CN118267413A - 龙胆萃取物用于制备头皮保健的组合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种龙胆萃取物用于制备头皮保健的组合物的用途。其中，龙胆萃取物是将龙胆(Gentiana scabra)以水于70℃～100℃下萃取45分钟～90分钟所得。基此，龙胆萃取物可用于头皮保健。

Description

龙胆萃取物用于制备头皮保健的组合物的用途
技术领域
本发明涉及一种龙胆萃取物，特别是关于一种龙胆萃取物用于制备头皮保健的组合物的用途。
背景技术
如何保养自身使外在保持年轻健康的外型，除了脸部保养外，头皮保健也变成焦点之一。
保健头皮主要是为了减缓头皮老化的症状，常见症状包括发色褪色为灰白、头皮出油量提高、产生大量头皮屑、大量掉发、头发稀疏细软等等。造成头皮老化的原因：压力大、作息不正常、紫外线、环境污染、不当的染烫发、日常清洁不足、贺尔蒙变化等等。并且，在正常情形下，每日落发量约50根～100根，当单日落发量超过150根时，则代表头皮不健康而有秃头危机。
因此，为了维持良好的外观，如何维持头皮健康的方法也备受关注。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种龙胆萃取物用于制备头皮保健的组合物的用途。其中，任一实施例的龙胆萃取物，其具有头皮保健的功能。
在一些实施例中，一种龙胆萃取物用于制备头皮保健的组合物的用途，其中龙胆萃取物是将龙胆(Gentiana scabra)以水于70℃～100℃下萃取45分钟～90分钟所得。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物包括具有式I所示结构的(2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-二羟基苯甲酰基)氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氢吡喃并[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三乙酸三酯((2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-dihydroxybenzoyl)oxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-2,4,5-triyltriacetate；Deglucosyltrifloroside)及具有式II所示结构的(2R,3R,4S,5R,6S)-4-乙酰氧基-2-(乙酰氧基甲基)-5-(苯甲酰氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氢吡喃并[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3-基2,3-二羟基苯甲酸酯((2R,3R,4S,5R,6S)-4-acetoxy-2-(acetoxymethyl)-5-(benzoyloxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-3-yl 2,3-dihydroxybenzoate；Deglucoscabraside)。于此，式I及式II如下所式：
以及
在一些实施例中，前述(2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-二羟基苯甲酰基)氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氢吡喃并[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三乙酸三酯(以下称Deglucosyltrifloroside)及(2R,3R,4S,5R,6S)-4-乙酰氧基-2-(乙酰氧基甲基)-5-(苯甲酰氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氢吡喃并[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3-基2,3-二羟基苯甲酸酯(以下称Deglucoscabraside)具有提高粒线体活性的作用。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物是将龙胆以水于85±5℃下萃取60分钟以得到初萃取液，并将初萃取液离心取得上清液，再将上清液过滤及减压浓缩后所得。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物具有强抗氧化力。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物具有阻止头皮发炎、发红的作用。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物有提升毛囊细胞粒线体活性的作用。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物具有维持毛囊健康的作用。
