CN109868230B - 一种鼠李糖乳杆菌及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，其在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14568。本发明公开的鼠李糖乳杆菌接种至酒糟中后，其可以利用酒糟中的糖类等物质为基础，进行乳酸发酵，乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解，因此，接种在酒糟中的鼠李糖乳杆菌可以在酒糟贮存中良好生长，并抑制酒糟贮存过程中霉菌等杂菌生长繁殖，从而实现酒糟原料贮存过程中营养组分的最大保持。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌及其筛选方法和应用。
背景技术
随着我国白酒技术的发展，白酒的年产量逐渐提高，作为白酒生产的副产物——酒糟的产量也越来越大，酒糟的再利用已成为白酒行业亟需解决的问题。近年来，我国白酒的年产量已经达到500-600万吨，白酒糟的产量更高达2100万吨。酒糟的妥善处理将直接影响到白酒生产企业的可持续发展，同时也关系到相关的国家节粮和环保政策的推广与落实。酒糟含有丰富的氨基酸、维生素和多种微量元素等，营养比较丰富，但其含水率高，如不加以处理，极易霉变腐败变质，这样不仅浪费了宝贵的资源，还会对周边的环境造成严重污染。因此，酒糟的再利用对我国废弃资源再利用和环境保护都具有十分重大的意义。
酒糟资源化方式中，厌氧消化技术是处理百万吨级酒糟最实用的技术途径之一。但由于酿酒工艺的自身要求，酒糟会大规模集中产生，考虑的建设成本等诸多问题，厌氧消化工艺无法短时间内消纳完集中产生的酒糟，为了保证厌氧消化工程发酵原料的可持续供应，酒糟需要一段时间贮存。目前，酒糟的主要贮存方式为自然堆放，但是自然堆放的酒糟容易霉变腐败，造成有机质损失严重，灰分增高；不仅如此，自然贮存过程中经历一系列生化反应，在一定程度上改变了其结构和成分，不利于后续厌氧消化的进行。
发明内容
本发明的第一目的就是针对现有技术存在的问题，提供一种能够用于酒糟贮存的鼠李糖乳杆菌，该菌可以作为生物添加剂单独接种于酒糟原料，改善酒糟的的贮存效果。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，其在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14568，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏日期为：2017年08月25日。
所述鼠李糖乳杆菌的16SrRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
具体的，所述的鼠李糖乳杆菌是从酒糟贮存场基地的渗滤液中分离纯化获得，渗滤液为酒糟原料贮存30天后，由贮存槽底部收集获得，具体酒糟贮存场的选择有很多。
具体的，所述的鼠李糖乳杆菌为革兰氏阳性菌，菌株呈杆状，长1.2～2.5μm，宽0.6～1μm。
本发明的第二目的是提供一种上所述的鼠李糖乳杆菌的筛选方法，其步骤如下：将采集的渗滤液按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度依次稀释，分别从各浓度的稀释液中吸取0.05mL，于MRS分离培养基平板均匀涂布，在30℃下恒温培养24h，镜检各菌落形态，挑取杆状菌落，反复划线分离纯化，获得该菌菌株。
具体的方案为，所述MRS分离培养基的制作方法为：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2g、碳酸钙20g，加水至1000mL，pH6.2-6.5，在120-122℃下高温灭菌25-30min。
进一步的，鼠李糖乳杆菌的活化步骤为，将鼠李糖乳杆菌接种于活化培养基，在30～35℃、PH6.0～6.5的条件下培养46-48h；鼠李糖乳杆菌的发酵扩大培养步骤为：将活化的鼠李糖乳杆菌接种于发酵扩大培养基，在30℃、120rpm条件下振荡培养48h。
具体的，所述活化培养基的制作方法为：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，补水至1000mL，pH6.2～6.5，在120-122℃下高温灭菌25-30min；所述发酵扩大培养基的制作方法为：称取蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖10g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，补水至1000mL，pH 6.2～6.5，在120-122℃下高温灭菌25-30min。以上所述的活化培养基和发酵扩大培养基均为液体培养基，若采用固体培养则分别在两种液体培养基配方基础上额外增加1.0％～2.0％(W/V)的琼脂即可。
