JP2013509444A - がんの治療方法及び治療用組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、３−(イミダゾ[１,２−ｂ]ピリダジン−３−イルエチニル)−４−メチル−Ｎ−(４−((４−メチルピペラジン−１−イル)−メチル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)ベンズアミドを用いたがん治療のための方法、キット及び薬剤組成物に関する。

Description

本発明は、新生物、がん及び病的血管新生に関係する疾患といった病的細胞増殖に関係する疾患の治療のためのマルチキナーゼ阻害剤ポナチニブ(ponatinib)(「化合物１」)に基づく薬剤組成物及び治療方法に関する。
プロテインキナーゼは多様な細胞プロセスの調節に中心的な役割を果たす大きな群のタンパク質である。そのようなキナーゼの一部の制限的ではないリストとしては、ａｂｌ、Ａｋｔ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｂｌｋ、Ｂｒｋ、ｃ−ＫＩＴ、ｃ−ｍｅｔ、ｃ−ｓｒｃ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９、ＣＤＫ１０、ｃＲａｆ１、ＣＳＫ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｅｒｋ、Ｐａｋ、ｆｅｓ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ５、Ｆｇｒ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、Ｆｐｓ、Ｆｒｋ、Ｆｙｎ、Ｈｃｋ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＮＳ−Ｒ、Ｊａｋ、ＫＤＲ、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ、ＭＥＫ、ｐ３８、ＰＤＧＦＲ、ＰＩＫ、ＰＫＣ、ＰＹＫ２、ｒｏｓ、ｔｉｅ、ｔｉｅ２、ＴＲＫ及びＺａｐ７０が挙げられる。異常なプロテインキナーゼ活性は、乾癬のような生命を脅かさない疾患から「がん」のような極めて深刻な疾患に及ぶいくつかの疾患に関係してきた。
これまでにもキナーゼ阻害剤が開発され、治療に使用されて、いくつかの重要な成功を収めてきた。しかし、標的とした患者の全てがそのようなキナーゼ阻害剤に反応したわけではなく、一部の患者では、ある阻害剤に対して、そのキナーゼにおける突然変異の出現又は他の機序により治療抵抗性（無反応性、難治性）となることもある。現在認可されているキナーゼ阻害剤は、問題となる副作用を生ずることがあり、患者によっては、その阻害剤に不耐性（intolerant）であるか、不耐性になることがある。残念ながら、新規かつより良好な治療に対するまだ対処できていない意義ある医療上の必要性が存在する。
例えば、異常チロシンキナーゼであるＢＣＲ−ＡＢＬは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及びフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）の特徴である。ＢＣＲ−ＡＢＬのチロシン阻害剤（「ＴＫＩ」）であるイマチニブによる治療を受けた患者の一部は、イマチニブに対する耐性を発現する。イマチニブ耐性はＢＣＲ−ＡＢＬの多様な突然変異の出現に結びつけられてきた。第二世代のＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤であるダサチニブ及びニロチニブも重要な貢献をし、多くの変異ＢＣＲ−ＡＢＬ種を阻害するが、少なくとも１つのそのような変異種であるＴ３１５Ｉ変異体に対してはなお無効である。現在、第二世代のＴＫＩが成功しなかったＣＭＬ又はＰｈ＋急性骨髄性白血病患者に対する標準的な治療法は存在しない。重要なことは、現在認可されている全てのＴＫＩに耐性をもつ変異体であるＴ３１５Ｉ変異を有する患者に対しては、利用可能な分子標的治療法がないことである。
多くのがんの発生及び進行に関与するチロシンキナーゼの他の例としては、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、及びアンギオポイエチン受容体ＴＩＥ２が挙げられる。
内部タンデム複製（ＩＴＤ）に起因するＦＬＴ３の構成的活性化は、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）患者の約１／３にみられる。
線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）は、子宮体がん（子宮内膜がん）、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及び胃がんを含むいくつかの充実性腫瘍、並びに多発性骨髄腫において活性化されることが知られている。
ＶＥＧＦＲ及び他のキナーゼにより媒介される異常な血管新生は、グリア芽細胞腫及び大腸がん（結腸直腸がん）のような各種のがん、並びに多様な他の増殖性疾患にも関与する。
プロテインキナーゼ自体及びその関連疾患の数の多さを考えると、とりわけＢＣＬ−ＡＢＬT315Iを阻害することができるＡＢＬ阻害剤を含む、多様なプロテインキナーゼに対して選択性を有し、従って関連する疾患の治療に有用であるかもしれない新規な阻害剤、若しくは阻害剤の組み合わせに対する要望は常に存在している。
本発明は、有効な経口活性阻害剤であるポナチニブ（化合物１）及びその薬剤組成物及び用途に関する。化合物１の非常に有望な薬理活性プロフィールは、生化学試験、細胞系実験、動物実験及び現在までのヒトの臨床試験結果に基づいて具体的に明らかとなってきた。
以下により詳細に開示するように、化合物１は、経口活性のマルチターゲット（多標的化）キナーゼ阻害剤である。この化合物は、これまでに報告された最も高効力のＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤であり、他の薬剤には耐性であって現在では治療できないＴ３１５Ｉ変異体を含む、あらゆる既知の標的変異形態を阻害することができる、最初の汎ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤（pan-BCR-ABL inhibitor）である。この化合物は、第１相（フェーズ１）臨床試験において、ダサチニブ及びニロチニブが有効ではない患者を含む、難治性血液がん患者（多数のＣＭＬ及びＰｈ＋ＡＬＬ患者を含む）において、魅力ある安全性プロフィールと十分な抗白血病活性とを実証した。
化合物１の薬物動態学的及び薬力学的特性（これは体内でのそのキナーゼ阻害活性、吸収、分布、代謝及び排出の総和を表す）は、標的キナーゼを阻害する（ＢＣＲ−ＡＢＬの場合には、耐性変異体を発現する細胞の増殖を抑制する）のに有効な濃度を達成することができる経口で生物学的利用が可能な化合物の特性を示す。現在までの魅力的な安全性プロフィールは、正常な機能に必要なキナーゼ活性の意図しない不適当な阻害を伴わずにそれらの目的を達成する際の成功をもたらす。
この選択性及び安全性プロフィールの意義は、ＢＣＲ−ＡＢＬ及びその変異体を超える多様なキナーゼを阻害する化合物１の強力な活性により強調される。例えば、化合物１はＦＬＴ３、ＦＧＦ受容体ファミリーの４種類すべて、３種類のＶＥＧＦ受容体のすべて、アンギオポイエチン受容体ＴＩＥ２を阻害したが、インスリン受容体、オーロラキナーゼ、及びサイクリン依存性キナーゼファミリーを含む数多くの他種類のキナーゼに対して不活性であった。
従って、本発明は、次式で示される３−(イミダゾ[１,２−ｂ]ピリダジン−３−イルエチニル)−４−メチル−Ｎ−(４−((４−メチルピペラジン−１−イル)−メチル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)ベンズアミド（化合物１）又はその薬学的に許容される塩を含有する薬剤組成物及びキット、並びにがん及び他の疾患の治療用へのその治療用途を特徴とする。
よって、本発明の１側面は、被治療者に投与された時に新生物、がん又は過剰増殖性疾患を治療するのに有効な量の化合物１又はその薬学的に許容される塩と１種又は２種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む経口投与に適した薬剤組成物に関する。化合物１又はその薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸塩であることができる。特定の態様では、この薬剤組成物は単位剤形に処方される。或る種の態様では、単位剤形は３０〜３００ｍｇの化合物１を含有することができる。例示の単位剤形は、化合物１又はその薬学的に許容される塩を５〜１００ｍｇ、５〜８０ｍｇ、５〜５０ｍｇ、５〜２０ｍｇ、７〜１００ｍｇ、７〜８０ｍｇ、７〜５０ｍｇ、７〜２０ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、１０〜８０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、１５〜１００ｍｇ、１５〜８０ｍｇ、１５〜６０ｍｇ、１５〜５０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの量で含んでいる。別の態様では、単位剤形の含有量は２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇとすることができる。単位剤形を例示すると、化合物１又はその薬学的に許容される塩の含有量が５±１ｍｇ、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇであるものが挙げられる。
別の態様では、薬剤組成物は固体の単位剤形（例、錠剤、軟カプセル又は硬カプセル）の形態に処方される。或る種の態様では、この単位剤形は３０〜３００ｍｇの化合物１を含有することができる。例示の単位剤形は、化合物１又はその薬学的に許容される塩を５〜１００ｍｇ、５〜８０ｍｇ、５〜５０ｍｇ、５〜２０ｍｇ、７〜１００ｍｇ、７〜８０ｍｇ、７〜５０ｍｇ、７〜２０ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、１０〜８０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、１５〜１００ｍｇ、１５〜８０ｍｇ、１５〜６０ｍｇ、１５〜５０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの量で含んでいる。別の態様では、この単位剤形の含有量は５±１ｍｇ、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇとすることができる。この単位剤形を例示すると、化合物１又はその薬学的に許容される塩の含有量が５±１ｍｇ、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇであるものが挙げられる。
別の側面では、本発明は、治療を要する被治療者の新生物、がん又は過剰増殖性疾患の治療方法であって、該被治療者に３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を経口投与することによる方法に関する。例示の単位剤形は、化合物１又はその薬学的に許容される塩を５〜１００ｍｇ、５〜８０ｍｇ、５〜５０ｍｇ、５〜２０ｍｇ、７〜１００ｍｇ、７〜８０ｍｇ、７〜５０ｍｇ、７〜２０ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、１０〜８０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、１５〜１００ｍｇ、１５〜８０ｍｇ、１５〜６０ｍｇ、１５〜５０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの量で含んでいる。別の態様では、この単位剤形の含有量は５±１ｍｇ、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇとすることができる。この単位剤形を例示すると、化合物１又はその薬学的に許容される塩の含有量が５±１ｍｇ、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇであるものが挙げられる。
特定の態様では化合物１又はその薬学的に許容される塩の３０〜３００ｍｇの平均日用量（例、化合物１又はその薬学的に許容される塩の２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの平均日用量；又は化合物１又はその薬学的に許容される塩の２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの平均日用量）を単位剤形の形態で被治療者に経口投与する。
化合物１又はその薬学的に許容される塩は、１週間に１日より多く、又は７日ごとに平均で４〜７回（例、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回）被治療者に投与することができる。或る種の態様では、化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に毎日投与する。
特定の態様では、被治療者は慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、脊髄異形成症候群、胃がん、子宮体がん、膀胱がん、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、腎臓がん、又は神経膠芽腫に罹患している。さらに別の態様では、被治療者はイマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に抵抗性（難治性）の状態にある。さらなる態様では、被治療者はイマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に不耐性の状態にある。別の態様では、被治療者はフィラデルフィア染色体陽性状態にある。さらに別の態様では、被治療者はＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤又はアンタゴニスト（例、ベバシズマブ、ソラフェニブ、又はスニチニブ）による治療に抵抗性の充実性（固体）がんに罹患している。さらなる態様では、被治療者はＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤又はアンタゴニスト（例、ベバシズマブ、ソラフェニブ、又はスニチニブ）による治療に不耐性の状態にある。一部の態様では、被治療者はＢＣＲ−ＡＢＬ変異体（例、ＢＣＲ−ＡＢＬＴ315I、ＢＣＲ−ＡＢＬF317L、又はＢＣＲ−ＡＢF359C）を発現するがんに罹患している。別の態様では、被治療者は、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＦＧＦＲ１、又はＰＤＧＦＲα変異体（例、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ｃ−ＫＩＴ、ＦＧＦＲ１ＯＰ２−ＦＧＦＲ１、又はＦ１Ｐ１Ｌ１−ＰＤＧＦＲα）を発現するがんに罹患している。さらなる態様では、化合物１又はその薬学的に許容される塩をｍＴＯＲ阻害剤と一緒に又は併用して、それぞれ当該新生物、がん、又は過剰増殖性疾患の治療に一緒にした時に有効な量で投与する。一部の態様では、ｍＴＯＲ阻害剤は、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、バイオオリムス、ゾタロリムス、ＬＹ２９４００２、Ｐｐ２４２、ＷＹＥ−３５４，Ｋｕ−００６３７９４、ＸＬ７６５、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＯＳＩ−０２７、ワートマンニン、クエルセチン、ミリセンチン（myricentin）、及びスタウロスポリン並びにそれらの薬学的に許容される塩から選ばれる。
さらなる態様では、本発明は、(ｉ)被治療者に投与された時に新生物、がん又は過剰増殖性疾患を治療するのに有効な量の化合物１又はその薬学的に許容される塩と１種又は２種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む経口投与に適した薬剤組成物，並びに(ii)この薬剤組成物を新生物、がん又は過剰増殖性疾患の治療のために被治療者に投与するための使用説明書を備えたキットに関する。一部の態様では、被治療者は慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、脊髄異形成症候群、胃がん、子宮体がん、膀胱がん、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、腎臓がん、又は神経膠芽腫に罹患している。
さらに別の側面では、本発明は、治療を要する被治療者の新生物、がん又は過剰増殖性疾患を、５〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を該被治療者に経口投与することにより治療する方法に関する。例示の単位剤形は、化合物１又はその薬学的に許容される塩を５〜１００ｍｇ、５〜８０ｍｇ、５〜５０ｍｇ、５〜２０ｍｇ、７〜１００ｍｇ、７〜８０ｍｇ、７〜５０ｍｇ、７〜２０ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、１０〜８０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、１５〜１００ｍｇ、１５〜８０ｍｇ、１５〜６０ｍｇ、１５〜５０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの量で含んでいる。別の態様では、この単位剤形は、化合物１又はその薬学的に許容される塩を５±１ｍｇ、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの量で含有しうる。
特定の態様では化合物１又はその薬学的に許容される塩の５〜３００ｍｇ平均日用量（例、化合物１又はその薬学的に許容される塩の５〜１００ｍｇ、５〜８０ｍｇ、５〜５０ｍｇ、５〜２０ｍｇ、７〜１００ｍｇ、７〜８０ｍｇ、７〜５０ｍｇ、７〜２０ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、１０〜８０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、１５〜１００ｍｇ、１５〜８０ｍｇ、１５〜６０ｍｇ、１５〜５０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの平均日用量；又は化合物１又はその薬学的に許容される塩の５±１ｍｇ、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの平均日用量）を単位剤形の形態で被治療者に経口投与する。
さらなる態様では、上記方法は、化合物１について４０〜６００ｎＭの平均定常状態トラフ(trough) 濃度を生ずる量、投与頻度及び投与期間で化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に投与することにより該被治療者のがん細胞の増殖を阻害する；化合物１について４０〜６００ｎＭの平均定常状態トラフ濃度を生ずる量、投与頻度及び投与期間で化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に投与することにより該被治療者の血管新生を阻害する；３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を、必要とする被治療者に毎日経口投与することにより該被治療者の血管新生を阻害する；化合物１について４０〜６００ｎＭの平均定常状態トラフ濃度を生ずる量、投与頻度及び投与期間で化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に投与することにより該被治療者のＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖を阻害する；ＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖を、必要とする抵抗性サブクローンの出現を抑制するのに十分な量の化合物１又はその薬学的に許容される塩に該細胞を接触させることによって、抵抗性サブクローンの出現を抑制しながら阻害する；複合変異体（compound mutant）の出現を抑制しながらＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖を阻害する、本方法は、複合変異体の出現を抑制するのに十分な量の化合物１又はその薬学的に許容される塩に該細胞を接触させることを含む；３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を、必要とする被治療者に毎日経口投与することにより該被治療者のＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞又はその変異体の増殖を阻害する；又は３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を、必要とする被治療者に毎日経口投与することにより該被治療者の変異体発現性細胞の増殖を阻害することを含む。
ここに述べた側面のいずれにおいても、単位剤形及び平均日用量における化合物１の量は、より低い投与量（例、小児用のより低い投与量）に変更することができる。一部の態様では、単位剤形は５〜３００ｍｇ又は平均日用量は５〜３００ｍｇを含有する。或る種の態様では、単位剤形は５〜１００ｍｇ、５〜８０ｍｇ、５〜５０ｍｇ、５〜２０ｍｇ、７〜１００ｍｇ、７〜８０ｍｇ、７〜５０ｍｇ、７〜２０ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、１０〜８０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、１５〜１００ｍｇ、１５〜８０ｍｇ、１５〜６０ｍｇ、１５〜５０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含有しうる。例示の単位剤形は、５±１ｍｇ、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの化合物１またはその薬学的に許容される塩を有するものである。
１側面において、本発明は、３０〜３００ｍｇの化合物１またはその薬学的に許容されるを含有する単位剤形の形態の経口投与用に処方された薬剤組成物に関する。特定の態様では、この単位剤形形態は、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含有しうる。特定の態様では、単位剤形は２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含有しうる。化合物１又はその薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸塩であることができる。
別の側面において、本発明は、化合物１について４０〜６００ｎＭの平均定常状態トラフ濃度を生ずる量、投与頻度及び投与期間で化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に投与することにより該被治療者のがん細胞の増殖を阻害する方法に関する。或る種の態様では、この化合物１の平均定常状態トラフ濃度は４０〜２００ｎＭ、５０〜２００ｎＭ、６０〜２００ｎＭ、７０〜２００ｎＭ、８０〜２００ｎＭ、９０〜２００ｎＭ、４０〜１２０ｎＭ、５０〜１２０ｎＭ、６０〜１２０ｎＭ、７０〜１２０ｎＭ、８０〜１２０ｎＭ、２００〜６００ｎＭ、２２０〜６００ｎＭ、２４０〜６００ｎＭ、２５０〜６００ｎＭ、２７０〜６００ｎＭ、２８０〜６００ｎＭ、２００〜４００ｎＭ、２００〜３００ｎＭ、２５０〜４００ｎＭ、３００〜５００ｎＭ、３５０〜５５０ｎＭ、４００〜６００ｎＭ、又は４５０〜６００ｎＭである。化合物１又はその薬学的に許容される塩は、７日ごとに平均で４〜７回（例、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回）該被治療者に投与することができる。或る種の態様では、化合物１又はその薬学的に許容される塩を該被治療者に毎日投与する。
特定の態様では化合物１又はその薬学的に許容される塩の３０〜３００ｍｇの平均日用量（例、化合物１又はその薬学的に許容される塩の２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの平均日用量；又は化合物１又はその薬学的に許容される塩の２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの平均日用量）を単位剤形の形態で該被治療者に経口投与する。特定の態様では、被治療者は、胃がん、子宮体がん、膀胱がん、多発性骨髄腫、乳がん、又は本書に記載した他のがんに罹患している。別の態様では、被治療者は慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、又は急性骨髄性白血病に罹患している。さらに別の態様では、被治療者は脊髄異形成症候群（例、第１群芽球過剰の不反応性貧血（ＲＡＥＢＩ）又は第２群芽球過剰の不反応性貧血（ＲＡＥＢII））に罹患している。
別の側面において、本発明は、３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を、必要とする被治療者に毎日経口投与することにより該被治療者のがん細胞の増殖を阻害する方法に関する。或る種の態様では、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に毎日経口投与する。特定の態様では、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に毎日経口投与する。特定の態様では、被治療者は、胃がん、子宮体がん、膀胱がん、多発性骨髄腫、乳がん、又は本書に記載した他のがんに罹患している。別の態様では、被治療者は慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病又は急性骨髄性白血病に罹患している。さらに別の態様では、被治療者は脊髄異形成症候群（例、第１群芽球過剰の不反応性貧血（ＲＡＥＢＩ）又は第２群芽球過剰の不反応性貧血（ＲＡＥＢII））に罹患している。
別の側面では、本発明は、化合物１について４０〜６００ｎＭの平均定常状態トラフ濃度を生ずる量、投与頻度及び投与期間で化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に投与することにより該被治療者の血管新生を阻害する方法に関する。或る種の態様では、この化合物１の平均定常状態トラフ濃度は４０〜２００ｎＭ、５０〜２００ｎＭ、６０〜２００ｎＭ、７０〜２００ｎＭ、８０〜２００ｎＭ、９０〜２００ｎＭ、４０〜１２０ｎＭ、５０〜１２０ｎＭ、６０〜１２０ｎＭ、７０〜１２０ｎＭ、８０〜１２０ｎＭ、２００〜６００ｎＭ、２２０〜６００ｎＭ、２４０〜６００ｎＭ、２５０〜６００ｎＭ、２７０〜６００ｎＭ、２８０〜６００ｎＭ、２００〜４００ｎＭ、２００〜３００ｎＭ、２５０〜４００ｎＭ、３００〜５００ｎＭ、３５０〜５５０ｎＭ、４００〜６００ｎＭ、又は４５０〜６００ｎＭである。化合物１又はその薬学的に許容される塩は、７日ごとに平均で４〜７回（例、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回）該被治療者に投与することができる。或る種の態様では、化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に毎日投与する。