在一些实施例中，前述头皮保健包括提高头皮含水量、改善落发、减缓头皮敏感度或其组合。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物的使用量为0.3克/日。
综上所述，任一实施例的龙胆萃取物，其能用以保健头皮。换言之，任一实施例的龙胆萃取物，其可用以制备头皮保健的组合物。在一些实施例中，龙胆萃取物具有提高粒线体活性的作用。在一些实施例中，龙胆萃取物具有阻止头皮发炎及发红用、提升毛囊细胞粒线体活性以维持毛囊健康、提高头皮含水量、改善落发、减缓头皮敏感度等作用，进而可维持头皮健康并达成头皮保健的效果。
附图说明
图1是抗氧化实验的实验结果图；
图2是粒线体活性实验的实验结果图；
图3是空白组的粒线体活性实验照片；
图4是实验组的粒线体活性实验照片；
图5是第0周及第8周的头皮含水量试验的数据结果图；
图6是第0周及第8周的洗头发时落发情形的数据结果图；
图7是第0周及第8周的落发严重性的圆饼图；
图8是头皮保健功效(防落发及头皮舒缓)的满意度评分结果图；
图9是龙胆萃取物的效性成分指纹图谱结果图；
图10是TCI-GS-05的氢核磁共振光谱的实验结果图；
图11是TCI-GS-07的氢核磁共振光谱的实验结果图；以及
图12是粒线体活性实验的实验结果图。
具体实施方式
于下列实施方式的说明中，除非另有相关说明，则「％」及「wt％」符号是指重量百分比。
龙胆(学名：Gentiana scabra)为龙胆科龙胆属的植物，亦称为龙胆草(植物名实图考)、胆草、草龙胆、山龙胆等。在中医上，其性寒味苦，通常以根入药，且主治目赤、咽痛、黄疸、热痢、胁痛及小便热痛等症。
在一些实施例中，将龙胆(产地：中国)的根茎作为原料(以下称龙胆原料)与作为溶剂的水以特定比例混合后，在70℃～100℃下萃取45分钟～90分钟后，在经过离心、过滤、浓缩等处理后即可得到龙胆萃取物。于此，若溶剂过少或萃取时间过短，则萃取效率将会明显下降；若萃取时间过长，则萃取物中的有效成分可能会产生降解。
在一些实施例中，萃取温度可以为80℃～90℃，且萃取时间可以为60分钟。举例来说，前述龙胆萃取物是将龙胆以水于85±5℃下萃取60分钟以得到初萃取液，并将初萃取液离心取得上清液，再将上清液过滤及减压浓缩后所得。
在一些实施例中，所使用的龙胆原料为龙胆的叶，且前述龙胆原料可以为经干燥处理过的根茎或现成购买已干燥过的现成龙胆根茎。
在一些实施例中，龙胆原料与水的重量比为15～30：1。举例来说，龙胆原料与水的重量比为15：1。
在一些实施例中，将龙胆原料与的水以特定重量比混合并在70℃～100℃下萃取45分钟～90分钟后可得到含有固体的第一萃取液。接着，冷却前述第一萃取液至室温(25℃～30℃)，并将冷却后带有固体的第一萃取液经离心机离心约10分钟，取其上清液为第一萃取上清液。然后，将第一萃取上清液以400目数的滤网进行过滤以去除细微固体，再以浓缩机将过滤后的第一萃取上清液于45℃～70℃下进行减压浓缩直到第一萃取上清液的白利糖度值(Degrees Brix)为6.0±0.5时停止浓缩，即可得到龙胆萃取物。其中，减压浓缩的设定温度可为60℃±5℃。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物具有强抗氧化力。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物具有阻止头皮发炎、发红的作用。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物具有提升毛囊细胞粒线体活性的作用。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物具有维持毛囊健康的作用。
在一些实施例中，龙胆萃取物用于制备头皮保健的组合物的用途，其中龙胆萃取物是将龙胆(Gentiana scabra)以水于70℃～100℃下萃取45分钟～90分钟所得。其中，头皮保健包括提高头皮含水量、改善落发、减缓头皮敏感度或其组合。也就是说，前述龙胆萃取物具有提高头皮含水量、改善落发、减缓头皮敏感度等作用。
在一些实施例中，前述任一组合物中所含有的龙胆萃取物的使用量为0.3克/日～2.5克/日。
在一些实施例中，组合物可以为液态(如，饮品等)或固态(如，粉末、锭剂等)。
举例来说，液态组合物中的龙胆萃取物的使用量为2.5克/日，而固态的组合物中龙胆萃取物的使用量为0.3克/日。
