于口服给药的药物组合物,其包含30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中,所述单位剂型可包含20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,所述单位剂型可包含20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐。所述化合物1或其药学上可接受的盐可例如为盐酸盐。
在另一个方面中,本发明涉及通过向所述受试者以产生40至600nM的化合物1的平均稳态波谷浓度的量、给药频率和持续时间给药化合物1或其药学上可接受的盐在受试者中抑制癌细胞增殖的方法。在一些实施方式中,化合物1的所述平均稳态波谷浓度为40至200nM、50至200nM、60至200nM、70至200nM、80至200nM、90至200nM、40至120nM、50至120nM、60至120nM、70至120nM、80至120nM、200至600nM、220至600nM、240至600nM、250至600nM、270至600nM、280至600nM、200至400nM、200至300nM、250至400nM、300至500nM、350至550nM、400至600nM或450至600nM。化合物1或其药学上可接受的盐可每7天时间给予所述受试者平均4至7次(例如,每周4次、每周5次、每周6次或每周7次)。在一些实施方式中,化合物1或其药学上可接受的盐每天给予所述受试者。在具体实施方式中,向所述受试者以单位剂型口服给予30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐的平均日剂量(例如,平均日剂量为20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐;或平均日剂量为20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐)。在具体实施方式中,所述受试者患有胃癌,子宫内膜癌,膀胱癌,多发性骨髓瘤,乳腺癌或本文所述的任一其它癌症。在另一实施方式中,所述受试者患有慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病。在另一实施方式中,所述受试者患有骨髓增生异常综合征(例如,顽固性贫血伴原始细胞增多1型(RAEBI)或顽固性贫血伴原始细胞增多2型(RAEBII))。
在另一个方面中,本发明涉及通过每天向所述受试者口服给药30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐在有此需要的受试者中抑制癌细胞增殖的方法。在一些实施方式中,向所述受试者每天口服给予20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,向所述受试者每天口服给予20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,所述受试者患有胃癌,子宫内膜癌,膀胱癌,多发性骨髓瘤,乳腺癌或本文所述的任一其它癌症。在另一实施方式中,所述受试者患有慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病。在另一实施方式中,所述受试者患有骨髓增生异常综合征(例如,顽固性贫血伴原始细胞增多1型(RAEBI)或顽固性贫血伴原始细胞增多2型(RAEBII))。
在另一个方面中,本发明涉及通过向所述受试者以产生40至600nM的化合物1的平均稳态波谷浓度的量、给药频率和持续时间给药化合物1或其药学上可接受的盐在受试者中抑制血管生成的方法。在一些实施方式中,化合物1的所述平均稳态波谷浓度为40至200nM、50至200nM、60至200nM、70至200nM、80至200nM、90至200nM、40至120nM、50至120nM、60至120nM、70至120nM、80至120nM、200至600nM、220至600nM、240至600nM、250至600nM、270至600nM、280至600nM、200至400nM、200至300nM、250至400nM、300至500nM、350至550nM、400至600nM或450至600nM。化合物1或其药学上可接受的盐,可每7天时间给予所述受试者平均4至7次(例如,每周4次、每周5次、每周6次或每周7次)。在一些实施方式中,化合物1或其药学上可接受的盐每天给予所述受试者。在具体实施方式中,向所述受试者以单位剂型口服给予30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐的平均日剂量(例如,平均日剂量为20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐;或平均日剂量为20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐)。在具体实施方式中,所述受试者患有前列腺癌,肺癌,乳腺癌,结肠直肠癌,肾癌或胶质母细胞瘤。在另一实施方式中,所述受试者患有对使用VEGF或VEGF-R抑制剂或拮抗剂(例如,贝伐单抗、索拉非尼或舒尼替尼)的治疗顽固的实体癌。在另一实施方式中,所述受试者患有对使用VEGF或VEGF-R抑制剂或拮抗剂(例如,贝伐单抗、索拉非尼或舒尼替尼)的治疗不耐受的实体癌。在一些实施方式中,所述受试者患有与异常血管生成有关的病症,例如糖尿病性视网膜病变,类风湿性关节炎,牛皮癣,动脉粥样硬化,慢性炎症,肥胖症,黄斑变性或心血管疾病。
在另一个方面中,本发明还涉及通过每天向所述受试者口服给药30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐在有此需要的受试者中抑制血管生成的方法。在一些实施方式中,向所述受试者每天口服给予20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,向所述受试者每天口服给予20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,所述受试者患有前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌或胶质母细胞瘤。在另一实施方式中,所述受试者患有对使用VEGF或VEGF-R抑制剂或拮抗剂(例如,贝伐单抗、索拉非尼或舒尼替尼)的治疗顽固的实体癌。在另一实施方式中,所述受试者患有对使用VEGF或VEGF-R抑制剂或拮抗剂(例如,贝伐单抗、索拉非尼或舒尼替尼)的治疗不耐受的实体癌。在一些实施方式中,所述受试者患有与异常血管生成有关的病症,例如糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、肥胖症、黄斑变性或心血管疾病。
在另一个方面中,本发明涉及试剂盒,其包括(i)以单位剂型配制用于口服给药的药物组合物,其包括30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐,和(ii)向受试者说明给药药物组合物用于治疗癌症或用于治疗与异常血管生成有关的病症的说明书。在一些实施方式中,所述单位剂型可包含20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,所述单位剂型可包含20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,所述所述受试者患有胃癌,子宫内膜癌,膀胱癌,多发性骨髓瘤,乳腺癌,慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病,骨髓增生异常综合征(例如,顽固性贫血伴原始细胞增多1型(RAEBI)或顽固性贫血伴原始细胞增多2型(RAEBII)或本文所述的任一其它癌症。在一些实施方式中,所述受试者患有糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、肥胖症、黄斑变性或心血管疾病。
在另一个方面中,本发明涉及通过向所述受试者以产生40至600nM的化合物1的平均稳态波谷浓度的量、给药频率和持续时间给药化合物1或其药学上可接受的盐在受试者中抑制BCR-ABL-表达细胞增殖的方法。在一些实施方式中,化合物1的所述平均稳态波谷浓度为40至200nM、50至200nM、60至200nM、70至200nM、80至200nM、90至200nM、40至120nM、50至120nM、60至120nM、70至120nM、80至120nM、200至600nM、220至600nM、240至600nM、250至600nM、270至600nM、280至600nM、200至400nM、200至300nM、250至400nM、300至500nM、350至550nM、400至600nM或450至600nM。化合物1或其药学上可接受的盐,可以以足以抑制耐药亚克隆出现的量给药或以足以抑制复合突变株出现的量给药。化合物1或其药学上可接受的盐,可每7天时间给予所述受试者平均4至7次(例如,每周4次、每周5次、每周6次或每周7次),并且用于包括2周、1个月、2个月、4个月、8个月、1年或18个月时间的不间断治疗。在一些实施方式中,化合物1或其药学上可接受的盐每天给予所述受试者。在具体实施方式中,向所述受试者以单位剂型口服给予30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐的平均日剂量(例如,平均日剂量为20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐;或平均日剂量为20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐)。在具体实施方式中,所述受试者患有选自慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病的病症。在另一实施方式中,所述病症为对化合物1以外的激酶抑制剂的治疗顽固的疾病(例如,对伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗顽固的病症)。在另一实施方式中,所述受试者患有对使用VEGF或VEGF-R抑制剂或拮抗剂(例如,贝伐单抗、索拉非尼或舒尼替尼)的治疗不耐受的实体癌。
在另一个方面中,本发明涉及通过将细胞与化合物1或其药学上可接受的盐接触抑制BCR-ABL-表达细胞增殖同时抑制耐药亚克隆出现的方法,所述化合物1或其药学上可接受的盐的量为足以抑制耐药亚克隆的出现的量。所述细胞可与20nM至320nM、30nM至320nM、20nM至220nM、30nM至220nM、20nM至120nM、30nM至120nM、40nM至320nM、40nM至220nM、40nM至120nM、50nM至320nM、50nM至220nM、50nM至120nM、70nM至320nM、70nM至220nM、90nM至320nM、90nM至220nM、110nM至320nM或110nM至220nM的化合物1或其药学上可接受的盐接触。所述细胞可与化合物1或其药学上可接受的盐接触包括2周、1个月、2个月、4个月、8个月、1年或18个月的不间断暴露时间。
在另一个方面中,本发明还涉及抑制BCR-ABL-表达细胞增殖同时抑制复合突变株出现的方法,所述方法包括将所述细胞与足以抑制复合突变株出现的量的化合物1或其药学上可接受的盐接触。所述细胞可与160nM至1μM、260nM至1μM、360nM至1μM、160nM至800nM、260nM至800nM、360nM至800nM、160nM至600nM、260nM至600nM、360nM至600nM、160nM至400nM、260nM至400nM、360nM至500nM或460nM至600nM的化合物1或其药学上可接受的盐接触。所述细胞可与化合物1或其药学上可接受的盐接触包括2周、1个月、2个月、4个月、8个月、1年或18个月的不间断暴露时间。
在任一上述方法中,所述细胞可对化合物1以外的激酶抑制剂的治疗顽固(例如,对伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗顽固)。在任一上述方法中,所述细胞可对VEGF或VEGF-R抑制剂或拮抗剂(例如,贝伐单抗、索拉非尼或舒尼替尼)的治疗不耐受。
在另一个方面中,本发明还涉及通过每天向所述受试者口服给药30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐在有此需要的受试者中抑制BCR-ABL-表达细胞或其突变株的增殖的方法。在一些实施方式中,向所述受试者每天口服给予20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,向所述受试者每天口服给予20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐。化合物1或其药学上可接受的盐,可以以足以抑制耐药亚克隆出现的量给药或以足以抑制复合突变株出现的量给药。在具体实施方式中,所述受试者患有选自慢性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病的病症。在另一实施方式中,所述病症对化合物1以外的激酶抑制剂的治疗顽固(例如,对伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗顽固的病症)。在另一实施方式中,所述病症对化合物1以外的激酶抑制剂的治疗不耐受(例如,对伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗不耐受的病症)。化合物1或其药学上可接受的盐,可每7天时间给予所述受试者平均4至7次(例如,每周4次、每周5次、每周6次或每周7次),并且用于包括2周、1个月、2个月、4个月、8个月、1年或18个月的不间断治疗时间。在一些实施方式中,化合物1或其药学上可接受的盐每天给予所述受试者。
在另一个方面中,本发明涉及试剂盒,其包括(i)以单位剂型配制用于口服给药的药物组合物,其包括30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐,和(ii)向罹患与BCR-ABL-表达细胞增殖有关的病症的受试者说明给药药物组合物的说明书。在一些实施方式中,所述单位剂型可包含20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,所述单位剂型可包含20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐。所述化合物1或其药学上可接受的盐可例如为盐酸盐。在具体实施方式中,所述受试者患有选自慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病的病症。在另一实施方式中,所述病症对化合物1以外的激酶抑制剂的治疗顽固(例如,对伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗顽固的病症)。在另一实施方式中,所述病症对化合物1以外的激酶抑制剂的治疗不耐受(例如,对伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗不耐受的病症)。
在另一个方面中,本发明涉及在有此需要的受试者中抑制突变株-表达细胞的增殖的方法,其通过每天口服给予所述受试者30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中,向所述受试者每天口服给予20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,向所述受试者每天口服给予20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中,所述突变株为FLT3突变株(例如,FLT3-ITD)、KIT突变株(例如,c-KIT或N822K)、FGFR突变株(例如,FGFR1OP2-FGFR1)、PDGFRα突变株(例如,F1P1L1-PDGFRα)或任一本文所述的突变株。在另一实施方式中,所述受试者患有急性髓性白血病或骨髓增生异常综合征(例如,顽固性贫血伴原始细胞增多1型(RAEBI)或顽固性贫血伴原始细胞增多2型(RAEBII))。在另一实施方式中,所述病症对化合物1以外的激酶抑制剂的治疗顽固(例如,对伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗顽固的病症)。在另一实施方式中,所述病症对化合物1以外的激酶抑制剂的治疗不耐受(例如,对伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗不耐受的病症)。化合物1或其药学上可接受的盐,可每7天时间给予所述受试者平均4至7次(例如,每周4次、每周5次、每周6次或每周7次),并且用于包括2周、1个月、2个月、4个月、8个月、1年或18个月的不间断治疗时间。在一些实施方式中,化合物1或其药学上可接受的盐每天给予所述受试者。
在一方面中,本发明涉及一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法,其通过向所述受试者各以一起有效治疗癌症的量一起或并行给药化合物1或其药学上可接受的盐与mTOR抑制剂。在另一个方面中,本发明还涉及一种在有此需要的受试者中治疗新生瘤的方法,其通过向所述受试者各以一起有效治疗新生瘤的量一起或并行给药化合物1或其药学上可接受的盐与mTOR抑制剂给药。在另一个方面中,本发明还涉及一种在有此需要的受试者中抑制血管生成的方法,其通过向所述受试者各以一起有效抑制血管生成的量一起或并行给药化合物1或其药学上可接受的盐与mTOR抑制剂给药。在另一个方面中,本发明涉及一种抑制细胞增殖的方法,其通过将细胞与各以一起有效抑制增殖的量化合物1或其药学上可接受的盐与mTOR抑制剂一起或并行接触。
在任一上述方面中,所述mTOR抑制剂为选自以下的雷帕霉素大环内酯:西罗莫司、依维莫司、坦罗莫司、ridaforolimus、biolimus、佐他莫司及其药学上可接受的盐。优选地,所述mTOR抑制剂为ridaforolimus或其药学上可接受的盐。在另一实施方式中,所述mTOR抑制剂为非雷帕霉素类似物,其选自LY294002、Pp242、WYE-354、Ku-0063794、XL765、AZD8055、NVP-BEZ235、OSI-027、渥曼青霉素、槲皮素、杨梅苷、星状孢子素及其药学上可接受的盐。
所述组合治疗可包括用药方案,其中化合物1或其药学上可接受的盐以及mTOR抑制剂在12天、8天、5天、4天、3天或2天内相互并行给药;化合物1或其药学上可接受的盐以及mTOR抑制剂在24小时内相互并行给药;或化合物1或其药学上可接受的盐以及mTOR抑制剂一起给药。化合物1和mTOR抑制剂可以以本发明的组合治疗给药,使用本文所述的任一用药方案。
在一些实施方式中,化合物1或其药学上可接受的盐,以低剂量给药;mTOR抑制剂以低剂量给药;或化合物1和mTOR抑制剂均以低剂量给药。
在具体实施方式中,所述组合治疗包括以产生40至600nM的化合物1的平均稳态波谷浓度的量、给药频率和持续时间向所述受试者给予化合物1或其药学上可接受的盐。例如,化合物1的所述平均稳态波谷浓度可为10至100nM、10至60nM、15至100nM、15至70nM、20至100nM、40至200nM、50至200nM、60至200nM、70至200nM、80至200nM、90至200nM、40至120nM、50至120nM、60至120nM、70至120nM、80至120nM、200至600nM、220至600nM、240至600nM、250至600nM、270至600nM、280至600nM、200至400nM、200至300nM、250至400nM、300至500nM、350至550nM、400至600nM或450至600nM。化合物1或其药学上可接受的盐,可每7天时间给予所述受试者平均4至7次(例如,每周4次、每周5次、每周6次或每周7次)。在一些实施方式中,化合物1或其药学上可接受的盐每天给予所述受试者。在具体实施方式中,向所述受试者以单位剂型口服给以30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐的平均日剂量(例如,平均日剂量为10至70mg、10至50mg、10至30mg、20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐;或平均日剂量为7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐。