特定の態様では化合物１又はその薬学的に許容される塩の３０〜３００ｍｇの平均日用量（例、化合物１又はその薬学的に許容される塩の２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの平均日用量；又は化合物１又はその薬学的に許容される塩の２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの平均日用量）を単位剤形の形態で被治療者に経口投与する。特定の態様では、被治療者は、前立腺がん、肺がん、乳がん、大腸がん、腎臓がん、又は神経膠芽腫に罹患している。さらに別の態様では、被治療者は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤又はアンタゴニスト（例、ベバシズマブ、ソラフェニブ、又はスニチニブ）による治療に抵抗性の充実性がんに罹患している。さらに別の態様では、被治療者はＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤又はアンタゴニスト（例、ベバシズマブ、ソラフェニブ、又はスニチニブ）による治療に不耐性の充実性がんに罹患している。或る種の態様では、被治療者は、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、黄斑変性症、又は心血管疾患のような病的（aberrant）血管新生に関連する疾患を有する。
別の側面において、本発明は、３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を、必要とする被治療者に毎日経口投与することにより、該被治療者の血管新生を阻害する方法に関する。或る種の態様では、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に毎日経口投与する。特定の態様では、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に毎日経口投与する。特定の態様では、被治療者は、前立腺がん、肺がん、乳がん、大腸がん、腎臓がん、又は神経膠芽腫に罹患している。さらに別の態様では、被治療者は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤又はアンタゴニスト（例、ベバシズマブ、ソラフェニブ、又はスニチニブ）による治療に抵抗性の充実性がんに罹患している。さらに別の態様では、被治療者はＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤又はアンタゴニスト（例、ベバシズマブ、ソラフェニブ、又はスニチニブ）による治療に不耐性の充実性がんに罹患している。或る種の態様では、被治療者は、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、黄斑変性症、又は心血管疾患のような異常（病的な）血管新生に関連する疾患を有する。
別の側面において、本発明は、(i)３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含んでいる単位剤形の形態で経口投与用に処方された薬剤組成物，並びに(ii)がんの治療又は病的血管新生に関する疾患の治療のために被治療者にこの薬剤組成物を投与するための使用説明書を備えたキットに関する。或る種の態様では、前記単位剤形は、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含有しうる。特定の態様では、前記単位剤形は、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含有しうる。特定の態様では、被治療者は、胃がん、子宮体がん、膀胱がん、多発性骨髄腫、乳がん、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、脊髄異形成症候群（例、第１群芽球過剰の不反応性貧血（ＲＡＥＢＩ）又は第２群芽球過剰の不反応性貧血（ＲＡＥＢII））、又は本書に記載した他のがんに罹患している。或る種の態様では、被治療者は、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、黄斑変性症、又は心血管疾患に罹患している。
別の側面では、本発明は、化合物１について４０〜６００ｎＭの平均定常状態トラフ濃度を生ずる量、投与頻度及び投与期間で化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に投与することにより被治療者のＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖を阻害する方法に関する。或る種の態様では、化合物１の平均定常状態トラフ濃度は４０〜２００ｎＭ、５０〜２００ｎＭ、６０〜２００ｎＭ、７０〜２００ｎＭ、８０〜２００ｎＭ、９０〜２００ｎＭ、４０〜１２０ｎＭ、５０〜１２０ｎＭ、６０〜１２０ｎＭ、７０〜１２０ｎＭ、８０〜１２０ｎＭ、２００〜６００ｎＭ、２２０〜６００ｎＭ、２４０〜６００ｎＭ、２５０〜６００ｎＭ、２７０〜６００ｎＭ、２８０〜６００ｎＭ、２００〜４００ｎＭ、２００〜３００ｎＭ、２５０〜４００ｎＭ、３００〜５００ｎＭ、３５０〜５５０ｎＭ、４００〜６００ｎＭ、又は４５０〜６００ｎＭである。化合物１またはその薬学的に許容される塩は、耐性サブクローンの出現を抑制するのに十分な量、または複合変異体の出現を抑制するのに十分な量で投与することができる。化合物１又はその薬学的に許容される塩は、７日ごとに平均で４〜７回（例、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回）の頻度で、２週間、１カ月、２カ月、４カ月、８カ月、１年、又は１８カ月の連続治療を含む期間にわたって被治療者に投与することができる。或る種の態様では、化合物１又はその薬学的に許容される塩は被治療者に毎日投与される。
特定の態様では化合物１又はその薬学的に許容される塩の３０〜３００ｍｇの平均日用量（例、化合物１又はその薬学的に許容される塩の２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの平均日用量；又は化合物１又はその薬学的に許容される塩の２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの平均日用量）を単位剤形の形態で被治療者に経口投与する。特定の態様では、被治療者は、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、又は急性骨髄性白血病から選ばれた疾患に罹患している。さらに別の態様では、前記疾患は化合物１以外の別のキナーゼ阻害剤による治療に抵抗性（例、イマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に抵抗性）である。さらに別の態様では、被治療者は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤又はアンタゴニスト（例、ベバシズマブ、ソラフェニブ、又はスニチニブ）による治療に不耐性の充実性がんに罹患している。
別の側面では、本発明は、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖を、該細胞を抵抗性サブクローンの出現を抑制するのに十分な量の化合物１又はその薬学的に許容される塩と接触させることにより、抵抗性サブクローンの出現を抑制しながら阻害する方法に関する。該細胞は、２０〜３２０ｎＭ、３０〜３２０ｎＭ、２０〜２２０ｎＭ、３０〜２２０ｎＭ、２０〜１２０ｎＭ、３０〜１２０ｎＭ、４０〜３２０ｎＭ、４０〜２２０ｎＭ、４０〜１２０ｎＭ、５０〜３２０ｎＭ、５０〜２２０ｎＭ、５０〜１２０ｎＭ、７０〜３２０ｎＭ、７０〜２２０ｎＭ、９０〜３２０ｎＭ、９０〜２２０ｎＭ、１１０〜３２０ｎＭ、又は１１０〜２２０ｎＭの化合物１又はその薬学的に許容される塩と接触させることができる。該細胞と化合物１又はその薬学的に許容される塩との接触は、２週間、１カ月、２カ月、４カ月、８カ月、１年、又は１８カ月の連続露出を含む期間にわたって行うことができる。
別の側面では、本発明は、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖を、該細胞を複合変異体の出現を抑制するのに十分な量の化合物１又はその薬学的に許容される塩と接触させることにより、複合変異体の出現を抑制しながら阻害する方法に関する。該細胞は、１６０ｎＭ〜１μＭ、２６０ｎＭ〜１μＭ、３６０ｎＭ〜１μＭ、１６０〜８００ｎＭ、２６０〜８００ｎＭ、３６０〜８００ｎＭ、１６０〜６００ｎＭ、２６０〜６００ｎＭ、３６０〜６００ｎＭ、１６０〜４００ｎＭ、２６０〜４００ｎＭ、３６０〜５００ｎＭ、又は４６０〜６００ｎＭの化合物１又はその薬学的に許容される塩と接触させることができる。該細胞と化合物１又はその薬学的に許容される塩との接触は、２週間、１カ月、２カ月、４カ月、８カ月、１年、又は１８カ月の連続露出を含む期間にわたって行うことができる。
上記方法のいずれにおいても、前記細胞は、化合物１以外のキナーゼ阻害剤による治療に抵抗性（例、イマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に抵抗性）のものであることができる。上記方法のいずれにおいても、前記細胞は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤又はアンタゴニスト（例、ベバシズマブ、ソラフェニブ、又はスニチニブ）による治療に不耐性のものであることができる。
別の側面において、本発明は、３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を、必要とする被治療者に毎日経口投与することにより該被治療者のＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖を阻害する方法に関する。或る種の態様では、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に毎日経口投与する。特定の態様では、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に毎日経口投与する。
化合物１又はその薬学的に許容される塩の投与は、抵抗性サブクローンの出現を抑制するのに十分な量で、又は複合変異体の出現を抑制するのに十分な量で行うことができる。特定の態様では、被治療者は慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病又は急性骨髄性白血病から選ばれた疾患に罹患している。さらに別の態様では、前記疾患は、化合物１以外のキナーゼ阻害剤による治療に抵抗性のもの（例、イマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に抵抗性の疾患）である。さらに別の態様では、前記疾患は、化合物１以外のキナーゼ阻害剤による治療に不耐性のもの（例、イマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に不耐性の疾患）である。化合物１又はその薬学的に許容される塩は、７日ごとに平均で４〜７回（例、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回）の頻度で、２週間、１カ月、２カ月、４カ月、８カ月、１年、又は１８カ月の連続治療を含む期間にわたって被治療者に投与することができる。或る種の態様では、化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に投与することができる。或る種の態様では、化合物１又はその薬学的に許容される塩は被治療者に毎日投与される。
別の側面では、本発明は、（ｉ）３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含んでいる単位剤形の形態で経口投与用に処方された薬剤組成物、並びに（ii）ＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖に関連する疾患に罹患した被治療者にこの薬剤組成物を投与するための使用説明書、を備えたキットに関する。或る種の態様では、前記単位剤形は、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含有しうる。特定の態様では、前記単位剤形は、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含有しうる。化合物１又はその薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸塩であることができる。特定の態様では、被治療者は慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病又は急性骨髄性白血病から選ばれた疾患に罹患している。さらに別の態様では、前記疾患は、化合物１以外のキナーゼ阻害剤による治療に抵抗性のもの（例、イマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に抵抗性の疾患）である。さらに別の態様では、前記疾患は、化合物１以外のキナーゼ阻害剤による治療に不耐性のもの（例、イマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に不耐性の疾患）である。
別の側面において、本発明は、３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を、必要とする被治療者に毎日経口投与することにより該被治療者の変異体発現性細胞の増殖を阻害する方法に関する。或る種の態様では、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に毎日経口投与する。特定の態様では、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を被治療者に毎日経口投与する。
或る種の態様では、前記変異体は、ＦＬＴ３変異体（例、ＦＬＴ３−ＩＴＤ）、ＫＩＴ変異体（例、ｃ−ＫＩＴ若しくはＮ８２２Ｋ），ＦＧＦＲ１変異体（例、ＦＧＦＲ１ＯＰ２−ＦＧＦＲ１）、ＰＤＧＦＲα変異体（例、Ｆ１Ｐ１Ｌ１−ＰＤＧＦＲα）、又は本書に記載した任意の変異体である。別の態様では、被治療者は、急性骨髄性白血病又は脊髄異形成症候群（例、第１群芽球過剰の不反応性貧血（ＲＡＥＢＩ）又は第２群芽球過剰の不反応性貧血（ＲＡＥＢII））に罹患している。さらに別の態様では、前記疾患は、化合物１以外のキナーゼ阻害剤による治療に抵抗性のもの（例、イマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に抵抗性の疾患）である。さらに別の態様では、前記疾患は、化合物１以外のキナーゼ阻害剤による治療に不耐性のもの（例、イマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に不耐性の疾患）である。化合物１又はその薬学的に許容される塩は、７日ごとに平均で４〜７回（例、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回）の頻度で、２週間、１カ月、２カ月、４カ月、８カ月、１年、又は１８カ月の連続治療を含む期間にわたって被治療者に投与することができる。或る種の態様では、化合物１又はその薬学的に許容される塩は被治療者に毎日投与される。
１側面において、本発明は、化合物１又はその薬学的に許容される塩をｍＴＯＲ阻害剤と一緒に又は併用して、それぞれを一緒になった時にがんの治療に有効な量で被治療者に投与することにより、治療を要する被治療者のがんを治療する方法に関する。別の側面では、本発明は、化合物１又はその薬学的に許容される塩をｍＴＯＲ阻害剤と一緒に又は併用して、それぞれを一緒になった時に新生物の治療に有効な量で被治療者に投与することにより、治療を要する被治療者の新生物を治療する方法に関する。別の側面では、本発明は、化合物１又はその薬学的に許容される塩をｍＴＯＲ阻害剤と一緒に又は併用して、それぞれを一緒になった時に血管新生の阻害に有効な量で、必要とする被治療者に投与することにより該被治療者の血管新生を阻害する方法に関する。別の側面では、本発明は、化合物１又はその薬学的に許容される塩をｍＴＯＲ阻害剤と一緒に又は併用して、それぞれを一緒になった時に細胞増殖の阻害に有効な量で細胞と接触させることにより、細胞増殖を阻害する方法に関する。
以上の側面のいずれにおいても、ｍＴＯＲ阻害剤は、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、バイオリムス、ゾタロリムス、及びそれらの薬学的に許容される塩から選ばれるラパマイシン系マクロライドでよい。望ましくは、ｍＴＯＲ阻害剤はリダフォロシムス又はその薬学的に許容される塩である。別の態様では、ｍＴＯＲ阻害剤はＬＹ２９４００２、Ｐｐ２４２、ＷＹＥ−３５４，Ｋｕ−００６３７９４、ＸＬ７６５、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＯＳＩ−０２７、ワートマンニン、クエルセチン、ミリセンチン、及びスタウロスポリン並びにそれらの薬学的に許容される塩から選ばれる非ラパマイシンアナログである。
併用療法としては、化合物１又はその薬学的に許容される塩とｍＴＯＲ阻害剤とを、他方の投与から１２日以内、８日以内、５日以内、４日以内、３日以内、又は２日以内に併用して投与する；化合物１又はその薬学的に許容される塩とｍＴＯＲ阻害剤とを他方の投与から２４時間以内に併用して投与する；又は化合物１又はその薬学的に許容される塩とｍＴＯＲ阻害剤とを一緒に投与する投与計画を含むことができる。化合物１とｍＴＯＲ阻害剤とは、本書に記載したいずれかの投与計画を用いて本発明の併用療法として投与することができる。
ある種の態様では、化合物１又はその薬学的に許容される塩を低容量で投与する；又はｍＴＯＲ阻害剤を低容量で投与する；又は化合物１とｍＴＯＲ阻害剤とをどちらも低用量で投与する。
特定の態様では、上記併用療法は、化合物１又はその薬学的に許容される塩を、化合物１について４０〜６００ｎＭの平均定常状態トラフ濃度を生ずる量、投与頻度及び投与期間で被治療者に投与することを含む。例えば、この化合物１の平均定常状態トラフ濃度は１０〜１００ｎＭ、１０〜６０ｎＭ、１５〜１００ｎＭ、１５〜７０ｎＭ、２０〜１００ｎＭ、４０〜２００ｎＭ、５０〜２００ｎＭ、６０〜２００ｎＭ、７０〜２００ｎＭ、８０〜２００ｎＭ、９０〜２００ｎＭ、４０〜１２０ｎＭ、５０〜１２０ｎＭ、６０〜１２０ｎＭ、７０〜１２０ｎＭ、８０〜１２０ｎＭ、２００〜６００ｎＭ、２２０〜６００ｎＭ、２４０〜６００ｎＭ、２５０〜６００ｎＭ、２７０〜６００ｎＭ、２８０〜６００ｎＭ、２００〜４００ｎＭ、２００〜３００ｎＭ、２５０〜４００ｎＭ、３００〜５００ｎＭ、３５０〜５５０ｎＭ、４００〜６００ｎＭ、又は４５０〜６００ｎＭとすることがでる。化合物１又はその薬学的に許容される塩は、７日ごとに平均で４〜７回（例、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は１週間に７回）被治療者に投与することができる。或る種の態様では、化合物１又はその薬学的に許容される塩は被治療者に毎日投与される。
特定の態様では化合物１又はその薬学的に許容される塩の３０〜３００ｍｇの平均日用量（例、化合物１又はその薬学的に許容される塩の１０〜７０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、１０〜３０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの平均日用量；又は化合物１又はその薬学的に許容される塩の７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの平均日用量）を単位剤形の形態で被治療者に経口投与する。
本発明の併用療法は、膀胱、胸部（乳部）、大腸、腎臓、肝臓、肺、頭頚部、胆嚢、卵巣、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺、前立腺、又は皮膚のがん；扁平上皮がん；子宮内膜がん（子宮体がん）；多発性骨髄腫；リンパ系の造血腫瘍（例、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、ホジキン型白血病、非ホジキン型白血病、ヘアリー細胞白血病、若しくはバーキット白血病）；骨髄系の造血腫瘍（例、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、若しくは前骨髄球性白血病）；間葉由来の腫瘍（例、線維肉腫若しくは横紋筋肉腫）；中枢若しくは末梢神経系の腫瘍（例、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、若しくは神経鞘腫）；黒色腫（メラノーマ）；セミノーマ；奇形がん（テラトカルシノーマ）；骨肉腫；又はカポジ肉腫に罹患した被治療者の治療に用いることができる。ある種の態様では、被治療者は、非小細胞型肺がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、唾液腺がん、膵臓がん、子宮体がん、大腸がん、腎臓がん、頭頸部がん、胃がん、多発性骨髄腫、甲状腺濾過胞がん、又は多形性神経膠芽腫に罹患している。
本発明の併用療法は、病的血管新生に関連する疾患を有する被治療者を治療するのに使用することができる。病的血管新生に関連する疾患は、充実性腫瘍（例、前立腺がん、肺がん、乳がん、大腸がん、腎臓がん、神経膠芽腫又は本書に記載したいずれかの充実性腫瘍）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、黄斑変性症、或いは心血管疾患であってもよい。
関連する側面において、本発明は、化合物１若しくはその薬学的に許容される塩、ｍＴＯＲ阻害剤、並びに薬学的に許容される担体若しくは希釈剤を含む薬剤組成物に関する。或る種の態様では、ｍＴＯＲ阻害剤は、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、バイオリムス、ゾタロリムス、及びそれらの薬学的に許容される塩から選ばれるラパマイシン系マクロライドである。望ましくは、ｍＴＯＲ阻害剤はリダフォロシムス又はその薬学的に許容される塩である。別の態様では、ｍＴＯＲ阻害剤はＬＹ２９４００２、Ｐｐ２４２、ＷＹＥ−３５４，Ｋｕ−００６３７９４、ＸＬ７６５、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＯＳＩ−０２７、ワートマンニン、クエルセチン、ミリセンチン、スタウロスポリン及びそれらの薬学的に許容される塩から選ばれる非ラパマイシンアナログである。
本発明はさらに、(i)３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含んでいる単位剤形の形態で経口投与用に処方された薬剤組成物、並びに(ii)ｍＴＯＲ阻害剤を含んでいる第２の薬剤組成物を備え、第１の薬剤組成物と第２の薬剤組成物とが個々の投与量で別々に処方されているキットに関する。
本発明はまた、３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩と、ｍＴＯＲ阻害剤、とを含んでいる、単位剤形の形態で経口投与用に処方された薬剤組成物を備えているキットにも関する。
或る種の態様の上記キットでは、上記単位剤形は、１０〜７０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、１０〜３０ｍｇ、２０〜１００ｍｇ、２０〜８０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、３０〜１００ｍｇ、３５〜１００ｍｇ、４０〜１００ｍｇ、５０〜１００ｍｇ、６０〜１００ｍｇ、７０〜１００ｍｇ、３０〜８０ｍｇ、３５〜８０ｍｇ、４０〜８０ｍｇ、５０〜８０ｍｇ、６０〜８０ｍｇ、５０〜３００ｍｇ、６０〜３００ｍｇ、７０〜３００ｍｇ、５０〜２００ｍｇ、６０〜２００ｍｇ、７０〜２００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、１２０〜３００ｍｇ、１４０〜３００ｍｇ、又は１００〜２００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含有しうる。特定の態様では、上記単位剤形は、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、５５±１１ｍｇ、６０±１２ｍｇ、６５±１３ｍｇ、７０±１４ｍｇ、７５±１５ｍｇ、８０±１６ｍｇ、９０±１８ｍｇ、１００±２０ｍｇ、１２０±２４ｍｇ、１４０±２８ｍｇ、１６０±３２ｍｇ、１８０±３６ｍｇ、２００±４０ｍｇ、２２０±４４ｍｇ、２４０±４８ｇ、又は２６０±５２ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を含有しうる。
或る種の態様の上記キットでは、ｍＴＯＲ阻害剤は、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、バイオリムス、ゾタロリムス、及びそれらの薬学的に許容される塩から選ばれるラパマイシン系マクロライドである。別の態様の上記キットでは、ｍＴＯＲ阻害剤はＬＹ２９４００２、Ｐｐ２４２、ＷＹＥ−３５４，Ｋｕ−００６３７９４、ＸＬ７６５、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＯＳＩ−０２７、ワートマンニン、クエルセチン、ミリセンチン、及びスタウロスポリン並びにそれらの薬学的に許容される塩から選ばれる非ラパマイシンアナログである。
本発明のキットはさらに、化合物１又はその薬学的に許容される塩とｍＴＯＲ阻害剤とを、がんに罹患した被治療者（例、膀胱、胸部（乳部）、大腸、腎臓、肝臓、肺、頭頚部、胆嚢、卵巣、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺、前立腺、又は皮膚のがん；扁平上皮がん；子宮体がん；多発性骨髄腫；リンパ系の造血腫瘍（例、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、ホジキン型白血病、非ホジキン型白血病、ヘアリー細胞白血病、若しくはバーキット白血病）；骨髄系の造血腫瘍（例、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、若しくは前骨髄球性白血病）；間葉由来の腫瘍（例、線維肉腫若しくは横紋筋肉腫）；中枢若しくは末梢神経系の腫瘍（例、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、若しくは神経鞘腫）；黒色腫；セミノーマ；奇形がん；骨肉腫；又はカポジ肉腫に罹患した被治療者）の治療、或いは病的血管新生に関連する疾患（例、充実性腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、又は黄斑変性症）に罹患した被治療者の治療用に投与するための使用説明書を備えることができる。
本発明の上記方法において、化合物１及びｍＴＯＲ阻害剤の投与の用量及び投与頻度は互いに独立して調整することができる。例えば、一方の化合物を毎日経口投与する一方で、他方の化合物は１日に１回静脈内投与することができる。１回の投与で両方の化合物を送りこむように両化合物を一緒に処方することもできる。
ｍＴＯＲ阻害剤及び化合物１の代表的な投与量は、疾患の種類及び程度、被治療者の全般的な健康状態、選択したｍＴＯＲ阻害剤の治療指数、両化合物の投与経路などの因子に応じて変動しよう。標準的な臨床試験を用いて本発明の任意の具体的な組み合わせに対して用量及び投与頻度を最適化してもよい。
本発明において有用な化合物は、ジアステレオマー及びエナンチオマーのような異性体、異性体混合物、並びにそれらの塩を包含する、それらの薬学的に許容される任意の形態において本書に記載した化合物を包含する。
定義：
本書に用いた「ＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞」なる用語は、野生（非変性）型ＢＣＲ−ＡＢＬ、耐性サブクローン、又はＢＣＲ−ＡＢＬの複合変異体のいずれかを発現する細胞を意味する。
本書に用いた「平均定常状態トラフ濃度」とは、定常状態薬物動態を生ずるのに十分な期間にわたって投与された（例、２３日間の毎日の投与）本発明の治療法のための投与計画の一部として１群の被治療者について観察された化合物１の平均血漿中濃度を意味し、ここで平均トラフ濃度は、その投与計画の次に予定された投与直前（例１時間以内）の時点での被治療者全員を通しての平均血中濃度である（例、毎日の投与計画の場合、トラフ濃度は化合物１の投与から約２４時間後でその翌日の投与の直前に測定される）。
「複合変異体の出現を抑制するのに十分な量」とは、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖を阻害するのに必要な化合物１の最小濃度で見られる複合変異体の出現率に比較して、in vitro又はin vivoで複合変異体の出現を測定可能に低減する化合物１の量を意味する。