在一些实施例中，前述之任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的龙胆萃取物。
在一些实施例中，前述之医药品可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于经肠道地、非经肠道地(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投药剂型。
在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。在一些实施例中，非经肠道地或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)或病灶内注射(intralesional injection)。
在一些实施例中，前述之医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术之医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用之载剂的种类与数量是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solutioncontaining alcohol)。
在一些实施例中，前述之任一组合物可为食用产品。换言之，食用产品包含特定含量的龙胆萃取物。在一些实施例中，食用产品可为一般食品、保健食品或膳食补充品。
在一些实施例中，前述之食用产品可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于口服的剂型。在一些实施例中，前述之一般食品可为食用产品本身。在一些实施例中，一般食品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)或调味料。
在一些实施例中，所得的龙胆萃取物可进一步作为食品添加物(food additive)，以制得含有龙胆萃取物的食品组合物。于此，能藉由现有方法于原料制备时添加任一实施例的龙胆萃取物，或是于食品的制作过程中添加任一实施例的龙胆萃取物，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食用产品(即食品组合物)。
在一些实施例中，前述龙胆萃取物包括具有式I所示结构的(2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-二羟基苯甲酰基)氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氢吡喃并[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三乙酸三酯((2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-dihydroxybenzoyl)oxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-2,4,5-triyltriacetate；Deglucosyltrifloroside，以下称Deglucosyltrifloroside)及具有式II所示结构的(2R,3R,4S,5R,6S)-4-乙酰氧基-2-(乙酰氧基甲基)-5-(苯甲酰氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氢吡喃并[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3-基2,3-二羟基苯甲酸酯((2R,3R,4S,5R,6S)-4-acetoxy-2-(acetoxymethyl)-5-(benzoyloxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-3-yl2,3-dihydroxybenzoate；Deglucoscabraside，以下称Deglucoscabraside)。二化合物的结构是如下所示：
以及
举例来说，将龙胆萃取物以体积比为10：1的正丁醇与水进行液相分配萃取可得到正丁醇可溶部(GSB)及水可溶部(GSW)。然后，以大孔树脂管柱层析对正丁醇可溶部进行分离后得到多个划分层，并以葡聚糖凝胶管柱层析(Sephadex LH-20columnchromatography)对各划分层进行分离后再以经薄层层析片(Thin-LayerChromatography,TLC)点片合并为多个分离部。接着，对多个分离部分别以中压管柱层析仪(Medium pressure liquid chromatography,MPLC)分离后再经薄层层析片点片合并为多个次分离部。将各分离部以逆向高效液相层析(RP-HPLC)进行纯化可得到TCI-GS-05与TCI-GS-07二化合物。最后，以氢-核磁共振光谱(1H-NMR)与电喷洒离子化质谱(ESIMS)分析TCI-GS-05化合物的化学结构，且以氢-核磁共振光谱(1H-NMR)与高解析液相层析质谱仪分析TCI-GS-07的化学结构后，可确认TCI-GS-05为Deglucosyltrifloroside及TCI-GS-07为Deglucoscabraside。