本发明的组合治疗可用于治疗患有以下癌症的受试者:膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、头颈癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌或皮肤癌;鳞状细胞癌;子宫内膜癌;多发性骨髓瘤;淋巴系统的造血系统肿瘤(例如,白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤或伯基特淋巴瘤);骨髓系统的造血系统肿瘤(例如,急性髓性白血病、慢性髓性白血病、多发性髓性白血病、骨髓增生异常综合征或前髓细胞性白血病);间质起源的肿瘤(例如,纤维肉瘤或横纹肌肉瘤);中枢或外周神经系统的肿瘤(例如,星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤或神经鞘瘤);黑色素瘤;精原细胞瘤;畸胎癌;骨肉瘤;或卡波西肉瘤。在一些实施方式中,所述受试者患有非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、唾液腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、肾癌、头颈癌、胃癌、多发性骨髓瘤、甲状腺滤泡癌或成胶质细胞瘤。
本发明的组合治疗可用于治疗患有与异常血管生成有关的病症的受试者。所述与异常血管生成有关的病症可为实体瘤(例如,前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、胶质母细胞瘤或任一本文所述的实体瘤)、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、肥胖症、黄斑变性或心血管疾病。
在相关方面中,本发明涉及药物组合物,其包含化合物1或其药学上可接受的盐、mTOR抑制剂,以及药学上可接受的载剂或稀释剂。在一些实施方式中,所述mTOR抑制剂为选自以下的雷帕霉素大环内酯:西罗莫司、依维莫司、坦罗莫司、ridaforolimus、biolimus、佐他莫司及其药学上可接受的盐。优选地,所述mTOR抑制剂为ridaforolimus或其药学上可接受的盐。在另一实施方式中,所述mTOR抑制剂为非雷帕霉素类似物,其选自LY294002、Pp242、WYE-354、Ku-0063794、XL765、AZD8055、NVP-BEZ235、OSI-027、渥曼青霉素、槲皮素、杨梅苷、星状孢子素及其药学上可接受的盐。
本发明还涉及试剂盒,其包括(i)以单位剂型配制用于口服给药的第一药物组合物,其包括30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐,和(ii)包括mTOR抑制剂的第二药物组合物,其中所述第一药物组合物和所述第二药物组合物分别以各自的剂量配制。
本发明还涉及试剂盒,其包括以单位剂型配制用于口服给药的药物组合物,其包括30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐,以及mTOR抑制剂。
在上述试剂盒的一些实施方式中,所述单位剂型可包含10至70mg、10至50mg、10至30mg、20至100mg、20至80mg、20至50mg、30至100mg、35至100mg、40至100mg、50至100mg、60至100mg、70至100mg、30至80mg、35至80mg、40至80mg、50至80mg、60至80mg、50至300mg、60至300mg、70至300mg、50至200mg、60至200mg、70至200mg、100至300mg、120至300mg、140至300mg或100至200mg的化合物1或其药学上可接受的盐。在具体实施方式中,所述单位剂型可包含7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg、45±9mg、55±11mg、60±12mg、65±13mg、70±14mg、75±15mg、80±16mg、90±18mg、100±20mg、120±24mg、140±28mg、160±32mg、180±36mg、200±40mg、220±44mg、240±48mg或260±52mg的化合物1或其药学上可接受的盐。
在上述试剂盒的一些实施方式中,所述mTOR抑制剂为选自以下的雷帕霉素大环内酯:西罗莫司、依维莫司、坦罗莫司、ridaforolimus、biolimus、佐他莫司及其药学上可接受的盐。在上述试剂盒的另一实施方式中,所述mTOR抑制剂为非雷帕霉素类似物,其选自LY294002、Pp242、WYE-354、Ku-0063794、XL765、AZD8055、NVP-BEZ235、OSI-027、渥曼青霉素、槲皮素、杨梅苷、星状孢子素及其药学上可接受的盐。
本发明的试剂盒还可包括向受试者说明给药化合物1或其药学上可接受的盐以及mTOR抑制剂用于治疗以下疾病的说明书:癌症(例如,受试者患有膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、头颈癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌或皮肤癌;鳞状细胞癌;子宫内膜癌;多发性骨髓瘤;淋巴系统的造血系统肿瘤(例如,白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤或伯基特淋巴瘤);骨髓系统的造血系统肿瘤(例如,急性髓性白血病、慢性髓性白血病、多发性髓性白血病、骨髓增生异常综合征或前髓细胞性白血病);间质起源的肿瘤(例如,纤维肉瘤或横纹肌肉瘤);中枢或外周神经系统的肿瘤(例如,星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤或神经鞘瘤);黑色素瘤;精原细胞瘤;畸胎癌;骨肉瘤;或卡波西肉瘤)或受试者患有与异常血管生成有关的病症(例如,实体瘤、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、肥胖症或黄斑变性)。
在本发明的方法中,给药化合物1和mTOR抑制剂的剂量和频率可独立地控制。例如,一种化合物可每天口服给药,而第二种化合物可每天一次经静脉注射给药。所述化合物还可一起配制,使得一次给药递送两种所述化合物。
待给药的mTOR和化合物1的示例性剂量将取决于如下变量:疾病的类型和严重性、所述受试者的总体健康状况、所选mTOR抑制剂的治疗指数,以及它们的给药途径。标准临床试验可用于优化本发明的任一具体组合的剂量和给药频率。
用于本发明的化合物包括以它们的任一药学上可接受形式的本文所述化合物,包括异构体,例如非对映异构体和对映异构体,异构体的混合物,及其盐。
定义
本文所用的术语“BCR-ABL-表达细胞”是指表达天然BCR-ABL、BCR-ABL的耐药亚克隆或复合突变株的细胞。
本文所用的术语“平均稳态波谷浓度”是指在一组受试者中观察到的化合物1的平均血浆浓度,所述化合物1作为本发明治疗的给药方案一部分给药足以产生稳态药代动力学的时间(即,每天给药共23天的时间),其中所述平均波谷浓度为所述受试者在给药方案的下次安排给药前(即,1小时内)的整体平均循环浓度(例如,对于每天的给药方案,所述波谷浓度在给药化合物1大约24小时后并且在下次每天给药之前测量)。
“足以抑制复合突变株出现的量”是指:与抑制BCR-ABL-表达细胞的增殖所需的化合物1的最低浓度发生的复合突变株出现的速度相比,显著地降低体外或体内复合突变株的出现的化合物1的量。
“足以抑制耐药亚克隆出现的量”是指:与抑制BCR-ABL-表达细胞增殖所需的化合物1的最低浓度发生的耐药亚克隆出现的速度相比,显著地降低体外或体内耐药亚克隆的出现的化合物1的量。
“抑制BCR-ABL-表达细胞的增殖”是指在体外或体内,BCR-ABL-表达细胞的生长速率被显著地减缓、停止或逆转。优选地,生长速率减缓至少20%、30%、50%或甚至70%,如使用合适的测定细胞生长速率的测试(例如,本文所述的细胞生长测试)所确定。
“抑制癌细胞的增殖”是指在体外或体内,癌细胞的生长速率被显著地减缓、停止或逆转。优选地,生长速率减缓至少20%、30%、50%或甚至70%,如使用合适的测定细胞生长速率的测试(例如,本文所述的细胞生长测试)所确定。
“抑制细胞的增殖”是指在体外或体内,细胞的生长速率被显著地减缓、停止或逆转。优选地,生长速率减缓至少20%、30%、50%或甚至70%,如使用合适的测定细胞生长速率的测试(例如,本文所述的细胞生长测试)所确定。
术语“给药”是指向哺乳动物给予一定剂量的药物组合物的方法,其中所述方法为例如,口服、静脉注射、腹膜内、动脉内或肌内给药。优选的给药方法可取决于多种因素,例如,药物组合物的成分,潜在或急性疾病的位点以及疾病的严重程度。虽然化合物1将通常以口服给药,但是其它给药途径也可用于进行本发明的方法。
术语“单位剂型”是指适于作为单元剂量(unitary dosages)的物理上分离的单位,例如丸剂、片剂、囊片、硬胶囊或软胶囊,各单位包含预定量的化合物1。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指任一药学上可接受的盐,例如无毒的酸加成盐或金属络合物,其普遍用于制药工业。酸加成盐的实例包括以下酸的盐:有机酸,例如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸,以及无机酸,例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸。
本文所用的术语“治疗”是指为了预防和/或治疗目的给药药物组合物。“预防疾病”是指预防性处理尚未患病但容易患有某种疾病或处于某种疾病的风险的受试者。“治疗疾病”或“治疗性处理”是指向已经患有疾病的受试者给予治疗,以改善或稳定所述受试者的病症。因此,在权利要求书和实施方式中,治疗是以治疗或预防目的给药于受试者。
“并行(concurrently)”给药mTOR抑制剂和化合物1是指所述mTOR抑制剂和化合物1分别配制,并在2、3、4、5、6或7天内相互独立地给药。
“一起(together)”给药mTOR抑制剂和化合物1是指所述mTOR抑制剂和化合物1一起配制于单一药物组合物中一起给药。
本文所用的“有效治疗新生瘤、癌症或过度增生性疾病的量”是指减缓生长、减缓细胞从原发位点向身体其它部分扩散或减轻所述新生瘤、癌症或过度增生性疾病引起的症状的化合物1的量。当新生瘤、癌症或过度增生性疾病对本文所述的治疗响应时,症状得以减轻,所述症状包括疼痛和其它类型的不适。
当涉及组合治疗时,本文所用的“有效治疗新生瘤或癌症的量”是指化合物1和mTOR抑制剂一起减缓生长、减缓细胞从原发位点向身体其它部分扩散或减轻所述新生瘤或癌症引起的症状的量。当新生瘤或癌症对本文所述的组合治疗响应时,症状得以减轻,所述症状包括疼痛和其它类型的不适。
术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。它们涉及人或其它哺乳动物(例如,小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类),其可罹患疾病或障碍或容易患有疾病或障碍(例如,癌症、新生瘤或异常血管生成),但是可能或可能没有具有所述疾病或障碍。在一些实施方式中,所述受试者为人。
术语“癌症”是指哺乳动物中的生理性病症,其典型特征在于失调的细胞生长。实例包括但不限于,癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体地,所述癌症的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、食道/口腔癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠或结肠直肠癌、头颈癌、胃癌、多发性骨髓瘤、肾癌、慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征以及本文所述的任一其它癌症。
术语“新生瘤(neoplasm)”是指哺乳动物中的生理性病症,其典型特征在于异常的细胞增殖。新生瘤的非限制性实例包括本文所述的任一肿瘤,例如实体瘤。更具体地,新生瘤的实例包括胃实体瘤或胃肠癌、子宫内膜癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌以及成胶质细胞瘤。
术语“过度增生性疾病”是指与病理性细胞增殖或病理性血管生成有关的疾病。与异常血管生成有关的病症的非限制性实例包括实体瘤、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、肥胖症、黄斑变性以及心血管疾病。
“低剂量”是指低于在单一治疗中通常给予受试者的药物的剂量,以治疗新生瘤、癌症或与异常血管生成有关的病症(例如,低于70%、60%、50%、40%或30%作为单一治疗的给药量)。本发明的组合可用于降低组合治疗的各个成分的剂量,基本达到显著低于作为单一治疗给药mTOR抑制剂或化合物1以达到相同效果所需的剂量的量。示例性低剂量的化合物1和mTOR抑制剂如下所示:化合物1每天口服7-42mg(例如,每天口服7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg或35±7mg);ridaforolimus以qdx5/周口服7-28mg(例如,qdx5/周口服7±1.5mg、10±2mg、15±3mg、20±4mg或25±3mg);依维莫司每天口服2-7mg(例如,每天口服2±0.4mg、3±0.6mg、4±0.8mg、5±0.9mg或6±1.2mg);坦罗莫司每周静脉输注3-21mg(例如,每周静脉输注3±0.6mg、5±1mg、7.5±1.5mg、10±2mg、15±3mg或18±3.5mg);西罗莫司每天口服0.5-12mg(例如,每天口服0.5±0.1mg、1±0.2mg、2±0.4mg、3±0.6mg、4±0.8mg、5±0.9mg、6±1.2mg、8±1.5mg或10±2mg);biolimus每天静脉输注100-600μg(例如,每天静脉输注100±20μg、150±30μg、200±40μg、300±50μg、400±50μg或500±50μg);佐他莫司每天静脉输注100-600μg(例如,每天静脉输注100±20μg、150±30μg、200±40μg、300±50μg、400±50μg或500±50μg);NVP-BEZ235每天口服5-50mg(例如,每天口服5±1mg、10±1.5mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、35±7mg、40±8mg、45±9mg或50±10mg);渥曼青霉素每天口服10-70mg(例如,每天口服10±2mg、15±5mg、20±6mg、30±7mg、40±8mg、50±9mg、70±10mg);槲皮素每天口服1-5g(例如,每天口服1±0.1mg、2±0.2mg、3±0.3mg、4±0.5mg或5±1mg);杨梅苷每天口服15-100mg(例如,每天口服15±5mg、20±6mg、30±7mg、40±8mg、50±9mg、75±10mg或100±25mg);以及星状孢子素每天口服10-50mg(例如,每天口服10±1.5mg、15±3mg、20±4mg、25±5mg、30±6mg、35±7mg、40±8mg、45±9mg或50±10mg)。以下化合物可以以低于目前单一治疗所述的剂量给药:LY294002、Pp242、WYE-354、Ku-0063794、XL765、AZD8055以及OSI-027。
根据以下详细说明、附图以及权利要求书,本发明的其它特征和优点将显而易见。
附图说明
图1A和1B为证明化合物1在表达天然BCR-ABL或BCR-ABLT3151的CML细胞系中抑制BCR-ABL信号传导的图。图1A描述了在用伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼或化合物1处理的表达天然BCR-ABL的Ba/F3细胞中的CrkL磷酸化的免疫印迹分析。将细胞在抑制剂的存在下培养4小时、采集、溶解,并利用用于CrkL(BCR-ABL的底物,其磷酸化为BCR-ABL激酶活性的确定临床标记)的抗体通过免疫印迹进行分析。通过电泳迁移率解析析磷酸化的和非磷酸化的形式,并通过光密度测定法对电泳带进行定量,表示为%磷酸化的CrkL。图1B描述了在用伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼或化合物1处理的Ba/F3BCR-ABLT315I表达细胞中的CrkL磷酸化的免疫印迹分析。测试和分析如上所述在组(panel)(A)中进行。缩写:NT,未处理。图1A和1B证明了化合物1在表达天然BCR-ABL或BCR-ABLT315I的CML细胞系中抑制BCR-ABL信号传导。
图2A-C证明了CML原代细胞使用化合物1的离体处理抑制了细胞增殖和BCR-ABL-介导的信号传导。图2A为离体化合物1-处理的单核细胞的细胞增殖的图,所述单核细胞来自带有天然BCR-ABL的CML髓性原始细胞危象(M-BC)患者(N=3)以及来自健康个体(N=3)。作为参考,虚线表示相对于未处理细胞的50%细胞活力。图2B为描绘单核细胞中的CrkL磷酸化的免疫印迹分析的图,所述单核细胞来自带有BCR-ABLT315I的CML淋巴性原始细胞危象(L-BC)患者,然后离体暴露于化合物1、伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼。在抑制剂的存在下将细胞培养过夜、采集、溶解,并利用CrkL免疫印迹分析。通过电泳迁移率解析磷酸化的和非磷酸化的形式,并通过光密度测定法对电泳带进行定量,表示为%磷酸化的CrkL。图2C为描绘单核细胞中的总体酪氨酸磷酸化的FACS分析的图,所述单核细胞来自图2B中的CML L-BC BCR-ABLT315I患者。在抑制剂的存在下培养过夜后,将细胞固定并渗透化处理,与FITC-标记的磷酸化的酪氨酸的抗体一起孵育,并通过FACS分析。报道值为相对于未染色对照的平均荧光强度的增加倍数。缩写:NT,未处理。
图3A和3B为对抗化合物1的集落形成分析的图。图3A为在化合物1、尼罗替尼,和达沙替尼的存在下,使用来自带有BCR-ABLT315I的CML AP患者的单核细胞的集落形成分析的图。图3B为在化合物1的存在下,使用来自健康个体的单核细胞的集落形成分析的图。将来自带有BCR-ABLT315I的CML加速期(AP)患者和来自健康个体的单核细胞接种至包含尼罗替尼、达沙替尼或化合物1的甲基纤维素中,并培养14-18天。在倒置显微镜下计数集落,结果表示为一式三份的平均值(误差条表示S.EM.)。
图4A-4C证明了化合物1在BCR-ABL-驱使的和BCR-ABLT315I-驱使的肿瘤生长的小鼠异种模型中有效。图4A和4B为静脉注射表达天然BCR-ABL(图4A)或BCR-ABLT315I(图4B)的Ba/F3细胞后,显示化合物1对SCID小鼠的存活的作用的图。将表达天然BCR-ABL或BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞注射至SCID小鼠的尾静脉,并将小鼠通过口服强饲法用每天一次的载剂、化合物1或达沙替尼治疗所示的给药期(3-21天)。图4C显示了化合物1在使用表达BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞的皮下异种模型中的体内效力以及对BCR-ABL磷酸化的抑制。将细胞皮下植入裸鼠的右侧腹,当平均肿瘤体积达到大约500mm3时,将小鼠通过口服强饲法用每天一次的载剂或化合物1连续治疗19天(所示的给药期)。使用Dunnett’s检验将各化合物1治疗组与载剂组进行比较,且星号表示统计学显著性(p<0.05)。在通过口服强饲法用单一剂量的载剂或30mg/kg的化合物1治疗的小鼠中评估BCR-ABL磷酸化(每组N=3)。给药六小时后,处死小鼠并使用对抗pBCR-ABL和eIF4E(内参照)的抗体通过免疫印迹分析分析肿瘤样品。
