TWI836834B - 龍膽萃取物用於製備頭皮保健的組合物的用途 - Google Patents
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Abstract
一種龍膽萃取物用於製備頭皮保健的組合物的用途。其中,龍膽萃取物是將龍膽(
Gentiana scabra)以水於70℃~100℃下萃取45分鐘~90分鐘所得。基此,龍膽萃取物可用於頭皮保健。
Description
本發明涉及一種龍膽萃取物,特別是關於一種龍膽萃取物用於製備頭皮保健的組合物之用途。
如何保養自身使外在保持年輕健康的外型,除了臉部保養外,頭皮保健也變成焦點之一。
保健頭皮主要是為了減緩頭皮老化的症狀,常見症狀包括髮色褪色為灰白、頭皮出油量提高、產生大量頭皮屑、大量掉髮、頭髮稀疏細軟等等。造成頭皮老化的原因:壓力大、作息不正常、紫外線、環境污染、不當的染燙髮、日常清潔不足、賀爾蒙變化等等。並且,在正常情形下,每日落髮量約50根~100根,當單日落髮量超過150根時,則代表頭皮不健康而有禿頭危機。
因此,為了維持良好的外觀,如何維持頭皮健康的方法也備受關注。
有鑑於此,本發明提供一種龍膽萃取物用於製備頭皮保健的組合物的用途。其中,任一實施例的龍膽萃取物,其具有頭皮保健的功能。
在一些實施例中,一種龍膽萃取物用於製備頭皮保健的組合物的用途,其中龍膽萃取物是將龍膽(
Gentiana scabra)以水於70℃~100℃下萃取45分鐘~90分鐘所得。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物包括具有式I所示結構的(2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-二羥基苯甲醯基)氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氫吡喃並[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三乙酸三酯((2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-dihydroxybenzoyl)oxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-2,4,5-triyl triacetate; Deglucosyltrifloroside)及具有式II所示結構的(2R,3R,4S,5R,6S)-4-乙醯氧基-2-(乙醯氧基甲基)-5-(苯甲醯氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氫吡喃並[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氫-2H-吡喃-3-基2,3-二羥基苯甲酸酯((2R,3R,4S,5R,6S)-4-acetoxy-2-(acetoxymethyl)-5-(benzoyloxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-3-yl 2,3-dihydroxybenzoate; Deglucoscabraside)。於此,式I及式II如下所式:
(I);以及
(II)。
在一些實施例中,前述(2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-二羥基苯甲醯基)氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氫吡喃並[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三乙酸三酯(以下稱Deglucosyltrifloroside)及(2R,3R,4S,5R,6S)-4-乙醯氧基-2-(乙醯氧基甲基)-5-(苯甲醯氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3, 4,4a,5,6,8-六氫吡喃並[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氫-2H-吡喃-3-基2,3-二羥基苯甲酸酯(以下稱Deglucoscabraside)具有提高粒線體活性的作用。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物是將龍膽以水於85±5℃下萃取60分鐘以得到初萃取液,並將初萃取液離心取得上清液,再將上清液過濾及減壓濃縮後所得。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物具有強抗氧化力。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物具有阻止頭皮發炎、發紅的作用。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物有提升毛囊細胞粒線體活性的作用。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物具有維持毛囊健康的作用。