在一些实施例中，前述Deglucosyltrifloroside及Deglucoscabraside均具有提高粒线体活性的作用。
例1：龙胆萃取物的制备
首先，将干燥后的龙胆(学名：Gentiana scabra；产地：中国山东)的根茎作为龙胆原料与的水以重量比15：1混合后，在85±5℃下萃取60分钟后可得到含有固体的第一萃取液。接着，冷却前述第一萃取液至室温(25℃～30℃)，并将冷却后带有固体的第一萃取液经离心机(厂牌/型号：Thermo Scientific Heraeus Fresco 17)离心约10分钟，取其上清液为第一萃取上清液。然后，将第一萃取上清液以400目数的滤网进行过滤以去除细微固体，再以浓缩机(厂牌/型号：BUCHI-Rotavapor R-100)将过滤后的第一萃取上清液于60℃±5℃下进行减压浓缩直到第一萃取上清液的白利糖度值为6.0±0.5时停止浓缩，即可得到龙胆萃取物。
例2：抗氧化实验
于此，利用过氧化氢(H2O2)伤害细胞时会产生活性氧类物质(ROS)的特性来观察龙胆萃取物的抗氧化强度。
所使用的细胞培养基为毛囊真皮乳头细胞生长培养基试剂盒(品牌：PromoCell)。所使用的细胞为人毛囊真皮乳头细胞(Human Follicle Dermal Papilla Cells,HFDPC；以下称HFDPC细胞)。
首先，取1×105个HFDPC细胞接种至每孔含有2毫升细胞培养基的6孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。
接着，将HFDPC细胞分为空白组、控制组及实验组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔2mL的实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养1小时。其中，实验组的实验培养基为含有1mM的过氧化氢(H2O2)、100μM的例1中所得到的龙胆萃取物的细胞培养基。控制组的实验培养基为含有1mM的过氧化氢的细胞培养基。空白组的实验培养基为单纯的细胞培养基。
接着，于各组中加入5μg/mL的DCFH-DA(品牌：Sigma)，并于37℃下反应15分钟。然后，添加1mM的过氧化氢至实验组和控制组的细胞培养基中并于37℃下继续反应1小时(空白组于此不额外添加过氧化氢)。
移除各组别的实验培养基并以1×PBS(Gibco公司；Cat.14200-075)清洗HFDPC细胞二次后，每孔加入200μL的胰蛋白酶(Trypsin；品牌：Sigma)于黑暗中反应15分钟以利于后续收集各组别的HFDPC细胞。
将各组HFDPC细胞收集后以400×g离心10分钟，去除各组别的上清液后以1×PBS清洗一次，再以400×g离心10分钟并去除上清液以得到各组的细胞沉淀物。
接着，将各组的细胞沉淀物以1mL的1×PBS回溶后可得到代测溶液。并且，以流式细胞仪(品牌：BD Accuri)分别使用450nm～490nm和510nm～550nm的激发和发射波长，检测DCFH-DA的荧光讯号，以推算ROS相对生产率(％)，如图1所示。
于此，空白组作为背景值，控制组作为细胞受到过氧化氢伤害后产生的ROS的代表组，而实验组则为测试龙胆萃取物抗氧化能力的组别。请参见图1。将空白组的ROS相对生产率视为100％，控制组的ROS相对生产率为747.6％，代表HFDPC细胞受到过氧化氢伤害产生大量的ROS；实验组的ROS相对生产率则为676.9％，相较于控制组其ROS相对生产率大约被抑制了10％。换言之，龙胆萃取物具有抑制过氧化氢并降低ROS的作用。
基此，当使用者服用龙胆萃取物后可有效的提升毛囊细胞抗氧化能力，进而阻止头皮发炎、发红。
例3：粒线体活性实验
所使用的细胞培养基为毛囊真皮乳头细胞生长培养基试剂盒(品牌：PromoCell)。所使用的细胞为人毛囊真皮乳头细胞(Human Follicle Dermal Papilla Cells,HFDPC；以下称HFDPC细胞)。
首先，取1×105个HFDPC细胞接种至每孔含有2毫升细胞培养基的6孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。