图5为在使用表达BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞小鼠模型中显示达沙替尼的作用的图。显示了在所示的给药期期间用载剂或达沙替尼治疗的小鼠的存活曲线。存活中值使用Kaplan-Meier方法计算,并为各组指示统计学显著性值。
图6A和6B为描绘在所中浓度化合物1的存在下回收BCR-ABL突变株的图。图6A显示了从ENU-处理的Ba/F3细胞回收的耐药亚克隆,所述细胞从天然BCR-ABL开始,在分级浓度的化合物1(10、20、40nM)的存在下培养。各条表示在回收的亚克隆中所指的BCR-ABL激酶区域突变的相对百分率。由于存活的耐药亚克隆的百分率与化合物1的浓度成相反关系,因此在图中对各浓度的化合物1表示不同数量的测序亚克隆(见表2)。观察到包含生长物的孔的百分率在各图右侧示出。图6B显示了从ENU-处理的表达BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞回收的耐药亚克隆,所述细胞在分级浓度的化合物1(40、80、160、320、640nM)的存在下培养。该测试从表达BCR-ABLT315I的细胞开始,所有回收的亚克隆包含所述T315I突变株,以及各图指出的具体继发突变株。所述数据证明了化合物1(作为单一药物)可在基于细胞的诱发突变筛选中抑制耐药生长物。
图7A-7D为化合物1的药代动力学数据的图。图7A显示了多种剂量的化合物1在第1周期第1天(C1D1)和第2周期第1天(C2D1)的Cmax。图7B显示了多种剂量的化合物1在第1周期第1天(C1D1)和第2周期第1天(C2D1)的AUC。图7C显示了单次口服给药后在C1D1的浓度时间曲线。图7D显示了多次口服给药后在C2D1的浓度时间曲线。
图8A-8E显示了化合物1的药效学数据。图8A为显示了化合物1在临床研究的所有患者中和在具有T315I突变株的患者中的药效学数据的图。图8B-8E为显示了15mg的化合物1在具有F359C突变株的患者中(图8B)、30mg的化合物1在不具突变株的患者中(图8C)、45mg的化合物1在具有F359C突变株的患者中(图8D),以及60mg的化合物1在具有T315I突变株的患者中(图8E)的药效学数据的图。
图9为显示了在AML细胞系中抑制激活的酪氨酸激酶的受体磷酸化的图。将AML细胞与浓度递增的化合物1孵育72小时,使用MTS测试评价细胞活力。MV4-11、Kasumi-1和EOL-1数据表示为来自3次实验的平均值±SD,且KG1数据表示为来自2次实验的平均值±SD。
图10为显示了在MV4-11细胞中抑制生长和诱导凋亡的图。将MV4-11细胞接种在96-孔板中,用浓度递增的化合物1处理,并在所示的时间测量半胱天冬酶3/7活性。数据表示为相对于载剂处理的细胞的半胱天冬酶活性的诱导倍数,并表示为来自3次单独实验的平均值±SD。
图11A和11B显示了有效性和MV4-11异种移植物的靶向抑制。图11A为多种剂量的化合物1的肿瘤生长图。当MV4-11侧面异种肿瘤达到大约200mm3(10只小鼠/组)时,开始以1、2.5、5、10和25mg/kg/天的剂量每天口服给药化合物1或载剂4周。对平均肿瘤体积(±SEM)作图。由于肿瘤负荷,在第28天的最后治疗前处死了3只载剂对照组中的小鼠(共10只)。因此,计算了从第0天至第24天(给药期间倒数第二个肿瘤测量的时间点,如星号所示)的肿瘤生长抑制。图11B为显示了多种剂量的化合物1抑制p-FLT3和p-STAT5的图。以所示浓度向带有确定的MV4-11肿瘤异种移植物小鼠给药单一口服剂量的化合物1(4只小鼠/组);对照动物仅接受载剂(5只小鼠)。6小时后采集肿瘤,并通过免疫印迹分析磷酸化的水平以及总FLT3和STAT5的水平。检查GAPDH作为对照。显示了来自两次独立实验的通过光密度测定法定量的FLT3和STAT5的相对磷酸化作为平均值(±SEM)。FLT3磷酸化相对于GAPDH进行校正,STAT5磷酸化相对于总STAT5蛋白进行校正。
图12为显示了用选择性抑制FLT3-ITD细胞的化合物1离体处理原代AML细胞的图。将原代白血病母细胞从4名AML患者的外周血中分离。FLT3-ITD状态通过病理学报告测定并PCR通过确定。将原代细胞培养物用所示浓度的化合物1处理72小时,并在那时使用MTS测试评估活力。将所有值相对于在不存在药物时孵育的细胞的活力进行校正。
图13为在细胞生长测试中显示了化合物1对急性髓性白血病(AML)-来源的KG1细胞的作用的图。
图14为在细胞生长测试中,与wtFGFR2SNU1细胞相比,显示了化合物1对具有扩增的FGFR2的SNU16胃癌细胞的作用的图。
图15为在软琼脂集落形成分析中显示了化合物1对SNU16胃癌细胞的作用的图。
图16为在细胞生长测试中,与wtFGFR2Hec1B细胞相比,显示了化合物1对具有突变株FGFR2(N549K)的AN3CA子宫内膜癌细胞的作用的图。
图17为在细胞生长测试中,与wtFGFR3RT112细胞相比,显示了化合物1对表达突变株FGFR3b(Y375C)的MGH-U3细胞的作用的图。
图18为在细胞生长测试中,与wtFGFR3NCI-H929细胞相比,显示了化合物1对携带t(4;14)易位并表达突变株FGFR3(K650E)的OPM2多发性骨髓瘤(“MM”)细胞的作用的图。
图19为显示了在细胞生长测试中化合物1对表达突变株FGFR4(Y367C)的MDA-MB-453乳腺癌细胞的作用的图。
图20为在具有FGFR2-驱使的AN3CA子宫内膜癌细胞异种模型中显示了口服给药化合物1对肿瘤生长的作用的图。
图21为在具有AN3CA子宫内膜癌细胞的异种模型中显示了口服给药化合物1的体内药效学和药代动力学的图。
图22为显示了经化合物1处理的具有子宫内膜癌细胞系(AN3CA和MFE-296)和野生型FGFR2细胞系(Hec-1-B和RL95-2)的细胞生长测试的结果的图。
图23为在AN3CA子宫内膜肿瘤异种移植物中显示了口服给药化合物1对肿瘤生长的作用的图。
图24A和24B为在细胞生长测试中显示了化合物1与ridaforolimus组合对FGFR2-突变的子宫内膜癌细胞的作用的图。图24A显示了具有AN3CA子宫内膜癌细胞系的细胞生长测试的结果。用于处理AN3CA细胞的1×EC50浓度对于化合物1为30nM,对于ridaforolimus为0.4nM。图24B显示了具有MFE-296子宫内膜癌细胞系的细胞生长测试的结果。用于处理MFE-296细胞的1×EC50浓度对于化合物1为100nM,对于ridaforolimus为1nM。显示了ridaforolimus单独(“Ridaforolimus”)、化合物1单独(“化合物1”),以及化合物1与ridaforolimus组合(“组合”)的数据。
图25A和25B为显示了化合物1与ridaforolimus组合的中值作用分析的图。显示了AN3CA细胞系(图25A)和MFE-296细胞系(图25B)的数据。
图26为在AN3CA细胞系中经过处理后显示的细胞周期分析的图。显示了未处理细胞(“未治疗”)或用ridaforolimus单独、化合物1单独或化合物1与ridaforolimus组合治疗的细胞的数据。
图27为显示了可能的FGFR2/MAPK途径和mTOR途径的示意图(改编自Katoh M.,J.Invest.Dermato1.,2009,128:1861-1867)。
图28A和28B为在AN3CA子宫内膜肿瘤异种移植物中显示了口服给药化合物1与ridaforolimus的作用的图。图28A显示了10mg/kg的化合物1与ridaforolimus的低剂量组合的数据。图28B显示了30mg/kg的化合物1与ridaforolimus的高剂量组合的数据。显示了ridaforolimus单独(“Rid”)、化合物1单独(“化合物1”),以及化合物1与ridaforolimus组合(“化合物1、Rid”)的数据。括号内提供剂量,单位为mg/kg。
图29显示了口服给药ridaforolimus单独、化合物1单独,以及化合物1与ridaforolimus组合的药代动力学和药效学数据。显示了多种浓度的ridaforolimus(“Rid”)和化合物1(“化合物1”)的数据。
发明详述
本发明提供治疗癌症的方法,包括给药化合物1。癌症的非限制性实例包括终成实体瘤的那些癌症,例如急性髓性白血病、胃癌或胃肠癌、子宫内膜癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤或乳腺癌。癌症的其它实例包括髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病或骨髓增生异常综合征(例如,顽固性贫血伴原始细胞增多1型(RAEBI)或顽固性贫血伴原始细胞增多2型(RAEBII))。
除了上述癌症,本发明的方法和组合物可用于治疗以下类型的癌症,以及其它类型的癌症:皮肤癌(例如,鳞状细胞癌、基底细胞癌或黑色素瘤)、前列腺癌、脑癌和神经系统癌、头颈癌、睾丸癌、肺癌、肝癌(例如,肝细胞瘤)、肾癌、骨癌、内分泌系统癌(例如,甲状腺癌和垂体瘤),以及淋巴系统癌(例如,霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)。可使用本发明的方法治疗的其它类型的癌症包括纤维肉瘤、神经外胚叶瘤(neurectodermal tumor)、间皮瘤、表皮样癌和卡波西肉瘤。
已经发现化合物1具有强效抗血管生成性质,因此,可用于治疗与异常血管生成有关的病症,包括实体癌(例如,前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌和胶质母细胞瘤)、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、肥胖症、黄斑变性和心血管疾病。
尤其是,化合物1为pan-BCR-ABL抑制剂。通过伊马替尼抑制致癌的BCR-ABL酪氨酸激酶在许多慢性期的慢性髓性白血病(CML)患者中产生了持续的响应,虽然在进展的CML和Ph+急性成淋巴细胞性白血病常见复发。伊马替尼耐药通常归因于BCR-ABL激酶区域突变株,同时二线BCR-ABL抑制剂尼罗替尼和达沙替尼为这些患者提供了备选治疗。然而,ABL激酶抑制剂治疗结果选择的BCR-ABLT315I突变株的交叉耐药和多耐药复合突变株仍然是临床关注的问题。在此,申请人公开了化合物1(BCR-ABLT315I和其它耐药突变株的在体外和体内的有效抑制剂)的评价。发现化合物1抑制无活性形式的BCR-ABLT315I。在基于细胞的诱发突变筛选中,化合物1在某些浓度完全抑制耐药,包括T315I突变株。口服给药pan-BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂(例如化合物1)的可用性在一线能力中提供了重要的治疗优势,其通过治疗期间最小化基于BCR-ABL激酶区域突变株的耐药的出现。
另外,申请人已经发现mTOR与化合物1组合比雷帕霉素大环内酯单一治疗或化合物1单一治疗更加有效地治疗病理性细胞增殖、抑制血管生成,并增加癌细胞的凋亡。可使用本发明的组合物、方法或试剂盒治疗的癌症的非限制性实例包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、头颈癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌或皮肤癌;鳞状细胞癌;子宫内膜癌;多发性骨髓瘤;淋巴系统的造血系统肿瘤(例如,白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤或伯基特淋巴瘤);骨髓系统的造血系统肿瘤(例如,急性髓性白血病、慢性髓性白血病、多发性髓性白血病、骨髓增生异常综合征或前髓细胞性白血病);间质起源的肿瘤(例如,纤维肉瘤或横纹肌肉瘤);中枢或外周神经系统的肿瘤(例如,星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤或神经鞘瘤);黑色素瘤;精原细胞瘤;畸胎癌;骨肉瘤;或卡波西肉瘤。可使用本发明的组合物、方法或试剂盒治疗的与异常血管生成有关的病症的非限制性实例包括实体瘤(例如,前列腺癌、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌或胶质母细胞瘤)、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、肥胖症、黄斑变性和心血管疾病。
化合物1的合成和制剂
化合物1可根据方案1所述和根据PCT公开WO 2007/075869所述进行合成。或者,步骤中使用的酰氯可用方案2(其描述了步骤5的改进)中描述的甲酯替换。
方案1
方案2
化合物1的单盐酸盐用于进行临床试验,取代了明显水溶性更低的游离碱。发现所述单-HCl盐为结晶性、无水固体,由大范围的可重现的溶剂形成。化合物1的盐酸盐在无缓冲的水中在pH 3.7具有1.7mg/mL的热力学溶解度。
化合物1的其它鉴定信息包括:
化学名:3-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-基乙炔基)-4-甲基-N-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺,盐酸盐;
USAN名:ponatinib(INN待定);
CAS登记号:1114544-31-8(HCl盐)和943319-70-8(游离碱);
CAS索引名:苯甲酰胺,3-(2-咪唑并[1,2-b]哒嗪-3-基乙炔基)-4-甲基-N-[4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基]-盐酸盐(1∶1);
分子式:C29H28C1F3N6O(HCl盐)和C29H27F3N6O(游离碱)(无手性中心);且
分子量:569.02g/mol(HCl盐)和532.56g/mol(游离碱)。
化合物1或优选其药学上可接受的盐(例如单HCl盐),可配制用于口服给药,利用任一有用于该目的的材料和方法。适于口服给药的包含化合物1的药学上可接受的组合物可以使用常规材料和方法(其中多种是公知的)进行配制。虽然所述组合物可为溶液、悬浮液或乳剂形式,但是固体剂型(例如胶囊、片剂、明胶胶囊、囊片等)是当前最感兴趣的。本领域已知用于制备制剂(包括前述的单位剂型)的方法可见于例如“Remington:The Science andPractice of Pharmacy”(20th ed.,ed.A.R.Gennaro,2000,Lippincott Williams &Wilkins)。化合物1可纯净地提供于胶囊中或与一种或多种任选的药学上可接受的赋形剂(例如填充剂、粘合剂、稳定剂、防腐剂、助流剂、崩解剂、着色剂、薄膜包衣等,如下所述)组合。
例如,制备白色不透明胶囊,其包含标示量的2mg化合物1游离碱,以盐酸盐提供,不含赋形剂。还可制备白色不透明胶囊,其包含5mg、15mg或20mg的化合物1游离碱,以盐酸盐提供,与常规赋形剂混合。在有关例示性胶囊混合物中,无活性成份用作赋形剂,其包括一种或多种填充剂、流动增强剂(flow enhancer)、润滑剂和崩解剂。例如,为5、15和20mg胶囊制备了胶囊混合物,其包含化合物1HCl盐加胶体二氧化硅(约0.3%w/w,流动增强剂)、无水乳糖(约44.6%w/w,填充剂)、硬脂酸镁(约0.5%w/w,润滑剂)、微晶纤维素(约44.6%w/w,填充剂),和淀粉羟乙酸钠(约5%w/w,崩解剂)。胶囊壳包含明胶和二氧化钛。
制剂工艺使用常规混合和包封工艺和机械装置。将化合物1的盐酸盐和所有混合赋形剂(除了硬脂酸镁)在V-搅拌器中混合并经筛磨粉碎。加入硬脂酸镁并再次混合所述原料。对V-搅拌器取样以确定混合均一性。测试了所述混合物的堆密度、振实密度、流动性和粒度分布。然后将所述混合物装入“3”号、“4”号或“1”号胶囊壳,取决于所述单位剂型的规格。
化合物1还配制为片剂,使用常规药学赋形剂进行,在混合物中包括一种或多种填充剂或填充剂的混合物、崩解剂、助流剂、润滑剂、薄膜包衣,和包衣溶剂,与较高规格胶囊中所用的相似。例如,可以使用以下相对量和比例(重量/重量)制备片剂:化合物1(90g,以HCl盐提供,15.0%w/w)、胶体二氧化硅(1.2g,0.2%w/w)、乳糖单水合物(240.9g,40.15%w/w)、硬脂酸镁(3g,0.5%w/w)、微晶纤维素(240.9g,40.15%w/w)和淀粉羟乙酸钠(24g,4.0%w/w),其中乳糖单水合物的量根据所用药物的量调节。
化合物1和赋形剂可以使用相同种类的机械装置混合,并根据胶囊的情况下所用操作进行操作。然后可以通过常规方式将所得的均匀混合物压制成片剂,例如调节目标片剂重量的旋转压片机,例如45mg片剂的300mg或15mg片剂的100mg;平均硬度为例如,45mg片剂的13kp和15mg片剂的3kp;且脆碎度不超过1%。如此制得的片芯可用常规薄膜包衣材料(例如,欧巴代II白色的水性悬浮液)喷雾,得到例如约2.5%重量增加(相对于片芯重量)。
mTOR抑制剂
雷帕霉素(通常已知为mTOR)的哺乳动物靶点为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(其调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动、细胞存活、蛋白合成和转录)。mTOR抑制剂(包括雷帕霉素及其类似物)为一类治疗剂,其特异地抑制来自mTOR或来自激酶(包括mTOR)的组合的信号传导(例如,该药物用作PI3K和mTOR二者的抑制剂)。mTOR为多种促有丝分裂信号传导途径中的关键媒介物(intermediary)并在正常组织和肿瘤形成过程中的增殖和血管生成的调节中起重要作用。存在两类mTOR抑制化合物:雷帕霉素大环内酯和非雷帕霉素类似物。
雷帕霉素(西罗莫司)为免疫抑制的内酰胺大环内酯,其由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生。见例如,J.B.McAlpine等人,J.Antibiotics,1991,44:688;S.L.Schreiber等人,J.Am.Chem.Soc.,1991,113:7433;和美国专利3,929,992,在此引入作为参考。
由于存在不止一种可接受的编号雷帕霉素及其类似物的原子的约定,本文所用的编号约定如下所示:
作为参考,许多化合物的R基团如下表中所示:
化合物 | -R |
雷帕霉素 | -OH |
AP23573 | -OP(O)(Me)2 |
坦罗莫司 | -OC(O)C(CH3)(CH2OH)2 |
依维莫司 | -OCH2CH2OH |
Biolimus | -OCH2CH2OEt |
ABT-578 | -四唑 |
用于本发明组合治疗的优选的雷帕霉素大环内酯包括但不限于,雷帕霉素(西罗莫司或雷帕鸣(Wyeth))、坦罗莫司或CCI-779(Wyeth,见美国专利5,362,718和6,277,983,在此将其内容整体引入作为参考)、依维莫司或RAD001(Novartis)、ridaforolimus或AP23573(Ariad)、biolimus(Nobori),和佐他莫司或ABT 578(Abbott Labs.)。
坦罗莫司为雷帕霉素的可溶性酯前药,与3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸形成的雷帕霉素42-酯,其公开在美国专利5,362,718中。已经证明坦罗莫司在体外和体内模型二者中对肿瘤生长具有显著抑制作用。坦罗莫司显示出细胞生长抑制作用(与细胞毒性质不同),并且可延迟肿瘤进展或肿瘤复发的时间。如WO 00/240000中所述,CCI-779可用于治疗多种起源的癌症,包括肾癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、淋巴瘤和黑色素瘤。