在一些實施例中,前述頭皮保健包括提高頭皮含水量、改善落髮、減緩頭皮敏感度或其組合。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物的使用量為0.3克/日。
綜上所述,任一實施例的龍膽萃取物,其能用以保健頭皮。換言之,任一實施例的龍膽萃取物,其可用以製備頭皮保健的組合物。在一些實施例中,龍膽萃取物具有提高粒線體活性的作用。在一些實施例中,龍膽萃取物具有阻止頭皮發炎及發紅用、提升毛囊細胞粒線體活性以維持毛囊健康、提高頭皮含水量、改善落髮、減緩頭皮敏感度等作用,進而可維持頭皮健康並達成頭皮保健的效果。
於下列實施方式的說明中,除非另有相關說明,則「%」及「wt%」符號是指重量百分比。
龍膽(學名:
Gentiana scabra)為龍膽科龍膽屬的植物,亦稱為龍膽草(植物名實圖考)、膽草、草龍膽、山龍膽等。在中醫上,其性寒味苦,通常以根入藥,且主治目赤、咽痛、黃疸、熱痢、脅痛及小便熱痛等症。
在一些實施例中,將龍膽(產地:中國)的根莖作為原料(以下稱龍膽原料)與作為溶劑的水以特定比例混合後,在70℃~100℃下萃取45分鐘~90分鐘後,在經過離心、過濾、濃縮等處理後即可得到龍膽萃取物。於此,若溶劑過少或萃取時間過短,則萃取效率將會明顯下降;若萃取時間過長,則萃取物中的有效成分可能會產生降解。
在一些實施例中,萃取溫度可以為80℃~90℃,且萃取時間可以為60分鐘。舉例來說,前述龍膽萃取物是將龍膽以水於85±5℃下萃取60分鐘以得到初萃取液,並將初萃取液離心取得上清液,再將上清液過濾及減壓濃縮後所得。
在一些實施例中,所使用的龍膽原料為龍膽的葉,且前述龍膽原料可以為經乾燥處理過的根莖或現成購買已乾燥過的現成龍膽根莖。
在一些實施例中,龍膽原料與水的重量比為15~30:1。舉例來說,龍膽原料與水的重量比為15:1。
在一些實施例中,將龍膽原料與的水以特定重量比混合並在70℃~100℃下萃取45分鐘~90分鐘後可得到含有固體的第一萃取液。接著,冷卻前述第一萃取液至室溫(25℃~30℃),並將冷卻後帶有固體的第一萃取液經離心機離心約10分鐘,取其上清液為第一萃取上清液。然後,將第一萃取上清液以400目數的濾網進行過濾以去除細微固體,再以濃縮機將過濾後的第一萃取上清液於45℃~70℃下進行減壓濃縮直到第一萃取上清液的白利糖度值(Degrees Brix)為6.0±0.5時停止濃縮,即可得到龍膽萃取物。其中,減壓濃縮的設定溫度可為60℃±5℃。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物具有強抗氧化力。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物具有阻止頭皮發炎、發紅的作用。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物具有提升毛囊細胞粒線體活性的作用。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物具有維持毛囊健康的作用。
在一些實施例中,龍膽萃取物用於製備頭皮保健的組合物的用途,其中龍膽萃取物是將龍膽(
Gentiana scabra)以水於70℃~100℃下萃取45分鐘~90分鐘所得。其中,頭皮保健包括提高頭皮含水量、改善落髮、減緩頭皮敏感度或其組合。也就是說,前述龍膽萃取物具有提高頭皮含水量、改善落髮、減緩頭皮敏感度等作用。
在一些實施例中,前述任一組合物中所含有的龍膽萃取物的使用量為0.3克/日~2.5克/日。
在一些實施例中,組合物可以為液態(如,飲品等)或固態(如,粉末、錠劑等)。
舉例來說,液態組合物中的龍膽萃取物的使用量為2.5克/日,而固態的組合物中龍膽萃取物的使用量為0.3克/日。
在一些實施例中,前述之任一組合物可為醫藥品。換言之,此醫藥品包含有效含量的龍膽萃取物。
在一些實施例中,前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投藥劑型。
在一些實施例中,經腸道或口服的投藥劑型可為,但不限於,錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)或類似之物。在一些實施例中,非經腸道地或局部地投藥劑型可為,但不限於,注射品(injection)、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation) 或類似之物。在一些實施例中,注射品的投藥方式可為皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)或病灶內注射(intralesional injection)。