接着，将HFDPC细胞分为空白组及实验组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔2mL的实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养24小时。其中，实验组的实验培养基为含有100μM的例1中所得到的龙胆萃取物的细胞培养基。空白组的实验培养基为单纯的细胞培养基。
移除各组别的实验培养基并以1×PBS(Gibco公司；Cat.14200-075)润洗HFDPC细胞二次后，以胰蛋白酶(Trypsin；品牌：Sigma)作用后收集各组别的HFDPC细胞，并以400×g离心5分钟，去除各组别的上清液后以1×PBS清洗一次，再以400×g离心5分钟并去除上清液以得到各组的细胞沉淀物。
于各组别中加入100μL的JC-1工作溶液。于此，JC-1工作溶液是取自流式细胞仪线粒体膜电位检测试剂盒(Flow cytometry Mitochrondrial membrane potentialdetection kit；品牌：BD)：JC-1工作溶液是将冻干的JC-1中加入130μL的DMSO以制备JC-1原液后，再以1：100的体积比与1×检测缓冲液混合所制得。
将各组的细胞沉淀物与JC-1工作溶液震荡混合以得到各组混合溶液，并避光反应15分钟。于反应15分钟后，将各组混合溶液以400×g离心5分钟，去除上清液后以1mL的1×清洗缓冲液(1×Wash buffer)清洗并以400×g离心5分钟，并重复二次1×清洗缓冲液的清洗、离心步骤，直到第二次离心去除上清液后可得到各组的待测沉淀物。于此，1×清洗缓冲液是取自流式细胞仪线粒体膜电位检测试剂盒。
以含有2％的牛血清蛋白(FBS)的1×PBS回溶各组的待测沉淀物以得到各组的待测溶液。并且，以流式细胞仪(品牌：BD Accuri)进行分析，以推算各组的JC-1相对累积(％)，如图2所示。并且，利用荧光显微镜观察并摄影细胞中粒线体的活性状态，如图3及图4所示。其中，荧光摄影照片是利用JC-1荧光染剂(MitoScreen,BD Biosciences)添加在活细胞中追踪当下的细胞反应，藉以判断细胞中粒线体是处于高活性(呈现红色)或是低活性(呈现绿色)阶段，并用荧光显微镜拍摄。
于此，将所检测出的JC-1累积代表细胞的粒线体活性。请参见图2。将空白组的JC-1相对累积视为100％，而实验组的JC-1相对累积为124.07％，代表实验组相对于空白组的粒线体活性提高了24.07％。也就是说，龙胆萃取提高了HFDPC细胞的粒线体活性。
请参见图3及图4。蓝色色块代表细胞核、绿色色块代表低活性的粒线体、而红色色块代表高活性的粒线体。空白组几乎仅见代表细胞核的蓝色色块，少数代表低活性粒线体的绿色色块及代表高活性粒线体的红色色块，如图3所示。实验组除代表细胞核的蓝色色块外，其代表高活性粒线体及低活性粒线体的红绿色块的数量均显著地高于空白组，代表实验组的细胞粒线体活性显著高于空白组的细胞粒线体活性。也就是说，HFDPC细胞经龙胆萃取物处理后其粒线体活性大幅上升。
基此，使用者服用龙胆萃取物后可有效的提升毛囊细胞粒线体活性，并维持毛囊健康，进而减少细胞死亡掉屑。
例4：人体实验
于此，将0.3克的粉末状的例1所制备的龙胆萃取物装入胶囊中以制成龙胆萃取物胶囊。
受试人员：7位受试者。其中，受试者的年龄介于20～65岁，且为头皮容易干燥、发痒之族群者。
测试项目：头皮含水量检测、自评问卷调查。
测试方式：7位受试者每日服用一颗龙胆萃取物胶囊，并连续服用8周。于服用前(即第0周)及服用8周后(即第8周)，分别进行头皮含水量检测、落发检测、自评问卷调查。
例4-1：人体实验-头皮含水量试验
头皮含水量检测是利用CM825(C+K electronic,Germany)检测仪器，将头部划分为左中右三区，并由额头往后脑勺方向依序检测3个位置(整头共取9个位置)来推算头皮的含水量。
请参阅图5。将7位受试者第0周时所检测的平均头皮含水量视为100％，并推算7位受试者服用8周龙胆萃取物胶囊后的相对平均头皮含水量。7位受试者第8周的平均头皮含水量为104.7％，代表平均头皮含水量增加4.7％，故而服用龙胆萃取物胶囊可使受试者的头皮含水量增加。由此可知，长期使用龙胆萃取物胶囊可改善头皮状况、维持头皮保湿度，即龙胆萃取物胶囊具头皮保健的功效。
例4-2：人体实验-洗头发时落发情形试验
检测方式：分别于第0周及第8周令7位受试者于清洗头发并观察洗发的落发量，进而令受试者对的洗头发时的落发情形的严重程度进行评量。评量项目为「洗头发掉发量多」，且评分选项的依严重程度分为：「无困扰(1分)、轻微(2分)、中度(3分)、明显(4分)、严重(5分)」。