「耐性サブクローンの出現を抑制するのに十分な量」とは、ＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖を阻害するのに必要な化合物１の最小濃度で見られる耐性サブクローンの出現率に比較して、in vitro又はin vivoで耐性サブクローンの出現を測定可能に低減する化合物１の量を意味する。
「ＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖を阻害する」とは、in vitro又はin vivoにおけるＢＣＲ−ＡＢＬ細胞の成長速度を測定可能に遅くする、停止させる、又は逆転させることを意味する。望ましくは、この成長速度の遅速率は、細胞成長速度を測定するための適当なアッセイ法（例、本書に記載した細胞成長アッセイ法）を用いて測定した場合で、２０％以上、３０％以上、５０％以上、さらには７０％以上である。
「がん細胞の増殖を阻害する」とは、in vitro又はin vivoでがん細胞の成長速度を測定可能に遅くする、停止させる、又は逆転させることを意味する。望ましくは、この成長速度の遅速率は、細胞成長速度を測定するための適当なアッセイ法（例、本書に記載した細胞成長アッセイ法）を用いて測定した場合で、２０％以上、３０％以上、５０％以上、さらには７０％以上である。
「細胞の増殖を阻害する」とは、in vitro又はin vivoで細胞の成長速度を測定可能に遅くする、停止させる、又は逆転させることを意味する。望ましくは、この成長速度の遅速率は、細胞成長速度を測定するための適当なアッセイ法（例、本書に記載した細胞成長アッセイ法）を用いて測定した場合で、２０％以上、３０％以上、５０％以上、さらには７０％以上である。
「投与」又は「投与する」なる用語は、哺乳動物にある量の薬剤組成物を与える方法を意味し、ここで、該方法は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、動脈内、又は筋肉内である。好ましい投与方法は、例えば、薬剤組成物の成分、潜在的又は実際の疾患の部位、並びに疾患の重篤度といった多様な因子に依存して変動しうる。化合物１は一般的には経口投与されるが、他の投与経路も本発明の方法を実施するのに有用でありうる。
「単位剤形」なる用語は、丸剤、錠剤、カプレット剤、硬カプセル又は軟カプセルといった、一体化した投薬形態として適当な物理的に分離した単位を意味する。
本書で用いた「薬学的に許容される塩」なる用語は、製薬業界で慣用されている、無毒な酸付加塩又は金属複合体若しくは錯体といった、いずれかの薬学的に許容される塩を意味する。酸付加塩の例としては、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、若しくはトリフルオロ酢酸などの有機酸の塩、並びに塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸などの無機酸の塩が挙げられる。
本書で用いた「治療する」又は「処置する」とは、予防及び／又は治療のために薬剤組成物を投与することを意味する。「疾患の予防」とは、まだ罹病の状態ではないが、ある特定の疾患に対して感受性があるか、又は何らかの他の危険性をもつ被治療者に予防的治療を施すことを意味する。「疾患の治療」又は「治療処置」への使用とは、既にある疾患に罹患している被治療者に対して、被治療者の症状の改善又は安定化のために治療を施すことを意味する。従って、本願の特許請求の範囲及び明細書においては、治療することは、治療又は予防目的で被治療者に投薬することである。
ｍＴＯＲ阻害剤及び化合物１を「併用して」投与するとは、ｍＴＯＲ阻害剤と化合物１とを別々の処方して、互いから２、３、４、５、６又は７日以内に別々に投与することを意味する。
ｍＴＯＲ阻害剤と化合物１とを「一緒に」投与するとは、ｍＴＯＲ阻害剤と化合物１とを単一の薬剤組成物中に一緒に処方し、一緒に投与することを意味する。
本書で用いた、新生物、がん又は過剰増殖性疾患を「治療するのに有効な量」とは、細胞増殖自体を遅らせるか、細胞の発生部位から体内の別の場所への拡がりを遅らせるか、又はその新生物、がん又は過剰増殖性疾患により起こる症状を軽減する化合物１の量を意味する。新生物、がん又は過剰増殖性疾患が本書に記載した治療法に応答した時に軽減される症状は、痛み、並びに他の種類の不快感を包含する。
併用療法に関しては、新生物又はがんを「治療するのに有効な量」とは、細胞増殖自体を遅らせるか、細胞の発生部位から体内の別の場所への拡がりを遅らせるか、又はその新生物又はがんにより起こる症状を軽減する化合物１及びｍＴＯＲ阻害剤の量を意味する。新生物又はがんが本書に記載した併用療法に応答した時に軽減される症状は、痛み、並びに他の種類の不快感を包含する。
「被治療者」及び「患者」なる用語は、本書では互換可能に使用される。これらの用語は、疾患又は症状（例、がん、新生物、又は病的血管新生）に罹患する可能性があるか又は感受性があるが、その疾患又は異常を有していても、有していなくてもよいヒト又は他の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、又は霊長類）を意味する。或る種の態様では、被治療者はヒトである。
「がん」なる用語は、典型的には制御不可能な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的症状を意味する。がんの例としては、それらに限られないが、がん腫、りんぱ腫、芽球腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。より具体的には、そのようながんの例としては、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、多形性神経膠芽腫、食道／口腔がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮体がん、前立腺がん、膀胱がん、肝細胞がん、乳がん、大腸若しくは結腸・直腸がん、頭頸部がん、胃がん、多発性骨髄腫、腎がん、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び本書に記載したあらゆる他のがんが挙げられる。
「新生物」なる用語は、典型的には異常な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的症状を意味する。新生物の制限しない例としては、充実性腫瘍のような、本書に記載したあらゆる腫瘍が挙げられる。より具体的には、新生物の例としては、胃がん若しくは胃・小腸がん、子宮体がん、膀胱がん、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、結腸・直腸がん、腎がん、及び多形性神経膠芽腫のような充実性腫瘍が挙げられる。
「過剰増殖性疾患」なる用語は、病的な異常細胞増殖又は異常血管新生に関連する疾患を意味する。病的血管新生に関連する疾患の制限しない例としては、充実性腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、黄斑変性症、及び心血管疾患が挙げられる。
「低用量」とは、新生物、がん、又は病的血管新生に関連する疾患の治療に対して、単独療法において被治療者に典型的に投与される薬剤の用量より少ない用量（例、単独療法としての投与量の７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、又は３０％以下）を意味する。本発明の併用療法を用いて、この併用療法における個々の薬剤成分の投与量を、単独療法としてｍＴＯＲ阻害剤又は化合物１を単独で投与することにより得られた同じ効果を達成するのに必要な用量より有意に少ない点まで低減させることができる。化合物１及びｍＴＯＲ阻害剤の低用量を例示すると次の通りである：化合物１を７〜４２ｍｇ経口で毎日（例、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、又は３５±７ｍｇ経口を毎日）；リダフォロリムスを７〜２８ｍｇ経口でＱＤ×５／週＜１週間に連続５日＞（例、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、又は２５±５ｍｇ経口をＱＤ×５／週）、エベロリムスを２〜７ｍｇ経口で毎日（例、２±０.４ｍｇ、３±０.６ｍｇ、４±０.８ｍｇ、５±０.９ｍｇ、又は６±１.２ｍｇ経口を毎日）；テムシロリムスを３〜２１ｍｇ静脈内輸注で毎週（例、３±０.６ｍｇ、５±１ｍｇ、７±１.５ｍｇ、１０±２ｍｇ、１５±３ｍｇ、又は１８±３.５ｍｇ静脈内輸注を毎週）；シロリムスを０.５〜１２ｍｇ経口で毎日（例、０.５±０.１ｍｇ、１±０.２ｍｇ、２±０.４ｍｇ、３±０.６ｍｇ、４±０.８ｍｇ、５±０.９ｍｇ、６±１.２ｍｇ、８±１.５ｍｇ、又は１０±２ｍｇ経口を毎日）；バイオリムスを１００〜６００μｇ静脈内輸注で毎日（例、１００±２０μｇ、１５０±３０μｇ、２００±４０μｇ、３００±５０μｇ、４００±５０μｇ、又は５００±５０μｇ静脈内輸注を毎日）；ゾタロリムスを１００〜６００μｇ静脈内輸注で毎日（例、１００±２０μｇ、１５０±３０μｇ、２００±４０μｇ、３００±５０μｇ、４００±５０μｇ、又は５００±５０μｇ静脈内輸注を毎日）；ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５を５〜５０ｍｇ経口で毎日（例５±１ｍｇ、１０±１.５ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、３５±７ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、又は５０±１０ｍｇ経口を毎日）；ワートマンニンを１０〜７０ｍｇ経口で毎日（例、１０±２ｍｇ、１５±５ｍｇ、２０±６ｍｇ、３０±７ｍｇ、４０±８ｍｇ、５０±９ｍｇ、又は７０±１０ｍｇ経口を毎日）；クエルセチン１〜５ｍｇ経口を毎日（例、１±０.１ｍｇ、２±０.２ｍｇ、３±０.３ｍｇ、４±０.５ｍｇ、又は５±１ｍｇ経口を毎日）；ミリセンチンを１５〜１００ｍｇ経口で毎日（例、１５±５ｍｇ、２０±６ｍｇ、３０±７ｍｇ、４０±８ｍｇ、５０±９ｍｇ、７５±１０ｍｇ、又は１００±２５ｍｇ経口を毎日）；並びにスタウロスポリンを１０〜５０ｍｇ経口で毎日（例、１０±１.５ｍｇ、１５±３ｍｇ、２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、３５±７ｍｇ、４０±８ｍｇ、４５±９ｍｇ、又は５０±１０ｍｇ経口を毎日）。下記化合物についても、単独療法について現在記載されている用量より低い用量で投与することができる：ＬＹ２９４００２、Ｐｐ２４２、ＷＹＥ−３５４，Ｋｕ−００６３７９４、ＸＬ７６５、ＡＺＤ８０５５、及びＯＳＩ−０２７。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、添付図面及び特許請求の範囲の記載から明らかとなろう。
図１Ａ及び１Ｂは、化合物１が、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ又はＢＣＲ−ＡＢＬT315Iを発現するＣＭＬ細胞系におけるＢＣＲ−ＡＢＬシグナリングを阻害することを実証するグラフである。図１Ａは、イマチニブ(imatinib)、ニロチニブ(nilotinib)、ダサチニブ(dasatinib)、又は化合物１(Compound 1)で処理された野生型ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞におけるＣｒｋＬリン酸化のイムノブロット分析を示す。細胞を阻害剤の存在下で４時間培養し、回収し、溶解し、そのリン酸化がＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ活性の確立した臨床マーカーであるＢＣＲ−ＡＢＬの基質であるＣｒｋＬに対する抗体を用いたイムノブロットにより分析した。リン酸化及び非リン酸化の両方の形態を電気泳動移動度により分離し、バンドをデンシトメトリーにより定量し、リン酸化ＣｒｋＬ率（％）(% pCrkL)として示す。略号：ＮＴ−処理せず。図１Ａ及び１Ｂは、化合物１が、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ又はＢＣＲ−ＡＢＬT315Iを発現するＣＭＬ細胞系におけるＢＣＲ−ＡＢＬシグナリングを阻害することを実証している。 図１Ａは、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、又は化合物１で処理されたＢＣＲ−ＡＢＬT315I発現性Ｂａ／Ｆ３細胞におけるＣｒｋＬリン酸化のイムノブロット分析を示す。アッセイ及び分析は図１Ａと同様に実施した。その他の点は図１Ａについて記載した通り。 図２Ａ〜２Ｃは、ＣＭＬ初代細胞の化合物１によるex vivo処理が細胞増殖及びＢＣＲ−ＡＢＬ媒介シグナリングを阻害することを実証する。図２Ａは、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬをもつＣＭＬ骨髄性急性転化（Ｍ−ＢＣ）患者（Ｎ＝３）由来及び健康な個人（Ｎ＝３）由来のex vivo化合物１処理した単核細胞（単核球）についての細胞増殖アッセイのプロットである。参考のために、点線は未処理細胞に対する５０％細胞生存率を示す。 図２Ｂは、化合物１、イマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブへのex vivo露出後のＢＣＲ−ＡＢＬT315IをもつＣＭＬリンパ性急性転化（Ｌ−ＢＣ）患者由来の単核細胞におけるＣｒｋＬリン酸化のイムノブロット分析を示すグラフである。細胞を阻害剤の存在下で一晩培養し、回収し、溶解し、ＣｒｋＬイムノブロットにより分析した。リン酸化及び非リン酸化の両方の形態を電気泳動移動度により分離し、バンドをデンシトメトリーにより定量し、リン酸化ＣｒｋＬ率（％）(% pCrkL)として示す。 図２Ｃは、図２ＢのＣＭＬ Ｌ−ＢＣ ＢＣＲ−ＡＢＬT315I患者由来の単核細胞における全（global）チロシンリン酸化のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。阻害剤の存在下で一晩培養した後、細胞を固定及び透過処理し、リン酸化チロシンに対するＦＩＴＣ表面処理抗体と共にインキュベーションし、ＦＡＣＳにより分析した。値は、非染色の対照に対する平均蛍光強度の増大倍率として報告する。 図３Ａ及び３Ｂは、化合物１に抗するコロニー形成アッセイのグラフである。図３Ａは、ＢＣＲ−ＡＢＬT315IをもつＣＭＬ ＡＰ患者由来の単核細胞を用いた化合物１、ニロチニブ及びダサチニブの存在下でのコロニー形成アッセイのグラフである。 図３Ｂは、健康な個人由来の単核細胞を用いた化合物１の存在下でのコロニー形成アッセイのグラフである。図３Ａ及び３Ｂにおいて、ＢＣＲ−ＡＢＬT315IをもつＣＭＬ加速期（ＡＰ，accelerated phase）患者由来及び健康な個人由来の単核細胞を、ニロチニブ、ダサチニブ又は化合物１を含有するメチルセルロース中で平板培養し、培養を１４〜１８日行う。コロニーを倒立顕微鏡下で計数し、結果を３回の反復試験での平均値として示す（エラー・バー（誤差棒線）はＳ.Ｅ.Ｍ.（標準誤差）を表す）。 図４Ａ〜４Ｃは、化合物１がＢＣＲ−ＡＢＬ駆動及びＢＣＲ−ＡＢＬT315I駆動の腫瘍成長のマウス異種移植モデルにおいて有効であることを示す。図４Ａ及び４Ｂは、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ（図４Ａ）又はＢＣＲ−ＡＢＬT315I（図４Ｂ）のいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞を静脈内注射した後のＳＣＩＤマウスの生存率に及ぼす化合物１の効果を示すグラフである。野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ又はＢＣＲ−ＡＢＬT315Iを発現するＢａ／Ｆ３細胞ＳＣＩＤマウスの尾静脈内に注射し、指定の投薬期間（３〜２１日目）の間、動物をビヒクル、化合物１、又はダサチニブによる経口強制（胃管）栄養によって１日に１回処置した。 図４Ａに関して説明した通りである。 図４Ｃは、ＢＣＲ−ＡＢＬT315Iを発現するＢａ／Ｆ３細胞を用いた皮下異種移植モデルにおける化合物１によるＢＣＲ−ＡＢＬリン酸化のin vivo効力及び抑制を示す。細胞をヌードマウスの右の側腹部に皮下移植し、平均腫瘍体積が約５００ｍｍ3に達したら、動物を連続１９日間（指定の投薬期間）ビヒクル又は化合物１による経口強制栄養によって１日に１回処置した。ダネット検定（Dunnett's test）を用いて各化合物１処置群をビヒクル群と比較し、統計的有意性（ｐ＜０.０５）を＊印により示す。ＢＣＲ−ＡＢＬリン酸化は、経口強制栄養によりビヒクル又は３０ｍｇ／ｋｇの化合物１のいずれかの１回量で処置された動物（１群あたりＮ＝３）において評価した。投薬から６時間後、マウスを致死させ、腫瘍サンプルを抗ｐＢＣＲ−ＡＢＬ抗体及び抗ｅＩＦ４Ｅ抗体（ローディング・コントロール）によるイムノブロット分析により分析した。 ＢＣＲ−ＡＢＬT315Iを発現するＢａ／Ｆ３細胞を用いたマウスモデルにおけるダサチニブの効果を示すグラフである。指定投薬期間の間、ビヒクル又はダサチニブで処置されたマウスについての生存曲線を示している。半数生存期間（median survival）をカプラン・マイヤー法を用いて算出した。統計的有意値を各群について示す。 図６Ａ及び６Ｂは、各種濃度の化合物１の存在下で回収されたＢＣＲ−ＡＢＬ変異体を示すグラフである。図６Ａは、漸増させた濃度（１０、２０、４０ｎＭ）の化合物１の存在下で培養した野生型ＢＣＲ−ＡＢＬから出発したＥＮＵ処置Ｂａ／Ｆ３細胞から回収された耐性サブクローンを示す。グラフ棒はそれぞれ回収されたサブクローン中の表示されたＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメイン変異体の相対的パーセンテージを示す。耐性サブクローンの生存率と化合物１の濃度は逆比例関係にあるので、化合物１の各濃度について異なる数の配列決定されたサブクローンが示される（表２を参照）。調査したウェルのうちアウトグロウス（outgrowth）を含んでいたものの割合を、各グラフの右側に示す。 図６Ｂは、漸増させた濃度（４０、８０、１６０、３２０、６４０ｎＭ）の化合物１の存在下で培養したＢＣＲ−ＡＢＬT315Iを発現するＥＮＵ処置Ｂａ／Ｆ３細胞から回収された耐性サブクローンを示す。ＢＣＲ−ＡＢＬT315Iを発現する細胞から出発したこのアッセイでは、全ての回収されたサブクローンは、各グラフ上に表示した特定の二次変異に加えて、Ｔ３１５Ｉ変異を含んでいる。データは、単独薬剤としての化合物１が、細胞系の変異形成スクリーンにおいて耐性アウトグロウスを抑制することができることを実証している。 図７Ａ〜７Ｄは、化合物１の薬物動態学データのグラフである。図７Ａは、１サイクル目の第１日（Ｃ１Ｄ１）及び２サイクル目の第１日（Ｃ２Ｄ１）における各種用量の化合物１についてのＣmaxを示す。 図７Ｂは、１サイクル目の第１日（Ｃ１Ｄ１）及び２サイクル目の第１日（Ｃ２Ｄ１）における各種用量の化合物１についてのＡＵＣを示す。 図７Ｃは、１回の経口投与後のＣ１Ｄ１濃度時間プロファイルを示す。 図７Ｃは、複数回の経口投与後のＣ２Ｄ１濃度時間プロファイルを示す。 図８Ａ〜８Ｅは、化合物１の薬物動態学データを示す。図８Ａは、臨床試験中の全患者及びＴ３１５１変異を有する患者における化合物１の薬物動態学データを示すグラフである。 図８Ｂは、Ｆ３５９Ｃ変異を有する患者における１５ｍｇの化合物１についての薬物動態学データを示すグラフである。 図８Ｃは、変異を有していない患者における３０ｍｇの化合物１についての薬物動態学データを示すグラフである。 図８Ｄは、Ｆ３５９Ｃ変異を有する患者における４５ｍｇの化合物１についての薬物動態学データを示すグラフである。 図８Ｅは、Ｔ３１５１変異を有する患者における６０ｍｇの化合物１についての薬物動態学データを示すグラフである。 図９は、ＡＭＬ細胞系における活性化チロシンキナーゼの受容体リン酸化の阻害を示すグラフである。ＡＭＬ細胞を漸増させた濃度の化合物１と共に７２時間インキュベーションし、ＭＴＳアッセイを用いて細胞生存率を評価した。ＭＶ４−１１、Ｋａｓｕｍｉ−１及びＥＯＬ−１データは、３回の実験からの平均値±ＳＤ（標準偏差）として示され、ＫＧ１データは２回の実験からの平均値±ＳＤとして示される。 図１０は、ＭＶ４−１１細胞における成長阻害及びアポトーシス誘導を示すグラフである。ＭＶ４−１１細胞を９６ウェルのプレートに播種し、漸増させた濃度の化合物１で処理し、カスパーゼ３／７活性を指定の時間で測定した。データは、ビヒクル処理した細胞に対するカスパーゼ活性の誘導倍率として示し、３回の別個の実験からの平均値±ＳＤとして提示する。 図１１Ａ及び１１Ｂは、ＭＶ４−１１異種移植の効力及び標的阻害を示す。図１１Ａは、各種用量の化合物１についての腫瘍成長のグラフである。側腹部のＭＶ４−１１異種移植腫瘍が約２００ｍｍ3に達した時に、１、２.５、５、１０及び２５ｍｇ／ｋｇ／日の用量での化合物１又はビヒクルの４週間にわたる毎日経口投与を開始した（１群あたりマウス１０頭）。平均腫瘍体積（±ＳＥＭ）をプロットする。腫瘍が負担になったため、ビヒクル対照群のマウス１０頭のうち３頭は、２８日目の最後の処理より前に致死させた。そのため、腫瘍成長阻害は、０日目から、投与期間中における腫瘍測定の最終時点の翌日である２４日目までで算出した（＊印により表示）。 図１１Ｂは、各種用量の化合物１に対するｐ−ＦＬＴ３及びｐ−ＳＴＡＴ５の阻害を示すグラフである。定着したＭＶ４−１１腫瘍異種移植片を有するマウスに、指定したレベルで化合物１を１回だけ経口投与した（マウス４頭／群）。対照マウスにはビヒクルだけを与えた（５頭）。６時間後に腫瘍を採取し、イムノブロット法によりリン酸化ＦＬＴ３及びＳＴＡＴ５濃度並びに全ＦＬＴ３及びＳＴＡＴ５濃度について分析した。対照としてＧＡＰＤＨを検査した。２つの独立した実験からの平均（±ＳＥＭ）として、ＦＬＴ３及びＳＴＡＴ５の相対的なリン酸化率のデンシトメトリーによる定量結果を示す。ＦＬＴ３リン酸化はＧＡＰＤＨに対して正規化し、ＳＴＡＴ５リン酸化は全ＳＴＡＴ５タンパク質に対して正規化した。 図１２は、初代ＡＭＬ細胞の化合物１によるex vivo処理がＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞を選択的に阻害することを示すグラフである。４人のＡＭＬ患者のそれれ末梢血液から初代白血病芽球細胞を単離した。ＦＬＴ３−ＩＴＤステータスを病理報告書により決定し、ＰＣＲにより確認した。初代細胞培養物を指定濃度の化合物１で７２時間処理し、この時点でＭＴＳを用いて生存率を評価した。全ての値を、薬剤の不存在下でインキュベーションした細胞の生存率に対して正規化した。 図１３は、細胞増殖アッセイにおける、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）由来ＫＧ１細胞に及ぼす化合物１の効果を示すグラフである。 図１４は、細胞増殖アッセイにおける、増幅ＦＧＦＲ２によるＳＮＵ１６胃がん細胞に及ぼす化合物１の効果を、ｗｔＦＧＦＲ２ ＳＮＵ１細胞の場合と比較して示すグラフである。 図１５は、軟寒天コロニー形成アッセイにおける、ＳＮＵ１６胃がん細胞に及ぼす化合物１の効果を示すグラフである。 図１６は、細胞増殖アッセイにおける、変異ＦＧＦＲ２（Ｎ５４９Ｋ）によるＡＮ３ＣＡ子宮体がん（子宮内膜がん）細胞に及ぼす化合物１の効果を、ｗｔＦＧＦＲ２ Ｈｅｃ１Ｂ細胞の場合と比較して示すグラフである。 図１７は、細胞増殖アッセイにおける、変異ＦＧＦＲ３ｂ（Ｙ３７５Ｃ）を発現するＭＧＨ−Ｕｓ細胞に及ぼす化合物１の効果を、ｗｔＦＧＦＲ３ ＲＴ１１２細胞の場合と比較して示すグラフである。 図１８は、細胞増殖アッセイにおける、ｔ(４;１４)転座を保有し、変異ＦＧＦＲ３（Ｋ６５０Ｅ）を発現するＯＰＭ２多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞に及ぼす化合物１の効果を、ｗｔＦＧＦＲ３ ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の場合と比較して示すグラフである。 図１９は、細胞増殖アッセイにおける、変異ＦＧＦＲ４（Ｙ３６７Ｃ）を発現するＭＦＡ−ＭＢ−４５３乳がん細胞に及ぼす化合物１の効果を示すグラフである。 図２０は、ＦＧＦＲ２駆動ＡＮ３ＣＡ子宮体がん細胞による異種移植モデルにおける細胞増殖に及ぼす化合物１の効果を示すグラフである。 図２１は、ＡＮ３ＣＡ子宮体がん細胞による異種移植モデルにおける化合物１の経口投与のin vivo薬力学及び薬物動態学データを示すグラフである 図２２は、化合物１による処置後の子宮体がん細胞系（ＡＮ３ＣＡ及びＮＦＥ−２９６）並びに野生型ＦＧＦＲ２細胞系（Ｈｅｃ−１−Ｂ及びＲＬ９５−２）を用いた細胞増殖アッセイの結果を示すグラフである。 図２３は、ＡＮ３ＣＡ子宮内膜腫瘍異種移植物における化合物１の経口投与が腫瘍成長に及ぼす効果を示すグラフである。 図２４Ａ及び２４Ｂは化合物１とリダフォロリムスとの組み合わせが細胞増殖アッセイにおけるＦＧＦＲ２変異子宮体がん細胞に及ぼす効果を示すグラフである。データは、リダフォロリムス単独（図中の「リダフォロリムス」）、化合物１単独（図中の「化合物１」）、及び化合物１とリダフォロロムスの併用（図中の「併用」）について示す。図２４Ａは、ＡＮ３ＣＡ子宮体がん細胞系による細胞増殖アッセイの結果を示す。ＡＮ３ＣＡ細胞を処置するのに用いた１×ＥＣ50濃度は、化合物１では３０ｎＭ、リダフォロリムスでは０.４ｎＭである。 図４Ｂは、ＭＦＥ−２９６子宮体がん細胞系による細胞増殖アッセイの結果を示す。ＭＦＥ−２９６細胞を処置するのに用いた１×ＥＣ50濃度は、化合物１では１００ｎＭ、リダフォロリムスでは１ｎＭである。 図２５Ａび２５Ｂは、化合物１とリダフォロリムスとの併用の中央値効果分析（median effect analysis）を示すグラフである。図２５ＡはＡＮ３ＣＡ細胞系についてのデータを示す。 図２５Ｂは、ＭＦＥ−２９６細胞系についての図２５Ａと同様のデータを示す。 図２６は、処置後のＡＮ３ＣＡ細胞系における細胞周期分析を示すグラフである。データは、未処置の細胞（図中の「未処置」）、又はリダフォロリムス単独、化合物１単独、若しくは化合物１とリダフォロロムスの併用の細胞を示す。 図２７は、考えられるＦＧＦＲ２／ＭＡＰＫ経路及びｍＴＯＲ経路（Katoh M., J. Invest. Dermatol., 2009, 128: 1861-1867からの修正）を示すスキームである。 図２８Ａ及び２８Ｂは、ＡＮ３ＣＡ子宮内膜腫瘍異種移植片におけるリダフォルリムスと併用した化合物１の経口投与の効果を示すグラフである。データは、リダフォロリムス単独（図中「Rid」）、化合物１単独（図中「化合物１」）、及び化合物１とリダフォロロムスの併用（図中「化合物1, Rid」）について示す。投与量はｍｇ／ｋｇ単位でカッコ内に示す。図２８Ａは、１０ｍｇ／ｋｇの低用量の化合物１をリダフォロリムスと併用した場合についてのデータを示す。 図２８Ｂは、３０ｍｇ／ｋｇの高用量の化合物１をリダフォロリムスと併用した場合についてのデータを示す。 図２９は、リダフォロリムス単独、化合物１単独、及び化合物１とリダフォロリムスとの併用の経口投与のについての薬物動態学的及び薬力学的データを示す。データは、各種濃度のリダフォロリムス単独（図中「Rid」）及び化合物１単独（図中「化合物１」）について示す。
本発明は、化合物１の投与を利用したがんの治療方法を提供する。がんの制限しない例としては、急性骨髄性白血病、胃若しくは胃腸がん、子宮体がん、膀胱がん、多発性骨髄腫、又は乳がんのような充実性腫瘍を生ずるものが挙げられる。がんの別の例としては、骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、又は脊髄異形成症候群（例、第１群芽球過剰の不反応性貧血（ＲＡＥＢＩ）又は第２群芽球過剰の不反応性貧血（ＲＡＥＢII））が挙げられる。
上述したがんに加えて、本発明の方法及び組成物は、下記種類の部位のがん並びに他のがんの治療に使用することができる：皮膚（例、扁平上皮がん、基底細胞がん若しくは黒色腫）、前立腺、脳及び神経系、頭頸部、精巣、肺、肝臓（例、肝細胞がん）、腎臓、骨、内分泌系（例、甲状腺腫瘍及び下垂体腫瘍）、並びにリンパ系（例、ホジキン型及び非ホジキン型リンパ腫）。本発明の方法を用いて治療することができる別の種類のがんとしては、線維肉腫、神経外胚葉腫瘍、中皮腫、類表皮がん、及びカポジ肉腫が挙げられる。
