CN107551019A - 一种代代花萼生物碱及其制备方法与在减肥药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药的技术领域，公开了一种代代花萼生物碱及其制备方法与在减肥药物中的应用。方法为：(1)将代代花萼干燥、粉碎、过筛，得到粗粉；采用盐酸将乙醇水溶液进行酸化，得到酸化乙醇溶液；采用酸化的乙醇溶液加热回流提取粗粉，提取液离心，上清液浓缩，得到浸膏；(2)采用盐酸溶解浸膏，过滤，将滤液用氯仿萃取，去除氯仿层，得到生物碱溶液；将生物碱溶液的pH调节至6～7，过滤，继续调节pH至10～11，得到碱性溶液；(3)将碱性溶液用氯仿进行萃取，将氯仿萃取液用水洗涤，脱水，浓缩干燥，得到代代花萼生物碱。本发明的代代花萼生物碱具有显著的降脂减肥活性，且使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用较低。

Description

一种代代花萼生物碱及其制备方法与在减肥药物中的应用

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种代代花萼生物碱及其制备方法与在减肥药物中的应用。

背景技术

生物碱是指来源于生物界的一类含氮有机物，其大多具有较复杂的环状结构，氮原子结合在环内；多呈碱性，可与酸成盐；多具有显著的生理活性。在中药里，有许多药材含有生物碱成分，通常具有很强的药理活性。如荷叶生物碱具有降脂减肥作用，板蓝根生物碱有抗病毒作用，石蒜碱型生物碱对流感病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒和SARS冠状病毒具有抑制作用，苦参碱对中枢神经系统具有解热、镇痛、抗惊厥、稳定神经等作用，燕麦生物碱具有抗氧化、降血脂、消炎止痒和抑制细胞增殖等多种生理活性。

目前肥胖通常采用综合措施治疗，包括饮食疗法、运动疗法、行为疗法、外科疗法和药物疗法。药物疗法是前几种疗法效果不佳或复发率高时的常用选择。然而减肥产品的现状令人深思，一方面市场上减肥产品存在种类泛滥，质量不稳定，疗效比较低，容易反弹等诸多问题，特别是化学减肥药，其副作用比中药、天然药更严重。另一方面，随着肥胖病人的增多，市场上对减肥药的需求也相应的增加，这样使得天然减肥药、中草药迅速发展，从而填补了这一空缺。近年来从分子水平研究中草药、天然药的减肥降脂作用已逐渐深入，与肥胖有关的肿瘤坏死因子(TNFα)、白介素(IL-6、IL-1β)等炎症因子和瘦素(leptin)、脂联素(adiponectin)、抵抗素(resistin)、解偶联白(UCP)、过氧化物酶增殖物激活受体(PPARα、PPARβ、PPARγ)、神经肽Y(NPY)、5-羟色胺(5-HT)等脂肪因子相继被发现，它们从不同通路对脂肪和血脂进行调节，使得中草药、天然减肥降脂药的多靶点作用机理更加清楚明了，为开发中药、天然产物减肥新药和保健品提供一定的基础。

代代(Citrus aurantium L.var.amara Engl)是芸香科柑橘属植物酸橙的一个变种，代代花是其花蕾的干品，具有良好的药理作用，常用于治疗气郁不舒、脘腹胀痛、积食不化、恶心呕吐等。目前国内外对代代花的研究主要以其挥发油类化合物为主，主要采用水蒸气蒸馏法提炼精油，并广泛应用于化妆品、香精、香料等行业中。而对代代花生物碱及其减肥功能的研究报道相对匮乏。代代花作为药食两用价值的天然保健品，其生物碱的提取纯化和药理活性等方面的研究还有待进一步深入探讨，因此本发明对代代花生物碱进行分离纯化，对其减肥活性进行评价，并进行HPLC分析，旨在明确其活性物质基础，对全面加强代代花的生物利用，开发减肥新药、指导临床用药具有重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种代代花萼生物碱的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的代代花萼生物碱。

本发明的再一目的在于提供上述代代花萼生物碱在制备减肥药物中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种代代花萼生物碱的制备方法，包含如下步骤：

(1)将代代(Citrus aurantium L.var.amara Engl)花萼干燥、粉碎、过筛，得到代代花萼粗粉；采用盐酸将乙醇水溶液进行酸化，得到酸化乙醇溶液；采用酸化的乙醇溶液加热回流提取代代花萼粗粉，将提取液离心，将上清液浓缩，得到代代花萼总生物碱浸膏；

