CN105779343A - 一株有效去除胆固醇和自由基的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株新型植物乳杆菌（<i>Lactobacillus </i><i>plantarum</i>）及其应用。所述植物乳杆菌已于2016年3月22日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016137。该菌株对胃酸和胆汁盐具有很强的耐受性，其在胃酸中的存活率高达165.41%，而且能有效去除胆固醇和自由基，抗氧化能力强。通过该菌株发酵制备得到的乳酸菌饮料不仅能大幅增加肠道中益生菌的数量，改善胃肠道的消化与吸收功能，还能有效降低人体血液中胆固醇的含量，清除自由基，增强机体的免疫力，市场前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一株有效去除胆固醇和自由基的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
乳酸菌（lacticacidbacteria，LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。乳酸菌也广泛存在于人体和动物肠道、许多食品、物料及少数临床样品中，不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。
乳酸菌主要应用于发酵型酸奶、乳酸菌饮料、发酵型肉制品、医药保健品等领域。乳酸菌产业已成为保健食品和医药领域发展最快的行业之一，全球市场规模已超过3000亿美元。我国乳酸菌产业的总规模已经超过了160亿元，平均年增长幅度为20%左右。随着市场的进一步成熟和益生菌概念的普及，同发达国家一样，我国的益生菌发酵乳制品将会成为乳品行业中增长速度最快的产品。目前我国益生菌乳产品年销售总额已超过10亿元人民币，酸奶的产量以40%的速度增长，益生菌酸奶和乳酸菌饮料的增长幅度高于酸奶的增长。
乳酸菌的性能直接决定了其发酵制品的品质，因此，建立乳酸菌菌种资源库，并在此基础上筛选和开发益生乳酸菌菌种显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一株新型植物乳杆菌及包含该菌株的益生菌制剂。申请人从健康成年人粪便中分离获得一株性能优良的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum），该菌株对胃酸和胆汁盐具有很强的耐受性，且能有效去除胆固醇和自由基，抗氧化能力强，应用前景广阔。
本发明一方面提供了一株植物乳杆菌DY-1（LactobacillusplantarumDY-1），已于2016年3月22日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2016137。
所述植物乳杆菌在药品、食品或保健品制备中的应用。
本发明还提供了一种乳酸菌饮料，是通过将上述植物乳杆菌进行发酵制备得到的。
所述乳酸菌饮料中植物乳杆菌的活菌数为10～30亿/mL。
本发明还提供了上述乳酸菌饮料的制备方法，具体包括：按发酵量的3-10%将上述植物乳杆菌接种至液体发酵培养基中；37℃发酵6～10小时；将发酵液进行无菌灌装、包装，即得乳酸菌饮料。
所述液体发酵培养基的各组分及其质量比分别为：红糖6.1%、葡萄糖5.5%、乳清粉0.07%、土豆泥0.04%、K2HPO40.03%、KH2PO40.02%和MgSO40.03%。
所述液体发酵培养基的初始pH值为5.5-6.5。
本发明提供的植物乳杆菌具有非常强的耐胃酸、耐胆汁盐能力，尤其是其在胃酸中的存活率高达165.41%，明显高于对照菌株，说明该菌株在胃酸中不但能够存活，还有一定程度的繁殖。所述植物乳杆菌能有效去除胆固醇，对MRS培养基中胆固醇的去除率达到88.5%，其发酵液上清液和无细胞提取物均具有较强的抗氧化能力，能有效清除自由基，对DPPH·的清除率分别高达96.9%和84.4%，取得了意料不到的技术效果。此外，本发明提供的乳酸菌饮料不仅能大幅增加肠道中益生菌的数量，改善胃肠道的消化与吸收功能，还能有效降低人体血液中胆固醇的含量，清除自由基，增强机体的免疫力，市场前景广阔。
具体实施方式
除了本发明筛选出的菌株外，实施本发明所用的各种原料、生产设备均可选自市售的任意一种，并没有特殊的限定。
以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
实施例1植物乳杆菌的筛选与鉴定
1、筛选
（1）取多名健康成年人新鲜粪便于内置有玻璃珠的灭菌三角瓶中，加入10倍重量PBS缓冲液置于摇床中震荡30min，然后收集到离心管中2000g离心5min收集上清；
（2）将上述上清5000g离心10min收集沉淀，用PBS缓冲液反复洗涤两次收集沉淀；
（3）向上述收集沉淀的离心管中加入原上清等体积的人工胃液充分悬浮沉淀，37℃水浴30min；
（4）将上述悬液5000g离心10min收集沉淀，用PBS缓冲液反复洗涤两次收集沉淀；
（5）向上述收集沉淀的离心管中加入原上清等体积的人工肠液充分悬浮沉淀，37℃水浴30min；
（6）将上述悬液5000g离心10min收集沉淀，用PBS缓冲液反复洗涤两次收集沉淀，最后用少量PBS缓冲液充分悬浮沉淀；