在一些實施例中,前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些實施例中,醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種:溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中,作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。
在一些實施例中,前述之任一組合物可為食用產品。換言之,食用產品包含特定含量的龍膽萃取物。在一些實施例中,食用產品可為一般食品、保健食品或膳食補充品。
在一些實施例中,前述之食用產品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中,前述之一般食品可為食用產品本身。在一些實施例中,一般食品可為但不限於:飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)或調味料。
在一些實施例中,所得的龍膽萃取物可進一步作為食品添加物(food additive),以製得含有龍膽萃取物的食品組合物。於此,能藉由習知方法於原料製備時添加任一實施例的龍膽萃取物,或是於食品的製作過程中添加任一實施例的龍膽萃取物,而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食用產品(即食品組合物)。
在一些實施例中,前述龍膽萃取物包括具有式I所示結構的(2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-二羥基苯甲醯基)氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氫吡喃並[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三乙酸三酯((2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-dihydroxybenzoyl)oxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-2,4,5-triyl triacetate; Deglucosyltrifloroside,以下稱Deglucosyltrifloroside)及具有式II所示結構的(2R,3R,4S,5R,6S)-4-乙醯氧基-2-(乙醯氧基甲基)-5-(苯甲醯氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3, 4,4a,5,6,8-六氫吡喃並[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氫-2H-吡喃-3-基2,3-二羥基苯甲酸酯((2R,3R,4S,5R,6S)-4-acetoxy-2-(acetoxymethyl)-5-(benzoyloxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-3-yl 2,3-dihydroxybenzoate; Deglucoscabraside,以下稱Deglucoscabraside)。二化合物的結構是如下所示:
(I);以及
(II)。
舉例來說,將龍膽萃取物以體積比為10:1的正丁醇與水進行液相液相分配萃取可得到正丁醇可溶部(GSB)及水可溶部(GSW)。然後,以大孔樹脂管柱層析對正丁醇可溶部進行分離後得到多個劃分層,並以葡聚糖凝膠管柱層析(Sephadex LH-20 column chromatography)對各劃分層進行分離後再以經薄層層析片(Thin-Layer Chromatography, TLC)點片合併為多個分離部。接著,對多個分離部分別以中壓管柱層析儀(Medium pressure liquid chromatography, MPLC)分離後再經薄層層析片點片合併為多個次分離部。將各分離部以逆向高效液相層析(RP-HPLC)進行純化可得到TCI-GS-05與TCI-GS-07二化合物。最後,以氫-核磁共振光譜(
1H-NMR)與電噴灑離子化質譜(ESIMS)分析TCI-GS-05化合物的化學結構,且以氫-核磁共振光譜(
1H-NMR)與與高解析液相層析質譜儀分析TCI-GS-07的化學結構後,可確認TCI-GS-05為Deglucosyltrifloroside及TCI-GS-07為Deglucoscabraside。
在一些實施例中,前述Deglucosyltrifloroside及Deglucoscabraside均具有提高粒線體活性的作用。
例
1
:龍膽萃取物的製備
首先,將乾燥後的龍膽(學名:
Gentiana scabra;產地:中國山東)的根莖作為龍膽原料與的水以重量比15:1混合後,在85±5℃下萃取60分鐘後可得到含有固體的第一萃取液。接著,冷卻前述第一萃取液至室溫(25℃~30℃),並將冷卻後帶有固體的第一萃取液經離心機(廠牌/型號:Thermo Scientific Heraeus Fresco 17)離心約10分鐘,取其上清液為第一萃取上清液。然後,將第一萃取上清液以400目數的濾網進行過濾以去除細微固體,再以濃縮機(廠牌/型號:BUCHI -Rotavapor R-100)將過濾後的第一萃取上清液於60℃±5℃下進行減壓濃縮直到第一萃取上清液的白利糖度值為6.0±0.5時停止濃縮,即可得到龍膽萃取物。
例
2
:抗氧化實驗
於此,利用過氧化氫(H
2O
2)傷害細胞時會產生活性氧類物質(ROS)的特性來觀察龍膽萃取物的抗氧化強度。
所使用的細胞培養基為毛囊真皮乳頭細胞生長培養基試劑盒(品牌:PromoCell)。所使用的細胞為人毛囊真皮乳頭細胞(Human Follicle Dermal Papilla Cells, HFDPC;以下稱HFDPC細胞)。
首先,取1×10
5個HFDPC細胞接種至每孔含有2毫升細胞培養基的6孔細胞培養盤中,於37℃下培養24小時。
接著,將HFDPC細胞分為空白組、控制組及實驗組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔2mL的實驗培養基,然後置於37°C下分別接續培養1小時。其中,實驗組的實驗培養基為含有1mM的過氧化氫(H
2O
2)、100μM的例1中所得到的龍膽萃取物的細胞培養基。控制組的實驗培養基為含有1mM的過氧化氫的細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基。
接著,於各組中加入5μg/mL的DCFH-DA(品牌:Sigma),並於37°C下反應15分鐘。然後,添加1mM的過氧化氫至實驗組和控制組的細胞培養基中並於37°C下繼續反應1小時(空白組於此不額外添加過氧化氫)。
移除各組別的實驗培養基並以1×PBS(Gibco公司;Cat. 14200-075)清洗HFDPC細胞二次後,每孔加入200μL的胰蛋白酶(Trypsin;品牌:Sigma)於黑暗中反應15分鐘以利於後續收集各組別的HFDPC細胞。
將各組HFDPC細胞收集後以400×
g離心10分鐘,去除各組別的上清液後以1×PBS清洗一次,再以400×
g離心10分鐘並去除上清液以得到各組的細胞沉澱物。
接著,將各組的細胞沉澱物以1mL的1×PBS回溶後可得到代測溶液。並且,以流式細胞儀(品牌:BD Accuri)分別使用450 nm ~490 nm和510 nm ~550 nm的激發和發射波長,檢測DCFH-DA的螢光訊號,以推算ROS相對生產率(%),如圖1所示。
於此,空白組作為背景值,控制組作為細胞受到過氧化氫傷害後產生的ROS的代表組,而實驗組則為測試龍膽萃取物抗氧化能力的組別。請參見圖1。將空白組的ROS相對生產率視為100%,控制組的ROS相對生產率為747.6%,代表HFDPC細胞受到過氧化氫傷害產生大量的ROS;實驗組的ROS相對生產率則為676.9%,相較於控制組其ROS相對生產率大約被抑制了10%。換言之,龍膽萃取物具有抑制過氧化氫並降低ROS的作用。
基此,當使用者服用龍膽萃取物後可有效的提升毛囊細胞抗氧化能力,進而阻止頭皮發炎、發紅。
例
3
:粒線體活性實驗
所使用的細胞培養基為毛囊真皮乳頭細胞生長培養基試劑盒(品牌:PromoCell)。所使用的細胞為人毛囊真皮乳頭細胞(Human Follicle Dermal Papilla Cells, HFDPC;以下稱HFDPC細胞)。
首先,取1×10
5個HFDPC細胞接種至每孔含有2毫升細胞培養基的6孔細胞培養盤中,於37℃下培養24小時。
接著,將HFDPC細胞分為空白組及實驗組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔2mL的實驗培養基,然後置於37°C下分別接續培養24小時。其中,實驗組的實驗培養基為含有100μM的例1中所得到的龍膽萃取物的細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基。
移除各組別的實驗培養基並以1×PBS(Gibco公司;Cat. 14200-075)潤洗HFDPC細胞二次後,以胰蛋白酶(Trypsin;品牌:Sigma)作用後收集各組別的HFDPC細胞,並以400×
g離心5分鐘,去除各組別的上清液後以1×PBS清洗一次,再以400×
g離心5分鐘並去除上清液以得到各組的細胞沉澱物。
於各組別中加入100μL的JC-1工作溶液。於此,JC-1工作溶液是取自流式細胞儀線粒體膜電位檢測試劑盒(Flow cytometry Mitochrondrial membrane potential detection kit;品牌:BD):JC-1工作溶液是將凍乾的JC-1中加入130μL的DMSO以製備JC-1原液後,再以1:100的體積比與1×檢測緩衝液混合所製得。