依维莫司为40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素,其结构和合成公开在WO94/09010中。依维莫司,其已经证明为强效的免疫抑制剂(美国专利5,665,772),还显示出抗肿瘤性质的证据(见例如,A.Boulay等人,Cancer Res.,2004,64:252-261)。作为这些性质的结果,依维莫司目前在一些国家上市用作预防同种异体移植物排斥的免疫抑制剂(B.Nashan,Ther.Drug.Monit.,2002,24:53-58),并进行了作为抗癌药物的临床测试(S.Huang and P.J.Houghton,Curr.Opin.Invest.Drugs,2002,3:295-304;M.M.Mita等人,Clin.Breast Cancer,2003,4:126-137;和M.Hidalgo and E.J.Rowinsky,Oncogene,2000,19:6680-6686)。
佐他莫司为其43-表异构体,例如,如WO 99/15530所公开,或雷帕霉素类似物如WO 98/02441和WO 05/016252所公开。
Ridaforolimus为含磷的雷帕霉素衍生物(见WO 03/064383,其中实施例9)。如同坦罗莫司和依维莫司,已经在多种PTEN-缺陷的肿瘤细胞系中证明了ridaforolimus的抗增殖活性,所述肿瘤细胞系包括胶质母细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌(E.K.Rowinsky,Curr.Opin.Onco1.,2004,16:564-575)。Ridaforolimus已经被美国食品和药物管理局指定为快速通道(fast-track)产品,用于治疗软组织和骨肉瘤。已经在多项临床试验中测试了Ridaforolimus对恶性血液病(例如,白血病和淋巴瘤)和实体瘤(例如,肉瘤、前列腺癌和成胶质细胞瘤)的靶向作用。
许多雷帕霉素大环内酯是本领域已知的。可用于本发明的方法、试剂盒和组合物的雷帕霉素大环内酯包括雷帕霉素的42-去甲氧基衍生物及其多种类似物,例如在WO 2006/095185中所公开(其中该化合物根据它们的编号系统被提及为“39-去甲氧基”化合物)。雷帕霉素的衍生物在实践本发明时具有特别的意义。
此外,现在已经报道了大量的雷帕霉素的其它结构变型,典型地来自发酵产物和/或来自合成。例如,关于雷帕霉素的类似物、同源物(homolog)、衍生物和其它结构相关化合物(“rapalogs”)的大量文献包括具有一种或多种与雷帕霉素有关的以下修饰的雷帕霉素的变型:去甲基化、消除或替换C7、C42和/或C29的甲氧基;消除、衍生化或替换C13、C43和/或C28的羟基;还原、消除或衍生化C14、C24和/或C30的酮;用5-元的脯氨酰基环(prolylring)替换6-元的4-甲基-哌啶-2-甲酰基环(pipecolate ring);或者用取代的环戊基环取代环己基环或替换环己基环;C28羟基的差向异构化;以及用含磷环部分取代。
因此,mTOR抑制剂包括例如雷帕霉素的43-和/或28-酯、醚、碳酸酯、氨基甲酸酯等,包括以下专利公开的那些,将其全部引入作为参考:烷基酯(美国专利4,316,885);氨基烷基酯(美国专利4,650,803);氟代酯(美国专利5,100,883);酰胺酯(美国专利5,118,677);氨基甲酸酯(美国专利5,118,678);甲硅烷基酯(美国专利5,120,842);氨基二酯(美国专利5,162,333);磺酸酯和硫酸酯(美国专利5,177,203);酯(美国专利5,221,670);烷氧基酯(美国专利5,233,036);O-芳基、-烷基、-烯基和-炔基醚(美国专利5,258,389);碳酸酯(美国专利5,260,300);芳基羰基和烷氧基羰基氨基甲酸酯(美国专利5,262,423);氨基甲酸酯(美国专利5,302,584);羟基酯(美国专利5,362,718);受阻的酯(美国专利5,385,908);杂环酯(美国专利5,385,909);偕-二取代(gem-disubstituted)酯(美国专利5,385,910);氨基链烷酯(美国专利5,389,639);磷酰基氨基甲酸酯(美国专利5,391,730);氨基甲酸酯(美国专利5,411,967);氨基甲酸酯(美国专利5,434,260);脒基氨基甲酸酯(美国专利5,463,048);氨基甲酸酯(美国专利5,480,988);氨基甲酸酯(美国专利5,480,989);氨基甲酸酯(美国专利5,489,680);受阻的N-氧化物酯(美国专利5,491,231);生物素酯(美国专利5,504,091);O-烷基醚(美国专利5,665,772);以及雷帕霉素的PEG酯(美国专利5,780,462)。还包括还原产物,24-二氢-、30-二氢-和24,30-四氢-雷帕霉素类似物以及雷帕霉素或任一前述化合物的28-表类似物(见例如,WO01/14387),以及任一前述化合物的酯或醚和非-还原化合物的肟、腙和羟胺。见例如美国专利5,373,014、5,378,836、5,023,264、5,563,145和5,023,263。
非雷帕霉素类似物mTOR抑制化合物包括但不限于,LY294002、Pp242(Chemdea目录号CD0258)、WYE-354(Chemdea目录号CD0270)、Ku-0063794(Chemdea目录号CD0274)、XL765(Exelixis;J.Clin.Onco1.,2008,2008ASCOAnnual Meeting Proceedings 26:15S),AZD8055(Astrazeneca)、NVP-BEZ235(Sauveur-Michel等人,Mo1.Cancer Ther.,2008,7:1851)、OSI-027(OSIPharmaceuticals)、渥曼青霉素、槲皮素、杨梅苷、星状孢子素,和ATP竞争性抑制剂(见美国专利申请系列11/361,213和11/361,599,将其每篇在此整体引入作为参考)。
其它可用于本发明的方法、试剂盒和组合物的非雷帕霉素类似物mTOR抑制化合物包括以下PCT公布公开的那些:WO2009008992;WO2009007750;WO2009007751;WO2009007749;WO2009007748;WO2008032060;WO2008032036;WO2008032033;WO2008032089;WO2008032091;WO2008032064;WO2008032077;WO2008032041;WO2008023159;WO2008023180;WO2007135398;WO2007129044;WO2007080382;和WO2006090169,将其每篇在此引入作为参考。
药物组合物
mTOR抑制剂的制剂为本领域熟知,包括,例如,适于口服给药西罗莫司、坦罗莫司、ridaforolimus和依维莫司的固体剂型,以及静脉给药的坦罗莫司和ridaforolimus的其它组合物。非-大环内酯mTOR抑制剂的制剂公开在上述专利文件中。化合物1可以与mTOR抑制剂一起配制,但是更典型地将分别配制以避免使制剂工艺复杂和允许上述两种药物的给药和用药方案独立时间安排,并允许更方便的任一药物的后续剂量调整。
剂量和给药
根据本发明的方法、试剂盒和组合物,治疗可由单一剂量或经一段时间的多剂量组成。化合物1可单独或与所述mTOR抑制剂并行给药。或者,化合物1和所述mTOR抑制剂可依次给药。例如,化合物1可在给药所述mTOR抑制剂前后给药(例如,之前一天或多天和/或之后一天或多天)。
给药可以每天一次或多次、每周一次或多次(或在多天间隔后)或以间歇时间表,并且该周期重复给定(例如,2-10个周期)或不定的次数。
取决于给药途径,有效剂量可以根据待治疗受试者的体重、体表面积或器官大小进行计算。最优化的合适剂量可由本领域技术人员根据人的临床试验中观察到的药代动力学数据容易地确定。最终剂量用药法将由主治医师根据改变药物作用的各种因素确定,例如,所述药物的比活性,损伤的严重性和所述受试者的响应性,所述受试者的年龄、病症、体重、性别和饮食,任何存在的感染的严重性,给药时间,伴随治疗的使用(或不使用),以及其它临床因素。由于使用本发明的组合进行了研究,将得到关于合适的剂量水平和治疗持续期的其它信息。
在本发明的组合治疗中,化合物1典型地以每天口服10-500mg的总剂量的化合物1重复循环给药。mTOR抑制剂可在化合物1之前、之后或同时,以相同的或不同的给药时间表和通过相同的或不同的给药途径给予。该组合治疗中所述mTOR抑制剂的剂量水平通常为每周治疗10-800mg的范围,例如,在一些情况下为35-250mg/周。该总周剂量水平可使用多种给药途径和给药时间表达成。所述给药时间表可间断。“间断”给药是指在各给药之间提供间歇期的给药时间表,例如每第二天给药,每第三天给药,或更普遍地,时间表在给药期间之间包含一天或多天或一周或多周的“假期”。此类间断给药的非限制性实例包括每周给药少于7天以及以下给药周期:一周QDx4、QDx5、QDx6或每天给药,接着无药物期间(例如,1、2或3周),然后继续1周的药物治疗,然后1周(或多周)无药物治疗,以此类推。为了进一步例示,隔周60mg QDx6的给药提供了在间断基础(即,每下一周)上的360mg的药物的周剂量。
例如,在口服给药的情况下,2-160mg的药物可以每周一天或多天给予,例如每天(QDx7)、每周6天(QDx6)、每周5天(QDx5)等等。因此,依维莫司可以QDx7以3-20mg/天的剂量给药,例如,5mg或10mg。Ridaforolimus可以QDx7以10-25mg/天的剂量口服给药,例如,10、12.5或15mg/天;或西罗莫司QDx7以2或4mg口服,在一些情况下具有6、8或10mg的负荷剂量。所述给药时间表可间断,如QDx4、QDx5和QDx6时间表所例示。实例包括以30-100mg QDx5或QDx6口服给药mTOR抑制剂。例如,在本发明的实践中,ridaforolimus、依维莫司、坦罗莫司或西罗莫司以10-50mg QDx5的水平口服给药。对于某些适应症,可能期望以30-50mg QDx5的口服剂量给药ridaforolimus。
暴露于mTOR抑制剂的所需整体水平也可通过肠胃外递送的各种时间表达成。在该情况下,给药10-250mg的mTOR抑制剂,例如,通过静脉输注共15-60分钟,通常30-60分钟,每1-4周时间一次或多次。在一种该方法中,所述mTOR抑制剂在30-60分钟静脉输注给药,每周一次,每4周时间进行3或4周。该静脉递送在ridaforolimus、西罗莫司和坦罗莫司的情况下具有特别的意义,其可提供为,例如,每周10-250mg的剂量,例如,25、50、75、100、150、200或250mg/周,每4周时间进行3或4周。50和75mg的剂量水平具有特别的意义。在另一种方法中,所述mTOR抑制剂通过静脉输注5-25mg的药物给药,每2周QDx5(例如,周一至周五静脉输注,每2周)。10、12.5、15、17.5和20mg的剂量具有特别的意义。
感兴趣的是所述mTOR抑制剂在单一治疗(以本文所述的与化合物1的组合治疗的部分给药)中已经批准或处于研究中的剂量水平和给药时间表。
还感兴趣的是组合治疗,其中剂量水平和/或给药时间表得到mTOR抑制剂和/或化合物1将给予所述受试者的低剂量(即,低于单一治疗的剂量)。
适应症
本发明的方法、试剂盒和组合物可用于治疗与病理性细胞增殖有关的疾病,例如新生瘤、癌症,和与病理性血管生成有关的病症。可使用本发明的组合物、方法或试剂盒治疗的与异常血管生成有关的病症的非限制性实例包括实体瘤、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、肥胖症,和黄斑变性。
本发明的方法、试剂盒和组合物可用于治疗原发性和/或转移性癌症,和其它癌性病症。例如,本发明的组合物和方法应有用于减小实体瘤的尺寸、抑制肿瘤生长或转移、治疗各种淋巴性癌症,和/或延长患有这些疾病的哺乳动物(包括人)的存活时间。
与BCR-ABL表达细胞的增殖有关的病症的具体实例包括癌症,如本文所述的任一癌症。其它癌症包括慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病,和急性髓性白血病。
FLT-3突变株表达细胞的增殖有关的病症的具体实例包括癌症和与癌症有关的病症,例如本文所述的任一癌症。FLT3中的激活突变是急性髓性白血病(AML)中最常见的遗传改变类型。这些突变株中绝大多数源自受体的近膜区域中的内部串联重复(ITD)。也发生激酶活化环中的激活点突变,但不常见。已经发现当使用标准治疗时,FLT3-ITD突变株与AML患者的较差预后有关,体现在复发和总体存活率二者。其它病症包括骨髓增生异常综合征(MDS),例如顽固性贫血、顽固性贫血伴原始细胞增多型(RAEB)(例如,具有5-9%原始细胞的RAEBI和具有10-19%原始细胞的RAEBII),顽固性贫血伴环形铁粒幼红细胞型,慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML),和非典型慢性髓性白血病(a-CML)。
病症的其它实例包括与FGFR1、PDGFRα、和KIT有关的病症。在罕见的骨髓增生型新生瘤(MPNs)的亚组中发现了影响FGFR1和PDGFRα的活性的易位。包括FGFR1基因和一些其它染色体配偶体(chromosome partner)(例如FGFR1OP2基因)的易位为8p11骨髓增生综合征(EMS)的特征,其为绝大多数患者最终和快速进展为AML的疾病。在大约10-20%的慢性嗜酸性白血病/特发性嗜伊红细胞增多症(CEL/HEL)患者中发现FIP1L1-PDGFRα融合蛋白,并且已经报道了这些患者对PDGFR抑制响应良好。另外,PDGFRα的T674I突变株在类似于BCR-ABL的T315I门控残基(gatekeeper reside)的位置突变。KIT(例如,cKIT或N822K)中的激活突变株也发现于AML中。KIT突变株较不常见并且在AML的特殊细胞遗传亚组中发现,总频率为2-8%。
病症的其它实例包括癌细胞(例如导致实体瘤的癌细胞)增殖有关的那些病症。示例性实体瘤包括胃癌或胃肠癌、子宫内膜癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌,和成胶质细胞瘤。
癌症和可以治疗的癌症病症的实例包括,但不限于,脑和中枢神经系统的肿瘤(例如,脑膜瘤、脑瘤、脊髓瘤、颅神经瘤,和CNS其它部分的肿瘤,例如成胶质细胞瘤或髓质胚细胞瘤);头和/或颈癌;乳腺肿瘤;循环系统的肿瘤(例如,心脏肿瘤、纵隔和胸膜肿瘤和其它胸内器官肿瘤、血管肿瘤,和与血管组织有关的肿瘤);血液和淋巴系统的肿瘤(例如,霍奇金病、非霍奇金病淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS有关的淋巴瘤、恶性免疫增生疾病、多发性骨髓瘤、恶性血浆细胞新生瘤、淋巴性白血病、髓性白血病、急性或慢性淋巴细胞性白血病、单核细胞性白血病、具体细胞类型的其它白血病、未指定细胞类型的白血病、未指定的淋巴、造血和相关组织的恶性新生瘤,例如弥散的大细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤或皮肤的T-细胞淋巴瘤);排泄系统的肿瘤(例如,肾癌、肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌,和它泌尿器官癌);胃肠道的肿瘤(例如,食道癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠乙状结肠连接部的肿瘤、直肠癌、肛门癌,和肛管癌);涉及肝脏和肝内胆管、胆囊,和胆道的其它部分、胰腺,和其它消化器官的肿瘤;口腔的肿瘤(例如,唇癌、舌癌、牙龈癌、口底部癌、上腭癌、腮腺癌、唾液腺癌、扁桃腺癌、口咽癌、鼻咽癌、梨状隐窝癌、下咽癌,和口腔的其它部位的肿瘤);生殖系统的肿瘤(例如,外阴癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌,和与女性生殖器官有关的其它部位的肿瘤、胎盘癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌,和与男性生殖器官有关的其它部位的肿瘤);呼吸道的肿瘤(例如,鼻腔癌、中耳癌、副鼻窦癌、喉癌、气管癌、支气管癌,和肺癌,例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌);骨骼系统的肿瘤(例如,四肢的骨骼和关节软骨的肿瘤、骨关节软骨的肿瘤,和其它部位的肿瘤);皮肤的肿瘤(例如,皮肤的恶性黑色素瘤、非-黑色素瘤皮肤癌、皮肤的基底细胞癌、皮肤的鳞状细胞癌、间皮瘤,和卡波西肉瘤);和涉及其它组织的肿瘤,其它组织包括外周神经和自主神经系统、结缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼和附属器官、甲状腺、肾上腺,和其它内分泌腺和相关结构、淋巴结的继发性和未指定的恶性新生瘤、呼吸和消化系统的继发性恶性新生瘤以及其它部位的继发性恶性新生瘤。
更具体地,本发明的试剂盒、组合物和方法可用于治疗肉瘤。在一些实施方式中,本发明的组合物和方法用于治疗膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴瘤白血病、头颈癌、子宫内膜癌、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌,和前列腺癌。
可有利地使用本发明的组合物和方法治疗的肿瘤包括PTEN-缺陷的肿瘤(见例如,M.S.Neshat等人,PNAS,2001,98:10314-10319;K.Podsypanina等人,PNAS,2001,98:101320-10325;G.B.Mills等人,PNAS,2001,98:10031-10033;和M.Hidalgo和E.K.Rowinski,Oncogene,2000,19:6680-6686)。如上所述,FRAP/mTOR激酶位于磷脂酰肌醇3-激酶/Akt-信号传导途径的下游,其在多种癌症中被上调,因为失去了PTEN肿瘤抑制基因。可以使用基因型分析和/或体外培养以及活组织检查肿瘤样本的研究鉴定PTEN-缺陷的肿瘤。涉及磷脂酰肌醇3激酶/Akt-mTOR途径异常的癌症的非限制性实例包括,但不限于,胶质瘤、淋巴瘤和肺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌或子宫颈癌,其与异常的生长因子受体(例如,EGFR、PDGFR、IGF-R和IL-2)有关;与P13激酶异常有关的卵巢肿瘤;黑色素瘤和乳腺癌、前列腺癌或子宫内膜癌,其与PTEN的异常有关;乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌,和前列腺癌,其与Akt的异常有关;淋巴瘤、乳腺癌或膀胱癌,和头颈癌,其与elF-4E的异常有关;套细胞淋巴瘤、乳腺癌,和头颈癌,其与Cyclin D的异常有关;以及家族性黑色素瘤和胰腺癌,其与P16的异常有关。
本发明的试剂盒、组合物和方法还可用于治疗与异常血管生成有关的疾病,例如糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、肥胖症、黄斑变性,和心血管疾病。
药用试剂盒
多种其它包装选择可用于实践本发明。本发明的药用试剂盒包括一种或多种容器(例如,小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶),其包含一种或多种药物组合物的成分,所述药物组合物包含化合物1和/或mTOR抑制剂,使得可以单独给药化合物1或一起或并行给药mTOR抑制剂与化合物1。所述试剂盒任选包括剂量、给药,和/或待治疗患者群体的说明书。
药用包装的不同成分可以以固体(例如,冻干的)或液体形式提供。各成分将通常适合作为各自容器中的等分部分或提供为浓缩的形式。药物包装或试剂盒可包括重构冻干成分的培养基。所述试剂盒的各个容器将优选保持在商业销售的紧密密封中。
或者,化合物1和mTOR抑制剂均配制为口服给药(例如,包含以用于口服递送的单位剂型的化合物1和同样以用于口服递送的单位剂型的ridaforolimus、西罗莫司或依维莫司的试剂盒)。配制口服给药的产品(例如,胶囊、片剂等)可包装在泡罩包装中,其可根据所选给药时间表进行设计和/或标记。
提供以下实施例以便为本领域技术人员提供如何进行、制备和评估请求保护的方法和化合物的完整公开和说明,旨在仅仅例示本发明而非限制发明人认为的发明的范围。