本发明的第三目的是提出一种如上所述的鼠李糖乳杆菌在酒糟贮存中的应用。具体的，是将发酵扩大培养后的鼠李糖乳杆菌菌液按0.33％～0.66％(W/V)的比例均匀喷洒到酒糟中，压实排气，塑料薄膜覆盖，堆放于阴凉处，至少贮存6个月。
本发明的鼠李糖乳杆菌接种至酒糟中后，其可以利用酒糟中的糖类等物质为基础，进行乳酸发酵，乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解。因此，接种在酒糟中的鼠李糖乳杆菌可以在酒糟贮存中良好生长，占据有利生态位，抑制酒糟贮存过程中霉菌等杂菌生长繁殖，实现酒糟原料贮存过程中营养组分的最大保持。具体的试验结果表明，鼠李糖乳杆菌接种至酒糟中后能够显著降低酒糟中TS、VS、纤维素等的损失，具体应用时，鼠李糖乳杆菌可以采用直接接种指酒糟的方法(如喷洒到酒糟中)实现酒糟的原位贮存，操作简单、投入小。
总体上来说，与现有技术相比，本发明公开的技术内容存在的有益效果是：(1)提供了一种新的鼠李糖乳杆菌属菌株；(2)公开的鼠李糖乳杆菌能够应用于酒糟贮存；(3)公开的鼠李糖乳杆菌是通过筛选得到，不会对周围环境及生态平衡造成危害，符合生物安全法规；(4)公开的鼠李糖乳杆菌贮存效果稳定，受温度影响小，在常温条件下也具有较好的贮存效果；(5)公开的鼠李糖乳杆菌仅须单一菌株即可应用于酒糟贮存，具有操作简单易行、无需配套设备与技术、投资规模小等优点。
具体实施方式
以下通过实施例1-3来进一步说明的本发明公开的技术方案。
实施例1：鼠李糖乳杆菌株的筛选
(1)MRS分离培养基的制作：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温80mL、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2g、碳酸钙20g，加水至1000mL，pH6.5，在121℃下高温灭菌30min，待用。
(2)收集贵州鸭溪镇一酒糟贮存场基地的渗滤液(任意一处酒槽贮存场都可以)，渗滤液按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度依次稀释，分别从各浓度的稀释液中吸取0.05mL，于MRS分离培养基平板均匀涂布，在30℃下恒温培养24h，镜检各菌落形态，挑取杆状菌落，反复划线分离纯化，获得该菌菌株，其性状特征如下：
形态特征：该菌在MRS分离培养基中的营养细胞为杆状，革兰氏阳性，长1.2～2.5μm，宽0.6～1μm；在30℃培养2～3天形成芽孢，芽孢大小0.6～0.9×1～1.5μm，为长圆形或圆柱形。
培养性质：该菌置于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板培养：在35℃下培养1天可大量生长，菌落表面凸起，乳白色，表面光滑无褶皱，菌落不透明，边缘呈规则圆形，菌落粘性大，随着培养时间的增加变为淡黄色。
分子生物学鉴定：提取该菌株全基因组DNA，PCR扩增16S rDNA片段，测序，测序结果在NCBI中进行比对，比对结果显示该菌株为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
实施例2：培养基及接种菌液的制备
1)活化培养基制备：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，补水至1000mL，pH6.5，在121℃下高温灭菌30min。
2)发酵扩大培养基制备：称取蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖10g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，补水至，pH 6.5，在121℃下高温灭菌30min。
3)接种菌液的制备：将鼠李糖乳杆菌接种至活化培养基中活化培样48h，得活化菌种；将活化菌种接种到扩大发酵培养基，在30℃、120rpm条件下振荡培养48h，得接种菌液，经发酵扩大培养后得到的接种菌液浓度为107-108CFU/mL。
实施例3：鼠李糖乳杆菌的应用
方案一：
将1mL实施例2制得的接种菌液接种于装有300g酒糟的1L烧杯中(接种量0.33％，V/W)，同时做不加菌液的对照组，烧杯口覆上保鲜膜并用注射器扎上20个孔，实验组和对照组均设置三个重复组，将烧杯置于30℃环境中。一个月后测定酒糟中TS、VS、纤维素、木质素、半纤维素的含量，检测结果均取重复实验组和重复对照组的均值，测定结果如下表1。
表1酒糟检测结果(30℃、一个月、接种量0.33％)
| 检测项目 | 原样 | 对照组 | 实验组 | 实验组-对照组 |
| TS％ | 37.42 | 43.09 | 37.83 | -5.26 |