將各組的細胞沉澱物與JC-1工作溶液震盪混合以得到各組混合溶液,並避光反應15分鐘。於反應15分鐘後,將各組混合溶液以400×
g離心5分鐘,去除上清液後以1mL的1×清洗緩衝液(1×Wash buffer)清洗並以400×
g離心5分鐘,並重複二次1×清洗緩衝液的清洗、離心步驟,直到第二次離心去除上清液後可得到各組的待測沉澱物。於此,1×清洗緩衝液是取自流式細胞儀線粒體膜電位檢測試劑盒。
以含有2%的牛血清蛋白(FBS)的1×PBS回溶各組的待測沉澱物以得到各組的待測溶液。並且,以流式細胞儀(品牌:BD Accuri)進行分析,以推算各組的JC-1相對累積(%),如圖2所示。並且,利用螢光顯微鏡觀察並攝影細胞中粒線體的活性狀態,如圖3及圖4所示。其中,螢光攝影照片是利用JC-1螢光染劑(MitoScreen ,BD Biosciences)添加在活細胞中追蹤當下的細胞反應,藉以判斷細胞中粒線體是處於高活性(呈現紅色)或是低活性(呈現綠色)階段,並用螢光顯微鏡拍攝。
於此,將所偵測出的JC-1累積代表細胞的粒線體活性。請參見圖2。將空白組的JC-1相對累積視為100%,而實驗組的JC-1相對累積為124.07%,代表實驗組相對於空白組的粒線體活性提高了24.07%。也就是說,龍膽萃取提高了HFDPC細胞的粒線體活性。
請參見圖3及圖4。藍色色塊代表細胞核、綠色色塊代表低活性的粒線體、而紅色色塊代表高活性的粒線體。空白組幾乎僅見代表細胞核的藍色色塊,少數代表低活性粒線體的綠色色塊及代表高活性粒線體的紅色色塊,如圖3所示。實驗組除代表細胞核的藍色色塊外,其代表高活性粒線體及低活性粒線體的紅綠色塊的數量均顯著地高於空白組,代表實驗組的細胞粒線體活性顯著高於空白組的細胞粒線體活性。也就是說,HFDPC細胞經龍膽萃取物處理後其粒線體活性大幅上升。
基此,使用者服用龍膽萃取物後可有效的提升毛囊細胞粒線體活性,並維持毛囊健康,進而減少細胞死亡掉屑。
例
4
:人體實驗
於此,將0.3克的粉末狀的例1所製備的龍膽萃取物裝入膠囊中以製成龍膽萃取物膠囊。
受試人員:7位受試者。其中,受試者的年齡介於20~65歲,且為頭皮容易乾燥、發癢之族群者。
測試項目:頭皮含水量檢測、自評問卷調查。
測試方式:7位受試者每日服用一顆龍膽萃取物膠囊,並連續服用8週。於服用前(即第0週)及服用8週後(即第8週),分別進行頭皮含水量檢測、落髮檢測、自評問卷調查。
例
4-1
:人體實驗
-
頭皮含水量試驗
頭皮含水量檢測是利用Corneometer
®CM825(C+K electronic, Germany)檢測儀器,將頭部劃分為左中右三區,並由額頭往後腦勺方向依序檢測3個位置(整頭共取9個位置)來推算頭皮的含水量。
請參閱圖5。將7位受試者第0週時所檢測的平均頭皮含水量視為100%,並推算7位受試者服用8週龍膽萃取物膠囊後的相對平均頭皮含水量。7位受試者第8週的平均頭皮含水量為104.7%,代表平均頭皮含水量增加4.7%,故而服用龍膽萃取物膠囊可使受試者的頭皮含水量增加。由此可知,長期使用龍膽萃取物膠囊可改善頭皮狀況、維持頭皮保濕度,即龍膽萃取物膠囊具頭皮保健的功效。
例
4-2
:人體實驗
-
洗頭髮時落髮情形
試驗
檢測方式:分別於第0週及第8週令7位受試者於清洗頭髮並觀察洗髮的落髮量,進而令受試者對的洗頭髮時的落髮情形的嚴重程度進行評量。評量項目為「洗頭髮掉髮量多」,且評分選項的依嚴重程度分為:「無困擾(1分)、輕微(2分)、中度(3分)、明顯(4分)、嚴重(5分)」。
請參閱圖6。將7位受試者第0週時所計數的平均洗頭髮時落髮情形(即嚴重程度的平均評分)視為100%,並推算7位受試者服用8週龍膽萃取物膠囊後的相對平均洗頭髮時落髮情形。7位受試者第8週的平均洗頭髮時落髮情形為80%,代表受試者對於「洗頭髮掉髮量多」的觀感降低且對嚴重程度的平均評分減少20%,故而服用龍膽萃取物膠囊可使受試者的於洗髮時減少落髮量。由此可知,長期使用龍膽萃取物膠囊可改善落髮狀況,即龍膽萃取物膠囊具防落髮的功效。
例
4-3
:人體實驗
-
落髮嚴重性評量
評量方式:分別於第0週及第8週令7位受試者填寫落髮嚴重性的評量,針對自身的落髮狀況進行評量。其中,評量選項包括:「無(無落髮情形)、輕微、中度、嚴重」。
請參閱圖7左圖。7位受試者於第0週時進行落髮嚴重性評量:無一人評量為「無」、3人評量為「輕微」(佔43%)、2人評量為「中度」(佔28%)、2人評量為「嚴重」(佔29%)。由此可知,7位受試者均有落髮情形。
請參閱圖7右圖。7位受試者於第8週時進行落髮嚴重性評量:1人評量為「無」(佔15%)、4人評量為「輕微」(佔57%)、1人評量為「中度」(佔14%)、1人評量為「嚴重」(佔14%)。由此可知,有1人明顯感到無落髮情形。且感到「中度」或「嚴重」落髮情形的人均減少。也就是說,服用龍膽萃取物膠囊可改善受試者落髮情形。由此可知,長期使用龍膽萃取物膠囊可改善落髮狀況,即龍膽萃取物膠囊具防落髮的功效。