请参阅图6。将7位受试者第0周时所计数的平均洗头发时落发情形(即严重程度的平均评分)视为100％，并推算7位受试者服用8周龙胆萃取物胶囊后的相对平均洗头发时落发情形。7位受试者第8周的平均洗头发时落发情形为80％，代表受试者对于「洗头发掉发量多」的观感降低且对严重程度的平均评分减少20％，故而服用龙胆萃取物胶囊可使受试者的于洗发时减少落发量。由此可知，长期使用龙胆萃取物胶囊可改善落发状况，即龙胆萃取物胶囊具防落发的功效。
例4-3：人体实验-落发严重性评量
评量方式：分别于第0周及第8周令7位受试者填写落发严重性的评量，针对自身的落发状况进行评量。其中，评量选项包括：「无(无落发情形)、轻微、中度、严重」。
请参阅图7左图。7位受试者于第0周时进行落发严重性评量：无一人评量为「无」、3人评量为「轻微」(占43％)、2人评量为「中度」(占28％)、2人评量为「严重」(占29％)。由此可知，7位受试者均有落发情形。
请参阅图7右图。7位受试者于第8周时进行落发严重性评量：1人评量为「无」(占15％)、4人评量为「轻微」(占57％)、1人评量为「中度」(占14％)、1人评量为「严重」(占14％)。由此可知，有1人明显感到无落发情形。且感到「中度」或「严重」落发情形的人均减少。也就是说，服用龙胆萃取物胶囊可改善受试者落发情形。由此可知，长期使用龙胆萃取物胶囊可改善落发状况，即龙胆萃取物胶囊具防落发的功效。
例4-4：人体实验-头皮保健功效的满意度评分
评量方式：令7位受试者于服用龙胆萃取物第8周后填写龙胆萃取物功效的评量，并针对自身头皮及头发情形的改善有感度予以评比计分。其中，评量功效包括：「防落发、头皮舒缓」；评比分数为1分(不满意)-10分(满意)，且评比分数越高表示对于功效满意度越佳。
请参阅图8。于服用8周龙胆萃取物后，7位受试者对于「防落发」功效的平均评分为8分，且对于「头皮舒缓」功效的平均评分为7.8分。也就是说，受试者对龙胆萃取于防止落发与头皮舒缓功效满意度为分别为8.0及7.8分，且100％受试者给予6分以上评价。由此可知，长期使用龙胆萃取物胶囊可有效改善头皮状况、防止落发并舒缓头皮，即龙胆萃取物胶囊具头皮保健的功效。
此外，于人体试验期间(服用期间)，龙胆萃取物皆无造成7位受试者肠胃道刺激与任何不适。
例5：龙胆萃取物的指纹图谱
将例1所制备的龙胆萃取物作为样品进行HPLC指纹图谱分析，分析结果如图9所示。
其中，所使用的设备为高效能液相层析仪(High Performance LiquidChromatography,HPLC)：高效液相层析仪是Hitachi chromaster 5260系列；冲提溶剂输送是Hitachi chromaster 5110；管柱恒温装置是Hitachi chromaster 5310；光二极管数组侦测器(Diode Array Detector,DAD)是Hitachi chromaster 5430，且所使用检测波长为210nm。
所使用溶剂为作为A液的额外添加0.1％的甲酸的甲醇，以及作为B液的额外添加0.1％的甲酸的水。
指纹图谱分析设定条件：流速为1mL/min。冲提条件：0分钟时A液：B液＝2：98；10分钟时A液：B液＝2：98；40分钟时A液：B液＝70：30；50分钟时A液：B液＝100：0；且60分钟时A液：B液＝100：0。分析实验时，管柱温度为40℃。
所使用的样品浓度为50mg/ml、注射量为10μl。
请参见图9，可见龙胆萃取物的效性成分主要出现于图谱中20分～30分之间，以及接近40分处。
例6：化合物的鉴定
将例所制备的龙胆萃取物取10L并以体积比为10：1的正丁醇与水进行液相-液相分配萃取，得到34.4克的正丁醇可溶部(GSB)及677.2克的水可溶部(GSW)。
然后，以作为层析材料的大孔树脂HP-20管柱(Diaion HP-20)对34.4克的正丁醇可溶部进行层析分离，总共可分离得到3个划分层(即GSB-F1、GSB-F2及GSB-F3)。其中，起始冲提液为纯水，尔后增加甲醇比例至100％的甲醇。接着，将GSB-F3划分层以葡聚糖凝胶管柱层析(Sephadex LH-20column chromatography)搭配甲醇作为冲提液进行分离，再经薄层层析片(TLC)点片合并，可得到8个分离部(即GSBF3-1～GSBF3-8)。
接着，对GSBF3-7以中压管柱层析仪(Medium pressure liquid chromatography,MPLC)(品牌：Rf+,Teledyne ISCO,Lincoln,NE)分离后再经薄层层析片点片合并后，可得到5个次分离部(即GSBF3-7-1～GSBF3-7-5)。
将GSBF3-7-1以逆向高效液相层析(RP-HPLC)进行纯化可得到TCI-GS-05化合物。于此，得到化合物的移动相为体积比2：3的甲醇与水。接着，以氢-核磁共振光谱(1H-NMR)与电喷洒离子化质谱(ESIMS)分析TCI-GS-05化合物的化学结构，可确认TCI-GS-05为Deglucosyltrifloroside，且TCI-GS-05的1H-NMR图谱如图10所示。TCI-GS-05化合物具有式I结构：