化合物１は、高い抗血管新生特性を有することが判明し、従って、充実性腫瘍（例、前立腺がん、肺がん、乳がん、大腸がん、腎臓がん、及び神経膠芽腫）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、黄斑変性症、並びに心血管疾患を包含する病的血管新生に関連する疾患の治療に有用となりうる。
特に、化合物１は、汎ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤である。イマチニブによる発がん性（腫瘍形成性）ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼの阻害は、慢性期の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の多くの患者において永続性のある反応を誘導するが、進行したＣＭＬ及びＰｈ＋急性リンパ芽球性白血病では再発が普通である。イマチニフ耐性は、普通にはＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメイン変異に起因し、第２世代のＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤であるニロチニブ及びダサチニブがこれらの患者に対する治療代替薬となる。しかし、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I変異及び順次ＡＢＬキナーゼ阻害剤療法で選択されたマルチ耐性複合変異体のクロス抵抗が臨床上の懸念のままである。ここに、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I及び他の耐性変異体の有効な阻害剤である化合物１のin vitro及びin vivo評価を説明する。化合物１は、不活性形態のＢＣＲ−ＡＢＬT315Iを阻害することが判明した。細胞系突然変異誘発スクリーンにおいて、化合物１は、Ｔ３１５Ｉを初めとして、或る種の濃度で耐性を完全に抑制した。経口投与される化合物１のような汎ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤が利用可能となることは、治療中にＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメイン突然変異に基づく薬剤耐性の出現を最小限にすることにより、第１世代薬の能力に重要な治療上の利点をもたらす。
さらに、本発明者らは、ｍＴＯＲと化合物１との組み合わせ（併用）が、病的細胞増殖の治療、血管新生の阻害、及びがん細胞のアポトーシスの増大に対して、ラパマイシンマクロライドの単独療法又は化合物１の単独療法より効果が大きいことを発見した。
本発明の組成物、方法又はキットを用いて治療することができるがんの制限しない例としては、膀胱、胸部（乳部）、大腸、腎臓、肝臓、肺、頭頚部、胆嚢、卵巣、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺、前立腺、又は皮膚のがん；扁平上皮がん；子宮体がん；多発性骨髄腫；リンパ系の造血腫瘍（例、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、ホジキン型白血病、非ホジキン型白血病、ヘアリー細胞白血病、若しくはバーキット白血病）；骨髄系の造血腫瘍（例、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、若しくは前骨髄球性白血病）；間葉由来の腫瘍（例、線維肉腫若しくは横紋筋肉腫）；中枢若しくは末梢神経系の腫瘍（例、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、若しくは神経鞘腫）；黒色腫；セミノーマ；奇形がん；骨肉腫；又はカポジ肉腫が挙げられる。
本発明の組成物、方法又はキットを用いて治療することができる病的血管新生に関連する疾患の制限しない例としては、充実性腫瘍（例、前立腺がん、肺がん、乳がん、大腸がん、腎臓がん、若しくは神経膠芽腫）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、黄斑変性症、及び心血管疾患が挙げられる。
［化合物１の合成及び処方組成物］
化合物１は、下記のスキーム１及びＰＣＴ公開ＷＯ２００７／０７５８６９に記載した方法で合成することができる。或いは、工程で利用した酸塩化物を、工程５の変法を記載する下記スキーム２に示すようにメチルエステルに置換することができる。
下記のスキーム１及び２における用語の意味は次の通りである：
Mol. Wt.: 分子量; exchange: 交換; wash: 洗浄; heptane: ヘプタン;
acetylene: アセチレン; oxyalyl chloride: 塩化オキザリル;
3-iodo-4-methylbenzoic acid: 3-ヨード-4-メチル安息香酸; filter: 濾過
Lewatit resin: レバチット樹脂; reslurry: 再スラリー化;
as free base: 遊離塩基形態。
著しく水溶性の低い遊離塩基の代わりに化合物１のモノ塩酸塩が臨床試験の実施に使用された。モノＨＣｌ塩は、ある範囲の溶媒から再現性よく形成される結晶性の無水固体であることが認められた。化合物１の塩酸塩の熱力学的溶解度は、非緩衝水中にｐＨ３.７で１.７ｍｇ／ｍＬである。
化合物１のさらなる同定情報は下記を含む：
化学名：３−(イミダゾ[１,２−ｂ]ピリダジン−３−イルエチニル)−４−メチル−Ｎ−(４−((４−メチルピペラジン−１−イル)メチル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)ベンズアミド塩酸塩；
ＵＳＡＮ名称：ポナチニブ（ＩＮＮ係属中）；
ＣＡＳ登録番号：１１１４５４４−３１−８（ＨＣｌ塩）及び９４３３１９−７０−８（遊離塩基）；
ＣＡＳインデックス名：ベンズアミド，３−(２−イミダゾ[１,２−ｂ]ピリダジン−３−イルエチニル)−４−メチル−Ｎ−[４−[(４−メチル-1-ピペラジニル)メチル]−３−(トリフルオロメチル)フェニル]−塩酸塩（１：１）；
分子式：Ｃ29Ｈ28ＣｌＦ3Ｎ6Ｏ（ＨＣｌ塩）及びＣ29Ｈ27Ｆ3Ｎ6Ｏ（遊離塩基）；
分子量：５６９.０２ｇ／ｍｏｌ（ＨＣｌ塩）及び５３２.５６ｇ／ｍｏｌ（遊離塩基）。
化合物１、又は好ましくはモノＨＣｌ塩のような薬学的に許容されるその塩は、経口投与用途に有用な任意の材料及び方法を用いて経口投与用に処方されうる。経口投与用に適した化合物１を含有する薬学的に許容される組成物は、多様なものが周知である慣用の材料及び方法を用いて処方されうる。この組成物は、溶液、懸濁液又はエマルション形態であってもよいが、カプセル剤、錠剤、ゲルキャップ剤等の固体剤形が現時点では最も興味がある。前述した単位剤形を初めとする処方組成物作製のための本技術分野で周知の方法は、例えば、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (第20版、A.R. nGennaro編、2000、Lippincott William & Wilkins) に見いだせる。化合物１は、カプセル中に単味で供給しても、又は次に例示するように、充填剤、結合剤、安定化剤、保存剤、流動性改善剤（glidants）、崩壊剤、着色剤、フィルムコーティング剤などの１種若しくは２種以上の任意の薬学的に許容される賦形剤と混合して供給してもよい。
例えば、塩酸塩として供給された公称２ｍｇの化合物１遊離塩基を、賦形剤を伴わずに含有する白色不透明カプセル剤が製剤された。塩酸塩として供給された５ｍｇ、１５ｍｇ、又は２０ｍｇのの化合物１遊離塩基を、慣用の賦形剤と混合して含有する白色不透明カプセル剤も製剤された。例示のカプセル用ブレンド中に賦形剤として使用された不活性成分としては、充填剤、流動性向上剤、滑剤及び崩壊剤の１種又は２種以上が挙げられる。例えば、カプセル用ブレンドは、化合物１のＨＣｌ塩に、コロイド状二酸化ケイ素（約０.３％w/w、流動性向上剤）、無水乳糖（約４４.６％w/w、充填剤）、ステアリン酸マグネシウム（約０.５％w/w、滑剤）、微結晶性セルロース（約４４.６％w/w、充填剤）、及びグリコール酸澱粉ナトリウム（約５％w/w、崩壊剤）を加えて含有する５、１５及び２０ｍｇカプセル剤用に調製された。カプセル殻はゼラチン及び二酸化チタンを含有する。
処方方法は慣用の混合及びカプセル化方法及び機械装置を用いた。化合物１の塩酸塩及びステアリン酸マグネシウム以外の全てのブレンド賦形剤成分をＶブレンダーで混合し、スクリーニングミル（ふるい分け粉砕装置）を通して粉砕した。ステアリン酸マグネシウムを添加し、材料を再び混合した。Ｖブレンダー内のブレンドをサンプリングしてブレンドの均一性を測定した。得られたブレンドを、かさ密度、タップ密度、流動性、及び粒度分布について試験した。ブレンドを次いで、単位剤形の強さに応じて、サイズ３、サイズ４又はサイズ１のカプセル殻内に充填してカプセル化した。
化合物１はまた、充填剤若しくは充填剤混合物、崩壊剤、流動性改善剤、滑剤、フィルムコーティング剤及びコーティング溶媒（より高強度のカプセル剤に用いたものに似たブレンド中に使用したもの）の１種又は２種以上を含む慣用の製薬用賦形剤を用いて、錠剤にも処方した。例えば、錠剤の製剤には下記の相対的な量及び割合（重量／重量）を用いて行うことができる：化合物１（９０ｇ、ＨＣｌ塩として供給、１５.０％w/w）、コロイド状二酸化ケイ素（１.２ｇ、０.２％w/w）、乳糖一水和物（２４０.９ｇ、４０.１５％w/w）、ステアリン酸マグネシウム（３ｇ、０.５％w/w）、微結晶性セルロース（２４０.９ｇ、４０.１５％w/w）、及びグリコール酸澱粉ナトリウム（２４ｇ、４.０％w/w）。乳糖一水和物の量は使用する薬剤の量に基づいて調整する。
化合物１と賦形剤を、カプセル剤の場合に使用したのと同様の種類の装置及び操作を用いて混合することができる。得られた均一なブレンドを次に回転式打錠プレスのような慣用手段により錠剤に圧縮すればよい。打錠プレスは、所望の錠剤重量（例、４５ｍｇ錠剤では３００ｍｇ又は１５ｍｇ錠剤では１００ｍｇ）、例えば４５ｍｇ錠剤では１３ｋｐ及び１５ｍｇ錠剤では３ｋｐの平均硬さ、並びに１％以下の破砕性に調整しておく。こうして製造された錠剤コアに、慣用のフィルムコーティング材料（例、OpadryTM II Whiteの水性懸濁液）を噴霧被覆してもよい。それにより、錠剤コアの重量に対して約２.５％程度の重量増加を生ずる。
［ｍＴＯＲ阻害剤］
ｍＴＯＲと通称されている哺乳類ラパマイシン標的（mammalian target of rapamycin）は、細胞成長、細胞増殖、細胞運動性、細胞生存、タンパク質合成、及び転写を調節するセリン/スレオニンタンパク質キナーゼである。ラパマイシン及びその類似物を含むｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲからの、又はｍＴＯＲを含むキナーゼの混合物（例、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲの両方の阻害剤として作用する薬剤）からのシグナル伝達を特異的に阻害する、ある種の治療薬である。ｍＴＯＲは、多重マイトジェンシグナル伝達経路（multiple mitogegnic signaling pathway）における主要な媒介となり、正常組織及び新生物形成過程における増殖及び血管新生 (angiogenesis) のモジュレーションにおいて中心的な役割を果たす。ラパマイシンマクロライドと非ラパマイシンアナログという２種類のｍＴＯＲ阻害性化合物がある。
ラパマイシン（シロリムス）は、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopics）が産生する免疫抑制性のラクタムマクロライドである。例えば、J.B. McAlpine et al., J. Antibiotics, 1991, 44: 688; S.L. Schreiber et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113; 及び米国特許第3,929,992号 (これらを参考文献として援用する) を参照されたい。
ラパマイシン及びその類似物の原子の番号付けに受容されている慣行が複数あるので、本明細書で使用する番号付けの慣行を下記に示す。
参考のために、いくつかの化合物についてのＲ基を次の表に示す。
化合物 −Ｒ
ラパマイシン −ＯＨ
ＡＰ２３５７３ −ＯＰ(Ｏ)(Ｍｅ)2
テムシロリムス −ＯＣ(Ｏ)Ｃ(ＣＨ3)(ＣＨ2ＯＨ)2
エベロリムス −ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＨ
バイオリムス −ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＥｔ
ＡＢＴ−５７８ −テトラゾール
本発明の併用療法に使用するのに望ましいラパマイシンマクロライドとしては、これらに制限されないが、ラパマイシン（シロリムス若しくはラパミューン（Wyeth社）、テムシロリムス若しくはＣＣＩ−７７９（Wyeth社、米国特許第5,362,718号及び第6,277,983号を参照、それらの内容をここに参考文献として援用）、エベロリムス若しくはＲＡＤ００１（Novartis社）、リダフォロリムス若しくはＡＰ２３５７３（Ariad社）、バイオリムス(Nobori社)、並びにゾタロリムス若しくはＡＢＴ５７８（Abobott Labs.社）が挙げられる。
テムシロリムスは、ラパマイシンの可溶性エステルプロドラッグであり、３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチルプロピオン酸とのラパマイシン４２エステルであって、米国特許第5,362,718号に開示されている。テムシロリムスはin vitroとin vivoの両モデルにおいて腫瘍成長に対する顕著な阻害効果を実証した。テムシロリムスは、細胞毒性特性とは異なり、細胞増殖抑制性を示し、腫瘍が悪化するまで又は再発するまでの時間を遅延させうる。ＷＯ 00/240000に開示されているように、ＣＣＩ−７７９は腎臓、胸部（乳部）、子宮頸管、子宮、頭頸部、肺、前立腺、膵臓、卵巣、結腸、リンパ腫及び黒色腫を含む各種部位起源のがんの治療に有用でありうる。
エベロリムスは、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチルラパマイシンであり、その構造及び合成はＷＯ 94/09010に開示されている。強力な免疫抑制剤であることが示されている (米国特許第5,665,772号) エベロリムスも、抗新生物特性の証拠を示す (例、A. Boulay et al., Cancer Res., 2004, 64: 252-261を参照)。これらの特性の結果、エベロリムスは同種移植拒絶反応予防用の免疫抑制剤として数カ国で現在市販され (B. Nashan, Ther. Drug. Monit., 2002、 24: 53-58)、抗がん剤として臨床試験を受けている (S. Huang and P.J. Houghton, Curr. Opin. Invest. Drugs, 2002, 3: 295-304; M.M. Mita et al., Clin. Breast Cancer, 2003, 4: 126-137; 及びM. Hidalgo and E.J. Rowinsky, Oncogene, 2000, 19: 6680-6686)。
ゾタロリムスは、ＷＯ 99/15530に開示されているように、その４３−エピ異性体であり、又はＷＯ98/02441及びＷＯ 05/016252に開示されているようにラパマイシン類似物である。
リダフォロリムスは、リン含有ラパマイシン誘導体である (ＷＯ 03/064383、その実施例９を参照)。テムシロリムス及びエベロリムスと同様に、リダフォロリムスは、神経膠芽細胞腫、前立腺がん、乳がん、膵臓がん、肺がん及び結腸がんを含む多様なＰＴＥＮ欠陥腫瘍細胞系において抗増殖活性を実証された (E.K. Rowinsky, Curr. Opin. Oncol., 2004, 16: 564-575)。リダフォロリムスは、米国食品医薬品局から、軟組織及び骨肉腫の治療用の優先審査医薬として指定を受けた。リダフォロリムスは、血液悪性腫瘍(例、白血病類及びリンパ腫類)及び充実性（固体）腫瘍（例、肉腫、前立腺がん、及び多形性神経膠芽腫）を標的とする複数の臨床試験において試験されている。
多くのラパマイシンマクロライドが本技術分野において知られている。本発明の方法、キット及び組成物において使用できるラパマイシンマクロライドとしては、例えば、ＷＯ 2006/095185に開示されているようなラパマイシンの４２−デスメトキシ誘導体 (該公報では、そこの番号付け系に基づいて「３９−デスメトキシ」化合物と記載されている) 及びその各種類似化合物が挙げられる。このラパマイシン誘導体は、本発明の実施において現在特に興味があるものである。
また、典型的には別の発酵生成物として及び／又は合成研究の成果として得られた多数の他のラパマイシン構造変更化合物がこれまでに報告されている。例えば、ラパマイシンに構造的に関係する類似物（アナログ）、同族物（ホモログ）、誘導体、及び他の化合物（［ラパログ］と総称）に関する大量の文献としては、とりわけ、ラパマイシンに対して下記の変更の１種又は２種以上を有するラパマイシンの構造変更化合物が挙げられる：Ｃ７、Ｃ４２及び／若しくはＣ２９のメトキシ基の脱メチル化、除去若しくは置換；Ｃ１３，Ｃ４３及び／若しくはＣ２８のヒドロキシル基の除去、誘導体化若しくは置換；Ｃ１４、Ｃ２４及び／若しくはＣ３０のケトン基の還元、除去若しくは誘導体化；６員のピペコレート環の５員プロリル環による置換；シクロヘキシル環上の別の置換若しくはシクロヘキシル環の置換シクロペンチル環による置換；Ｃ２８ヒドロキシル基のエピマー化；並びにリン含有部分による置換。
従って、ｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、下記特許文献（これらすべてを参考文献として援用する）に記載されているものを包含する、ラパマイシンの４３−及び／若しくは２８−エステル、エーテル、カーボネート、カルバメート等が挙げられる：ラパマイシンのアルキルエステル（米国特許第4,316,885号）；アミノアルキルエステル（米国特許第4,650,803号）；フッ素化エステル（米国特許第5,100,883号）；アミドエステル（米国特許第5,118,677号）；カルバメートエステル（米国特許第5,118,678号）；シリルエステル（米国特許第5,120,842号）；アミノジエステル（米国特許第5,162,333号）；スルホネート及びサルファートエステル（米国特許第5,177,203号）；エステル（米国特許第5,221,670号）；アルコキシエステル（米国特許第5,233,036号）；Ｏ-アリール、−アルキル、−アルケニル、及び−アルキニルエーテル（米国特許第5,258,389号）；カーボネートエステル（米国特許第5,260,300号）；アリールカルボニル及びアルコキシカルボニルカルバメート（米国特許第5,262,423号）；カルバメート（米国特許第5,302,584号）；ヒドロキシエステル（米国特許第5,362,718号）；ヒンダートエステル（米国特許第5,385,908号）；複素環エステル（米国特許第5,385,909号）；ジェム(gem-)二置換エステル（米国特許第5,385,910号）；アミノアルカン酸エステル（米国特許第5,389,639号）；ホスホリルカルバメートエステル（米国特許第5,391,730号）；カルバメートエステル（米国特許第5,411,967号）；カルバメートエステル（米国特許第5,434,260号）；アミジノカルバメートエステル（米国特許第5,463,048号）；カルバメートエステル（米国特許第5,480,988号）；カルバメートエステル（米国特許第5,480,989号）；カルバメートエステル（米国特許第5,489,680号）；ヒンダードＮ-オキシドエステル（米国特許5,491,231号）；ビオチンエステル（米国特許第5,504,091号）；Ｏ-アルキルエーテル（米国特許第5,665,772号）;及びＰＥＧエステル（米国特許第5,780,462号）。やはり包含されるのは、ラパマイシン及び前述したいずれかの化合物の還元生成物である、２４−ジヒドロ、３０−ジヒドロ、及び２４,３０−テトラヒドロラパマイシン類似物並びに２８−エピ類似物（例、ＷＯ 01/14387を参照）、並びに前記のいずれかのエステル若しくはエーテル並びに非還元化合物のオキシム、ヒドラゾン、及びヒドロキシアミンである。例えば、米国特許第5,373,014号、5,378,836号、5,023,264号、5,563,145号及び5,023,263号を参照。
非ラパマイシンアナログ型のｍＴＯＲ阻害性化合物としては、それらに限られないが、ＬＹ２９４００２、Ｐｐ２４２（Chemdea Cat. No. CD0258）、ＷＹＥ−３５４（Chemdea Cat. No. CD0270）、Ｋｕ−００６３７９４（Chemdea Cat. No. CD0274）、ＸＬ７６５（Exelixis; J. Clin. Oncol., 2008, 2008 ASCO Annual Meeting Proceedings 26: 15S）、ＡＺＤ８０５５（Assrazeneca社）、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（Sauveur-Michel et al., Mol. Cancer Ther., 2008, 7: 1851）、ＯＳＩ−０２７（ODI Pharmaceuticals社）、ワートマンニン、クェルセチン、ミリセチン、スタウロスポリン、及びＡＴＰ競合性阻害剤（米国特許出願番号11/361,213及び11/361,599を参照、それぞれの全体を参考文献としてここに援用）が挙げられる。
本発明の方法、キット及び組成物に使用できる他の非ラパマイシンアナログのｍＴＯＲ阻害性化合物としては、下記のＰＣＴ公開番号に記載のものが挙げられる：ＷＯ2009/008992; ＷＯ2009/007750; ＷＯ2009/007751; ＷＯ2009/007749; ＷＯ2009/007748; ＷＯ2008/032060; ＷＯ2008/032036; ＷＯ2008/032033; ＷＯ2008/032089; ＷＯ2008/032091; ＷＯ2008/032064; ＷＯ2008/032077; ＷＯ2008/032041; ＷＯ2008/023159; ＷＯ2008/023180; ＷＯ2007/135398; ＷＯ2007/129044; ＷＯ2007/080382; 及びＷＯ2006/090169 (それぞれを参考文献としてここに援用)。
[薬剤組成物]
例えば、シロリムス、テムシロリムス、ラダフォロリムス、及びエベロリムスの経口投与に適した固体剤形並びにテムシロリムス及びリダフォロリムスの静脈内投与用の他の組成物をはじめとするｍＴＯＲ阻害剤の処方組成物は、本技術分野では非常によく知られている。非マクロライド系ｍＴＯＲ阻害剤の処方組成物は、上掲の特許文献に開示されている。化合物１はｍＴＯＲ阻害剤と一緒に処方することもできるが、より典型的には、製剤過程の複雑化を避けるとともに、２種類の薬剤の独立した投与スケジュール及び投与計画を可能にして、どちらの薬剤の投与についてもその後の調節をより簡易にするために、両者は別個に処方されよう。
［用量及び投与］
本発明の方法、キット及び組成物によると、治療は１回の投与又はある期間にわたる複数会の投与からなることができる。化合物１は単独で、又はｍＴＯＲ阻害剤の投与と同時に投与しうる。或いは、化合物１とｍＴＯＲ阻害剤とを順番に投与してもよい。例えば、化合物１をｍＴＯＲ阻害剤の投与前又は投与後に（例、１日以上前に及び／又は１日以上後に）投与することができる。
投与は、１日若しくは１週間に１回若しくは２回以上（又はそれ以外の何らかの複数日間隔で）或いは間欠的スケジュールでよく、そのサイクルを所定の回数（例、２〜１０サイクル）又は不定回数で反復しうる。
投与経路に応じて、治療する被治療者（個体）の体重、体表面積、又は臓器サイズに従って有効用量を算出することができる。適当な投与量の最適化は、ヒトの臨床試験で判明した薬物動態学データに照らして当業者が容易に実施することができる。最終的な投与計画は、例えば、薬剤の特異的活性、被治療者の損傷の重篤度及び反応性、被治療者の年齢、症状、体重、性別及び食事内容、現在の感染があればその重篤度、投与期間、併用する療法の有無、並びに他の臨床因子といった薬剤の作用を変質させる各種の因子を考慮して主治医により決定されよう。本発明の組み合わせ（併用療法）を用いて研究が実施されているので、適当な用量レベル及び治療継続期間についてはさらなる情報が今後も出てくるであろう。
本発明の併用療法では、化合物１は典型的には、１０〜５００ｍｇの合計日用量を毎日経口投与するサイクルの反復で投与される。ｍＴＯＲ阻害剤は、化合物１の前、後、又はそれと同時に、同一又は異なる投与スケジュールで、かつ同一又は異なる投与経路で投与することができる。この併用療法におけるｍＴＯＲ阻害剤の用量レベルは、一般的には治療１週間あたりの合計量で１０〜８００ｍｇの範囲内であり、場合によっては３５〜２５０ｍｇ／週であろう。このような合計週用量レベルは、多様な投与経路及び投与スケジュールを用いて達成しうる。投与スケジュールは、間欠的であってもよい。「間欠的」投与とは、例えば、１日おきの投与、２日おきの投与、又はより一般的には、投与と投与の間に１日以上又は１週間以上の「休日」を挟んだスケジュールといった、投与間に投与しない期間があるスケジュールでの投与を意味する。このような間欠的投与の制限しない例としては、１週間あたり６日以下の投与、並びに１週間はＱＤ×４、ＱＤ×５、ＱＤ×６若しくは毎日の投与の後、例えば、１、２若しくは３週間の薬剤を投与しない期間があり、その翌週は薬剤治療を再開した後、１週間若しくは数週間は薬剤治療をしない、といった投与サイクルが挙げられる。別の例を示すと、１週間おきの６０ｍｇのＱＤ×６投与は、間欠的基準（すなわち、一週間おき）で３６０ｍｇの薬剤の週用量を与える。
例えば、経口投与の場合で、２〜１６０ｍｇの薬剤を１週間に１日以上、例えば、毎日（ＱＤ×７）、１週間に６日（ＱＤ×６）、１週間に５日（ＱＤ×５）などのスケジュールで投与することができる。例えば、エベロリムスは３〜２０ｍｇ／日、例えば、５ｍｇ又は１０ｍｇ/日の用量でＱＤ×７投与することができる。リダフォリムスは、１０〜２５ｍｇ／日、例えば、１０ｍｇ、１２.５ｍｇ、又は１５ｍｇ/日の用量でＱＤ×７ｐ.ｏ.投与することができる。また、シロリムスは２又は４ｍｇｐ.ｏ.ＱＤ×７、場合によっては、６、８又は１０ｍｇの負荷用量で投与することができる。投与スケジュールは、ＱＤ×４、ＱＤ×５又はＱＤ×６スケジュールにより例示されるように間欠的であってもよい。例としては、３０〜１００ｍｇＱＤ×５又はＱＤ×６でのｍＴＯＲ阻害剤の経口投与が挙げられる。例えば、本発明の実施において、リダフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムス又はシロリムスを１０〜５０ｍｇＱＤ×５のレベルで経口投与してもよい。ある種の適応症については、３０〜５０ｍｇ経口の用量レベルでリダフォロリムスをＱＤ×５投与することが望ましいことがある。
また、ｍＴＯＲ阻害剤への所望の総露出レベルを、各種スケジュールでの非経口送給により達成することもできる。そのような場合、１０〜２５０ｍｇのｍＴＯＲ阻害剤を、例えば１５〜６０分間、多くは３０〜６０分間の静脈内輸注により、１〜４週間に１回以上の間隔で投与する。そのような手法の１例では、ｍＴＯＲ阻害剤を、４週間ごとのサイクルで、１週間に１回の３０〜６０分間での静脈内輸注を３又は４週間投与する。このような静脈内送給は、特にリダフォロリムス、シロリムス及びテムシロリムスの場合に興味があり、これらは例えば１０〜２５０ｍｇの週用量（例、２５、５０、７５、１００、１５０、２００又は２５０ｍｇ／週）で４週間ごとのサイクルで３又は４週間にわたって投与することができる。５０ｍｇ及び７５ｍｇの用量レベルが現時点では特に興味がある。別の手法では、隔週に５〜２５ｍｇの薬剤をＱＤ×５静脈内輸注（例、第２週目ごとに月曜から金曜までの静脈内輸注）によりｍＴＯＲ阻害剤を投与する。１０、１２.５、１５、１７.５及び２０ｍｇの用量が現時点で特に興味がある。
特に興味があるのは、単独療法におけるｍＴＯＲ阻害剤に対して既に認可されたか、又は臨床試験中の用量レベル及び投与スケジュールを、本書に記載した化合物１との併用療法の一部として投与することである。