(2)采用盐酸溶解代代花萼总生物碱浸膏，过滤，将滤液用氯仿萃取，去除氯仿层，得到生物碱溶液；将生物碱溶液的pH调节至6～7，过滤，继续调节pH至10～11，得到碱性溶液；

(3)将碱性溶液用氯仿进行萃取，将氯仿萃取液用水洗涤，脱水，减压浓缩干燥，得到代代花萼生物碱(CAVAAs)。

步骤(1)中所述盐酸与乙醇水溶液的体积比为1：10～2：5；步骤(1)中代代花萼粗粉与酸化乙醇溶液的质量体积比为1g：(10～15)mL；

步骤(1)中所述乙醇水溶液的体积分数为60％～80％，所述盐酸的浓度为1wt％～2wt％。

步骤(1)中所述加热回流的温度为75～100℃；所述回流提取的时间为2～4h；步骤(1)中所述回流提取的次数为2～4次。

步骤(1)中所述浓缩为减压浓缩；所述减压浓缩的温度为40～60℃，所述减压浓缩时的转速为40～60r/min。

步骤(1)中所述干燥的温度为50～60℃。

步骤(1)中所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为8～12min。

步骤(2)中所述盐酸的浓度为1wt％～2wt％，所述pH的调节剂为浓氨水；

步骤(2)和(3)中所述氯仿萃取次数为3～4次；

步骤(3)中所述减压浓缩的温度为40～60℃；所述减压浓缩时的转速为40～60r/min。

步骤(3)中所述脱水的脱水剂为无水硫酸钠；所述减压浓缩的温度为40～60℃，干燥的温度为40～60℃，干燥至恒重。

一种代代花萼生物碱(CAVAAs)，通过上述制备方法制备得到；

所述代代花萼生物碱(CAVAAs)在制备减肥药物和/或降脂药物中的应用。

本发明的原理：植物来源的生物碱能通过抑制胃肠道脂肪酶的活性，减少胃肠道脂肪的吸收、抑制脂肪酸合成酶(FAS)、调节能量代谢，促进脂肪分解、降低血脂水平等多种作用机制来达到减肥降脂的药理作用。本发明发现和确证植物生物碱具有显著的减肥降脂活性，且植物生物碱的使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。

本发明的代代花萼生物碱中辛弗林作为减肥促进剂，能够刺激-3肾上腺素受体而发生脂质分解以及随后产生的生热作用。代代花萼生物碱中各成分相互配合，能够提高辛弗林的减肥功效。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提取的代代花萼生物碱(CAVAAs)在体外几乎不影响人正常肝细胞L-O2的细胞活力；并且代代花萼生物碱(CAVAAs)在体外能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖；

(2)本发明提取的代代花萼生物碱(CAVAAs)中辛弗林含量超过50％，代代花萼生物碱(CAVAAs)可能主要通过辛弗林发挥抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖抑制作用；

(3)本发明的代代花萼生物碱(CAVAAs)在体内能显著降低秀丽隐杆线虫的脂肪和甘油三酯的含量；

(4)本发明的代代花萼生物碱(CAVAAs)的用药剂量比较低，而且在有效用药剂量范围内毒性较低。

附图说明

图1是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)对人正常肝细胞L-O2的毒性作用图；其中，**：与control组比较，P<0.01；control组即空白对照组，其加药浓度(CAVAAs浓度)为0μg/mL；

图2是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)对3T3-L1前脂肪细胞的增殖抑制作用图；其中，**：与control组比较，P<0.01；control组即细胞空白对照组；

图3是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)的高效液相色谱分析图；

图4是标准品辛弗林的高效液相色谱分析图；

图5是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)通过油红O染色发显示的对秀丽隐杆线虫的脂肪含量的影响图；图中“con”表示空白对照组，即代代花萼生物碱的浓度为0；

图6是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)对秀丽隐杆线虫的脂肪含量的抑制作用图；其中，**：与control组比较，P<0.01；control组为空白对照组，即代代花萼生物碱的浓度为0；

图7是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)对秀丽隐杆线虫的甘油三酯含量的影响图；其中，**：与control组比较，P<0.01；control组为空白对照组，即代代花萼生物碱的浓度为0。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中，人正常肝细胞L-O2、3T3-L1前脂肪细胞购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM培养基购自于广州茂云生物科技有限公司；代代花萼购自广州清平药材市场。