| VS％ | 91.09 | 89.24 | 91.01 | 1.77 |
| 半纤维素％ | 11.50 | 8.45 | 9.62 | 1.17 |
| 纤维素％ | 22.16 | 19.86 | 21.91 | 2.05 |
| 木质素％ | 27.12 | 25.52 | 26.95 | 1.43 |
| 原料降解率％ | - | 18.88 | 0.98 | -17.90 |
由上表1可知，在30℃环境中，酒糟中添加鼠李糖乳杆菌作用一个月后，实验组的酒糟中VS、纤维素、木质素、半纤维素的含量都明显高于对照组，但原料的VS降解率低于空白组。
方案二：
方案二与方案一的区别在于是将烧杯置于20℃的环境中，其他条件均一致，结果如下表2所示。
表2酒糟检测结果(20℃、一个月、接种量0.33％)
| 检测项目 | 原样 | 对照组 | 实验组 | 实验组-对照组 |
| TS％ | 37.42 | 39.61 | 37.61 | 1.99 |
| VS％ | 91.09 | 90.02 | 90.96 | 0.94 |
| 半纤维素％ | 11.50 | 8.45 | 9.62 | 1.17 |
| 纤维素％ | 22.16 | 19.86 | 21.91 | 2.05 |
| 木质素％ | 27.12 | 25.52 | 26.95 | 1.43 |
| 原料降解率％ | - | 11.77 | 1.58 | -10.19 |
由上表2可知，在20℃环境中，酒糟中添加鼠李糖乳杆菌作用一个月后，实验组的酒糟中VS、纤维素、木质素、半纤维素的含量都明显高于对照组。与方案一的30℃环境中作用一个月时相比，采用方案二的贮存效果略有下降，说明30℃的作用环境要优于20℃。
方案三：
方案三与方案一的区别在于是鼠李糖乳杆菌作用三个月后检测各指标，其他条件均一致，结果如下表3所示。
表3酒糟检测结果(30℃、三个月、接种量0.33％)
由上表3可知，在30℃环境中，酒糟中添加鼠李糖乳杆菌作用三个月后，实验组的酒糟中VS、纤维素、木质素、半纤维素的含量明显高于对照组，与30℃环境中作用一个月时相比其贮存效果有明显上升，说明本发明的鼠李糖乳杆菌的使用稳定性好，可以用于较长时间贮存酒糟。
方案四：
方案四与方案一的区别在于是接种量(V/W)的选择，该方案额外选择了接种量0.66％、0.99％，其他条件均一致，检测结果与方案一的0.33％接种量检测结果一并放在一起进行比较，结果如下表4所示。
表4酒糟检测结果(30℃、一个月、接种量0.33％/0.66％/0.99％)
由上表4可知，在30℃环境中，酒糟中添加不同接种量的鼠李糖乳杆菌作用一个月后，实验组的酒糟中VS、纤维素、木质素、半纤维素的含量均要高于对照组，但总体贮存效果随接种量增大表现为先增加后降低趋势，即接种量为0.66％时酒糟的贮存效果最好，0.33％的次之，当接种量达到0.99％时贮存效果又开始下降，贮存效果与对照组相差明显。
方案五：
在贵州鸭溪镇选定一酒糟贮存场，将10kg实施例2制得的接种菌液接种于10t酒糟中(接种量0.66％，V/W)，混匀后薄膜覆盖酒糟堆体，常温阴凉处堆放，同时做不加菌液和不覆膜的对照。一个月后测定酒糟TS、VS、纤维素、木质素、半纤维素的含量，测定结果如下表5。
表5酒糟检测结果(常温、一个月、接种量0.66％)
| 检测项目 | 原样 | 对照组 | 实验组 | 实验组-对照组 |
| TS％ | 38.58 | 43.17 | 40.61 | -2.56 |
| VS％ | 92.37 | 90.29 | 92.28 | 1.99 |
| 半纤维素％ | 11.5 | 8.54 | 10.21 | 1.67 |
| 纤维素％ | 22.16 | 19.56 | 21.98 | 2.42 |
| 木质素％ | 27.12 | 25.47 | 27.08 | 1.61 |
| VS降解率％ | - | 23.19 | 1.26 | -21.93 |
由上表5可知，在常温环境中，酒糟中添加鼠李糖乳杆菌作用一个月后，实验组的酒糟中VS、纤维素、木质素、半纤维素的含量都明显高于对照组，说明该菌的应用不仅限于小范围的提升酒糟贮存效果，其可以直接添加到酒厂的酒糟中，以提升酒糟的贮存效果，使酒糟在贮存过程中能够最大程度的降低有机质损失。
序列表
<110> 中节能绿碳环保有限公司
<120> 一种鼠李糖乳杆菌及其筛选方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1468
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)
<400> 1
gaatggggag catgctataa tgcaagtcga acgagttctg attattgaaa ggtgcttgca 60