例
4-4
:人體實驗
-
頭皮保健功效的滿意度評分
評量方式:令7位受試者於服用龍膽萃取物第8週後填寫龍膽萃取物功效的評量,並針對自身頭皮及頭髮情形的改善有感度予以評比計分。其中,評量功效包括:「防落髮、頭皮舒緩」;評比分數為1分(不滿意)-10分(滿意),且評比分數越高表示對於功效滿意度越佳。
請參閱圖8。於服用8週龍膽萃取物後,7位受試者對於「防落髮」功效的平均評分為8分,且對於「頭皮舒緩」功效的平均評分為7.8分。也就是說,受試者對龍膽萃取於防止落髮與頭皮舒緩功效滿意度為分別為8.0及7.8分,且100%受試者給予6分以上評價。由此可知,長期使用龍膽萃取物膠囊可有效改善頭皮狀況、防止落髮並舒緩頭皮,即龍膽萃取物膠囊具頭皮保健的功效。
此外,於人體試驗期間(服用期間),龍膽萃取物皆無造成7位受試者腸胃道刺激與任何不適。
例
5
:龍膽萃取物的指紋圖譜
將例1所製備的龍膽萃取物作為樣品進行HPLC指紋圖譜分析,分析結果如圖9所示。
其中,所使用的設備為高效能液相層析儀(High Performance Liquid Chromatography, HPLC):高效液相層析儀是Hitachi chromaster 5260系列;沖提溶劑輸送是Hitachi chromaster 5110;管柱恆溫裝置是Hitachi chromaster 5310;光二極體陣列偵測器(Diode Array Detector, DAD)是Hitachi chromaster 5430,且所使用偵測波長為210 nm。
所使用溶劑為作為A液的額外添加0.1%的甲酸的甲醇,以及作為B液的額外添加0.1%的甲酸的水。
指紋圖譜分析設定條件:流速為1 mL/min。沖提條件:0分鐘時A液:B液=2:98;10分鐘時A液:B液=2:98;40分鐘時A液:B液=70:30;50分鐘時A液:B液=100:0;且60分鐘時A液:B液=100:0。分析實驗時,管柱溫度為40℃。
所使用的樣品濃度為50 mg/ml、注射量為10 μl。
請參見圖9,可見龍膽萃取物的效性成分主要出現於圖譜中20分~30分之間,以及接近40分處。
例
6
:化合物的鑑定
將例所製備的龍膽萃取物取10L並以體積比為10:1的正丁醇與水進行液相-液相分配萃取,得到34.4克的正丁醇可溶部(GSB)及677.2克的水可溶部(GSW)。
然後,以作為層析材料的大孔樹脂HP-20管柱(Diaion HP-20)對34.4克的正丁醇可溶部進行層析分離,總共可分離得到3個劃分層(即GSB-F1、GSB-F2及GSB-F3)。其中,起始沖提液為純水,爾後增加甲醇比例至100%的甲醇。接著,將GSB-F3劃分層以葡聚糖凝膠管柱層析(Sephadex LH-20 column chromatography)搭配甲醇作為沖提液進行分離,再經薄層層析片(TLC)點片合併,可得到8個分離部(即GSBF3-1~GSBF3-8)。
接著,對GSBF3-7以中壓管柱層析儀(Medium pressure liquid chromatography, MPLC)(品牌:Combi
Flash ®Rf+, Teledyne ISCO, Lincoln, NE)分離後再經薄層層析片點片合併後,可得到5個次分離部(即GSBF3-7-1~GSBF3-7-5)。
將GSBF3-7-1以逆向高效液相層析(RP-HPLC)進行純化可得到TCI-GS-05化合物。於此,得到化合物的移動相為體積比2:3的甲醇與水。接著,以氫-核磁共振光譜(
1H-NMR)與電噴灑離子化質譜(ESIMS)分析TCI-GS-05化合物的化學結構,可確認TCI-GS-05為Deglucosyltrifloroside,且TCI-GS-05的
1H-NMR圖譜如圖10所示。TCI-GS-05化合物具有式I結構:
(I)。
將GSBF3-7-2以逆向高效液相層析進行純化可得到TCI-GS-07化合物。於此,得到化合物的移動相為體積比1:4的甲醇與水。接著,以氫-核磁共振光譜(
1H-NMR)與高解析液相層析質譜儀分析TCI-GS-07化合物的化學結構,可確認TCI-GS-07為Deglucoscabraside,且TCI-GS-07的
1H-NMR圖譜如圖11所示。TCI-GS-07化合物具有式II結構:
(II)。
於此,所使用的核磁共振光譜儀(Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer, NMR)。其1D與2D光譜使用Ascend 400 MHz系列(品牌:Bruker Co., Germany)。並且,其以δ表示化學位移(chemical shift),單位為 ppm。
所使用的高解析液相層析質譜儀:串連超高效液相層析儀 (Ultimate 3000 HPLC)與高解析度軌道式離子阱質譜儀(Q-EXACTIVE System with Ion Max Source)測定,單位為 m/z。