实施例1从代代花萼中制备得到代代花萼生物碱(CAVAAs)

(1)将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中60℃干燥12h，用粉碎机粉碎后，过60目筛，得代代花萼粗粉；用质量分数1％盐酸酸化体积分数为60％乙醇水溶液，盐酸与60％乙醇水溶液的体积比为1:10，得到酸化乙醇溶液；称取代代花萼粗粉100g，用酸化乙醇溶液加热回流提取，其中料液比为1g：10mL，回流提取温度为75℃，回流提取时间为4h，回流提取次数为4次；然后合并提取液，3000r/min下离心12min，取上层清液，将上层清夜用旋转蒸发仪在40℃下减压浓缩至浸膏状，得到代代花萼总生物碱浸膏；

(2)采用质量百分数为1％盐酸溶解步骤(1)的代代花萼总生物碱浸膏，过滤，将滤液用氯仿萃取3次(氯仿的体积与滤液体积相等)，去除氯仿层，得到生物碱溶液；采用浓氨水将生物碱溶液的pH调节至6～7，用滤纸过滤，继续采用浓氨水调节过滤后的滤液pH至10～11，得到碱性溶液；

(3)采用与碱性溶液等体积的氯仿对碱性溶液进行萃取，萃取次数4次，将氯仿萃取液合并，向氯仿萃取液中加入蒸馏水，用无水硫酸钠脱水(缓慢加入无水硫酸钠，并充分震荡均匀，观察硫酸钠的结块情况，如果加进去就结成饼状的说明水多继续添加硫酸钠，直到沉淀后硫酸钠呈松散流沙状且可以自由滑动，并且没有明显的融化状态，干燥脱水结束)，用旋转蒸发仪在温度40℃、转速40r/min、真空度0.090MPa的条件下减压浓缩，40℃干燥至恒重，得到淡黄色的代代花萼总生物碱(CAVAAs)。

实施例2从代代花萼中制备得到代代花萼生物碱(CAVAAs)

(1)将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中55℃干燥18h，用粉碎机粉碎后，过50目筛，得代代花萼粗粉；用质量分数1.5％盐酸酸化体积分数为70％乙醇水溶液，盐酸与70％乙醇水溶液的体积比为1:5，得到酸化乙醇溶液；称取代代花萼粗粉100g，用酸化乙醇溶液加热回流提取，其中料液比为1g：13mL，回流提取温度为85℃，回流提取时间为3h，回流提取次数为3次；然后合并提取液，4000r/min下离心10min，取上层清液，将上层清夜用旋转蒸发仪在50℃下减压浓缩至浸膏状，得到代代花萼总生物碱浸膏；

(2)采用质量百分数为1.5％盐酸溶解步骤(1)的代代花萼总生物碱浸膏，过滤，将滤液用氯仿萃取3次(氯仿的体积与滤液体积相等)，去除氯仿层，得到生物碱溶液；采用浓氨水将生物碱溶液的pH调节至6～7，用滤纸过滤，继续采用浓氨水调节过滤后的滤液pH至10～11，得到碱性溶液；

(3)采用与碱性溶液等体积的氯仿对碱性溶液进行萃取，萃取次数3次，将氯仿萃取液合并，向氯仿萃取液中加入蒸馏水，无水硫酸钠脱水(缓慢加入无水硫酸钠，并充分震荡均匀，观察硫酸钠的结块情况，如果加进去就结成饼状的说明水多继续添加硫酸钠，直到沉淀后硫酸钠呈松散流沙状且可以自由滑动，并且没有明显的融化状态，干燥脱水结束)，用旋转蒸发仪在温度50℃、转速50r/min、真空度0.090MPa的条件下减压浓缩，50℃烘箱干燥至恒重，得到淡黄色的代代花萼总生物碱(CAVAAs)。

实施例3从代代花萼中制备得到代代花萼生物碱(CAVAAs)

(1)将代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中50℃干燥24h，用粉碎机粉碎后，过40目筛，得代代花萼粗粉；用质量分数2％盐酸酸化体积分数为80％乙醇水溶液，盐酸与80％乙醇水溶液的体积比为2:5，得到酸化乙醇溶液；称取代代花萼粗粉100g，用酸化乙醇溶液加热回流提取，其中料液比为1g：15mL，回流提取温度为100℃，回流提取时间为2h，回流提取次数为2次；然后合并提取液，5000r/min下离心8min，取上层清液，将上层清夜用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩至浸膏状，得到代代花萼总生物碱浸膏；