将GSBF3-7-2以逆向高效液相层析进行纯化可得到TCI-GS-07化合物。于此，得到化合物的移动相为体积比1：4的甲醇与水。接着，以氢-核磁共振光谱(1H-NMR)与高解析液相层析质谱仪分析TCI-GS-07化合物的化学结构，可确认TCI-GS-07为Deglucoscabraside，且TCI-GS-07的1H-NMR图谱如图11所示。TCI-GS-07化合物具有式II结构：
于此，所使用的核磁共振光谱仪(Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer,NMR)。其1D与2D光谱使用Ascend 400MHz系列(品牌：Bruker Co.,Germany)。并且，其以δ表示化学位移(chemical shift)，单位为ppm。
所使用的高解析液相层析质谱仪：串连超高效液相层析仪(Ultimate3000HPLC)与高分辨率轨道式离子阱质谱仪(Q-EXACTIVE System with Ion Max Source)测定，单位为m/z。
基此，龙胆萃取物包括具有式I所示结构的(Deglucosyltrifloroside)及具有式II所示结构的(Deglucoscabraside)。
例7：化合物的功效实验
将例7所分离的TCI-GS-05化合物及TCI-GS-07化合物进行粒线体活性分析实验。
所使用的细胞培养基为毛囊真皮乳头细胞生长培养基试剂盒(品牌：PromoCell)。所使用的细胞为人毛囊真皮乳头细胞(Human Follicle Dermal Papilla Cells,HFDPC；以下称HFDPC细胞)。
首先，取1×105个HFDPC细胞接种至每孔含有2毫升细胞培养基的6孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时。
接着，将HFDPC细胞分为空白组及TCI-GS-05实验组、TCI-GS-07实验组。移除各组别的细胞培养基并更换为每孔2mL的实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养24小时。其中，TCI-GS-05实验组的实验培养基为含有100μM的例7中所分离到的Deglucosyltrifloroside的细胞培养基。TCI-GS-07实验组的实验培养基为含有100μM的例7中所分离到的Deglucoscabraside的细胞培养基。空白组的实验培养基为单纯的细胞培养基。
移除各组别的实验培养基并以1×PBS(Gibco公司；Cat.14200-075)润洗HFDPC细胞二次后，以胰蛋白酶(Trypsin；品牌：Sigma)作用后收集各组别的HFDPC细胞，并以400×g离心5分钟，去除各组别的上清液后以1×PBS清洗一次，再以400×g离心5分钟并去除上清液以得到各组的细胞沉淀物。
于各组别中加入100μL的JC-1工作溶液。于此，JC-1工作溶液是取自流式细胞仪线粒体膜电位检测试剂盒(Flow cytometry Mitochrondrial membrane potentialdetection kit；品牌：BD)：JC-1工作溶液是将冻干的JC-1中加入130μL的DMSO以制备JC-1原液后，再以1：100的体积比与1×检测缓冲液混合所制得。
将各组的细胞沉淀物与JC-1工作溶液震荡混合以得到各组混合溶液，并避光反应15分钟。于反应15分钟后，将各组混合溶液以400×g离心5分钟，去除上清液后以1mL的1×清洗缓冲液(1×Wash buffer)清洗并以400×g离心5分钟，并重复二次1×清洗缓冲液的清洗、离心步骤，直到第二次离心去除上清液后可得到各组的待测沉淀物。于此，1×清洗缓冲液是取自流式细胞仪线粒体膜电位检测试剂盒。
以含有2％的牛血清蛋白(FBS)的1×PBS回溶各组的待测沉淀物以得到各组的待测溶液。并且，以流式细胞仪(品牌：BD Accuri)进行分析，以推算各组的粒线体相对活性(％)，如图12所示。需要特别说明的是，图12中的粒线体相对活性是以百分比呈现，其中使用Excel软件之STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。在图12中，「***」代表在与空白组比较下其p值小于0.001。
请参见图12。将空白组的粒线体相对活性视为100％，而TCI-GS-05实验组的粒线体相对活性为142.4％且TCI-GS-07实验组的粒线体相对活性为124.8％，代表TCI-GS-05及TCI-GS-07二实验组相对于空白组的粒线体活性分别提高了42.4％及24.8％。也就是说，二化合物均提高了HFDPC细胞的粒线体活性。