基此,龍膽萃取物包括具有式I所示結構的(Deglucosyltrifloroside)及具有式II所示結構的(Deglucoscabraside)。
例
7
:化合物的功效實驗
將例7所分離的TCI-GS-05化合物及TCI-GS-07化合物進行粒線體活性分析實驗。
所使用的細胞培養基為毛囊真皮乳頭細胞生長培養基試劑盒(品牌:PromoCell)。所使用的細胞為人毛囊真皮乳頭細胞(Human Follicle Dermal Papilla Cells, HFDPC;以下稱HFDPC細胞)。
首先,取1×10
5個HFDPC細胞接種至每孔含有2毫升細胞培養基的6孔細胞培養盤中,於37℃下培養24小時。
接著,將HFDPC細胞分為空白組及TCI-GS-05實驗組、TCI-GS-07實驗組。移除各組別的細胞培養基並更換為每孔2mL的實驗培養基,然後置於37°C下分別接續培養24小時。其中,TCI-GS-05實驗組的實驗培養基為含有100μM的例7中所分離到的Deglucosyltrifloroside的細胞培養基。TCI-GS-07實驗組的實驗培養基為含有100μM的例7中所分離到的Deglucoscabraside的細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基。
移除各組別的實驗培養基並以1×PBS(Gibco公司;Cat. 14200-075)潤洗HFDPC細胞二次後,以胰蛋白酶(Trypsin;品牌:Sigma)作用後收集各組別的HFDPC細胞,並以400×
g離心5分鐘,去除各組別的上清液後以1×PBS清洗一次,再以400×
g離心5分鐘並去除上清液以得到各組的細胞沉澱物。
於各組別中加入100μL的JC-1工作溶液。於此,JC-1工作溶液是取自流式細胞儀線粒體膜電位檢測試劑盒(Flow cytometry Mitochrondrial membrane potential detection kit;品牌:BD):JC-1工作溶液是將凍乾的JC-1中加入130μL的DMSO以製備JC-1原液後,再以1:100的體積比與1×檢測緩衝液混合所製得。
將各組的細胞沉澱物與JC-1工作溶液震盪混合以得到各組混合溶液,並避光反應15分鐘。於反應15分鐘後,將各組混合溶液以400×
g離心5分鐘,去除上清液後以1mL的1×清洗緩衝液(1×Wash buffer)清洗並以400×
g離心5分鐘,並重複二次1×清洗緩衝液的清洗、離心步驟,直到第二次離心去除上清液後可得到各組的待測沉澱物。於此,1×清洗緩衝液是取自流式細胞儀線粒體膜電位檢測試劑盒。
以含有2%的牛血清蛋白(FBS)的1×PBS回溶各組的待測沉澱物以得到各組的待測溶液。並且,以流式細胞儀(品牌:BD Accuri)進行分析,以推算各組的粒線體相對活性(%),如圖12所示。需要特別說明的是,圖12中的粒線體相對活性是以百分比呈現,其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差,且各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析。在圖12中,「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。
請參見圖12。將空白組的粒線體相對活性視為100%,而TCI-GS-05實驗組的粒線體相對活性為142.4%且TCI-GS-07實驗組的粒線體相對活性為124.8%,代表TCI-GS-05及TCI-GS-07二實驗組相對於空白組的粒線體活性分別提高了42.4%及24.8%。也就是說,二化合物均提高了HFDPC細胞的粒線體活性。
基此,使用者服用含有Deglucosyltrifloroside及Deglucoscabraside的龍膽萃取物後可有效的提升毛囊細胞粒線體活性,並維持毛囊健康,進而減少細胞死亡掉屑。
綜上所述,根據任一實施例的龍膽萃取物,其可用以製備頭皮保健的組合物。換言之,前述之組合物具有下列一種或多種功能:提高細胞粒線體活性(例如毛囊細胞)、強抗氧化力、阻止頭皮發炎及發紅、維持毛囊健康、提高頭皮含水量、改善落髮、減緩頭皮敏感度等。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾,皆應涵蓋於本發明的範疇內,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1是抗氧化實驗的實驗結果圖;
圖2是粒線體活性實驗的實驗結果圖;
圖3是空白組的粒線體活性實驗照片;
圖4是實驗組的粒線體活性實驗照片;
圖5是第0週及第8週的頭皮含水量試驗的數據結果圖;
圖6是第0週及第8週的洗頭髮時落髮情形的數據結果圖;
圖7是第0週及第8週的落髮嚴重性的圓餅圖;
圖8是頭皮保健功效(防落髮及頭皮舒緩)的滿意度評分結果圖;
圖9是龍膽萃取物的效性成分指紋圖譜結果圖;
圖10是TCI-GS-05的氫核磁共振光譜的實驗結果圖;