(2)采用质量百分数为2％盐酸溶解步骤(1)的代代花萼总生物碱浸膏，过滤，将滤液用氯仿萃取3次(氯仿的体积与滤液体积相等)，去除氯仿层，得到生物碱溶液；采用浓氨水将生物碱溶液的pH调节至6～7，用滤纸过滤，继续采用浓氨水调节过滤后的滤液pH至10～11，得到碱性溶液；

(3)采用与碱性溶液等体积的氯仿对碱性溶液进行萃取，萃取次数2次，将氯仿萃取液合并，向氯仿萃取液中加入蒸馏水，无水硫酸钠脱水后(缓慢加入无水硫酸钠，并充分震荡均匀，观察硫酸钠的结块情况，如果加进去就结成饼状的说明水多继续添加硫酸钠，直到沉淀后硫酸钠呈松散流沙状且可以自由滑动，并且没有明显的融化状态，干燥脱水结束)，用旋转蒸发仪在温度60℃、转速60r/min、真空度0.090MPa的条件下减压浓缩，60℃烘箱干燥至恒重，得到淡黄色的代代花萼总生物碱(CAVAAs)。

实施例4MTT法检测代代花萼生物碱(CAVAAs)对L-O2细胞毒性的影响

取生长对数期的人正常肝细胞L-O2，1000rpm离心5min，弃去上清液，用含质量分数为10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞数为3×10⁵/mL，100μL接种于96孔培养板中，置于5％CO₂培养箱中，37℃培养24h后，弃去上清液，加入含有CAVAAs(实施例1制得)的DMEM培养基(CAVAAs的终浓度分别为15.625μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL)。在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，弃去上清液，PBS清洗两次，每孔加入200μL不含血清的DMEM基础培养基和20μL噻唑蓝(MTT)，放入培养箱中继续孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，避光放置于微量振荡器均匀震荡10min，用酶标仪测量在490nm波长下的OD值，计算细胞增殖抑制率。测试结果如图1所示。图1是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)对人正常肝细胞L-O2的毒性作用图；其中，**：与control组(即空白对照组，其加药浓度(CAVAAs浓度)为0μg/mL)比较，P<0.01。

在CAVAAs浓度低于500μg/mL范围内，代代花萼生物碱作用于L-O2细胞24h，对L-O2细胞的生长均没有毒性作用(图1)。因此后续的实验中，代代花萼生物碱(CAVAAs)浓度设定为500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL。

实施例5代代花萼生物碱(CAVAAs)对3T3-L1前脂肪细胞的增值抑制作用

将3T3-L1前脂肪细胞以1×10⁵个/ml浓度接种于96孔细胞培养板(100μL/孔)，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。待孔板中的细胞完全贴壁后，加入不同浓度(15.625，31.25，62.5，125，250和500μg/mL)的代代花萼生物碱(CAVAAs)(实施例1)溶液100μl。同时设细胞空白对照组(control组)，即加入与样品液等量体积的完全培养液(即含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养液)；阳性对照组，加与样品同浓度同体积的五-氟尿嘧啶作为阳性对照。每个浓度设3个平行。在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，24h后取出，倒置显微镜观察细胞形态的变化。用注射器小心吸弃96孔板中培养液，用不含钙、镁离子的PBS洗板2次，然后每孔加入5mg/m L的MTT溶液20μL(需关灯操作，MTT见光易分解)和DMEM完全培养液180μL，在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养4h。小心吸取孔内的细胞培养液弃掉，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。用酶联免疫检测仪在波长为490nm下测定其吸光度值。

细胞的增殖抑制率＝(细胞空白对照组吸光度值-样品组吸光度值)/空白对照组的吸光值。

图2是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)对3T3-L1前脂肪细胞增殖抑制率的柱状图。其中，**：与control组比较，P<0.01；control组即细胞空白对照组。

由实施例1制备得到的代代花萼生物碱(CAVAAs)对3T3-L1前脂肪细胞具有很好的增殖抑制作用，其半抑制浓度IC₅₀为352.5306ug/ml，提示代代花萼生物碱(CAVAAs)可能通过抑制前脂肪细胞增殖达到减肥效果。