やはり興味あるのは、用量レベル又は投与スケジュールがｍＴＯＲ阻害剤及び／又は化合物の低用量（すなわち、単独療法について用いる用量より少ない用量）での被治療者への投与を生ずる併用療法である。
［適応症］
本発明の方法、キット及び組成物を用いて、新生物、がん、及び病的血管新生に関連する疾患のような病的細胞増殖に関連する疾患を治療することができる。本発明の組成物、方法、又はキットを用いて治療することができる病的（異常）血管新生に関連する疾患の制限しない例としては、充実性腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、及び黄斑変性症が挙げられる。
本発明の方法、キット及び組成物は、原発性及び／若しくは転移性のがん、並びに他のがん症状の治療に使用することができる。例えば、本発明の組成物及び方法は、充実性腫瘍の縮小、腫瘍成長若しくは転移の阻止、各種リンパ性がんの治療、並びに／又はこれらの疾患に罹患した哺乳動物（ヒトを含む）の生存期間の延長に有用となる筈である。
ＢＣＲ−ＡＢＬ発現性細胞の増殖に関連する疾患の具体的な例としては、本書に記載したいずれかの「がん」のような「がん」が挙げられる。追加のがんとしては、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、及び急性骨髄性白血病が挙げられる。
ＦＬＴ−３変異発現性細胞の増殖に関連する疾患の具体例としては、本書に記載した何れかのがんのような「がん」及びがんに関連する疾患が挙げられる。ＦＬＴ３の活性化変異は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に最も普通にみられる種類の遺伝子変質である。これらの突然変異の大半は、該受容体の膜近接領域における遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）から起こる。キナーゼ活性化ループにおける活性化点変異も起こるが、頻度はより低い。ＦＬＴ３−ＩＴＤ突然変異は、標準的治療法で治療した場合に再発及び総合生存率の両面でＡＭＬ患者の予後を悪くしてきた。別の疾患としては、不反応性貧血、芽球過剰による不反応性貧血（ＲＡＥＢ）（例、芽球５〜９％のＲＡＥＢＩ及び芽球１０〜１９％のＲＡＥＢII）、環状鉄赤芽球による不反応性貧血、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、及び非定型慢性骨髄性白血病（ａ−ＣＭＬ）のような骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）が挙げられる。
疾患の他の例としては、ＦＧＦＲ１、ＰＤＧＦＲα、及びＫＩＴに関連するものが挙げられる。ＦＧＦＲ１及びＰＤＧＦＲαの活性に影響する転座は、稀な骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）の亜集団に見られる。ＦＧＦＲ１遺伝子及び或る範囲の他の染色体パートナー（例、ＦＧＦＲ１ＯＰ２遺伝子）を含む転座は、大部分の患者が最終的かつ急速にＡＭＬ進行する８ｐ１１骨髄増殖性症候群（ＥＭＳ）の特徴である。ＦＩＰ１Ｌ１−ＰＤＧＦＲα融合たんぱく質は、慢性好酸球性白血病／突発性好酸球増加症（ＣＥＬ／ＨＥＬ）の患者の約１０〜２０％に見られ、これらの患者はＰＤＧＦＲ阻害によく反応することが報告されている。また、ＰＤＧＦＲαのＴ６７４Ｉ変異は、ＢＣＲ−ＡＢＬのＴ３１５Ｉゲートキーパー残基に類似の位置で変異する。ＫＩＴの活性化変異（例、ｃＫＩＴ又はＮ８２２Ｋ）もＡＭＬに見られる。ＫＩＴ変異はあまり普通ではなく、２〜８％の総合的頻度でＡＭＬの特定の細胞遺伝的亜集団に見られる。
他の症例としては、例えば充実性腫瘍を生ずるがん細胞のようながん細胞の増殖に関連するものが挙げられる。充実性腫瘍を例示すると、胃若しくは胃腸がん、子宮体がん、膀胱がん、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、腎臓がん、及び多形性神経膠芽腫が挙げられる。
治療することができるがん及びがん症状の例としては、それらに限られないが、脳及び中枢神経系の腫瘍（例、髄膜、脳、脊髄、脳神経、並びに神経膠芽腫若しくは骨髄芽細胞腫のようなＣＮＳの他部分の腫瘍）；頭部及び／若しくは頸部のがん；胸部腫瘍（乳がん）；循環系の腫瘍（例、心臓、中角膜及び胸膜、並びに他の胸腔内器官、血管の腫瘍、並びに腫瘍関連血管組織）；血液及びリンパ系の腫瘍（例、ホジキン病、非ホジキン病型リンパ腫、バーキット白血病、エイズ関連リンパ腫、悪性免疫増殖性疾患、多発性骨髄腫、悪性プラズマ（形質）細胞新生物、リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性若しくは慢性リンパ球性白血病、単球性白血病、特異的細胞型の他の白血病、非特異的細胞型の白血病、リンパ球の非特異的悪性新生物、造血及び関連組織、例えば、びまん性大細胞性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫）；排出系（例、腎臓、腎盂、尿管、膀胱、及び他の泌尿器）の腫瘍；胃腸管（例、食道、異、小腸、結腸、結腸直腸、直腸Ｓ状結腸移行部、直腸、肛門、及び肛門管）の腫瘍；肝臓並びに肝内胆管、胆嚢、及び胆管の他の部分、膵臓、及び他の消化器に関連する腫瘍；口腔（例、口唇、舌、歯肉、口底、口蓋、耳下腺、唾液腺、扁桃、中咽頭、鼻咽頭、梨状陥凹、下咽頭、及び他の口腔部位）の腫瘍；生殖器系（例、外陰、膣、子宮頸部、子宮、卵巣、及び女性生殖器に関連する他部位、胎盤、陰茎、前立腺、精巣、及び男性生殖器に関連する他部位）の腫瘍；気道（例、鼻腔、中耳、副鼻腔、気管、気管支、及び肺）の腫瘍（例、小細胞肺がん及び非小細胞肺がん）；骨格系（例、四肢の骨及び関節軟骨、骨関節軟骨、及び他の部位）の腫瘍；皮膚の腫瘍（例、皮膚の悪性黒色腫、非黒色腫皮膚がん、皮膚の基底細胞がん、皮膚の扁平上皮がん、中皮腫、及びカポジ肉腫）；並びに、末梢神経及び自律神経系、結合及び軟組織、後腹膜及び腹膜、眼及び付属器、甲状腺、副腎、及び他の内分泌腺及び関連構造体、呼吸器系及び消化器系の続発性悪性新生物及び他の部位の続発性悪性新生物を含む、他の組織に関連する腫瘍が挙げられる。
より具体的には、本発明のキット、組成物、及び方法は、肉腫の治療に使用することができる。一部の態様では、本発明の組成物及び方法は膀胱がん、乳がん、慢性リンパ性白血病、頭頸部がん、子宮体がん、非ホジキンリンパ種、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、及び前立腺がんの治療に使用される。
本発明の組成物及び方法を用いて有利に治療できる腫瘍として、ＰＴＥＮ欠損腫瘍（例えば、M.S. Neshat et al., PNAS, 2001, 98: 10314-10319; K. Podsypanina et al., PNAS 2001, 98: 10320-10325; G.B. Mills et al., PNAS, 2001, 98: 10031-10033; 及びM. Hidalgo and E.K. Rowinski, Ondogene, 2000, 19: 6680-6686を参照）が挙げられる。既に上述したように、ＦＲＡＰ／ｍＴＯＲキナーゼは、ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子の欠損のために複数のがんを増大方向に調節するホスファチジルイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔシグナル伝達経路の下流に位置する。ＰＴＥＮ欠損腫瘍は、遺伝子型分析及び／又はin vitro培養及び生検腫瘍検体の試験を用いて同定しうる。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ／Ａｋｔ−ｍＴＯＲ経路の異常に関連するがんの制限しない例としては、それらに限られないが、異常成長因子受容体（例、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦ−Ｒ及びＩＬ−２）に関連する肺、膀胱、卵巣、子宮内膜、前立腺、若しくは子宮頸部の腫瘍、神経膠腫、及びリンパ腫；Ｐ１３キナーゼの異常に関連する卵巣腫瘍、ＰＴＥＮの異常に関連する黒色腫及び胸部、前立腺若しくは子宮内膜の腫瘍；Ａｋｔの異常に関連する胸部、胃、卵巣、膵臓及び前立腺がん；ｅｌＦ−４Ｅの異常に関連するリンパ腫、胸部若しくは膀胱のがん、及び頭頸部のがん；サイクリンＤの異常に関連する外套細胞リンパ腫、乳がん、及び頭頸部がん；並びにＰ１６の異常に関連する家族性黒色腫及び膵臓がんが挙げられる。
本発明のキット、組成物、及び方法はまた糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、黄斑変性症、又は心血管疾患のような病的血管新生に関連する疾患の治療にも使用することができる。
［薬剤キット］
本発明の実施には多様な他のパッケージの選択肢も利用可能である。本発明の薬剤キットとしては、化合物１単独又はｍＴＯＲ阻害剤と化合物１との一緒若しくは同時の投与を可能にする、化合物１及び／又はｍＴＯＲ阻害剤を含有する薬剤組成物の１種又は２種以上の成分を収容した１又は２以上の容器（例、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ、又はビン）を備える。本キットは場合により用量決定、投与及び／又は治療する患者集団・患者数についての指示を含む。
１つの薬剤パッケージにおける個々の異なる成分を固体（例、凍結乾燥）又は液体形態で供給することができる。各成分は一般に、そのそれぞれの容器内で等分に分けるのに適した形態又は濃縮形態で供給されよう。薬剤パック又はキットは凍結乾燥成分を再構成する（元に戻す）ための媒質を備えていてもよい。キットの個々の容器は、市販のために密閉状態に保持することが好ましい。
或いは、化合物１とｍＴＯＲ阻害剤の両者が経口投与用に処方される（例、キットは化合物１を経口投与用の単位剤形の形態で、リダフォロリムス、シロリムス又はエベロリムスのいずれかも経口投与用の単位剤形の形態で含む）。経口投与用に処方された製品、例えば、カプセル剤、錠剤等は、ブリスターパックに入れてパッケージされ、このパックは、選択された投与スケジュールに従ってレイアウト及び／又はラベル貼りされうる。
以下の実施例は、本発明の方法及び化合物をいかに実施、製造及び評価するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するように提示したものであり、本発明の純粋な例示を意図し、本発明の範囲を制限する意図はない。
慢性骨髄性白血病のためのＢＣＲ−ＡＢＬおよび変異体の阻害
（実験操作）
阻害剤：イマチニブをＰＢＳに溶解して１０．０ｍＭの保存溶液を作製し、１０μL 部分に分けて、−２０℃で保存した。化合物１、ニロチニブおよびダサチニブをＤＭＳＯに溶解して１０．０ｍＭの保存溶液を作製し、１０μL 部分に分けて、−２０℃で保存した。１０．０ｍＭの保存溶液の連続希釈を各実験での使用直前に行った。化合物１（３−（イミダゾ〔１．２ｂ〕ビリダジン−３−イルエチニル）−４−メチル−Ｎ−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）ベンズアミド）は本明細書に記載のようにして調製できる。
ＡＢＬ T315I ：化合物１複合体の結晶化および構造決定：マウスＡＢＬT315I のキナーゼドメイン（残基２２９−５１５）を大腸菌（E.coli）においてＹｏｐＨプロテインチロシンホスファターゼと共発現させ、既報（Ｒｅｆ．）のようにして精製した。ＡＢＬT315I の精製は、化合物１の存在下で、金属アフィニティ−：ＭｏｎｏＱおよびサイズ排除クロマトグラフィーカラムの組み合わせを用いて行い、ほぼ均質（＞９５％）とした。化合物１と結合した最終精製ＡＢＬT315I の典型的収率は約１ｍｇ／Ｌであった。ＡＢＬT315I および化合物１の共結晶を、等量の化合物１：ＡＢＬT315I 複合体（２５ｍｇ／ｍＬ）とウエル溶液（３０％ｗ／ｖポリエチレン４０００、０．２Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、pH８．５）とを混合することにより、４℃での懸滴蒸気拡散法により成長させた。１〜２日後、結晶が５０×５０×３００μｍ3 の典型的サイズに達し、凍結防止剤として３０％ｖ／ｖグリセロールを添加した母液中に回収した。Ｘ線回折データを１００Ｋでビームライン（beam line)１９ＢＭにおいて集めた（Advanced Photon Service 、アルゴンヌ、イリノイ) 。データをＨＫＬ２０００パッケージを用いることによりスペースグループＰ２１においてインデクセーションおよびスケーリングを行った。ＡＢＬT315I との複合体中の化合物１の構造を、イマチニブと結合した野生型ＡＢＬ（ＰＤＢコード：１ＩＥＰ）の構造を用いてＡＭｏＲｅによる分子置換によって決定した。非対称単位に２つのＡＢＬT315I 分子が存在した。Ｑｕａｎｔａ（Accelrys Inc. 、サンディエゴ、カリフォルニア) におけるマニュアルリビルディングと組み合わせたＣＮＸによって構造をさらに正確なものとし、リファインメントおよびモデルビルディングの数サイクルの後、化合物１をデンシティ（density)中に構築した。さらにリファインメントおよびモデルビルディングをコンバージェンス（convergence)に達するまで行った。１．９５Åにリファインされた最終モデルは、不規則な活性化ループ中の３８６−３９７を除いて、残基２２８−５１１からなる。結合した阻害剤である化合物１およびＩ３１５の側鎖についての電子密度は、両複合体において、阻害剤の結合様式にあいまいさを残さず十分解像された。
ＡＢＬ T315I の自動リン酸化分析：全長チロシン−脱リン酸化ＡＢＬおよびＡＢＬT315I (Invitrogen;サンディエゴ、ＣＡ）を用いたキナーゼ自動リン酸化分析を、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブまたは化合物１の存在下で既報（O'Hare et al., Blood 104:2532(2004))のようにして行った。使用した阻害剤の濃度は０、０．１、１、１０、１００、１０００ｎＭであった。
細胞系：Ｂａ／Ｆ３トランスフェクタント（全長の野生型ＢＣＲ−ＡＢＬまたは１つのキナーゼドメイン変異をもつＢＣＲ−ＡＢＬを発現する）を１０％ＦＣＳ、１unit/mL ペニシリンＧ、および１mg/mL ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（完全培地）中に３７℃、５％ＣＯ2 で維持した。ＢＣＲ−ＡＢＬT315A を発現するＢａ／Ｆ３細胞系は、Dr. Neil Shah, USCF の好意により供与された。Ｂａ／Ｆ３親細胞にはＷＥＨＩ−調整培地により提供されるＩＬ−３が補充された。細胞増殖アッセイの前に、各Ｂａ／Ｆ３細胞系よりＲＮＡを分離し、ＲＴ−ＰＣＲ、次いでMutation Surbeyor ソフトウェア（SoftGenetics, State College, PA)を用いるＤＮＡ配列分析によりキナーゼドメイン変異を確認した。
細胞増殖アッセイ：Ｂａ／Ｆ３細胞系を９６−ウェルプレート（４×１０3 細胞／ウェル）に分配し、漸増する濃度の化合物１と共に７２時間インキュベートした。野生型または変異型のＢＣＲ−ＡＢＬのいずれかを発現する系においてＩＣ50測定に使用する阻害剤の濃度は、０、０．０４、０．２、１、５、２５、１２５および６２５ｎＭであった。Ｂａ／Ｆ３親細胞においてＩＣ50測定に使用する阻害剤の濃度は、０、１、５、２５、１２５、６２５、３１２５および１０，０００ｎＭであった。増殖は、メタンチオスルホネート（ＭＴＳ）系の生存率分析（CellTiter96 Aqueous One Solution Reagent; Promega,マディソン、WI) を用いて測定した。ＩＣ50値は４回反復した３つの独立した実験の平均値として報告される。ＣＭＬまたは正常な初代細胞を用いる細胞増殖実験には、ＣＭＬ骨髄性急性転化（Ｍ−ＢＣ）患者の末梢血からまたは健康な個人からＦｉｃｏｌｌグラディエント（GE Healthcare ）上で単核細胞を分離した。細胞を９６−ウエルプレート中（５×１０4 細胞／ウエル）、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１００μＭβ−メルカプトエタノールを加えたＲＰＭＩ中の漸増させた濃度（０〜１０００ｎＭ）の化合物１上に播種した。７２時間のインキュベーション後、細胞をＭＴＳアッセイに付すことにより細胞生存率を評価した。すべての値は薬剤を含まない対称ウエルに対して正規化した。
Ｂａ／Ｆ３細胞系におけるＣｒｋＬリン酸化：野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ又はＢＣＲ−ＡＢＬT315I のいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞（５×１０6 細胞／ウエル）を、阻害剤の不存在下またはイマチニブ（２０００ｎＭ）、ダサチニブ（５０ｎＭ）、ニロチニブ（５００ｎＭ）もしくは化合物１（0. 1〜1000ｎＭ）の存在下、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ中で４時間培養した。細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を加えた沸騰ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に入れて直接溶解させた。溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＣｒｋＬ抗体Ｃ−２０（Santa Cruz) でイムノブロッティングを行った。リン酸化および非リン酸化ＣｒｋＬを示差的バンド移動度により区別し、そしてバンドシグナル強度をLumi Imager (Roche) でデンシトメトリーにより定量し、リン酸化ＣｒｋＬ率 (％) として示した。
ＢＣＲ−ＡＢＬ T315I 患者試料の化合物１へのex vivo 暴露：インフォームドコンセントを得た後、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I 変異を有するリンパ性急性転化におけるＣＭＬ（ＣＭＬ Ｌ−ＢＣ）患者由来の末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離により分離した。ＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定分析により、試料が主にＢＣＲ−ＡＢＬT315I 変異を含んでいることを確認した。単核細胞（５×１０6 細胞／ウエル）を、阻害剤の不存在下またはイマチニブ（１０００ｎＭ）、ダサチニブ（５０ｎＭ）、ニロチニブ（２００ｎＭ）もしくは化合物１（５０ｎＭ、５００ｎＭ）の存在下、２０％ＢＩＴ (Stem Cell)、40μｇ／ｍＬヒト低密度リポタンパク質および100 μＭ β- メルカプトエタノールを加えた無血清ＩＭＤＭ培地（Invitrogen) で一晩培養した。細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を加えた沸騰ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に入れて直接溶解させた。溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＣｒｋＬ抗体Ｃ−２０（Santa Cruz) でイムノブロッティングを行った。リン酸化および非リン酸化ＣｒｋＬを示差的バンド移動度により区別した。バンドシグナル強度をLumi Imager (Roche) でデンシトメトリーにより定量した。
ＦＡＣＳによる全体のチロシンリン酸化：単核細胞（２×１０5 ) を阻害剤の不存在下またはイマチニブ（１０００ｎＭ）、ダサチニブ（５０ｎＭ）、ニロチニブ（２００ｎＭ）もしくは漸増させた濃度の化合物１（５０ｎＭ、５００ｎＭ）の存在下、無血清培地で一晩培養した。細胞を固定、および製造者（Caltag、サンディエゴ、CA) の指示により透過処理し、２μｇの抗ホスホチロシン４Ｇ１０−ＦＩＴＣ抗体（BD Biosciences、サンホゼ、CA) と共に１時間インキュベーションを行い、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを加えたＰＢＳで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド中に固定した。ＦＩＴＣシグナル強度をＦＡＣＳＡｒｉａ装置（ＢＤ）で分析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。値は、非染色の対称に対するＭＦＩの増大倍率として報告する。
初代ＣＭＬ細胞および正常骨髄の造血性コロニー形成アッセイ：ＢＣＲ−ＡＢＬT315I をもつ初代ＣＭＬ細胞および正常な造血性前駆体に対する化合物１の影響を評価するために、フィコール密度遠心分離により分離された骨髄単核細胞を漸増させた濃度の化合物１（ＣＭＬ患者：０、１０、２５、５０ｎＭ；健康な個人：０、１００、２００、５００、１０００ｎＭ）と共に培養した。顆粒球／マクロファージコロニー形成（ＣＦＵ−ＧＭ）を評価するために、細胞を、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を含むＩＭＤＭ：メチルセルロース培地（１：９ｖ／ｖ）（Methocult GF H4534; Stem Cell Technologies、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア、カナダ）１ｍＬ中で３組培養した（５×１０4 細胞／プレート) 。細胞を加湿したインキュベーター中３７℃で14〜18日培養した。＞５０細胞／コロニーを陽性コロニースコアリングの基準としてコロニーを計測した。結果は未処理対照±ＳＥＭに対するコロニーの割合として報告する。
薬物動態学：化合物１（クエン酸塩緩衝液中、pH２．７４）の薬物動態プロフィールを、経口強制栄養によって１回量を投与した後ＣＤ−１雌マウスにおいて評価した。血液試料を各種時点で集め、血漿中の化合物１の濃度を、タンパク質沈降およびブランクマウス血漿中で調製された較正標準を用いる内部標準ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により測定した。報告された濃度は３−マウス／時間／用量群からの平均値である。
Ｂａ／Ｆ３生存モデル：野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ又はＢＣＲ−ＡＢＬT315I を発現するＢａ／Ｆ３細胞を、ＳＣＩＤ雌マウスの尾静脈内に注射した（無血清培地中の１×１０7 細胞／ｍＬ懸濁液１００μL ）。７２時間後から、マウスを、ビヒクル（２５ｍＭクエン酸塩緩衝液、pH２．７５）、化合物１、またはダサチニブでの経口強制栄養により１日１回、連続１９日間まで処置した。動物をＩＡＣＵＣガイドラインにより瀕死となったら致死させ、剖検でのマウスの評価は腫瘍細胞浸潤で生じる脾腫による死亡と一致した。生存データをKaplan-Meier法を用いて分析し、統計的有意性を各処置群とビヒクル群の生存時間を比較することによりLog-rank試験（GraphPad PRISM) で評価した。p ＜０．０５の値は統計的に有意であり、p ＜０．０１は統計的に高度に有意であると考えられた。
Ｂａ／Ｆ３腫瘍モデル：ＢＣＲ−ＡＢＬT315I を発現するＢａ／Ｆ３細胞を雌のヌードマウスの右の側腹部に皮下移植した（無血清培地中の１×１０7 細胞／ｍＬ細胞懸濁液１００μL ）。効果の分析のために、マウスを、平均腫瘍体積が５００ｍｍ3 に達したら異なる処置群に無作為に割り当てた。マウスを連続１９日間ビヒクル（２５ｍＭクエン酸塩緩衝液、pH２．７５）又は化合物１による経口強制栄養によって１日に１回処置した。以下の式を用いて腫瘍体積（ｍｍ3 ) を算出した：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2 ×０．５。処置期間が終了した時の腫瘍増殖阻害を測定するために、腫瘍体積の変化率を式：ΔＶ＝（Ｔfinal −Ｔinitial ）／Ｔinitial ×１００ (ここでＴinitial は処置開始時の腫瘍体積であり、Ｔfinal は動物を致死させた時の体積である) を用いて全動物について算出した。各処置群の平均腫瘍体積変化を、一方向ＡＮＯＶＡ試験（GraphPad PRISM) を用いて他の全部の群と、およびダネット検定（Dunnett's test）を用いて統計的有意性についてビヒクル処置群と比較し、ここでｐ＜０. ０５の値は統計的に有意であり、p ＜０．０１は統計的に高度に有意であると考えられた。チロシン−リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬおよびＣｒｋＬのレベルの分析のために、腫瘍をもつ動物（平均腫瘍サイズ：５００ｍｍ3 ）を、経口強制栄養によりビヒクル又は３０ｍｇ／ｋｇの化合物１のいずれかの１回量で処置した。マウスへの投薬から６時間後（Ｎ＝３／群）、動物を致死させ、腫瘍サンプルをｐＢＣＲ−ＡＢＬおよびｅＩＦ４Ｅに対する抗体（Cell Signaling Technology ）によるウエスタンブロット分析および全ＣｒｋＬ（Ｃ−２０；Santa Cruz）のために集めた。
化合物１の単独剤による促進細胞系変異誘発スクリーニング：野生型ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞を、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ；５０μｇ／ｍＬ）で一晩処理し、小球状とし、新鮮培地に再懸濁し、漸増させた濃度の化合物１を加えた２００μL の完全培地中１×１０5 細胞／ウエルの密度で９６−ウエルプレートに分配した。２８日の実験の間２日毎に、倒立顕微鏡での目視検査による細胞増殖および培地の色の変化についてウエルを観察した。細胞のアウトグロウス（outgrowth)が観察されたウエルの内容物を、最初の９６−ウエルプレートと同じ濃度の化合物１を加えた完全培地２ｍＬを含む２４−ウエルプレートに移した。ある条件のウエルすべてにおいて同時に増殖が観察されたら、２４の代表ウエルをさらに分析するために拡張させた。コンフルエンシー（confluency) の状態で、２４−ウエルプレートの細胞を遠心分離により集めた。ＤＮＥａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅキット（QIAGEN, Inc.バレンシア、ＣＡ）を用いて、ＤＮＡを細胞ペレットから抽出した。ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメインをプライマーＢ２Ａ（5'TTCAGAAGCTTCTCCCTGACAT3') およびＡＢＬ４３１７Ｒ（5'AGCTCTCCTGGAGGTCTCC3')を用いて増幅し、ＰＣＲ産物をプライマーＡＢＬ３３３５Ｆ（5'ACCACGCTCCATTATCCAGCC3')およびＡＢＬ４２７５Ｒ（5'CCTGCAGCAAGGTAGTCA3') を用いて業者（Agencourt Bioscience Corporation、ベヴァリー、ＭＡ）により２方向に配列決定し、クロマトグラムをMutation Surveyor ソフトウェア (SoftGenetics、State College 、PA) を用いて変異について分析した。このスクリーニングの結果は３回の独立実験からの累積データとして報告される（表２）。１回の独立実験においてＢＣＲ−ＡＢＬT315I ( 表３参照）またはＢＣＲ−ＡＢＬE255V （表４参照）を発現するＢａ／Ｆ３細胞で開始する化合物１単独剤についても上記と同様に変異誘発スクリーニングを行った。
（結果）
(1) ＡＢＬ T315I との複合体中の化合物１のＸ線結晶解析
最近のＸ線結晶学的検討により、ＡＢＬ変異体のキナーゼドメインにおけるT315I 変異は、野生型ＡＢＬ中のT315側鎖でなされるはずの水素結合を形成することをイマチニブ、ニロチニブおよびダサチニブのそれぞれが妨げる単一の点変異として作用することが明らかにされた。化合物１の結合のＤＦＧ−アウトモード（out-mode) およびタンパク質接触の全体ネットワークはイマチニブのものと似ているが、少なくとも１つの重要な違いがある：化合物１のエチニル結合が、他の阻害剤で見られる立体的衝突を避けるような位置に分子を置き、I315との生産的ファンデアワールス相互作用を可能にする。
(2) 化合物１はＡＢＬ T315I の触媒活性を阻害する。