实施例1:慢性髓性白血病的BCR-ABL和突变株的抑制
实验操作
抑制剂:将伊马替尼溶于PBS得到10.0mM储备溶液,分配为10μL等分部分,并保存在-20℃。将化合物1、尼罗替尼和达沙替尼溶于DMSO得到10.0mM储备溶液,分配为10μL等分部分,并保存在-20℃。即将用于各实验前,对10.0mM储备溶液进行系列稀释。化合物1(3-(咪唑并[1,2b]哒嗪-3-基乙炔基)-4-甲基-N-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺)可根据本文所述制备。
ABLT315I:化合物1复合体的结晶和结构测定:在大肠杆菌中将鼠类ABLT315I(残基229-515)的激酶区域与YopH蛋白酪氨酸磷酸酶共同表达,并根据先前报道(Ref)进行纯化。在化合物1的存在下使用金属亲和性、Mono Q和尺寸排阻色谱法柱的组合将ABLT315I纯化至几乎同质(>95%)。最终纯化的与化合物1结合的ABLT315I的典型产率为大约1mg/L。通过混合等体积的化合物1:ABLT315I复合体(25mg/mL)和孔溶液(well solution)(30%w/v聚乙烯4000、0.2M乙酸钠、0.1M Tris-HCl,pH 8.5),利用在4℃的悬滴汽相扩散法(hanging drop vapor diffusion method)生长ABLT315I和化合物1的共结晶。1-2天后,结晶达到50×50×300μm3的尺寸,并在补充30%v/v甘油作为冷冻保护剂的母液中采集。在100K在光束线19BM(Advanced PhotonService,Argonne,IL)收集X射线衍射数据。将数据指标化并使用HKL2000软件包定标为空间群P21。使用与伊马替尼结合的天然ABL(PDB号:1IEP)的结构,通过AMoRe分子置换确定化合物1与ABLT315I复合体的结构。在不对称单元中存在两个ABLT315I分子。在Quanta(Accelrys Inc.,San Diego,CA)中用CNX结合手动重建精修所述结构,且几次精修和建模循环后,化合物1逐渐汇集。进行进一步精修和建模直至达到会聚(convergence)。精修至的最终模型由残基228至511组成(除了活化环中的386-397),其为混乱的。结合抑制剂化合物1以及I315的侧链的电子密度在两个复合体中良好分辨,使得抑制剂的结合模式清晰。
ABLT315I的自磷酸化测试:在伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼或化合物1的存在下进行了具有全长酪氨酸-去磷酸化的ABL和ABLT315I(Invitrogen;San Diego,CA)的激酶自磷酸化测试,如之前所述(O’Hare等人,Blood104:2532(2004))。所用抑制剂的浓度为:0、0.1、1、10、100、1000nM。
细胞系:在37℃和5%CO2中,Ba/F3转染子(表达全长、天然BCR-ABL或具有单个激酶区域突变株的BCR-ABL)在补充有10%FCS、1单位/mL青霉素G,和1mg/mL链霉素的RPMI 1640(完全培养基)中维持。表达BCR-ABLT315A的Ba/F3细胞系获赠于Neil Shah博士(UCSF)。亲代Ba/F3细胞补充有由WEHI-条件培养基提供的IL-3。细胞增殖测试之前,将RNA从各Ba/F3细胞系中分离,且通过RT-PCR然后使用Mutation Surveyor软件(SoftGenetics,State College,PA)的DNA序列分析确定激酶区域突变株。
细胞增殖测试:将Ba/F3细胞系分配于96-孔板(4×103细胞/孔)中,并与浓度渐增的化合物1孵育72小时。用于在表达天然或突变BCR-ABL的细胞系中进行IC50测定的抑制剂浓度为:0、0.04、0.2、1、5、25、125,和625nM。用于在亲代Ba/F3细胞中进行IC50测定的抑制剂浓度为:0、1、5、25、125、625、3125,和10,000nM。使用基于甲烷硫代磺酸(MTS)的活力测试(Cell Titer 96Aqueous One Solution Reagent;Promega,Madison,WI)测量增殖。IC50值报道为一式四份进行的三次独立实验的平均值。对于使用CML或正常原代细胞的细胞增殖实验,将单核细胞在Ficoll梯度(GEHealthcare)上从CML髓性原始细胞危象(M-BC)患者或健康个体的外周血中分离。将细胞接种在96-孔板(5×104细胞/孔)中,其中含有在补充10%FBS、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素,和100μMβ-巯基乙醇的RPMI中的分级浓度的化合物1(0-1000nM)。孵育72小时后,通过将细胞进行MTS测试评估细胞活力。将所有值根据不含药物的对照孔进行标准化。
Ba/F3细胞系中的CrkL磷酸化:在不存在抑制剂或在伊马替尼(2000nM)、达沙替尼(50nM)、尼罗替尼(500nM)或化合物1(0.1-1000nM)的存在下,将表达天然BCR-ABL或BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞(5×106/孔)在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺,和青霉素/链霉素的RPMI中培养4小时。将细胞直接溶解在煮沸的补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的SDS-PAGE加样缓冲液中。将溶胞产物进行SDS-PAGE,并用抗-CrkL抗体C-20(Santa Cruz)进行免疫印迹。磷酸化的和非磷酸化的CrkL基于不同带迁移而区别,且带信号强度通过光密度测定法在Lumi Imager(Roche)上进行定量,表示为%磷酸化的CrkL。
BCR-ABLT315I患者样品离体暴露于化合物1:获得知情同意后,通过Ficoll离心从淋巴性原始细胞危象(CML L-BC)的具有BCR-ABLT315I突变株的CML患者中分离外周血单核细胞。RT-PCR和测序分析证明样品主要包含BCR-ABLT315I突变株。在不存在抑制剂或在伊马替尼(1000nM)、达沙替尼(50nM)、尼罗替尼(200nM)或化合物1(50nM,500nM)的存在下,将单核细胞(5×106细胞/孔)在无血清的补充有20%BIT(StemCell)、40μg/mL人低密度脂蛋白和100μMβ-巯基乙醇的IMDM培养基(Invitrogen)中培养过夜。将细胞直接溶解在煮沸的补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的SDS-PAGE加样缓冲液中。将溶胞产物进行SDS-PAGE,并用抗-CrkL抗体C-20(Santa Cruz)进行免疫印迹。磷酸化的和非磷酸化的CrkL基于不同带迁移而区别。带信号强度通过光密度测定法在Lumi Imager(Roche)上进行定量。
总体酪氨酸磷酸化(FACS):在不存在抑制剂或在伊马替尼(1000nM)、达沙替尼(50nM)、尼罗替尼(200nM)或分级浓度的化合物1(50,500nM)的存在下,将单核细胞(2×105)在无血清的培养基中培养过夜。根据生产商的说明书(Caltag;San Diego,CA)将细胞固定并渗透化处理,用2μg的抗-磷酸酪氨酸4G10-FITC抗体(BD Biosciences,San Jose,CA)孵育1小时,用补充有1%BSA和0.1%叠氮化钠的PBS洗涤两次,并固定在1%甲醛中。在FACSAria仪器(BD)上分析FITC信号强度,并计算平均荧光强度(MFI)。值报道为相对于未染色对照的MFI增加倍数。
原代CML细胞和正常骨髓的造血集落形成分析:为了评估化合物1对抗带有BCR-ABLT315I的原代CML细胞和正常造血祖细胞的作用,将通过Ficoll密度离心分离的骨髓单核细胞用分级浓度的化合物1(CML患者:0、10、25、50nM;健康个体:0、100、200、500、1000nM)培养。以一式三份将细胞接种(5×104细胞/板)在1mL的IMDM:甲基纤维素培养基(1∶9v/v)中,其包含50ng/mL SCF、10ng/mL GM-CSF,和10ng/mL IL-3(MethocultGF H4534;Stem Cell Technologies,Vancouver,British Columbia,Canada),评估粒细胞/巨噬细胞集落形成(CFU-GM)。将细胞在37℃在加湿培养箱中培养14-18天。计算集落,其中>50细胞/集落作为阳性集落评分的标准。结果报道为相对于未治疗对照的集落百分率±SEM。
药代动力学:通过口服强饲法单剂量给药后在CD-1雌性小鼠中评估化合物1的药代动力学概况(在柠檬酸盐缓冲液中,pH 2.74)。在各个时间点收集血样,并通过内标LC/MS/MS方法,使用蛋白沉淀和在空白小鼠血浆中制备的校正标准测定血浆中化合物1的浓度。浓度报道为来自3只小鼠/时间点/剂量组的平均值。
Ba/F3存活模型:表达天然BCR-ABL或BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞注射至雌性SCID小鼠的尾静脉(100μL的在无血清培养基中的1×107细胞/mL悬浮液)。开始72小时后,将小鼠通过口服强饲法用载剂(25mM柠檬酸盐缓冲液,pH 2.75)、化合物1或达沙替尼每天一次处理,连续19天。根据IACUC指导方针当小鼠垂死时将其处死,并与由于肿瘤细胞渗入导致的脾肿大而死亡的小鼠一致评估尸检小鼠。使用Kaplan-Meier方法分析存活数据,并使用时序检验(GraphPad PRISM),通过比较各治疗组与载剂组的存活时间评估统计学显著性。认为p<0.05具有统计学显著性,且p<0.01具有高度统计学显著性。
Ba/F3肿瘤模型:将表达BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞皮下植入雌性裸鼠的右侧腹(100μL的在无血清培养基中的1×107细胞/mL细胞悬浮液)。为了分析有效性,当平均肿瘤体积达到大约500mm3时将小鼠随机指定为不同的治疗组。将小鼠通过口服强饲法用载剂(25mM柠檬酸盐缓冲液,pH 2.75)或化合物1每天一次处理,连续19天。使用以下公式计算肿瘤体积(mm3):肿瘤体积=L×W2×0.5。为了测定治疗期结束时的肿瘤生长抑制,使用公式ΔV=(T最终-T开始)/T开始×100(其中T开始为治疗开始时的肿瘤体积且T最终为动物处死时的体积)计算所有动物的肿瘤体积百分变化。使用单侧ANOVA检验(GraphPad PRISM)将各治疗组的平均肿瘤体积变化与所有其它组比较,且使用Dunnett’s检验比较各治疗组与载剂治疗组小鼠的统计学显著性,其中认为p<0.05具有统计学显著性,且p<0.01具有高度统计学显著性。为了分析酪氨酸-磷酸化的BCR-ABL和CrkL水平,将带有肿瘤的动物(平均肿瘤尺寸:500mm3)通过口服强饲法用单剂量载剂或30mg/kg化合物1治疗。给药6小时后(N=3/组),处死动物并收集肿瘤样品用于蛋白印迹分析,所述分析具有对抗pBCR-ABL和eIF4E(Cell Signaling Technology)和总CrkL(C-20;Santa Cruz)的抗体。
用单剂化合物1进行加速的基于细胞的诱发突变筛选:将表达天然BCR-ABL的Ba/F3细胞用N-乙基-N-亚硝基脲(ENU;50μg/mL)处理过夜,沉淀,再悬浮于新鲜培养基中,并以1×105细胞/孔的密度分配至96-孔板,板中含有200μL补充有分级浓度的化合物1的完全培养基。通过在倒置显微镜下目测检查观察各孔中的细胞生长和培养基颜色变化,在28天的实验过程中每两天观察一次。将其中观察到细胞生长物的孔的内容物转移至包含2mL补充有与开始的96-孔板浓度相同的化合物1的完全培养基的24-孔板。如果在给定条件下所有孔同时观察到生长,则将24个代表性的孔扩展以进一步分析。在融合时,通过离心收集24-孔板中的细胞。BCR-ABL激酶区域使用DNEasy Tissue试剂盒(QIAGEN,Inc.,Valencia,CA)从细胞碎片中提取DNA。使用引物B2A (5’TTCAGAAGCTTCTCCCTGACAT 3’)和ABL4317R(5’AGCTCTCCTGGAGGTCCTC 3’)扩增,PCR产物通过商业承包商(Agencourt Bioscience Corporation,Beverly,MA)使用引物ABL3335F(5’ACCACGCTCCATTATCCAGCC 3’)和ABL4275R(5’CCTGCAGCAAGGTAGTCA 3’)双向测序,且使用Mutation Surveyor软件(SoftGenetics,State College,PA)分析色谱图的突变。该筛选的结果报道为来自三次独立实验的累积数据(见表2)。在单次独立实验中,根据上述也对单剂化合物1进行所述诱发突变筛选,起始于表达BCR-ABLT315I(见表3)或BCR-ABLE255V(见表4)的Ba/F3细胞。
结果
(1)化合物1与ABLT315I复合体的X射线结晶学分析。
近期X射线结晶学研究已经揭示了ABL突变株的激酶区域中的T315I突变作用为简单点突变,其防止伊马替尼、尼罗替尼,和达沙替尼与天然ABL的T315侧链形成氢键。化合物1结合的DFG-out模式和总蛋白接触网(network of protein contact)与伊马替尼的模式相似,除了至少一个重要区别:化合物1中的乙炔基连接基定位所述分子以避免其它抑制剂中可见的空间位阻(steric clash),并允许与I315产生范德华相互作用。
(2)化合物1抑制ABLT315I的催化活性。
我们在使用纯化的、去磷酸化的、全长天然ABL激酶和ABLT315I激酶蛋白生化测试中,通过比较伊马替尼、尼罗替尼和达沙替尼测试了化合物1的活性。虽然各个抑制剂减弱了天然ABL的酶活性,但是仅化合物1有效对抗ABLT315I突变株,如体外[γ-32P]-ATP自磷酸化全长ABLT315I激酶所测。观察到化合物1对其它测试的临床相关的伊马替尼-耐药ABL突变株具有相似的强效抑制,所述突变株包括ABLG250E、ABLY253F,和ABLE255K。这些结果确定了化合物1直接靶向天然的ABL激酶和激酶区域突变的ABL激酶,包括所述ABLT315I激酶突变株。
(3)化合物1抑制表达天然或突变BCR-ABL(包括BCR-ABLT315I)的Ba/F3细胞的生长。
细胞增殖测试使用亲代Ba/F3细胞和Ba/F3细胞(表达天然BCR-ABL或在激酶区域具有单一突变株(M244V、G250E、Q252H、Y253F、Y253H、E255K、E255V、T315A、T315I、F317L、F317V、M351T、F359V或H396P)的BCR-ABL)进行。化合物1强效地抑制了表达天然BCR-ABL的Ba/F3细胞的增殖(IC50:0.5nM)。需要注意,所有测试的BCR-ABL突变株保持对化合物1敏感(IC50:0.5-36nM;表1),包括所述BCR-ABLT315I突变株(IC50:11nM)。使用AnnexinV的染色显示通过化合物1抑制增殖与凋亡的诱导有关(数据未示出)。亲代Ba/F3细胞的生长抑制在化合物1浓度为1713nM时达到IC50,表明抑制作用与BCR-ABL抑制有关。
我们还测试了化合物1对抗一组患者来源的BCR-ABL-阳性和-阴性细胞系。虽然我们观察到对K562、KY01和LAMA细胞(源自原始细胞危象的CML患者)的强效生长抑制,然而其对三种不同的BCR-ABL-阴性白血病细胞系没有显著活性,其中IC50与Ba/F3亲代细胞相当或更大(表1)。
表1.细胞增殖测试中化合物1的IC50值。
(4)在表达BCR-ABLT315I的细胞中,化合物1抑制BCR-ABL-介导的信号传导。
为了确定在表达天然BCR-ABL或BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞中的靶向抑制,我们检查了BCR-ABL和直接的BCR-ABL底物CrkL的酪氨酸磷酸化状态(图1)。监测CrkL酪氨酸磷酸化状态提供了在原代人细胞中评估BCR-ABL激酶活性的便利方法,并且是在涉及新的BCR-ABL的CML临床试验中的优选药效学测试(Druker等人,N Engl J Med 344:1031(2001);Talpaz等人,N Engl J Med 354:2531(2006)),因为在原代细胞溶胞产物中由于蛋白水解不稳定性直接测量磷酸化的BCR-ABL酪氨酸磷酸化状态是不可行的。为了比较,包括了临床ABL抑制剂伊马替尼、尼罗替尼和达沙替尼。在CrkL凝胶位移分析中,酪氨酸-磷酸化的CrkL的百分率降低,其直接响应于BCR-ABL的抑制。虽然所有测试的抑制剂有效对抗表达天然BCR-ABL的Ba/F3细胞(图1A),但是仅化合物1证明了对抗T315I突变株的活性(图1B)。在表达天然BCR-ABL或BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞的平行实验中,观察到BCR-ABL磷酸化的抑制。BCR-ABL磷酸化在用伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼或化合物1处理过夜的表达天然BCR-ABL或BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞中进行评估。样品使用对抗pBCR-ABL和eIF4E(内参照)的抗体通过免疫印迹分析进行分析。
(5)用化合物1处理CML原代细胞抑制了细胞增殖。
为了评估化合物1对来自患有BCR-ABL-驱使的白血病患者的原代细胞的有效性,我们将来自CML髓性原始细胞危象患者或健康个体的单核细胞暴露于分级浓度的化合物1中,并在72小时后测试活细胞。与生化和细胞活力数据一致,化合物1诱导了的活细胞数量的选择性降低,且与正常细胞相比,其在原代CML细胞中的IC50值大约低500倍(图2A)。
(6)在原代CML细胞中,化合物1抑制BCR-ABLT315I激酶活性和集落形成,且对正常细胞毒性最低。
为了评估在将获自具有T315I突变株的CML淋巴性原始细胞危象患者的单核细胞离体暴露于化合物1后的靶向抑制,我们进行了类似于Ba/F3细胞系所述的测试,其中将细胞在抑制剂的存在下孵育过夜,采集和溶解,并通过免疫印迹分析CrkL磷酸化。暴露于化合物1产生磷酸化的CrkL信号的降低,而其它三种临床ABL抑制剂均未显示任何效果(图2B),而且在通过FACS分析来自该患者的细胞的总体酪氨酸磷酸化的过程中获得了相似的结果(图2C)。
我们还评估了化合物1在髓性集落形成分析中的有效性,该测试使用来自带有BCR-ABLT315I的CML加速期患者和健康个体的单核细胞。在抑制剂的存在下将细胞接种在甲基纤维素中,培养大约14-18天,并在倒置显微镜下计数。虽然尼罗替尼或达沙替尼均未显示任何对抗来自T315I患者的细胞的作用,但是化合物1以浓度依赖方式抑制了集落的形成(图3A)。不同的是,化合物1在低于500nM的浓度未对正常造血细胞显示出毒性(图3B),其与使用正常细胞进行的细胞增殖测试一致(图2A)。
(7)口服化合物1延长了患有BCR-ABLT315I-依赖性疾病的小鼠的存活并降低肿瘤负荷。
为了检查化合物1的体内药代动力学概况,通过口服强饲法向CD-1小鼠给药单剂量的化合物1(2.5或30mg/kg),并在给药后2、6和24小时通过LC/MS/MS测量化合物1的血浆浓度。化合物1可口服生物利用,且用2.5mg/kg剂量治疗的小鼠分别在2、6和24小时达到89.6、58.2和1.9nM的平均血浆浓度。在30mg/kg的升高剂量,平均血浆分别在2、6和24小时达到781.7、561.3和7.9nM。在2.5mg/kg(AUC0-24h:767nmo1·h/mL)至30mg/kg(AUC0-24h:7452nmo1·h/mL)剂量之间观察到剂量-暴露相称性(dose-exposureproportionality)。总之,这些数据证明了化合物1的血药浓度可用中等口服剂量维持几个小时,其中所述血药浓度超出所有测试的BCR-ABL突变株的体外IC50值。