实施例6代代花萼生物碱(CAVAAs)的HPLC分析

准确称取实施例1制得的代代花萼生物碱(CAVAAs)1.9mg，用色谱级乙腈溶解制备得到1.9mg/ml的代代花萼生物碱(CAVAAs)HPLC分析供试液。HPLC色谱分析条件：Poroshell120EC-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；以乙腈(A)－体积分数0.1％磷酸水溶液(B)为流动相；梯度洗脱：0～25min，A在混合流动相中所占体积比由15％变为20％；25～35min，A在混合流动相中所占体积比保持不变；35～45min，A在混合流动相中所占体积比由20％变为30％A；45～50min，A在混合流动相中所占体积比由30％变为15％；50～60min，A在混合流动相中所占体积比保持不变；流速为1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长为283nm；进样量：10μL。图3为实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)的高效液相色谱分析图。

实施例7标准品辛弗林的HPLC分析

准确称取标准品辛弗林1.9mg，用色谱级乙腈溶解制备得到1.9mg/ml的辛弗林HPLC分析供试液。HPLC色谱分析条件同实施例6中分析条件。图4为标准品辛弗林的高效液相色谱分析图。

由图3和图4对比可知，代代花萼生物碱(CAVAAs)中辛弗林含量超过50％，因此辛弗林可能是代代花萼生物碱(CAVAAs)发挥降脂减肥活性的成分。

实施例8油红O染色法检测代代花萼生物碱(CAVAAs)对秀丽隐杆线虫的脂肪含量的影响

将不同浓度梯度(2mg/mL,1.5mg/mL,1mg/mL,0.5mg/mL,0.1mg/mL，0mg/mL)代代花萼生物碱(实施例1制得)(CAVAAs)的母液(溶剂为水)加于LB液体培养液和NGM固体培养基中，然后再将经过同期化处理的L1期线虫(秀丽隐杆线虫)接种到已加上述不同浓度母液且涂布有在加入上述不同浓度母液的LB培养液中活化的OP50大肠杆菌的NGM培养基中，23℃培养箱恒温培养。观察两到三天，待L1期线虫长到L4期时，用M9缓冲液将NGM固体培养基中的线虫洗下后，挑出200条于离心管中用于脂肪含量检测，再挑出50条线虫于另一个离心管中用于显微镜观测。将两个管都置于离心机中以1500r/min的速度离心2min，弃去上清液，加入1ml的多聚甲醛进行固定，于室温下静置15min。然后将离心管置于-80℃冰箱冻存15min后，立即于水浴锅45℃条件进行快速解冻。将离心管置于离心机中以1500r/min的速度离心2min，弃去上层清液，并用PBS缓冲溶液将线虫清洗三次。加入含0.1％TritonX-100的油红O 1min后，静置于室温中0.5h，再用PBS缓冲溶液清洗三次直到将溶液中的油红O洗去。然后将离心管中线虫吸取至干净培养皿中，在显微镜下观察。在用于酶标仪检测脂肪含量的离心管中加350μL的裂解液，震荡混匀，并置于-80℃冰箱30min后室温解冻，继续震荡混匀直至使线虫充分裂解。将含有裂解完全的线虫溶液的离心管置于离心机中，以1500r/min的速度离心1min，吸取上层清液到96孔板中，150μL/孔，三组平行，然后置于酶标仪496nm波长下检测各孔吸光度值。

测试结果如图5和6所示。图5是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)通过油红O染色发显示的对秀丽隐杆线虫的脂肪含量的影响图(图中“con”表示空白对照组，即代代花萼生物碱的浓度为0)；图6是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)对秀丽隐杆线虫的脂肪含量的抑制作用图；其中，**：与control组(空白对照组，即代代花萼生物碱的浓度为0)比较，P<0.01。

图5中线虫体内颜色深的部分(原红色部分)为油红O对脂肪进行染色的部分，线虫体内颜色深的部分(红色部分)越少，说明线虫体内脂肪含量越少。由图5可知，不同浓度梯度代代花萼生物碱(CAVAAs)处理的线虫体内的颜色深的部分(红色部分)均比空白对照组的颜色深的部分(红色部分)少，且随着加药浓度(代代花萼生物碱浓度)的增大，红色部分越少。从图6中可知，代代花萼生物碱(CAVAAs)能够有效降低秀丽隐杆线虫体内的脂肪含量，且不呈浓度依赖性(图6)。