（7）将上述悬液后涂布于MRS培养基上（葡萄糖20g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，蛋白胨10g，无水醋酸钠5g，碳酸钙1g，吐温-801mL，K2HPO42g，琼脂15-20g，盐液A5mL，蒸馏水1000mL，pH6.5），37℃培养24～48小时，挑取平板上带有透明圈的菌落分别划线接种到MRS培养基上，37℃培养24～48小时，重复操作几次得到的纯菌种进行保存。
2、鉴定
对上述筛选的乳酸菌分别进行耐胃酸、耐胆汁盐能力检测，对胃酸、胆汁盐耐受性都相对较强的菌株进行分子生物学方法鉴定，测得其16SrDNA序列。然后将对胃酸和胆汁盐耐受性最强的菌株DY-1的16SrDNA序列通过NCBIBLAST进行比对分析，结果显示该序列与植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）的16SrDNA序列同源性超过99%，因此本发明筛选到的DY-1菌株为植物乳杆菌。
申请人将该菌株命名为植物乳杆菌DY-1（LactobacillusplantarumDY-1）。并已于2016年3月22日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2016137。
实施例2植物乳杆菌DY-1对胃酸和胆汁盐的耐受性
1、耐胃酸性能检测方法：
取活化后的植物乳杆菌DY-1菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心（5000g、5min）收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次后向离心管中加入40ml人工胃液（配制方法借鉴中华人民共和国兽药典的方法，取稀盐酸16.4ml加水摇匀稀释至1000ml，用浓盐酸或10%的NaOH调整pH为3.0，于121℃灭菌30min，在无菌室以1g/100ml比例加胃蛋白酶），37℃水浴培养2h，每隔30min摇匀一次，于0h和2h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，计算2h样品菌体的存活率，存活率=（2h时的活菌数/0h时的活菌数）×100%。
2、耐胆汁盐性能检测方法：
取活化后的植物乳杆菌DY-1菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心（5000g、5min）收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次后向离心管中加入40ml人工肠液（配制方法：取KH2PO46.8g，加蒸馏水500ml溶解，用0.4%（w/v）的NaOH溶液调节pH值至6.8，加水至1000ml，每100ml溶液中加0.3g禽胆盐，充分溶解后，于115℃灭菌15min。），37℃水浴培养2h，每隔30min摇匀一次，于0h、2h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，计算2h样品菌体的存活率，存活率=（2h时的活菌数/0h时的活菌数）×100%。
同时，以嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）CGMCC1.1854和干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）CGMCC1.2435作为对照，进行上述耐胃酸和耐胆汁盐性能检测。具体结果见表1。
表1耐胃酸、耐胆汁盐性能检测结果
从表1中的数据可以看出，与嗜酸乳杆菌CGMCC：1.1854和干酪乳杆菌CGMCC：1.2435相比，本发明筛选到的植物乳杆菌DY-1具有非常强的耐胃酸、耐胆汁盐能力，尤其是其在胃酸中的存活率高达165.41%，明显高于对照菌株，说明植物乳杆菌DY-1在胃酸中不但能够存活，还有一定程度的繁殖。
实施例3植物乳杆菌DY-1对胆固醇的去除效果
本实验参照Brashears等(1998)的方法，并略有改进。
将植物乳杆菌DY-1菌株活化后接种于MRS培养基，37℃培养过夜，作为种子液。
配制含5%（v/v）蛋黄液的MRS培养基，取其中2ml培养基，5000r/min离心7min，取1ml上清液置于离心管中，加入9ml无水乙醇，振荡处理5min，10000r/min离心10min，取2ml上清液加入2mlP-Fe-S试剂，冰浴混匀反应30min，测OD550，计算培养基中胆固醇的初始含量。
然后，将植物乳杆菌DY-1的种子液接种至上述MRS培养基中，在37℃条件下培养24h后，再次测定培养基中胆固醇的最终含量，计算植物乳杆菌DY-1对胆固醇的去除率。同时以嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）CGMCC：1.1854作为对照菌株，采用上述同样的操作，计算嗜酸乳杆菌对胆固醇的去除率。
胆固醇去除率=（初始含量－最终含量）/初始含量×100%
结果显示：本发明筛选到的植物乳杆菌DY-1对MRS培养基中胆固醇的去除率达到88.5%；而对照菌株嗜酸乳杆菌对胆固醇去除率仅为19.8%。从而说明植物乳杆菌DY-1对胆固醇的去除效果较好。
实施例4植物乳杆菌DY-1的抗氧化效果
DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它，则表示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或超氧自由基等自由基的能力，抗氧化效果显著。
将植物乳杆菌DY-1进行传代活化后，以5%（质量比）接种量接种于MRS液体培养基，37℃静置培养18h，3000r/min，离心15min，分别收集发酵上清和菌体。
制备无细胞提取物：用pH值为7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤菌体3次，重新悬浮于磷酸缓冲溶液中，调整菌数至109cfu/ml；然后超声波冰浴破碎菌体，10000r/min离心10min，上清液即为无细胞提取物。
DPPH·的测定方法：首先将DPPH溶于无水乙醇，制备成浓度为0.2M的DPPH·溶液；各取1ml发酵上清液和无细胞提取物，分别加入1ml浓度为0.2mmol/L的DPPH·，混匀，室温下静置30min后，在517nm处测吸光度变化。
DPPH·的清除率(%)=［1-(A1-A2)/A3］×100
式中:A1表示未加样品的DPPH·溶液的原始吸光度;
A2表示样品在测定波长时的本身吸光度;
A3表示加样后DPPH溶液的吸光度。
结果显示：植物乳杆菌DY-1的发酵上清液和无细胞提取物对DPPH·的清除率分别高达96.9%和84.4%，从而说明本发明提供的植物乳杆菌DY-1的发酵液上清液和无细胞提取物均具有较强的抗氧化能力，能有效清除自由基，而且该菌株发酵上清液的清除效果要明显高于无细胞提取物，这说明植物乳杆菌DY-1生长期间的代谢产物对自由基的清除发挥更重要的作用，抗氧化能力更强。
此外，本发明提供的植物乳杆菌DY-1发酵上清液和无细胞提取物对超氧阴离子自由基(O－2)也具有很好的去除效果，去除率分别达到83.4%和70.1%。超氧阴离子自由基是第一氧自由基，可以通过一系列反应生成其它氧自由基，具有重要的生物功能，并且与多种疾病密切相关。本发明所述植物乳杆菌DY-1对维护人体健康将产生重要的作用。
实施例5发酵植物乳杆菌DY-1制备乳酸菌饮料
配制液体发酵培养基：在发酵罐中加入适量水，分别将红糖、葡萄糖、乳清粉、土豆泥、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4加入到罐中，搅拌溶解后定容。利用高温蒸汽控制发酵罐内压力0.09～0.10MPa，使温度控制在115℃～121℃，杀菌25～45min，结束后冷却降温至37～40℃，其中各成分的质量体积比最终分别为：红糖6.1%、葡萄糖5.5%、乳清粉0.07%、土豆泥0.04%、K2HPO40.03%、KH2PO40.02%、MgSO40.03%，培养基的初始pH值为5.5-6.5。
按发酵量的3-10%接种上述植物乳杆菌DY-1（CCTCCNO:M2016137）的种子液于发酵罐中，搅拌15min，充分混匀后关闭搅拌；控制发酵温度为37℃，发酵时间为6～10小时，冷水迅速降温至10℃以下，进行无菌灌装、包装，即得到乳酸菌饮料，其中植物乳杆菌DY-1活菌数高达10-30亿/mL。
实施例6乳酸菌饮料的效果评价
从健康人群中随机挑选成年男女各10名，收集其新鲜粪便检测其中的乳酸菌及双歧杆菌数平均为2.35×108CFU/g和8.44×109CFU/g。20名健康成年人每天食用本发明所述乳酸菌饮料50ml，一周后检测其新鲜粪便中乳酸菌及双歧杆菌数平均为9.12×109CFU/g和8.57×1011CFU/g。从结果看，食用该乳酸菌饮料能明显提高人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，取得了意料不到的技术效果。
此外，长期研究数据表明，每日饮用本发明提供的乳酸菌饮料，不仅能大幅增加肠道中益生菌的数量，改善胃肠道的消化与吸收功能，还能有效降低人体血液中胆固醇的含量，清除自由基，增强机体的免疫力，维护身体健康。
Claims (7)
1.一株植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌的保藏号为CCTCCNO:M2016137。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在药品、食品或保健品制备中的应用。
3.一种乳酸菌饮料，其特征在于，所述的乳酸菌饮料是通过将权利要求1所述的植物乳杆菌进行发酵制备得到的。
4.如权利要求3所述的乳酸菌饮料，其特征在于，所述乳酸菌饮料中植物乳杆菌的活菌数为10～30亿/mL。
5.权利要求3或4所述乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤包括：按发酵量的3-10％将上述植物乳杆菌接种至液体发酵培养基中；37℃发酵6～10小时；将发酵液进行无菌灌装、包装，即得乳酸菌饮料。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的液体发酵培养基的各组分及其质量比分别为：红糖6.1％、葡萄糖5.5％、乳清粉0.07％、土豆泥0.04％、K2HPO40.03％、KH2PO40.02％和MgSO40.03％。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的液体发酵培养基的初始pH值为5.5-6.5。
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