tcttgattta attttgaacg agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctggcctt 120
aagtggggga taacatttgg aaacagatgc taataccgca taaatccaaa aaccgcatgg 180
ttcttggctg aaagatggcg taagctatcg cttttggatg gacccgcggc gtattaacta 240
attggtgagg taacggctca ccaagggaat gatacgtaac cgaactgaaa ggttgatccg 300
ccacattggg actgaaacac ggcccaaact cctacgggag gcaacagtaa ggaatcttcc 360
acaatggacg caagtctgat ggaacaacgc cgcgtgagtg aaaaagggtt tccggtccta 420
aaactctgtt gttggaaaaa aatggtccgc aaaataactg ttgtccgcgt gacggtatcc 480
aaccaaaaag ccacggctaa ctacgtgcca acagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540
ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag 600
ccctcggctt aaccgaggaa gtgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggcca 660
gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag 720
gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta 780
gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gaatgctagg tgttggaggg tttccgccct 840
tcagtgccgc agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa 900
ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttggaagcaa 960
cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatct tttgatcacc tgagagatca ggtttcccct 1020
tcgggggcaa aatgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1080
ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatg actagttgcc agcatttagt tgggcactct 1140
agtaagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200
ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg agaccgcgag 1260
gtcaagctaa tctcttaaag ccattctcag ttcggactgt aggctgcaac tcgcctacac 1320
gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380
tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagt ttgtaacacc cgaagccggt ggcgtaaccc 1440
tttagggagc gagccgtcta agcgacaa 1468
Claims (4)
1.一种鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus），其在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14568。
2.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种如权利要求1-2任意一项所述的鼠李糖乳杆菌在酒糟贮存中的应用。
4.根据权利要求3所述的鼠李糖乳杆菌在酒糟贮存中的应用，其特征在于：将发酵扩大培养后的鼠李糖乳杆菌菌液按0.33％～0.66％(W/V)的比例均匀喷洒到酒糟中，压实排气，塑料薄膜覆盖，堆放于阴凉处。
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