实施例9甘油三酯试剂盒法检测代代花萼生物碱(CAVAAs)对秀丽隐杆线虫的甘油三酯含量的影响

将不同浓度梯度(2mg/mL,1.5mg/mL,1mg/mL,0.5mg/mL,0.1mg/mL)代代花萼生物碱(实施例1制得)(CAVAAs)母液加入LB液体培养液和NGM固体培养基中，然后再将经过同期化处理的L1期线虫(秀丽隐杆线虫)接种到已加上述不同浓度母液且涂布有在加药(加入代代花萼生物碱)LB培养液中活化的OP50大肠杆菌的NGM培养基中，23℃培养箱恒温培养。观察两到三天，待L1期线虫长到L4期时，用M9缓冲液将NGM固体培养基中的线虫洗下后，挑出200条于离心管中，1500r/min的速度离心2min后，弃去上清液。用PBS缓冲液清洗线虫3次，加入300μL的裂解液，震荡混匀，并置于-80℃冰箱30min后室温解冻，继续震荡混匀直至使线虫充分裂解，必要时可以加用超声辅助裂解。将含有裂解完全的线虫溶液的离心管置于离心机中，以1500r/min的速度离心1min，吸取上层清液到96孔板中，100Μl/孔，然后每孔加入250mL甘油三酯试剂盒工作液,三组平行，最后置于酶标仪510nm波长下检测吸光度值。测试结果如图7所示。图7是实施例1制备的代代花萼生物碱(CAVAAs)对秀丽隐杆线虫的甘油三酯含量的影响图；其中，**：与control组(空白对照组，即代代花萼生物碱的浓度为0)比较，P<0.01。

与control组相比，用实施例1得到的不同浓度代代花萼生物碱(CAVAAs)处理后的秀丽线虫体内甘油三酯含量均有效降低，且甘油三酯含量随着加样浓度的增加而减小，由此说明代代花萼生物碱(CAVAAs)能够有效降低秀丽隐杆线虫体内的甘油三酯含量且呈现浓度依赖性(图7)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种代代花萼生物碱的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：

(1)将代代花萼干燥、粉碎、过筛，得到代代花萼粗粉；采用盐酸将乙醇水溶液进行酸化，得到酸化乙醇溶液；采用酸化的乙醇溶液加热回流提取代代花萼粗粉，将提取液离心，将上清液浓缩，得到代代花萼总生物碱浸膏；

(2)采用盐酸溶解代代花萼总生物碱浸膏，过滤，将滤液用氯仿萃取，去除氯仿层，得到生物碱溶液；将生物碱溶液的pH调节至6～7，过滤，继续调节pH至10～11，得到碱性溶液；

(3)将碱性溶液用氯仿进行萃取，将氯仿萃取液用水洗涤，脱水，减压浓缩干燥，得到代代花萼生物碱。

2.根据权利要求1所述代代花萼生物碱的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述盐酸与乙醇水溶液的体积比为1：10～2：5；步骤(1)中所述乙醇水溶液的体积分数为60％～80％，所述盐酸的浓度为1wt％～2wt％。

3.根据权利要求1所述代代花萼生物碱的制备方法，其特征在于：步骤(1)中代代花萼粗粉与酸化乙醇溶液的质量体积比为1g：(10～15)mL；

步骤(1)中所述加热回流的温度为75～100℃；所述回流提取的时间为2～4h。

4.根据权利要求1所述代代花萼生物碱的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述盐酸的浓度为1wt％～2wt％，所述pH的调节剂为浓氨水。

5.根据权利要求1所述代代花萼生物碱的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述回流提取的次数为2～4次；

步骤(1)中所述浓缩为减压浓缩；所述减压浓缩的温度为40～60℃，所述减压浓缩时的转速为40～60r/min。

6.根据权利要求1所述代代花萼生物碱的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述干燥的温度为50～60℃；

步骤(1)中所述离心的转速为3000～5000r/min；所述离心的时间为8～12min。

7.根据权利要求1所述代代花萼生物碱的制备方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中所述氯仿萃取次数为3～4次；

步骤(3)中所述减压浓缩的温度为40～60℃；所述减压浓缩时的转速为40～60r/min。

8.根据权利要求1所述代代花萼生物碱的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述脱水的脱水剂为无水硫酸钠；所述干燥的温度为40～60℃，干燥至恒重。

9.一种由权利要求1～8任一项所述制备方法得到的代代花萼生物碱。

10.根据权利要求9所述代代花萼生物碱的应用，其特征在于：所述代代花萼生物碱在制备减肥药物中的应用。