精製した脱リン酸化全長野生型ＡＢＬキナーゼおよびＡＢＬT315I キナーゼタンパク質を用いた生化学的アッセイにおいてイマチニブ、ニロチニブおよびダサチニブと比較した化合物１の活性を試験した。全長ＡＢＬT315I キナーゼのvitro[γ-32 P]-ATP自動リン酸化により測定して、各阻害剤が野生型ＡＢＬの酵素活性を減少させたのに対し、化合物１のみがＡＢＬT315I 変異体に対して有効であった。化合物１による類似の効力ある阻害が、ＡＢＬG250E 、ＡＢＬY253F およびＡＢＬE255K を含む、試験した追加の臨床的に関連するイマチニブ耐性ＡＢＬ変異体について見られた。これらの結果は、化合物1 が野生型およびＡＢＬT315I キナーゼ変異体を含むキナーゼドメイン変異体ＡＢＬキナーゼを直接標的とすることを実証した。
(3) 化合物１は野生型またはＢＣＲ−ＡＢＬ T315I を含む変異体ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞の増殖を阻害する。
Ｂａ／Ｆ３親細胞および、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ、またはキナーゼドメインに単一の変異(M224V, G250E, Q252H, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315A, T315I, F317L, F317V, M351T, F359V, またはH396P)をもつＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞を用いて細胞増殖アッセイを行った。化合物１は野生型ＢＣＲ−ＡＢＬ (ＩＣ50：0.5nM)を発現するＢａ／Ｆ３細胞の増殖を強く阻害した。特に、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I 変異体 (ＩＣ50：１１nM）を含む試験したすべてのＢＣＲ−ＡＢＬ変異体は化合物１に感受性のままであった (ＩＣ50：0.5-36nM；表１) 。アネキシン（Annexin)Ｖでの染色により、化合物１による増殖の阻害はアポトーシスの誘導と関連していることが示された（データ示さず）。Ｂａ／Ｆ３親細胞の増殖阻害は、１７１３ｎＭの化合物１濃度までＩＣ50に達さず、これは阻害効果がＢＣＲ−ＡＢＬ阻害に関連していることを示唆する。
また、患者由来のＢＣＲ−ＡＢＬ陽性および陰性細胞系のパネルに対しても化合物１を試験した。Ｋ５６２、ＫＹ０１およびＬＡＭＡ細胞（急性転化のＣＭＬ患者由来）の強い増殖阻害が見られたが、３種の異なるＢＣＲ−ＡＢＬ陰性白血病細胞系に対して有意な活性は見られず、ＩＣ50はＢａ／Ｆ３親細胞のものに匹敵するかそれ以上であった（表１）。
(4) 化合物１はＢＣＲ−ＡＢＬ T315I を発現する細胞のＢＣＲ−ＡＢＬ媒介シグナリングを阻害する。
野生型ＢＣＲ−ＡＢＬまたはＢＣＲ−ＡＢＬT315I を発現するＢａ／Ｆ３細胞の標的阻害を確認するために、ＢＣＲ−ＡＢＬおよび直接のＢＣＲ−ＡＢＬ基質ＣｒｋＬのチロシンリン酸化状態を調べた（図１）。ＣｒｋＬチロシンリン酸化状態のモニタリングは、初代ヒト細胞でのＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ活性を評価する便利な手段を提供し、新規ＢＣＲ−ＡＢＬを含むＣＭＬ臨床試験での好ましい薬力学アッセイである（Druker et al., N Engl J Med 344:1031 (2001) ; Talpaz et al., N Engl J Med 354:2531 (2006) 。というのは、リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンリン酸化状態の直接測定は、タンパク質分解の不安定さにより初代細胞溶解物中ではできないためである。比較のため、臨床的ＡＢＬ阻害剤であるイマチニブ、ニロチニブおよびダサチニブを含有させた。ＣｒｋＬゲルシフトアッセイにおいて、チロシン−リン酸化ＣｒｋＬの割合はＢＣＲ−ＡＢＬの阻害に直接応答して減少する。試験した阻害剤のすべてが野生型ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞に対して有効であった (図１Ａ）のに対し、化合物１のみT315I 変異体に対する活性を実証した（図１Ｂ）。野生型ＢＣＲ−ＡＢＬまたはＢＣＲ−ＡＢＬT315I を発現するＢａ／Ｆ３細胞中の並行試験においてＢＣＲ−ＡＢＬリン酸化の阻害が見られた。ＢＣＲ−ＡＢＬリン酸化は、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブまたは化合物１で一晩処理された野生型ＢＣＲ−ＡＢＬまたはＢＣＲ−ＡＢＬT315I のいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞において評価された。ｐＢＣＲ−ＡＢＬ及びｅＩＦ４Ｅに対する抗体（ローディング・コントロール）によるイムノブロット分析により試料を分析した。
(5) 化合物１によるＣＭＬ初代細胞の処理は細胞増殖を阻害する。
ＢＣＲ−ＡＢＬによる白血病の患者由来の初代細胞への化合物１の効果を評価するために、ＣＭＬ骨髄性急性転化患者由来、または健康な個人由来の単核細胞を漸増させた濃度の化合物１に暴露し、７２時間後の生存細胞を評価した。生化学的および細胞系生存率データと一致して、化合物１は正常細胞に比べ、初代ＣＭＬ細胞における約５００倍低いＩＣ50で生存細胞数の選択的減少を引き起こした（図２Ａ）。
(6) 化合物１は初代ＣＭＬ細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬ T315I キナーゼ活性およびコロニー生成を阻害し、正常細胞に対しては最小毒性を有する。
T315I 変異をもつＣＭＬ骨髄性急性転化患者由来の単核細胞の化合物１へのex vivo 暴露後の標的阻害を評価するために、Ｂａ／Ｆ３細胞系について記載したと同様のアッセイを行った。ここで細胞は阻害剤の存在下で一晩インキュベートし、回収し、溶解させ、そしてイムノブロットによりＣｒｋＬリン酸化について分析した。化合物１に暴露すると、リン酸化ＣｒｋＬシグナルにおける減少が生じ、一方、他の３種の臨床ＡＢＬ阻害剤はいずれも何ら効果を示さず（図２Ｂ）、ＦＡＣＳによる全チロシンリン酸化についてはこの患者由来の細胞を分析すると同様の結果が得られた（図２Ｃ）。
また、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I をもつＣＭＬ加速相の患者由来および健康な個人由来の単核細胞を用いて骨髄性コロニー生成アッセイにおいて化合物１の効果を評価した。細胞を阻害剤の存在下メチルセルロース中に播種し、約１４〜１８日間培養し、そして倒立顕微鏡で計測した。ニロチニブもダサチニブもT315I 患者由来の細胞に対して何ら効果を示さなかったが、化合物１は濃度依存的にコロニーの生成を阻害した（図３Ａ）。対照的に化合物１は５００ｎＭ以下の濃度では正常な造血細胞に何ら毒性を示さなかった（図３Ｂ）が、これは正常細胞を用いて行った細胞増殖アッセイと一致する（図２Ａ）。
(7) 経口での化合物１はＢＣＲ−ＡＢＬ T315I 依存性疾患のマウスにおいて生存を延ばし腫瘍負荷を低減する。
化合物１のin vivo 薬物動態プロフィールを調べるために、マウスに経口強制栄養により化合物１の１回量（２．５または３０ｍｇ／ｋｇのいずれか）を投与し、化合物１の血漿中濃度を投与後２、６および24時間においてLC/MS/MSによって測定した。化合物１は経口で生物利用が可能であり、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で処置したマウスは２、６および２４時間においてそれぞれ８９．６、５８．２および１．９ｎＭの平均血漿中レベルを達成した。３０ｍｇ／ｋｇの増加させた用量では、平均血漿中レベルが２、６および２４時間においてそれぞれ７８１．７、５６１．３および７．９ｎＭを達成した。用量−暴露比例が、２．５ｍｇ／ｋｇ（ＡＵＣ0-24h :767 nmol-h/mL) および３０ｍｇ／ｋｇ（ＡＵＣ0-24h :7452 nmol-h/mL)用量の間で見られた。また、これらのデータは、試験したすべてのＢＣＲ−ＡＢＬ変異体についてin vitroでのＩＣ50値を超える化合物１の血中濃度を、適度な経口用量で数時間維持できることを実証する。
次いで、ＣＭＬの十分確立したいくつかのマウスモデルにおいて化合物１のin vitro活性を評価した。まず、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞をマウスの尾静脈内に静脈内注射した生存モデルにおいて活性を調べた。図４Ａに示すように、化合物１またはダサチニブのいずれかでの処置により、ビヒクル処置マウスでの１９日間の半数生存期間（median survival)に比べ、生存期間が延びた。ダサチニブの経口日用量５ｍｇ／ｋｇ−これは効果的な投与計画として報告されてきた（Lombardo et al., J Med Chem 47:6658 (2004)) −は半数生存期間を２７日に延ばした（ｐ＜０．０１）。同様に、化合物１の経口日用量２．５および５ｍｇ／ｋｇは半数生存期間をそれぞれ２７．５および３０日に延ばした（両用量レベルについてｐ＜０．０１）。
次いで、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I を発現するＢａ／Ｆ３細胞を用いるこの同じ生存モデルにおいて、化合物１の活性を評価した。１６日の半数生存期間であるビヒクル処置マウスに比べ、化合物１での処置（１９日間まで）により用量依存的に生存期間が延びた（図４Ｂ）。化合物１の経口日用量２．５ｍｇ／ｋｇでは半数生存期間を０．５日延ばしただけだが（ｐ＞０．０５）、５、１５および２５ｍｇ／ｋｇで投薬した化合物１では、半数生存期間をそれぞれ１９．５、２６および３０日に延ばした（３つの用量レベルすべてについてｐ＜０．０１）。対照的に、このT315I 生存モデルを用いる独立した並行実験により、ビヒクルまたはダサチニブで処置したマウス間の半数生存期間の違いは確認されなかった（図５）。
化合物１の抗腫瘍活性を、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I を発現するＢａ／Ｆ３細胞をマウスに皮下注射した異種移植モデルにおいてさらに評価した。腫瘍増殖は、ビヒクル処置マウスに比べ用量依存的に（図４Ｃ）化合物１により阻害され、１０および３０ｍｇ／ｋｇの経口日用量で腫瘍増殖は有意に抑制された（％Ｔ／Ｃ＝それぞれ６８％および２０％、両用量レベルについてｐ＜０．０１）。化合物１を５０ｍｇ／ｋｇで毎日経口投薬すると、有意な腫瘍退縮を生じ（％Ｔ／Ｃ＝０．９％、ｐ＜０．０１）、処置開始時に比べ最終測定時には平均腫瘍体積が９６％減少した。標的阻害を確認するために、ビヒクルまたは化合物１の１回の投薬の６時間後に回収したマウス由来の腫瘍において、リン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬT315I およびリン酸化ＣｒｋＬのレベルを評価した。図４Ｃに示すように、３０ｍｇ／ｋｇの経口１回量によりリン酸化ＢＣＲ−ＡＢＬおよびリン酸化ＣｒｋＬのレベルが顕著に低下した。
(8) 化合物１の単独薬剤は耐性サブクローンのアウトグロウスを完全に抑制するのに十分である。
細胞増殖Ｂａ／Ｆ３パネルにおいて探査されなかった抵抗性に敏感な可能な部位、特に化合物１−特異的変異（例えば、阻害剤−酵素接触残基）を調べるため、および化合物１が他の阻害剤単独薬剤を上回る利点を提供するかどうかを評価するために、本発明者らがこれまでイマチニブ、ニロチニブおよびダサチニブに対して実証してきた、確立された促進変異誘発アッセイにおいてこの化合物を試験した。
野生型ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞から開始する一連の実験において、いくつかの濃度の化合物１（５−４０ｎＭ）で抵抗性プロフィールを確立し、アウトグロウスを有するウエルのパーセンテージおよび観察された変異の範囲の両方において濃度依存的減少を見出した（図６Ａ）。５ｎＭの化合物１において、すべてのウエル（５７６／５７６）はアウトグロウスを示し、配列決定された代表的サブクローンの９０％が野生型ＢＣＲ−ＡＢＬを発現した（表２）。化合物１の濃度を１０ｎＭに上げると、アウトグロウスの顕著な減少（１６８／１４４０ウエル、１１．７％）および変異したサブクローンの頻度の増加（３３．１％、表２）の両方を生じた。回収された変異は、いくつかのＰ−ループ残基（Ｇ２５０、Ｑ２５２、Ｙ２５３およびＥ２５５）での発生、Ｃ−ヘリックス（Ｋ２８５、Ｅ２９２およびＬ２９８）またはその近くでのクラスター、およびＴ３１５（Ｔ３１５Ｉ）、Ｆ３１７、Ｖ３３９、Ｆ３５９、Ｌ３８７およびＳ４３８を含んでいた。回収された変異の中で、そのほとんどがイマチニブ抵抗性（またはニロチニブもしくはダサチニブ抵抗性）において以前に報告されていた（O'Hare et al., Blood 110:2242 (2007)で概説) 。化合物１に特異的な新規な変異には出会わなかった。Y253、T315およびF317の位置は接触残基であり、K285は水素結合の寄与に欠かせないE286に隣接する。
T315I を完全に抑制する濃度で存続している変異は、化合物１への抵抗性に重要性を示すようであるので、次に２０ｎＭの化合物１を調べ、アウトグロウスが急速に縮小する（３／１４４０ウエル、０．２％、図６Ａ、表２）ことを見出し、E255V およびT315I の2 つの変異だけが残った。このように、本発明者らの広範な調査の中で、化合物１に高レベルの抵抗性を与える得る、これまでに未発見の変異を同定した。Ｂａ／Ｆ３親細胞でのＩＣ50よりも４０倍以上低い濃度である４０ｎＭの化合物１で、in vitro抵抗性の完全な抑制が達成された。この抵抗性アウトグロウスの欠如を、より高濃度の化合物１（８０、１６０、３２０ｎＭ、データは示さず）においてさらに確認した。本発明者らの知る限り、他のＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤単独薬剤でこの能力を有するものは示されていない。
(9) 化合物１の複合変異体に対する影響
化合物１での療法は、イマチニブおよび少なくとも１つのサルベージ療法（ＦＤＡ−認可第２ラインのＡＢＬキナーゼ阻害剤など）の不首尾の設定において試験されるようなので、T315I およびその他の抵抗性付与変異が予め存在する可能性がかなりある。これまで希少であり少数の症例でしか報告されていないが、患者は同じ対立遺伝子中に予め存在する変異と関連した第２のキナーゼドメイン変異を含む複合ＢＣＲ−ＡＢＬ変異により成功しないこともありうる（Khorashad et al., Blood 111:2378 (2008); Shah et al., J Clin Invest 117:2562 (2007); Stagno et al., Leuk Res 32:673 (2008)) 。単一のキナーゼドメイン変異のレベルにおける非常に限定された抵抗性感受性を見出し、複合変異への化合物１の敏感さの検討を必要とした。
主にT315I サブクローンをもつ患者を処置するために化合物が使用される状況を模するために、再び促進変異誘発アッセイを行い、今回は存在するT315I 変異のバックグラウンドで開始した（図８Ｂおよび表３）。やはり濃度依存の階層があり、阻害剤はすべての試験した複合変異体を制御できることを見出した。Y253H/T315I およびE255V/T315I を除くすべての複合変異体を160 ｎＭの濃度の化合物１で除去した。３２０ｎＭにおいては、唯一の残った複合変異体は、２つの最も抵抗性の単一変異体を結合させるE255V/T315I であり、アウトグロウスは、最も高い試験濃度（６４０ｎＭ）であるが、Ｂａ／Ｆ３親細胞でのＩＣ50のほぼ３倍以下での濃度で完全に抑制された。この抵抗性プロフィールは、化合物１に対し最も抵抗性の単一ＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメイン変異であるＢＣＲ−ＡＢＬE255V のバックグラウンドから開始した引き続くスクリーニングにおいて確認され、E255V/T315I 複合変異体が320 ｎＭで残り、640 ｎＭで除去された (表４）。
（考察）
化合物１は、ＡＢＬおよびＡＢＬT315I のキナーゼドメインの不活性なＤＦＧ外（ＤＦＧ−out)の構造に結合し、T315I 変異に近接する炭素−炭素三重結合を特徴づけるＡＢＬキナーゼ阻害剤である。Ｘ線結晶学的検討により、化合物１はＤＦＧ外結合様式でＡＢＬT315I に結合することが確認された。化合物1 は広い水素結合網を維持し、またイマチニブの結合部位と有意に重複するキナーゼの領域を占めていた。化合物１は、多数のヴァン・デル・ヴァールス接触と共に、キナーゼへの５つの水素結合を形成し、キナーゼの強い阻害を生じた（ＡＢＬT315I ＩＣ50：２．０ｎＭ；野生型ＡＢＬＩＣ50：０．３７ｎＭ）。さらに、三重結合自体は、T315の側鎖と生産的疎水性接触を生じるのに最適なように位置し、一方、その線状の形と剛直な結合構造は、立体的接触を避け、化合物１の他の２つの部分をその確立された結合ポケットに位置させる柔軟性のない結合部として作用する構造的制約を強いる。
細胞増殖アッセイでの化合物１の評価により、野生型またはＢＣＲ−ＡＢＬT315I を含むキナーゼドメインＢＣＲ−ＡＢＬ変異体を発現する細胞に対する強い汎ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害、およびフィラデルフィア染色体（Ph) 陽性細胞のPh陰性細胞に対するよりも高い選択性が確認された（表１）。Ｂａ／Ｆ３細胞においては、これは野生型ＢＣＲ−ＡＢＬを発現する細胞および親細胞との間で選択性の３０００倍以上の差となる（野生型ＩＣ50：０．５ｎＭ；親細胞ＩＣ50：１７１３ｎＭ）。結果は、細胞アッセイ（図２）および造血コロニー形成アッセイ（図３）において、化合物１でex vivo 処理した初代ＣＭＬ細胞対正常細胞についても一致した。試験したＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメイン変異体の中で、Ｅ２５５Ｖ変異体が最も化合物１に対して耐性であった（ＩＣ50：３６ｎＭ）。この変異はイマチニブに対して高レベルの耐性を、ニロチニブおよびダサチニブの両方に対して中レベルの耐性を与えることが報告されている（O'Hare et al., Blood 110:2242 (2007)) 。しかし、特に、残基Ｙ２５３およびＦ３５９における変異（これはニロチニブでの不成功（Kantarjian et al., Blood 110:3540 (2007)）の際に報告されている）、およびＦ３１７における変異（ダサチニブに対する臨床的耐性に関与（Burgess et al., Proc Natl Acad Sci USA 102:3395 (2005)) は、化合物１により、T315I 細胞に匹敵するかそれ以下のＩＣ50値で強く阻害された（表１）。
ＢＣＲ−ＡＢＬシグナリングの再活性化は、特に慢性相の疾患の患者における、臨床的ＡＢＬ阻害剤に対するキナーゼドメイン変異で媒介される耐性というよくみられる特徴であるので、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I 発現性細胞をＣｒｋＬリン酸化−野生型および変異型ＢＣＲ−ＡＢＬの確立された直接基質−についてのイムノブロット分析により分析した。in vitroでのＢａ／Ｆ３細胞およびex vivo での初代ＣＭＬ ＢＣＲ−ＡＢＬT315I 細胞の両方において、化合物１での処理はｐＣｒｋＬの割合（％）の著しい減少を生じ、一方、３種の臨床的ＡＢＬ阻害剤は何ら効果を示さなかった（図１Ｂおよび図２Ｂ）。Ｂａ／Ｆ３細胞においてｐＢＣＲ−ＡＢＬおよびｐＢＣＲ−ＡＢＬT315I のレベルを調べると同様の阻害がみられ、ｐＣｒｋＬの割合（％）読み出しの有効性が確認された。このＣｒｋＬシフトアッセイはＡＢＬキナーゼ阻害剤の薬力学的効力を試験する好ましい手段であり、その第１相評価において化合物１に使用されるであろう。
化合物１は、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬおよびＢＣＲ−ＡＢＬT315I により引き起こされるＣＭＬの一連のマウスモデルにおいて経口投与した後の強い活性を実証した。野生型ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞を用いた生存モデルにおいて、化合物１は２．５および５ｍｇ／ｋｇの低用量で著しく生存期間を延ばした（図４Ａ）。ダサチニブを５ｍｇ／ｋｇ用いて同様の効果がみられ、これは同じ用量レベルでは野生型ＢＣＲ−ＡＢＬに対するマウスでの化合物１のin vitro活性はダサチニブに匹敵することを示した。重要なことは、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I を発現するＢａ／Ｆ３細胞を用いる生存および皮下ＣＭＬモデルの両方において、化合物１が５、１５、および２５ｍｇ／ｋｇでマウスの生存期間を顕著に延長したことである（図４Ｂ）。
腫瘍の停止および退縮は皮下腫瘍モデルにおいては３０および５０ｍｇ／ｋｇで生じ、ＢＣＲ−ＡＢＬシグナリング抑制は３０ｍｇ／ｋｇの用量でみられた（図４Ｃ）。化合物１はこれらの試験で用いたすべての用量レベルで十分に許容された。これらの結果はいくつかの意味をもつ。まず、化合物１が経口的に生物利用可能である事実は臨床においてこれまで試みられてきた他のT315I 阻害剤を上回る利点を提供する。特に、ＡＢＬ／Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤ＭＫ−０４５７およびＰＨＡ−７３９３５８の両方は、ＢＣＲ−ＡＢＬ活性を阻害するのに十分な用量を達成するのに静脈投与を必要とする（Giles et al., Blood 109:500 (2007); Gontarewicz et al., Blood 111:4355 (2008))。さらに、これらの阻害剤の両方とも正常細胞およびＢＣＲ−ＡＢＬT315I 細胞の両方を同様の濃度で阻害する。対照的に、本発明者らのin vivo データでは、化合物１は、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I に依存性のＣＭＬ動物モデルにおいて5 〜50ｍｇ／ｋｇの広い治療範囲を有することが示唆される。
本発明者らはイマチニブ、ニロチニブおよびダサチニブに対する臨床的耐性を与えるＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼドメイン変異のスペクトルを予測するために以前、本発明者らの促進細胞系変異誘発スクリーニングを用いた（Bradeen et al., Blood 108:2332 (2006))。第２ラインの各ＡＢＬ阻害剤で処置したＣＭＬ患者における追加の追跡データが利用可能となりつつあり、いくかの変異がニロチニブ (L248R, Y253H, E255K/V, T315I, F359I/V; (Kantarjian et al., Blood 110:3540 (2007)) またはダサチニブ (V299L, T315I, F317I/L; (Shah et al.,J Clin Invest 117:2562 (2007))−これらは本発明者らのin vitroプロファイリングとかなり一致する−のいずれかの不成功と関連して報告されてきた。化合物１についての本発明者らの促進変異誘発スクリーニングでは、アウトグロウスを有するウエルの割合と観察された変異の範囲の両方に濃度依存性の減少が見出された。１０ｎＭの化合物１では１３の異なる残基にわたり１６の異なる置換がみられたが、濃度を２０ｎＭに急激に上げると観察された全アウトグロウス（１０ｎＭで１１．７％、２０ｎＭで０．２％）および回収された変異型（図６Ａおよび表２）の両方が減少した。２０ｎＭで回収された耐性サブクローンのみがＴ３１５１ＩまたはＥ２５５Ｖ変異をもっており、４０ｎＭ以上の化合物１ではアウトグロウスの完全な抑制がみられた（図６Ａおよび表２）。本発明者らのデータは、適宜レベルで投与された化合物１は、単一変異による耐性に対する感受性から免れるのかもしれないことを示唆する。化合物１単独薬剤を用いたこの結果は、ニロチニブまたはダサチニブといずれかと前臨床T315I 阻害剤との２剤の併用の存在下でのみこのアッセイで達成されていた（O'Hare et al., Pro Natl Acad Sci USA 105:5507 (2008)) 。
耐性アウトグロウスを抑制する化合物１の能力の程度をさらに探求するために、２つの個々の最も抵抗性の変異体、ＢＣＲ−ＡＢＬT315I またはＢＣＲ−ＡＢＬE255V のいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞のバックグラウンドから開始する促進変異誘発スクリーニングを行った。この予測的アッセイでは、ある種の複合変異、とくに化合物１に対する中〜高レベルの耐性であるＹ２５３Ｈ，Ｅ２５５ＶおよびＴ３１５Ｉからなる組の任意の２つを示した（表３および４）。これらの中でＹ２５３Ｈ／Ｔ３１５ＩおよびＥ２５５Ｖ／Ｔ３１５Ｉが化合物１に関して最も耐性の組み合わせであると予測される（図６Ｂおよび表３および４）。特に、Ｔ３１５Ｉ要素の存在により、現在認可されている臨床的ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤のいずれもこれらの変異体に対して活性でないことが示唆される。このように、化合物１は、その他すべての阻害剤に耐性が高いと予測されるであろうＴ３１５ＩおよびＥ２５５Ｖを含む複合変異を除去する能力がある。現在、ＢＣＲ−ＡＢＬのキナーゼドメイン内の複合変異は稀である（表５）が、患者の生存期間が延び、連続的ＡＢＬキナーゼ阻害剤処置を受ける患者がより多くなったことで、その優位性が向上すると考えられ、現在それらをもつ患者にとっては大きな問題をもたらす。完全に網羅的でありうる変異誘発スクリーニングはないが、本発明者らのデータから、化合物１への結合を完全に排除するであろう変異は十分なキナーゼ活性の保存と両立しないであろうことが示唆される。このモデルでは、阻害から逃げることは「機能的自殺」の犠牲をはらって生じるであろう。
本発明者らの生化学的、細胞系およびin vivo 実験の結果を組み合わせると、適宜量で投与された化合物１は、汎ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤として単独薬剤での使用を考慮することを保証するための、野生型ＢＣＲ−ＡＢＬおよび試験された全ＢＣＲ−ＡＢＬ変異体に対する十分な活性を示す。
さらに、本発明者らの結果は、化合物１がT315I を含む複合変異体を制御するための見込みがあることを示すが、単一変異段階では耐性サブクローンを除去することが有利であるという認識を高める。
臨床研究
化合物１はＢＣＲ−ＡＢＬT315I 、野生型酵素および試験した他のすべての変異体の酵素活性を強力に阻害する経口利用可能なチロシンキナーゼ阻害剤である。これはまた、＜４０ｎＭのＩＣ50でこれらのＢＣＲ−ＡＢＬ変異体を発現する細胞系の生存も阻害する。
第１相臨床試験を、化合物１の安全性を評価し、臨床的活性の予備的評価を得るために行った。試験はオープンラベル・ドーズ・エスカレーション・デザイン（open-label dose escalation design)を用いた。化合物１を合成し、本明細書に記載のように処方した。
治療に抵抗性の（または再発した、あるいは利用できる標準治療がない）血液の悪性腫瘍をもつ患者（ＥＣＯＧ状態≦２、ＱＴｃＦ≦４５０ｍｓ、適切な肝臓および腎臓機能、および正常な心臓機能）が適格であり、化合物１の経口日用量の１回量を投与された。血液の悪性腫瘍にはＣＭＬ（任意の相）、ＡＬＬ，ＡＭＬ，ＭＤＳ，ＭＭまたはＣＬＬがある。さらに、患者は登録前に、２１日以上の化学療法を受けたり、または１４日以上研究用薬剤を飲んでいてはいけなかった。
５７人の患者（女性３０人）を登録して処置し、年齢中央値が６１歳（２６〜８５歳の範囲）で診断からの年数の中央値が５．４年（０〜２１年）であった。診断はＣＭＬ５０人（慢性〔ＣＰ〕３７人、促進〔ＡＰ〕７人、ブラスト相〔ＢＰ〕６人）、Ｐｈ+ ＡＬＬ３人、およびその他の悪性腫瘍４人（骨髄線維症２人、骨髄腫１人、およびＭＤＳ１人）であった。４８人のＰｈ+ 患者（Ｐｈ+ ｐｔ）のＢＣＲ−ＡＢＬにおける変異の状態は変異のない患者１４人、変異のある患者３４人（Ｔ３１５Ｉが１４、Ｆ３１７Ｌが５、Ｇ２５０Ｅが４、２以上の変異が３、および残りはＦ３５９ＣおよびＦ３５９Ｖを含むその他の変異を示した）。他の特異的変異はＭ３５１Ｔ，Ｌ２７３Ｍ／Ｆ３５９Ｖ，Ｇ２５０Ｅ，Ｅ２７９Ｋ，Ｆ３５９Ｃ，Ｌ３８７ＦおよびＥ４５３Ｋであった）。５３人のＰｈ+ ｐｔ（ＣＭＬおよびＡＬＬ）における事前治療はイマチニブ（患者の９６％）、ダサチニブ（８７％）およびニロチニブ（５７％）であり、ここで３５ｐｔは≧３の事前ＴＫＩ、５０ｐｔは≧２の事前ＴＫＩであった。