我们接下来评估了化合物1在几种充分确立的CML小鼠模型中的体内活性。首先,在存活模型中检查了活性,其中将表达天然BCR-ABL的Ba/F3细胞静脉注射至小鼠的尾静脉。如图4A所示,与用载剂治疗的小鼠19天的存活中值相比,用化合物1或达沙替尼的治疗延长了存活。5-mg/kg达沙替尼的每天口服剂量(其已经报道为有效的用药方法(Lombardo等人,J MedChem 47:6658(2004)))将存活中值延长至27天(p<0.01)。相似地,2.5和5mg/kg化合物1的每天口服剂量将存活中值时间分别延长至27.5和30天(p<0.01,对于两个剂量水平)。
然后,在该相同存活模型中,使用表达BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞评估了化合物1的活性。与载剂治疗的小鼠(其具有16天的存活中值)相比,化合物1治疗(持续19天)以剂量依赖性方式延长了存活(图4B)。虽然每天口服给药2.5mg/kg化合物1使存活中值增加仅0.5天(p>0.05),但是在5、15和25mg/kg剂量的化合物1显著地将存活中值分别延长至19.5、26和30天(p<0.01,对于三个剂量水平)。不同的是,使用该T315I存活模型的独立平行研究证明用载剂或达沙替尼治疗的小鼠之间的存活中值没有区别(图5)。
在异种移植模型(其中将表达BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞皮下注射至小鼠)中进一步评估了化合物1的抗-肿瘤活性。与载剂治疗的小鼠相比,化合物1以剂量依赖性方式抑制了肿瘤生长(图4C),且在10和30mg/kg的每天口服剂量下显著抑制了肿瘤生长(%T/C=68%和20%;p<0.01,对于两个剂量水平)。每天口服给药50mg/kg化合物1产生了显著的肿瘤消退(%T/C=0.9%,p<0.01),且与开始治疗相比,在最终测量时平均肿瘤体积减小96%。为了确定靶向抑制,在用载剂或化合物1一次性给药6小时后采集的小鼠肿瘤中评估了磷酸化的BCR-ABLT315I和磷酸化的CrkL的浓度。如图4C所示,30mg/kg的单次口服剂量显著降低了磷酸化的BCR-ABL和磷酸化的CrkL的浓度。
(8)单剂化合物1足以完全抑制耐药亚克隆的生长物。
为了观察细胞增殖Ba/F3组中未探测到的容易发生耐药性的潜在位点,尤其化合物1特异的突变株(例如,在抑制剂-酶接触残基),并且为了评估化合物1是否比其它单剂抑制剂提供了优势,我们在自己确立的加速诱发突变测试中测试了该化合物,该测试已经在先前对伊马替尼、尼罗替尼和达沙替尼进行了验证。
在一组开始于表达天然BCR-ABL的Ba/F3细胞的实验中,我们在几个浓度的化合物1(5-40nM)建立了耐药性曲线,并发现在具有生长物的孔的百分率和观察到的突变株的范围二者出现剂量依赖性降低(图6A)。在5nM化合物1,所有孔(576/576)出现了生长物,且90%的测序代表性亚克隆表达天然BCR-ABL(表2)。将化合物1的浓度升高至10nM同时导致生长物的显著下降(168/1440孔;11.7%)和突变株亚克隆的频率升高(33.1%;表2)。回收的突变株包括在几个P-环残基(G250、Q252、Y253和E255),在或近C-螺旋(K285、E292和L298)的簇,和T315(T315I)、F317、V339、F359、L387和S438处出现的突变。在所述回收的突变株中,几乎所有突变株先前已经在伊马替尼耐药(或尼罗替尼或达沙替尼耐药)中遇到(在O’Hare等人,Blood110:2242(2007)综述)。未遇到对化合物1特异的新的突变株。位置Y253、T315和F317为接触残基,且K285靠近重要的氢键供体E286。
由于在完全抑制T315I的浓度仍存在的突变株更可能代表了对化合物1耐药的关键问题,我们继续研究了20nM化合物1,并发现生长物急剧减少(3/1440孔;0.2%;图6A,表2),且仅两种突变株E255V和T315I仍存在。因此,在我们的普查中,未鉴定出先前未发现的能够对化合物1赋予高水平耐药的突变株。在40nM化合物1(其比亲代BaF/3细胞的IC50低40倍以上)达到完全抑制体外耐药。耐药生长物的出现进一步在更高浓度的化合物1(80、160、320nM;数据未示出)得以确认。就我们所知,没有任何其它单剂BCR-ABL抑制剂显示出具有该能力。
表2.化合物1开始于天然BCR-ABL的基于细胞的诱发突变测试
(9)化合物1对复合突变株的作用。
由于化合物1治疗可能在伊马替尼和至少一种补救治疗(例如一种FDA批准的二线ABL激酶抑制剂)失效的情况下进行测试,因此预先存在T315I或其它耐药参照突变株是很有可能的。尽管至今为止不常见且仅在少数病例中记录,但是患者也可能对涉及继发性激酶区域突变株结合在相同等位基因预先存在的突变的化合物BCR-ABL突变株失效(Khorashad等人,Blood111:2378(2008);Shah等人,J Clin Invest 117:2562(2007);Stagno等人,LeukRes 32:673(2008))。已经在单一激酶区域突变的水平发现非常有限的耐药敏感性概况,我们希望研究化合物1产生复合突变株的易损性(vulnerability)。
为了模拟化合物1用于治疗具有显著的T315I亚克隆患者的情况,我们再次进行了加速诱发突变测试,这次开始于已有T315I突变株的背景下(图8B和表3)。我们发现仍然存在浓度依赖性等级,而且所述抑制剂仍能控制所有测试的复合突变株。所有复合突变株(除了Y253H/T315I和E255V/T315I)在160nM浓度的化合物1得以消除。在320nM,唯一保留的复合突变株为E255V/T315I,其组合了两种最耐药的单突变株,且生长物在最高测试浓度(640nM)被完全抑制,仍然比亲代Ba/F3细胞的IC50低3倍。该耐药概况在随后的开始于BCR-ABLE255V(对化合物1最耐药的单BCR-ABL激酶区域突变株)的背景的筛选中得以确认,且所述E255V/T315I复合突变株在320nM仍然存在且在640nM消失(表4)。
表3.化合物1开始于BCR-ABLT315I的基于细胞的诱发突变测试
表4.化合物1开始于BCR-ABLE255V的基于细胞的诱发突变测试
讨论
化合物1为ABL激酶抑制剂,其结合至无活性的DFG-out构象的ABL和ABLT315I的激酶区域,而且特征在于与邻近T315I突变株的碳-碳叁键连接。X射线结晶学研究证明了在DFG-out结合模式中化合物1结合至ABLT315I。化合物1保留了大量氢键网络,还占据了明显与伊马替尼的结合位点重叠的激酶区域。化合物1形成了五个结合至激酶的氢键,连同许多范德华接触,导致了激酶的强效抑制(ABLT315IIC50:2.0nM;天然ABL IC50:0.37nM)。此外,叁键本身的最优化位置使得产生了与I315侧链的许多疏水性接触,同时其线性形状和刚性几何形状形成了构象限制,避免了空间冲突并充当了不可弯曲的使得化合物1的其它两个部分处于确立的结合口袋中的连接基的作用。
在细胞增殖测试中化合物1的评估确证了其对抗表达天然或激酶区域突变BCR-ABL(包括BCR-ABLT315I)的细胞的强效的pan-BCR-ABL抑制,以及对费城染色体(Ph)-阳性细胞高度选择性(相对于Ph-阴性细胞)(表1)。在Ba/F3细胞中,这解释了表达天然BCR-ABL的细胞与亲代细胞之间超过3000倍的敏感性差异(天然IC50:0.5nM;亲代IC50:1713nM)。对于在细胞测试(图2A)以及在造血集落形成分析(图3)中用化合物1离体处理的原代CML细胞与正常细胞的对比,结果是一致的。在测试的BCR-ABL激酶区域突变株中,所述E255V突变株对化合物1最具耐药性(IC50:36nM),且已经报道该突变株对伊马替尼产生高水平的耐药性,并对尼罗替尼和达沙替尼二者产生中等水平的耐药性(O’Hare等人,Blood 110:2242(2007))。然而需要注意,在残基Y253和F359(已经在尼罗替尼失效时进行了报道(Kantarjian等人,Blood 110:3540(2007)),以及F317(在对达沙替尼临床耐药中涉及到(Burgess等人,Proc Natl Acad Sci U S A 102:3395(2005))的突变株被化合物1有效地抑制,其IC50值等于或低于T315I细胞的IC50值(表1)。
由于BCR-ABL信号传导的再次激活是对临床ABL抑制剂的激酶区域突变株介导的耐药的最常见特征,尤其在具有慢性期疾病的患者中,我们通过免疫印迹分析对BCR-ABLT315I-表达细胞的CrkL(天然和突变BCR-ABL确定的直接底物)磷酸化进行了分析。在体外Ba/F3细胞和离体原代CMLBCR-ABLT315I细胞二者中,用化合物1处理产生了显著的%pCrkL降低,而三种临床ABL抑制剂均未显示出任何作用(图1B和图2B)。在Ba/F3细胞中探测pBCR-ABL和pBCR-ABLT315I的水平时观察到相似的抑制,确证了%pCrkL读数的有效性。该CrkL变化测试为检查ABL激酶抑制剂的药效学有效性的优选方式,并将应用于化合物1的I期评估。
化合物1证明了在一系列天然BCR-ABL或BCR-ABLT315I驱使的CML小鼠模型中口服给药后的强效活性。在使用表达天然BCR-ABL的Ba/F3细胞的存活模型中,化合物1在2.5和5mg/kg的低剂量显著延长了存活(图4A)。使用5mg/kg的达沙替尼观察到相似的有效性,表明在相同剂量水平,化合物1在小鼠中对抗天然BCR-ABL的体内活性与达沙替尼相当。重要地,在使用表达BCR-ABLT315I的Ba/F3细胞的存活和皮下CML模型二者中,化合物1在5、15和25mg/kg的剂量显著延长了小鼠的存活(图4B)。在皮下肿瘤模型中,肿瘤在30和50mg/kg出现停滞或消退,并且在30mg/kg的剂量观察到BCR-ABL信号传导的抑制(图4C)。化合物1在这些研究中使用的所有剂量水平均良好耐受。这些结果具有几个意义。首先,化合物1口服可生物利用的事实提供了超越其它先前已经在临床中尝试的T315I抑制剂的优势。尤其是,ABL/Aurora激酶抑制剂MK-0457和PHA-739358二者均需要静脉注射给药以达到足以抑制BCR-ABL活性的剂量(Giles等人,Blood109:500(2007);Gontarewicz等人,Blood 111:4355(2008))。此外,这两种抑制剂均在同等浓度同时抑制正常细胞和BCR-ABLT315I细胞。不同的是,我们的体内数据表明,化合物1在CML动物模型中具有宽治疗范围(5至50mg/kg,依赖于BCR-ABLT315I)。
我们先前已经使用了我们的加速的基于细胞的诱发突变筛选以预测显示对伊马替尼、尼罗替尼和达沙替尼临床耐药性的BCR-ABL激酶区域突变株的范围(Bradeen等人,Blood 108:2332(2006))。由于对用各种二线ABL抑制剂治疗的CML患者的其它随访数据即将可用,已经报道了几种与尼罗替尼(L248R,Y253H,E255K/V,T315I,F359I/V;(Kantarjian等人,Blood110:3540(2007))或达沙替尼(V299L,T315I,F317I/L;(Shah等人,J Clin Invest117:2562(2007))失效有关的突变株,其大体上与我们的体外概况一致。在我们的化合物1的加速的诱发突变筛选中,我们具有生长物的孔的百分率和观察到的突变株的范围二者中观察到浓度依赖性降低。尽管在10nM化合物1,我们观察到跨越13个不同残基的16种不同的取代,但是将浓度升高至20nM,观察到的总生长物(11.7%,10nM;0.2%,20nM)和回收的突变株类型(图6A和表2)急剧减少。在20nM唯一回收的耐药亚克隆包含T315I或E255V突变株,并且在40nM化合物1或更高浓度观察到生长物的完全抑制(图6A和表2)。我们的数据表明化合物1(以合适的浓度给药)可免除对基于单突变株的耐药的易感性。使用单剂化合物1的该结果先前已经在仅在尼罗替尼或达沙替尼之一与临床前T315I抑制剂的双重组合的存在下的测试中达到(O’Hare等人,Proc Natl Acad Sci U S A 105:5507(2008))。
为了进一步研究化合物1抑制耐药生长物的能力的大小,我们进行了加速的诱发突变筛选,其开始于表达两种分别最耐药的突变株(BCR-ABLT315I或BCR-ABLE255V)之一的Ba/F3细胞的背景。该预测性测试涉及具体的复合突变株,尤其是包括对化合物1中等至高度耐药的Y253H、E255V,和T315I的集合中任两个的那些突变株(表3和4)。在这些中,预测Y253H/T315I和E255V/T315I为对化合物1最耐药的组合(图6B和表3和4)。需要注意,T315I成分的出现表明目前批准的临床BCR-ABL抑制剂无一对这些突变株具有活性。因此,化合物1具有消除复合突变株(包括预测为对所有其它抑制剂高度耐药的T315I和E255V)的能力。目前,BCR-ABL的激酶区域内的复合突变株不常见(表5),但是相信它们的普遍性将随着患者延长的存活和随着更多患者接受随后ABL激酶抑制剂的治疗而增加,在目前它们对于那些具有它们的患者提出了难以克服的困难。尽管所有诱发突变筛选都不可能完全详尽无遗,但是我们的数据表明会完全阻止与化合物1结合的突变株可能与保持充分的激酶活性不共存。在该情况下,逃避抑制将带来“功能性自杀”的代价。
表5.赋予对化合物1中等至高度耐药的E255V或T315I的BCR-ABL复合突变株
(1)Shah等人,(2007)JCI 117,2562-2569
(2)Khorashad等人,(2008)Blood 111,2378-2381
(3)Slagno等人,(2008)Leuk Res 32,673-674
注释:在本筛选中未检测到以下临床报道的复合突
变株:V299L/E255V。
缩写:NR,未报道。
我们的生化、基于细胞的,和体内研究的组合结果表明,以合适的量给药的化合物1对抗天然BCR-ABL和所有测试的BCR-ABL突变株显示出充分活性,以保证单剂用作pan-BCR-ABL抑制剂的考虑。此外,我们的结果表明,化合物1保留了控制涉及T315I的复合突变株的希望,但是仍需意识到在单突变株阶段消除耐药亚克隆是有利的。
实施例2:临床研究
化合物1为口服可用的酪氨酸激酶抑制剂,其有效地抑制BCR-ABLT315I、天然酶和所有其它测试的变型的酶活性。其还抑制表达所述BCR-ABL变型的细胞系的存活,其具有<40nM的IC50。
进行了一项I期临床试验用于评估化合物1的安全性和提供临床活性的初步评估。该试验运用了开放式剂量递升设计。根据本文所述合成和配制化合物1。
对治疗顽固(或复发或尚无可用的标准治疗)、ECOG状态≤2、QTcF<450ms、充分的肝功能和肾功能,和正常的心功能的恶性血液病的患者是合格的,而且接受单一的每天口服剂量的化合物1。恶性血液病包括CML(任何期)、ALL、AML、MDS、MM或CLL。另外,征募前,患者不能接受≥21天的化疗或≥14天的研究药物。
征募并治疗了57名患者(30名男性),中值年龄为61岁(范围为26-85)且诊断后的中值时间为5.4年(0-21年)。诊断包括了50个CML(37个慢性期[CP]、7个加速期[AP]、6个急变期[BP])、3个Ph+ALL,和4个其它恶性肿瘤(2个骨髓纤维化、1个骨髓瘤,和1个MDS)。48名Ph+患者中的BCR-ABL突变状态包括14名不具突变株的患者和34名具有突变株的患者(14名T315I、5名F317L、4名G250E,3名具有2或2种以上的突变株,剩余显示了其它突变株(包括F359C和F359V),其它特异的突变株为M351T、L273M/F359V、G250E、E279K、F359C、L387F,和E453K)。53名Ph+患者(CML和ALL)中的先前治疗包括伊马替尼(96%的患者)、达沙替尼(87%),和尼罗替尼(57%),其中35名患者具有≥3种TKI且50名患者具有≥2种先前TKI。
患者接受以下剂量浓度的治疗:2mg(3名患者)、4mg(6名患者)、8mg(7名患者)、15mg(8名患者)、30mg(7名患者)、45mg(13名患者),和60mg(13名患者)。45mg被确定为进一步研究的最大耐受剂量(MTD)。允许患者内的剂量升高。
初步安全性和有效性数据如下所示:对于2至30mg组(cohort):无DLT;对于45mg组:在一名患者中见到可逆的疹;且对于60mg组:四名患者出现了可逆的胰腺相关的DLT(胰腺炎)。最常见的与药物有关的任何等级的不良事件(AE)为血小板减少症(25%)、贫血、脂肪酶升高、恶心,和疹(各12%),和关节痛、疲乏,和胰腺炎(各11%)。
药代动力学和药效学(PK/PD)研究包括具有氘代化合物1作为内标的血浆分析(PK)和测量相对于总水平(PD)的BCR-ABL底物CRKL的磷酸化水平(p-CRKL)。在整个前24小时和在第1周期(C1)的第8、15,和22天(D),以及C2的D1(周期=28天)的给药前进行取样。PD作用的分级包括不可评估(在基线p-CRKL≤20%或用于分析的样品过少)、暂时的(在2个或更多个给药后时间点p-CRKL抑制≥50%*,但是未维持整个第1周期)、持续的(在2个或更多个给药后时间点p-CRKL抑制≥50%*,其维持整个第1周期)或无作用(基于以上标准无p-CRKL抑制)。*表示如果基线p-CRKL过低则≥25%抑制也可接受(例如,35%)以可靠地定量≥50%降低。
药代动力学数据证明了化合物1的半衰期为19-45小时。在≥30mg的剂量,半衰期为18小时。图7A和7B显示了在给药范围内Cmax和AUC与剂量的线性关系。图7C和7D显示了浓度时间曲线。在第1天在30mg剂量的Cmax为大约55nM。重复给药后,在可评估患者中观察到1.5至3倍的蓄积。
接受每天60mg的化合物1的患者的药代动力学数据提供于表6中。
表6.以60mg(ng/mL)口服给药的化合物1的概况
以60mg(给药一个28天的周期后在24小时的浓度)每天给药的平均稳态波谷浓度为大约45ng/mL,其对应于大约90nM的循环血浆浓度,即可以在这些受试者中用于抑制耐药亚克隆的出现的循环浓度。在30mg或更高的剂量,波谷浓度超过40nM(21ng/mL),即突变测试证明了完全抑制突然出现的克隆的浓度(如图6A所示)。
PD数据证明了在8mg和更高剂量抑制CrkL磷酸化。如图8A所示,在全体人群中在≥8mg的剂量和在T315I患者中在≥15mg的剂量观察到持续的靶向抑制。图8B-8E显示了不同剂量和在具有不同突变株的患者中的药效学数据。总体最佳血液学响应为22名CP患者中22人(85%)的完全血液学响应(CHR),包括新的和基线CHR,以及12名AP、BP或ALL患者中5人的主要血液学响应(MHR)。细胞遗传学响应为8个完全细胞遗传学响应(CCyR)和12个MCyR。T315I受试者中的最佳血液学响应为9名CP名患者中8人(89%)的CHR,包括新的和基线CHR,以及8名AP、BP或ALL患者中3人的MHR。12名T315I患者中9人适合CyR评估:5名CP和1名AP、BP或ALL患者达到CCyR,且6名CP和3名AP、BP或ALL达到MCyR。分子学响应包括在32名CP AML患者中的8个MMR(4名患者在基线具有T315I)。
结论:在高达30mg化合物1的剂量未观察到DLT,并在更高剂量观察到可逆的DLT。PK和PD证明了在30mg的血药浓度超过了体外抑制耐药的突变BCR-ABL亚型(包括T315I)所需的浓度。初步分析表明了在对批准的二线TKI达沙替尼和尼罗替尼耐药的患者中的临床抗肿瘤活性的证据,所述患者包括具有BCR-ABL的T315I突变株的患者。至今为止获得的结果表明:(1)在全体人群在8mg和更高剂量观察到一致的持续的靶向抑制,(2)在T315I患者中在15mg剂量或更高浓度观察到持续的靶向抑制,(3)鉴定出45mg的化合物1为MTD,以及(4)抑制正在进行治疗的患者出现耐药亚克隆所需的更高剂量是耐受的且不存在显著不良事件。在≥30mg的剂量观察到超过化合物1的pan-BCR-ABL活性的阈值的波谷药物浓度。在≥15mg的剂量,在具有多种突变株(包括T315I)患者中出现持续的BCR-ABL的抑制。总之,这些结果与对目前可用的TKI失效的顽固的Ph+患者中的抗白血病活性的临床证据非常相关。
实施例3:急性髓性白血病的FLT3突变株的抑制
实验操作