圖11是TCI-GS-07的氫核磁共振光譜的實驗結果圖;以及
圖12是粒線體活性實驗的實驗結果圖。
Claims (9)
- 一種龍膽萃取物用於製備頭皮保健的組合物的用途,其中該龍膽萃取物是將龍膽(Gentiana scabra)的根莖或葉以水於70℃~100℃下萃取45分鐘~90分鐘所得,該水與該龍膽的重量比為15~30:1,該頭皮保健為提高頭皮含水量或減緩頭皮敏感度。
- 如請求項1所述的用途,其中該龍膽萃取物包括具有式I所示結構的(2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-二羥基苯甲醯基)氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氫吡喃並[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三乙酸三酯((2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-dihydroxybenzoyl)oxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetra hydro-2H-pyran-2,4,5-triyl triacetate;Deglucosyltrifloroside)及具有式II所示結構的(2R,3R,4S,5R,6S)-4-乙醯氧基-2-(乙醯氧基甲基)-5-(苯甲醯氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氫吡喃並[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氫-2H-吡喃-3-基2,3-二羥基苯甲酸酯((2R,3R,4S,5R,6S)-4-acetoxy-2-(acetoxymethyl)-5-(benzoyloxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-3-yl 2,3-dihydroxybenzoate;Deglucoscabraside); ;以及
- 如請求項2所述的用途,其中該(2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-二羥基苯甲醯基)氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氫吡喃並[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三乙酸三酯及該(2R,3R,4S,5R,6S)-4-乙醯氧基-2-(乙醯氧基甲基)-5-(苯甲醯氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氫吡喃並[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氫-2H-吡喃-3-基2,3-二羥基苯甲酸酯具有提高粒線體活性的作用。
- 如請求項1所述的用途,其中該龍膽萃取物是將該龍膽以該水於85±5℃下萃取60分鐘以得到初萃取液,將該初萃取液離心取得上清液,並將該上清液過濾及減壓濃縮後所得。
- 如請求項1所述的用途,其中該龍膽萃取物具有強抗氧化力。
- 如請求項4所述的用途,其中該龍膽萃取物具有阻止頭皮發炎、發紅的作用。
- 如請求項1所述的用途,其中該龍膽萃取物具有提升毛囊細胞粒線體活性的作用。
- 如請求項6所述的用途,其中該龍膽萃取物具有維持毛囊健康的作用。
- 如請求項4所述的用途,其中該龍膽萃取物的使用量為0.3克/日。
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Non-Patent Citations (2)
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期刊 Wei Li et al., "Chemical constituents of the rhizomes and roots of Gentiana scabra (Gentianaceae)", Biochemical Systematics and Ecology, 61, 2015, 169-174. * |
期刊 Yu-Min He et al., "The anti-inflammatory secoiridoid glycosides from Gentianae Scabrae Radix: the root and rhizome of Gentiana scabra", Journal of Natural Medicines, 69(3), 2015, 303-312.; * |
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