基此，使用者服用含有Deglucosyltrifloroside及Deglucoscabraside的龙胆萃取物后可有效的提升毛囊细胞粒线体活性，并维持毛囊健康，进而减少细胞死亡掉屑。
综上所述，根据任一实施例的龙胆萃取物，其可用以制备头皮保健的组合物。换言之，前述之组合物具有下列一种或多种功能：提高细胞粒线体活性(例如毛囊细胞)、强抗氧化力、阻止头皮发炎及发红、维持毛囊健康、提高头皮含水量、改善落发、减缓头皮敏感度等。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种龙胆萃取物用于制备头皮保健的组合物的用途，其特征在于，该龙胆萃取物是将龙胆(Gentiana scabra)以水于70℃～100℃下萃取45分钟～90分钟所得。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该龙胆萃取物包括具有式I所示结构的(2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-二羟基苯甲酰基)氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氢吡喃并[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三乙酸三酯((2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-dihydroxybenzoyl)oxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-2,4,5-triyltriacetate；Deglucosyltrifloroside)及具有式II所示结构的(2R,3R,4S,5R,6S)-4-乙酰氧基-2-(乙酰氧基甲基)-5-(苯甲酰氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氢吡喃并[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3-基2,3-二羟基苯甲酸酯((2R,3R,4S,5R,6S)-4-acetoxy-2-(acetoxymethyl)-5-(benzoyloxy)-6-(((3S,4R,4aS)-8-oxo-4-vinyl-3,4,4a,5,6,8-hexahydropyrano[3,4-c]pyran-3-yl)oxy)tetrahydro-2H-pyran-3-yl 2,3-dihydroxybenzoate；Deglucoscabraside)；
以及
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，该(2R,3S,4R,5R,6R)-3-((2,3-二羟基苯甲酰基)氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氢吡喃并[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氢-2H-吡喃-2,4,5-三乙酸三酯及该(2R,3R,4S,5R,6S)-4-乙酰氧基-2-(乙酰氧基甲基)-5-(苯甲酰氧基)-6-(((3S,4R,4aS)-8-氧代-4-乙烯基-3,4,4a,5,6,8-六氢吡喃并[3,4-c]吡喃-3-基)氧基)四氢-2H-吡喃-3-基2,3-二羟基苯甲酸酯具有提高粒线体活性的作用。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该龙胆萃取物是将该龙胆以该水于85±5℃下萃取60分钟以得到初萃取液，将该初萃取液离心取得上清液，并将该上清液过滤及减压浓缩后所得。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该龙胆萃取物具有强抗氧化力。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，该龙胆萃取物具有阻止头皮发炎、发红的作用。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该龙胆萃取物具有提升毛囊细胞粒线体活性的作用。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，该龙胆萃取物具有维持毛囊健康的作用。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该头皮保健包括提高头皮含水量、改善落发、减缓头皮敏感度或其组合。
10.如权利要求4所述的用途，其特征在于，该龙胆萃取物的使用量为0.3克/日。
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