细胞系、抗体和试剂:MV4-11、RS4;11、Kasumi-1和KG1细胞获自American Type Culture Collection(Manassas,VA),且EOL1细胞获自DSMZ(Braunschweig,Germany)。根据标准技术,将细胞在37℃在5%(v/v)CO2中使用补充有10%FBS(20%FBS,对于Kasumi-1细胞)的RPMI 1640保持和培养。化合物1在ARIAD Pharmaceuticals(Cambridge,MA)合成,且索拉非尼和舒尼替尼购自American Custom Chemical Corporation(San Diego,CA)。将所有化合物制备为DMSO中的10mM储备溶液。所用的抗体包括:磷酸-PDGFRα、PDGFRα、FLT3、FGFR1和GAPDH,它们购自Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz,CA);STAT5、KIT、磷酸-KIT、磷酸-FGFR和磷酸-FLT3购自Cell Signaling Technology(Beverly,MA);磷酸-STAT5购自BDBiosciences(San Jose CA)。
细胞活力测试:使用Cell Titer 96Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay(Promega,Madison WI)评估细胞活力。将指数生长的细胞系接种在96-孔板中并37℃孵育过夜。接种24小时后,细胞用化合物或载剂(DMSO)处理72小时。使用Wallac Victor微板读数器(PerkinElmer,Waltham,MA)测量荧光。将数据以相对载剂治疗的细胞的百分活力作图,并使用MicrosoftExcel的XLfit版本4.2.2计算IC50值(产生50%抑制的浓度)。数据显示为3次独立实验的平均值(±SD),各以一式三份测试。
免疫印迹分析:为了检查受体酪氨酸激酶信号的抑制,细胞用一定浓度范围(0.03-100nM)的化合物1处理1小时。将细胞溶解于冰冷的SDS水解缓冲液(0.06M Tris-HCL、1%SDS和10%甘油)中,并使用BCA蛋白测试(Thermo Scientific,Rockford,IL)测定蛋白浓度。细胞的溶胞产物(50μg)通过电泳解析,并使用NuPage试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)转移至硝基纤维素膜。使用磷酸化抗体将膜进行免疫印迹,然后用恢复免疫印迹剥离缓冲液(Thermo Scientific)剥离,再使用总蛋白抗体进行免疫印迹。以化合物1处理的细胞相对于载剂处理的细胞中的百分磷酸化的蛋白作图计算IC50值。
凋亡测试:为了测量半胱天冬酶活性,以1x104细胞/孔将MV4-11细胞接种于黑壁的96-孔板,保持24小时,然后用化合物1处理指定的时间点。根据生产商的方案加入Apo-One均质半胱天冬酶3/7试剂(Promega,Madison,WI),并用Wallac Victor微板读数器测量荧光。为了测量PARP裂解,将MV4-11细胞接种在6-孔板中,并在接着的那天用化合物1处理24小时。在处理结束时,将细胞用SDS缓冲液溶解,并进行免疫印迹以测量总PARP和裂解的PARP表达(Cell Signaling Technology)。
皮下异种移植物模型:在Piedmont Research Center(Morrisville,NC)进行了MV4-11人肿瘤异种移植物的有效性研究。简言之,通过皮下移植MV4-11细胞(1x107在50%基质胶中)至雌性CB.17 SCID小鼠的右侧腹建立肿瘤异种移植物,当平均肿瘤体积达到大约200mm3时开始给药。将化合物1稀释于25mM柠檬酸盐缓冲液(pH=2.75)的载剂中,并使小鼠每天一次口服给药4周。用卡尺测量肿瘤的两个维度(长度和宽度),单位为毫米。用以下公式计算肿瘤体积(mm3):肿瘤体积=(长度x宽度2)/2。如下计算肿瘤生长抑制(TGI):TGI=(1-ΔT/ΔC)x100,其中ΔT表示各治疗组的平均肿瘤体积变化,ΔC表示对照组的平均肿瘤体积变化。收集肿瘤体积数据并用单侧ANOVA检验(GraphPad Prism,San Diego,CA)分析,以测定组间的总体差异。使用Dunnett’s多重比较检验进一步比较各化合物1治疗组与载剂对照组的统计学显著性。认为p值<0.05具有统计学显著性,p值<0.01具有高度统计学显著性。
药代动力学和药效学:建立MV4-11异种移植物肿瘤后,向小鼠给药单一口服剂量的化合物1,并在6小时后采集肿瘤。各个肿瘤在冰冷的包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀化,并通过离心使之澄清。样品通过SDS-PAGE解析,转移至硝基纤维素膜,并使用对抗总的和磷酸化的FLT3和STAT5的抗体进行免疫印迹。化合物1在血浆中的浓度通过内标LC/MS/MS方法使用蛋白沉淀和在空白小鼠血浆中配制的校正标准品进行测定。低于定量限(BQL)等于<1.2ng/ml化合物1。浓度报道为4只小鼠/组的平均值。
原代AML患者样品的离体处理:根据Institutional Review Board ofOregon Health & Science University批准的知情同意,去识别(de-identified)和收集所有患者样品。通过Ficoll梯度然后通过红细胞溶解从来自急性髓性白血病患者的外周血分离单核细胞。使用Guava ViaCount试剂和GuavaPersonalCell Analysis流式细胞仪(Guava Technologies,Hayward,CA)定量细胞。将细胞接种在96-孔板(5x104/孔)中,所述板含有在补充有10%FBS、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、两性霉素B,和10-4M2-巯基乙醇的RPMI中的分级浓度的化合物1(1-1000nM)。孵育72小时后,将细胞进行MTS测试(Cell Titer Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay,Promega)用于评估细胞活力。根据不含药物的接种细胞的活力,标准化所有值,且百分活力用于测定化合物1对各样品的IC50。通过PCR在各患者的基因组DNA上测定FLT3状态。
结果
(1)化合物1抑制突变型、组成性激活的FLT3、KIT、FGFR1和PDGFRα驱使的造血细胞系的信号传导和增殖。
化合物1抑制FLT3、KIT、FGFR1和PDGFRα的体外激酶活性,其IC50分别为13、13、2和1nM。此处,化合物1的活性在一组白血病细胞系(其在FLT3(FLT3-ITD;MV4-11细胞)和KIT(N822K;Kasumi-1细胞)带有激活突变株或在FGFR1(FGFR1OP2-FGFR1;KG-1细胞)和PDGFRα(FIP1L1-PDGFRα;EOL-1细胞)带有激活融合)进行了评估。化合物1以剂量依赖性方式抑制所有4种RTK的磷酸化,其IC50为0.3-20nM(表7)。
表7.在AML细胞系中增殖和信号传导的抑制
IC50(nM)
与这些激活的受体在驱使白血病生成是至关重要的相一致(Chalandon等人,Haematologica 90:949-968(2005)),化合物1还强效地抑制了所有4种细胞系的活力,其IC50为0.5-17nM(图9,表7)。不同的是,抑制RS4;11细胞(其在这4种受体中缺乏激活的突变株)的IC50为>100nM。这些数据表明化合物1选择性地靶向表达这些异常RTK中的一种的白血病细胞。
然后将化合物1的效力和活性概况与两种其它多靶点的激酶抑制剂(索拉非尼和舒尼替尼)比较,通过平行检查它们对相同细胞系组的活力的作用。虽然观察到索拉非尼和舒尼替尼对抗FLT3(IC50分别为4和12nM)和PDGFRα(0.5和3nM)的有效抑制活性,但是两种化合物在对抗KIT(59和56nM)或FGFR1(>100和>100nM)时均未显示比化合物1高的效力(表7)。
(2)化合物1对MV4-11细胞的强效凋亡作用
由于FLT3-ITD突变株在AML中的主要临床相关性,因此随后的研究重点在于鉴定化合物1对抗该靶点的活性。为了检查化合物1对FLT3-ITD-驱使的MV4-11细胞的活力的作用的基础,测量了其对2种凋亡标记的作用。在半胱天冬酶3/7活性中观察到剂量依赖性和时间依赖性增加,且在10-30nM化合物1和处理16小时内见到最大诱导(高至4倍)(图10)。相似地,在≥10nM的浓度,化合物1显示出PARP裂解的几乎最大诱导,并伴随抑制STAT5的磷酸化,所述STAT5为突变的FLT3-ITD激酶的直接下游底物(Choudhary等人,Blood.110:370-374(2007))和细胞存活的重要调节子。总之,这些数据支持了以下结论:通过化合物1抑制FLT3-ITD,经过诱导凋亡抑制了MV4-11细胞活力。
(3)体内效力和药效学研究
为了检查化合物1在体内对FLT3-ITD-驱使的肿瘤生长的作用,将化合物1(1-25mg/kg)或载剂口服给予(每天一次共28天)携带MV4-11异种移植物的小鼠。如图11A所示,化合物1以剂量依赖性方式强效地抑制了肿瘤生长。给药最低测试剂量1mg/kg,导致肿瘤生长的显著抑制(TGI=46%,p<0.01),并且2.5mg/kg或更高的剂量导致肿瘤消退。需要注意,给药10或25mg/kg导致完全且持续的肿瘤消退,而且在31天的随访期间未检测到可触及的肿瘤。
为了确证体内靶向调节,向携带MV4-11异种移植物的小鼠给药单一口服剂量的载剂或化合物1(1、2.5、5或10mg/kg)。6小时采集肿瘤并通过免疫印迹分析评估磷酸化的FLT3和STAT5的水平。1mg/kg化合物1的单一剂量对FLT3信号传导具有中等的抑制作用,p-FLT3和p-STAT5的水平降低大约30%。升高剂量的化合物1导致信号传导的抑制增强,5和10mg/kg剂量分别抑制信号传导大约75和80%。药代动力学分析证明了化合物1在血浆中的浓度与FLT3-ITD信号传导的抑制之间成正相关(图11B)。这些数据显示信号传导通过化合物1的抑制与效力程度相关(图11A),并且支持以下结论:FLT3-ITD信号传导的抑制解释了化合物1在该模型中的抗-肿瘤活性。
(4)化合物1在原代AML细胞中的活性
为了评估化合物1在来自AML患者的原代细胞中的活性,我们从4名患者中获得了外周血母细胞;3人表达野生型FLT3,1人带有FLT3-ITD突变株。FLT3状态通过在来自各患者的基因组DNA上的PCR确定。暴露于化合物1达72小时后测量细胞活力(图12)。与细胞系中获得的结果一致,化合物1降低了FLT3-ITD阳性原代母细胞的活力,其IC50为4nM,而野生型母细胞在测试的浓度(高达100nM)未显示活力降低。总之,这些发现支持了以下结论:化合物1对带有FLT3-ITD突变株的白血病细胞具有选择性细胞毒性。
讨论
此处,使用包含激活形式的各种这些受体的白血病细胞系,我们证明了化合物1显示出对抗激酶(涉及恶性血液病的发病机制的激酶的离散集合(FLT3、KIT,和FGFR和PDGFR家族的成员))的活性,其效力与BCR-ABL观察到的相似,即,抑制靶点蛋白磷酸化和细胞活力的IC50的范围分别为0.3-20nM和0.5-17nM。先前已经证明了其它多靶点激酶抑制剂(例如索拉非尼和舒尼替尼)具有对抗这些激酶的子集的抑制活性。然而,我们发现化合物1在其抑制所有4种激酶的活性的能力方面是独特的且高效的。由于化合物1在本文测试的模型中显示出对抗FLT3、KIT、FGFR1和PDGFRα的效力相当,因此化合物1可用于治疗其中这些激酶起作用的疾病。
认为具有FGFR1和PDGFRα的遗传重组的MPN不常见;然而,已经证明所得的融合蛋白在这些疾病的发病机制中起重要作用(Gotlib等人,Leukemia 22:1999-2010(2008);Macdonald等人,Acta Haemato1.107:101-107(2002))。EMS为侵袭性疾病,其在不予治疗时可快速转化为AML。我们在此还证明了化合物1强效地抑制FGFR1OP2-FGFR1融合蛋白驱使的AMLKG1细胞系的活力,支持了化合物1在该疾病类型中的临床适用性。当用PDGFR抑制剂伊马替尼治疗时,具有PDGFRα融合的HEL/CEL患者达到显著的血液学响应(Gotlib等人,Leukemia 22:1999-2010(2008)),我们已经证明了化合物1具有对抗FIP1L1-PDGFRα融合蛋白的强效活性,如在白血病EOL细胞系中所证明。然而,已经证明了PDGFRα的T674I突变株(其在类似于BCR-ABL中的T315I门控残基的位置发生突变)在患者中对伊马替尼产生耐药性(Gotlib等人,Leukemia 22:1999-2010(2008))。重要地,化合物1具有对抗PDGFRαT674I突变株激酶的强效活性,其IC50为3nM,支持化合物1在治疗携带该融合蛋白的患者中的适用性。
AML中的FLT3-ITD改变的发生率和预后重要性表明该激酶在疾病的发病机制中起关键作用(Levis等人,Leukemia 17:1738-1752(2003)),而且这还代表了治疗干预的主要靶点。在本文报道的使用FLT3-ITD表达细胞系MV4-11的研究中,我们证明了体外和体内抑制FLT3活性与抑制肿瘤细胞活力之间的紧密关系。在体外,低nM浓度的化合物1(即,<10nM)导致FLT3磷酸化降低,活力降低和凋亡标记升高。在体内异种移植物模型中,1mg/kg每天口服剂量的化合物1导致肿瘤生长的显著抑制,且5mg/kg或更高剂量导致肿瘤消退。与对肿瘤生长的作用是由于FLT3的抑制相一致,单剂量1mg/kg化合物1导致FLT3-ITD和STAT5磷酸化的部分抑制,5和10mg/kg的剂量导致基本上全部抑制。最后,化合物1强效抑制分离自FLT3-ITD阳性AML患者的原代母细胞的活力(IC50为4nM),但是不抑制分离自三种FLT3野生型患者的原代母细胞(IC50>100nM)。
许多具有FLT3活性的化合物已经被公开了,并且已经在患者中评估了其中的几种,且至今报道了相对中等的临床活性(例如,Stirewalt等人,Nat.Rev.Cancer 3:650-665(2003);Chu等人,Drug Resist.Updat.12:8-16(2009);Weisberg等人,Oncogene Jul 122010)。根据显示为了有效杀死FLT3依赖的AML细胞,需要维持FLT3抑制的临床前研究,出现了一种观点:为了达到最大治疗益处,可能需要持续且几乎完全的FLT3激酶的抑制(Pratz等人,Blood 113:3938-3946(2009))。我们的体外研究证明了完全(即,持续基本上完全的)抑制FLT3磷酸化和作用可在≤10nM的浓度获得。重要地,化合物1药代动力学性质的初步分析(当在可耐受浓度给药时)证明波谷浓度超过40nM(即,下次每天给药之前)。这些数据支持了以下结论:化合物1的效力和药理学性质允许持续且几乎完全地在患者中抑制FLT3。
化合物1为多靶点激酶抑制剂,其显示对FLT3的强效抑制,且对带有FLT3-ITD突变株的AML细胞具有细胞毒性。重要地,该药物显示出对抗其它RTK、FGFR1、KIT和PDGFRα的活性,也已经证明其在恶性血液病的发病机制中起作用。需要注意,化合物1在体外对抗这些RTK的效力和在人中观察到的化合物1的血浆浓度支持化合物1对抗这些靶点的临床作用。总之,这些观察为研发化合物1作为AML和其它恶性血液病(例如KIT、FGFR1或PDGFRα驱使的那些)的新的治疗提供了强有力的临床前支持。
实施例4:在具有FLT3突变株的AML患者中的初步结果
除了在实施例3中讨论的非常显著的基于细胞的结果,初步临床试验结果包括接受每天口服给予45mg化合物1治疗后,在具有FLT3-ITD突变株的顽固的AML患者中的完全响应。总之,这些结果支持了在具有FLT3-ITD驱使的AML和其它恶性血液病的患者中化合物1的开发。此外,鉴于其对抗其它激酶的抑制概况,ponatinib还具有对抗KIT、FGFR1、PDGFRα或其它激酶(天然或突变的)驱使的各种癌症的重要作用。
实施例5:化合物1的激酶选择性概况
试剂:根据本文所述合成化合物1。购买了以下化合物:PD173074(Calbiochem,Gibbstown,NJ)、BMS-540215(American Custom Chemical,San Diego,CA)、CHIR-258和BIBF-1120(Selleck Chemical Co,London ON,Canada)。
激酶测试:在Reaction Biology Corporation(RBC,Malvem,PA USA)进行激酶抑制测试以测定IC50。在10μM ATP中使用具有3倍系列稀释(开始于1μM)的10点曲线测试化合物。给出了来自2次测试的平均数据。
细胞生长测试:使用Cell Titer 96Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay(Promega,Madison,WI)或CyQuant Cell Proliferation Assay(Invitrogen,Carlsbad,CA)评估细胞生长。接种24小时后,细胞用化合物处理,并生长72小时。通过在零时间点(处理时)校正细胞计数,并使用Microsoft Excel的XLfit版本4.2.2以生长百分率相对载剂(二甲亚砜,DMSO)治疗的细胞对数据作图,确定产生50%生长抑制的浓度(GI50)。数据显示为来自以一式三份测试的3次独立实验的平均值(±SD)。
软琼脂集落形成分析:使用CytoSelect 96-Well Cell Transformation Assay(Cell Biolabs,San Diego,CA)进行软琼脂测试。简言之,将细胞悬浮在0.08%琼脂中。并接种在96-孔板中的0.06%琼脂中。在接种时用化合物1处理细胞一次并孵育8-10天。根据生产商方案,将细胞用碘代硝基四唑氯化物(Sigma,St.Louis,MO)染色或溶解和用CyQuant Dye定量。“ND”表示未测定。
Western免疫印迹:接种24小时后处理细胞,并与抑制剂孵育1小时。将细胞溶解于SDS缓冲液或Phospho-SagrTM缓冲液(Novagen,Gibbstown,NJ),且将蛋白溶胞产物免疫沉淀过夜和/或用指示的抗体免疫印迹。使用Quantity One软件定量蛋白表达(BioRad,Hercules,CA)。通过使用XLfit4对标准化为总蛋白信号的磷酸信号的百分抑制作图计算IC50值(导致50%抑制的浓度)。表中显示的数据为来自2-3次测试的平均值。
皮下肿瘤模型:将AN3CA细胞移植至裸鼠的右侧腹。为了分析有效性,当平均肿瘤体积达到大约200mm3时,通过每天口服给予12天给药抑制剂。为各治疗组计算平均肿瘤体积(±SE;肿瘤体积=LxW2x0.5)。
药效学/药代动力学:为了药效学分析,将肿瘤样品收集后冷冻,在Phospho-SafeTM缓冲液中均化,并通过Wesem免疫印迹分析。通过内标LC/MS/MS方法使用蛋白沉淀,并在空白小鼠血浆中配制的校正标准品测定血浆中的抑制剂浓度。数据显示为来自3只小鼠/时间点/组的平均值。
化合物1的体外效力和选择性在具有多重组激酶区域和肽底物的激酶测试中进行评估(表8)。发现化合物1抑制受体酪氨酸激酶的PDGFR、FGFR,和VEGFR家族的成员(例如FLT1、FLT4,和KDR)(表1)。化合物1为所有4种FGF受体(FGFR1、FGFR 2、FGFR 3、FGFR 4)以及FGFR1(V561M)和FGFR2(N549H)的强效抑制剂(表8),当与不抑制所有4种FGFR的其它多靶点激酶抑制剂(例如舒尼替尼、索拉非尼,和达沙替尼)比较时,这是独特的。然而,需要注意,化合物1不抑制Aurora或胰岛素激酶家族成员,也不抑制细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)/Cyclin E。
表8.化合物1的激酶选择性概况
实施例6:化合物1在癌症细胞模型中的作用
化合物1在多种癌症细胞系中影响细胞活性。根据实施例5所述进行实验操作。在表达FGFR1-FGFR1OP2融合基因的急性髓性白血病来源的KG1细胞系中,化合物1抑制细胞生长和FGFR1的磷酸化。图13A显示化合物1对KG1细胞系的生长抑制,测定的GI50为10nM。化合物1抑制FGFR1的磷酸化,其IC50为10nM,其通过Western免疫印迹分析在用化合物1处理的KG1细胞中表达的P-FGFR1、T-FGFR1,和甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(“GADPH”)测定。GAPDH数据用作对照。