患者を次の用量レベルで処置した：２ｍｇ（３ｐｔ）、４ｍｇ（６ｐｔ）、８ｍｇ（７ｐｔ）、１５ｍｇ（８ｐｔ）、３０ｍｇ（７ｐｔ）、４５ｍｇ（１３ｐｔ）、および６０ｍｇ（１３ｐｔ）。４５ｍｇはさらなる検討のための最大許容用量（ＭＴＤ）として同定された。患者内用量漸増が許容された。
予備的な安全性および効力のデータは次の通りであった：２〜３０ｍｇコホート（集団）：ＤＬＴなし；４５ｍｇコホート：患者１人に可逆性発疹がみられた；および６０ｍｇコホート：４人の患者がＤＬＴに関連した可逆性膵臓（膵炎）を発症した。各グレードの最も共通した薬剤関連有害事象（ＡＥ）は血小板減少（２５％）、貧血、リパーゼ低下、悪心および発疹（各１２％）、および関節痛、疲労および膵炎（各１１％）であった。
薬物動態学および薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）検討は、内部標準としての重水素化化合物１を用いた血漿分析（ＰＫ）、および全レベルに対するＢＣＲ−ＡＢＬの基質であるＣＲＫＬのリン酸化レベル（ｐ−ＣＲＫＬ）の測定（ＰＤ）を含んだ。最初の２４時間をとおして、サイクル１（Ｃ１）の８、１５および２２日目（Ｄ）、およびＣ２のＤ１での投与前（サイクル＝２８日）にサンプリングを行った。ＰＤ効果の分類は、評価できない（ベースラインでｐ−ＣＲＫＬ≦２０％または分析試料が少なすぎる）、一時的（２以上の投薬後時点でｐ−ＣＲＫＬ阻害≧５０％* 、しかしサイクル１中持続しない）、持続的（２以上の投薬後時点でｐ−ＣＲＫＬ阻害≧５０％* 、サイクル１中持続）、または効果なし（上記基準でｐ−ＣＲＫＬ阻害なし）を含んだ。* は、≧５０％の減少を信頼性をもって定量するのにベースラインのｐ−ＣＲＫＬが低すぎる（例えば、３５％）場合、≧２５％阻害が許容されることを示す。
薬物動態のデータは、化合物１の半減期が１９〜４５時間であることを実証した。≧３０ｍｇの用量では、半減期は１８時間である。図７Ａおよび７Ｂは、投薬範囲を超えて投薬するためのＣmax およびＡＵＣの直線関係を示す。図７Ｃおよび７Ｄは濃度時間プロフィールを示す。３０ｍｇ用量での１日目のＣmax は約５５ｎＭであった。投薬を繰り返した後、評価可能な患者において１．５〜３倍の蓄積がみられた。
化合物１を毎日６０ｍｇ投与された患者の薬物動態データを表６に示す。
毎日６０ｍｇ投与された場合の平均定常状態トラフレベル（１回の２８日サイクル後の投薬２４時間後でのレベル）は約４５ｎｇ／ｍＬであった。これは約９０ｎＭの循環血漿中濃度に相当し、これらの被治療者の抵抗性サブクローンの出現を抑制するために有用でありうる循環濃度である。３０ｍｇ以上の用量では、トラフレベルは４０ｎＭ（２１ｎｇ／ｍＬ）を超え、これは変異アッセイで、出現するクローンの完全な抑制が実証された濃度である（図６Ａのように）。
ＰＤデータは８ｍｇ以上の用量でのＣｒｋＬリン酸化の阻害を実証している。図８Ａに示すように、持続的標的阻害が全体の集団では≧８ｍｇ用量で、Ｔ３１５Ｉ患者では≧１５ｍｇ用量でみられた。図８Ｂ〜８Ｅは各種用量および異なる変異をもつ患者での薬力学的データを示す。全体的な最良の血液学的反応は、新規であり基準のＣＨＲを含む、２２ＣＰ患者中２２人（８５％）での完全な血液学的反応（ＣＨＲ）であり、主要な血液学的反応（ＭＨＲ）は１２ＡＰ、ＢＰまたはＡＬＬ患者中の５人であった。細胞遺伝学的反応は８人の完全細胞遺伝学的反応（ＣＣｙＲ）および１２人のＭＣｙＲであった。Ｔ３１５Ｉサブセット中の最良の血液学的反応は、新規であり基準のＣＨＲを含む、９ＣＰｐｔ中の８人（８９％）におけるＣＨＲ、および８人のＡＰ、ＢＰまたはＡＬＬ患者中の３人におけるＭＨＲであった。１２人のＴ３１５Ｉ患者中９人はＣｙＲについて評価可能であり、５人のＣＰおよび１人のＡＰ、ＢＰまたはＡＬＬ患者はＣＣｙＲを達成し、６人のＣＰおよび３人のＡＰ、ＢＰまたはＡＬＬ患者はＭＣｙＲを達成した。分子的反応は３２人のＣＰ ＡＭＬ患者において８人のＭＭＲがあった（基準値においてＴ３１５Ｉ患者中４人）。
結論：化合物１の３０ｍｇまではＤＬＴはみられず、可逆性ＤＬＴがより高い用量でみられた。ＰＫおよびＰＤは、３０ｍｇでの血中レベルはＴ３１５Ｉを含む耐性の変異ＢＣＲ−ＡＢＬイソフォームのin vitro阻害に必要なレベルを超えることを実証する。予備的分析により、ＢＣＲ−ＡＢＬのＴ３１５Ｉ変異をもつ患者を含む、認可された第２ラインのＴＫＩ、ダサチニブおよびニロチニブへの耐性をもつ患者における臨床的抗腫瘍活性の証拠が明らかにされた。これまでに得られた結果は、(1) 全集団において８ｍｇ以上の用量でみられる一貫した持続的標的阻害、(2) １５ｍｇ以上の用量でみられるＴ３１５Ｉ患者における持続的標的阻害、(3) ４５ｍｇの化合物１のＭＴＤとしての同定、および(4) 治療を受ける患者での耐性サブクローンの出現を抑制するのに必要なより高い用量が顕著な有害事象がなく許容された。トラフ薬剤濃度は、化合物１の汎用ＢＣＲ−ＡＢＬ活性の閾値を超え、≧３０ｍｇでみられる。≧１5 ｍｇの用量では、Ｔ３１５Ｉを含む種々の変異をもつ患者でＢＣＲ−ＡＢＬの持続的阻害があった。また、これらの結果は、現在利用可能なTKI で成功しなかった難治性Ｐｈ+ 患者での抗白血病活性の臨床的証拠とよく関連している。
急性骨髄性白血病のためのＦＬＴ３変異体の阻害
（実験操作）
細胞系、抗体および試薬：ＭＶ４−１１，ＲＳ４；１１，Ｋａｓｕｍｉ−１およびＫＧ１細胞はAmerican Type Cultur Collection ( マナッサス、VA) から、ＥＯＬ１細胞はＤＳＭＺ（ブラウンシュバイク、独）から入手した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｋａｓｕｍｉ−１細胞では２０％ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ１６４０を用いて標準法に従って５％（ｖ／ｖ）ＣＯ2 中３７℃で維持し培養した。化合物１をＡＲＩＡＤ Phamaceuticals ( ケンブリッジ、MA) において合成し、ソラフェニブおよびスニチニブはAmerican Custom Chemical Corporation (サンディエゴ、CA) より購入した。全化合物をＤＭＳＯ中の１０ｍＭ保存溶液として調製した。使用する抗体は以下の通りであった：Santa Cruz Biotechnology (サンタクルーズ、CA) 製のphospho-PDGFR α,PDGFRα,FLT3, FGFR1およびGAPDH ；Cell Signaling Technology ( ベヴァリー、MA) 製のSTAT5, KIT, phospho-KIT, phospho-FGFR および phospho- FLT3；BD Biosciences (サンホセ、CA) 製のphospho-STAT5 。
細胞生存アッセイ：細胞生存率をCell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega、マディソン、WI) を用いて評価した。指数的に増殖している細胞系を96- ウエルプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。播種24時間後、細胞を化合物またはビヒクル（ＤＭＳＯ）で72時間処理した。Wallac Victor マイクロプレートリーダー (PerkinElmer 、ウォールサム、MA) を用いて蛍光を測定した。データをビヒクル処理細胞に対する生存率としてプロットし、ＩＣ50 (５０％阻害を生じる濃度）をマイクロソフトエクセルのXLfit バージョン4.2.2 を用いて算出した。データは、それぞれ３回試験した、別々の３実験からの平均（±ＳＤ）として示す。
イムノブロット分析：受容体チロシンキナーゼシグナリングの阻害を調べるために、細胞をある濃度範囲（０．０３〜１００ｎＭ）にわたり化合物１で１時間処理した。細胞を氷冷ＳＤＳ溶解緩衝液（０．０６Ｍトリス−ＨＣＬ，１％ＳＤＳおよび１０％グリセロール）中で溶解させ、タンパク質濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（Thermo Scientific,ロックフォード、IL) を用いて測定した。細胞溶解液（５０μｇ）を電気泳動により分離し、NuPage試薬 (Invitrogen, カールスバッド、CA) を用いてニトロセルロース膜に移した。膜をリン酸化抗体でイムノブロットし、次いでRestore Wester Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific)で剥がし、全タンパク質抗体でイムノブロットした。ＩＣ50値をビヒクル処理細胞に対する化合物１処理細胞におけるリン酸化タンパク質の割合をプロットすることにより算出した。
アポトーシスアッセイ：カスパーゼ活性の測定のために、ＭＶ４−１１細胞を黒色の壁の９６−ウエルプレートに１×１０4 細胞／ウエル中で24時間培養し、次いで化合物１で表示した時間処理した。Apo-One Homogenous Caspase 3/7試薬 (Promega,マディソン、WI) を製造者のプロトコルに従って添加し、Wallac Victor マイクロプレートリーダーで蛍光を測定した。ＰＡＲＰ開裂を測定するために、ＭＶ４−１１細胞を６−ウエルプレートに播種し、次の日に化合物１で２４時間処理した。処理の最後に細胞をＳＤＳ緩衝液で溶解させ、全ＰＡＲＰおよび開裂ＰＡＲＰ発現の両方について測定するためにイムノブロットした（Cell Sinaling Technology) 。
皮下異種移植モデル：ＭＶ４−１１ヒト腫瘍異種移植効力の検討を、Piedmont Research Center (モリスビル、ＮＣ）によって行った。簡単に述べると、腫瘍異種移植を、ＣＢ．１７ＳＣＩＤ雌マウスの右側腹部へのＭＶ４−１１細胞（５０％マトリゲル中１×１０7 ）の皮下移植により確立し、投薬を平均腫瘍体積が約２００ｍｍ3 に達した時に開始した。化合物１を２５ｍＭクエン酸緩衝液（pH＝２．７５）のビヒクル中で希釈し、マウスに１日１回４週間経口で投薬した。腫瘍をミリメートル単位でキャリパーにより二次元で（長さおよび幅）測定した。腫瘍体積（ｍｍ3 ）を次の式で算出した：腫瘍体積＝（長さ×幅2 ）／２。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を次の式で算出した：ＴＧＩ＝（１−ΔＴ／ΔＣ）×１００、ここでΔＴは各処置群の平均腫瘍体積変化を表し、ΔＣは対照群の平均腫瘍体積変化を示す。腫瘍体積データを集め、群間の全体的な差を決定するために１方向ＡＮＯＶＡ試験（GraphPad Prism、サンディエゴ、CA) により分析した。さらに、各化合物１処置群を、ダネット（Dunnett's ）多重比較試験を用いて統計的有意性についてビヒクル群と比較した。ｐ値＜０. ０５は統計的に有意であり、ｐ値＜０. ０１は統計的に高度に有意であると考えられた。
薬物動態および薬力学：ＭＶ４−１１異種移植腫瘍の確立後、マウスに化合物１の経口１回量を投与し、６時間後に腫瘍を採取した。個々の腫瘍を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中にホモジナイズし、遠心分離により清澄化した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に移し、全体およびリン酸化ＦＬＴ３およびＳＴＡＴ５に対する抗体でイムノブロットした。血漿中の化合物１の濃度を、タンパク質沈降およびブランクのマウス血漿中で作製した較正標準を用いる内部標準ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により測定した。定量限界以下（ＢＱＬ）＝＜１．２ｎｇ／ｍＬ化合物１。報告される濃度は４マウス／群からの平均値である。
ex vivo での初代ＡＭＬ患者試料の処理：全患者試料を個人が特定されないようにし（de-identified)、Institution Review Board of Oregon Health & Scientific University から認可されたインフォームドコンセントにより集めた。急性骨髄性白血病の患者からの末梢血より、Ficollグラディエントおよび赤血球溶解により単核細胞を分離した。Guava ViaCount試薬およびGuava Personal Cell Analysisフローサイトメーター (Guava Technologies、ヘイワード、CA) を用いて細胞を定量した。細胞を９６−ウエルプレート（５×１０4 ／ウエル) 中、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、フンギソンおよび１０-4Ｍ２−メルカプトエタノールを加えたＲＰＭＩ中の漸増させた濃度（１〜１０００ｎＭ）の化合物１上に播種した。７２時間のインキュベーション後、細胞の生存率を評価するために細胞をＭＴＳアッセイ（Cell Titer Aqueous One Solution Cell Prolifiration Assay, Promega)にかけた。全部の値を、薬剤なしで播種した細胞の生存率に対して正規化し、生存率（％）を用いて各試料について化合物１のＩＣ50を決定した。ＦＬＴ３ステータスを各患者由来のゲノムでのＰＣＲにより決定した。
（結果）
(1) 化合物１は、構成的に活性なＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＦＧＦＲ１およびＰＤＧＦＲα変異体により引き起こされる造血細胞系におけるシグナリングおよび増殖を阻害した。
化合物１はＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＦＧＦＲ１およびＰＤＧＦＲαのin vitroキナーゼ活性をそれぞれ１３、１３、２、および１ｎＭのＩＣ50で阻害する。ここで、化合物１の活性は、ＦＬＴ３（ＦＬＴ３−ＩＴＤ；ＭＶ４−１１細胞）およびＫＩＴ（Ｎ８２２Ｋ；Kasumi-1細胞) における活性化変異またはＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１ＯＰ２−ＦＧＦＲ１；ＫＧ−１細胞）およびＰＤＧＦＲα（ＦＩＰＩＬ１−ＰＤＧＦＲα；ＥＯＬ−１細胞）の活性化融合物をもつ白血病細胞系のパネルにおいて評価された。化合物１は０．３〜２０ｎＭのＩＣ50の範囲で用量依存的に４種すべてのＲＴＫのリン酸化を阻害した（表７）。
これらの活性化受容体が白血病誘発に重要である（Chalandon et al., Haematologica 90:949-968 (2005))ことに一致して、化合物１は０．５〜１７ｎＭのＩＣ50で４細胞系すべての生存も強く阻害した（図９、表７）。これに対し、これらの４種の受容体における活性化変異をもたないＲＳ４；１１細胞の阻害のＩＣ50は＞１００ｎＭであった。これらのデータは、化合物１がこれらの異常ＲＴＫの１つを発現する白血病細胞を選択的に標的化することを示す。
次に、化合物１の効力および活性化プロフィールを、同じ細胞系パネルの生存率に対するその効果を並行して調べることにより、他の２つの多標的化キナーゼ阻害剤、ソラフェニブおよびスニチニブのものと比較した。ソラフェニブおよびスニチニブの強い阻害活性がＦＬＴ３（それぞれ４および１２ｎＭのＩＣ50）およびＰＤＧＦＲα（０．５および３ｎＭ）に対してみられたのに対し、化合物１がＫＩＴ（５９および５６ｎＭ）またはＦＧＦＲ１（＞１００および＞１００ｎＭ）に対して有する高い効力はいずれの化合物も示さなかった（表７）。
(2) 化合物１のＭＶ４−１１細胞に対する強いアポトーシス効果
ＡＭＬにおけるＦＬＴ３−ＩＴＤ変異の主要な臨床的関連性を考慮し、次の実験はこの標的に対する化合物１の活性の特性決定に焦点を当てた。化合物１のＦＬＴ３−ＩＴＤにより生じるＭＶ４−１１細胞の生存率に対する影響の根拠を調べるために、アポトーシスの２つのマーカーに対するその影響を測定した。カスパーゼ３／７活性の用量および時間依存性の増加が観察され、最大の誘導（４倍まで）が１０〜３０ｎＭの化合物１による１６時間以内の処置でみられた（図１０）。同様に、≧１０ｎＭ濃度では、化合物１はＰＡＲＰ開裂の最大に近い誘導、および付随するＳＴＡＴ５〔変異ＦＬＴ３−ＩＴＤキナーゼの直接下流の基質であり（Choudhary et al., Blood, 110:370-374 (2007) ) 細胞生存の重要な調節剤である〕のリン酸化の阻害を示した。これらのデータを併せると、化合物１によるＦＬＴ３−ＩＴＤの阻害はアポトーシスの誘導を通じてMV4-11細胞の生存を阻害するという結論を裏付ける。
(3) in vivo 効力および薬力学的検討
化合物１のＦＬＴ３−ＩＴＤにより生じるin vivo 腫瘍成長に対する影響を調べるため、化合物１（１〜２５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルをＭＶ４−１１異種移植マウスに１日１回経口で２８日間投与した。図１１Ａに示すように、化合物１は用量依存的に腫瘍成長を強く阻害した。試験した最小の用量である１ｍｇ／ｋｇの投与では、腫瘍成長の著しい阻害（ＴＧＩ＝４６％、ｐ＜０．０１）を生じ、２５ｍｇ／ｋｇ以上の用量では腫瘍の退縮を引き起こした。特に、１０または２５ｍｇ／ｋｇでの投薬では、完全な持続的腫瘍退縮が生じ、３１日の追跡では触知可能な腫瘍は検出されなかった。
in vivo での標的変化を確認するために、ＭＶ４−１１異種移植片マウスにビヒクルまたは化合物１を１、２．５、５または１０ｍｇ／ｋｇの経口の１回量を投与した。６時間後に腫瘍を採取し、リン酸化ＦＬＴ３およびＳＴＡＴ５をイムノブロット分析により評価した。１ｍｇ／ｋｇ化合物１の１回量はＦＬＴ３シグナリングに中程度の阻害効果を示し、ｐ−ＦＬＴ３およびｐ−ＳＴＡＴ５のレベルを約３０％低下させた。化合物１の用量を増加させると、５および１０ｍｇ／ｋｇ用量でシグナリングの阻害が増大し、それぞれシグナリングを約７５および８０％阻害した。薬物動態分析により、血漿中の化合物１濃度とＦＬＴ３−ＩＴＤシグナリング阻害の間に正の関連があることが実証された（図１１Ｂ）。これらのデータは、化合物１によるシグナリングの阻害が効力の程度と関連し（図１１Ａ）、ＦＬＴ３−ＩＴＤシグナリングの阻害がこのモデルでの化合物１の抗腫瘍活性を説明するという結論を裏付ける。
(4) 初代ＡＭＬ細胞での化合物１の活性
ＡＭＬ患者由来の初代細胞での化合物１の活性を評価するために、４人の患者から末梢血芽細胞を得た；３つは野生型ＦＬＴ３を発現し、１つはＦＬＴ３−ＩＴＤ変異をもつ。ＦＬＴ３ステータスを各患者からのゲノムＤＮＡでのＰＣＲにより確認した。細胞生存率を、化合物１に７２時間暴露した後測定した（図１２）。細胞系で得られた結果と一致して、化合物１はＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性初代芽細胞の生存を４ｎＭのＩＣ50で低下させ、一方、野生型芽細胞は試験した濃度（１００ｎＭ以下）では生存率の減少を示さなかった。これらの知見を併せると、化合物１がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異をもつ白血病細胞に対して選択的に細胞傷害性であるという結論を裏付ける。
（考察）
ここに本発明者らは、これらの受容体のそれぞれの活性化形態を含む白血病細胞系を用いて、化合物１が血液悪性腫瘍の病因に関連する別々のキナーゼ群（ＦＬＴ３、ＫＩＴおよびＦＧＦＲおよびＰＤＧＦＲファミリーのメンバー）に対して、ＢＣＲ−ＡＢＬでみられたと同様の効力で、即ち標的タンパク質リン酸化および細胞生存の阻害について、それぞれ０．３〜２０ｎＭおよび０．５〜１７ｎＭのＩＣ50で活性を示すことを示す。他の多標的化キナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブおよびスニチニブ、はこれらのキナーゼのサブセットに対して阻害活性を有することがこれまで示されてきた。しかし、本発明者らは、化合物１が４種すべてのキナーゼの活性を高い効力で阻害する能力において独特であることを見出した。化合物１はここで試験したモデルにおいてＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＦＧＦＲ１およびＰＤＧＦＲαに対して同等に効力を示すので、化合物１はこれらのキナーゼが役割を果たす疾患の処置に有用でありうる。
ＦＧＦＲ１およびＰＤＧＦＲαの遺伝的転位を有するＭＰＮは稀であると考えられている；しかし得られる融合タンパク質はこれらの疾患の病因において主要な役割を果たしていることが実証されてきた（Gotlib et al., Leukemia 22:1999-2010 (2008); Macdonald et al., Acta Haematol 107:101-107 (2002))。ＥＭＳは治療しない場合はＡＭＬに迅速に変わる進行性の疾患である。ここに本発明者らは、化合物１が、ＦＧＦＲ１ＯＰ２−ＦＧＦＲ１融合タンパク質により生じるＡＭＬ ＫＧＩ細胞系の生存を強く阻害することを示し、これは化合物１のこのタイプの疾患への臨床的適用を裏付ける。ＰＤＧＦＲα融合物を有するＨＥＬ／ＣＥＬ患者は、ＰＤＧＦＲ阻害剤のイマチニブで治療すると劇的な血液学的応答を達成し（Gotlib et al., Leukemia 22:1999-2010 (2008))、そして本発明者らは化合物１が、白血病ＥＯＬ細胞系で実証されたようにＦＩＰ１Ｌ１−ＰＤＧＦＲα融合タンパク質に対して強い活性を有することを示した。しかし、ＢＣＲ−ＡＢＬにおけるＴ３１５Ｉゲートキーパー残基に類似した位置で変異したＰＤＧＦＲαのＴ６７４Ｉ変異体は患者においてイマチニブへの耐性を与えることが実証されている（Gotlib et al., Leukemia 22:1999-2010 (2008))。重要なことに、化合物１がＰＤＧＦＲαのＴ６７４Ｉ変異体キナーゼに対して強い活性（３ｎＭのＩＣ50）を有し、これはこの融合タンパク質をもつ患者の治療に化合物１を適用することを裏付ける。
ＡＭＬにおけるＦＬＴ３−ＩＴＤの変化の発生および予知の重要性は、このキナーゼが疾患の病因に重要な役割を果たし（Levis et al., Leukemia 17:1738-1752 (2003)) 、従って治療的介入に主要な標的となることを示す。ＦＬＴ３−ＩＴＤ発現細胞系ＭＶ４−１１をを用いた本明細書に報告した検討において、本発明者らはin vitroおよびin vivo の両方におけるＦＬＴ３活性の阻害と腫瘍細胞生存率との間の密接な関係を示す。in vitroでは低いｎＭ濃度（即ち、＜１０ｎＭ）の化合物１はＦＬＴ３リン酸化の減少、生存率の低下、およびアポトーシスのマーカーにおける増加を生じさせた。in vivo 異種移植モデルでは、１ｍｇ／ｋｇの経口日用量によって、腫瘍成長の顕著な阻害を、５ｍｇ／ｋｇ以上の用量では腫瘍の退縮を生じた。腫瘍成長への影響がＦＬＴ３の阻害によることに一致して、化合物１の１ｍｇ／ｋｇの１回量によって、ＦＬＴ３−ＩＴＤおよびＳＴＡＴ５リン酸化の部分的阻害が生じ、一方、５および１０ｍｇ／ｋｇの用量では実質的阻害を生じた。最後に、化合物１はＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＩ患者から分離した初代芽細胞の生存を，強く阻害した（４ｎＭのＩＣ50）が、３人のＦＬＴ３野生型患者から分離したものはそうではなかった（ＩＣ50＞１００ｎＭ）。
ＦＬＴ３活性をもつ多くの化合物が報告され、いくつかは既に患者で評価され、比較的低い臨床活性がこれまで報告されている（例、Stirewalt et al., Nat. Rev. Cancer 3:650-665 (2003); Chu et al., Drug Resist. Updat. 12:8-16 (2009); Weisberg et al., Oncogene Jul 12 2010) 。ＦＬＴ３依存性ＡＭＬ細胞を殺すにはＦＬＴ３阻害が持続されることが必要との臨床前の検討に基づき、最大の治療的利益を達成するには、連続的でほぼ完全なＦＬＴ３キナーゼの阻害が必要かもしれないとの見解が現れた（Pratz et al., Blood 113:3938-3946 (2009)) 。本発明者らのin vitroでの検討は、完全、即ち持続した実質的なＦＬＴ３リン酸化および機能の阻害が≦10ｎＭ濃度で得られることを実証する。重要なのは、化合物１の薬物動態的特性の予備的分析により、許容できるレベルで投薬した場合に、４０ｎＭを超えるトラフレベル（即ち、次の日用量の前）が証明ざれたことである。これらのデータは、化合物１の効力および薬理学的特性により患者においてＦＬＴ３の連続的でほぼ完全な阻害が許容されるという結論を支持する。
化合物１は、ＦＬＴ３の強い阻害を示し、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するＡＭＬ細胞に対し細胞傷害性である多標的化キナーゼ阻害剤である。重要なことに、この薬剤は、追加のＲＴＫであるＦＧＦＲ１、ＫＩＴおよびＰＤＧＦＲαに対して活性を示し、これらはまた血液悪性腫瘍の病因において役割を果たすことが示されてきた。特に、これらのＲＴＫに対するin vitroでの化合物１の効力およびヒトで観察される化合物１の血漿中レベルは、これらの標的に対する化合物１の臨床的役割を裏付ける。これらの所見は一緒に、ＡＭＬおよび他の血液悪性腫瘍（ＫＩＴ、ＦＧＦＲ１またはＰＤＧＦＲαにより引き起こされるものなど）に対する新規な治療法としての化合物１の開発の強い臨床前裏付けを提供する。
ＦＬＴ３変異をもつＡＭＬ患者での予備的結果
実施例３で考察した非常に有意義な細胞を用いた結果を超え、予備的臨床試験結果は、毎日経口で投与する４５ｍｇの化合物１での処置後のＦＬＴ３−ＩＴＤを有する難治性ＡＭＬ患者における完全な反応を含む。全体として、これらの結果はＦＬＴ３−ＩＴＤによるＡＭＬおよび他の血液悪性腫瘍をもつ患者における化合物１の開発を支持する。さらに、他のキナーゼに対する阻害的プロフィールを考慮すると、ポナチニブはまた、ＫＩＴ、ＦＧＦＲ１またはＰＤＧＦＲαまたはその他のキナーゼ（野生型または変異型）により引き起こされる種々のがんに対して重要な役割ももつ。
化合物１のキナーゼ選択性プロフィール
試薬：化合物１は本明細書に記載のようにして合成した。以下の化合物は購入した：ＰＤＩ１７３０７４（Calbiochem、ギブスタウン、NL) 、ＢＭＳ−５４０２１５（American Custom Chemical、サンディエゴ、CA) 、ＣＨＩＲ−２５８およびＢＩＢＦ−１１２０（Selleck Chemical Co.、ロンドン ON 、カナダ) 。
キナーゼアッセイ：ＩＣ５０を測定するためのキナーゼ阻害アッセイはReaction BiologyCorporation (RBC、モルヴァン、PA、米国) において実施された。１μM から開始した３倍連続希釈物での１０点カーブを用いて１０μM ＡＴＰにおいて化合物を試験した。２回のアッセイからの平均データを示す。
細胞増殖アッセイ：細胞増殖をCell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega、マディソン、WI) またはCyQuant Cell Proliferation Assay (Invitrogen、カールスバッド、CA) のいずれかを用いて評価した。細胞を播種して２４時間後、細胞を化合物で処理し、７２時間培養した。50％増殖阻害 (GI50) を引き起こす濃度を、時間０ (処理時間) での細胞数について補正すること、およびマイクロソフトエクセルのXLfit バージョン4.2.2 を用いてビヒクル (ジメチルスルホキシド、DMSO) 処理細胞に対する増殖率としてデータをプロットすることにより測定した。データは、３回試験した、別々の３実験からの平均（±ＳＤ）として示す。
軟寒天コロニー形成アッセイ：軟寒天アッセイを、CytoSelect 96-Well Cell Transformation Assay (Cell Biolabs、サンディエゴ、CA) を用いて行った。簡単に述べると、細胞を0.08％寒天中に再懸濁し、96- ウエルプレート中の0.06％寒天上に播種した。細胞を播種した時点で化合物１で１回処理し、８〜１０日間インキュベートした。細胞をヨードニトロテトラゾリウムクロリド（Sigma 、セントルイス、MO) で染色するか、可溶化し、製造者のプロトコルに従ってCyQuant Dye で定量した。「ＮＤ」は測定せずを意味する。
ウエスタンイムノブロッティング：細胞を、播種２４時間後に処理し、阻害剤と共に１時間インキュベートした。細胞をＳＤＳ緩衝液またはPhospho-Sasfe TM緩衝液 (Novagen 、ギブスタウン、NJ) 中で溶解させ、タンパク質溶解物を一晩免疫沈降させ、および／または記載の抗体でイムノブロットした。タンパク質発現を、Qantity One ソフトウエア (BioRad、ハークルス、CA) を用いて定量した。ＩＣ５０値 (50％阻害を引き起こす濃度) をXLfit4を用いて、全タンパク質シグナルに対して正規化したホスホ- シグナルの阻害率 (％) をプロットすることにより算出した。表に示したデータは２〜３回のアッセイからの平均値である。
皮下腫瘍モデル：ＡＮ３ＣＡ細胞をヌードマウスの右側腹部に移植した。効果の分析のために、平均腫瘍体積が約２００ｍｍ3 に達したら、阻害剤を１２日間毎日経口投薬により投与した。平均腫瘍体積（±ＳＥ；腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2 ×0.5)を各処置群について算出した。
薬物動態／薬力学：薬力学的分析のために腫瘍試料を採取したら凍結し、Phospho-SafeＴＭ緩衝液中にホモジナイズし、ウエスタンイムノブロッティングにより分析した。血漿中の阻害剤濃度をタンパク質沈降およびブランクのマウス血漿中で作製した較正標準を用いる内部標準ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより測定した。示したデータは３マウス／時点／群からの平均値である。
化合物１のin vitroでの効力および選択性をマルティプル組換えキナーゼドメインおよびペプチド基質を用いたキナーゼアッセイにおいて評価した（表８）。化合物１は、受容体チロシンキナーゼのＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲおよびＶＥＧＦＲファミリーのメンバー（ＦＬＴ１、ＦＬＴ４およびＫＤＲなど）を阻害することが見出された（表１）。化合物１は、４種すべてのＦＧＦ受容体：ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、およびＦＧＦＲ１（Ｖ５６１Ｍ）およびＦＧＦＲ２（Ｎ５４９Ｈ）の強い阻害剤であり（表８）、これは４種すべてのＦＧＦＲは阻害しない他の多標的化キナーゼ阻害剤（例、スニチニブ、ソラフェニブ、およびダサチニブ）と比べた場合に独特である。しかし、特に、化合物１はＡｕｒｏｒａまたはインスリンキナーゼファミリーのメンバーは阻害せず、またシクリン（cyclin) 依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）／ＣｙｃｌｉｎＥも阻害しなかった。
がんの細胞モデルにおけるの化合物１の効果
化合物１は各種がん細胞系で細胞活性に影響を及ぼした。実験操作は実施例５に記載の通りに行った。ＦＧＦＲ１−ＦＧＦＲ１ＯＰ２融合遺伝子を発現した急性骨髄性白血病由来のＫＧ１細胞系において、化合物１は細胞増殖およびＦＧＦＲ１のリン酸化を阻害した。図１３Ａは、１０ｎＭという限定されたＧＩ５０での化合物１のＫＧ１細胞系に対する増殖阻害を示す。化合物１は１０ｎＭのＧＩ５０でＦＧＦＲ１のリン酸化を阻害し、これは化合物１で処理されたＫＧ１細胞でのＰ−ＦＧＦＲ１、Ｔ−ＦＧＦＲ１およびグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（「ＧＡＤＰＨ」）の発現のウエスタンイムノブロット分析により測定した。
化合物１はまた、正常細胞に比較し、がん細胞の細胞活性に選択的に影響しうる。化合物１は、ｗｔＦＧＦＲ２ ＳＮＵ１細胞に比べ、増幅したＦＧＦＲ２をもつＳＮＵ１６胃癌細胞を選択的に阻害した（図１４）。化合物１は、ＳＮＵ１６胃癌細胞でのタンパク質発現についてのウエスタンイムノブロット分析において、低下させたリン酸化ＦＧＦＲ２、ＦＲＳ２ａおよびＥｒｋ１／２の存在により測定すると、ＳＮＵ１６でのシグナリングを阻害した。化合物１は、ｗｔＦＧＦＲ２ ＳＮＵ１細胞に比べた場合、軟寒天でのＳＮＵ１６コロニー形成も選択的に阻害した（図１５）。表９は、ｗｔＦＧＦＲ２ ＳＮＵ１細胞系と比べた、胃癌細胞系ＳＮＵ１６およびＫａｔｏＩＩＩにおける化合物１の活性のまとめを示す。化合物１は、ｗｔＳＮＵ１に比べ、細胞増殖および胃癌細胞ＳＮＵ１６およびＫａｔｏＩＩＩのＦＲＳ２ａおよびＥｒｋ１／２のリン酸化を選択的に阻害した。
化合物１は、ｗｔＦＧＦＲ２ ＨｅｃｌＢ細胞に比べた場合、変異体ＦＧＦＲ２（Ｎ５４９Ｋ）をもつ子宮体がん（子宮内膜がん）細胞ＡＮ３ＣＡを選択的に阻害した。化合物１は、４９０ｎＭのＧＩ５０のＨｅｃｌＢ細胞に比べると、３０ｎＭのＧＩ５０でＡＮ３ＣＡ細胞の細胞増殖を阻害した（図１６）。化合物１はまた、化合物１で処理された子宮体がん細胞ＡＮ３ＣＡでのタンパク質発現のウエスタンイムノブロット分析により測定して、ＡＮ３ＣＡ細胞でのシグナリング、特にＦＲＳ２ａおよびＥｒｋ１／２のリン酸化も選択的に阻害した。表１０は、ｗｔＦＧＦＲ２ ＨｅｃｌＢおよびＲＬ９５細胞系に比べた、子宮体がん細胞系ＡＮ３ＣＡにおける化合物１の活性のまとめを示す。
化合物１は、膀胱がんおよび多発性骨髄腫（ＭＭ）の細胞モデルにおいてＦＧＦＲ３を阻害した。化合物１は、ｗｔＦＧＦＲ３ ＲＴ１１２細胞に比べた場合、変異体ＦＧＦＲ３ｂ（Ｙ３７５Ｃ）を発現する膀胱がん細胞ＭＧＨ−Ｕ３の増殖を選択的に阻害した（図１７）。化合物１はまた、化合物１で処理されたＭＧＨ−Ｕ３細胞でのタンパク質発現のウエスタンイムノブロット分析により測定して、ＭＧＨ−Ｕ３でのＦＲＳ２ａのシグナリングを阻害した（Ｐ−ＦＲＳ２ａについてＩＣ５０＝４１ｎＭ）。化合物１は、ｗｔＦＧＦＲ３ ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞に比べた場合、ｔ（４；１４）転座を有し変異体ＦＧＦＲ３（Ｋ６５０Ｅ）を発現するＯＰＭ２ ＭＭ細胞の増殖を選択的に阻害した（図１８）。ＦＧＦＲ３シグナリングは、化合物１で処理されたＯＰＭ２ ＭＭ細胞でのタンパク質発現のウエスタンイムノブロット分析により測定して、ＯＰＭ２細胞において化合物１により阻害された（データ示さず）さらに化合物１は、ＯＰＭ２においてＦＲＳ２ａのシグナリングを阻害した（Ｐ−ＦＲＳ２ａについてＩＣ５０＝６５ｎＭ）。
化合物１は、乳がんの細胞モデルにおいてＦＧＦＲ４を阻害した。変異体ＦＧＦＲ４（Ｙ３６７Ｃ）を発現するＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳がん細胞に対する化合物１の効果は、細胞増殖の阻害（図１９）、および化合物１で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞でのタンパク質発現のウエスタンイムノブロット分析により測定した、ＦＧＦＲ４およびＦＲＳ２ａの細胞シグナリングの阻害（Ｐ−ＦＧＦＲ４についてＩＣ５０＝１２ｎＭおよびＰ−ＦＲＳ２ａについてＩＣ５０＝１４ｎＭ）を含む。
表１１は、ＣＨＩＲ−２５８，ＢＩＢＦ−１１２０，ＢＭＳ−５４０２１５およびＰＤ１７３０７４を含む各種キナーゼの阻害のＦＧＦＲモデルにおけるＲＴＫ阻害剤活性の比較を示す。ＩＣ５０（ｎＭ）データはＲＢＣにより行われたキナーゼアッセイについて示され、ＧＩ５０（ｎＭ）データは細胞増殖アッセイについて示される。
（結論）
化合物１はキナーゼおよび細胞アッセイにおいて４種すべてのＦＧＦ受容体に対して強い活性を示す経口的に活性なキナーゼ阻害剤である。シグナリングおよび増殖は４種すべてのＦＧＦＲを発現するモデルにおいて阻害され、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２に対して最も強い活性がみられた。化合物１の活性は、胃がん、子宮体がん、膀胱がん、および多発性骨髄腫を含む多数のがん種においてみられた。化合物１の活性は、臨床で評価されている既知のＦＧＦＲ活性をもつ他のＲＴＫ阻害剤に匹敵した。
化合物１の経口送達はＦＧＦＲ２が引き起こすＡＮ３ＣＡの異種移植モデルでの充実性腫瘍成長の低減に有効であった
化合物１は１０および３０ｍｇ／ｋｇの経口用量でＡＮ３ＣＡ腫瘍成長をそれぞれ３６％および６２％阻害した（図２０）。日用量の投与計画が示されるが、間欠的な用量の投与計画も有効であるかもしれない。
in vivo の薬力学および薬物動態の関連も測定し、ここで化合物１の血漿中レベルは投薬６時間後ウエスタンイムノブロット分析により測定した（図２１）。化合物１の経口投薬はＡＮ３ＣＡ異種移植においてＦＲＳ２ａおよびＥｒｋ１／２シグナリングを阻害した（図２１）。
化合物１の経口送達は、臨床的に関連するＦＧＦＲ２（Ｎ５４９Ｋ）変異を発現した子宮体がんモデルにおいて腫瘍成長を強力に阻害した。細胞増殖の阻害は腫瘍における下流シグナリングの阻害と関連した。これらのデータは、ＦＧＦ受容体の変化により特徴付けられる多くの腫瘍型の処置に化合物１を使用することを裏付ける。
化合物１とリダフォロリムスとの併用治療
試薬：化合物１およびリダフォロリムス（ＡＰ２３５７３，ＭＫ−８６６９）はARIAD Pharmaceuticals により合成された。以下の化合物は購入した：ＢＭＳ−５４０２１５（American Custom Chemical、サンディエゴ、CA) 、ＣＨＩＲ−２５８，ＡＺＤ２１７１およびＢＩＢＦ−１１２０（Selleck Chemical Co.、ロンドン ON 、カナダ) 。
キナーゼアッセイ：ＩＣ５０を測定するためのキナーゼ阻害アッセイはReaction BiologyCorporation (RBC、モルヴァン、PA、米国) において実施した。１μM から開始した３倍連続希釈物での１０点カーブを用いて１０μM ＡＴＰにおいて化合物を試験した。２回のアッセイからの平均データを示す。
細胞増殖アッセイ：細胞増殖をCell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega、マディソン、WI) またはCyQuant Cell Proliferation Assay (Invitrogen、カールスバッド、CA) のいずれかを用いて評価した。細胞を播種して２４時間後、細胞を化合物で処理し、７２時間培養した。50％増殖阻害 (GI50) を引き起こす濃度を、時間０ (処理時間) での細胞数について補正すること、およびマイクロソフトエクセルのXLfit バージョン4.2.2 を用いてビヒクル (DMSO) 処理細胞に対する増殖率（％）としてデータをプロットすることにより測定した。
併用アッセイおよび分析：試験した各化合物について５０％最大阻害での有効用量（ＥＤ５０）を測定し、１ｘとして定義した。使用した薬剤濃度は固定したＥＤ比で０．１２５×から８×の範囲であった。細胞増殖に対する組み合わせ効果をＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ法（CalcuSynソフトウエア、Biosoft)により分析した。
ウエスタンイムノブロッティング：細胞を、播種の２４時間後に処理し、阻害剤と共に１時間インキュベートした。細胞をＳＤＳ緩衝液またはPhospho-Safe緩衝液 (Novagen 、ギブスタウン、NJ) 中で溶解させ、タンパク質溶解物を一晩免疫沈降させ、および／または記載の抗体でイムノブロットした。タンパク質発現を、Qantity One ソフトウエア (BioRad、ハークルス、CA) を用いて定量した。ＩＣ５０値 (50％阻害を引き起こす濃度) をXLfit4を用いて、全タンパク質シグナルに対して正規化したホスホ−シグナルの阻害率 (％) をプロットすることにより算出した。表に示したデータは２〜３回のアッセイからの平均値である。
皮下腫瘍モデル：ＡＮ３ＣＡ細胞をヌードマウスの右側腹部に移植した。効力の分析のために、平均腫瘍体積が約２００ｍｍ3 に達したら、化合物１を２１日間毎日経口投薬するか、またはＱＤＸ５を３週間腹腔内投薬して、阻害剤を投与した。平均腫瘍体積（±ＳＥ；腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2 ×0.5)を各処置群について算出した。
薬物動態／薬力学：薬力学的分析のために腫瘍試料を採取したら凍結し、Phospho-Safe中にホモジナイズし、ウエスタンイムノブロッティングにより分析した。血漿中の阻害剤濃度をタンパク質沈降およびブランクのマウス血漿中で作製した較正標準を用いる内部標準ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により測定した。示したデータは３マウス／時点／群からの平均値である。
化合物１は各種がん細胞系において細胞活性に影響を及ぼした。表１２は、ＡＺＤ２１７１，ＣＨＩＲ−２５８，ＢＩＢＦ−１１２０およびＢＭＳ−５４０２１５を含む各種キナーゼ阻害剤についての、ＦＧＦＲ細胞モデルでのＲＴＦ阻害剤活性の比較を示す。化合物１はＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４に対する強い阻害剤である。キナーゼアッセイについてのＩＣ５０（ｎＭ）データはＲＢＣにより得られた。表１２は、細胞増殖アッセイについてはＧＩ５０ (ｎＭ) を、シグナリングについてはＩＣ５０ (ｎＭ) を示す。
化合物１は、ＦＧＦＲ２−変異子宮体がん細胞系の増殖およびシグナリングを選択的に阻害した。化合物１は、ｗｔＦＧＦＲ２Ｈｅｃ−１−ＢおよびＲＬ９５−２細胞系に比べて、子宮体がん細胞系ＡＮ３ＣＡおよびＭＦＥ−２９６を阻害した（図２２）。化合物１は、各種濃度の化合物１のＡＮ３ＣＡに対する影響についてのウエスタンイムノブロット分析により測定して、ＡＮ３ＣＡ細胞でのシグナリング、特にＦＲＳ２ａおよびＥｒｋ１／２のリン酸化を阻害した。表１３は、ｗｔＦＧＦＲ２Ｈｅｃ−１−ＢおよびＲＬ９５−２細胞系に比べた、子宮体がん細胞系ＡＮ３ＣＡおよびＭＦＥ−２９６での化合物１の活性のまとめを示す。
化合物１の経口送達はＦＧＦＲ−２変異ＡＮ３ＣＡ子宮体がん異種移植の成長を阻害した。化合物１は１０および３０ｍｇ／ｋｇでＡＮ３ＣＡ腫瘍成長をそれぞれ４９％および８２％阻害した（図２３）。化合物１は投薬６時間後に薬力学マーカーを阻害した。化合物１の経口投薬は、リン酸化および非リン酸化ＦＲＳ２ａ、リン酸化および非リン酸化Ｅｒｋ１／２および対照としてのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼについての投薬６時間後のウエスタンイムノブロット分析により測定して、ＡＮ３ＣＡ異種移植におけるＦＲＳ２ａおよびＥｒｋ１／２のリン酸化を阻害した（データ示さず）。
これらのデータは、化合物１が経口利用可能な強力な汎ＦＧＦＲ阻害剤であることを示す。活性は、胃がん、子宮体がん、膀胱がん、および多発性骨髄腫を含む多数のがん種においてみられた。化合物１の活性は、臨床で評価中の既知のＦＧＦＲ活性をもつ他の阻害剤に匹敵した。さらに、経口での化合物１は、ＦＧＦＲ２について臨床的に関連するＮ５４９Ｋ変異を発現する子宮体がんモデルにおいて腫瘍成長を強く阻害する。
がんモデルにおける化合物１のｍＴＯＲ阻害剤との相乗的抗腫瘍活性
図２４Ａは、各種濃度のリダフォロリムス、化合物１、および化合物１とリダフォロリムスとの併用についてＡＮ３ＣＡ細胞系での化合物１の増殖阻害を示す。図２４Ｂは、各種濃度のリダフォロリムス、化合物１、および化合物１とリダフォロリムスとの併用についてＭＦＥ−２９６細胞系での化合物１の増殖阻害を示す。濃度はＥＣ５０の関数として示す。化合物１とリダフォロリムスとの併用は、いずれかの化合物単独に比べ、ＦＧＦＲ２変異子宮体がん細胞系ＡＮ３ＣＡおよびＭＦＥ−２９６に相乗効果を発揮した。ＡＮ３ＣＡ細胞系での化合物１とリダフォロリムスの併用のメジアン効果分析は、ＡＮ３ＣＡ細胞系（図２５Ａ）およびＭＦＥ−２９６細胞系（図２５Ｂ）について示される。ＡＮ３ＣＡ細胞系については、４．３〜１０００ｎＭの化合物１および０．０５〜１３ｎＭのリダフォロリムスの濃度範囲内で相乗効果がみられた（図２５Ａ）。ＭＦＥ−２９６細胞系については、１４〜７５０ｎＭの化合物１および０．１４〜７．５ｎＭのリダフォロリムスの濃度範囲内で相乗効果がみられた（図２５Ｂ）。
細胞周期分析を、リダフォロリムス、化合物１、および化合物１とリダフォロリムスとの併用で２４時間処理した後ＡＮ３ＣＡにおいて行った。化合物１とリダフォロリムスの併用で処理した場合、未処理または１つの化合物単独で処理した細胞に比べ、Ｇ０−Ｇ１サイクルの間、細胞周期の停止が増加するのが観察された (図２６) 。
ＡＮ３ＣＡ細胞系での各種シグナリング分子に対する化合物１とリダフォロリムスの影響を投薬２４時間後のウェスタンイムノブロット分析により測定した。化合物１（３０ｎＭまたは３００ｎＭ）とリダフォロリムス（０．５ｎＭまたは５ｎＭ）の併用はＦＲＳ２ａ、Ｅｒｋ１／２およびＳ６シグナリングの阻害を生じた（データ示さず）。
図２７はＦＧＦＲ２およびｍＴＯＲ経路の考えられるモデルを示す概略図である。理論に拘束されることは意図せず、このモデルにおいて化合物１はＦＧＦＲ２／ＭＡＰＫ経路を阻害し、リダフォロリムスはｍＴＯＲ経路を阻害するようである。
化合物１とリダフォロリムスを併用して経口送達すると、ＦＧＦＲ２変異ＡＮ３ＣＡ腫瘍異種移植において抗腫瘍活性の向上がみられた。図２８Ａは、低用量の化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ）とリダフォロリムス（０．３ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇ）の併用についてのＡＮ３ＣＡ腫瘍成長の阻害を示す。図２８Ｂは、高用量の化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ）とリダフォロリムス（０．３ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇ）の併用についてのＡＮ３ＣＡ腫瘍成長の阻害を示す。結果は、化合物１の毎日の（図２８Ａおよび２８Ｂにおける黒色の線）およびリダフォロリムスの週５日の（図２８Ａおよび２８Ｂにおける灰色の線）経口投薬について示す。表１４はＡＮ３ＣＡ異種移植モデルにおける化合物１およびリダフォロリムスの効力のまとめを示し、ここで「ＴＧＩ」はビヒクルに対する腫瘍成長阻害を意味する。
in vivo の薬力学および薬物動態の関連についても投薬６時間後に測定した（図２９）。投薬６時間後化合物１の血漿中レベルも示す（図２９）。
化合物１とリダフォロリムスの相乗活性が、ＦＧＦＲ２変異子宮体がん細胞の成長に対してみられた。これらのデータは、化合物１とリダフォロリムスが、ＦＧＦＲ２変異子宮体がんモデルにおいて強い組み合わせ活性を有することを示す。理論に拘束されることは意図せず、化合物１およびリダフォロリムスにより、それぞれＦＧＦＲ２／ＭＡＰＫおよびｍＴＯＲ経路を通して強い二重の阻害が達成された。化合物１とリダフォロリムスの併用の相乗効果が、in vitro細胞増殖アッセイおよびin vivo 誘導腫瘍退縮を介して観察された。
化合物１はＦＧＦＲによる多数の腫瘍のモデルにおいて強い活性を有する汎用ＦＧＦＲ阻害剤である。化合物１によるＦＧＦＲ２シグナリングおよびリダフォロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤によるｍＴＯＲシグナリングの二重の阻害により、ＦＧＦＲ２が起こす子宮体がんのin vitroモデルおよびin vivo 腫瘍退縮において相乗活性が生じる。
これらのデータは、新生物、がんおよび病的血管新生に関連する病状などの病的細胞増殖に関連する疾患の処置のための、ｍＴＯＲ阻害剤と併用した化合物の使用に対する裏付けを提供する。本発明の組成物、方法またはキットを用いて処置しうるがんの制限されない例としては、膀胱がん、乳がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、頭部および頸部のがん、胆嚢がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、前立腺がん、又は皮膚のがん；扁平上皮がん；子宮体がん；多発性骨髄腫；リンパ系の造血腫瘍（例、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、ホジキン型白血病、非ホジキン型白血病、ヘアリー細胞白血病、若しくはバーキット白血病）；骨髄系の造血腫瘍（例、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、若しくは前骨髄球性白血病）；間葉由来の腫瘍（例、線維肉腫若しくは横紋筋肉腫）；中枢若しくは末梢神経系の腫瘍（例、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、若しくは神経鞘腫）；黒色腫；セミノーマ；テトラカルシノーマ；骨肉腫；又はカポジ肉腫が挙げられる。
本発明の組成物、方法又はキットを用いて処置することができる病的血管新生に関連する疾患の制限しない例としては、充実性腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症、肥満症、黄斑変性症、及び心血管疾患が挙げられる。
〔その他の実施態様〕
本明細書に述べたすべての刊行物、特許および特許出願は、各独立した刊行物または特許出願が具体的かつ個々に記載され援用されたと同じ程度にここに参照として援用される。米国特許仮出願No. ６１／２５６，６６９（２００９年１０月３０日出願）、No. ６１／２５６，６９０（２００９年１０月３０日出願）およびNo. ６１／２６１，０１４（２００９年１１月１３日出願）はここに参照として援用される。
本発明はその具体的態様に関連して記載されているが、さらなる改変が可能であることは当然であり、本出願は、一般的に本発明の原理に従いそして本発明の属する分野内で既知または慣用の実施の範囲に入り上記で開示した必須の要件に適用され得る、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用または適応を含み、そして特許請求の範囲に記載されている。
その他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (27)

  1. 被治療者に投与した時に新生物、がん、又は過剰増殖性疾患の治療に有効な量の化合物１又はその薬学的に許容される塩と、１種又は２種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む、経口投与に適した薬剤組成物。
  2. 化合物１の塩酸塩を含む、請求項１記載の薬剤組成物。
  3. 単位剤形の形態に処方された請求項１又は２記載の薬剤組成物。
  4. ３０〜３００ｍｇの化合物１を含む、請求項３に記載の薬剤組成物。
  5. ２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、又は４５±９ｍｇの化合物１を含む、請求項３記載の薬剤組成物。
  6. 固体単位剤形の形態に処方された請求項１又は２記載の薬剤組成物。
  7. 前記固体単位剤形が錠剤、軟カプセル剤、又は硬カプセル剤である、請求項６記載の薬剤組成物。
  8. ３０〜３００ｍｇの化合物１を含む、請求項６記載の薬剤組成物。
  9. ２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、又は４５±９ｍｇの化合物１を含む、請求項６記載の薬剤組成物。
  10. 治療を必要とする被治療者の新生物、がん、又は過剰増殖性疾患を治療する方法であって、該被治療者に３０〜３００ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を経口投与することを含む方法。
  11. 平均日用量で２０±４ｍｇ、２５±５ｍｇ、３０±６ｍｇ、４０±８ｍｇ、又は４５±９ｍｇの化合物１又はその薬学的に許容される塩を単位剤形の形態で前記被治療者に経口投与する、請求項１０記載の方法。
  12. 化合物１又はその薬学的に許容される塩を、１週間に２日以上又は７日間の期間ごとに平均４〜７回の頻度で前記被治療者に投与する請求項１０記載の方法。
  13. 化合物１又はその薬学的に許容される塩を前記被治療者に毎日投与する、請求項１２記載の方法。
  14. 前記被治療者が慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、脊髄異形成症候群、胃がん、子宮体がん、膀胱がん、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、腎臓がん、又は神経膠芽腫に罹患している、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記被治療者が慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、又は急性骨髄性白血病に罹患している請求項１４記載の方法。
  16. 前記被治療者が、イマチニブ、ニロチニブ又はダサチニブによる治療に抵抗性の状態にある、請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記被治療者がフィラデルフィア染色体陽性状態にある、請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記被治療者が、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤又はアンタゴニストによる治療に抵抗性の充実性がんに罹患している、請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
  19. 前記充実性がんが、ベバシズマブ、ソラフェニブ、又はスニチニブによる治療に抵抗性である、請求項１８記載の方法。
  20. 前記被治療者がＢＣＲ−ＡＢＬ変異体を発現するがんに罹患している、請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
  21. 前記ＢＣＲ−ＡＢＬ変異体が、ＢＣＲ−ＡＢＬＴ315I、ＢＣＲ−ＡＢＬF317L、又はＢＣＲ−ＡＢF359Cである、請求項２０記載の方法。
  22. 前記被治療者が、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＦＧＦＲ１、又はＰＤＧＦＲα変異体を発現するがんに罹患している、請求項１０〜１９のいずれかに記載の方法。
  23. 前記変異体が、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ｃ−ＫＩＴ、ＦＧＦＲ１ＯＰ２−ＦＧＦＲ１、又はＦ１Ｐ１Ｌ1−ＰＤＧＦＲαである、請求項２２記載の方法。
  24. 化合物１又はその薬学的に許容される塩をｍＴＯＲ阻害剤と一緒に又は併用して、それぞれを前記新生物、がん、又は過剰増殖性疾患の治療に一緒になった時に有効な量で投与する、請求項１０〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. 前記ｍＴＯＲ阻害剤が、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、バイオオリムス、ゾタロリムス、ＬＹ２９４００２、Ｐｐ２４２、ＷＹＥ−３５４，Ｋｕ−００６３７９４、ＸＬ７６５、ＡＺＤ８０５５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＯＳＩ−０２７、ワートマンニン、クエルセチン、ミリセンチン、及びスタウロスポリン並びにそれらの薬学的に許容される塩から選ばれる、請求項２４記載の方法。
  26. （ｉ）被治療者に投与された時に新生物、がん又は過剰増殖性疾患を治療するのに有効な量の化合物１又はその薬学的に許容される塩と１種又は２種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む経口投与に適した薬剤組成物、並びに（ii）この薬剤組成物を新生物、がん又は過剰増殖性疾患の治療のために被治療者に投与するための使用説明書、を備えたキット。
  27. 前記被治療者は慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、脊髄異形成症候群、胃がん、子宮体がん、膀胱がん、多発性骨髄腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、腎臓がん、又は神経膠芽腫に罹患している、請求項２６記載のキット。
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