化合物1还可选择性影响癌细胞的细胞活性,如与正常细胞相比。当与wtFGFR2SNU1细胞比较时,化合物1选择性抑制具有扩增的FGFR2的SNU16胃癌细胞(图14)。化合物1抑制SNU16中的信号传导,如通过在SNU16胃癌细胞中用于蛋白表达的Western免疫印迹分析磷酸化的FGFR2、FRS2a、和Erk 1/2的出现降低而测定。当与wtFGFR2SNU1细胞比较时,化合物1还选择性抑制软琼脂中的SNU16集落形成(图15)。表9提供化合物1在胃癌细胞系SNU16和KatoIII中的活性的概况,如与wtFGFR2SNU1细胞系相比。化合物1选择性抑制细胞生长和胃癌细胞SNU16和KatoIII的FRS2a和Erk 1/2的磷酸化,如与wt SNU1相比。
表9.化合物1在胃癌细胞系中活性的概况
当与wtFGFR2Hec1B细胞相比时,化合物1选择性抑制具有突变FGFR2(N549K)的AN3CA子宫内膜癌细胞。化合物1抑制AN3CA细胞的细胞生长,其GI50为30nM,与Hec1B细胞相比,其GI50为490nM (图16)。化合物1还抑制AN3CA细胞中的信号传导,尤其是FRS2a和Erk 1/2的磷酸化,如通过在用化合物1处理的AN3CA子宫内膜癌细胞中用于蛋白表达的Western免疫印迹分析测定。表10提供化合物1在子宫内膜癌细胞系AN3CA中的活性的概况,与wtFGFR2Hec1B和RL95细胞系相比。
表10.化合物1在子宫内膜癌细胞系中的活性的概况
nd:未测定
化合物1在膀胱癌和多发性骨髓瘤(MM)的细胞模型中抑制FGFR3。当与wtFGFR3RT112细胞比较时,化合物1选择性抑制表达突变FGFR3b(Y375C)的膀胱癌MGH-U3细胞的生长(图17)。化合物1还在MGH-U3中抑制FRS2a的信号传导(IC50=41nM,对于P-FRS2a),如通过在用化合物1处理的MGH-U3细胞中用于蛋白表达的Western免疫印迹分析测定。当与wtFGFR3NCI-H929细胞比较时,化合物1选择性抑制携带t(4;14)易位和表达突变FGFR3(K650E)的OPM2MM细胞的生长(图18)。在OPM2细胞中FGFR3信号传导被化合物1抑制,如通过在用化合物1处理的OPM2MM细胞中用于蛋白表达的Western免疫印迹分析测定(数据未显示)。另外,化合物1抑制OPM2中FRS2a的信号传导(IC50=65nM,对于P-FRS2a)。
化合物1在乳腺癌的细胞模型中抑制FGFR4。化合物1对表达突变FGFR4(Y367C)的MDA-MB-453乳腺癌细胞的作用包括抑制细胞生长(图19)和FGFR4和FRS2a的细胞信号传导,如通过在用化合物1处理的MDA-MB-453细胞中用于蛋白表达Western免疫印迹分析测定(IC50=12nM,对于P-FGFR4,和14nM,对于P-FRS2a)。
表11提供了对于多种激酶抑制剂(包括CHIR-258、BIBF-1120、BMS-540215,和PD173074)在FGFR模型中RTK抑制剂活性的比较。对于通过RBC进行的激酶测试,显示IC50(nM)数据,对于细胞生长测试,显示GI50(nM)数据。
表11.在FGFR模型中RTK抑制剂活性的比较
结论
化合物1为口服有效的激酶抑制剂,其在激酶和细胞测试中显示出对抗所有4种FGF受体的强效活性。在表达所有4种FGFR的模型中抑制了信号传导和生长,且观察到对抗FGFR1和FGFR2的最强效活性。在多种癌症类型(包括胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌和多发性骨髓瘤)中观察到化合物1的活性。化合物1的活性有利地匹敌在临床中评估为具有已知FGFR活性的其它RTK抑制剂的活性。
实施例7:口服递送化合物1有效降低了FGFR2-驱使的AN3CA异种移植物模型中的实体瘤生长。
化合物1在10和30mg/kg口服剂量分别抑制AN3CA肿瘤生长达36%和62%(图20)。尽管提供了每天用药方案,但是间断用药方案也可是有效的。
还确定了体内药效学和药代动力学关系,其中给药6小时后通过Western免疫印迹分析测定了化合物1的血浆浓度(图21)。口服给药化合物1在AN3CA异种移植物中抑制了FRS2a和Erk1/2信号传导(图21)。
口服递送化合物1在表达临床相关FGFR2(N549K)突变株的子宫内膜癌模型中有效抑制肿瘤生长。抑制细胞生长与抑制肿瘤中的下游信号传导相关。这些数据支持了使用化合物1治疗许多特征在于FGF受体改变的肿瘤。
实施例8:化合物1与Ridaforolimus的组合治疗
实验操作
试剂:由ARIAD Pharmaceuticals合成化合物1和ridaforolimus(AP23573,MK-8669)。购买以下化合物:BMS-540215(American CustomChemical,San Diego,CA)、CHIR-258、AZD2171和BIBF-1120(SelleckChemical Co.,London ON,Canada)。
激酶测试:在Reaction Biology Corporation(RBC,Malvern,PA USA)进行激酶抑制测试以测定IC50。在10μM ATP中使用具有3倍系列稀释(开始于1μM)的10点曲线测试化合物。显示了来自2次测试的平均数据。
细胞生长测试:使用Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay(Promega,Madison,WI)或CyQuant Cell Proliferation Assay(Invitrogen,Carlsbad,CA)评估细胞生长。接种24小时后用化合物处理细胞,并生长72小时。通过在零时间点(处理时)校正细胞计数并使用Microsoft Excel的XLfit版本4.2.2以生长百分率相对载剂(DMSO)治疗的细胞对数据作图测定产生50%生长抑制的浓度(GI50)。
组合测试和分析:对于各个测试的化合物,测定在50%最大抑制的有效剂量(ED50),并定义为1x。所用的药物浓度范围为0.125×至8×,以固定的ED比。使用Chou和Talalay的方法(CalcuSyn软件,Biosoft)分析对细胞生长的组合作用。
Western免疫印迹:接种24小时后处理细胞,并与抑制剂孵育1小时。将细胞溶解于SDS缓冲液或Phospho-SafeTM缓冲液(Novagen,Gibbstown,NJ),且将蛋白溶胞产物免疫沉淀过夜和/或用指示的抗体免疫印迹。使用Quantity One软件定量蛋白表达(BioRad,Hercules,CA)。通过使用XLfit4对标准化为总蛋白信号的磷酸信号的百分抑制作图计算IC50值(导致50%抑制的浓度)。表中显示的数据为来自2-3次测试的平均值。
皮下肿瘤模型:将AN3CA细胞移植至裸鼠的右侧腹。为了分析有效性,当平均肿瘤体积达到大约200mm3时,通过每天口服给予21天或静脉给予QDX5共3周给药抑制剂。为各治疗组计算平均肿瘤体积(±SE;肿瘤体积=LxW2x0.5)。
药效学/药代动力学:为了药效学分析,将肿瘤样品收集后冷冻,在Phospho-Safe中均化,并通过Wesem免疫印迹分析。通过内标LC/MS/MS方法使用蛋白沉淀,以及在空白小鼠血浆中配制的校正标准品测定血浆中的抑制剂浓度。数据显示为来自3只小鼠/时间点/组的平均值。
化合物1在多种癌症细胞系中影响细胞活性。表12提供了对于多种激酶抑制剂(包括AZD2171、CHIR-258、BIBF-1120,和BMS-540215)在FGFR细胞模型中RTK抑制剂活性的比较。化合物1为FGFR1-FGFR4的强效抑制剂。对于通过RBC进行的激酶测试,显示IC50(nM)数据。表12显示了GI50(nM)数据(对于细胞生长测试)和IC50(nM)数据(对于信号传导)。
表12.在FGFR模型中RTK抑制剂活性的比较
化合物1选择性抑制FGFR2-突变株的子宫内膜癌细胞系的生长和信号传导。化合物1抑制子宫内膜癌细胞系AN3CA和MFE-296,与wtFGFR2Hec-1-B和RL95-2细胞系相比(图22)。化合物1抑制AN3CA细胞中的信号传导,尤其是FRS2a和Erk 1/2的磷酸化,如通过用于多种浓度的化合物1对AN3CA细胞的作用的Western免疫印迹分析测定。表13提供了化合物1在子宫内膜癌细胞系AN3CA和MFE-296中的活性的概况,与wtFGFR2Hec-1-B和RL95-2细胞系相比。
表13.化合物1在子宫内膜癌细胞系中的活性的概况
化合物1
口服递送化合物1抑制FGFR-2突变株的AN3CA子宫内膜肿瘤异种移植物的生长。化合物1在10和30mg/kg分别抑制AN3CA肿瘤生长达49%和82%(图23)。化合物1在给药后6小时抑制药效学标记子。口服给药化合物1抑制AN3CA异种移植物中的FRS2a和Erk1/2信号传导,如通过用于磷酸化的和非磷酸化的FRS2a、磷酸化的和非磷酸化的Erk1/,以及甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶作为对照的Western免疫印迹分析在给药6h后测定(数据未显示)。
这些数据显示化合物1为强效的、口服可利用的pan-FGFR抑制剂。已经在多种癌症类型(包括胃癌、子宫内膜、膀胱,和多发性骨髓瘤)中观察到活性。化合物1的活性有利地匹敌在临床中评估为具有已知FGFR活性的其它制剂的活性。另外,口服化合物1强效地抑制了对FGFR2表达临床相关N549K突变株的子宫内膜癌模型中的肿瘤生长。
实施例9:化合物1与mTOR抑制剂在癌症模型中的协同抗-肿瘤活性。
对于多种浓度的ridaforolimus、化合物1,以及化合物1与ridaforolimus的组合,图24A显示了化合物1对AN3CA细胞系的生长抑制。对于多种浓度的ridaforolimus、化合物1,以及化合物1与ridaforolimus的组合,图24B显示了化合物1对MFE-296细胞系的生长抑制。浓度以EC50的函数给出。与任一单独化合物相比,化合物1与ridaforolimus的组合对FGFR2-突变株的子宫内膜癌细胞系AN3CA和MFE-296均提供了协同作用。对于AN3CA细胞系(图25A)和MFE-296细胞系(图25B),提供了化合物1与ridaforolimus的组合对AN3CA细胞系的中值作用分析。对于AN3CA细胞系,在4.3至1000nM浓度范围内的化合物1与0.05至13nM浓度范围内的ridaforolimus观察到协同作用(图25A)。对于MFE-296细胞系,在14至750nM浓度范围内的化合物1与0.14至7.5nM浓度范围内的ridaforolimus观察到协同作用(图25B)。
用ridaforolimus、化合物1,以及化合物1与ridaforolimus的组合治疗24小时后,在AN3CA细胞中进行了细胞周期分析。与未处理的细胞或与用一种化合物单独处理的细胞相比,用化合物1与ridaforolimus的组合治疗时在G0-G1周期中观察到增强的细胞周期停滞(图26)。
还通过给药24小时后的Western免疫印迹分析测定了化合物1和ridaforolimus在AN3CA细胞系中对多种信号传导分子的作用。化合物1(30nM或300nM)与ridaforolimus(0.5nM或5nM)的组合导致FRS2a、Erk1/2,和S6信号传导的抑制(数据未显示)。
图27为FGFR2和mTOR途径的可能模型的示意图。不希望受限于理论,在该模型中化合物1表现为抑制FGFR2/MAPK途径且ridaforolimus表现为抑制mTOR途径。
口服递送化合物1与ridaforolimus的组合后,在FGFR2-突变株的AN3CA肿瘤异种移植物中观察到增强的抗-肿瘤活性。对于低剂量化合物1(10mg/kg)与ridaforolimus(0.3mg/kg或1.0mg/kg)的组合,图28A显示了AN3CA肿瘤生长的抑制。对于高剂量化合物1(30mg/kg)与ridaforolimus(0.3mg/kg或1.0mg/kg)的组合,图28B显示了AN3CA肿瘤生长的抑制。显示出了每天口服给药化合物1(图28A和28B中的黑线)和每天口服给药ridaforolimus,每周5天(图28A和28B中的灰线)的结果。表14提供化合物1和ridaforolimus在AN3CA异种移植物模型中的有效性的概况,其中“TGI”表示相对于载剂的肿瘤生长抑制。
表14.化合物1与ridaforolimus AN3CA异种移植物模型中的有效性
还在给药6小时后测定了体内药效学和药代动力学关系(图29)。还给出了给药6小时后化合物1的血浆浓度(图29)。
观察到化合物1和ridaforolimus对抗FGFR2-突变株的子宫内膜癌细胞生长的协同活性。这些数据证明化合物1和ridaforolimus在FGFR2-突变株的子宫内膜癌模型中具有强效的组合活性。不希望受限于理论,分别通过化合物1和ridaforolimus经过FGFR2/MAPK和mTOR途径达到了有效的双重抑制。经体外的细胞生长测试和体内的肿瘤消退诱导观察到化合物1与ridaforolimus的组合的协同作用。
化合物1为pan-FGFR抑制剂,其在多种FGFR-驱使的肿瘤模型中具有强效活性。化合物1对FGFR2信号传导以及mTOR抑制剂(例如ridaforolimus)对mTOR信号传导的双重抑制,导致在体外的FGFR2-驱使的子宫内膜癌模型和体内的肿瘤消退中产生协同活性。
这些数据提供了化合物1与mTOR抑制剂的组合在治疗与病理性细胞增殖相关的疾病中的用途,所述疾病例如新生瘤、癌症,和与病理性血管生成有关的病症。可以使用本发明的组合物、方法或试剂盒治疗的癌症的非限制性实例包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、头颈癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌或皮肤癌;鳞状细胞癌;子宫内膜癌;多发性骨髓瘤;淋巴系统的造血系统肿瘤(例如,白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤或伯基特淋巴瘤);骨髓系统的造血系统肿瘤(例如,急性髓性白血病、慢性髓性白血病、多发性髓性白血病、骨髓增生异常综合征或前髓细胞性白血病);间质起源的肿瘤(例如,纤维肉瘤或横纹肌肉瘤);中枢或外周神经系统的肿瘤(例如,星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤或神经鞘瘤);黑色素瘤;精原细胞瘤;畸胎癌;骨肉瘤;以及卡波西肉瘤。可以使用本发明的组合物、方法或试剂盒治疗的与异常血管生成有关的病症的非限制性实例包括实体瘤、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、慢性炎症、肥胖症、黄斑变性,以及心血管疾病。
其它实施方式
在本说明书中提到的所有公开、专利和专利申请在此引入作为参,犹如各篇独立的公开或专利申请被具体地和单独地指出引入参考。2009年10月30日提交的美国临时专利申请61/256,669,2009年10月30日提交的61/256,690,以及2009年11月13日提交的61/261,014在此引入作为参考。
虽然本发明已经结合其具体实施方式进行了公开,但是需要理解其可能包括其它改进,且本申请既定包括本发明的任何变更、使用或改编,只要在大体上遵循本发明的原理,且包括来自本领域已知和通常实践的偏离本发明公开的属于本发明且可应用于上文提及的主要特征的那些内容,并遵循权利要求的范围。
其它实施方式在权利要求书中给出。
Claims (27)
1.适于口服给药的药物组合物,其包含化合物1或其药学上可接受的盐,以及一种或多种药学上可接受的赋形剂,其中当给予至受试者时,所述化合物1或其药学上可接受的盐的量有效治疗新生瘤、癌症或过度增生性疾病。
2.权利要求1的药物组合物,其包含化合物1的盐酸盐。
3.权利要求1或2的药物组合物,其配制为单位剂量形式。
4.权利要求3的药物组合物,其包含30至300mg的化合物1。
5.权利要求3的药物组合物,其包含20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg或45±9mg的化合物1。
6.权利要求1或2的药物组合物,其配制为固体单位剂量形式。
7.权利要求6的药物组合物,其中所述的固体单位剂量形式为片剂,软胶囊或硬胶囊。
8.权利要求6的药物组合物,其包含30至300mg的化合物1。
9.权利要求6的药物组合物,其包含20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg或45±9mg的化合物1。
10.一种在有此需要的受试者中治疗新生瘤、癌症或过度增生性疾病的方法,所述方法包括向所述受试者口服给予30至300mg的化合物1或其药学上可接受的盐。
11.权利要求10的方法,其中向所述受试者以单位剂量形式口服给予20±4mg、25±5mg、30±6mg、40±8mg或45±9mg的化合物1或其药学上可接受的盐的平均日剂量。
12.权利要求10的方法,其中化合物1或其药学上可接受的盐,每周给予所述受试者多于1天或每7天时间给予所述受试者平均4至7次。
13.权利要求12的方法,其中向所述受试者每天给予化合物1或其药学上可接受的盐。
14.权利要求10-13中任一项的方法,其中所述受试者患有慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌或胶质母细胞瘤。
15.权利要求14的方法,其中所述受试者患有慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病。
16.权利要求10-15中任一项的方法,其中所述受试者患有对使用伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼的治疗顽固的病症。
17.权利要求10-16中任一项的方法,其中所述受试者患有费城染色体阳性病症。
18.权利要求10-14中任一项的方法,其中所述受试者患有对使用VEGF或VEGF-R抑制剂或拮抗剂的治疗顽固的实体癌。
19.权利要求18的方法,其中所述实体癌对于贝伐单抗、索拉非尼或舒尼替尼的治疗是顽固的。
20.权利要求10-17中任一项的方法,其中所述受试者患有表达BCR-ABL突变株的癌症。
21.权利要求20的方法,其中所述BCR-ABL突变株为BCR-ABLT315I、BCR-ABLF317L或BCR-ABLF359C。
22.权利要求10-19中任一项的方法,其中所述受试者患有表达FLT3、KIT、FGFR1或PDGFRα突变株的癌症。
23.权利要求22的方法,其中所述的突变株为FLT3-ITD、c-KIT、FGFR1OP2-FGFR1或F1P1L1-PDGFRα。
24.权利要求10-23中任一项的方法,其中所述化合物1或其药学上可接受的盐,与mTOR抑制剂一起或并行给药,且各自以一起有效治疗所述新生瘤、癌症或过度增生性疾病的量给药。
25.权利要求24的方法,其中所述mTOR抑制剂选自西罗莫司、依维莫司、坦罗莫司、ridaforolimus、biolimus、佐他莫司、LY294002、Pp242、WYE-354、Ku-0063794、XL765、AZD8055、NVP-BEZ235、OSI-027、渥曼青霉素、槲皮素、杨梅苷和星状孢子素及其药学上可接受的盐。
26.试剂盒,其包括
(i)化合物1或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的适于口服给药的药物组合物,其中所述化合物1或其药学上可接受的盐的药物组合物的量为当给予至受试者时有效治疗新生瘤、癌症或过度增生性疾病的量;和
(ii)用于向受试者说明给药所述药物组合物以治疗所述新生瘤、癌症或过度增生性疾病的说明书。
27.权利要求26的试剂盒,其中所述受试者患有慢性髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、胃癌、子宫内膜癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌或胶质母细胞瘤。
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